JP6795765B2 - 細胞膜穿孔用容器およびこれを用いた細胞膜穿孔方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば細胞膜を穿孔するための穿孔体を備える細胞膜穿孔用容器およびこれを用いた細胞膜穿孔方法に関する。

近年、再生医療分野の発展に伴い、細胞内に目的物質を導入する技術の重要性が高まっている。従来、このような物質導入技術として、ウイルスベクター法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が知られる。ウイルスベクター法においては、不特定の細胞群に目的物質を導入することができ、エレクトロポレーション法は、比較的容易な方法として広く用いられている。マイクロインジェクション法は特定の細胞にのみ穿孔を形成するものである。

特開２００１−５２３７２５号公報

しかしながら、ウイルスベクター法は細胞のがん化の可能性が指摘されており、エレクトロポレーション法においては穿孔後の細胞の生存率の低さが問題となっている。また、マイクロインジェクション法においては作業効率が悪いという欠点を有する。

本発明は、前述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とすることは、細胞の生存率が高く、かつ、細胞内への目的物質導入における作業効率の高い細胞膜穿孔用容器およびこれを用いた細胞膜穿孔方法を提供することである。

この発明は、第１の発明と第２の発明とを有する。
第１の発明は、可撓性材料で形成される第１袋体と、可撓性材料で形成されるとともに前記第１袋体に積層される第２袋体と、を備え、前記第１袋体は、その内部と外部とを連通可能な第１連通口と、前記第２袋体に対向する第１内面と、その反対側に位置する第１外面と、前記第１内面に設けられた第１開口部とを有し、前記第２袋体は、その内部と外部とを連通可能な第２連通口と、前記第１袋体に対向する第２内面と、その反対側に位置する第２外面と、前記第２内面に設けられた第２開口部とを有し、前記第１袋体および前記第２袋体は、前記第１開口部および前記第２開口部に設けられるとともに、液体が透過可能であり、かつ、細胞が透過不能なメッシュサイズを有する細胞担持フィルタを介して連通し、前記第２外面の内側には、前記細胞担持フィルタに対向する位置に細胞に穿孔可能な穿孔体を備え、前記穿孔体は、前記第２外面に接合されるベース部と、前記ベース部から前記細胞担持フィルタに向かって突出する複数の突起部とを備え、前記突起部には細胞膜に対する酸化処理手段を備えることを特徴とする。

前記第１の発明において、前記酸化処理手段は光増感剤であり、前記第１袋体は、光透過性であってもよい。

前記第１の発明において、前記穿孔体は、前記第２外面から前記細胞担持フィルタに向かって押圧されるとともに、前記細胞担持フィルタよりも前記１外面側に、押圧力を分散するための圧力分散手段を備えてもよい。

第２の発明は、 可撓性材料で形成される第１袋体と、可撓性材料で形成されるとともに前記第１袋体に積層される第２袋体と、を備え、前記第１袋体は、その内部と外部とを連通可能な第１連通口と、前記第２袋体に対向する第１内面と、その反対側に位置する第１外面と、前記第１内面に設けられた第１開口部とを有し、前記第２袋体は、その内部と外部とを連通可能な第２連通口と、前記第１袋体に対向する第２内面と、その反対側に位置する第２外面と、前記第２内面に設けられた第２開口部とを有し、前記第１袋体および前記第２袋体は、前記第１開口部および前記第２開口部に設けられるとともに、液体が透過可能であり、かつ、細胞が透過不能なメッシュサイズを有する細胞担持フィルタを介して連通し、前記第２外面の内側には、前記細胞担持フィルタに対向する位置に細胞に穿孔可能な穿孔体を備え、前記穿孔体は、前記第２外面に接合されるベース部と、前記ベース部から前記細胞担持フィルタに向かって突出する複数の突起部とを備え、前記突起部には細胞膜に対する酸化処理手段を備える細胞膜穿孔用容器を用いた細胞膜穿孔方法であって、複数の細胞を含む細胞培養液を前記第２袋体に前記第２連通口から注入する工程と、前記細胞担持フィルタに前記穿孔体を押圧し、細胞に穿孔を形成する工程とを含むことを特徴とする。

前記第２の発明は、前記酸化処理手段は光増感剤であり、前記細胞担持フィルタに前記穿孔体を押圧させた状態で前記穿孔体に光刺激を供給する工程を含むことを特徴とする。

前記第２の発明は、前記穿孔体は、光透過性であり、前記光刺激は、前記穿孔体を介して供給されるものであってもよい。

本発明において、細胞担持フィルタで細胞を保持し、これに穿孔体を押圧するだけで複数の細胞への穿孔の形成が可能となり、作業効率の向上が可能である。また、穿孔体により形成された穿孔は細胞自身の修復力により閉じられるので、細胞の高い生存率を維持することが可能である。

細胞膜穿孔用容器の斜視図 図１の細胞膜穿孔用容器の分解組立図 図１の細胞膜穿孔用容器のＩＩＩ−ＩＩＩ線断面図であってその概要を示す図 穿孔体の部分拡大図 実験例において撮影された本願発明にかかる実施形態の画像および画像処理した画像 実験例において撮影された対照実験にかかる画像および画像処理した画像

図１〜図３は本発明の細胞膜穿孔用容器の一実施形態を示したものである。なお、図３は図１のＩＩＩ−ＩＩＩ線断面図であるが、分かりやすいように厚さ寸法を大きく示しており、図１および図２の寸法関係とは相違する。
細胞膜穿孔用容器１は、重ねて配置される第１袋体１０と第２袋体２０とを含む。第１袋体１０は、光透過性の可撓性材料で形成され、その内部と外部とを連通可能な第１連通口１１と、第２袋体に対向する第１内面１２と、その反対側に位置する第１外面１３と、第１内面１２の中央近傍に設けられた第１開口部１４とを有する。第１内面１２と第１外面１３とは、その周囲において水密に固着される。

同様に第２袋体２０は、光透過性の可撓性材料で形成され、その内部と外部とを連通可能な第２連通口２１と、第１袋体１０に対向する第２内面２２と、その反対側に位置する第２外面２３と、第２内面２２の中央近傍に設けられた第２開口部２４とを有する。第２内面２２と第２外面２３とは、その周囲において水密に固着される。これら固着は、例えば熱溶着や接着剤を用いた接着により実現可能である。

第１内面１２、第１外面１３、第２内面２２、第２外面２３として、例えばポリエチレン（ＰＥ）やエチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）などの樹脂やこれらの組み合わせ材料を用いることができる。

第１内面１２および第１外面１３と、第２内面２２および第２外面２３とは、略矩形の同形同大であり、その矩形の一辺に第１連通口１１および第２連通口２１がそれぞれ設けられる。第１連通口１１および第２連通口２１にはコネクタ１５，１６がそれぞれ水密に接続され、コネクタ１５，１６にはキャップ１７，１８が取り付けられている。このコネクタ１５，１６を介して第１袋体１０および第２袋体２０において、その内部と外部とが連通可能である。具体的には、キャップ１７，１８を外したコネクタ１５，１６にシリンジ先端を取付け、シリンジによって第１袋体１０または第２袋体２０に液体または気体を注入することができる。また、シリンジを用い減圧することによって第１袋体１０または第２袋体２０の液体または気体を吸引することができる。なお、この実施形態において第１袋体１０および第２袋体２０の加圧および減圧にはシリンジを用いているが、これに限定されるものではなく、加圧および減圧が可能なものであればよい。

コネクタ１５，１６は、第１袋体１０および第２袋体２０の積層方向において、重ならない位置に設ける。このように重ならないようにすることによって、例えば一方のコネクタにシリンジを接続して注入・吸引をする際に、他方のコネクタが作業の妨げになるのを予防することができる。

第１袋体１０と第２袋体２０とは、第１開口部１４および第２開口部２４が互いに対向して積層される。これら第１開口部１４および第２開口部２４の間には細胞担持フィルタ３が設けられ、この細胞担持フィルタ３を介して第１袋体１０と第２袋体２０とが連通する。細胞担持フィルタ３は、第１開口部１４および第２開口部２４の直径よりも大きい。細胞担持フィルタ３は、第１袋体１０に対向する面において、その端部が、第１内面１２の第１開口部１２周縁と水密に固着される。同様に第２袋体２０に対向する面において、その端部が、第２内面２２の第２開口部２２周縁と水密に固着される。さらに、細胞担持フィルタ３の周囲において第１内面１２と第２内面２２とが水密に固着される。

細胞担持フィルタ３は、液体が透過可能であり、かつ、細胞が透過不能なメッシュサイズを有する
第２袋体２０の第２外面２３の内側には、細胞担持フィルタ３に対向する位置に細胞に穿孔可能な穿孔体４を備える。穿孔体４は、光透過性であり、より具体的には透明な材料により構成されることが望ましい。図４を併せて参照すれば、穿孔体４は、第２外面２３に接合されるベース部４１と、ベース部４１から細胞担持フィルタ３に向かって突出する複数の突起部４２とを備え、突起部４２には細胞膜に対する酸化処理手段を備える。突起部４２は、直径約０．３〜１μｍ、高さ約０．３〜２μｍ、ピッチ約０．３〜３μｍに設定することができる。

上記のような細胞膜穿孔用容器１を用いた細胞膜穿孔方法について説明する。この実施形態では酸化処理手段として光増感剤を用いる。具体的には、穿孔体の突起部４２に光増感剤を含ませたものを用いる。細胞膜穿孔用容器１は、滅菌したものを用いるとともに、少なくともキャップ１７，１８を外しておこなう作業は、例えばクリーンルーム等において滅菌状態でおこなう。なお、当該作業を滅菌状態でおこなうか否かは目的に応じ適宜選択可能である。

細胞培養培地中に、細胞と導入しようとする目的物質とが含まれる細胞分散液を、第２袋体２０に注入する。具体的には、細胞分散液をシリンジに充填し、このシリンジ先端をキャップ１８を外したコネクタ１６に接続して、細胞分散液を第２袋体２０の内部に注入する。注入後コネクタ１６にキャップ１８を嵌める。この状態で、細胞は第２袋体２０内で培養が可能である。

第２袋体２０に細胞分散液が注入された状態で、第１袋体１０のコネクタ１５に空のシリンジを接続し、第１袋体１０内部を吸引する。第１袋体１０内が減圧されることにより、第２袋体２０の細胞分散液が細胞担持フィルタ３に向かって移動する。細胞担持フィルタ３は、液体は透過するが、細胞は透過しないから、細胞担持フィルタ３に細胞が保持される。このように細胞を細胞担持フィルタ３に保持させることによって、後の工程において、穿孔体４の突起部４２と細胞の確実な接触が可能となる。すなわち、細胞が培地中に浮遊している状態では、穿孔体４を加圧したときに細胞が突起部４２から逃げるように分散し、突起部４２と細胞とを接触させることが困難であるが、細胞担持フィルタ３に保持させることによってこれを可能とすることができる。なお、第１袋体１０における吸引は必須の工程ではない。吸引しなくても細胞担持フィルタ３で細胞を保持できればこの工程を省略することができる。

第１袋体１０において、その内部を減圧した際に、細胞担持フィルタ３と第１外面１３とが密着し、第１連通口１１を塞いでしまわないように、スペーサを設けることもできる。スペーサは第１袋体１０内外に別途設けてもよいし、第１袋体１０および第１連通口１１等を補強して、これらの少なくとも一部が密着しないようにしてもよい。

細胞を細胞担持フィルタ３で保持した後、シリンジの接続を外し、コネクタ１５にキャップ１７を嵌める。このとき、第１袋体１０に培養液等の液体を注入し、第１外面１３と細胞担持フィルタ３との間に液体を充填してもよい。この実施形態において、液体が充填された第１袋体１０が圧力分散手段として機能する。第１袋体１０に液体を充填することによって、後述の穿孔体４を細胞担持フィルタ３に押圧する際に、圧力を分散し、穿孔体４と細胞担持フィルタ３との接触圧力を均等にすることができる。穿孔体４からの押圧力が不均一である場合には、ある部分では細胞がつぶれ、ある部分では穿孔が全く形成されないという問題が生じるが、上記のように圧力を均等にすることによって、細胞群において均一に穿孔を形成することができる。また、細胞膜穿孔用容器１の図面下方に別途液体パック等を圧力分散手段として配置することによって、第１袋体１０に液体を充填したときと同様の圧力の分散効果を得ることができる。

次に細胞担持フィルタ３で保持された細胞に対して穿孔体４を加圧し、細胞に穿孔体４の突起部４２を接触させる。細胞に突起部４２が接触した状態において、穿孔体４のベース部４１側から細胞と突起部４２との接触部分に向かって光照射をおこなう。穿孔体４は光透過性であるので、これを介して細胞への照射が可能である。突起部４２に光増感剤が含まれるので、光照射により突起部４２に接触した細胞の膜に穿孔が形成される。このように形成された穿孔から目的物質が流入し細胞内に取り込ませることができる。なお、この穿孔は数秒〜数分で細胞自身の修復力により閉じられる。

以上のように、細胞膜穿孔用容器１を用いて細胞に目的物質を導入することができる。この実施形態によれば、複数の突起部４２を用いて細胞に穿孔を形成することができるから、細胞群への穿孔が可能である。同時に複数の細胞への穿孔形成が可能であり、作業効率の向上を図ることができる。また、細胞分散液中に、細胞と導入しようとする目的物質とを一緒に入れることにより、穿孔と目的物質の導入とを同時におこなうことができ、作業効率が一層向上される。

この細胞膜穿孔用容器１を用いることにより、穿孔が形成された細胞は、細胞自身の修復力により穿孔が閉じられるので、高い細胞生存率を維持することができる。しかも、設定した圧力で機械的に細胞膜穿孔用容器を加圧するだけで穿孔が形成されるので、容易かつ簡便に実現可能である。

（実験例）
以下の実験により、細胞膜穿孔用容器１を用いて細胞群に穿孔を形成した。細胞群として、神経系株化細胞PC12を用いた。この細胞の培養は、T.K. Saito, M. Takahashi, H. Muguruma, E. Niki and K. Mabuchi, “Phototoxic process after rapid photosensitive membrane damage of 5,5 ″ -bis(aminomethyl) -2,2 ′ :5 ′ ,2 ″ -terthiophene dihydrochloride”, J. Photochem. Photobiol., Vol.61, Issue 3, pp.114-121 (2001)の細胞培養に関する記述に準じておこなった。

穿孔体４は、直径８５mm、厚さ1.5ｍｍとし、材質としてポリジメチルシロキサン(PDMS,シリコーンゴムの一種)を用いた。突起部４２は、径が約1μm、高さが約2μm、ピッチが約3μmである。第１袋体１０および第２袋体２０において、素材はポリエチレン（γ線滅菌対応 厚さ140μm）とし、寸法は縦約１７０ｍｍ、横約１５０ｍｍである。細胞担持フィルタ３は、オムニポア（Merck Millipore、孔径0.2μm 膜厚65μm 直径90mm）を使用した。なお自作の円形の加熱シーリング装置（丸大機工）でフィルタをバッグの間に溶着している。

第１袋体１０にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）液5mlを10mlシリンジで加え、空気を抜いてキャップを閉じた。続いて第２袋体２０にPBS液40mlを10mlシリンジで加え、空気を抜いてキャップを閉じた。細胞培養容器からPC12細胞を剥離・分散させ、15ml遠沈管に入れた。細胞分散液3000μl+蛍光色素Alexa Fluor 594 for Microinjection (LifeTechnologies) 10倍希釈液30μlを混ぜ、5mlピペットで上層に入れた。色素が第１袋体１０に行き渡るよう、目視で確認した。

細胞膜穿孔用容器１を加圧・光照射装置(CP-02,丸大機工)にセットし、穿孔処理をおこなった。加圧は98.9 N、処理時間60秒とした。穿孔後、上層の細胞分散液を10mlシリンジで回収し、15ml遠沈管に入れた。十分回収できない場合、PBS 5mlを第２袋体２０に加え、軽く振り、回収した。遠心分離し、上澄み液をすべて除去した。その後、撮影用培地(Neuro Basal without Phenol Red)1mlを加えて、細胞を再分散した。スライドガラスに細胞分散液を30μl滴下し、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡（IX71, オリンパス）にて観察・撮影をおこなった。その結果を図５に示した。図６は対照実験の結果であり、上記と同様の実験において光照射をしていないものである。なお、この実験例において、第１袋体１０からの培養液の吸引をおこなわなくても細胞を細胞担持フィルタ３で保持可能であったため、この工程を省略した。

図５および図６における透過像および蛍光像は、画像処理プログラムにおいて画像処理し、細胞の生存率を算出した。画像処理プログラムは NI Vision Assistant 2015SP1 (National Instruments) により基本部分を作成し、最終的にLabVIEW2015 SP1(National Instruments)で完成させた。

画像処理プログラムは以下のように動作する。
１．透過像と蛍光像のファイルを読み込み、出力像ファイルを指定する。
２．透過像より細胞が存在する領域（細胞よりも小さな異物を排除判定）を自動算出し、蛍光像における同領域の輝度情報のみを有効とし、細胞が存在しないと判定された領域を輝度０とする。
３．このようにして、細胞領域由来の蛍光のみ自動認識した画像を出力像ファイルとして保存する。
４．その上で、細胞が存在する領域における平均輝度を計算および表示する。

このようにして得られた値を比較したところ、図５に示した光照射あり・加圧ありの穿孔可能条件の領域1-3においてそれぞれ、22.8, 29.7, 21.6、平均値24.7の結果が得られた。図６に示した光照射なし・加圧ありであって穿孔不能な、対照実験となる領域1-3においてそれぞれ、15.7, 16.5, 10.3、平均値14.2の結果が得られた。

実験前にセルカウンターで検出した萎縮した死細胞の比率が４０％で、これらの細胞が条件によらず蛍光染色される傾向を加味すると、穿孔可能条件では有意に輝度が上昇しており、生細胞に対する細胞膜穿孔と膜の回復による蛍光色素の細胞内導入が認められたと判断した。

上記のような細胞膜穿孔用容器１は、第１袋体１０および第２袋体２０の内部における滅菌状態が維持されたまま穿孔の形成をおこなうことができる。したがって、目的物質を導入した細胞を細胞膜穿孔用容器１から例えば生体内に直接戻すことも可能である。なお、細胞膜穿孔用容器１内において細胞は細胞担持フィルタ３に保持されているが、培養培地存在下で細胞膜穿孔用容器１を撹拌するだけで細胞を培養培地に浮遊させることができ、細胞の回収も容易である。

この実施形態において、第１袋体１０および第２袋体２０として透明材料を用いているが、これによって細胞膜穿孔用容器１内を容易に視認することができる。したがって、細胞分散液の状態や、穿孔体４と細胞担持フィルタ３との接触の状態等を視認しながら作業することができる。

細胞担持フィルタ３において、その大きさ、孔の大きさ、および材質は、この実施例に例示されたもののほか、目的に応じてこの技術の分野において用いられる種々のものを採用することができる。同様に、穿孔体４の材質や、突起部４２の大きさ、ピッチ等も任意に変更可能である。

この実施形態において、酸化処理手段として光増感剤を用い、光照射により細胞膜に穿孔を形成することとしたが、このほかに、例えば酸化処理剤として音響増感剤を用い、超音波照射することにより穿孔を形成することもできる。

この実施形態および発明において、「第１」および「第２」の用語は、同様の構成要素を単に区別するために用いるものであって、順列を示すものではない。

１ 細胞膜穿孔用容器
３ 細胞担持フィルタ
４ 穿孔体
１０ 第１袋体
１１ 第１連通口
１２ 第１内面
１３ 第１外面
１４ 第１開口部
２０ 第２袋体
２１ 第２連通口
２２ 第２内面
２３ 第２外面
２４ 第２開口部
４１ ベース部
４２ 突起部

Claims (6)

1. 可撓性材料で形成される第１袋体と、
   可撓性材料で形成されるとともに前記第１袋体に積層される第２袋体と、を備え、
   前記第１袋体は、その内部と外部とを連通可能な第１連通口と、前記第２袋体に対向する第１内面と、その反対側に位置する第１外面と、前記第１内面に設けられた第１開口部とを有し、
   前記第２袋体は、その内部と外部とを連通可能な第２連通口と、前記第１袋体に対向する第２内面と、その反対側に位置する第２外面と、前記第２内面に設けられた第２開口部とを有し、
   前記第１袋体および前記第２袋体は、前記第１開口部および前記第２開口部に設けられるとともに、液体が透過可能であり、かつ、細胞が透過不能なメッシュサイズを有する細胞担持フィルタを介して連通し、
   前記第２外面の内側には、前記細胞担持フィルタに対向する位置に細胞に穿孔可能な穿孔体を備え、
   前記穿孔体は、前記第２外面に接合されるベース部と、前記ベース部から前記細胞担持フィルタに向かって突出する複数の突起部とを備え、前記突起部には細胞膜に対する酸化処理手段を備えることを特徴とする細胞膜穿孔用容器。
2. 前記酸化処理手段は光増感剤であり、
   前記第１袋体は、光透過性であることを特徴とする請求項１記載の細胞膜穿孔用容器。
3. 前記穿孔体は、前記第２外面から前記細胞担持フィルタに向かって押圧されるとともに、前記細胞担持フィルタよりも前記１外面側に、押圧力を分散するための圧力分散手段を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞膜穿孔用容器。
4. 可撓性材料で形成される第１袋体と、
   可撓性材料で形成されるとともに前記第１袋体に積層される第２袋体と、を備え、
   前記第１袋体は、その内部と外部とを連通可能な第１連通口と、前記第２袋体に対向する第１内面と、その反対側に位置する第１外面と、前記第１内面に設けられた第１開口部とを有し、
   前記第２袋体は、その内部と外部とを連通可能な第２連通口と、前記第１袋体に対向する第２内面と、その反対側に位置する第２外面と、前記第２内面に設けられた第２開口部とを有し、
   前記第１袋体および前記第２袋体は、前記第１開口部および前記第２開口部に設けられるとともに、液体が透過可能であり、かつ、細胞が透過不能なメッシュサイズを有する細胞担持フィルタを介して連通し、
   前記第２外面の内側には、前記細胞担持フィルタに対向する位置に細胞に穿孔可能な穿孔体を備え、前記穿孔体は、前記第２外面に接合されるベース部と、前記ベース部から前記細胞担持フィルタに向かって突出する複数の突起部とを備え、前記突起部には細胞膜に対する酸化処理手段を備える細胞膜穿孔用容器を用いた細胞膜穿孔方法であって、
   複数の細胞を含む細胞培養液を前記第２袋体に前記第２連通口から注入する工程と、
   前記細胞担持フィルタに前記穿孔体を押圧し、細胞に穿孔を形成する工程とを含むことを特徴とする細胞膜穿孔方法。
5. 前記酸化処理手段は光増感剤であり、
   前記細胞担持フィルタに前記穿孔体を押圧させた状態で前記穿孔体に光刺激を供給する工程を含むことを特徴とする請求項４記載の細胞膜穿孔方法。
6. 前記穿孔体は、光透過性であり、
   前記光刺激は、前記穿孔体を介して供給されることを特徴とする請求項５記載の細胞膜穿孔方法。