JP6789124B2 - 腫瘍形成を抑制するディコップ２（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ２）（Ｄｋｋ２）阻害 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2014年7月3日に出願された米国特許仮出願第62/020,684号に係る優先権を主張する。

連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
本発明は米国立衛生研究所によって付与された助成金CA132317に基づいて政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
癌は世界的に重大な健康問題である。世界中で毎年数千万人が癌と診断され、最終的に患者の半分以上が癌で死亡する。米国では全男性の約半分、全女性の1/3が生涯のある時点で癌と診断され、4人に1人が癌で死亡する(Jemal et al., CA Cancer J. Clin., 2002, 52:23-47; Howlader et al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute)。最もよく確認されるヒト癌には、臓器および実質組織から生じた癌、例えば、結腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、および子宮内膜癌が含まれる。西半球では20人に1人が結腸癌に罹患する(Henderson, Nature Cell Biology, 2000, 2(9): p.653-60)。世界中で毎年100万人の新規患者が結腸癌と診断され、その半分がこの疾患のために死亡する(Liu et al., Cell, 2002, 108(6): p.837-47)。

過去何十年間に癌の処置および診断は著しく進歩した。癌のための処置選択肢には、外科手術、化学療法、放射線療法、および免疫療法が含まれる。さらに最近では、免疫系を刺激することにねらいを定めた免疫療法処置が数多くの調査を特に引き寄せてきた。免疫療法は非常に高い効果があり得るが、発生母地の臓器に関係なくごく一部の患者しか通常療法に応答しない。免疫療法の有効性および特異性を改善するために、この分野における新たな発見が明らかに必要とされている。

Wntシグナル伝達は、細胞運命の決定、分化、極性、増殖、および移動を含む多種多様な細胞プロセスを制御する。分泌タンパク質のWntファミリーは、低密度リポタンパク質受容体関連(LRP)タンパク質5および6(LRP5/6)などのいくつかの受容体クラスに結合して、Wnt/β-カテニン経路、Wnt/カルシウム経路、およびWnt/Jnk経路を含むいくつかの異なる細胞内シグナル伝達カスケードを活性化させる。LRP5/6へのWntの結合によって、分解のためにβ-カテニンを刺激する多タンパク質複合体の機能を遮断してその結果細胞質内および核内にβ-カテニンが蓄積することでWnt/β-カテニン経路が特異的に活性化される。核β-カテニンは転写因子Lef/TCFファミリーのメンバーと複合体を形成し、遺伝子発現を活性化する。

幹細胞機能の変化から生じる場合がある病理学的状態、例えば変性疾患および癌は、Wnt/β-カテニン経路活性の変化と頻繁に関連付けられる。実際に、Wnt/β-カテニン経路の過剰活性化は、時期尚早な幹細胞老化と、年齢に関連する幹細胞機能喪失とを誘導すると考えられている(Brack et al., Science, 2007, Vol.317 no. 5839 pp.807-810; Liu et al., Science, 2007, Vol.317 no. 5839 pp.803-806)。癌では、Wnt/β-カテニン経路の過剰活性化は、他の細胞増殖調節遺伝子の変異と共に起こることが多く、異常な細胞増殖につながる場合がある(Reya and Clevers, Nature, 2005, 434(7035):843-50)。従って、進行中の多くの調査は、癌における潜在的な治療標的としてWnt/β-カテニン経路に焦点を置いている(Breuhahn et al., Oncogene, 2006, 25: 3787-3800; Greten et al., Br J Cancer, 2009, 100: 19-23)。特に、癌ゲノム配列決定プロジェクトを含む、いくつかの調査研究から、結腸癌の80％超でWnt/β-カテニン経路の主要なサプレッサーである腺腫様大腸ポリポーシス(adenomatosis polyposis coli)(APC)遺伝子が変異しているか、さらには消失さえしていることが明らかになった(Kinzler and Vogelstein, Cell. 1996, Oct 18;87(2): 159-70. Review; Sjoblom et al., Science, 2006, Oct 13;314(5797):268-74; Mann et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(4): p.1603-8)。APCならびにGSK3βおよびアキシン(Axin)などのタンパク質は、分解のためにβ-カテニンをマーキングする複合体を形成する。APCの変異がこの複合体を破壊して細胞質β-カテニンのレベルの増大とその核移行とを招く。β-カテニンは、Wntシグナル伝達の最も重要なアダプターであるため、Wntリガンドに応答して発癌因子の発現を促進する。

Wntシグナル伝達はまた多数の分泌型ポリペプチドアンタゴニストでも調節される。これらの分泌型ポリペプチドアンタゴニストには、4種類の分泌型ディコップ(Dickkopf)(Dkk)タンパク質(Monaghan et al., Mech Dev, 1999. 87: 45-56; Krupnik et al., Gene, 1999. 238: 301-13)が含まれる。これらの4種類のDkkタンパク質のうちDKK1、2、および4は、WntコレセプターLRP5/6に高親和性で直接結合することで、有効な古典的Wntシグナル伝達アンタゴニストであることが証明されている(Mao et al., Nature, 2001. 411: 321-5; Semenov et al., Curr Biol, 2001. 11: 951-61; Bafico et al., Nat Cell Biol, 2001. 3: 683-6; Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81)。DKK1は脊椎動物発生における頭部および心臓の形成において重要な役割を果たしていると報告されているが(Niida et al., Oncogene, 2004, Nov. 4; 23(52):8520-6)、Dkk2は脊椎動物発生において皮質の役割を果たしているとは考えられない。Dkk2のないマウスは、血糖が少なく(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109: 11402-7)、骨量が少なく(Li et al., Nat Genet, 2005. 37: 945-52)、かつ眼表面上皮に欠損がある(Gage et al., Dev Biol, 2008. 317: 310-24; Mukhopadhyay et al., Development, 2006. 133: 2149-54)。DKKタンパク質がWntアンタゴニストであることを考えると、DKKの不活化によってWnt活性が増大して従って癌形成が加速するというのが平凡な知恵の教えるところである。しかしながら、癌形成におけるDKKタンパク質の役割は直接調べられたことがない。

Dkk分子は2つの保存されたシステインリッチドメインを含有する(Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81)。以前に、古典的Wntシグナル伝達の阻害ではDKK1およびDKK2の2番目のCysリッチドメインが重要な役割を果たしていることが示された(Li et al., J Biol Chem, 2002. 277: 5977-81; Brott and Sokol Mol. Cell. Biol, 2002. 22: 6100-10)。最近になって、DKK2の2番目のCysリッチドメインの構造は、このドメインの解析および図示された、DKKとLRP5/6とのおよびクレメン(Kremen)とのDKK相互作用に必要なアミノ酸残基であった(Chen et al., J Biol Chem, 2008. 283: 23364-70; Wang et al., J Biol Chem, 2008. 283: 23371-5)。LRP5/6とのDkk相互作用は、Dkkを介したWnt阻害のための主な機構の基礎となる。膜貫通タンパク質でもあるクレメン Dkkとの相互作用が、Wntシグナル伝達のDkk拮抗作用を促進すると示されたが、この相互作用には他の未解決の機能がある可能性がある。Alaスキャン変異誘発によって、LRP5の3番目のYWTD反復ドメイン上にあるアミノ酸残基がDKK1およびDKK2に結合するのに重要であると同定された(Zhang et al., Mol. Cell. Biol, 2004. 24: 4677-84)。これらの結果はDKK1/LRP6の3番目および4番目のYWTD反復ドメイン複合体の構造研究によって確認されている(Cheng et al., Nat Struct Mol Biol, 2011. 18: 1204-10; Chen et al., Dev Cell, 2011. 21: 848-61; Ahn et al., Dev Cell, 2011. 21: 862-73.; Bourhis et al., Structure, 2011.19: 1433-42)。構造研究の1つから、DKKのN末端と、LRPの1番目のYWTD反復ドメインとの間に別のDKK-LRP相互作用部位があることも明らかになった(Bourhis et al., Structure, 2011. 19: 1433-42)。

Wntシグナル伝達は、初期胚発生において役割があること、および腫瘍形成を促進することが最初に発見されたが、最近の研究から広範囲の生物学的プロセスにおいて役割を果たしていることが明らかになった。本発明は、平凡な知恵からではなく、腫瘍促進におけるWntアンタゴニストの役割の思いもよらない発見から始まっている。Wntシグナル伝達の変化をもたらすと考えられるこのWnt阻害物質の中和は、おそらく腫瘍免疫微小環境を調整することによって、腫瘍形成を阻害する。明らかに、癌細胞の増殖を減らし、癌細胞死を誘発し、癌を処置するための新たな手法が必要とされている。本発明はこの必要を満たす。さらに、本発明は、抗癌免疫療法および癌診断を改善するための必要を満たす。

本発明は、それを必要とする対象において癌を処置する組成物および方法に関する。癌を処置する方法は、薬学的に許容される担体中の有効量のディコップ2(DKK2)遺伝子枯渇物質(depleting agent)を対象に投与する工程を含む。

別の局面において、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を処置するかまたは減少させる方法を含む。該方法は、薬学的に許容される担体中の有効量のDKK2遺伝子枯渇物質(depleting agent)を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、血管新生は、癌に関連した腫瘍血管新生である。他の態様において、血管新生は、虚血性疾患および炎症性疾患に関連した病理学的血管新生である。さらに他の態様では、血管新生は心血管疾患に関連する。

別の局面において、本発明は、対象において癌を処置するための薬学的組成物を含む。本発明の薬学的組成物はDKK2枯渇物質および薬学的に許容される担体を含む。

さらに別の局面において、本発明は、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法を提供する。該方法は、有効量のDKK2抗体またはその断片を薬学的に許容される担体と共に対象に投与する工程を含む。さらなる局面において、本発明は、対象において細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供する。該方法は、有効量のDKK2抗体またはその断片を薬学的に許容される担体と共に対象に投与する工程を含む。一部の態様において、T細胞媒介性免疫応答はCD8⁺細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答である。

本発明はまた、対象において癌または癌を発症する素因を診断する方法も提供する。該方法は、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルを判定する工程を含み、癌を有していない対象に由来する対照生物学的試料におけるDKK2発現のレベルと比較した場合の、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルの増大が、癌または癌を発症する素因を対象が有しているという指標であり、かつ癌または癌を発症する素因が対象において検出された場合にこの対象に対して処置が推奨される。

本発明はさらに、それを必要とする対象において、癌の処置のための有効性を判定するための方法を提供する。該方法は、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルを判定する工程であって、癌を有していない対象に由来する対照生物学的試料におけるDKK2発現のレベルと比較した場合の、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルの増大が、処置が有効であるという指標である、工程、および、処置が有効であると判定された場合に対象に対してさらなる処置を推奨する工程を含む。一部の態様において、処置は、化学療法、放射線療法、免疫療法、および癌ワクチン療法からなる群より選択される少なくとも1つを含む。

さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和DKK2抗体を含む組成物を含む。

なおさらなる局面において、本発明は、対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断するためのキットを含む。キットは、DKK2遺伝子のmRNAを検出するための試薬、DKK2タンパク質を検出するための試薬、およびDKK2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬からなる群より選択される試薬を含む。

一部の態様において、癌は、腺腫様大腸ポリポーシス(APC)変異を発現する細胞を含む腫瘍を含む。一部の態様において、DKK2枯渇物質は、DKK2抗体、siRNA、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、ペプチドミメティック(peptidomimetic)、低分子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の態様において、DKK2枯渇物質は中和活性を有する。他の態様において、DKK2抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む。さらに他の態様では、DKK2抗体は、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2中和エピトープを標的とする。さらなる態様において、DKK2抗体は、YAL008-5-1A10(SEQ ID NO:8および9)、YAL008-7-1A10(SEQ ID NO:12および13)、ならびにYAL008-1-5F8(SEQ ID NO:10および11)からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む合成抗体である。

一部の態様において、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される。一部の態様において、癌は転移性である。

一部の態様において、本発明の組成物および方法は、化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を、対象に投与する工程をさらに含む。一部の態様において、さらなる作用物質はプログラム細胞死1(programmed cell death 1)(PD-1)抗体である。他の態様において、DKK2枯渇物質およびさらなる作用物質は対象に同時投与される。さらに他の態様では、DKK2枯渇物質およびさらなる作用物質は対象に同時処方および同時投与される。

一部の態様において、投与経路は、吸入、経口、直腸、腟、非経口、局部的、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、くも膜下腔内、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。

一部の態様において、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルは正常対照レベルより少なくとも10％高い。一部の態様において、発現レベルは、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって判定される。

一部の態様において、本発明の処置は少なくともDKK2枯渇物質を含む。

一部の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。

さらなる態様において、本発明のキットの試薬は、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和DKK2抗体を含む。
[本発明1001]
それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、薬学的に許容される担体中の有効量のディコップ2(Dickkopf2)(DKK2)遺伝子枯渇物質(depleting agent)を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
前記癌が、腺腫様大腸ポリポーシス(adenomatosis polyposis coli)(APC)変異を発現する細胞を含む腫瘍を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記DKK2枯渇物質が、DKK2抗体、siRNA、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、ペプチドミメティック(peptidomimetic)、低分子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記DKK2枯渇物質が中和活性を有する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
前記DKK2抗体が、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2中和エピトープを標的とする、本発明1003の方法。
[本発明1007]
前記DKK2抗体が、YAL008-5-1A10(SEQ ID NO:8および9)、YAL008-7-1A10(SEQ ID NO:12および13)、ならびにYAL008-1-5F8(SEQ ID NO:10および11)からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む合成抗体である、本発明1003の方法。
[本発明1008]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記癌が転移性である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記さらなる作用物質がプログラム細胞死1(programmed cell death 1)(PD-1)抗体である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記DKK2枯渇物質および前記さらなる作用物質が前記対象に同時投与される、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記DKK2枯渇物質および前記さらなる作用物質が前記対象に同時処方および同時投与される、本発明1010の方法。
[本発明1014]
投与経路が、吸入、経口、直腸、腟、非経口、局部的、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、くも膜下腔内、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
それを必要とする対象において血管新生を処置するかまたは減少させる方法であって、薬学的に許容される担体中の有効量のディコップ2(DKK2)遺伝子枯渇物質を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1016]
前記血管新生が、癌に関連した腫瘍血管新生である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記血管新生が、虚血性疾患および炎症性疾患に関連した病理学的血管新生である、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記血管新生が心血管疾患に関連する、本発明1015の方法。
[本発明1019]
前記癌が、腺腫様大腸ポリポーシス(APC)変異を発現する細胞を含む腫瘍を含む、本発明1016の方法。
[本発明1020]
前記DKK2枯渇物質が、DKK2抗体、siRNA、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、ペプチドミメティック、低分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1015の方法。
[本発明1021]
前記DKK2枯渇物質が中和活性を有する、本発明1015の方法。
[本発明1022]
前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記DKK2抗体が、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2中和エピトープを標的とする、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記DKK2抗体が、YAL008-5-1A10(SEQ ID NO:8および9)、YAL008-1-5F8(SEQ ID NO:10および11)、ならびにYAL008-7-1A10(SEQ ID NO:12および13)からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む合成抗体である、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1026]
前記癌が転移性である、本発明1016の方法。
[本発明1027]
化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1028]
前記さらなる作用物質がプログラム細胞死1(PD-1)抗体である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記DKK2枯渇物質および前記さらなる作用物質が前記対象に同時投与される、本発明1027の方法。
[本発明1030]
DKK2枯渇物質および薬学的に許容される担体を含む、対象において癌を処置するための薬学的組成物。
[本発明1031]
前記癌が、腺腫様大腸ポリポーシス(APC)変異を発現する細胞を含む腫瘍を含む、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1032]
前記DKK2枯渇物質が中和活性を有する、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1033]
前記DKK2枯渇物質が、DKK2抗体、siRNA、リボザイム、アンチセンス分子、アプタマー、ペプチドミメティック、低分子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1034]
前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1035]
前記DKK2抗体が、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2中和エピトープを標的とする、本発明1034の薬学的組成物。
[本発明1036]
前記DKK2抗体が、YAL008-5-1A10(SEQ ID NO:8および9)、YAL008-1-5F8(SEQ ID NO:10および11)、ならびにYAL008-7-1A10(SEQ ID NO:12および13)からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む合成抗体である、本発明1034の薬学的組成物。
[本発明1037]
化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を含む、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1038]
前記さらなる作用物質がプログラム細胞死1(PD-1)抗体である、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1039]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1040]
前記癌が転移性である、本発明1030の薬学的組成物。
[本発明1041]
対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量のDKK2抗体またはその断片を薬学的に許容される担体と共に該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1042]
前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記さらなる作用物質がプログラム細胞死1(PD-1)抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記DKK2抗体および前記さらなる作用物質が前記対象に同時投与される、本発明1043の方法。
[本発明1046]
対象において細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、有効量のディコップ2(DKK2)抗体またはその断片を薬学的に許容される担体と共に該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1047]
前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、抗体の生物学的に活性な断片、抗体模倣物、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記DKK2抗体が、SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2中和エピトープを標的とする、本発明1046の方法。
[本発明1049]
前記DKK2抗体が、1A10のアミノ酸配列(SEQ ID NO:9および11)ならびに5F8のアミノ酸配列(SEQ ID NO:13および15)の少なくとも1つを含む合成抗体である、本発明1046の方法。
[本発明1050]
前記T細胞媒介性免疫応答がCD8 ⁺ 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答である、本発明1046の方法。
[本発明1051]
対象において癌または癌を発症する素因を診断する方法であって、該対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルを判定する工程を含み、癌を有していない対象に由来する対照生物学的試料におけるDKK2発現のレベルと比較した場合の、該対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルの増大が、癌または癌を発症する素因を対象が有しているという指標であり、かつ、癌または癌を発症する素因が対象において検出された場合にこの対象に対して処置が推奨される、方法。
[本発明1052]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルが、正常対照レベルより少なくとも10％高い、本発明1051の方法。
[本発明1054]
前記対象に由来する生物学的試料または正常対照に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルが、前記遺伝子のmRNAの検出、該遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および該遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法を用いて判定される、本発明1051の方法。
[本発明1055]
以下の段階を含む、それを必要とする対象において癌のための処置の有効性を判定するための方法：該対象に由来する生物学的試料におけるディコップ2(DKK2)遺伝子の発現レベルを判定する工程であって、癌を有していない対象に由来する対照生物学的試料におけるDKK2発現のレベルと比較した場合の、該対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルの増大が、該処置が有効であるという指標である、工程、および、該処置が有効であると判定された場合に該対象に対してさらなる処置を推奨する工程。
[本発明1056]
前記処置が、化学療法、放射線療法、免疫療法、および癌ワクチン療法からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記対象に由来する生物学的試料におけるDKK2の発現レベルが、正常対照レベルより少なくとも10％高い、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記発現レベルが、前記遺伝子のmRNAの検出、該遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および該遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって判定される、本発明1055の方法。
[本発明1059]
前記処置が少なくともDKK2枯渇物質を含む、本発明1055の方法。
[本発明1060]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1061]
前記対象が哺乳動物である、本発明1001、1015、1041、1047、1051、および1055のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記哺乳動物がヒトである、本発明1061の方法。
[本発明1063]
SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和ディコップ2(DKK2)抗体を含む、組成物。
[本発明1064]
対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断するためのキットであって、ディコップ2(DKK2)遺伝子のmRNAを検出するための試薬、DKK2タンパク質を検出するための試薬、およびDKK2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬からなる群より選択される試薬を含む、キット。
[本発明1065]
前記試薬が、SEQ ID NO:1、5および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和DKK2抗体を含む、本発明1064のキット。
[本発明1066]
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、膵臓癌、および食道癌からなる群より選択される、本発明1064のキット。

本発明を例示する目的で、本発明のある特定の態様を図面に図示する。しかしながら、本発明は、図面に図示した態様の厳密な取り合わせおよび手段に限定されない。
図1A〜1Cは、APCKO(APCminDKK2^-/-)マウスにおける腫瘍量の減少を図示した一連のヒストグラムおよび画像である。同腹子マウス(雄)を、通常の固形飼料を与えてSPF動物施設に18週間、収容した。図1A:腫瘍/ポリープの数。図1B:腫瘍/ポリープのサイズ:APCKO腫瘍はAPCマウスの腫瘍より小さくなる傾向がある。図1C:代表的なHE染色は、APCKOマウスの腫瘍の方が小さく、頻度が少ないことを示している。 図2Aおよび2Bは、DKK2がMC38細胞において増殖を調節しないことを証明したヒストグラムである。図2A:50K細胞をプレーティングした。一晩の血清飢餓後に、組換え(r)DKK2を培地に添加した。24時間後に、ATPliteキットを用いて増殖を測定した。図2B:同様の設定で、細胞を収集し、血球計(heamocytometer)を用いて計数した。両実験ともn=3、P>0.05。 図3Aおよび3Bは、18週齢APCマウスまたはAPCKOマウスのポリープ(図3A)およびパイエル板(PP)(図3B)に由来するCTLのフローサイトメトリー分析を図示したグラフである。CD69およびグランザイムB(GZMB)はCTL(細胞傷害性Tリンパ球)活性化マーカーである。この分析は、DKK2を不活化することで、ポリープおよびPPにおいてCD8+CTLが過剰活性化されることを強調している。PPは消化管リンパ節である。 ポリープがほとんど目に見えない11週間で、APCKOマウスのパイエル板から得たCD8細胞によるグランザイムB(gzmb)発現の増大を図示した一連のグラフおよびヒストグラムである。APCおよびAPKCKOは、同じカゴの仲間(cagemate)/同腹仔である。 DKK2ヌル腫瘍間の関係および一貫性、細胞傷害性T細胞(CTL)の過剰活性化、ならびにアポトーシスの増大を証明した一連の画像である。消化管上皮細胞をデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンド標識(TUNEL)で染色した。 図6Aおよび6Bは、非造血細胞によって生成されたDKK2がCD8細胞上でのGZMB発現の増大に大きく寄与することを図示したグラフである。同じカゴの仲間である野生型(WT)およびKO(DKK2^-/-)(図6A)マウスならびにAPCおよびAPCKO(図6B)マウスに致死線量を照射し、WT CD45.1骨髄細胞を移植した。マウスをサルファトリム(sulfatrim)で4週間、処置した。照射して8週間後にマウスを安楽死させ、PPを収集し、フローサイトメトリーを用いてGZMB発現について分析した。APC状況に関係なく、DKK KOマウスでは移植CD8細胞におけるGZMB発現の増大が観察された。 上皮細胞においてDKK2が欠失すると、APCマウスのパイエル板(PP)に由来するCD8細胞の活性化が増大することを証明した一連のグラフである。5週齢の同じカゴの仲間および同腹子をタモキシフェンで処置した。11週齢マウスをCD8細胞について研究した。上皮細胞にDKK2が無いAPCマウスに由来する試料のPPでは、gzmb発現およびCD69発現の増大が検出された。 図8Aおよび8Bは、DKK2抗体YAL008-1-5F8(5F8)およびYAL008-5-1A10(1A10)の2つのクローンを図示した一連のヒストグラムである。図8A:5F8および1A10はrDKK2(3nM)を認識するが、rDKK1を認識しないことを示すELISA。図8B:293T細胞に対する24時間のWntレポーターアッセイにおいて、DKK2のWnt阻害機能は1A10および5F8によって逆転される。 図9A〜9Cは、新規a-DKK2 Ab(5F8=YAL008-1-5F8および1A10=YAL008-5-1A10)によるDKK2中和が、APCminマウスの腫瘍量の減少をもたらすことを図示する。8週齢APCマウスを200ugの5F8、1A10、およびIgGで8週間、72時間ごとに処置した。ホルマリンで固定した腸のメチレンブルー染色によって腫瘍量を測定した。腫瘍数(図9A)と腫瘍体積(図9B)は両方ともa-Dkk2 ab(抗体、ab)で処置したマウスの方が少ない。体重に有意差はない(図9C)。n=5、^*P<0.05。 抗DKK2抗体がパイエル板(PP)のCTL活性化を増大させることを証明した一連のグラフおよびヒストグラムである。n=5、^*P<0.05。 マウスを免疫するのに使用した抗原とその配列を列挙した表である。2つの主な抗体が、特に対象となった(^*または^**で印を付けた)が、YAL008-1抗原(SEQ ID NO:1)に対する抗体YAL008-1-5F8は、完全長DKK2タンパク質に対して最大の親和性を示し、中和活性についてさらに特徴決定された。YAL008-5抗原(SEQ ID NO:5)に対する抗体YAL008-5-1A10およびYAL008-7抗原(SEQ ID NO:7)に対する抗体YAL008-7-1A10は、完全長DKK2タンパク質を認識し、中和活性を有する。これらの抗体は、AbMax(AbMax Biotechnology Co., Ltd., China)によって合成ペプチドから作製された。YAL008-5-1A10およびYAL008-7-1A10はヒトDKK2とマウスDKK2の両方で同一の配列から作製されたが、YAL008-1-5F8は、マウス配列と2残基異なるヒト配列から作製された。YAL008-1-5F8は依然としてマウスDKK2タンパク質と交差反応性がある。マウスDKK2タンパク質に対する両抗体の親和性は酵素結合免疫測定法(ELISA)に基づいて0.1〜1nM範囲である。記号「#」は、コンジュゲーションのために付加したシステイン残基を示す。YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10、およびYAL008-7-1A10のCDRのアミノ酸配列(SEQ ID NO:8〜13)も表の下に示した。 提唱されたDKK-LRP6外部ドメイン相互作用機構を図示した画像である。LRP6外部ドメインの4つ全てのβプロペラをこの図に示した。DKK(N末端ペプチドおよびDKK1Cを含む)を示した。YAL008-1-5F8(5F8)およびYAL008-5-1A10(1A10)Dkk2中和抗体に対する抗原を矢印で示した。 図13Aおよび13Bは、同種異系移植片腫瘍モデルにおいてDKK2中和がグランザイムB陽性細胞および腫瘍細胞死の増大を伴って腫瘍量を減少させることを示した一連のグラフおよび画像である。マウス結腸癌細胞(MC38)を免疫適格C57BLマウスに皮下移植し、生着して6日後から抗DKK2抗体(5F8=YAL-008-1-5F8)で処置した。腫瘍成長曲線(図13A)ならびにアポトーシス細胞およびグランザイムB陽性細胞を対象にした腫瘍切片の免疫染色(図13B)を示した。n=5。 中和抗DKK2抗体によってグランザイムB陽性NK細胞およびCD8細胞が増大することを図示した一連のヒストグラムである。図13からの同種異系移植片腫瘍における細胞のフローサイトメトリー分析から、DKK2を中和しても、腫瘍において、CD45造血細胞の数もNK細胞の数もCD8⁺細胞の数も影響を受けなかったが、グランザイムB陽性造血細胞、NK細胞、およびCD8⁺細胞のパーセントは増加することが明らかである。n=5。 長期処置レジメンにおいてDKK2を中和すると用量依存的に腫瘍進行が遅くなることを証明した一連のグラフである。5F8=YAL-008-1-5F8。 図15からの腫瘍の免疫染色分析から、DKK2を中和するとGZMB陽性細胞および腫瘍細胞死が増大することが裏付けられたことを図示した一連のヒストグラムおよび画像である。この図から、DKK2中和抗体で長期間処置すると、CD8細胞数の増加ならびに腫瘍血管新生および腫瘍細胞増殖の減少を含む二次的な抗腫瘍効果が誘導されることも明らかである。 腫瘍細胞のDKK2発現が低下すると、GZMB陽性細胞および腫瘍細胞死の増大を伴って腫瘍進行が遅くなることを図示した一連のグラフおよびヒストグラムである。MC38のDKK2発現はshRNAによって発現停止され、低レベルのDKK2を発現するMC38細胞は同種異系移植片モデルにおいて小さな腫瘍を形成した。前の実験において分からなかった作用機構と一致して、DKK2発現の低下は腫瘍細胞死およびグランザイムB陽性細胞の増大と相関関係があった。 宿主DKK2を不活化すると、GZMB陽性細胞および腫瘍細胞死が増大することに付随して腫瘍進行が遅くなることを図示した一連のグラフおよびヒストグラムである。この図および図19のデータから、一方が宿主であり他方が腫瘍細胞である2つのDKK2供給源が存在する可能性のあることが分かる。両方とも腫瘍成長を促進するのに重要である。 同種異系移植片マウス腫瘍モデルを用いて、DKK2を中和すると、GZMB陽性細胞および腫瘍細胞アポトーシスが増大することに付随して肺癌形成が減少することを図示した一連のグラフおよびヒストグラムである。5F8=YAL-008-1-5F8。 単独で投与した場合または他の抗体(Sigma IgG; PD-1抗体)と組み合わせて投与した場合の腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を図示した一連のグラフである。図20Aは、ルイス肺癌(LLC)同種異系移植片肺腫瘍モデルにおいて、YAL-008-1-5F8には腫瘍妨害に対してPD-1抗体と同様の効果があったことを証明する。YAL-008-1-5F8とPD-1抗体の組み合わせはPD-1抗体単独より強い腫瘍進行抑制を示した。 単独で投与した場合または他の抗体(Sigma IgG; PD-1抗体)と組み合わせて投与した場合の腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を図示した一連のグラフである。図20Bは、LLC同種異系移植片腫瘍モデルを用いて単独で投与した場合または他の抗体(Sigma IgG; PD-1抗体)と組み合わせて投与した場合のマウス生存率に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を示す。 単独で投与した場合または他の抗体(Sigma IgG; PD-1抗体)と組み合わせて投与した場合の腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を図示した一連のグラフである。図20Cは、MC38結腸癌モデルにおいて単独で投与した場合または他の抗体と組み合わせて投与した場合の腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を図示する。このMC38モデルでは、PD-1抗体は腫瘍形成に有意な影響を及ぼさなかった。

発明の詳細な説明
本発明は、ディコップ2(DKK2)の阻害によって、ニュートラルキラー(neutral killer)(NK)細胞およびCD8⁺細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含む免疫エフェクター細胞の細胞傷害活性の増大、腫瘍細胞アポトーシスの増大し、腫瘍血管新生の減少に付随して腫瘍形成が抑制されるという思いもよらない発見に関する。従って、本明細書に記載の様々な態様において、本発明の方法は、有効量のDKK2遺伝子枯渇物質を患者に投与する段階によって癌を処置する方法、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法、対象において細胞集団または組織に対する免疫エフェクター細胞性免疫応答を刺激する方法に関する。さらに、本発明は、癌または癌を発症する素因を診断する方法、および癌を処置するための免疫療法処置の使用を決定するための方法を含む。さらに、本発明は、癌を処置するための薬学的組成物、ならびに上記の方法を実施するためのキットを包含する。

定義
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を、本発明を試験するための実施において使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書において説明する。本発明を説明およびクレームする際に、以下の専門用語を使用する。

本明細書で使用する場合、専門用語は特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを目的としていないことも理解しなければならない。

本明細書で使用する場合、「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すために用いられる。例として、「1つの要素」は1つの要素または複数の要素を意味する。

量、期間などの測定可能な値について言及している際に本明細書で使用する場合、指定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適しているので、「約」という用語は、このようなばらつきを包含することを意味する。

本明細書で使用する場合、「10％高い」とは、対照より少なくとも10％またはそれ以上、例えば、20％、30％、40％、もしくは50％、60％、70％、80％、90％高い、もしくはそれ以上高い発現レベル、および/または1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍もしくはそれ以上高い発現レベル、ならびにその間の任意のおよび全ての全増加分または部分的な増加分を指す。

本明細書で使用する場合、「対照」または「参照」という用語は同義に用いられ、比較の基準として用いられる値(例えば、健常対象におけるDKK2発現レベル)を指す。

本明細書中で使用する「対象」または「患者」はヒトでも非ヒト哺乳動物でもよい。非ヒト哺乳動物には、例えば、家畜およびペット、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウス哺乳動物が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書中で使用する「変異」とは、天然状態からの変化をもたらすDNA配列中の変化である。変異は、少なくとも1つのデオキシリボ核酸塩基、例えば、プリン(アデニンおよび/もしくはチミン)ならびに/またはピリミジン(グアニンおよび/もしくはシトシン)の欠失および/または挿入および/または重複および/または置換を含んでもよい。変異は、生物(対象)の観察可能な特徴(表現型)の識別可能な変化を生じてもよいかまたは生じなくてもよい。

本明細書で使用する「免疫原性」という用語は、抗原またはエピトープなどの、ある特定の物質が哺乳動物の体内で免疫応答を誘発できることである。この免疫応答は体液性および/または細胞性でもよい。

本明細書で使用する「活性化」という用語は、目に見えて分かる生化学的変化または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分連結の後の細胞の状態を指す。T細胞の文脈では、このような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているT細胞の状態を指す。T細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および調節性または細胞溶解性のエフェクター機能の実行を誘導することもある。他の細胞の文脈では、この用語は、特定の物理化学的プロセスの上方制御または下方制御を意味する。「活性化T細胞」という用語は、現在細胞分裂しているか、サイトカインを産生しているか、調節性もしくは細胞溶解性のエフェクター機能を実行しているT細胞、および/または「活性化」プロセスを最近受けたことがあるT細胞を示す。

本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義に用いられ、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなくてはならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながっている2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用する、この用語は、当技術分野において、例えば、一般的にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当技術分野において一般的にタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。タンパク質の中には多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、例えば、特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチド変種、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

本発明の文脈において、よく出現する核酸塩基については以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンを指す。「C」はシトシンを指す。「G」はグアノシンを指す。「T」はチミジンを指す。「U」はウリジンを指す。

本明細書で使用する「RNA」という用語はリボ核酸と定義される。

本明細書で使用する「免疫療法剤」という用語は、患者の免疫系を調整する任意の剤を含むことが意図される。「免疫療法」とは、患者の免疫系を変える処置を指す。

本明細書で使用する「治療の」という用語は処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、軽快、または根絶によって得られる。

「処置」という用語は、本発明の文脈において使用する場合に、疾患または障害に対する治療的処置ならびに予防的または抑制的な措置を含むことが意図される。従って、例えば、処置という用語は、疾患または障害が発症する前または発症した後に作用物質と投与し、それによって、疾患または障害の全徴候を阻止することまたは取り除くことを含む。別の例として、疾患が臨床的に発現した後に疾患の症状と闘うための作用物質の投与は、疾患の「処置」を含む。これは癌の予防を含む。

「生物学的試料」という用語は、生物または生物の成分(例えば、細胞)から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的な組織または液体の試料でもよい。しばしば、試料は、患者から得られた試料である「臨床試料」である。このような試料には、骨髄、心臓組織、痰、血液、リンパ液、血球(例えば、白血球)、組織もしくは細針生検試料、尿、腹水、および胸膜液、またはこれらに由来する細胞が含まれるが、これに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的な目的で採取した凍結切片などの組織切片を含んでもよい。

「DKKタンパク質」は、1つまたは複数のシステインリッチドメインを含有するDkkタンパク質ファミリーの中のタンパク質を指す。Dkkタンパク質ファミリーには、Dkk1、Dkk2、Dkk3、およびDkk4、ならびにこれらのタンパク質の1つまたは複数と配列レベルで、構造的に、または機能的に十分に関連する他の任意のタンパク質が含まれる。このタンパク質ファミリーは、例えば、Krupnik et al.(1999) Gene 238:301に記載されている。この定義には、Dkkタンパク質の対立遺伝子変種および変異体、例えば、本明細書において列挙された対立遺伝子変種および変異体も包含される。

「等価な」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用する場合、機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指すことが理解される。等価なヌクレオチド配列は、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失だけ異なる配列、例えば、対立遺伝子変種を含み、従って、遺伝暗号の縮重のために本明細書に記載の核酸のヌクレオチド配列と異なる配列を含む。

「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。二本の一本鎖核酸が二本鎖二重鎖を形成する場合に「ハイブリダイズ」する。二本鎖領域は、一本鎖核酸の一方もしくは両方の完全長、または一方の一本鎖核酸の全ておよび他方の一本鎖核酸の部分配列を含んでもよいか、または、二本鎖領域は各核酸の部分配列を含んでもよい。ハイブリダイゼーションはまた、二本の鎖が依然として二本鎖らせんを形成するのであれば、ある特定のミスマッチを含む二重鎖が形成することも含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。プローブと、テンプレート核酸の標的部位の「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルをはっきりと解読することができるように、プローブが主に標的とハイブリダイズすることを指す。さらに本明細書において説明するように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらす、このような条件は、相同性領域の長さ、領域のGC含有率、ハイブリッドの融解温度「Tm」に応じて変化する。従って、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含有率、酸性度、および温度の点で異なる。

DNAまたはRNAなどの核酸に関して本明細書で使用する「単離された」という用語は、それぞれ、天然の高分子供給源に存在する他のDNAまたはRNAから分離された分子を指す。本明細書で使用する、単離された、という用語はまた、組換えDNA法によって生成された場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、または化学合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質も指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然には存在せず、天然状態で見い出されないと考えられる核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞のタンパク質から単離されたポリペプチドも指すために本明細書において用いられ、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することが意図される。「単離された細胞」または「単離された細胞集団」とは、天然環境には存在しない細胞または細胞集団である。

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、適宜、リボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAの類似体と、説明されている態様に当てはまる場合には一本鎖(センスまたはアンチセンス)ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されるはずである。EST、染色体、cDNA、mRNA、およびrRNAは、核酸と言及される可能性のある分子の代表例である。

「幹細胞」は、望ましい細胞タイプに分化することができる細胞を指す。幹細胞には、胚性幹(ES)細胞;成人幹細胞;および体性幹細胞、例えば、未拘束の(uncommitted)中胚葉に由来するSP細胞が含まれる。「全能性」幹細胞は、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の細胞を含む全ての組織タイプに分化することができる。「多分化能性」または「多能性」の幹細胞は、いくつかの運命のうちの少なくとも2つに分化することができる細胞である。

「変種」という用語は、ポリヌクレオチド配列の文脈において用いられる場合には、遺伝子またはそのコード配列の変種に関連するポリヌクレオチド配列を包含することがある。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」変種も含むことがある。これらのポリペプチドには、一般的に、互いに対して有意なアミノ酸同一性がある。多型変種は、ある特定の種の個体間の、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変化である。多型変種は、ポリヌクレオチド配列が1塩基だけ異なる「一塩基多型」(SNP)を包含することがある。SNPの存在は、例えば、ある特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性質を示すことがある。

「Wntアンタゴニスト」または「Wnt阻害物質」という用語は、Wnt経路を介してシグナル伝達を下方制御する(例えば、抑制または阻害する)分子または組成物を指す。下方制御は、直接的に、例えば、Wntシグナル伝達経路におけるタンパク質の生理活性を阻害することによって行われてもよいか、または間接的に、例えば、Wntシグナル伝達の下流メディエーター(例えば、TCF3)を阻害することによって、またはβ-カテニンなどの安定性を減少させることによって行われてもよい。Wntアンタゴニストの例には、Dkkポリペプチド(Glinka et al., Nature, 1998, 391: 357-62; Niehrs, Trends Genet,1999, 15(8):314-9)、クレセント(crescent)ポリペプチド(Marvin et al., Genes & Dev., 2001, 15: 316-327)、ケルベルス(cerberus)ポリペプチド(米国特許第6,133,232号)、WISE/スクレロスチン(Li et al., J Biol Chem, 2005. 280: 19883-7)、アキシンポリペプチド(Zeng et al., Cell, 1997, 90(1): 181-92; Itoh et al., Curr Biol , 1998, 8(10):591-4; Willert et al., Development, 1999, 126(18):4165-73)、Frzbポリペプチド(Cadigan et al., Cell , 1998, 93(5):767-77; 米国特許第6,133,232号; 米国特許第6,485,972号)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)ポリペプチド(He et al., Nature, 1995) 374(6523): 617-22)、T細胞因子(TCF)ポリペプチド(Molenaar et al., Cell, 1996, 86(3):391-9)、ドミナントネガティブディシブルド(dishevelled)ポリペプチド (Wallingford et al., Nature, 2000, 405(6782): 81-5)、ドミナントネガティブN-カドヘリンポリペプチド(米国特許第6,485,972号)、ドミナントネガティブβ-カテニンポリペプチド(米国特許第6,485,972号)、下流転写因子(例えば、TCFなど)のドミナントネガティブ、Wntポリペプチドのドミナントネガティブ、LRP-フリズルド(frizzled)-wnt複合体を破壊する作用物質、ならびにWntを隔離する作用物質(例えば、クレセントおよびWntに対する抗体)が含まれるが、これに限定されない。Wntアンタゴニストポリペプチドは、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、またはヒツジに由来してもよく、非哺乳動物、例えば、ゼノパス(Xenopus)、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ(Drosophila)、ニワトリ、またはウズラに由来してもよい。Wntアンタゴニストは、Dkk、クレセント、ケルベルス、アキシン、Frzb、GSK、TCF、ドミナントネガティブディシブルド、ドミナントネガティブN-カドヘリン、およびドミナントネガティブβ-カテニンポリペプチドを含むが、これに限定されない、様々なポリペプチドの断片、ホモログ、誘導体、対立遺伝子変種、およびペプチドミメティックも包含する。他の態様において、Wntアンタゴニストは抗体(例えば、Wnt特異的抗体)、ポリヌクレオチド、および低分子も含む。

本明細書で使用する「癌」という用語は、癌腫、肉腫を含むが、これに限定されない任意の悪性腫瘍を含む。癌は、細胞が制御されずに、および/または異常に分裂し、次いで、周囲組織に侵入し、破壊することから生じる。本明細書で使用する「増殖する」および「増殖」とは、有糸分裂している細胞を指す。本明細書で使用する「転移」とは、発生した部位から悪性腫瘍が離れて広がることを指す。癌細胞は、血流を通って、リンパ系を通って、体腔を通過して、またはそれらの任意の組み合わせで転移してもよい。

「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤する傾向および転移を生じる傾向がある上皮細胞で構成された悪性の新たな成長を指す。

「癌ワクチン」という用語は、癌と闘うためまたは癌の発生に寄与する作用物質と闘うために免疫系を刺激するワクチンを指す。2つの大まかなタイプの癌ワクチン:健常対象において癌が発症しないことを目的とする予防的癌ワクチンと、癌に対する身体の自然防御を強化することによって、既にある癌を処置することを目的とする治療的癌ワクチンがある(Lollini et al., Nature Reviews Cancer, 2006; 6(3):204-216)。本明細書で使用する「癌ワクチン」という用語は、予防的癌ワクチンと治療的癌ワクチンの両方を含むと解釈すべきである。

「転移」という用語は、ある臓器または部分から別の隣接しない臓器または部分に癌が広がることを指す。

「血管新生」という用語は、新たな血管が、一般的に組織または臓器の周囲または内部に発生することを指す。正常な生理学的条件下ではヒトまたは動物は非常に特異的で限られた状況でしか血管を形成しない。例えば、血管新生は、通常、創傷治癒、胎児発生および胚発生、ならびに黄体、子宮内膜、および胎盤の形成の際に観察される。制御されていない(持続的および/または無秩序な)血管新生は様々な疾患状態に関連し、腫瘍の成長および転移の間に発生する。

「寛解させる」または「処置する」という用語は、実施した行為の結果として、癌またはメラノーマに関連する臨床徴候および/または症状が和らげられることを意味する。モニタリングされる徴候または症状は、特定の癌またはメラノーマに特有のものであり、熟練した臨床家に周知であり、同様に、徴候および状態をモニタリングするための方法も熟練した臨床家に周知である。例えば、熟練した臨床家には、特定の腫瘍に通常用いられる画像診断法を用いて(例えば、腫瘍をモニタリングするために超音波または磁気共鳴画像(MRI)を用いて)、腫瘍のサイズまたは成長速度をモニタリングできることが公知である。

本明細書で使用する場合、「薬学的組成物」という用語は、本発明において有用な少なくとも1種類の化合物と、他の化学成分、例えば、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および/または賦形剤の混合物を指す。薬学的組成物は、化合物を生物に投与するのを容易にする。静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、肺投与、および局部的投与を含むが、これに限定されない、化合物を投与する複数の技法が当技術分野において存在する。

「薬学的に許容される担体」という言葉は、本発明の化合物が意図された機能を果たすことができるように、対象の中に、または対象に本発明の化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を含む。典型的に、このような化合物は、ある臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に運搬または輸送される。それぞれの塩または担体は、製剤の他の成分と適合し、対象を傷つけないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働く可能性のある材料のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース;トラガカントゴム末;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤ろう;油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油;グリコール、例えば、プロピレングリコール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張性食塩水;リンガー液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;希釈剤;造粒剤;潤滑剤;結合剤;崩壊剤;湿潤剤;乳化剤;着色剤;離型剤;コーティング剤;甘味剤;着香剤;芳香剤;防腐剤;抗酸化物質;可塑剤;ゲル化剤;シックナー;硬化剤;止め薬;懸濁剤;界面活性剤;保湿剤;担体;安定剤;ならびに薬学的製剤において用いられる他の無毒の適合性物質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」はまた、化合物の活性と適合し、対象に対して生理学的に許容される任意および全てのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補助的な活性化合物も組成物に取り入れられてもよい。

本明細書で使用する「抗体」または「Ab」という用語は、抗原上にある特定のエピトープに特異的に結合するタンパク質、または免疫グロブリン分子に由来するポリペプチド配列を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンでもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分でもよい。本発明において有用な抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体(「イントラボディ(intrabody)」)、Fv、FabおよびF(ab)₂、ならびに単鎖抗体(scFv)およびヒト化抗体を含む様々な形で存在してもよい(Harlow et al., 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。抗体は天然供給源に由来してもよいか、または組換え供給源に由来してもよい。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。

本明細書で使用する「合成抗体」という用語は、組換えDNA技術を用いて作製された抗体、例えば、本明細書に記載のようにバクテリオファージが発現した抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって抗体が作製され、かつこのDNA分子が抗体タンパク質を発現させるかまたは抗体を特定するアミノ酸配列を発現させ、このDNA配列またはアミノ酸配列が、使用可能でありかつ当技術分野において周知である合成DNAまたはアミノ酸配列技術を用いて得られている、抗体を意味することも解釈されなければならない。

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の少なくとも1つの部分またはその組換え変種を指し、抗原結合ドメイン、例えば、抗体断片と標的、例えば、抗原との認識および特異的結合を付与するのに十分な、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')₂、およびFv断片、scFv抗体断片、直鎖抗体、シングルドメイン抗体、例えば、sdAb(VLまたはVH)、VHHドメイン、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これに限定されない。「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含み、単鎖ポリペプチドとして発現することがでる融合タンパク質を指し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は短い可動性のポリペプチドリンカーを介して連続して連結されており、scFvは、これが得られたインタクトな抗体の特異性を保持している。定めのない限り、本明細書で使用するscFvは、VL可変領域およびVH可変領域を、例えば、ポリペプチドのN末端およびC末端について、どちらの順序でも有してもよく、scFvは、VL-リンカー-VHを含んでもよいか、またはVH-リンカー-VLを含んでもよい。

本明細書で使用する「抗体重鎖」とは、天然コンホメーションをとる抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちのより大きい鎖を指し、この「抗体重鎖」は通常、抗体が属するクラスを決定する。

本明細書で使用する「抗体軽鎖」とは、天然コンホメーションをとる抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちのより小さい鎖を指す。カッパ(κ)軽鎖およびラムダ(λ)軽鎖とは2つの主な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

本明細書で使用する「組換え抗体」という用語は、組換えDNA技術を用いて作製された抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現システムが発現した抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって抗体が作製され、かつこのDNA分子が抗体タンパク質を発現させるかまたは抗体を特定するアミノ酸配列を発現させ、このDNA配列またはアミノ酸配列が、使用可能でありかつ当技術分野において周知である組換えDNA技術またはアミノ酸配列技術を用いて得られている、抗体を意味することも解釈しなければならない。

本明細書で使用する「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫学的に能力のある細胞の活性化、またはその両方を伴ってもよい。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働くことができることを理解する。さらに、抗原は組換えDNAに由来してもよいか、またはゲノムDNAに由来してもよい。従って、当業者は、この用語が本明細書において用いられた場合に、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが「抗原」をコードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列だけでコードされる必要はないことを理解する。本発明は、複数種の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、これらのヌクレオチド配列は、望ましい免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることが容易に分かる。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解する。抗原は作製、合成されてもよいか、または生物学的試料から得られてもよいことが容易に分かる。このような生物学的試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生物学的液体が含まれ得るが、これに限定されない。

「アプリケーター」という用語は、この用語が本明細書において用いられる場合に、本発明の化合物および組成物を投与するための、皮下注射器、ピペットなどを含むが、これに限定されない任意の装置を意味する。

本明細書で使用する場合、「アプタマー」は、別の分子に特異的に結合することができる低分子を指す。アプタマーは、典型的には、ポリヌクレオチドベースまたはペプチドベースの分子である。ポリヌクレオチドアプタマーは、特定の標的分子、例えば、有機分子および無機分子の中でも特にペプチド、タンパク質、薬物、ビタミンに対して適切な結合親和性および特異性を有するように設計された高度に特異的な三次元コンホメーションをとり、通常、数本の核酸鎖を含む、DNA分子またはRNA分子である。このようなポリヌクレオチドアプタマーは、指数増菌(exponential enrichment)によるリガンドの体系的進化を用いることによって膨大なランダム配列集団より選択することができる。ペプチドアプタマーは、典型的には、特異的リガンドに結合する、タンパク質スキャフォールドに取り付けられた約10〜約20アミノ酸のループである。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドシステムなどの方法を用いてコンビナトリアルライブラリーから特定および単離されてもよい。

本明細書で使用する「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の減少、または癌状態に関連する様々な生理学的症状の寛解を含むが、これに限定されない様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体が、最初の場所で腫瘍の発生を阻止する能力があることでも明らかにすることができる。

本明細書で使用する「異種移植片」という用語は、ある種のドナーから採取し、別の種のレシピエントに移植した組織の移植片を指す。

本明細書で使用する「同種異系移植片」という用語は、ある種のドナーから採取し、同種のレシピエントに移植した組織の移植片を指す。

範囲:本開示全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲の形で提示することができる。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためのものであり、本発明の範囲に対する融通の利かない限定と解釈してはならないことが理解されるはずである。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲(subrange)ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内にある個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるはずである。これは範囲の幅に関係なく適用される。

説明
免疫系は活性化と抑制との間でバランスが保たれている。免疫監視から逃れることは、腫瘍が形成する必要条件の1つである。腫瘍が免疫監視から逃れる手法の1つは、多量の免疫抑制分子を産生することである。何年にもわたって、ますます多くの免疫抑制分子および免疫抑制機構が同定されている。これらの免疫抑制分子の中和が様々な悪性腫瘍を処置するのに有効であることが示されている。

本発明は、ニュートラルキラー(NK)細胞およびCD8⁺細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性を抑制して腫瘍血管新生を刺激する分泌型腫瘍形成エンハンサーDKK2の発見に関する。DKK2は、β-カテニンによって媒介されるWntシグナル伝達を阻害し、β-カテニンによって媒介されないWnt活性を変化させることができ、かつWnt非依存的機能も有し得る分泌タンパク質である。DKK2は血管新生促進活性を有することも示された(Park et al., Angiogenesis, 2014. 17: 221-34; Min et al., J Clin Invest, 2011. 121: 1882-93)。DKK2は多くの組織において発現しており、ヒト結腸直腸癌、胃腸癌、肝臓癌、腎臓癌、および膵臓癌において上方制御されている。下記の実験証拠から、DKK2阻害物質および中和抗体は、DKK2が発現している癌を処置するための重要な免疫調節剤および腫瘍血管新生サプレッサーであることが分かる。従って、DKK2は、これらの癌を処置するための有望な標的である。

本発明の方法
本発明は、それを必要とする対象において癌を処置する方法であって、薬学的に許容される担体中の有効量のDKK2)遺伝子枯渇物質を対象に投与する工程を含む、方法に関する。「DKK2遺伝子枯渇物質」という用語は、DKK2発現を阻害するもしくは低下させるか、または細胞、組織、もしくは体液におけるDKK2活性を阻害するもしくは低下させる任意の作用物質を意味する。

低分子干渉RNA(siRNA):
一態様において、枯渇物質は低分子干渉RNA(siRNA)である。siRNAは、関心対象の遺伝子またはポリヌクレオチドに対してターゲティングされた一組のヌクレオチドを含むRNA分子である。本明細書で使用する「siRNA」という用語は、(i)二本鎖RNAポリヌクレオチド、(ii)一本鎖ポリヌクレオチド、および(iii)このようなポリヌクレオチドの中に1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のヌクレオチド変化または置換がある、(i)または(ii)いずれかのポリヌクレオチドを含むが、これに限定されない全ての形態のsiRNAを包含する。siRNAおよび遺伝子発現を阻害するための、その使用は当技術分野において周知である(Elbashir et al., Nature, 2001, 411 (6836): 494-988)。本発明では、siRNAは、DKK2などの関心対象の遺伝子の発現および/または活性を妨害することができる。

リボザイム:
さらなる態様において、枯渇物質はボザイムである。リボザイムおよび遺伝子発現を阻害するための、その使用も当技術分野において周知である(Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 17479-17482; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28:4929-4933; Eckstein et al., 国際公開公報番号WO92/07065; Altaian et al., 米国特許第5,168,053号)。リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと同様に他の一本鎖RNAを特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列を改変することによって、RNA分子中の特定のヌクレオチド配列を認識し、切断するように分子を操作することができる(Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030)。このアプローチの主な利点は、リボザイムが配列特異的であるということである。2つの基本的なタイプのリボザイム、すなわち、テトラヒメナ(tetrahymena)型(Hasselhoff, 1988, Nature 334:585)およびハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さが4塩基の配列を認識するのに対して、ハンマーヘッド型リボザイムは長さが11〜18塩基の塩基配列を認識する。配列が長ければ長いほど、その配列が標的mRNA種にしか生じない可能性が大きくなる。その結果、特定のmRNA種を不活化する場合、テトラヒメナ型リボザイムよりもハンマーヘッド型リボザイムの方が好ましく、18塩基の認識配列の方が、様々な無関係のmRNA分子の中でランダムに生じる可能性がある短い認識配列より好ましい。関心対象の遺伝子(すなわち、DKK2)の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、望ましい遺伝子のmRNA配列に相補的な標的配列を基本リボザイム構造に取り入れることによって設計される可能性がある。関心対象の遺伝子を標的とするリボザイムは、市販の試薬(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)を用いて合成されてもよいか、またはリボザイムをコードするDNAから遺伝子発現されてもよい。

アンチセンス分子:
別の態様において、枯渇物質はアンチセンス核酸配列である。アンチセンス分子および遺伝子発現を阻害するための、その使用は当技術分野において周知である(Cohen, 1989, Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press)。アンチセンス核酸は、この用語が本明細書の他の場所で定義されるように、特定のmRNA分子の少なくとも一部と相補的なDNA分子またはRNA分子である(Weintraub, 1990, Scientific American 262:40)。細胞内で、アンチセンス核酸は、対応するmRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成し、それによって、遺伝子の翻訳を阻害する。アンチセンス分子は、Inoue, 1993、米国特許第5,190,931号に開示されるアンチセンス分子をコードするDNAを用いて、遺伝子発現を介して細胞に供給されてもよい。または、アンチセンス分子は合成により作製され、次いで、細胞に供給されてもよい。約10〜約30個のアンチセンスオリゴマーが簡単に合成され、標的細胞に導入されるので好ましい。本発明により意図される合成アンチセンス分子には、非改変オリゴヌクレオチドと比較して生物学的活性が改善された、当技術分野において公知のオリゴヌクレオチド誘導体(米国特許第5,023,243号)が含まれる。

低分子阻害物質
ヒトLRP5の3番目のYWTD反復ドメインのβ-プロペラ構造の上部空洞に位置する、いくつかのアミノ酸残基が、DKK結合と、DKKを介したWnt拮抗作用に重要なことは当技術分野において周知である(Zhang et al., Mol Cell Biol. 2004;24:4677-4684)(図12)。本発明の一態様において、この空洞に結合し、DKKとLRP5/6との相互作用を破壊することができる低分子はDKK2阻害物質として働く。特定の態様において、DKK2阻害物質は、DKK結合に関与することが当技術分野において公知のLRP5の任意のアミノ酸残基と類似した任意の低分子である。これらの残基の非限定的な例は、Glu721、Trp863、Tyr719、Arg764、Asp887、Phe888、Gly781、Trp780、およびMet890である(Zhang et al., Mol Cell Biol. 2004;24:4677-4684)。さらなる態様において、DKK2阻害物質として働く低分子は、ガロシアニン化合物(例えば、IIC8およびIIIC3)(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109: 11402-7)である。

抗体
本発明は、抗DKK2抗体を含む組成物を使用することを意図する。一態様において、該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、および抗体の生物学的に活性な断片、ならびにそれらの任意の組み合わせより選択される抗体を含む。特定の態様において、合成抗体、例えば、抗体YAL008-1-5F8(DKK2のN末端に位置しDKK2のN末端に位置する

、SEQ ID NO:1である抗原ペプチド配列を使用)、抗体YAL008-5-1A10(DKK2の第2のCysリッチドメインに位置する

、SEQ ID NO:5である抗原ペプチド配列を使用)、および抗体YAL008-7-1A10(DKK2の第2のCysリッチドメインに位置する

、SEQ ID NO:7である抗原ペプチド配列を使用)(図11および12)は、AbMax Biotechnology Co. Ltd.(China)によって生成される。さらなる態様において、コンジュゲーションのためにシステイン(「C」)が抗原ペプチドの3'末端に付加される。

抗体を生成する方法は当技術分野において公知である。本発明に従って用いられる抗体を生成するための例示的な技法が本明細書において説明される。抗体は、天然供給源に由来するか組換え供給源に由来するかに関係なく、標的分子上に存在するエピトープに特異的に結合することができる任意の免疫グロブリン分子を含むことが当業者に理解される。一態様において、標的分子は含む。

本発明の組成物および方法において用いられる標的分子に対する抗体がポリクローナル抗体(IgG)である場合、適切な動物に、完全長標的タンパク質を含むペプチドまたはその断片、上流制御因子またはその断片を接種することによって作製される。これらのポリペプチドまたはその断片は、化学合成および生物学的合成を含む当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。

次いで、標的分子またはその断片に特異的に結合する、接種された動物において産生された抗体は、動物から得られた液体から単離される。ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ウサギ、およびロバなどがあるが、これに限定されない、いくつかの非ヒト哺乳動物において、このように抗体を作製することができる。ポリクローナル抗体を作製するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Harlow et al., 1998, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。

完全長標的分子またはその断片に対して作製されたモノクローナル抗体は、任意の周知のモノクローナル抗体調製手順、例えば、Harlow et al.(1998, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)およびTuszynski et al.(1988, Blood, 72: 109-115)に記載の手順を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は米国特許出願公開第2003/0224490号に記載の方法によって調製することができる。抗原に対して作製されたモノクローナル抗体は、本明細書において引用された標準的な手順を用いて抗原で免疫されたマウスから作製される。本明細書に記載の手順を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野において使用可能であり、例えば、Wright et al., 1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4): 125-168およびその中で引用された参照文献に記載されている技術を用いてクローニングおよび配列決定することができる。

本発明の方法において用いられる抗体が、完全長標的分子またはその断片に対する抗体に対応する生物学的に活性な抗体断片または合成抗体である場合、抗体は以下の通りに調製される。望ましい抗体またはその断片をコードする核酸を適切なベクターにクローニングする。ベクターをトランスフェクションによって、多量の抗体またはその断片を作製するのに適した細胞に導入する。次いで、望ましい抗体をコードするDNAを細胞内で発現させ、それによって抗体を生成する。望ましいペプチドをコードする核酸は、当技術分野において使用可能であり、例えば、Wright et al., 1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4): 125-168およびその中で引用された参照文献に記載されている技術を用いてクローニングおよび配列決定することができる。または、多量の望ましい抗体またはその断片を、化学合成技術を用いて合成することもできる。抗体のアミノ酸配列が既知であれば、当技術分野において公知の方法を用いて、望ましい抗体を化学合成することができる。

本発明はまた、標的分子上に存在するエピトープと特異的に反応するヒト化抗体の使用を含んでもよい。これらの抗体は標的分子に結合することができる。本発明において有用なヒト化抗体には、ヒトフレームワークと、標的となった細胞表面分子と特異的に反応する抗体、典型的にはマウス抗体に由来する1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)がある。YAL008-1-5F8、YAL008-51A10、およびYAL008-7-1A10のCDR配列のアミノ酸配列を図11に列挙した。

本発明において用いられる抗体がヒト化される場合、Queen et al.,(米国特許第6,180,370号)、Wright et al., 1992, Critical Rev. Immunol. 12(3,4): 125-168、およびこれらの中で引用された参照文献に記載のように、またはGu et al., 1997, Thrombosis & Hematocyst 77(4):755-759に記載のように、または当技術分野において公知のヒト化抗体を作製する他の方法を用いて抗体を作製することができる。Queen et al.に開示される方法は、一部は、アクセプターヒトフレームワーク領域をコードするDNAセグメントに取り付けられた、望ましい抗原に結合することができるドナー免疫グロブリンに由来する重鎖および軽鎖の相補性決定領域(CDR)をコードする組換えDNAセグメントを発現させることによって生成されるヒト化免疫グロブリンの設計に向けられている。一般的に言って、Queen特許の発明には、実質的に任意のヒト化免疫グロブリンを設計する応用性がある。Queenは、DNAセグメントが、典型的に、ヒト化免疫グロブリンコード配列に機能的に連結された、天然で結合しているプロモーター領域または異種プロモーター領域を含む発現制御DNA配列を含むことを説明している。発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーターシステムでもよい。または、発現制御配列は、原核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターにおける原核生物プロモーターシステムでもよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主は、導入されたヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、要望に応じて、ヒト化した軽鎖、重鎖、軽鎖/重鎖二量体もしくはインタクトな抗体、結合断片、または他の免疫グロブリン型の収集および精製が続いてもよい(参照により本明細書に組み入れられる、Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, 1979)。

当技術分野において周知の手順に従って、ヒト抗体、特に相補性決定領域(CDR)のDNA配列を単離することができる。好ましくは、ヒトCDR DNA配列は、国際公開公報番号WO1987/02671に記載のように不死化B細胞から単離される。本発明の抗体の生成において有用なCDRは、標的分子に結合することができるモノクローナル抗体をコードするDNAから同様に得られる場合がある。このようなヒト化抗体は、周知の方法を用いて、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ウサギ、または他の脊椎動物を含むが、これに限定されない、抗体を産生することができる任意の便利な哺乳動物供給源において作製することができる。定常領域およびフレームワークDNA配列に適した細胞ならびに抗体が発現および分泌される宿主細胞は、American Type Culture Collection, Manassas, VAなどの多数の供給源から入手することができる。

DKK2に対して反応する特異的抗体または抗体断片を作製する別の方法は、細菌内で発現させた免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーを、DKK2タンパク質またはペプチドを用いてスクリーニングすることを伴う。例えば、完全Fab断片、VH領域、およびFv領域を、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌内で発現させることができる。例えば、Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-546; Huse et al., Science, 1989, 246: 1275-1281;およびMcCafferty et al., Nature, 1990, 348: 552-554を参照されたい。このようなライブラリーを、例えば、DKK2ペプチドでスクリーニングすると、DKK2と反応する免疫グロブリン断片を同定することができる。または、SCID-huマウス(Genpharmから入手可能)を用いて、抗体またはその断片を生成することができる。

さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 1990, 348: 552-554に記載の技法を用いて作製した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 1991, 352: 624-628およびMarks et al., J Mol Biol, 1991, 222: 581-597は、それぞれ、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離について述べている。その後の刊行物は、鎖シャッフリング(chain shuffling)(Marks et al., BioTechnology, 1992, 10: 779-783)ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略である組み合わせ感染(combinatorial infection)およびインビボ組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 1993, 21: 2265-2266)による高親和性(nM範囲)ヒト抗体の生成について述べている。従って、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替法である。

DNAはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることによって改変されてもよく(米国特許第4,816,567号; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81: 6851)、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有結合によりつなげることによって改変されてもよい。典型的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインの代わりに用いられるか、第1の抗原に対して特異性を有する、ある抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を有するキメラ二価抗体を作り出すために、抗体の、ある抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられる。

機能的な抗体断片を生成するために様々な技法が開発されている。抗体断片は抗体の可変領域または抗原結合領域を含んでもよい。従来、これらの断片はインタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して得られた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, 24: 107-117およびBrennan et al., Science, 1985, 229: 81を参照されたい)。しかしながら、今では、組換え宿主細胞がこれらの断片を直接、産生することができる。例えば、抗体断片を、前述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Fab'-SH断片を大腸菌から直接、回収し、化学結合して、F(ab')2断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology, 1992, 10: 163-167)。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接、単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は当業者に明らかである。他の態様において、えり抜きの抗体は単鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185;米国特許第5,571,894号;および米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載のように、「直鎖抗体」でもよい。このような直鎖抗体断片は単一特異性または二重特異性でもよい。

抗体模倣物または「非抗体結合タンパク質」は、抗体可変領域用の代替タンパク質フレームワークとして非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドを用いることによって、アドネクチン(adnectin)、アビマー(avimer)、単鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチドミメティックを含む非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドを使用する(米国特許第5,260,203号;同第5,770,380号;同第6,818,418号および同第7,115,396号)。抗体と同じようにターゲティングし、標的に結合する他の化合物が開発されている。これらの「抗体模倣物」のいくつかは、抗体可変領域用の代替タンパク質フレームワークとして非免疫グロブリンタンパク質を使用する。抗体を、「抗体様結合ペプチドミメティック」(ABiP)と呼ばれる、さらに小さなペプチドミメティックに変えるための方法を使用することができる。抗体を、さらに小さなペプチドミメティックに変えるための方法論は抗体の代替物としても有用な場合がある(Murali et al. Cell Mol Biol, 2003, 49(2):209-216)。

多ドメインを含み「アビマー」と呼ばれる単鎖ポリペプチドである融合タンパク質が、ヒト細胞外受容体ドメインからインビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって開発された。「アビマー」は、様々な標的分子に対する親和性および特異性の点で抗体といくらか似ている結合タンパク質の一種である(Silverman et al. Nat Biotechnol, 2005, 23: 1556-1561)。結果として生じた多ドメインタンパク質は、単エピトープ結合タンパク質と比較して改善した親和性(場合によってはnM以下の)および特異性を示すことができる複数の独立した結合ドメインを含むことができる。アビマーの構築方法および使用方法に関する、さらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第20040175756号、同第20050048512号、同第20050053973号、同第20050089932号、および同第20050221384号に開示される。

非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、RNA分子および非天然オリゴマー(例えば、プロテアーゼ阻害物質、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣物)を含むが、これに限定されない化合物においても抗体特性が模倣されてきた。上記の化合物は全て本発明と使用するのに適している。これらは、特異性が合わせられた抗体を設計するための全インビトロ法を開発することによって、動物において抗体を開発する制約を回避することを目標とした。

当技術分野において公知のように、アプタマーは、特定の分子標的にしっかりと結合する核酸で構成される高分子である。TuerkおよびGold (Science, 1990, 249:505-510)は、アプタマーを選択するためのSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法を開示する。SELEX法では、核酸分子(例えば、1015個の異なる分子)の大きなライブラリーを生成する、および/または標的分子を用いてスクリーニングする。次いで、単離されたアプタマーを、標的結合および/またはアプタマー構造に寄与しない、あらゆるヌクレオチド(すなわち、コア結合ドメインまで切断されたアプタマー)を排除するようにさらに改良することができる。例えば、アプタマー技術の総説については、Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-1650を参照されたい。

本発明の抗DKK2抗体に関する「中和」という用語または「DKK2活性を中和する抗体」という句は、DKK2と結合または接触すると、DKK2によって誘導される、細胞増殖活性、癌の転移、癌細胞の浸潤または癌細胞の移動、Wntシグナル伝達、血管新生、腫瘍形成を促進する微小環境の確立が阻害される抗体を指すことが意図される。DKK2は細胞外に分泌され、癌細胞の増殖、移動、浸潤、および転移の必須の因子として機能するので、一部の抗DKK2抗体は、これらの活性を中和する可能性がある。本発明における中和抗体は、治療用途において、難治性疾患である癌および癌の転移を予防または処置するのに特に有用である。DKK2の過剰発現を特徴とする癌の転移を阻害するために、本発明における中和抗体は患者に投与されてもよいか、または細胞と接触されてもよい。

本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、少数の例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた競合的アッセイシステムおよび非競合的アッセイシステムが含まれるが、これに限定されない。このようなアッセイは日常的であり、かつ当技術分野において周知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 2002を参照されたい)。

併用療法
本明細書に記載の方法において同定された化合物は、癌を処置するのに有用な少なくとも1種類のさらなる化合物と組み合わされた場合でも本発明の方法において有用である場合がある。さらなる化合物は、本明細書において同定された化合物、または癌の症状および/もしくは転移を処置すること、阻止すること、もしくは減少させることが公知である化合物、例えば、市販の化合物を含んでもよい。

一局面において、本発明は、本発明において有用な作用物質は、治療用物質、例えば、化学療法剤、免疫療法剤、抗細胞増殖物質、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれに限定されない抗腫瘍剤と併用されてもよいことを意図する。例えば、以下の非限定的な例示的なクラスの任意の従来の化学療法剤が本発明に含まれる:アルキル化剤;ニトロソウレア;代謝拮抗物質;抗腫瘍性抗生物質;植物アルキロイド(alkyloid);タキサン;ホルモン剤;および多種多様な作用物質。

アルキル化剤は、細胞内に存在する条件下でアルキル基を多くの電気陰性基に付加し、それによって、DNA複製を妨害して癌細胞が複製するのを阻止する能力があるために、このように名付けられた。ほとんどのアルキル化剤は細胞周期非特異的である。特定の局面において、アルキル化剤は、DNA二重らせん鎖中のグアニン塩基を架橋結合することによって腫瘍成長を停止させる。非限定的な例には、ブスルファン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、塩酸メクロレタミン、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、およびウラシルマスタードが含まれる。

代謝拮抗物質は、細胞周期の合成(S)期の間にDNAに塩基が取り込まれないようにして正常な発生および分裂を阻止する。代謝拮抗物質の非限定的な例には5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、およびチオグアニンなどの薬物が含まれる。

抗腫瘍性抗生物質は一般的に、細胞分裂に必要な酵素を妨害することによって、または細胞を取り囲む膜を変えることによって細胞分裂を阻止する。このクラスには、DNA構造を破壊することによって細胞分裂を阻止するように働き、その機能を終わらせる、ドキソルビシンなどのアントラサイクリンが含まれる。これらの作用物質は細胞周期非特異的である。抗腫瘍性抗生物質の非限定的な例には、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンが含まれる。

植物アルカロイドは、有糸分裂を阻害するもしくは停止させるか、または細胞増殖に必要なタンパク質を細胞が生成するのを阻止する酵素を阻害する。頻繁に用いられる植物アルカロイドには、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。しかしながら、本発明は、これらの植物アルカロイドにのみ限定されると解釈してはならない。

タキサンは、細胞機能において重要な、微小管と呼ばれる細胞構造に影響を及ぼす。正常な細胞増殖において、微小管は、細胞が分裂を始めると形成されるが、細胞が分裂するのを停止すると、微小管は解体または破壊される。タキサンは微小管が分解するのを妨げ、その結果、癌細胞は微小管でかなり目詰まりするために増殖および分裂できなくなる。非限定的な例示的なタキサンにはパクリタキセルおよびドセタキセルが含まれる。

例えば白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫を含む、ある特定のタイプの癌のために、ホルモン剤およびホルモン様薬物が用いられる。ホルモン剤およびホルモン様薬物は、これらの有効性を高めるために他のタイプの化学療法薬物と用いられることが多い。性ホルモンは、女性ホルモンまたは男性ホルモンの働きまたは産生を変えるために用いられ、乳癌、前立腺癌、および子宮内膜癌の成長を遅らせるために用いられる。多くの場合、これらのホルモンの産生の阻害(アロマターゼ阻害物質)または働きの阻害(タモキシフェン)を療法の補助として用いることができる。他の何らかの腫瘍もホルモン依存性である。タモキシフェンは、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの活性を妨害するホルモン剤の非限定的な例である。

多種多様な作用物質には、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、L-アスパラギナーゼ、およびプロカルバジンなどの化学療法剤が含まれる。

化学療法剤の他の例には、以下の化学療法剤:ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロマファジン(chlomaphazine)、クロロホスファミド(chlorophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネストリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤(anti-adrenal)、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート(edatrexate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エフロルニチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK＠ラゾキサン;シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル(タキソーロ(TAXOLO)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)およびドキセタキセル(タキソテール(TAXOTERE)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害物質RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;ならびにカペシタビン、ならびにその薬学的に許容される塩、酸、および誘導体が含まれるが、これに限定されない。

抗細胞増殖物質はアポトーシス誘導物質または細胞傷害物質とさらに定義することができる。アポトーシス誘導物質は、グランザイム、Bcl-2ファミリーメンバー、チトクロムC、カスパーゼ、またはそれらの組み合わせでもよい。例示的なグランザイムには、グランザイムA、グランザイムB、グランザイムC、グランザイムD、グランザイムE、グランザイムF、グランザイムG、グランザイムH、グランザイムI、グランザイムJ、グランザイムK、グランザイムL、グランザイムM、グランザイムN、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の特定の局面において、Bcl-2ファミリーメンバーは、例えば、Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok、またはそれらの組み合わせである。

さらなる局面において、カスパーゼは、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-3、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-6、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-10、カスパーゼ-11、カスパーゼ-12、カスパーゼ-13、カスパーゼ-14、またはそれらの組み合わせである。特定の局面において、細胞傷害剤は、TNF-α、ゲロニン、プロジギオシン、リボソーム阻害タンパク質(RIP)、シュードモナス属(Pseudomonas)エキソトキシン、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素B、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)VacA、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)YopT、ビオラセイン(Violacein)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、イロフルベン、ジフテリア(Diptheria)毒素、ミトギリン(mitogillin)、リシン、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、サポリン6、またはそれらの組み合わせである。

免疫療法剤は、インターロイキン-2または他のサイトカイン、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)シグナル伝達阻害物質、例えば、PD-1に結合するモノクローナル抗体、イピリムマブでもよいが、これに限定されない。免疫療法剤はまた細胞傷害性Tリンパ球抗原A-4(CTLA-4)シグナル伝達もブロックすることができ、癌ワクチンおよび樹状細胞に基づく療法にも関連することができる。

免疫療法剤はさらに、サイトカイン処理によってまたは養子細胞療法および/もしくは造血幹細胞移植による外因性細胞の導入によって活性化および増殖されたNK細胞でもよい。養子細胞療法に適したNK細胞は、自己由来NK細胞のエクスビボ増殖、末梢血に由来する未刺激のもしくは増殖された同種異系NK細胞、末梢血および臍帯血に由来するCD34+造血前駆細胞、ならびにNK細胞株を含む様々な供給源から得ることができる。キメラ抗原受容体またはサイトカインを発現する遺伝子組換えされたNK細胞も本発明において意図される。本発明に有用な別の免疫療法剤は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が患者に投与される養子T細胞療法(ACT)に基づく剤である。投与されるT細胞は、主要組織適合性(MHC)に制限されないやり方で細胞表面抗原を認識する腫瘍特異的抗原受容体、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作することができる。または、投与されるT細胞は、MHC分子によって提示される細胞内抗原のエピトープを認識する従来のαβTCRでもよい。

薬学的組成物および製剤
本発明は、本発明の方法において使用するためのDKK2枯渇物質を含む薬学的組成物の使用を想定する。

このような薬学的組成物は、対象に投与するのに適した形をとる。または、薬学的組成物は、1種類もしくは複数種の薬学的に許容される担体、1種類もしくは複数種のさらなる成分、またはこれらの何らかの組み合わせをさらに含んでもよい。薬学的組成物の様々な成分は、当技術分野において周知のように、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わされて、生理学的に許容される塩の形で存在してもよい。

態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/day〜100mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。別の態様において、本発明を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/day〜500mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。

本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の身元(identity)、大きさ、および状態に応じて、さらに、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、組成物は0.1％〜100％(w/w)の活性成分を含んでもよい。

本発明の方法において有用な薬学的組成物は、吸入投与経路、経口投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、非経口投与経路、局部的投与経路、経皮投与経路、肺投与経路、鼻腔内投与経路、頬側投与経路、眼投与経路、くも膜下腔内投与経路、静脈内投与経路、または別の投与経路のために適宜開発されてもよい。他の意図される製剤は、射出されるナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する放出される赤血球、および免疫に基づく製剤を含む。投与経路は当業者に容易に明らかであり、処置されている疾患のタイプおよび重篤度、処置されている獣医学患畜またはヒト患者のタイプおよび年齢などを含む任意の数の要因に左右される。

本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、公知の任意の方法によって調製されてもよいか、または薬理学の分野において今後開発されてもよい。一般的に、このような準備方法は、活性成分を担体または1種類もしくは複数種の他のアクセサリー成分と結合させる工程、次いで、必要であれば、または所望であれば、生成物を望ましい1回用量単位または複数回用量単位に成型または包装する工程を含む。

本明細書で使用する「単位用量」は、活性成分の予め決められた量を含む、薬学的組成物の別々の量である。活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の投与量に等しいか、またはこのような投与量の便利な一部分、例えば、このような投与量の1/2もしくは1/3である。単位剤形は単回一日量用の単位剤形でもよいか、または、複数回一日量(例えば、1日につき約1〜4回またはそれ以上)のうちの1つの単位剤形でもよい。複数回一日量が用いられる場合、単位剤形は各用量について同じでもよいかまたは異なってもよい。

本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの倫理的投与に適した薬学的組成物に向けられるが、このような組成物は、一般的に、全種類の動物に投与するのに適していると当業者に理解される。組成物を様々な動物に投与するのに適するようにするために、ヒトに投与するのに適した薬学的組成物を改良することは良く理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者(veterinary pharmacologist)が、もしあれば普通の実験だけで、このような改良を設計および実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が意図される対象には、ヒトおよび他の霊長類、商業的に関連する哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌを含む哺乳動物が含まれるが、これに限定されない。

一態様において、前記組成物は1種類または複数種の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。一態様において、薬学的組成物は、治療的有効量のDKK2枯渇物質および薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は有用であり、グリセロール、水、食塩水、エタノール、ならびに他の薬学的に許容される塩溶液、例えば、リン酸および有機酸の塩を含むが、これに限定されない。これらの薬学的に許容される担体および他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991 , Mack Publication Co., New Jerseyに記載されている。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、または多価アルコール、例えば、マンニトールおよびソルビトールを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって可能になる。

製剤は、従来の賦形剤、すなわち、当業者に公知の経口投与、非経口投与、鼻投与、静脈内投与、皮下投与、経腸投与、または他の任意の適切な投与方法に適した、薬学的に許容される有機担体物質または無機担体物質と混合して用いられてもよい。製剤は滅菌されてもよく、所望であれば、補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色剤、着香剤、および/または芳香物質などと混合されてもよい。これらは、所望の場合、他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わされてもよい。

本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約0.005％〜2.0％の防腐剤を含んでもよい。防腐剤は、環境中の汚染物質に曝露された場合に劣化するのを防ぐために用いられる。本発明に従って有用な防腐剤の例には、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミドウレア(imidurea)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される防腐剤が含まれるが、これに限定されない。特に好ましい防腐剤は、約0.5％〜2.0％ベンジルアルコールおよび0.05％〜0.5％ソルビン酸の組み合わせである。

組成物は、好ましくは、化合物の分解を阻害する抗酸化物質およびキレート剤を含む。一部の化合物に好ましい抗酸化物質は、組成物の総重量に対して約0.01重量％〜0.3重量％の好ましい範囲にあるBHT、BHA、α-トコフェロール、およびアスコルビン酸、より好ましくは0.03重量％〜0.1重量％の範囲にあるBHTである。好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量に対して0.01重量％〜0.5重量％の量で存在する。特に好ましいキレート剤には、組成物の総重量に対して約0.01重量％〜0.20重量％の重量範囲にある、より好ましくは0.02重量％〜0.10重量％の範囲にあるエデト酸塩(例えば、エデト酸二ナトリウム)およびクエン酸が含まれる。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害な場合がある、組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。BHTおよびエデト酸二ナトリウムが、それぞれ、一部の化合物に特に好ましい抗酸化物質およびキレート剤であるが、他の適切なおよび等価な抗酸化物質およびキレート剤を、当業者に公知のように代用することができる。

投与/投薬
投与のレジメンは、有効量を構成するものに提供を及ぼす可能性がある。例えば、治療用製剤は、癌に関連する外科的介入の前もしくは後に、または患者が癌と診断された直後に患者に投与されてもよい。さらに、いくつかの分割投与量ならびに時間をずらした(staggered)投与量が毎日または連続して投与されてもよいか、または、用量は連続注入されてももしくは大量瞬時投与されてもよい。さらに、治療状況または予防状況の切迫した要件により示されるように、治療用製剤の投与量は比例して増加または減少されてもよい。

患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに対する本発明の組成物の投与は、公知の手順を用いて、患者において癌を処置するのに有効な投与量および期間で行うことができる。治療効果を実現するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性、投与時間、該化合物の排出速度、処置期間、該化合物と併用される他の薬物、化合物、または材料、疾患または障害の状態、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および前病歴などの要因、ならびに医学分野において周知の同様の要因に従って変化することがある。最適な治療応答を提供するように投与レジメンが調整されてもよい。例えば、いくつかの分割量が毎日投与されてもよいか、または、治療状況の切迫した要件により示されるように用量が比例して減少されてもよい。本発明の治療用化合物の有効な用量範囲の非限定的な例は約0.01〜50mg/体重kg/日である。当業者であれば、関連する要因を研究し、過度の実験なく治療用化合物の有効量に関する決定を下すことができるだろう。

化合物は、1日に数回もの頻度で動物に投与されてもよいか、または、1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回などの少ない頻度で、数ヶ月に1回もしくは1年に1回、またはそれ未満などのさらに少ない頻度で投与されてもよい。1日あたりに投薬される量の化合物が、非限定的な例では、毎日、1日おきに、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、または5日ごとに投与されてもよいことが理解される。例えば、1日おきに投与する場合、月曜日に1日あたり5mgの用量が開始し、水曜日に、その後の1日あたり5mgの第1の用量が投与され、金曜日に、その後の1日あたり5mgの第2の用量が投与されてもよい。投薬の頻度は当業者に容易に明らかであり、処置されている疾患のタイプおよび重篤度ならびに動物のタイプおよび年齢などがあるが、これに限定されない任意の数の要因に左右される。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性無く、特定の患者、組成物、および投与方法について望ましい治療応答を実現するのに有効な活性成分の量を得るように変えられてもよい。当技術分野において通常の知識を有する医師、例えば、内科医または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、内科医または獣医師は、望ましい治療効果を実現するために必要なレベルより少ないレベルで、薬学的組成物において用いられる本発明の化合物の投薬を開始し、望ましい効果が実現するまで投与量を徐々に増加させ得る。

特定の態様では、投与を容易にするために、および投与量を均一にするために化合物を投与単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する投与単位剤形とは、処置しようとする患者への単位投与として適した物理的に別個の単位を指す。それぞれの単位は、必要とされる薬学的ビヒクルに結合して望ましい治療効果を生じるように算出された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、(a)治療用化合物の独特の特徴および実現しようとする特定の治療効果によって、ならびに(b)患者における癌を処置するためのこのような治療用化合物を配合/製剤化する分野に固有の制約によって決定され、かつ(a)ならびに(b)に直接左右される。

投与経路
当業者は、投与のために複数の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも速やかでかつ効果的な反応を提供できることを認める。

本発明の任意の組成物の投与経路には、吸入投与、経口投与、鼻投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、経粘膜投与(例えば、舌下投与、舌投与、(経頬)頬側投与、(経尿道)尿道投与、腟投与(例えば、経腟投与および膣周囲投与)、(鼻腔内)鼻投与、ならびに(経直腸)直腸投与)、膀胱内投与、肺内投与、十二指腸内投与、胃内投与、くも膜下腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、動脈内投与、静脈内投与、気管支内投与、吸入投与、ならびに局部的投与が含まれる。適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルキャップ(gel cap)、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、散剤、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、硬膏剤、ローション、ディスク、坐剤、鼻投与用または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥散剤またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用だと考えられる製剤および組成物は、本明細書に記載の特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるはずである。

徐放製剤および薬物送達システム
本発明の薬学的組成物の徐放製剤または持続放出製剤は従来技術を用いて作製することができる。場合によっては、使用される剤形は、様々な比率で望ましい放出プロファイルをもたらすようにヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透析膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはそれらの組み合わせなどを用いて、剤形中の1種類または複数種の活性成分がゆっくりと放出されるもの、または徐放されるものとして提供することができる。本明細書に記載の徐放製剤を含む、当業者に公知の適切な徐放製剤は、本発明の薬学的組成物と使用するために容易に選択することができる。従って、徐放に合わせられた、経口投与に適した単回単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、ゲルキャップ、およびカプレットは本発明に包含される。

ほとんどの徐放薬学的製品には、非徐放対応物により成し遂げられるものと比べて薬物療法を改善するという共通の目的がある。理想的には、医学的処置の際に、最適に設計された徐放調製物を用いることは、最小限の原体を用いて、状態を最小限の時間で治癒または管理することを特徴とする。徐放製剤の利点には、薬物の活性が長期間にわたること、投与頻度が少ないこと、患者コンプライアンスが高いことが含まれる。さらに、徐放製剤を用いて、作用の開始時間、または薬物の血中濃度などの他の特徴に影響を及ぼすことができ、従って、副作用の発生に影響を及ぼすことができる。

免疫応答刺激
一態様において、本発明は、有効量のDKK2抗体またはその断片を薬学的に許容される担体と共に対象に投与する段階によって、抗腫瘍免疫を提供するための方法およびT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。

活性化Tリンパ球(T細胞)ならびに癌および感染症を処置するための免疫療法内での活性化Tリンパ球(T細胞)の使用は当技術分野において周知である(Melief et al., Immunol. Rev., 1995, 145: 167-177; Riddell et al., Annu. Rev. Immunol, 1995, 13:545-586)。本発明に開示されるように、DKK2が排除されるとCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が活性化され、腫瘍が抑制される。

CTL活性化に関するマーカーは、細胞毒、例えば、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシン、サイトカイン、IL-2、IL-4、CD25、CD54、CD69、CD38、CD45RO、CD49d、CD40L、CD137、CD134でもよいが、これに限定されない。本明細書の実施例のセクションに提示したように、試料中での、これらのマーカーのうち少なくとも1つのレベルの測定値を用いてCTL活性化を評価することができる。MoFloソーター(DakoCytomation, Fort Collins, Colo.)、FACSAria(商標)、FACSArray(商標)、FACSVantage(商標)、BD(商標)LSR II、およびFACSCalibur(商標)(BD Biosciences, San Jose, Calif)を含むが、これに限定されない様々な市販のセルソーターのどれを用いても、T細胞または一般的には本発明の任意の細胞を選別することができる。

血管新生
血管新生は、成長および発生においてならびに創傷治癒および肉芽組織形成において正常かつ極めて必要なプロセスである。血管新生の正常な調節は、血管の形成を誘導する因子と、このプロセスを休止させるまたは阻害する因子との微妙なバランスによって決定される。このバランスが破壊された場合に、通常、血管形成を増大させる病理学的血管新生という結果になる。病理学的血管新生は癌ならびに様々な虚血性疾患および炎症性疾患(例えば、心血管疾患)の顕著な特徴である。腫瘍は、血液が供給されないと、ある特定のサイズを超えて成長することも広がることもできないので、腫瘍血管新生を遮断することは抗癌療法における効果的なアプローチである。また、抗血管新生剤とも呼ばれる血管新生阻害物質の使用も、虚血性疾患および炎症性疾患の処置に関連するものとして当技術分野において公知である。本発明の一態様において、DKK2枯渇物質は、癌の成長を阻止するかまたは遅らせる血管新生成阻害物質である。別の態様において、DKK2枯渇物質は、虚血性疾患および炎症性疾患を予防または処置する抗血管新生剤である。炎症性疾患の非限定的な例は心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、および慢性関節リウマチである。

診断および処置
一態様において、本発明は、対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断する方法に関する。該方法は、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルを判定する工程を含み、正常対照DKK2発現のレベルと比較した場合のDKK2の発現レベルの増大が、対象が癌を有しているかまたは癌もしくは転移を発症する素因を有しているという指標である。

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において癌を処置するための免疫療法処置の有効性を判定するための方法に関する。該方法は、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2遺伝子の発現レベルを判定する工程を含み、正常対照におけるDKK2の発現レベルと比較した場合のDKK2の発現レベルの増大が、免疫療法処置が有効であるという指標である。本発明の一部の局面において、癌の処置は、固形腫瘍の処置、または転移の処置を含んでもよい。転移は、癌化細胞または悪性細胞が移動しており、癌をある部位から別の部位に広げている癌の一形態である。このような癌には、皮膚、乳房、脳、子宮頸部、精巣などの癌が含まれる。さらに具体的には、癌には、以下の臓器または系が含まれ得るが、これに限定されない:心臓、肺、胃腸、尿生殖路、肝臓、骨、神経系、婦人科学、血液学、皮膚、および副腎。さらに具体的には、本明細書の方法は、神経膠腫(シュワン腫、グリア芽細胞腫、星状細胞腫)、神経芽細胞腫、クロム親和細胞腫、パラガンリオーマ(paraganlioma)、髄膜腫、副腎皮質癌、腎臓癌、様々なタイプの血管癌、骨芽細胞型骨癌(osteoblastic osteocarcinoma)、前立腺癌、卵巣癌、子宮筋腫、唾液腺癌、脈絡叢癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、および巨核芽球性白血病を処置するのに使用することができる。皮膚癌には、悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カルポジ(Karposi)肉腫、黒子、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、および乾癬が含まれる。

関心対象の遺伝子(DKK2)の発現の対照標準量
本発明の方法は、対象に由来する生物学的試料におけるDKK2発現の測定量と、DKK2発現の対照量(すなわち、参照)を比較する工程を含む。

一態様において、DKK2発現の標準対照レベルは、健常対象におけるDKK2の発現のレベルを測定することによって得ることができる。好ましくは、健常対象は同様の年齢、性別、および人種の対象であり、どのタイプの重篤な疾患とも、特に、どのタイプの癌とも診断されたことがない。

別の態様において、DKK2の発現の対照量は、当技術分野において受け入れられているDKK2の発現の値である。この参照値は、標準的な統計方法を適用することによって、DKK2発現の平均値または中間値に基づいて対象群について算出されたベースライン値でもよい。

一態様において、発現レベルは、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって判定される。

本発明のある特定の局面において、DKK2の発現レベルは対象に由来する試料中で判定される。試料は、好ましくは、本明細書において引用された試料に加えて、腫瘍細胞、腫瘍細胞の周囲から出た任意の液体(すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など)、または腫瘍と生理学的に接触しているか、もしくは腫瘍の近くにある任意の液体、または他の任意の体液を含み、これらも本発明に含まれると考えなければならない。

測定方法
DKK2発現のレベルを判定するために当業者に公知の任意の方法を使用することができる。例えば、マイクロアレイを使用することができる。マイクロアレイは当技術分野において公知であり、配列の点で遺伝子産物(例えば、mRNA、ポリペプチド、その断片など)と一致するプローブを既知の位置に特異的にハイブリダイズまたは結合させることができる表面からなる。関心対象の少なくとも1つの遺伝子を検出するために、ハイブリダイゼーション試料は、試験試料を少なくとも1つの核酸プローブと接触させることによって形成される。DKK2を検出するための好ましいプローブは、DKK2 mRNAにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、完全長核酸分子またはその一部、例えば、長さが少なくとも10、15、もしくは20ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で適切な標的と特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでもよい。ハイブリダイゼーション試料は、核酸プローブが関心対象の標的に特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で維持される。特異的ハイブリダイゼーションは、適宜、高ストリンジェンシー条件下または中程度のストリンジェンシー条件下で行うことができる。好ましい態様において、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。次いで、特異的ハイブリダイゼーションが存在すれば、標準的な方法を用いて検出される。核酸プローブと、試験試料中の遺伝子との間に特異的ハイブリダイゼーションが起これば、核酸プローブに存在する配列は対象のmRNAにも存在する。複数の核酸プローブも使用することができる。スキャナーによって検出されたハイブリダイゼーション強度データは自動的に取得され、Affymetrix Microarray Suite(MASS)ソフトウェアによって処理される。150の標的強度を用いた発現レベルに対して生データが基準化される。少数の異なる遺伝子のmRNA発現プロファイルを測定する代わりの方法は、例えば、古典的なTaqMan(登録商標)Gene Expression AssaysまたはTaqMan(登録商標)Low Density Arrayマイクロ流体カード(micro fluidic card)(Applied Biosystems)のいずれかによる方法である。特に、本発明は好ましくはqPCRシステムを用いる。非限定的な例には、Bio-rad (Berkley, California)から市販されているPrimePCRPathways(登録商標)などの市販のキットが含まれる。

試料、特にmRNAの転写状態も、当技術分野において公知の他の核酸発現技術によって測定することができる。当業者に公知の任意の方法を用いて試料からmRNAを単離することができる。非限定的な例には、市販のキット、例えば、Qiagen(Netherlands)から市販されているRNeasy(登録商標)またはMolecular Research Center, Inc.(Cincinnati, Ohio)から市販されているMini Kit the TRI Reagent(登録商標)が含まれ、これらを用いてRNAを分離することができる。一般的に、単離されたmRNAは、当技術分野において公知の方法を用いて増幅することができる。例えば、PCRまたはRT-PCR法を用いた増幅システムが当業者に公知である。増幅技術の概要については、例えば、Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1995)を参照されたい。

mRNA発現をプロファイルするための別の正確な方法は、第一、第二、第三、ならびにそれに続く次世代の配列決定技術を含む次世代配列決定(NGS)の使用でもよい。

本発明の他の局面において、試料中のペプチドまたはポリペプチドの量を決定するための当技術分野において公知の全ての手段によって、ペプチド、ポリペプチドの量を決定すること、またはペプチド、ポリペプチドの生物学的活性を検出することができる。これらの手段は、様々なサンドイッチアッセイ形式、競合アッセイ形式、または他のアッセイ形式で標識分子を用いることができるイムノアッセイ装置および方法を含む。このようなアッセイは、ペプチドまたはポリペプチドの存在または非存在を示すシグナルを発する。さらに、シグナルの強さを、好ましくは、試料中に存在するポリペプチドの量と直接的または間接的(例えば、逆比例(reverse-proportional))に相関させることができる。さらに適切な方法は、ペプチドまたはポリペプチドに特有の物理的特性または化学的特性、例えば、その正確な分子量またはNMRスペクトルを測定する工程を含む。該方法は、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイと連結した光学装置、バイオチップ、分析装置、例えば、質量分析計、NMR分析器、またはクロマトグラフィー装置を含む。さらに、方法は、マイクロプレートELISAをベースとする方法、完全自動化イムノアッセイまたはロボットイムノアッセイ(例えば、Elecsys(商標)分析器で使用可能)、CBA(酵素コバルト結合アッセイ、例えば、Roche-Hitachi(商標)分析器で使用可能)、およびラテックス凝集アッセイ(例えば、Roche-Hitachi(商標)分析器で使用可能)を含む。

キット
本発明は、少なくともDKK2の検出に有用な、標識された(例えば、フルオレサー(fluorescer)、クエンチャーなど)、または標識されていない、一組の好ましい抗体を含む。

ある特定の態様において、キットが提供される。本明細書を考慮して、これらの方法において使用するための市販のキットが当業者に公知である。一般的に、キットは、関心対象のポリペプチドまたは核酸もしくはmRNAの存在を検出するのに適した検出試薬を含む。

別の態様において、プローブセットまたは抗体のパネルがある。一部の態様において、抗体のパネルは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和DKK2抗体を含む。一部の態様において、プローブセットのパネルは、DKK2レベルを検出し、癌診断または癌もしくは転移を発症する素因に関する情報を提供するように設計される。プローブセットは、特定のゲノムにおいて可能な限り多くのペプチドを検出することを目的としたプローブセットより小さく、かつ安価であるので特に有用である。本発明において、プローブセットは、癌遺伝子に関する情報を提供するポリペプチドの検出を対象にしている。プローブセットはまた、癌に関する情報を提供しないペプチドを検出する多数または少数のプローブを含んでもよい。このようなプローブは対照として、および基準化のために有用である(例えば、スパイクイン(spiked-in)マーカー)。プローブセットは乾燥した混合物でもよいか、または溶解した混合物でもよい。一部の態様において、プローブセットを固体支持体に取り付けて、プローブアレイを形成することができる。プローブは、抗体、または核酸(例えば、DNA、RNA、DNAおよびRNAの化学修飾型)、LNA(ロックド核酸)、またはPNA(ペプチド核酸)、または関心対象のペプチド配列もしくは核酸配列と特異的に相互作用することができる他の任意のポリマー化合物でもよい。

キットは、本質的に任意の試料(例えば、白血病の血液、腫瘍細胞、腫瘍組織など)中のペプチド(例えば、DKK2、既知の癌マーカー、免疫アクチベーター、もしくはアポトーシスタンパク質)または核酸配列を単離および/または検出するために設計できることが意図される。本明細書を考慮して多種多様な試薬および方法が当技術分野において公知である。

ここで、以下の実施例に関連して本発明を説明する。これらの実施例は例示目的のためだけに提供される。本発明は、これらの実施例に限定されると解釈してはならず、反対に、本明細書において提供される開示の結果として明らかになる任意および全てのバリエーションを包含すると解釈しなくてはならない。

これ以上説明することなく、当業者は、前述の説明と以下の説明に役立つ実施例を用いて、本発明の化合物を作製および使用することができ、クレームされた方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示し、決して、本開示の残りを限定すると解釈してはならない。

実施例1:遺伝子DKK2欠失はAPC ^Min/+ マウスにおけるの腫瘍量の減少につながる
APC^Min/+マウス(APCと名付けた)およびAPC^Min/+DKK2^-/-(APCKO)マウスを、特定の病原体が存在しない動物施設に収容した。DKK2の非存在下では、腫瘍数が少なくなり、サイズが小さくなったことで示されるように、腫瘍進行は有意に遅くなった(図1Aおよび図1B)。これに応じて、腫瘍によって誘導される異常、例えば、巨脾腫、胸腺萎縮、およびリンパ球減少症(You, S., et al., Int J Exp Pathol, 2006. 87(3): p.227-36)がAPCKOマウスでは有意に小さくなった。この現象は、高脂肪飼料および低脂肪飼料を与えた雄マウスおよび雌マウスの群において見られ、一貫性のある結果が得られた。まとめると、これらのデータから、DKK2の非存在下では結腸癌進行は有意に遅くなることが強く示唆される。いくつかの研究がDKK2を腫瘍細胞増殖の増大または減少と結び付けているので(Hirata, H., et al., Clin Cancer Res, 2009. 15(18): p.5678-87; Hauer, K., et al., Cancer Res, 2013. 73(2): p.967-77)、増殖を促進する潜在的な関与についてDKK2を試験した。この調査では、マウス結腸癌MC38細胞(Mayo Clinic)を24時間後に組換えDKK2(rDKK2)で処理し、次いで、細胞増殖に対する効果を、ATPliteキット(PerkinElmer)および血球計算器の両方を用いて測定した(図2)。データから、rDKK2はMC38細胞の増殖に影響を及ぼさないことが分かる。DKK2をDKK2中和抗体で中和してもMC38増殖は変化しなかった(示さず)。細胞増殖に関連するタンパク質であるKi67発現を対象にしたAPCマウスおよびAPCKOマウスの組織学的分析でも、腫瘍または正常領域の増殖に有意差は示されなかった。

実施例2:DKK2の欠如により他の白血球部分母集団またはマーカーに対する有意な影響なしでCD8 ⁺ 活性化が増大する
DKK2発現が正しい抗腫瘍免疫応答を与えるように腫瘍微小環境を変えることができるかどうか試験するために、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のレベルおよび抗腫瘍活性を分析した。APCマウスは、その腫瘍の性質のために、腫瘍領域を研究し、隣接する正常領域と比較するユニークな機会を与える。CD4のレベル、活性化マーカーおよびサイトカイン産生(IL-2、IFNg、TNFa、CD25、CD69、FoxP3)、細胞ならびにMDSCのいくつかの抑制特性(アルギナーゼおよびiNOS機能)の測定を含む分析からAPCマウス対APCKOマウスの差は示されなかった。パイエル板(PP)、脾臓、腸間膜リンパ節(MLN)、固有層、胸腺、および骨髄などの他の臓器も分析し、有意差は観察されなかった。

免疫系の主な抗腫瘍活性の1つには腫瘍反応性CD8⁺T細胞の細胞傷害活性が含まれる(Waldner et al., World J Gastroenterol, 2006. 12(45): p.7233-8)。CTLはMHCI内でコグネイト抗原を認識することによって腫瘍細胞を標的とし、gzmbなどの細胞傷害性化合物を放出する(Naito, Y., et al. Cancer Res, 1998. 58(16): p.3491-4)。セリンプロテアーゼであるgzmbが取り込まれると、標的細胞においてタンパク質分解によりカスパーゼが活性化され、Bidが切断され、DNAが断片化され、アポトーシスが誘導される(Thornberry et al., J Biol Chem, 1997. 272(29): p.17907-11; Heusel et al., Cell, 1994. 76(6): p.977-87)。APCマウスおよびAPCKOマウスにおけるTIL分析から、gzmb⁺およびCD69+(別のCD8+活性化マーカー)CD8細胞のパーセントが有意に増加することが明らかになった(図3A)。CD8⁺T細胞のいくつかのサブタイプは腸腫瘍に浸潤する。CD8ab⁺細胞には、最も顕著なgzmb発現の差があることが見い出された(データは示さず)。APCKOのCD8 TILにおけるgzmb発現の増加は、TUNELアッセイで検出された腫瘍中の高レベルのアポトーシス細胞と同時に起きる(図5)。APCマウスのリンパ系のさらなる分析から、18週齢で、PPのCD8⁺細胞における有意に高いgzmb発現のレベルが明らかになった(図3B)。ポリープがほとんど目に見えない11週齢マウスも、PPにおけるCD8⁺活性化について分析した。APCKOに由来するPPにおけるgzmb発現がAPCに由来するPPと比べて有意に増大したことが観察された(図4)。他のいくつかのリンパ臓器(すなわち、MLN、脾臓、および鼠径LN)もgzmb発現について分析したが、差は観察されなかった。

実施例3:腸非造血性DKK2はKOマウスにおいて主に表現型を担っている
DKK2は腸上皮細胞において発現していることが以前に報告された(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(28): p.11402-7)。DKK2が免疫/造血細胞ではなく腸上皮細胞において発現していることが、PP由来のCD8+活性低下の主な原因の一つである可能性があるかどうか判定するために、以下の2つの実験を行った。

(A)腸特異的コンディショナルDKK2.KOマウスの作製:DKK2-floxが導入されたマウスを作製し、APCマウスと交配したタモキシフェン誘導性ビリン-creマウスと交雑させた(子孫をAPC-V-KOおよびAPCと名付けた)。実際に、タモキシフェンで処置した11週齢APC-V-KOマウスのPP CD8細胞では、APCマウスと比較してgzmb発現およびCD69発現の増大が検出された(図7)。

(B)BM養子移入:免疫細胞におけるDKK2発現によってCD8⁺T細胞の活性が調節されるという可能性を除外するために、WT/KOマウスを放射線照射し、CD45.1⁺マウスからのBM養子移入を行った。APCKOマウスのPPのCD45.1⁺CD8⁺細胞におけるgzmb発現のレベルの増大(図6)は、DKK2供給源が非造血性であるという可能性と一致した。

実施例4:腸/結腸癌におけるDKK2ターゲティングは治療利益を有する
DKK2は分泌され、腫瘍量を減少させるために抗体(Ab)でターゲティングするのに適した候補である。DKK2は眼瞼の発生に重要であるが(Gage et al., Dev Biol, 2008. 317(1): p.310-24)、成獣マウスにおいて重要な機能があることは公知ではない。本発明は、開発された3つの新規のAbクローン(YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10、およびYAL008-71A10;図11)を開示する。これらのAbクローンはDKK2に対して高い特異性があるが、DKK1に対して特異性がなく(図8A)、DKK2を中和し、DKK2のWntアンタゴニスト機能を阻害する(図8B)。予備試験では、APCマウス(8週齢)にYAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10、YAL008-71A10、またはIgGを腹腔内注射した。8週間後に腸腫瘍を評価した。a-Dkk2 abで処置したマウスの腫瘍数および腫瘍体積が有意に減少したことと、腫瘍によって誘導される免疫異常が少なくなったことが観察された(図9Aおよび図9B)。この処置は体重にほとんど影響を及ぼさなかった。このことから、この処置は重大な副作用を誘導しない可能性があることが示唆される(図9C)。結果から、結腸癌マウスモデルにおいてDKK2全体が欠失すると腫瘍/ポリープが有意に小さくなることが分かる。これは、これらのマウスのPP CD8⁺細胞におけるgzmb発現の増大と同時に起きる(図10)。まとめると、これらの結果は、DKK2を標的としかつ中和することができ、かつと、APCマウスにおける腫瘍量を減少できる、機能的な抗体(Ab)が開発されたことが証明し、DKK2ターゲティングの治療用途の主な証拠となっている。このgzmb発現の差は、APCKOマウスにおいて腫瘍/ポリープ量を減少させる重要な主因の一つである。従って、本明細書において提示したデータは腸/結腸癌の進行におけるDKK2の重要な役割を強調している。

実施例5:結腸癌細胞移植マウスモデルにおけるDKK2ターゲティングによってDKK2が腫瘍挙動および微小環境の調節のための重要なプレーヤーであることが示される
MC38細胞はC57BLマウスのマウス結腸癌に由来し、免疫応答性WT C57BLマウスに移植されると非常に速く進行する。従って、この異種移植片モデルは、高悪性度の進行性腫瘍モデルに代わる良い手段として役立つ。これを用いて、進行癌を処置するa-Dkk2 Abの治療能力を試験することができる。ある研究では、C57BLマウス(n=5/群)にMC38細胞を移植した。6日後に、マウスを、腹腔内(IP)経路を介して、8mg/kgのマウスIgGまたはa-Dkk2 Ab(YAL008-1-5F8)で処置した。図13Aは、YAL008-1-5F8が腫瘍成長を有意に阻害することを示す。腫瘍切片の免疫染色から、YAL008-1-5F8は腫瘍細胞アポトーシスおよびグランザイムB陽性細胞を増大させることが明らかになる(図13B)。重要なことに、これらの移植腫瘍に浸潤した白血球のフローサイトメトリー分析から、CD45、NK、CD8⁺、骨髄系細胞、またはCD4の数に差が無いことが分かったが、YAL008-1-5F8で処置すると、グランザイムB陽性NK細胞およびCD8⁺細胞を含むグランザイムB陽性CD45陽性白血球が有意に増大した(図14)。これらの結果は、DKK2を中和すると、エフェクター免疫細胞の調節を伴う機構を介して腫瘍形成が抑制される遺伝子モデル研究と一致する。

図15は、MC38細胞を用いた同種異系移植片モデルにおいて、抗DKK2抗体で長期間処置すると腫瘍形成がさらに低下したことを示す。さらに、この抗体は腫瘍形成の抑制について用量依存的な効果を示す。抗体(YAL008-1-5F8)で処置した腫瘍においてグランザイムB陽性細胞および腫瘍細胞アポトーシスが増大したことに加えて、長期間にわたって処置するとCD8⁺T細胞が増大し、腫瘍の血管新生および増殖が低下する(図16)。

実施例6:進行性結腸直腸癌モデルにおけるDKK2ターゲティング
APCマウスは最も確立しているマウスモデルの1つであるが、そのポリープは、めったに癌腫に変わることはない。ポリープだけでなく腫瘍を発症する、さらに強い発癌性変異をもつ結腸癌モデルにおいてDKK2ターゲティングを研究するために、いくつかのマウス系統:C57BL/6APC^tm1TyJ/Jマウス、B6.129S4-Kras^tm4Tyj/Jマウス、およびビリン-CreER2マウスを交配する。5週齢でタモキシフェンを注射する。9週間の時点で18週間まで72時間ごとに、3つのマウス群(n=5)を200ugのYAL008-1-5F8/YAL008-5-1A10/IgGで処置する。

マウスの腸を固定し、FACS分析および腫瘍量の評価のためにPPを単離する。脾臓、胸腺、および血液も収集して、リンパ球減少症(B/T細胞)について分析する。腫瘍を評価した後に、組織学的に評価するために腸を処理する。結果は、YAL008-1-5F8で処置したマウスおよびYAL008-5-1A10で処置したマウスでは、IgGで処置したマウスと比較して腫瘍数および腫瘍体積の減少を示すはずである。さらに、PPのCD8細胞におけるgzmbレベルの上昇が検出された。

実施例7:確立されたポリープおよび腫瘍を有するAPCマウスにおけるDKK2ターゲティング
200ugのYAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10、またはIgGを用いて、購入した16週齢APCマウス(完全に発症したポリープ/腫瘍)に対して5週間、72時間ごとに処置を行う。エンドポイント日に、前の実施例7で述べたようにデータを収集する。a-DKK2 Abで処置したマウスの腫瘍量(数および体積)の有意な減少が観察されるはずである。これらのPP CD8細胞において高レベルのgzmbも検出されるはずである。

実施例8:腫瘍成長を促進するDKK2の供給源の調査
腫瘍形成における、腫瘍により生成されたDKK2の役割を調べるために、一方のマウス群にDKK2-shRNA-MC38細胞を注射し、他方のマウス群に対照-ShRNA-MC38細胞を注射する。DKK2 shRNAによってDKK2発現は半分を超えて低下する(図17、左パネル)。移植片モデルにおける腫瘍形成はDKK2-shRNA-MC38細胞の方が対照-ShRNA-MC38細胞より有意に遅くなる(図17、真ん中のパネル)。重要なことに、DKK2-shRNA-MC38細胞を移植した腫瘍ではグランザイムB陽性細胞およびアポトーシス細胞が増大している(図17、右パネル)。

宿主に由来するDKKの役割を調べるために、本発明者らはMC38細胞をWT C57BLマウスまたはDKK2ヌルC57BLマウスに移植した。図18は、DKK2ヌルマウスでは腫瘍がゆっくりと形成することを示す。さらに、DKK2ヌルマウスに移植した腫瘍ではグランザイムB⁺細胞およびアポトーシス細胞が増大している。

まとめると、これらのデータから、腫瘍細胞により生成されたDKK2と、宿主により生成されたDKK2は両方とも腫瘍成長を支えるのに重要なことが分かる。

実施例9:YAL008-1-5F8で処置したAPCマウスにおける腫瘍量の減少におけるT細胞の役割
本明細書に記載の結果から、APCKOマウスおよびYAL008-1-5F8で処置したAPCマウスにおいて腫瘍量が著しく減少したことには、APCKOマウスの腫瘍およびYAL008-1-5F8で処置したマウスのPPにおける高レベルのgzmb発現が伴ったことが以前に分かっている。腫瘍があまり誘導されなかったので、T細胞がこのような現象を担っているのかどうか、または多量のgzmbが検出されるのかどうか調べるために、抑制T細胞が無いマウスを使用する。Rag2欠損マウスをAPCマウスと交配する。T/B細胞ノックアウトAPCマウス(n=5)をYAL008-1-5F8またはIgGで8週間、処置する。エンドポイント日に、マウスを安楽死させ、腫瘍量を研究する。これらの2つの群の腫瘍量に有意差は検出されないはずである。従って、DKK2の欠如は、腸腫瘍に浸潤し、癌細胞を死滅させるT細胞における多量のgzmb発現の原因となる。

実施例10:T細胞活性化の調節におけるDKK2の役割
DKK2がT細胞のgzmb発現に直接影響を及ぼしているのかどうか、またはその発現を調節する他の細胞/因子に影響を及ぼしているのかどうか分かっていることは重要である。この問題を研究するために、ナイーブCD8⁺T細胞を脾臓、MLN、iel、およびPPから単離する。これらの細胞を、培地中にrDKK2およびrWnt3aを含むかまたはrDKK2およびrWnt3aを含まないCD3/CD28コーティングプレートにおいてインキュベートする。初期段階活性化に相当する48時間後と、中期段階活性化に相当する72時間後に、試料を収集し、FACSでgzmb発現について分析する。長期インキュベーションでrDKK2が生理活性を失うので、48時間で、さらなる用量のrDKK2をウェルに投与する。rDKK2を培地に添加したら、gzmb発現の減少が検出されるはずである。このことは、DKK2がgzmb発現に直接影響を及ぼしているという考えを裏付けている。

実施例11:腫瘍量の調節における上皮内リンパ球細胞(iel)の役割:rDKK2およびYAL008-1-5F8の存在下および非存在下でのielの死滅能力
CD8細胞におけるgzmb発現の増大は、その細胞傷害能力および抗腫瘍特性と強い相関関係がある。本発明を含むいくつかの研究から、ielは実際に結腸癌細胞を死滅できることが分かっている(Arvonen et al., Clin Exp Rheumatol, 2010, 28(1): p.128-34; Ebert Immunology, 2009. 127(2): p.206-15; Di Sabatino et al. Gut, 2006, 55(4): p.469-77; Lundqvist et al., J Immunol, 1996. 157(5): p.1926-34; Melgar et al., Immunology, 2002. 106(4): p.476-85およびNussler et al., Langenbecks Arch Surg, 2000. 385(3): p.218-24)。今までに、本明細書において開示された結果から、APCKOのCD8⁺Tilにおいてgzmb発現が特に上昇しており、これらの細胞の供給源は腸の上皮内リンパ球である可能性があることが分かっている。これらの細胞の表現型は、高度なgzmb⁺であり、CD69⁺ 95％超であるのでielの表現型と一致し、かなりのCD4⁺CD8⁺集団(活性化CD4⁺ielの顕著な特徴)が観察された(Pahar et al., Eur J Immunol, 2006. 36(3): p.583-92)。

DKK2またはその阻害がielの死滅能力を直接調節できるかどうか研究するために、11週齢APCマウスに由来するCD8⁺ielをFACSによって選別し、10:1および5:1のE:T比で10K MC38細胞とインキュベートする。DKK2がielの死滅能力に直接影響を及ぼすことができるかどうか調べるために、rDKK2(15nM)およびYAL008-1-5F8/IgG(3nM)を培地に添加する。24時間後に、MC38細胞をFACSでアネキシンV染色およびPI染色について分析する。この実験を3回繰り返す(毎回、n=3)。YAL008-1-5F8で処理した細胞では死滅が増大し、DKK2で処理したウェルでは死滅が減少するはずである。この実験を、APCマウスに由来するAPC10.1細胞に対しても行う(De Giovanni et al., Int J Cancer, 2004, 109(2): p.200-6)。同様の結果が得られるはずである。ielの細胞傷害機能におけるgzmbの役割を保証するために、gzmb阻害物質(例えば、25〜100uMのZ-AAD-CMK(Biovision, CA))を添加する。

実施例12:腫瘍量の調節におけるielの役割:APC/APCKOおよびAPC/APC-V-KOに由来するielの死滅能力
11週齢のAPC/APCKOマウスおよびAPC/APC-V-KOマウスに由来するCD8⁺ielのCTL活性を比較するために、これらをFACSで選別する。マウスは年齢/性別が一致する同じカゴの同腹子である。本明細書中の実施例11において前述したようにこの実験を行う。APCKOマウスまたはAPC-V-KOマウスのielの高い細胞傷害能が検出されるはずである。24週齢APC/APCKOマウスおよびAPC/APC-V-KOマウスのTil CD8を用いた同様の実験も行う。この実験では、腸腫瘍を注意深く収集し、消化した後に、FACSでCD8細胞を選別する。腫瘍は非常に小さいので、1群につき2匹のマウスをプールする。この実験のために、5:1のE:T比を用いる。

実施例13:CD8細胞中のgzmbの調節におけるWntシグナル伝達の役割
多くの研究がWntシグナル伝達をT細胞機能と結び付けており、記憶細胞におけるWntシグナル伝達に特に注目すべきものである(Xue and Zhao Ann N Y Acad Sci, 2012. 1247: p.16-33; Jeannet et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(21): p.9777-82; Barker et al., Adv Cancer Res, 2000. 77: p.1-24およびZhou et al., Immunity, 2010. 33(2): p.229-40)。DKK2のWntアンタゴニスト特性はgzmbの下方制御を担っている可能性がある。gzmb発現の調節におけるWntの役割を調べるために、LRP5/6 KOマウスに由来するナイーブ胸腺CD8⁺T細胞を、ビーズを用いて選別し、Wntシグナル伝達が無い細胞を選択する。次いで、細胞をCFSEで標識し、11週齢のAPCマウスおよびAPC-v-KOマウス(同じカゴの仲間/同腹子)にi.v.注射する。以前の結果から、PPに移動した、注射したナイーブ細胞は、注射して24〜96時間後にgzmbを産生し始めることが分かっているので、48時間後にPPを収集し、CFSE+細胞におけるgzmbのレベルをFACSで測定する。LRP5/6 KO T細胞はWntリガンドに応答することができないので、APC/APC-v-KOマウスにおいてgzmb発現の差を示さないはずである。従って、本明細書において提示した結果から、CD8⁺細胞におけるgzmb発現のDKK2低下はWntシグナル伝達が阻害されたことに起因する可能性があることが証明されるはずである。

実施例14:癌療法のためのDKK2、および癌免疫療法を改善するための抗DKK2の使用
本発明は結腸癌におけるDKK2の役割を開示する。本明細書において提示したデータは、結腸癌の促進におけるDKK2の重大な、かつ認められていない役割に関する強力な、かつ説得力のある論拠を提供する。さらに、本発明に示したように、gzmb調節におけるDKK2の役割も全く予想外のことである。従って、結腸癌におけるDKK2発現の調節は患者に新たな治療選択肢を提供する道を開く。APC/APCKOマウスへの様々なノックアウトT細胞の養子移入と、腫瘍量を研究するための老化が進んでいるAPC/APC-V-KOマウスの使用を含む、いくつかの実験が進められている。DKK2中和は腫瘍発達を停止させるように見えないが、TILにおいてgzmb発現を増大させる可能性があるという事実があるために、100％有効ではなかった癌ワクチンまたは他の免疫療法を改善するための優れたツールとなる。本発明において示したように、結腸癌処置におけるMUC1ワクチンおよびPD-1ターゲティングを改善するなど癌免疫療法を改善するには、DKK2に対する抗体を使用することが理想的である。

実施例15:DKK2抗体は同種異系移植片モデルにおいて肺腫瘍形成を抑制する
マウスLLC肺癌細胞をC57BLマウスに移植し、抗DKK2抗体(YAL008-1-5F8)で処置した。この抗体は、グランザイムB陽性細胞およびアポトーシス腫瘍細胞の増大を伴って腫瘍形成を抑制した(図19)。

実施例16:NK細胞活性化に対するDKK2およびWntの効果
ヒトNK細胞株NK-92および脾臓由来初代マウスNK細胞およびMC38移植腫瘍を、DKK2、Wnt3a、Wnt5A、およびDKK1の組換えタンパク質の存在下または非存在下で、ならびにWnt阻害物質(LGK-974を含む)およびGSK阻害物質(CHIR99021を含む)の存在下または非存在下でグランザイム発現および細胞傷害活性について試験した。このように、DKK2およびWntによるNK細胞活性化の調節を評価することができる。

実施例17:DKK2抗体はPD-1抗体と関連付けた場合に腫瘍形成を最適に抑制する
C57BLマウス(n=5/群)にLLC細胞またはMC38細胞を移植した。6日後に、16mg(8mg/抗体)/kgのマウスIgG、a-Dkk2抗体(YAL008-1-5F8)および/またはPD-1抗体を用いて腹腔内(IP)経路を介してマウスを処置した。腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の効果をPD-1抗体と比較した(Cancer Res. 2005 Feb 1;65(3): 1089-96)。LLC同種異系移植片肺腫瘍モデルでは、腫瘍妨害に対するYAL-008-1-5F8の効果はPD-1抗体の効果とほぼ同じであり、YAL-008-1-5F8抗体およびPD-1抗体の組み合わせはPD-1抗体単独より大きな腫瘍進行抑制を示した(図20A)。マウス生存率に対するYAL-008-1-5F8の効果はPD-1抗体の効果とほぼ同じであり、YAL-008-1-5F8抗体およびPD-1抗体の組み合わせはPD-1抗体単独の使用と比べて生存率を増加させた(図20B)。図20Cは、単独で投与された場合の、または他の抗体と組み合わせて投与された場合の、MC38結腸癌モデルにおける腫瘍形成に対するYAL-008-1-5F8の比較効果を図示する。このMC38モデルではPD-1抗体は腫瘍形成に有意な効果を示さなかった。

本明細書において引用された全ての特許、特許出願、刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、特定の態様に関連して開示されたが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることが意図される。

Claims (21)

1. SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2エピトープを標的とする中和ディコップ2(Dickkopf2)(DKK2)抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む、癌を処置するための医薬。
2. SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2エピトープを標的とする中和ディコップ2(DKK2)抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む、血管新生を処置するかまたは減少させるための医薬。
3. 前記血管新生が、癌に関連した腫瘍血管新生である、請求項2に記載の医薬。
4. 前記血管新生が、虚血性疾患および炎症性疾患に関連した病理学的血管新生である、請求項2に記載の医薬。
5. 前記血管新生が心血管疾患に関連する、請求項2に記載の医薬。
6. 前記癌が、腺腫様大腸ポリポーシス(adenomatosis polyposis coli)(APC)変異を発現する細胞を含む腫瘍を含む、請求項1または3に記載の医薬。
7. 前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、および食道癌からなる群より選択される、請求項1、3、または6に記載の医薬。
8. 前記癌が転移性である、請求項1、3、6、または7に記載の医薬。
9. 前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬。
10. 前記DKK2抗体が、YAL008-1-5F8(SEQ ID NO:10および11)、YAL008-5-1A10(SEQ ID NO:8および9)、ならびにYAL008-7-1A10(SEQ ID NO:12および13)からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む合成抗体である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬。
11. 化学療法剤、抗細胞増殖物質、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるさらなる作用物質を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の医薬。
12. 前記さらなる作用物質がプログラム細胞死1(programmed cell death 1)(PD-1)抗体である、請求項11に記載の医薬。
13. 前記DKK2抗体および前記さらなる作用物質を同時投与するために用いられる、請求項11または12に記載の医薬。
14. 前記DKK2抗体および前記さらなる作用物質が同時投与用に一緒に製剤化される、請求項11または12に記載の医薬。
15. 吸入、経口、直腸、腟、非経口、局部的、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、くも膜下腔内、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される経路を介した投与用の、請求項1〜14のいずれか一項に記載の医薬。
16. SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDDK2エピトープを標的とする中和ディコップ2(DKK2)抗体ならびに薬学的に許容される担体を含む、対象において細胞集団または組織に対するCD8 ⁺ 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を刺激するための医薬。
17. 前記DKK2抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、重鎖抗体、ヒト抗体、およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される抗体を含む、請求項16に記載の医薬。
18. 前記DKK2抗体が、5F8のアミノ酸配列(SEQ ID NO:10および11)ならびに1A10のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8、9、12、および13)の少なくとも1つを含む合成抗体である、請求項16または17に記載の医薬。
19. SEQ ID NO:1、5、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和ディコップ2(DKK2)抗体を含む、癌を処置するための、血管新生を処置するかまたは減少させるための、対象において細胞集団または組織に対するCD8 ⁺ 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を刺激するための、あるいは対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断するための、組成物。
20. 対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断するためのキットであって、DKK2タンパク質を検出するための試薬およびDKK2タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬からなる群より選択される試薬を含み、該試薬が、SEQ ID NO:1、5および7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むDKK2エピトープを標的とする中和DKK2抗体を含む、キット。
21. 前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、および食道癌からなる群より選択される、請求項20に記載のキット。

Images