JP6786757B2 - 新規なアミロイド線維生成抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、新規なアミロイド線維生成抑制剤に関する。本発明はまた該抑制剤を含むアミロイドーシスを予防及び／又は治療するための医薬組成物に関する。

アミロイドーシスとは、β−シート構造を有するタンパク質が重合して不溶性のアミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）又はアミロイド線維と呼ばれる細線維を形成し、生体内に沈着して組織傷害をもたらす疾患群のことを指す。ドイツの病理学者であるＶｉｒｃｈｏｗは、アミロイドーシスの組織標本がヨードで紫色に染まることを発見した。この結果から、Ｖｉｒｃｈｏｗは組織に沈着した物質は多糖体であると考え、これを「デンプン様物質」すなわち「アミロイド」と命名し、アミロイドの沈着により惹起される病態をアミロイドーシスと呼ぶことを提唱した。その後の研究により、アミロイドの主成分はナイロン様に重合して線維を形成するタンパク質であり、アミロイドには血清アミロイドＰ成分やグリコサミノグリカンなどが含まれていることが分かっている。現在では、アミロイドは「コンゴレッド染色で橙赤色に染まり、偏光顕微鏡下で観察すると緑色に強く輝く複屈折を起こす幅８−１５ｎｍの枝分かれのない細線維の集積からなる」と定義されている。

アミロイド線維の沈着によって臓器障害が引き起こされるアミロイドーシスには、家族性アミロイドポリニューロパチー（familial amyloid polyneuropathy；ＦＡＰ）、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、細胞内にアミロイド様物質がたまるハンチントン病をはじめとする遺伝性神経変性疾患など様々な疾患が含まれている。その中でもＦＡＰは、末梢神経、自律神経、腎、皮膚などの全身諸臓器にアミロイド沈着をきたし、常染色体優性遺伝形式で遺伝浸透する全身性アミロイドーシスであり、我が国、特に九州地方及び中部地方で多くの症例が確認されている。１９５２年にポルトガル人のＦＡＰ症例が初めて報告されて以来、世界各国から同様の症例報告がなされている。ＦＡＰの原因となるアミロイド線維は、主として、血清タンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）が変異したもので構成されている。

正常ＴＴＲは、β−シート構造を多く含む立体構造をしており、肝臓、脳脈絡叢、網膜、膵α細胞などで産生されるが、特にその９０％以上が肝臓で産生されるといわれている。正常ＴＴＲは、四量体を形成してサイロキシン（Ｔ４）やレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などを介したビタミンＡの輸送体としての役割を担っている。正常ＴＴＲの変異体は、これまでに１００種以上が報告されており、構造安定性が低く、四量体から単量体への構造変化を起こしやすいことが明らかになっている。

わが国で多いＦＡＰは、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ型の変異ＴＴＲを原因タンパク質とするＦＡＰである。ＦＡＰの主要性状は、左右対称性に下肢末端から上行する知覚障害を伴う多発性神経炎と自律神経障害（交代性の下痢と便秘、起立性低血圧、排尿障害等）であり、これらはいずれもアミロイドによる神経障害が原因である。その後、心臓、腎臓、消化管へのアミロイド沈着が著しくなり、これらの臓器の機能不全を引き起こす。一般的には、２０代後半から３０代で発症し１０年で歩行不能となり、１０数年の経過で心不全、腎不全などで死亡する予後不良の疾患であり、厚生省特定疾患にも指定されている難病の一つである。

ＦＡＰをもたらし得る変異ＴＴＲタンパク質は、正常ＴＴＲタンパク質に比べ構造安定性が低く、分子中のβ−シート構造が互いに会合し不溶性のアミロイド線維を形成して組織に沈着するといわれている。ＦＡＰの治療としては、変異ＴＴＲの約９０％以上が肝臓で産生されることから肝移植治療が行われている。一方で、アミロイド線維形成メカニズムに基づいたＦＡＰの治療方法として、四量体ＴＴＲ分子の乖離（解離）の阻害などが試みられている（非特許文献１及び２）。

また、本発明者らにより、糖、ペプチド又はポリエチレングリコールで修飾されたシクロデキストリン誘導体を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤が提案されている（特許文献１）。そこでは、修飾されたシクロデキストリン誘導体の例として、６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル）−Ｄ−グリコシル−β−シクロデキストリン及び６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンが開示されている。
また、本発明者らにより、アルキレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーを有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤が提案されている（特許文献２）。
さらに、本発明者らにより、ポリアミドアミンデンドリマー（Ｇ２）と６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル）−Ｄ−グリコシル−β−シクロデキストリンとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）と、ＴＴＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＴＲ）との複合体による、ＴＴＲの発現抑制が報告されており、そこでは、ＧＵＧ−β−ＣＤＥのｓｉＲＮＡ用キャリアとしての利用が提案されている（非特許文献３）。

しかしながら、難治性アミロイドーシスに対する治療薬で単独で臨床的に十分有効な治療効果を示す治療薬の開発は未だに成功していない。そのため、併用による効果を期待した薬剤の併用療法が考えられるが、その場合は薬物相互作用により副作用が発生するなどの様々な問題点が発生する可能性がある。そこで、より有効な治療効果を示す薬剤が求められていた。

特開２０１０−９００５４号公報 国際公開WO２０１１／００２０２６号公報

Yukio Ando, (2005), Med Mol Morphol, 38: pp. 142-154 Sekijima Y. "Recent progress in the understanding and treatment of transthyretin amyloidosis." (2014) J Clin. Pharm. Ther., 39: p225-33 「家族性アミロイドポリニューロパチーの治療を企画したｓｉＲＮＡ用キャリアとしてのデンドリマー／グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン結合体の有効利用」、第２８回日本ＤＤＳ学会学術集会講演要旨、２０１２年

本発明は、難治性アミロイドーシスに対するより有効な治療薬を提供することを目的とする。
より具体的には、安全性が高く、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成の抑制効果が従来の治療薬に比べてより優れたアミロイド線維の形成を抑制できる新規な物質を提供することである。さらには、そのような新規な物質を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬、特に家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）の予防及び／又は治療のための医薬を提供することである。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、本発明者らが創製した高機能分子デンドリマー結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）と、ＲＮＡ干渉による原因タンパク質産生の抑制を企図した核酸医薬（ｓｈＲＮＡなど）との複合体を形成させることで、ＧＵＧ−β−ＣＤＥの治療効果（線維形成抑制及び線維溶解）が著しく増強されることを見出し、本発明を完成した。
難治性アミロイドーシスは、様々な要因による原因タンパク質の立体構造変化が原因となり進行・発症することが知られているが、その発症過程は、アミロイド原因タンパク質の、（１）産生上昇あるいは変異タンパク質の産生、（２）立体構造変化によるアミロイド線維化、（３）アミロイド線維の組織沈着、の３つの重要なステップを経て進行する。本発明により提供されるＧＵＧ−β−ＣＤＥ／核酸医薬複合体は、これらの３つのステップを同時に抑制することにより、従来よりも高い治療効果を発揮しうる、新規マルチターゲット型アミロイドーシス治療薬でもある。

本発明は以下のものを含む。
（１）シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体と、トランスサイレチンのｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡとからなる複合体を有効成分として含むアミロイド線維生成抑制剤。
（２）前記シクロデキストリンが、グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン（ＧＵＧ−β−ＣｙＤ）である上記（１）に記載のアミロイド線維生成抑制剤。
（３）前記ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、上記（１）又は（２）に記載のアミロイド線維生成抑制剤。
（４）前記ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡである上記（３）に記載のアミロイド線維生成抑制剤。
（５）前記結合体が、グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）である、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．２）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．８）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ２．５）、又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ４．５）である上記（２）〜（４）のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤。
（６）前記複合体における、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ＲＮＡのチャージ比が、２０〜１００である上記（２）〜（５）のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤。
（７）前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤を含むアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬組成物。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、優れたアミロイド線維形成抑制活性に加えて優れたアミロイド線維溶解活性を持つので、アミロイドの線維化ならびにアミロイド線維の組織沈着の両者を有意に抑制することができる。また、本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、これらの作用に加えてアミロイド原因タンパク質の産生も抑制することができる。従って、本発明のアミロイド線維生成抑制剤を含む本発明の医薬組成物は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬として有用であり、特に、難治性のアミロイドーシス、例えば、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）に対して有用である。

ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体（１００μＭ）によるアミロイド線維形成抑制の効果を示す図である。図中、＊はｃｏｎｔｒｏｌと比較してｐ＜０．０５を、＋はＧＵＧ−β−ＣＤＥと比較してｐ＜０．０５を示す。 ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体の各種濃度（３０μＭ、６０μＭ、１００μＭ）でのアミロイド線維形成抑制の効果を示す図である。図中＊はｃｏｎｔｒｏｌと比較してｐ＜０．０５を示す。 ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体（１００μＭ）によるアミロイド線維溶解作用の効果を示す図である。 ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体によるアルツハイマー病の原因タンパク質であるＡβアミロイドの線維形成抑制の効果を示す図である。図中、＊はｃｏｎｔｒｏｌと比較してｐ＜０．０５を、＋はＧＵＧ−β−ＣＤＥと比較してｐ＜０．０５を示す。 ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体による、アミロイドーシスマウスモデルを用いたアミロイド線維形成抑制の効果を示す図である。上段がＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色の結果、下段が、アミロイド線維の検出の結果である。

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法及び材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
なお、本明細書においては、アミロイド線維の形成を抑制する作用と、形成されたアミロイド線維を溶解する作用とを合わせ持ったものをアミロイド線維生成抑制剤という。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、シクロデキストリン（ＣｙＤ）とポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＣＤＥ）と、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡとからなる複合体（以下、単に「本発明の複合体」という場合がある）を有効成分として含む。
本発明のシクロデキストリン・ポリアミドアミンデンドリマー結合体を構成するシクロデキストリンは、α、β、又はγ−シクロデキストリンのいずれでもよく、またこれらのα、β、又はγシクロデキストリンは、化学修飾型又は非修飾型のシクロデキストリンであることもできる。シクロデキストリンを修飾する一般的な方法としては、例えば、メチル化、ヒドロキシエチル又はヒドロキシプロピルなどのヒドロキシアルキル化、グルコシル化、マルトシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、硫酸化、スルホブチル化、カルボキシメチル化、カルボキシエチル化、アミノ化、カルボキシル化、トシル化、又はジメチルアセチル化などをあげることができる。シクロデキストリンは、好ましくはβ−シクロデキストリンであり、さらに好ましくはグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン（ＧＵＧ−β−ＣｙＤ）である。よって、好ましい本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン（ＧＵＧ−β−ＣｙＤ）とポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）と、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡとからなる複合体を有効成分として含む。

本発明のシクロデキストリン・ポリアミドアミンデンドリマー結合体を構成するポリアミドアミンデンドリマーは、アルキレンジアミンをコアとするデンドリマーであり、コアとなるアルキレンジアミンは特に制限されず、一般に用いられる種類のものを用いたデンドリマーをあげることができる。

以下、本発明の複合体を、グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン（以下、ＧＵＧ−β−ＣｙＤと略す場合がある。）とアルキレンジアミンをコアとするポリアミドアミンデンドリマー（以下、単に「デンドリマー」という場合がある。）との結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）を例として説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の複合体を構成するグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン（ＧＵＧ−β−ＣｙＤ）とアルキレンジアミンをコアとするポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）は、任意のＧＵＧ−β−ＣｙＤと任意のデンドリマーを常法に従い結合させて得ることができる。ＧＵＧ−β−ＣｙＤは、これに限定されないが、６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル）−Ｄ−グリコシル−β−シクロデキストリンを例示することができる。また、デンドリマーとしては、これに限定されないが、例えば、第２〜第１０世代の、好ましくは第２〜第６世代の、より好ましくは第２世代のデンドリマーをあげることができる。
本発明の複合体で用いるＧＵＧ−β−ＣＤＥにおける、シクロデキストリンの置換度（ＤＳ）は、例えば、約１．２〜約４．５のもの、好ましくは、約１．８のものを用いることができる。

本発明の複合体において好ましく用いられるＧＵＧ−β−ＣｙＤとデンドリマーの結合体は、６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル）−Ｄ−グリコシル−β−シクロデキストリンと第２世代のデンドリマーの結合体であり、下記構造で表される。

また、これに限定されないが、具体的には、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．２）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．８）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ２．５）、又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ４．５）をあげることができる。

本発明の複合体は、上記の結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）とトランスサイレチン（ＴＴＲ）のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡとからなる。
ＲＮＡとしては、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすものであればいずれでもよいが、例えば、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをあげることができ、好ましくはｓｈＲＮＡである。用いるＲＮＡの種類や長さは、ＲＮＡとの複合体形成によりＧＵＧ−β−ＣＤＥのアミロイド線維生成抑制効果（アミロイド線維形成抑制効果又はアミロイド線維溶解効果の少なくとも一方）が増強できる限り特に限定されない。

本発明においては、トランスサイレチン（ＴＴＲ）のｍＲＮＡ配列から本発明に使用可能なｓｉＲＮＡ配列を決定することができる。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿００３７１で見いだすことができる。本発明に使用するｓｉＲＮＡのための該ｍＲＮＡ上のターゲットサイトの選択は、公知の知識を用いて行うことができる。例えば、これに限定されないが、Ui-Tei K., et al. Nucleic Acids Research (2004) 32 (3): 936-948などの文献の記載を参考にすることができる。また、これに限定されないが、例えば、（ｉ）ＧＣ含量が約３０〜約７０％、好ましくは約５０％である、（ｉｉ）すべての塩基が均等であり、また、Ｇが連続していない、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５'末端の塩基がＡ又はＵである、などの基準を参考にできる。

本発明に使用するｓｉＲＮＡが具備すべき特徴としては、該ｓｉＲＮＡを動物細胞（例えば、ヒト細胞）に導入した場合に、ＲＮＡ干渉を生じ、トランスサイレチン産生を減少させることができる。また、標的であるトランスサイレチンの産生を効率よく抑制すると同時に、無関係の遺伝子の発現に影響（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果）を及ぼすことのない高い選択性を有すること、及び、オリゴ核酸（ｓｉＲＮＡ）自体が望ましくない毒性、副作用を発現しないことが望ましい。このようなｓｉＲＮＡ配列は、公知知識に基づき、当業者が決定することができ、ｓｉＲＮＡ自体は、常法に従って作製して検討を行う（例えば、実際のｓｉＲＮＡを作製し、細胞に導入し、トランスサイレチン産生の抑制活性や細胞に対する毒性を確認することを含む）ことにより、当業者が取得することができる。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果がないことの確認は、これに限定されないが、例えば、候補ｓｉＲＮＡについて、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことにより確認できる。

さらに、本発明において用いることができるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖配列は、トランスサイレチンのｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド、好ましくは１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドの配列を含む。そのようにして決定した配列を用いて、それらの配列から作製したｓｉＲＮＡが本発明の目的の効果を生じるか否かを確認することができる。従って、作製したｓｉＲＮＡが本発明の効果を生じる限り本発明に含まれ、それらを含む医薬組成物及びそれを利用する方法も本発明に含まれる。

本発明で用いるｓｉＲＮＡは末端にオーバーハンギングをもつことが好ましい。ｓｉＲＮＡのオーバーハングは、５’又は３’末端、好ましくはＲＮＡの３’末端にある。オーバーハングを構成するヌクレオチド数は、約１〜５ヌクレオチドであり、好ましくは約１〜４ヌクレオチド、さらに好ましくは約２〜３ヌクレオチド、より好ましくは２ヌクレオチドである。オーバーハングは、Ｔ又はＵもしくはＧであるのが好ましい。これに限定されないが、オーバーハンギングとして、ＴＴ、ＵＵ、ＵＧをもつｓｉＲＮＡが好ましい。

本発明で用いられるｓｉＲＮＡの例として、現在、治療薬として開発中のもの（例えば、Ｒｅｖｕｓｉｒａｎ）、又は市販されているものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明で使用するｓｉＲＮＡは、単一のｓｉＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｉＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。

本発明においては、ｓｉＲＮＡ前駆体としてのｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いることもできる。ｓｉＲＮＡ前駆体としてのｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３’末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。
本発明で使用するｓｈＲＮＡは、単一のｓｈＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｈＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。

本発明に用いるＲＮＡは、化学的に又は遺伝子組換え的に周知の方法で合成することができるが、ヌクレオチド数を考慮すると、慣用のＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するのが容易である。また、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社に合成を依頼して作製することも可能である。

ＧＵＧ−β−ＣＤＥとＲＮＡのチャージ比は、下記に示すように、ＲＮＡとの複合体形成によりＧＵＧ−β−ＣＤＥのアミロイド線維生成抑制効果（アミロイド線維形成抑制効果又はアミロイド線維溶解効果の少なくとも一方）が増強できる限り特に限定されないが、例えば、チャージ比２０〜２００、好ましくはチャージ比５０〜１５０、特に好ましくはチャージ比１００をあげることができる。
複合体の形成は、上記のチャージ比の範囲で両者を混合することにより作成できる。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、アミロイドーシスの発症過程である、アミロイド原因タンパク質の、（１）産生上昇あるいは変異タンパク質の産生、（２）立体構造変化によるアミロイド線維化、（３）アミロイド線維の組織沈着、の３つの重要なステップを同時に抑制することができる、新規マルチターゲット型アミロイドーシス治療薬である。
本発明者らにより、上記の（１）〜（３）の３つのステップを同時に抑制しうる目的で創製された、ＧＵＧ−β−ＣＤＥとＲＮＡ干渉効果を期待した核酸医薬（ｓｈＲＮＡなど）とを複合体形成させた本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、原因タンパク質産生（過程（１））の抑制効果が付加されるのみならず、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ自身が有している治療効果（線維形成抑制・線維溶解）が著しく増強されるという特徴を有する。
例えば下記の実施例で示されるように、ＧＵＧ−β−ＣＤＥによって得られる線維形成抑制効果は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで約２倍以上に増強される。また、アミロイド線維形成抑制作用を示すＧＵＧ−β−ＣＤＥの濃度は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで約半減させることが可能である。さらに、ＧＵＧ−β−ＣＤＥの線維溶解作用に関しても、ｓｈＲＮＡとの複合体形成により有意に増強される。
このように、本発明における、ＧＵＧ−β−ＣＤＥと核酸医薬（ｓｈＲＮＡなど）との複合体形成による線維形成抑制・線維溶解の増強効果は、上記の３つのステップを同時に抑制しうる効果に加え、低濃度でも高い治療効果を発揮するマルチターゲット型アミロイドーシス治療薬という特徴を有する。また、より低い濃度で有効な効果を示すことができるので、安全性の向上も図れる。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、ＧＵＧ−β−ＣＤＥとＴＲＲのｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉効果を示す核酸（ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡなど）との複合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／核酸）を有効成分として含むことにより、上記（１）〜（３）の全てのステップを抑制することに加えて、核酸との複合体形成によるアミロイド線維形成抑制・線維溶解活性の増強効果により、アミロイド線維の生成を効果的に抑制できる。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、本発明の複合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／核酸）を含む限り、それをどのような形態で含んでもよい。本発明のアミロイド線維生成抑制剤に含まれる有効成分の割合（有効成分の質量／アミロイド線維生成抑制剤の質量）は、変異ＴＴＲのアミロイド線維生成を抑制できる量であれば特に制限されないが、例えば、８０％〜１００％が好ましい。

本発明のアミロイド線維生成抑制剤は、本発明の複合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／核酸）を含めば、固体又は液体のいずれの形態でも利用することができるが、これに薬学上許容される担体又は添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として調製することもできる。

本発明はまた、本発明のアミロイド線維生成抑制剤を有効成分として含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬組成物である。

本発明の医薬組成物は、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）や老人性アミロイドーシスなどをはじめとするアミロイドーシスやアミロイドーシスに関連する疾患に対して、広い範囲で適用可能である。また、すでにアミロイドーシスに罹患した患者であっても、本発明の医薬組成物を適用すれば、障害が見られる組織を改善することが期待できる。したがって、本発明の医薬組成物によれば、アミロイドーシスやアミロイドーシスに関連する疾患の予防及びこれらの疾患による病状の進行や悪化の抑制だけでなく、病状の改善、すなわちこれらの疾患に対する治療効果が期待できる。

本発明の医薬組成物が対象とする疾患は、全身性アミロイドーシス及び限局性アミロイドーシスの何れも含む。これに限定されないが、具体的な疾患としては、全身性アミロイドーシスとして、免疫グロブリン性アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス）、ＡＡアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）などをあげることができ、限局性アミロイドーシスとして、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、プリオン病などをあげることができる。本発明が対象として特に好ましくは、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）、アルツハイマー病、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、ＡＡアミロイドーシスをあげあることができる。

例えば、ＦＡＰを発病した患者のうち症状が軽度な患者は本発明の医薬組成物を投与することにより症状の進行や悪化を防ぐことが可能であり、症状が重篤な患者に対しても治療効果を期待できる場合がある。また、変異トランスサイレチンを有する個体は加齢とともにＦＡＰを発症する可能性の高い潜在患者であるが、本発明の医薬組成物を投与することによりＦＡＰの発症を予防することができる。

本発明の医薬組成物としては、本発明のアミロイド線維生成抑制剤をそのまま用いてもよいが、通常は有効成分である本発明のアミロイド線維生成抑制剤と１又は２種以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態を調製して用いることが望ましい。

ＦＡＰの予防及び治療の際には、本発明の医薬だけでなく、トランスサイレチン四量体を安定化する非ステロイド性抗炎症薬、例えば、ジフルニサルなどと併用することも望ましい。

本発明の医薬組成物は、非経口剤であることが好ましく、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、乳糖やオリゴ糖などの賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、抗酸化剤、矯味剤、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、保存剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、キャリア、薬学的アジュバント及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明の医薬組成物のより好ましい形態として、注射剤を挙げることができる。注射剤は、通常、非水溶媒（又は水溶性有機溶媒）を実質的に含まず、媒体が実質的に水である溶媒で溶解又は希釈可能である。注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。

さらに、本発明の医薬組成物の好ましい形態として、凍結乾燥製剤（凍結乾燥した注射剤）もまた挙げることができる。このような凍結乾燥製剤であっても、注射用水（注射用蒸留水）、電解質液（生理食塩水など）などを含む輸液、栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体又は溶媒により溶解可能であり容易に注射液を調製でき、その容器もガラス容器及びプラスチック容器が使用できる。注射剤内容物の１００重量部に対して本発明の医薬を０．０１重量部以上、好ましくは０．１〜１０重量部含有することができる。

本発明の医薬組成物の投与量及び投与回数などは特に限定されず、患者の年齢、体重、及び性別などの条件、並びに疾患の種類や重篤度、予防又は治療の目的などに応じて適宜選択可能である。通常は、非経口投与による場合には有効成分量として成人一日あたり０．１μｇ〜１０ｇが好ましく、１０μｇ〜１０００ｍｇがより好ましく、１００μｇ〜５００ｍｇがより好ましいが、このような投与量を一日数回に分けて投与してもよい。本発明の医薬の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよく、特に制限されない。

以下、本発明を、以下に記載の実施例をもとに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：アミロイド線維形成抑制（１）
（１）実験材料
本実施例で用いたトランスサイレチン（ＴＴＲ）は、熊本大学大学院生命科学研究部等生命倫理に関する規則に定める倫理委員会のガイドラインに従い、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ型の変異をもつ患者から得た血清より精製した。純度決定は非加熱（非還元）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。
６−Ｏ−α−（４−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル）−Ｄ−グリコシル−β−シクロデキストリン（ＧＵＧ−β−ＣｙＤ）は塩水港精糖より入手し、ポリアミドアミンデンドリマー（Ｇ２）はＳｉｇｍａより入手した。ＧＵＧ−β−ＣＤＥは以下のようにして調製した。ＧＵＧ−β−ＣｙＤ ６７．８ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、縮合剤４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−ホルモリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）１５．５ｍｇを添加後、ポリアミドアミンデンドリマー（Ｇ２）０．５ｍＬとともに室温で１２時間反応させ、結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）を得た。得られたＧＵＧ−β−ＣＤＥを４８時間透析（透析膜：ＭＷＣＯ＝３５００）後、エタノールにより沈殿させ、凍結乾燥することで精製した。

ＧＵＧ−β−ＣＤＥとＴＴＲのｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡとの複合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ）は、合成したＧＵＧ−β−ＣＤＥとｓｈＲＮＡ（ＴＧ３０８５７４、Ｏｒｉｇｅｎｅより入手）を用いて、以下のようにして調製した。１．５ｍＬエッペンドルフチューブにトリス−エチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）に溶解したｓｈＲＮＡ５μｇを添加した。さらに、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に溶解したＧＵＧ−β−ＣＤＥを添加し、１０秒間ボルテックスした後、１５分間室温でインキュベートすることで複合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ）を調製した。

（２）アミロイド線維の形成方法
Ｖａｌ３０ＭｅｔＴＴＲを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を含む１ｍＭグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．０）で２０μＭの濃度になるように調製し、３７℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。

（３）アミロイド線維の測定方法
作成したアミロイド線維は、重合したβ−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンＴを用いて検出した。５０ｍＭ グリシン溶液に溶解した５００μＭ チオフラビンＴ溶液６００μＬに、インキュベーションしたサンプル３μＬを添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計Ｆ−４５００を用い、２５℃で４４２ｎｍの励起光で励起される４８９ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、スリット幅は励起側１０ｎｍ、蛍光側２０ｎｍで測定した。

（４）ＧＵＧ−β−ＣＤＥによるアミロイド線維形成の抑制結果
上記の方法を用いて、ヒト血清由来のＶａｌ３０ＭｅｔＴＴＲを、１００μＭのＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った。対照として、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１００μＭ）を用いた。結果を図１に示す。ＧＵＧ−β−ＣＤＥによって得られる線維形成抑制効果（約３０％）は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで約２倍以上（約７０％）に増強された。

実施例２：アミロイド線維形成抑制（２）
実施例１と同様にして、各種濃度（３０μＭ、６０μＭ、９０μＭ）のＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡの共存又は非共存下でアミロイド化させ、ＴＴＲのアミロイド線維形成の定量解析を行った。対照として、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１００μＭ）を用いた。結果を図２に示す。１００μＭのＧＵＧ−β−ＣＤＥによって得られる線維形成抑制効果は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで、約半分（６０ μＭ）の濃度で確認された。つまり、アミロイド線維形成抑制作用を示すＧＵＧ−β−ＣＤＥの濃度は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで約半減させることが可能であった。

実施例３：アミロイド線維溶解
ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体のアミロイド線維溶解作用を確認した。具体的には以下のようにして行った。
ヒト血清由来のＶａｌ３０ＭｅｔＴＴＲのアミロイド線維を形成させた後に、アミロイド線維を１００μＭのＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡの共存又は非共存下で６時間インキュベーションした。その後、アミロイド線維の定量解析を行った。対照として、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１００μＭ）を用いた。結果を図３に示す。ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１００ μＭ）は、一度形成したＴＴＲアミロイド線維に対してアミロイド線維溶解効果を示すが、本効果は、ｓｈＲＮＡと複合体を形成させることで有意に増強された。

なお、ｓｈＲＮＡとの複合体の形成により、アミロイド線維形成抑制についてＧＵＧ−β−ＣｙＤが効果を発揮する濃度（５０ ｍＭ）の５００分の１の低濃度（１００ μＭ）でも著明なアミロイド線維形成抑制効果を得ることができ、また、デンドリマー自身が線維溶解作用を発揮する濃度（５００ μＭ）の５分の１の低濃度（１００ μＭ）で溶解作用について効果を発揮した（データ示さず）。

実施例４：Ａβ ４０アミロイド線維形成抑制
アルツハイマー病の原因タンパク質であるＡｍｙｌｏｉｄ β（Ａβ ４０）を、実施例１に記載の方法により調製したＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１００μＭ）又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ（１００μＭ／０．１μｇ）複合体の共存下でアミロイド線維化させ、アミロイド線維化により生じたβシートと選択的に結合するチオフラビンＴを用いて、Ａβ ４０のアミロイド線維形成の定量解析を行った。

（Ａβアミロイド線維の形成方法）
Ａｍｙｌｏｉｄ β−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｕｍａｎ，１−４０、ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ， ＩＮＣ．）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５０μＭになるように調整し、３７℃で７２時間インキュベーションしアミロイド線維を形成させた。
（Ａβアミロイド線維の測定方法）
Ａβアミロイド線維は、チオフラビンＴを用いて検出した。５０ｍＭ グリシン溶液に溶解した５００μＭのチオフラビン−Ｔ溶液 ６００ μＬにサンプル６ μＬを添加後、混合し、測定用試料とし、蛍光強度測定（励起４４５ ｎｍ，測定４９０ ｎｍ）を行った。
結果を図４に示す。ＧＵＧ−β−ＣＤＥは、Ａβ４０のアミロイド線維形成に対して著明な抑制効果を示し、その効果は、ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ｃｏｎｔｒｏｌ）と複合体を形成させることで有意に増強された。

実施例５：アミロイドーシスマウスモデルを用いたアミロイド線維形成抑制
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の代謝産物アミロイドＡ（ＡＡ）が組織に沈着する「ＡＡアミロイドーシス（二次性又は反応性アミロイドーシスとも呼ばれる）」のマウスモデルを用い、実施例１に記載の方法により調製したＧＵＧ−β−ＣＤＥ又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ複合体を投与することによる組織沈着アミロイド（脾臓組織）の変化をＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色、及び偏光顕微鏡により解析した。

（ＡＡアミロイドーシスモデルの作成方法）
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週齢、雄）を用い、２％硝酸銀０．４ｍｌをマウス背部皮下に、Ａｍｙｌｏｉｄ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＡＥＦ）（J Rheumatol. 33, 2260-70, 2006）３ｍｌを腹腔内にそれぞれ投与し、ＡＡアミロイドーシスモデルを作成した。マウスに、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（１０ ｍｇ／ｋｇ）又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ（１０ ｍｇ／ｋｇ）を尾静注により投与した。
（アミロイド線維組織沈着の測定方法）
投与５日後に、ＡＡアミロイドーシスモデルにおいてアミロイド沈着が認められる脾臓組織を回収し、Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色を用いてアミロイド線維沈着を評価した。
Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ原末１ ｇを蒸留水１００ ｍｌに溶解し、撹伴しながら４５ ｇのＮａＣｌを加えて、さらに十分撹拌し、１００ ｍｌのエタノールを加えて１０°Ｃで冷却後、ろ過した。このＣｏｎｇｏ ｒｅｄ原液１００ ｍｌに対して、５ｇのフェノールと１ ｍｌの酢酸を加えたＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色液で、回収した脾臓組織を１時間染色し、水洗後にヘマトキシリン液で核染色した。アミロイドの検出は本法を用い、偏光顕微鏡でアップルグリーンを呈することにより同定した。
結果を図５に示す。脾臓組織においてＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色及び偏光顕微鏡によるアミロイド線維沈着を解析した結果、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡ投与群においてアミロイド線維の減少が確認された。

上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。

アミロイド線維の沈着によって臓器障害が引き起こされる疾患には、ＦＡＰをはじめ、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病、及びその他の遺伝性の疾患が含まれる。例えば、アルツハイマー病は、６５歳以上の高齢者の約１０％を占め、今後高齢化がさらに進む日本において社会的な問題となっている。アミロイド線維の沈着はタンパク質の不溶性の線維状凝集体の形成に起因することから、本発明の複合体はこれらの多様なアミロイドーシス疾患への治療にも応用が可能である。

Claims (12)

1. グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体と、トランスサイレチンのｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｈＲＮＡとからなる複合体を有効成分として含むアミロイド線維生成抑制剤。
2. 前記アミロイド線維生成抑制が、アミロイド原因タンパク質の産生上昇あるいは変異タンパク質の産生の抑制、アミロイド原因タンパク質の立体構造変化によるアミロイド線維化の抑制、およびアミロイド線維の組織沈着の抑制に基づく請求項１に記載のアミロイド線維生成抑制剤。
3. 前記グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体のアミロイド線維溶解活性がｓｈＲＮＡにより増強されていることを特徴とする、請求項１に記載のアミロイド線維生成抑制剤。
4. 前記グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）は、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．２）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．８）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ２．５）、又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ４．５）である請求項１〜３のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤。
5. 前記複合体における、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ｓｈＲＮＡのチャージ比が、２０〜１００である請求項１〜４のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤。
6. 請求項１〜５のいずれか一つに記載のアミロイド線維生成抑制剤を含むアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬組成物。
7. 前記アミロイドーシスが、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）、アルツハイマー病、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、又はＡＡアミロイドーシスである請求項６に記載の医薬組成物。
8. グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体と、トランスサイレチンのｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を起こすｓｈＲＮＡとからなる複合体を有効成分として含むアミロイド線維溶解剤。
9. 前記グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンとポリアミドアミンデンドリマーとの結合体（ＧＵＧ−β−ＣＤＥ）は、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．２）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ １．８）、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ２．５）、又はＧＵＧ−β−ＣＤＥ（Ｇ２， ＤＳ ４．５）である請求項８に記載のアミロイド線維溶解剤。
10. 前記複合体における、ＧＵＧ−β−ＣＤＥ／ＲＮＡのチャージ比が、２０〜１００である請求項８又は９に記載のアミロイド線維溶解剤。
11. 請求項８〜１０のいずれか一つに記載のアミロイド線維溶解剤を含むアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬組成物。
12. 前記アミロイドーシスが、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）、アルツハイマー病、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、又はＡＡアミロイドーシスである請求項１１に記載の医薬組成物。

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