JP6804462B2 - 指数関数の底が２より大きい核酸増幅 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年12月15日に出願した米国仮出願第62/092102号の優先権を主張するものである。

連邦支援の研究開発下で行われた発明の権利に関する陳述
適用なし。

本明細書に記載の方法及び組成物は、一般に核酸増幅の分野に関する。特に、増幅効率を増加する方法及び組成物を本明細書において記載する。

様々な核酸増幅方法が利用可能であり、多くは、核酸検出に基づく高感度の診断アッセイの実行に用いられてきた。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、最も広く使用されるDNA増幅及び定量方法である。ネステッドPCR、2段階のPCRは、PCRの特異性及び感受性を上昇させるために使用される(米国特許第4,683,195号)。PCR増幅に使用するためのネステッドプライマーは、リバース及びフォワードプライマー標的部位間の標的配列上の領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。しかしながら、PCRには一般にいくつかの制限がある。PCR増幅は、各サイクルで標的配列の量の2倍より少ない増加のみ達成できる。それは依然として比較的遅い。更に、この方法の感受性は典型的には制限され、ほんのわずかな分子で存在する標的の単一の反応での検出を困難にする。

米国特許第4,683,195号 米国特許第6,794,499号 米国特許第6,670,461号 米国特許第6,262,490号 米国特許第6,770,748号 米国特許第6,027,998号 米国特許第6,605,451号 PCT出願第WO 97/31256号 PCT出願第WO 01/92579号 米国特許第5,830,711号 米国特許第6,027,889号 米国特許第5,686,243号 PCT出願WO0056927A3号 PCT出願WO9803673A1号 米国特許第8,252,558号 米国特許第4,458,066号 米国特許第5474920号 米国特許第5,958,349号 米国特許第6,403,037号 米国特許第6,440,725号 米国特許第6,783,736号 米国特許第6,818,185号

Berger及びKimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES、San Diego: Academic Press, Inc.社 Sambrookら(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Anderson及びYoung、Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985) 「A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics」John SantaLucia, Jr.、PNAS、2月17日、1998年 vol. 95 no. 4 1460〜1465頁 Ausbelら; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach, Ed、Cold Spring Harbor Press (1995) The Electronic Protocol Book、Chang Bioscience (2002); Msuihら、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996) The Nucleic Acid Protocols Handbook、R. Rapley, ed.、Humana Press社、Totowa、N.J. (2002) Abramsonら、Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb.;4(1):41〜7頁 Dayら、Genomics、29(1): 152〜162頁(1995) Ehrlichら、Science 252:1643〜50頁(1991) Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press社(1990) Favisら、Nature Biotechnology 18:561〜64頁(2000) Rabenauら、Infection 28:97〜102頁(2000) Belgrader、Barany、及びLubin、Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification、1995 (ワールドワイドウェブで入手可能:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-) LCR Kit Instruction Manual、Cat. #200520、Rev. #050002、Stratagene社、2002 Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188〜93頁(1991) Bi及びSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997) Zirviら、Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999) Deanら、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002) Barany及びGelfand、Gene 109:1〜11頁(1991) Walkerら、Nucl. Acid Res. 20:1691〜96頁(1992) Polstraら、BMC Inf. Dis. 2:18- (2002) Lageら、Genome Res. 2003 Feb.;13(2):294〜307頁 Landegrenら、Science 241:1077〜80頁(1988) Demidov, V.、Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.;2(6):542〜8頁 Cookら、J Microbiol Methods. 2003 May;53(2):165〜74頁 Schweitzerら、Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.;12(1):21〜7頁 Harrisら、BioTechniques 54:93〜97頁(2013年2月) Narangら、(1979) Meth. Enzymol. 68: 90〜99頁 Brownら、(1979) Meth. Enzymol. 68: 109〜151頁 Beaucageら、(1981) Tetra. Lett.、22: 1859〜1862頁 Tsurumiら、J. Virology 67(12):7648〜7653頁(1993)) Zijderveld及びvan der Vliet、J. Virology 68(2):1158〜1164頁(1994) Boehmer及びLehman、J. Virology 67(2):711〜715頁(1993) Skaliter及びLehman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10665〜10669頁(1994) Rigler及びRomano、J. Biol. Chem. 270:8910〜8919頁(1995) Siegelら、J. Biol. Chem. 267:13629〜13635頁(1992) Zhuら、1994、Anal. Chem. 66:1941〜48頁 FluorescenceSpectroscopy (Pesceら、Eds.) Marcel Dekker社、New York、(1971) Whiteら、Fluorescence Analysis: A Practical Approach、Marcel Dekker社、New York、(1970) Berlman、Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules、2nd ed.、Academic Press社、New York、(1971) Griffiths、Colour and Constitution of Organic Molecules、Academic Press社、New York、(1976) Indicators (Bishop、Ed.). Pergamon Press、Oxford、19723 Haugland、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、Molecular Probes、Eugene (1992)

本明細書に記載する方法及び組成物は、外側プライマー結合部位が増幅時に産生されるアンプリコンにおいて維持されるように設計された、新規のプライマー(例えば、新規の内側プライマー)の使用に基づく。

本明細書において、以下の実施形態を提供する:実施形態1:試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーの形態である、又は第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではなく、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、核酸プライマーセット。

実施形態2:第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマーを更に含む、実施形態1に記載のプライマーセット。

実施形態3:試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある、第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマー;並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程;並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。

実施形態4:DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含む、実施形態1から3のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態5:二本鎖形態の結合した配列c-aのT_mが、二本鎖形態の結合した配列a-bのT_mより高い、実施形態1から4のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態6:結合した配列c-aが、結合した配列a-bよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、実施形態1から5のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態7:前記増幅が、PCRの対数期中に3^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、実施形態3から6に記載の方法。

実施形態8:前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約12%〜42%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、実施形態3から7に記載の方法。

実施形態9:第二のプライマーが、第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーの形態である、又は第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第二のプライマーが、
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列eを含む第二の外側プライマー;並びに
第二の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列fを含み、f'がe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに
第二の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列e'の3'側にあり、第二の鎖鋳型配列h'に相補的ではない、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列g
を含む二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマー
を含む、実施形態1、2、5、若しくは6に記載のプライマーセット、又は実施形態3から8に記載の方法。

実施形態10:二本鎖形態の結合した配列g-eのT_mが、二本鎖形態の結合した配列e-fのT_mよりも高い、実施形態9に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態11:結合した配列g-eが、結合した配列e-fよりもGCリッチ及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、実施形態9又は10に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態12:前記増幅が、PCRの対数期中に6^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、実施形態9から11に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態13:前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約36%〜66%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、実施形態9から12に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態14:クランプ配列c及びgが、存在する場合、増幅中にコピーされ得ない、実施形態1から13のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態15:クランプ配列c及び/又はgが、存在する場合、2'-O-メチルRNAを含む、実施形態14に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態16:第一の内側プライマー及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、ヘアピン配列を含まない、実施形態1から15のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態17:第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列cが相補的な配列c'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列gが相補的な配列g'に連結するヘアピン配列を含む、実施形態3から15に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態18:試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーの形態である、又は第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも3つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマーを含む、核酸プライマーセット。

実施形態19:第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマーを更に含む、実施形態18に記載のプライマーセット。

実施形態20:試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にある、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマー
を含む、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマー、並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。

実施形態21:DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含む、実施形態18から20に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態22:g1がg2とは異なる配列を有する、実施形態18から21に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態23:二本鎖形態の結合した配列c1-dのT_mが、二本鎖形態の結合した配列d-aのT_mより高く、二本鎖形態の結合した配列c2-d-aのT_mが、二本鎖形態の結合した配列d-a-bのT_mより高い、実施形態18から22に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態24:結合した配列c1-dが、結合した配列d-aよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有し、結合した配列c2-d-aが、結合した配列d-a-bよりもGCリッチであり、及び/又は結合した配列d-a-bよりも多くの安定化塩基を含有する、実施形態18から23に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態25:前記増幅が、PCRの対数期中に4^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、実施形態20から24に記載の方法。

実施形態26:前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約25%〜55%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、実施形態20から25に記載の方法。

実施形態27:第二のプライマーが、第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第二のプライマーの形態である、又は第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第二のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも3つの第二のプライマーが、
第二の鋳型鎖配列h'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列hを含む第二の外側プライマー;
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列eを含み、e'がh'に隣接する、及びh'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列eがその5'端で、
一本鎖プライマー配列eに隣接する、及び一本鎖プライマー配列eの5'側にあるプライマー配列h;並びに
第二の鎖鋳型配列h'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列h'の3'側にある第二の鎖鋳型配列j'に相補的ではない、プライマー配列hに隣接する及びプライマー配列hの5'側にあるクランプ配列g1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第二の中間プライマー;並びに、
第一の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列fを含み、f'がe'に隣接する及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;
プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるプライマー配列h;並びに
プライマー配列hに隣接する、及びプライマー配列hの5'側にあり、クランプ配列c2が第一の鎖鋳型配列j'に相補的ではないクランプ配列g2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマーを含む、実施形態18から26に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態28:二本鎖形態の結合した配列g1-hのT_mが、二本鎖形態の結合した配列h-eのT_mよりも高く、二本鎖形態の結合した配列g2-h-eのT_mが、二本鎖形態の結合した配列h-e-fのT_mよりも高い、実施形態27に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態29:結合した配列g1-hが、結合した配列h-eよりもGCリッチ及び/又はより多くの安定化塩基を含有し、結合した配列g2-h-eが、結合した配列h-e-fよりもGCリッチ及び/又は結合した配列h-e-fよりも多くの安定化塩基を含有する、実施形態27又は28に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態30:前記増幅が、PCRの対数期中に8^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、実施形態27から29に記載の方法。

実施形態31:前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約42%〜72%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、実施形態27から30に記載の方法。

実施形態32:クランプ配列c1及びc2、並びにg1及びg2が、存在する場合、増幅中にコピーされ得ない、実施形態18から31に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態33:クランプ配列c1及びc2、並びにg1及びg2が、存在する場合、2'-O-メチルRNAを含む、実施形態32に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態34:第一の内側プライマー、及び第一の中間プライマー、並びに/又は第二の内側プライマー及び第二の中間プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、ヘアピン配列を含まない、実施形態20から33に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態35:第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列c2が相補的な配列c2'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第一の中間プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列c1が相補的な配列c1'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列g2が相補的な配列g2'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の中間プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列g1が相補的な配列g1'に連結するヘアピン配列を含む、実施形態20から33に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態36:増幅がPCRを含む、実施形態3から17又は20から35に記載の方法。

実施形態37:DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含み、熱安定性である、実施形態3から17又は20から36に記載の方法。

実施形態38:標的核酸を検出する工程、及び任意選択により標的核酸を定量する工程を含む、実施形態3から17又は20から37に記載の方法。

実施形態39:試料が単一細胞由来の核酸からなる、実施形態3から17又は20から38に記載の方法。

実施形態40:結合した配列a-bが、結合した配列c-aよりも多くの不安定化塩基を含有する、実施形態1から6のいずれかに記載のプライマーセット又は方法。

実施形態41:結合した配列e-fが、結合した配列g-eよりも多くの不安定化塩基を含有する、実施形態9から11に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態42:結合した配列d-aが、結合した配列c1-dよりも多くの不安定化塩基を含有する、及び/又は結合した配列d-a-bが、結合した配列c2-d-aよりも多くの不安定化塩基を含有する、実施形態18から24に記載のプライマーセット又は方法。

実施形態43:結合した配列h-eが、結合した配列g1-hよりも多くの不安定化塩基を含有する、及び/又は結合した配列h-e-fが、結合した配列g2-h-eよりも多くの不安定化塩基を含有する、実施形態27から29に記載のプライマーセット又は方法。

二本鎖DNA鋳型上で行われる完全なネステッドPCRを示す概略図である。隣接プライマーは、図2及び図3に記載する通りである。 図2は、標的ヌクレオチド配列の一端にハイブリダイズする例示的な2つのプライマーセットを示す概略図である。このセットは、例えばフォワードプライマーセットであってよい。プライマー配列の異なるセグメントを示す(a,b,c);相補的な配列は(a',b',c')として示す。鋳型配列は、d'、a'、及びb'として3'から5'を示す。外側プライマー(a)は一本鎖である。内側プライマーは、一本鎖部分(b)及び二本鎖部分(a-c)を有する。 図2に示す標的ヌクレオチド配列形態の反対の端にハイブリダイズする例示的な2つのプライマーセットを示す概略図である。このセットは、例えば、リバースプライマーセットであってよい。プライマー配列の異なるセグメントを示す(e,f,g);相補的な配列は(e',f',g')として示す。鋳型配列は、h'、e'、及びf'として3'から5'を示す。外側プライマー(e)は一本鎖である。内側プライマーは、一本鎖部分(f)及び二本鎖部分(a-g)を有する。 標的ヌクレオチド配列の一端にハイブリダイズする例示的な3つのプライマーセットを示す概略図である。このセットは、例えばフォワードプライマーセットであってよい。プライマー配列の異なるセグメントを示す(a,b,c1,c2,d);相補的な配列は(a',b',c1',c2',d')として示す。鋳型配列は、i'、d'、a'、及びb'として3'から5'を示す。外側プライマー(d)は一本鎖である。中間プライマーは、一本鎖部分(a)及び二本鎖部分(d-c1)を有する。内側プライマーは、一本鎖部分(b)及び二本鎖部分(a-d-c2)を有する。 図4に示す標的ヌクレオチド配列の反対の端にハイブリダイズする例示的な3つのプライマーセットを示す概略図である。このセットは、例えば、リバースプライマーセットであってよい。プライマー配列の異なるセグメントを示す(e,f,g1,g2,h);相補的な配列は(e',f',g1',g2',h')として示す。鋳型配列は、j'、h'、e'、及びf'として3'から5'を示す。外側プライマー(d)は一本鎖である。中間プライマーは、一本鎖部分(e)及び二本鎖部分(h-g1)を有する。内側プライマーは、一本鎖部分(f)及び二本鎖部分(e-h-g2)を有する。 プライマーが鋳型とハイブリダイズすることが可能な場合、クランプ配列を有する例示的なプライマーの2つの代替えの構造を示す概略図である。蛍光クエンチャー(Q)は、鋳型鎖の相当する蛍光標識(F)をクエンチする位置のプライマーに存在する。実施例1では、プライマー及び相補的な標的配列のTmを、クランプの存在あり、及びなしで測定する実験を実施した。(A)二本鎖形態の結合した配列c-aのT_mが、二本鎖形態の結合した配列a-bのT_mよりも高い場合に形成される構造。(B)二本鎖形態の結合した配列c-aのT_mが、二本鎖形態の結合した配列a-bのT_mよりも小さい場合に形成される構造。 (A)蛍光クエンチャー(Q)が、鋳型鎖の相当する蛍光標識(F)をクエンチする位置の内側プライマーに存在する、例示的な2つのプライマーセットを示す概略図である。(B)実施例2のプライマー伸長反応からの時間の関数としての蛍光強度。3つの上昇する線はわずかに異なるクランプによる別々の反応であり、平らな線は外側(隣接)、置換プライマーの存在なしである。

定義
請求項及び明細書に使用する用語は、別段の指定がない限り以下に記載するように定義する。

用語「核酸」は、ヌクレオチドポリマーを指し、別段の制限がない限り、自然発生のヌクレオチドと同様の方法(例えば、ハイブリダイズ)において機能し得る天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む。

核酸という用語は、例えばゲノムDNA;通常、メッセンジャーRNA(mRNA)の逆転写又は増幅によって得られるmRNAのDNA表示である相補的DNA(cDNA);合成的に又は増幅によって産生されるDNA分子;mRNA;及び非コードRNAを含む、DNA又はRNAの任意の形態を含む。

核酸という用語は、二本鎖又は三本鎖核酸複合体、並びに一本鎖分子を包含する。二本鎖又は三本鎖核酸複合体において、核酸鎖は同延である必要はない(すなわち、二本鎖核酸は、両鎖の全長にわたって二本鎖で有る必要はない)。

核酸という用語は、メチル化及び/又はキャッピングによる等、その任意の化学修飾も包含する。核酸修飾は、更なる電荷、分極率、水素結合、静電気的相互作用、及び個々の核酸塩基又は全体としての核酸に機能性を組込む化学基の付加を含み得る。そのような修飾は、2'-位糖修飾、5-位ピリミジン修飾、8-位プリン修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、5-ブロモ-ウラシルの置換、糖-リン酸主鎖修飾、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等異常な塩基対形成の組合せ等、塩基修飾を含み得る。

より具体的には、いくつかの実施形態では、DNA及びRNAに見出される等、ポリマーが塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構造にヌクレオ塩基を含有するならば、核酸は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、及びプリン又はピリミジン塩基のN-又はC-グリコシドである核酸の任意の他の型、並びに非ヌクレオチド主鎖を含有する他のポリマー、例えばポリアミド(例えばペプチド核酸(PNA))及びポリモルフォリノポリマー(Anti-Virals, Inc.社、Corvallis、OregonからNeugeneとして市販されている)、及び他の合成配列特異的核酸ポリマーを含み得る。核酸という用語は、ロックド核酸(LNA)のそれらの開示に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,794,499号、米国特許第6,670,461号、米国特許第6,262,490号、及び米国特許第6,770,748号に記載のLNAも包含する。

核酸は、完全に化学的な合成方法、例えば核酸を産生する任意の種からの単離による生物源からの固相媒介化学合成から、若しくは分子生物学的手段による核酸の操作を含む方法、例えばDNA複製、PCR増幅、逆転写から、又はこれらの方法の組合せから得ることができる。

本明細書で使用する場合、用語「相補的な」は、2つのヌクレオチド間;すなわち、核酸の所与の位置におけるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合して、基準の塩基対を形成することができ、次いで2つの核酸がその位置で互いに相補的であると考えられる場合の正確な対形成の能力を指す。2つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドのいくつかのみが結合する、「部分的」であってよく、又は全相補性が一本鎖分子間に存在する場合、それは完全であってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を有する。

「特異的なハイブリダイゼーション」は、定義したストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーション混合物に存在する他のヌクレオチド配列への実質的な結合がない、核酸の標的ヌクレオチド配列への結合を指す。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの緩和が、配列ミスマッチを許容することを認識する。

いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行う。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、通常、約5℃〜約20℃又は定義したイオン強度及びpHでの特異的な配列の融解温度(T_m)より25℃低い温度を指す。本明細書で使用する場合、T_mは、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖へと半解離する温度である。核酸のT_mを算出する方法は、当業者に周知であり(例えば、Berger及びKimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES、San Diego: Academic Press, Inc.社及びSambrookら(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照)、両方ともストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のそれらの記載に関して参照により本明細書に組込まれる)。標準の参照によって示すように、T_m値の簡単な見積もりは、核酸が1M NaClの水溶液中である場合、方程式:T_m=81.5+0.41(% G+C)によって算出することができる(例えば、Anderson及びYoung, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)を参照)。ハイブリッドの融解温度(及び、したがって、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件)が、プライマー又はプローブの長さ及び性質(DNA、RNA、塩基組成物)並びに標的核酸の性質(DNA、RNA、塩基組成物、溶液中に存在又は固定化等)、並びに塩及び他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在又は不在)等、様々な因子によって影響される。これらの因子の効果は周知であり、当技術分野において標準の参照に議論されている。ほとんどの配列の特異的なハイブリダイゼーションを達成するのに好適な、例示的なストリンジェントな条件は:少なくとも約60℃の温度及びpH7で約0.2モル濃度の塩濃度である。隣接個体の熱力学に基づくオリゴヌクレオチド配列のTm算出は、「A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics」John SantaLucia, Jr.、PNAS、2月17日、1998年 vol. 95 no. 4 1460〜1465頁に記載のように行うことができる(この記載に関して、本明細書に参照により組み込まれる)。

用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い、通常200ヌクレオチドより短い、より具体的には100ヌクレオチドより短い、最も具体的には50ヌクレオチドより短い核酸を指すために使用される。典型的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖DNA分子である。

用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズし(「アニーリング」とも呼ぶ)、適切な緩衝液中及び好適な温度での適切な条件下(すなわち、DNA若しくはRNAポリメラーゼ又は逆転写酵素等、4つの異なるヌクレオシド三リン酸、及び重合剤の存在中)でヌクレオチド(RNA又はDNA)重合の開始部位として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図する用途によるが、プライマーは典型的には、少なくとも7ヌクレオチド長であり、いくつかの実施形態では、10〜30ヌクレオチドの範囲であり、又はいくつかの実施形態では、長さが10〜60ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、プライマーは例えば15〜50ヌクレオチド長であってよい。短いプライマー分子は通常、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。

プライマー、又はその部分が核酸内のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、プライマーは、別の核酸にアニールすると言われる。プライマーが特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズするという記載は、プライマーが完全又は排他的のいずれかで、そのヌクレオチド配列にハイブリダイズすると意味することを意図しない。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で使用する増幅プライマーは、ヌクレオチド配列に「アニールする」又は「特異的である」と言われる。この記載は、ヌクレオチド配列に完全にアニールするプライマー、並びにヌクレオチド配列に部分的にアニールするプライマーを包含する。

用語「プライマー対」は、増幅されるDNA配列の5'端に相補的にハイブリダイズする5'「上流プライマー」又は「フォワードプライマー」、及び増幅される配列の3'端とハイブリダイズする3'「下流プライマー」又は「リバースプライマー」を含む、プライマーのセットを指す。当業者に認識されるように、用語「上流」及び「下流」又は「フォワード」及び「リバース」は限定されることを意図しないが、いくつかの実施形態において例示的な方向を提供する。

「プローブ」は、1つ又は複数の型の化学結合によって相補的な配列の標的核酸に結合することができる核酸であり、通常相補的な塩基対形成によって、通常水素結合形成によって、したがって二重鎖構造を形成する。プローブは、検出可能な標識によって標識して、プローブの容易な検出、特にいったんプローブがその相補的な標的にハイブリダイズすることを可能にすることができる。しかしながら、代わりに、プローブは標識されていなくてもよいが、直接的又は間接的のいずれかで標識されるリガンドとの特異的な結合によって検出可能であってよい。プローブは、サイズが著しく異なり得る。通常、プローブは長さが少なくとも7〜15ヌクレオチドであってよい。他のプローブは、少なくとも20、30、又は40ヌクレオチド長である。更に他のプローブは多少長く、少なくとも50、60、70、80、又は90ヌクレオチド長である。更に他のプローブは更に長く、少なくとも100、150、200又はそれ以上長いヌクレオチド長である。プローブは、任意の上記の値によって制限される任意の範囲内である任意の長さであってもよい(例えば、長さ15〜20ヌクレオチド)。

プライマー又はプローブは、標的ヌクレオチド配列に完全に相補的であってよく、完全に相補的に満たなくてもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ヌクレオチド配列の相補鎖に、少なくとも7ヌクレオチドの配列にわたり、より典型的には10〜30ヌクレオチドの範囲の配列にわたり、いくつかの実施形態では少なくとも14〜25ヌクレオチドの配列にわたり、少なくとも65%の同一性を有し、いくつかの実施形態では、少なくとも75%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する。特定の塩基(例えば、プライマーの3'塩基)は、通常標的ヌクレオチド配列の対応する塩基に望ましくは完全に相補的であることが理解される。プライマー及びプローブは、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列にアニールする。

プライマー内のプライマー又はヌクレオチド配列の部分に関して、本明細書で使用する場合、用語、核酸「に特異的な」は、好適なアニーリング条件下で標的核酸に特異的にアニールすることができるプライマー又はヌクレオチド配列を指す。

本教示による増幅は、直線的に又は指数関数的に、核酸配列を増幅する広範な技法を制限なく含む、典型的には鋳型依存的様式で、少なくとも1つの標的核酸の少なくとも一部を複製する任意の手段を包含する。増幅工程を実施するための例示的な手段は、それらの複数のバージョン及び組合せ、例えば限定はされないが、OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(組合せた連鎖反応-CCRとしても公知)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)等を含む、PCR、核酸鎖ベース増幅(NASBA)、2ステップ多重増幅、ローリングサークル増幅(RCA)等を含む。そのような技法の記載は、他の情報源の中でも、Ausbelら; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach, Ed、Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book、Chang Bioscience (2002); Msuihら、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook、R. Rapley, ed.、Humana Press社、Totowa、N.J. (2002); Abramsonら、Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb.;4(1):41〜7頁、米国特許第6,027,998号;米国特許第6,605,451号、Baranyら、PCT出願第WO 97/31256号; Wenzら、PCT出願第WO 01/92579号; Dayら、Genomics、29(1): 152〜162頁(1995)、Ehrlichら、Science 252:1643〜50頁(1991); Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press社(1990); Favisら、Nature Biotechnology 18:561〜64頁(2000);及びRabenauら、Infection 28:97〜102頁(2000); Belgrader、Barany、及びLubin、Developmen
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いくつかの実施形態では、少なくとも1つのプライマーを少なくとも1つの標的核酸中の相補的な又は実質的に相補的な配列とアニーリングする工程;ポリメラーゼを使用する鋳型依存的様式でヌクレオチドの少なくとも1つの鎖を合成する工程;及び、新しく形成した核酸二重鎖を変性して鎖を分離する工程の逐次的手順の少なくとも1サイクルを含む。サイクルは、繰り返されても繰り返されなくてもよい。増幅は、熱サイクリングを含んでもよく、又は等温で実施されてもよい。

「ネステッド増幅」は、標的核酸を増幅する2つより多くのプライマーの使用を指す。

「半ネステッド増幅」は、標的ヌクレオチド配列の一端にアニールする1つより多くのプライマー(例えば、2つ又は3つ)の使用を指す。

「完全ネステッド増幅」は、標的ヌクレオチド配列の各端にアニールする1つより多くのプライマーの使用を指す。

ネステッド増幅に関連して、アンプリコンの一端にアニールする複数のプライマーは、用語「内側」、「外側」、及び「中間」を使用して区別する。

「外側プライマー」は、標的ヌクレオチド配列の同じ端にアニールする別のプライマーよりも標的ヌクレオチド配列の端に近い配列にアニールするプライマーを指す。いくつかの実施形態では、外側プライマー配列は標的核酸から産生したアンプリコンの端を規定する。「外側プライマー」は、本明細書において「隣接プライマー」とも呼ばれる。

「内側プライマー」は、標的ヌクレオチド配列の同じ端にアニールする別のプライマーよりも標的ヌクレオチド配列の中間に近い配列にアニールするプライマーを指す。

用語「中間プライマー」は、標的ヌクレオチド配列の一端にアニールする少なくとも3つのプライマーを使用するネスト増幅に関して、本明細書において使用する。中間プライマーは、内側プライマーと外側プライマーとの間の配列にアニールするものである。

本明細書で使用する場合、用語「に隣接する」は、作用方法のために十分に近接する配列を指すために使用する。いくつかの実施形態では、互いに隣接する配列は、介在するヌクレオチドがなく真隣である。

「多重増幅反応」は、配列によって区別可能な2つ又はそれ以上の核酸が同時に増幅されるものである。

用語「qPCR」は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を指すために本明細書において使用され、「リアルタイムPCR」又は「動力学的なポリメラーゼ連鎖反応」としても公知であり、全ての用語はリアルタイムシグナル検出によるPCRを指す。

「試薬」は、分析物(例えば、分析される核酸)以外の、反応において使用される任意の薬剤を広く指す。核酸増幅反応の例示的な試薬は、限定はされないが、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼ、dNTP、等を含む。酵素反応のための試薬は、例えば、基質、補助因子、緩衝液、金属イオン、阻害剤、及び活性化剤を含む。

用語「標識」は、本明細書で使用する場合、検出可能な及び/又は定量可能なシグナルを提供するために使用することができる任意の原子又は分子を指す。特に、標識は、直接的又は関節的に、核酸又はタンパク質に取り付けることができる。プローブに取り付けることができる好適な標識は、限定はされないが、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補助因子、及び酵素基質を含む。

用語「色素」は、本明細書で使用する場合、通常電磁放射を吸収する任意の有機又は無機分子を指す。

用語「蛍光色素」は、本明細書で使用する場合、通常、ランプ、光ダイオード、又はレーザー若しくは別の蛍光色素等、電磁放射の供給源による発光時に、蛍光メカニズムによるより長い波長の電磁放射を放出する任意の色素を指す。

増幅効率を増加する一般的な手法
米国特許第8,252,558号及びHarrisら、BioTechniques 54:93〜97頁(2013年2月)は、「ポリメラーゼ連鎖置換反応」(PCDR)と名付けられたネステッドPCRの形態を教示する(両文書は、この記載に関して本明細書に参照により組み込まれる)。PCDRでは、外側プライマーから伸長が生じる場合、反応が鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いるため、内側プライマーから産生された伸長鎖を置換する。理論的に、これは各増幅サイクルにつき増幅産物の2倍より多い増加、及びしたがって従来のPCRを超える上昇した感受性及びスピードを可能にする。実際に、ネステッドプライマーから作製したすべてのアンプリコンは、外側プライマーのプライマーアニーリング部位をもはや含有しない。したがって、PCDRは、非常に多くのサイクルの各増幅サイクルにつき、増幅産物の2倍より多い増加を維持することができない。このため、PCDRは、標的核酸を検出するために必要な増幅サイクル数(例えば、約23〜約20)において、中程度の減少のみを提供する。対照的に、以下のTable 1(表1)は、継続的に1サイクルにつき4倍(4^{サイクル数})が、1サイクルにつき2倍する場合と同じ増幅量を得るのに必要なサイクル数を示す。サイクルにつき継続的な6倍の複製は、15サイクルで達成すると予想され、これは通常のPCRでは40サイクルを要すると予想される。

各増幅サイクルの増幅産物の2倍より多くの増加を維持するカギは、内側(ネステッド)プライマーの伸長産物が外側(隣接)プライマー配列を含有するように内側(ネステッド)プライマーを設計することである。図1は、完全ネステッドPCRがフォワード内側及び外側プライマー並びにリバース内側及び外側プライマーを使用して行われるスキームを示す。フォワード外側プライマー配列(又はその相補鎖)から(及びを含む)か、リバース外側プライマー配列による(及びを含む)、2つの鋳型鎖伸長から4つの新しい鎖のそれぞれが生成するように、内側プライマーが外側プライマー配列を含有する鋳型にアニールする場合、「フラップ」が形成される。しかし、内側プライマーがアニールする場合、付加配列もすぐにアニールし、アニーリングから外側プライマーをブロックするため、内側プライマーの5'端に外側プライマー配列を単純に付加するよりも多くが必要である。この問題の解決策は、本明細書では「クランプ」と呼ばれる、両配列に相補的なオリゴヌクレオチドと共に内側プライマー(すなわち、外側プライマー配列に加えた配列)上への更なる5'付加を使用する。議論しやすくするため、付加配列は「クランプ配列」と呼ぶ。この構成を図2に示す。

クランプ配列cは、鋳型(d'領域)に相同ではない。ここで、c-a/c'-a'はa-b/a'-b'より安定である。いくつかの実施形態では、これは、aと比較して長く、GCリッチ(すなわち、aよりGCリッチ)、或いはaがそのような塩基を含有しない場合に1つ若しくは複数の安定化塩基、又はaより多くの安定化塩基を含有する、配列cを用いることによって達成され得る。いくつかの実施形態では、これは、bと比較して長く、GCリッチ(すなわち、bよりGCリッチ)、或いはbがそのような塩基を含有しない場合に1つ若しくは複数の安定化塩基、又はbより多くの安定化塩基を含有する、配列cを用いることによって達成され得る。いくつかの実施形態では、安定化塩基はc-a-bのa領域、並びにc'-a'のa'領域に含まれて、a-b/a'-b'と比較してc-a/c'-a'の安定性を増強することができる。代わりに、又は更に、bは、イノシン等1つ又は複数の不安定化塩基を含有することができる。外側プライマーは配列aのままである。この場合、鋳型中の配列a'は外側プライマーに利用できるままである。c'-a'クランプ及び内側プライマーの5'端は、任意の他の配列よりも高温で素早くアニールし、したがって、c'-a'クランプが、ヘアピン構造を形成するように内側プライマーに連結する必要はない。しかし、いくつかの実施形態では、この型のヘアピン構造を有する内側プライマーの使用は、反応のスピードを増加し得る。

いくつかの実施形態では、内側プライマーのc配列は(赤色で強調する)は、好ましくはPCR中にコピーされない。もしそうであれば、次いでこれらの新しい鋳型は、他の可能な構造にわたる鎖置換コンテストで「勝利する」、及び再び隣接プライマー、配列aがアニーリングするのを妨げる内側プライマーc-a-b/c'-a'-b'二重鎖で作製されるc'-a'テールを有する。このコピーを妨げるため、赤色の配列は、DNAポリメラーゼがよくコピーできないRNA(又は、比較的容易に合成的に作製される2'-O-メチルRNA)から作製することができる。この赤色の配列は、塩基対形成できるが、コピーできない任意の塩基から作製できる。

いくつかの実施形態では、クランプオリゴヌクレオチド(a'-c')は、例えば3'ヒドロキシル基の欠損により、又は増幅の特異性を改善できる化学ブロッキング部分を使用して3'端での伸長をブロックされる。

試料
核酸を含有する試料は、生物源から得ることができ、当技術分野で公知の従来の方法を使用して調製できる。特に、本明細書に記載の方法で有用な核は、単細胞生物及び植物又は非ヒト動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、霊長類、及び他の非ヒト哺乳動物並びにヒト等の高等生物を含む、任意の供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、病原体に感染したことが疑われる、又は病原体に感染したことが公知の個体、がん等の疾患を有することが疑われる又は疾患を有することが公知の個体、又は妊娠中の個体から得ることができる。

核酸は、任意の様々な標準的技法によって、細胞、体液(例えば、血液、血液画分、尿等)、又は組織試料から得ることができる。いくつかの実施形態では、方法は、血漿、血清、脊髄、リンパ液、腹水、胸水、口腔液、皮膚の外側部分の試料;気道、腸管、生殖管、又は尿路からの試料;涙、唾液、血液細胞、幹細胞、又は腫瘍の試料を用いる。試料は、生若しくは死臓器から、又はインビトロ培養物から得ることができる。例示的な試料は、単一細胞、パラフィン包埋組織試料、及び針生検を含み得る。いくつかの実施形態では、分析した核酸は単一細胞から得られる。

対象の核酸は当技術分野で周知の方法を使用して単離することができる。試料核酸は純粋な形態である必要はないが、典型的には、本明細書に記載の方法の工程を実施するのに十分に純粋である。

標的核酸
核酸増幅によって検出できる任意の標的核酸は、本明細書に記載の方法を使用して検出することができる。典型的な実施形態では、少なくともいくつかのヌクレオチド配列情報が標的核酸として公知である。例えば、用いられる増幅反応がPCRである場合、十分な配列情報が通常、所与の標的核酸の各端について入手可能であり、好適な増幅プライマーの設計を可能にする。

標的は、例えば、ウイルス、細菌、原虫、又は菌類等の病原体と関連する核酸;RNA、例えば、過剰発現又は過小発現が疾患を示すもの、組織又は発生特異的な様式で発現されるもの;又は特定の刺激によって誘導されるもの;特異的な多型(例えば、SNP)、対立遺伝子、又はハプロタイプに関して、例えば遺伝子型判定で分析することができるゲノムDNAを含み得る。特定の関心は、遺伝病又は他の病理学において変更された(例えば、増幅、欠損、及び/又は変異)ゲノムDNA;望ましい又は望ましくない性質と関連する配列;及び/又は個体を独自に同定する配列(例えば、法医学的に又は父系性の決定)である。

プライマー設計
核酸増幅に好適なプライマーは、好適な核酸ポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分長い。プライマーの正確な長さ及び組成は、例えば、アニーリング反応の温度、プライマーの供給源及び組成、並びにプローブが用いられる場合、プライマーアニーリング部位へのプローブアニーリング部位の近接、並びにプライマー:プローブ濃度の比を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的核酸配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、約10〜約60の範囲でヌクレオチドを含有するが、より多い又はより少ないヌクレオチドを含有し得る。プライマーは、それらのそれぞれの鎖に選択的にアニールし、安定な二重鎖を形成するのに十分相補的であるべきである。

一般に、当業者は、対象の標的核酸を増幅することができる好適なプライマーを設計する方法を知っている。例えば、PCRプライマーは、任意の市販のソフトウェア又はPrimer3(例えばRozen及びSkaletsky (2000) Meth. Mol. Biol., 132: 365〜386頁; www.broad.mit.edu/node/1060等を参照)等のオープンソースのソフトウェアを使用して、又はRoche社のUPLのウェブサイトにアクセスすることによって設計することができる。アンプリコン配列を、両端のUPLプローブ配列と共に、Primer3プログラムに入力して、Primer3プログラムが両端のプローブ配列のいずれかの側上でプライマーを設計するのを確実にする。

プライマーは、例えば、Narangら、(1979) Meth. Enzymol. 68: 90〜99頁のリン酸トリエステル法;Brownら、(1979) Meth. Enzymol. 68: 109〜151頁のリン酸ジエステル法;Beaucageら、(1981) Tetra. Lett.、22: 1859〜1862頁のジエチルホスホラミダイト法;米国特許第4,458,066号の固体支持法等の方法による直接化学合成を含む、任意の好適な方法によって調製することができ、又は市販の供給源から提供することができる。プライマーは、Sephadexカラム(Amersham Biosciences, Inc.社、Piscataway、NJ)又は当業者に公知の他の方法を使用して精製され得る。プライマー精製は、本明細書に記載の方法の感受性を改善し得る。

外側プライマー
図2は、2つのプライマーセットが、標的ヌクレオチド配列の一端の第一の鋳型鎖にどのようにアニールするかを示す。議論しやすくするため、このプライマーセットは「フォワード」プライマーセットであると考えることができる。外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズする配列aを含む。図3は、2つのプライマーセットが、標的ヌクレオチド配列の反対の端の第二の鋳型鎖にどのようにアニールするかを示す。議論しやすくするため、このプライマーセットは「リバース」プライマーセットであると考えることができる。ここで、外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズする配列eを含む。図4及び図5は、例示的な「フォワード」及び「リバース」の3つのプライマーセットを示す。図4では、フォワード外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズする配列dを含む。図5では、フォワード外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズする配列dを含む。一般に、好適な外側プライマーの設計の検討は、従来のネステッドPCRで使用するための外側プライマーの設計と異ならない。特に、いくつかの実施形態では、別のプライマー配列(例えば内側又は中間プライマー配列)と比較して「外側」である任意のプライマー配列のT_mは、好ましくは、内側(又は中間)プライマー配列のT_mより低い。したがって、例えば、PCRの下降温度ランプ中、内側プライマーは、外側プライマーの前にアニール及び伸長を開始することができ;そうでなければ、外側プライマーの早期伸長が内側プライマーの標的部位をブロックし、そのアニーリングを妨げる。より具体的には、図2に示す実施形態では、プライマー配列aはプライマー配列bのT_mより低いT_mを有する。同様に、図3に示す実施形態では、プライマー配列eは、プライマー配列fより低いT_mを有する。いくつかの実施形態では、T_mの差は少なくとも約4℃であり、一般に約4〜約20℃の範囲である。いくつかの実施形態では、T_mの差は約4〜約15℃の範囲である。しかし、外側プライマーのT_mは通常、効率的なPCRを維持するために十分高く、例えば、いくつかの実施形態では、外側プライマーのT_mは少なくとも40℃である。T_mは、配列の長さ、GC含量を調節することによって、及び/又は配列中に安定化若しく
は不安定化塩基を含むことによって調節できる。

「安定化塩基」は、例えば、DNAオリゴヌクレオチドに組込まれて、二重鎖の安定性を増加することができるペプチド核酸(PNA)のストレッチを含む。ロックド核酸(LNA)及びアンロックド核酸(UNA)は、固相オリゴヌクレオチド合成中にDNAオリゴヌクレオチドに容易に組込まれ得るRNAの類似体であり、それぞれ二重鎖の安定性を増加及び減少する。好適な安定化塩基は、塩基対(したがって、全体として二重鎖)の安定性を増加する修飾DNA塩基も含む。これらの修飾塩基は、固相合成の間にオリゴヌクレオチドに組込まれ、DNA二重鎖の安定性を増加する、より予測可能な方法を提供し得る。例は、AP-dC(G-クランプ)及び2-アミノアデニン、並びに5-メチルシトシン及びC(5)-プロピニルシトシン(シトシンを置換する)、並びにC(5)-プロピニルウラシル(チミンを置換する)を含む。

「不安定化塩基」は、典型的なA-T及び/又はG-C塩基対よりも安定でない塩基対の形成によって、二本鎖DNAを不安定化するものである。イノシン(I)は、シトシン(C)と塩基対を形成するが、I-C塩基対はG-C塩基対よりも安定ではないため、不安定化塩基である。この低い安定性は、G-C塩基対の3つの水素結合と比べて、イノシンが、2つしか水素結合を形成できないプリンである事実から生じる。他の不安定化塩基は当業者に公知であり、又は容易に同定される。

2つのプライマーセットの内側プライマー
図2を参照して、フォワードの2つのプライマーセットの内側プライマーは、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'はa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、並びに一本鎖プライマー配列bはその5'端で、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する。この第一の鎖は:一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列cを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖形態(すなわち、c-a/c'-a')の結合した配列c-a(ハイフンは、この文脈において配列c及びaで構成される結合した核酸配列を示すために使用される)のT_mは、二本鎖形態(すなわち、a-b/a'-b')の結合した配列a-bのT_mより高い。これは、例えば、結合した配列c-aを結合した配列a-bよりも長く及び/若しくはよりGCリッチにすることにより、並びに/又は結合した配列c-aを結合した配列a-bよりも多くの安定化塩基を含むように設計することにより、容易に達成される(「より多く」の必要条件は、配列a-bがG-C塩基対及び/又は安定化塩基を含有しない状況を含む)。代わりに、又は更に、結合した配列a-bは、結合した配列c-aよりも多くの不安定化塩基を含むように設計することができる(「より多く」の必要条件は、配列c-aが不安定化塩基を含有しない状況を含む)。いくつかの実施形態では、a'-c'はその3'端で伸長をブロックされる。

フォワードの2つのプライマーセットは、半ネステッド増幅のための単純な従来のリバースプライマー又はリバースの2つのプライマーセットと用いることができる。

図3を参照して、リバースの2つのプライマーセットの内側プライマーは、第一の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列fを含み、f'はe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fはその5'端で、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する。この第一の鎖は:一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに第一の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列e'の3'側にある第一の鎖鋳型配列h'に相補的ではない、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列gを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖形態(すなわち、g-e/g'-e')の結合した配列g-eのT_mは、二本鎖形態(すなわち、e-f/e'-f')の結合した配列e-fのT_mより高い。これは、例えば、結合した配列g-eを結合した配列e-fよりも長く及び/若しくははよりGCリッチにすることにより、並びに/又は結合した配列e-fよりも多くの安定化塩基を含むように、二本鎖形態の結合した配列g-eのT_mが、二本鎖形態の結合した配列e-fのT_mより高い、結合した配列を設計することにより、容易に達成される(「より多く」の必要条件は、配列e-fがGC塩基対及び/又は安定化塩基を含有しない状況を含む)。代わりに、又は更に、結合した配列e-fは、結合した配列g-eよりも多くの不安定化塩基を含むように設計することができる(「より多く」の必要条件は、配列g-eが不安定化塩基を含有しない状況を含む)。いくつかの実施形態では、e'-g'はその3'端で伸長をブロックされる。

いくつかの実施形態では、クランプ配列c及びgは、存在する場合、増幅の間コピーすることができない。RNA又はRNA類似体、例えば加水分解耐性RNA類似体は、増幅の間、DNA依存性ポリメラーゼによってコピーされることなく二本鎖クランプ配列を形成するために必要な塩基対形成を提供するために用いることができる。最も一般的なRNA類似体は、2'-O-メチル-置換RNAである。特異的な塩基対形成はできるが、コピーできない他の核酸類似体は、ロックド核酸(LNA)又はBNA(架橋化核酸)、モルフォリノ、及びペプチド核酸(PNA)を含む。これらのオリゴヌクレオチドは異なる主鎖糖、又はPNAの場合、リボースリン酸の代わりにアミノ酸残基を有するが、それらは依然としてワトソンクリック塩基対形成によりRNA又はDNAに結合するが、ヌクレアーゼ活性に免疫性である。それらは、酵素的に合成できず、ホスホラミダイト戦略、又はPNAに関してはペプチド合成の方法を使用して合成的にのみ得ることができる。

所望であれば、クランプ配列cは、a-c/a-c'がヘアピン構造から形成されるように相補的配列c'に共有結合的に連結することができるが、これはプライマーの二本鎖クランプ部分の効率的な形成に必ずしも必要ではない。同様に、クランプ配列gは、必要ではないが、e-g/e'-g'がヘアピン構造から形成されるように相補的配列g'に共有結合的に連結することができる。

3つのプライマーセットのプライマー
いくつかの実施形態では、増幅の各サイクルで産生されるコピー数を更に増加するために、第三のプライマーが標的核酸配列の1端又は両端に用いられ得る。図4及び図5は、例示的な「フォワード」及び「リバース」の3つのプライマーセットを示す。3つのプライマーセットは、上述のように外側プライマー及び上述の内側プライマーと構造が基本的に同じ中間プライマーを含む。更なるプライマーは、中間プライマーの鋳型鎖5'にハイブリダイズするように設計された内側プライマーである。

フォワードの3つのプライマーセットの内側プライマーは、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'はa'に隣接する、及びa'の5'側にある。一本鎖プライマー配列bはその5'端で、一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d、並びにプライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する。クランプ配列c2は、内側プライマー(c1)に使用するクランプ配列と同じ、又は異なってよい。好ましい実施形態では、c1及びc2は異なる配列である。同様の検討を、2つのプライマーセットの内側プライマーに関して上述したように、3つのプライマーセットの内側プライマーの設計に適用し、及びリバースの3つのプライマーセットの内側プライマー(図5に示す)は、フォワードの3つのプライマーセットの内側プライマーと同じ構造を有する。1つ又は複数(又は全部)のクランプオリゴヌクレオチド(図4のd'-c1'及びa'-d'-c2'並びに図5のh'-g1'及びe'-h'-g2')は、それらの3'端で伸長をブロックされ得る。フォワードの3つのプライマーセットは、半ネステッド増幅のための単純な従来のリバースプライマーと、リバースの2つのプライマーセットと、又はリバースの3つのプライマーセットと用いることができる。

いくつかの実施形態では、プライマーアニーリング及び伸長の順序は、別のプライマーに関して「内側」である任意のプライマーが、他のプライマーより前にアニール及び伸長を開始するように、プライマー配列のT_mに基づいて制御される。したがって、例えば、2つのプライマーセットでは、内側プライマーは外側プライマーの前にアニール及び伸長を開始し、3つのプライマーセットでは、内側プライマーは中間プライマーの前にアニール及び伸長を開始し、中間プライマーは外側プライマーの前にアニール及び伸長を開始する。例えば、図4に示す実施形態では、プライマー配列のT_mは、dのT_m<aのT_m<bのT_mという関係を有する。図5に示す実施形態では、プライマー配列のT_mは、hのT_m<eのT_m<fのT_mという関係を有する。上記したように、T_mは配列長、GC含量、及び任意選択により、安定化及び/又は不安定化塩基の存在の関数である。

更なるネステッドプライマーは、上述の原理に基づいて設計することができる。

ポリメラーゼ
本開示の方法は、増幅のためポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは5'から3'のエクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼである。ポリメラーゼは、第一のプライマーから伸長する鎖が第一のプライマーに関して「外側」である第二のプライマーから伸長する鎖を形成する重合によって置換され得るような条件下で使用される。好都合には、ポリメラーゼは、鋳型鎖に相補的な鎖を置換することができ、「鎖置換」と呼ばれる特性である。鎖置換は、鋳型分子につき標的配列の複数コピーの合成をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の方法における使用のためのDNAポリメラーゼは、非常に加工性である。例示的なDNAポリメラーゼは、5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するTaq DNAポリメラーゼの変異体、例えば、Taq DNAポリメラーゼ(ABI社)のStoffel断片、SDポリメラーゼ(Bioron社)、USPN 5474920に記載の5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損する変異体Taq、Bcaポリメラーゼ(Takara社)、Pfx50ポリメラーゼ(Invitrogen社)、Tfu DNAポリメラーゼ(Qbiogene社)を含む。熱サイクリングが行われる場合(PCRのように)、DNAポリメラーゼは好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼである。以下のTable 2(表2)は、5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を有さないが、熱安定性を伴う鎖置換活性を有するNew England Biolabs社から入手可能なポリメラーゼを列挙する。

いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼとトポイソメラーゼの一部のと間の融合、例えばTOPOTAQ(商標)(Fidelity Systems, Inc.社)を含む。

鎖置換は、ヘリカーゼ等鎖置換因子の使用によって促進もされる。鎖置換因子の存在下で鎖置換を実行することができる任意のDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼがそのような因子の不在下で鎖置換を実行しない場合でさえも、本開示の方法での使用に好適である。本明細書に記載の方法において有用な鎖置換因子は、BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット(Tsurumiら、J. Virology 67(12):7648〜7653頁(1993))、アデノウイルスDNA結合タンパク質(Zijderveld及びvan der Vliet、J. Virology 68(2):1158〜1164頁(1994))、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8(Boehmer及びLehman、J. Virology 67(2):711〜715頁(1993); Skaliter及びLehman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10665〜10669頁(1994))、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB; Rigler及びRomano、J. Biol. Chem. 270:8910〜8919頁(1995))、並びにウシ胸腺ヘリカーゼ(Siegelら、J. Biol. Chem. 267:13629〜13635頁(1992))を含む。ヘリカーゼ及びSSBは、熱安定性形態で入手可能であり、したがってPCRにおける使用に好適である。

増幅
上記のプライマーセットは、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で、試料核酸と接触させる。望ましい核酸増幅方法は、用いられる反応条件下で鎖置換可能な5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して行われる。この増幅は、増幅反応に用いられる全てのプライマーの配列を含むアンプリコンを産生する。プライマーセットは、好都合には、別々のオリゴヌクレオチドの形態で増幅混合物に添加することができる。例えば、2つのプライマーセットは、3つのオリゴヌクレオチド(内側プライマーがヘアピン構造を含まないと仮定して)からなることができ、3つのプライマーセットは5つのオリゴヌクレオチド(内側プライマーも中間プライマーも、ヘアピン構造を含まないと仮定して)からなることができる。

上記のように、2つのプライマーセットを使用する半ネステッド増幅に関して、PCRの対数期中、3^{サイクル数}までの速さが達成できる。半ネステッドの2つのプライマーセットを使用する増幅は、単一コピーの核酸の検出に必要な増幅サイクル数を約12%から約42%(例えば37%)減らすことができる。これは、約23〜27増幅サイクル内で生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する(そうでなければ、40又はそれより多くのサイクルを必要とする)。いくつかの実施形態では、半ネステッドの、2つのプライマーセットのPCRは、23、24、25、26、又は27増幅サイクルで生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。

以下のTable 3(表3)は、本明細書に記載の異なる実施形態を使用して、単一コピー核酸を10¹²コピーまで増幅するために必要なサイクル数を示す。上記のように、2つのプライマーセットを使用する完全ネステッド増幅に関して、PCRの対数期中、6^{サイクル数}までの速さが達成できる。完全ネステッドの2つのプライマーセットを使用する増幅は、単一コピーの核酸の検出に必要な増幅サイクル数を約36%から約66%(例えば61%)減らすことができる。これは、約13〜17増幅サイクル内で生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。いくつかの実施形態では、完全ネステッドの、2つのプライマーセットのPCRは、13、14、15、16、又は17増幅サイクルで生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。

上記のように、3つのプライマーセットを使用する半ネステッド増幅に関して、PCRの対数期中、4^{サイクル数}までの速さが達成できる。半ネステッドの3つのプライマーセットを使用する増幅は、単一コピーの核酸の検出に必要な増幅サイクル数を約25%から約55%(例えば50%)減らすことができる。これは、約20増幅サイクル内で生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する(そうでなければ、40又はそれより多くのサイクルを必要とする)。いくつかの実施形態では、半ネステッドの、3つのプライマーセットのPCRは、18、19、20、21、又は22増幅サイクルで生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。

上記のように、3つのプライマーセットを使用する完全ネステッド増幅に関して、PCRの対数期中、8^{サイクル数}までの速さが達成できる。完全ネステッドの3つのプライマーセットを使用する増幅は、単一コピーの核酸の検出に必要な増幅サイクル数を約42%から約72%(例えば67%)減らすことができる。これは、約11〜15増幅サイクル内で生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。いくつかの実施形態では、完全ネステッドの、3つのプライマーセットのPCRは、9、10、11、12、又は13増幅サイクルで生体試料の単一コピーの核酸の検出を促進する。

いくつかの実施形態では、増幅工程はPCRを使用して実施される。リアルタイムPCR反応の実行に関して、反応混合物は通常、適切な緩衝液、約1から約10mMの範囲、例えば約2 から約8mMの範囲のマグネシウムイオン(Mg²⁺)の供給源、ヌクレオチド、並びに任意選択により界面活性剤、及び安定剤を含有する。1つの好適な緩衝液の例は、約5mMから約85mMの濃度のTRIS緩衝液であり、10mMから30mMの濃度が好ましい。一実施形態では、TRIS緩衝液の濃度は、2倍強度(2×)形態の反応混合物中、20mMである。反応混合物は約7.5から約9.0のpH範囲を有することができ、典型的には約8.0から約8.5のpH範囲である。ヌクレオチドの濃度は、約25mMから約1000mMの範囲であってよく、典型的には約100mMから約800mMの範囲である。dNTP濃度の例は、100、200、300、400、500、600、700、及び800mMである。Tween 20、Triton X 100、及びNonidet P40等の界面活性剤もまた、反応混合物に含まれ得る。ジチオスレイトール(DTT、クリーランド試薬)又はメルカプトエタノール等の安定化剤も含まれ得る。更に、マスターミックスは、任意選択によりdUTP並びにウラシルDNAグリコシラーゼ(ウラシル-N-グリコシラーゼ、UNG)を含有し得る。マスターミックスは、Applied Biosystems社、Foster City、CAにより市販されている(TaqMan(登録商標)Universal Master Mix、cat. nos. 4304437、4318157、及び4326708)。

標識戦略
任意の好適な標識戦略を本明細書に記載の方法に用いることができる。反応を単一の増幅産物の存在に関して分析する場合、普遍的検出プローブを増幅混合物中で用いることができる。特定の実施形態では、リアルタイムPCR検出は普遍的qPCRプローブを使用して行うことができる。好適な普遍的qPCRプローブは、SYBR Green、Pico Green (Molecular Probes, Inc.社、Eugene、OR)、Eva Green (Biotinum社)、エチジウムブロマイド(Zhuら、1994、Anal. Chem. 66:1941〜48頁を参照)等の、二本鎖DNA色素を含む。

いくつかの実施形態では、1つ又は複数の標的特異的qPCRプローブ(すなわち、検出される標的ヌクレオチド配列に特異的)を増幅混合物中で用いて、増幅産物を検出する。標識の賢明な選択によって、異なる標識が励起され及び/又は単一の反応中異なる波長が検出される(「多重検出」)分析を行うことができる。例えば、FluorescenceSpectroscopy (Pesceら、Eds.) Marcel Dekker社、New York、(1971); Whiteら、Fluorescence Analysis: A Practical Approach、Marcel Dekker社、New York、(1970); Berlman、Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules、2nd ed.、Academic Press社、New York、(1971); Griffiths、Colour and Constitution of Organic Molecules、Academic Press社、New York、(1976); Indicators (Bishop、Ed.). Pergamon Press、Oxford、19723;及びHaugland、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、Molecular Probes、Eugene (1992)を参照。

いくつかの実施形態では、増幅混合物中で用いる1つ又は複数のプライマー上の標識を含むことが便利であり得る。

例示的な自動化及びシステム
いくつかの実施形態では、標的核酸は、自動化した試料の操作及び/又は分析プラットフォームを使用して検出される。いくつかの実施形態では、市販の自動化分析プラットフォームが利用される。例えば、いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)システム(Cepheid社、Sunnyvale、CA)が利用される。

本明細書に記載の方法は、GeneXpertシステムの使用に関して例示する。例示的な試料調製及び分析方法を以下に記載する。しかし、本発明は、特定の検出方法又は分析プラットフォームに限定されない。当業者は、任意の数のプラットフォーム及び方法が利用され得ることを認識する。

GeneXpert(登録商標)は、内蔵式の単回使用のカートリッジを利用する。試料抽出、増幅、及び検出は全て、この内蔵式の「カートリッジの実験室」内で行われ得る(例えば、米国特許第5,958,349号、第6,403,037号、第6,440,725号、第6,783,736号、第6,818,185号を参照;これらのそれぞれが、この記載に関してその全体が参照により本明細書に組込まれる)。

カートリッジの成分は、限定はされないが、試薬、フィルター、並びに標的核酸の抽出、精製、及び増幅に有用な捕獲技術を含有する処理チャンバーを含む。バルブはチャンバーからチャンバーへの液体の移動を可能にし、核酸溶解及び濾過成分を含有する。光学窓は、リアルタイム光学検出を可能にする。反応チューブは、非常に速い熱サイクリングを可能にする。

いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)システムは、スケーラビリティーのための複数のモジュールを含む。各モジュールは、試料操作及び分析成分とともに、複数のカートリッジを含む。

試料をカートリッジに添加後、試料を溶解緩衝液と接触させ、放出された核酸は、シリカ又はガラス基質等の核酸結合基質に結合する。次いで試料の上澄みを除去し、Tris/EDTA緩衝液等溶出緩衝液で核酸を溶出する。次いで溶出液をカートリッジ中で処理して、本明細書に記載のように標的遺伝子を検出し得る。いくつかの実施形態では、溶出液を使用して、カートリッジに凍結乾燥粒子として存在する少なくともいくつかの試薬を戻す。

いくつかの実施形態では、PCRを使用して増幅し、1つ又は複数の標的核酸の存在を検出する。いくつかの実施形態では、PCRは、AptaTaq(Roche社)等、ホットスタート機能を有するTaqポリメラーゼを使用する。

いくつかの実施形態では、オフライン遠心分離を使用して、細胞含量が少ない試料によるアッセイ結果を改善する。試料を、添加する緩衝液あり又はなしで、遠心分離し、上澄みを除去する。次いで、ペレットを、より少ない容積の上澄み、緩衝液、又は他の液体中に再懸濁する。次いで、再懸濁したペレットを、先に記載したようにGeneXpert(登録商標)カートリッジに添加する。

キット
本明細書に記載の方法を行うためのキットも予期する。そのようなキットは、これらの方法のいずれかを実行するのに有用な1つ又は複数の試薬を含む。キットは通常、1つ又は複数の別々の組成物として、又は任意選択により、試薬の適合性を可能にする混合として、試薬を保持する1つ又は複数の容器を有するパッケージを含む。キットは、緩衝液、希釈液、標準物質、及び/又は試料の処理、洗浄、若しくはアッセイの任意の他の工程の実施に有用な任意の他の材料等、使用者の観点から望ましい他の材料も含み得る。

キットは、好ましくは、本明細書に記載の1つ又は複数のスクリーニング方法を行うための使用説明書を含む。キットに含まれる使用説明書は、包装材料に添付されるか添付文書として含むことができる。使用説明書は、典型的には手書き又は印刷物であるが、それらはそのようなものに限定されない。そのような使用説明書を保管し、それらを末端使用者に伝達できる任意の媒体を用いることができる。そのような媒体は、限定はされないが、電子保存媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学式媒体(例えば、CD ROM)等を含む。本明細書で使用する場合、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

(実施例1)
プライマー/標的構造上の「クランプ」オリゴの効果の確認
「クランプ」オリゴの存在あり及びなしで、プライマーオリゴ(「プライマー」と呼ばれるが、本実験においてはそのように使用されない)及び相補的標的配列のTmを測定する実験を実施した。標的オリゴを5'蛍光タグ(フルオレセイン)によって合成し、プライマーを蛍光クエンチング部分に組込む(図6参照)。赤色は2'-O-メチル主鎖の存在を示す。試験したオリゴ配列を以下のTable 4(表4)に列挙する。図6の構造中に示す右回りの最も二重らせん領域のTmを、温度が上昇し、蛍光及びクエンチャーがこの二重らせん領域の融解によって分けられる結果生じる蛍光の増加に従って測定した。

標的結合のためのプライマーの領域が、図6Aに示すように、クランプによってb/b'結合に制限される場合、次いでその領域のTmは、ab/a'b'結合を有する図6Bの状況下よりもずっと低いことが予測される。以下のTable 4(表4)には、この及び以下の実験に使用するオリゴを列挙する。Table 5(表5)は、クランプオリゴの存在下又は不在下での、プライマー及び標的オリゴの予測される及び観察されるTmである。

全てのハイブリッド融解分析の条件は:0.01M tris-HCl、0.05M KCl及び0.006M MgCl₂であった。全てのオリゴヌクレオチドは1マイクロモル濃度であった。上記のTable 4(表4)のオリゴ混合物を95℃に加熱し、45℃までゆっくりと冷却し、フルオレセイン蛍光をCepheid SmartCycler(商標)を使用してモニターした。蛍光変化の速度が最大になる温度としてTmを決定した。

b/b'及びab/a'b'のTmをソフトウェア(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer)を使用して予測した。観察したTmは、標的の領域d'-a'が、クランプオリゴの存在下で、一本鎖を維持し、ハイブリダイゼーション可能である構造と一致する。

隣接プライマー(16147〜16149)の存在も、1マイクロモル濃度で、図7Aで図解するように、測定したTmにわずかな違いを作り出した。

(実施例2)
外側(隣接)プライマーの伸展性
図7Aに図式的に示す外側(隣接)プライマーの伸展性を、Table 6(表6)に示す条件下でのPCR反応で試験した。

全ての反応は、10mM Tris-HCl、0.125mM 各dATP、dTTP、dCTP及びdGTP、上記のtable 1(表1)のプライマーオリゴ16140 0.15マイクロモル濃度、table 1(表1)の標的オリゴ16145 0.125マイクロモル濃度、table 1(表1)のクランプオリゴ16142 0.125マイクロモル濃度、45mM KCl、3.5mM MgCl₂、DNAポリメラーゼ活性を有するが、5'から3'又は3'から5'エクソヌクレアーゼ活性を有さない14ユニットのAmpliTaqCS、及び組込み反応に温度活性化「ホットスタート」を提供する、15ユニットのTaqポリメラーゼに対する抗体を含有した。

上記のTable 6(表6)につき、0.125mMの隣接プライマー又は隣接プライマーなしを添加した;95℃まで温度を上昇させてオリゴを分離し、同時にポリメラーゼを活性化しながら、SmartCyclerを使用して経時的に反応をモニターし、次いで温度を60度まで下げて、オリゴをアニールし、任意のプライマー伸長を起こした。結果を6Bに示す。3つの生じるトレースは、わずかに異なるクランプによる別々の反応である;平らなトレースは、外側(隣接)、置換プライマーの存在なしである。これらの結果は、外側(隣接)プライマーが存在する場合にクエンチャーの置換が生じる鎖置換反応を示す。

Claims (20)

1. 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーの形態である、又は第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第一のプライマーが、
   第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
   a'に隣接する、及びa'の5'側にある、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
   を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
   一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
   第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではなく、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
   を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結し、かつ、
   二本鎖形態の結合した配列c-aのT _m が、二本鎖形態の結合した配列a-bのT _m より高い、
   核酸プライマーセット。
2. 第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマーを更に含む、請求項1に記載のプライマーセット。
3. 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
   (a)試料を、
   (i)第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
   a'に隣接する、及びa'の5'側にある第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
   を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
   一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
   第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある、第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
   を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマー;並びに
   (ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
   と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程;並びに
   (b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
   を含み、かつ、
   二本鎖形態の結合した配列c-aのT _m が、二本鎖形態の結合した配列a-bのT _m より高い、
   方法。
4. DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含む、請求項3に記載の方法。
5. 結合した配列c-aが、結合した配列a-bよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項1又は2に記載のプライマーセット。
6. 前記増幅が、PCRの対数期中に3^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、請求項3に記載の方法。
7. 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、12%〜42%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項3又は6に記載の方法。
8. 第二のプライマーが、第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーの形態である、又は第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第二のプライマーが、
   第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列eを含む第二の外側プライマー;並びに
   第二の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列f
   を含み、f'がe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
   一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに
   第二の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列e'の3'側にある第二の鎖鋳型配列h'に相補的ではなく、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列g
   を含む二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマー
   を含み、かつ、
   二本鎖形態の結合した配列g-eのT _m が、二本鎖形態の結合した配列e-fのT _m よりも高い、
   請求項1、2、又は、5に記載のプライマーセット。
9. 結合した配列g-eが、結合した配列e-fよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項8に記載のプライマーセット。
10. 前記増幅が、PCRの対数期中に6^{サイクル数}までの速さで標的核酸を増幅する、請求項8又は9に記載のプライマーセット。
11. 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、36%〜66%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項8から10のいずれか一項に記載のプライマーセット。
12. クランプ配列cが、増幅中にコピーされ得ない、請求項1、2、5、及び8から11のいずれか一項に記載のプライマーセット。
13. クランプ配列cが、2'-O-メチルRNAを含む、請求項12に記載のプライマーセット。
14. クランプ配列c及びgが、増幅中にコピーされ得ない、請求項8から13のいずれか一項に記載のプライマーセット。
15. クランプ配列c及びgが、2'-O-メチルRNAを含む、請求項14に記載のプライマーセット。
16. 第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、ヘアピン配列を含まない、請求項1、2、5、及び8から15のいずれか一項に記載のプライマーセット。
17. 第一の内側プライマー及び第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列のいずれもがヘアピン配列を含まない、請求項8から16のいずれか一項に記載のプライマーセット。
18. 第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列cが相補的な配列c'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列gが相補的な配列g'に連結するヘアピン配列を含む、請求項1、2、5、及び8から15のいずれか一項に記載のプライマーセット。
19. 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーの形態である、又は前記第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも3つの第一のプライマーが、
    第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
    第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
    一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
    第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
    を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
    第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
    一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列a;
    プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
    プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
    を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマーを含み、かつ、
    二本鎖形態の結合した配列c1-dのT _m が、二本鎖形態の結合した配列d-aのT _m より高く、二本鎖形態の結合した配列c2-d-aのT _m が、二本鎖形態の結合した配列d-a-bのT _m より高い、
    核酸プライマーセット。
20. 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
    (a)試料を、
    (i)第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
    第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
    一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
    第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
    を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
    第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
    一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;
    プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
    プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にある、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
    を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマー
    を含む、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマー、並びに
    (ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
    と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程、並びに
    (b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
    を含み、かつ、
    二本鎖形態の結合した配列c1-dのT _m が、二本鎖形態の結合した配列d-aのT _m より高く、二本鎖形態の結合した配列c2-d-aのT _m が、二本鎖形態の結合した配列d-a-bのT _m より高い、
    方法。