JP6820924B2 - フルクトース−含有基質からプシコースを生産する方法 - Google Patents

Description

本発明は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を産業的規模に短時間内に高い生産性で得る方法、前記方法で得られたプシコース−含有生産物を分離して液状または粉末状のプシコースを連続的に製造する方法に関する。

糖シロップを製造する生物学的方法の開発は、主に酵素または菌体を利用して高い転換率に特定の糖を高濃度に生産することに集中されてきた。

このような糖シロップ生産開発の理由は、糖シロップ生産以降に濃縮などの後続工程が必要であるため、このような後続工程の必要性を最小化し、高い純度に特定の糖を生産することによって特定の糖の分離および精製に要する費用と時間を減らそうとした。

最近、特定組成の糖シロップの場合、優れた甘美質と甘美度を有するため、生物学的生産工程以降に、追加的な濃縮、分離および精製工程の遂行を最小化して生産されたシロップ自体または最小限の後続工程を経た後に製品化する必要性がある場合がある。

また、特定の糖を含有するシロップを産業的規模に短時間内に高い生産性で生産する必要があり、同時に安定的にシロップを製造する必要性がある。

本発明は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応により、フルクトース−含有基質から高い生産性でプシコースを産業的規模に生産することができるプシコース−含有生産物を製造する方法を提供する。

また、本発明は、前記方法で得られたプシコース−含有生産物を分離して液状または粉末状のプシコースを製造する方法を提供する。

本発明の一例は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造する方法に関するものである。

より詳しくは、本発明は、生産物内に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上で生産する反応流速１を基準にして、８．５乃至２０の反応流速で固定化反応を行い、生産物内のプシコース、グルコースおよびフルクトースの固形分含有量１００重量％を基準にして、プシコースおよびグルコースの合計固形分含有量を２０重量％未満に含むプシコース−含有生産物を製造する方法に関するものである。

本発明のまた他の一例は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造し、高純度分離装置を利用してプシコース含有量８０％以上または９０重量％以上（例、９０重量％）のプシコース分画とプシコース含有量５％以下の糖組成を有するラフィネート（ｒａｆｆｉｎａｔｅ）分画を分離し、前記プシコース分画は追加工程を行って液状または粉末状製品でプシコースを得る方法に関するものである。

以下、本発明をより詳しく説明する。

本発明の一例は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造する方法に関するものである。

前記固定化反応に用いられる基質は、フルクトース−含有基質であって、効率的なプシコース生産のために、基質として用いられるフルクトースの含有量は、全体フルクトース−含有基質の固形分含有量１００（ｗ／ｖ）％を基準にして７５乃至９５％（ｗ／ｖ）、例えば、８０乃至９１％（ｗ／ｖ）であってもよい。前記フルクトースは、緩衝溶液または水（例えば蒸溜水）に溶解された溶液状態でプシコース−含有生産物を製造する方法に用いられてもよい。前記フルクトース−含有基質は、プシコース転換反応に利用されるフルクトースを含む限り特に限定されず、例えば異性化糖シロップであってもよい。異性化糖シロップをプシコース生産用基質として用いる場合、異性化糖シロップ生産工程とプシコース生産工程を一連の工程で連続して行うこともできる。

本発明の方法により得られるプシコース−含有生産物は、プシコースだけでなく、フルクトース、グルコース、および多様なオリゴ糖を含有することができる。前記生産物に含まれているプシコースおよびグルコースの合計含有量は、プシコース−含有生産物に含まれているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、２０重量％未満であってもよく、例えば９重量％以上乃至２０重量％未満であってもよい。前記生産物に含まれているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、プシコースおよびグルコースの合計固形分含有量が９重量％以上乃至２０重量％未満であり、フルクトース含有量が８０重量％超過乃至９１重量％であってもよい。前記生産物に含まれているプシコース含有量は、フルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、４重量％乃至２９重量％以下であってもよい。

本発明に適用可能なプシコース生産用生体触媒は、例えば酵素または菌体は転換反応温度、反応時間、基質のフルクトース含有量などの因子により影響を受けることができる。例えば、反応温度５０乃至６０で１時間以内に基質内フルクトースからプシコースの転換率が４乃至２９％であるものを用いることができる。

前記生体触媒は、プシコース転換酵素またはプシコース転換酵素を生産する菌体であってもよく、前記酵素または菌体は、ビーズに含まれて固定化反応のためのカラムに充填されてもよい。

前記プシコース生産用生体触媒が菌体である場合、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株またはプシコースエピマー化酵素をコードする遺伝子が導入された組換え菌株であってもよい。

本発明の具体的一例において、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株としては、高い安定性を有しながらも、高収率でプシコースエピマー化酵素を生産することができる菌株であってもよく、前記組換え菌株は、多様な宿主細胞、例えば大腸菌、バシラス属菌株、サルモネラ属菌株およびコリネバクテリウム属菌株などを用いることができるが、好ましくはＧＲＡＳ菌株であるコリネバクテリウム属菌株であってもよく、コリネバクテリウムグルタミクムであってもよい。

組換え菌株を用いた場合、プシコースエピマー化酵素は、多様な菌株に由来する酵素のコード遺伝子を用いることができ、例えば韓国特許公開２０１４−００２１９７４に記載されたトレポネマプリミティア由来酵素、韓国特許公開２０１４−００８０２８２に記載されたルミノコッカストロクエス由来酵素および韓国登録特許１０−１３１８４２２号に記載されたクロストリジウムシンデンス由来酵素であってもよく、またエンシファーアドヘレンス由来酵素であってもよい。具体的な一例において、本発明によるプシコースエピマー化酵素は、クロストリジウムシンデンス由来酵素であってもよく、例えば配列番号７のアミノ酸配列を有し、配列番号８または配列番号９の核酸配列を含む。配列番号８の核酸配列は、大腸菌最適化核酸配列であり、配列番号９はコリネバクテリウムに適するように変形された核酸配列である。

本発明の一例による組換え菌株の製造において、前記プシコースエピマー化酵素をコードする核酸配列の上部に位置する調節配列を用いて酵素の発現を調節することができ、調節配列は、転写プロモーターを必須的に含み、追加的にリボソーム結合領域および／またはスペーサ配列などを含むことができる。前記調節配列を構成する要素は、直接連結されたり、１個乃至１００個の塩基、例えば５個乃至８０個の塩基を有する核酸配列のリンカーを一つ以上含んで連結されてもよい。

一具体的な例において、前記転写プロモーターは、コリネバクテリウム属菌株でプシコースエピマー化酵素をコードする核酸配列を発現する核酸分子であってもよいが、ｔａｃ１、ｔａｃ２、ｔｒｃ、ｓｏｄプロモーターであってもよい。ｓｏｄプロモーターは、コリネバクテリウムグルタミクムに由来するものであり、好ましくは配列番号１の核酸配列をコアー領域として含む。ｔｒｃプロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃ ＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものである。Ｔａｃ１プロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃ ＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものである。Ｔａｃ２プロモーターは、大腸菌由来プロモーターであり、ｔｒｐプロモーターとｌａｃ ＵＶ５プロモーターの組み合わせで製造されたものであって、前記Ｔａｃ１プロモーターの配列を変形して最適化した形態である。

前記リボソーム結合領域とスペーサは、化学的に直接連結されたりその中間にリンカー核酸配列を介して間接的に連結されてもよい。本発明の一例においてリボソーム結合領域（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）およびスペーサ配列は５'から３'の順に順次連結された一つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明の一例によるプロモーター配列、リボソーム結合領域（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）およびスペーサ配列の核酸配列を下記表１に示す。表１で濃く下線表示された部分は、調節配列のうち、リボソーム結合領域、スペーサ配列、リンカー配列などを示す。

本発明によるプシコースエピマー化酵素は、酵素活性および熱安定性に優れたものが好ましく、そこで、本発明の具体的な例において、転写プロモーターまたは調節配列は、プシコースエピマー化酵素をコーディングする遺伝子との組み合わせが重要であり、本発明に使用されたプシコースエピマー化酵素とはｔａｃ１、ｔａｃ２、ｔｒｃ、ｔｒｉｐ、ｓｏｄプロモーターの全てが適正以上の蛋白質発現を提供することができ、ｓｏｄプロモーターを用いた場合には、蛋白質のフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）が堅固で熱安定性が高く現れる結果を得ることができるため、より好ましい。

組換え菌株を用いたプシコース生産方法などは、韓国特許公開２０１４−００２１９７４、韓国特許公開２０１４−００８０２８２および韓国登録特許１０−１３１８４２２号に記載された方法により行われてもよいが、特に限定されない。

前記プシコース生産方法は、前記コリネバクテリウム属菌株をフルクトース−含有原料と反応させる段階を含む。一具体的な例において、前記コリネバクテリウム属菌株をフルクトースと反応させる段階は、前記菌株または酵素が固定化された担体にフルクトースを接触させる段階により行われてもよい。このように固定化酵素または菌体をフルクトース−含有基質と反応させることによってフルクトースをプシコースに転換してフルクトースからプシコースを生産することができる。

前記プシコース生産方法において、前記反応は、ｐＨ６乃至９．５、例えば、ｐＨ７乃至９、ｐＨ７乃至８またはｐＨ８乃至９の条件下で行われてもよい。

また、前記反応は、３０℃以上、例えば４０℃以上の温度条件下で行われてもよい。温度が８０℃以上になると基質であるフルクトースの褐変現象が起こり得るため、前記反応は、４０乃至８０℃、例えば、５０乃至７５℃、６０乃至７５℃、または６８乃至７５℃の条件下で行われてもよい。

前記反応時間が長いほどプシコース転換率が高くなり、反応時間短くなると生産性が良くなる。例えば、前記反応時間は、０．５時間（３０分）以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上にすることが良い。反応時間が４８時間を超えるとプシコース転換率の増加率が微々であるか、むしろ減少するため、反応時間は４８時間を越えないことが良い。したがって、前記反応時間は、０．５乃至４８時間、１乃至４８時間、２乃至４８時間、３乃至４８時間、４乃至４８時間、５乃至４８時間、または６乃至４８時間にすることができ、産業的および経済的側面を考慮して、０．５乃至４８時間、０．５乃至３６時間、０．５乃至２４時間、０．５乃至１２時間、または０．５乃至６時間程度にすることができるが、これに制限されるのではない。前記条件は、フルクトースからプシコースへの転換効率が最大化する条件として選定されたものである。

前記フルクトースをプシコースに切換させる酵素（例えば、エピメラーゼ）は、金属イオンにより活性化が調節され得るため、前記プシコース生産において、金属イオンを添加するとフルクトースからプシコースへの転換効率、つまり、プシコース生産率が増加することができる。

したがって、前記コリネバクテリウム属菌株を含むプシコース生産用組成物は、金属イオンを追加的に含むものであってもよい。また、前記コリネバクテリウム属菌株を利用したプシコース生産方法は、金属イオンを添加する段階を追加的に含むことができる。一具現例において、前記金属イオンは、前記培養段階の培養培地に添加されたり、前記培養段階が前記金属イオンが添加された培養培地で行われるものであってもよい。他の具現例において、前記金属イオンは、フルクトースに添加されたり、前記コリネバクテリウム属菌株が固定化された担体に添加されたり（フルクトース添加前）、前記コリネバクテリウム属菌株が固定化された担体とフルクトースとの混合物に添加されたり（フルクトース添加後）、またはフルクトース添加時にフルクトースと混合物の形態でまたはそれぞれ添加されてもよい。

前記金属イオンは、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記金属イオンは、マンガンイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオンおよびコバルトイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよく、一例において前記金属イオンは、マンガンイオン、コバルトイオン、またはこれらの混合物であってもよい。前記金属イオンの添加量が０．５ｍＭ未満である場合には、プシコース生産収率増進効果が微々であるため、前記金属イオンの添加量は０．５ｍＭ以上にすることができる。一方、前記金属イオンの添加量が５ｍＭを超えるとその超過量に比べて効果が微々であるため、前記金属イオンの添加量は５ｍＭ以下にすることができる。例えば、前記金属イオンの添加量は、０．５ｍＭ乃至５ｍＭ、例えば、０．５ｍＭ乃至２ｍＭ範囲にすることができる。

本発明によるプシコース生産用酵素または菌体を担体に固定化して用いる場合、前記担体は、固定された菌株、または前記菌株から生産される酵素の活性が長期間維持され得る環境を造成することができるものであって、酵素固定化用途で用いることができる公知の全ての担体であってもよい。例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を用いることができる。アルギン酸ナトリウムは、海草類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類で、マンヌロン酸（β−Ｄ−ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）とグルロン酸（α−Ｌ−ｇｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が組成されており、含有量の面では無作為にベータ−１，４結合をなして形成されて、菌株または酵素が安定的に固定されて優れたプシコース収率を示すことに有利になり得る。

一具体的な例において、プシコースの収率をより増進させるために１．５乃至４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、例えば約２．０％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を菌株の固定化に用いることができる。例えば、菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養液、または前記菌株の破砕物の１乃至２体積倍のアルギン酸ナトリウム水溶液に前記菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を添加して混合した後、前記得られた混合液を注射器ポンプと真空ポンプを用いて約０．２Ｍカルシウムイオン溶液に落としてビーズが生成されるようにすることによって、アルギン酸ナトリウム担体に菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を固定化させることができる。前記酵素は、前記菌株、菌株培養物または前記菌株の破砕物から通常の方法、例えば透析、沈澱、吸着、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法により精製されたものであってもよい。

前記菌体または酵素が担持された担体、例えばビーズは、圧縮処理してビーズの大きさを減少させ、膨潤を減少させてプシコース生産量を増加させ、長期間安定的に用いることができるプシコース生産用ビーズであってもよい。

一例は、プシコース生産酵素または菌体と担体としてアルギン酸またはその塩を含む圧縮処理された圧縮ビーズであって、圧縮処理前のビーズの平均粒径１００を基準に圧縮ビーズの平均粒径が６２乃至１００であるプシコース生産用ビーズであってもよい。圧縮ビーズは、液状基質と反応時に膨潤現象が減少し、具体的にビーズ平均粒径の膨潤率が、液状基質と接触前ビーズ粒径の膨潤率１００を基準にして、１００乃至１５５であってもよく、例えば１００乃至１３０、または１００乃至１２５などであってもよい。

本発明による圧縮ビーズを製造する方法は、金属イオン処理方法と金属イオン処理および膨潤抑制剤でコーティングする方法、および凍結乾燥法を含むことができる。前記金属イオンは、ビーズ圧縮処理は、Ｍｎ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｆｅ^２＋、およびＣｕ^２＋からなる群より選択された１種以上の２価金属イオンであってもよく、膨潤抑制剤は、キトサン、キチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キト−オリゴ糖（Ｃｈｉｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）およびポリリジンからなる群より選択される１種以上であってもよい。前記凍結乾燥法は、−９０℃乃至−１０℃温度範囲で凍結し、１０ｍｔｏｒｒ未満の圧力下で−４０℃乃至２０℃温度範囲で乾燥して行われてもよい。

金属イオン処理方法または金属イオン処理および膨潤抑制剤でコーティングする方法により圧縮処理を行ったビーズの場合、圧縮ビーズの好ましい含水率は５０乃至８８％であってもよい。また凍結乾燥法で製造された圧縮ビーズの場合、好ましい含水率は１０乃至５０％であってもよい。

本発明は、前記製造方法によりプシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質から製造された、プシコース−含有生産物の分離工程を行って液状または粉末状プシコースを製造する方法に関するものである。

具体的な一例は、本発明によりプシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造し；
生産されたプシコース−含有生産物を脱色または脱塩し；
前記脱色物または脱塩物を、プシコースの固形分含有量７５Ｂｒｉｘ（％）以上に濃縮する段階を含む、プシコース−含有液状製品を得るプシコースの製造方法に関するものである。

他の一例として、本発明によりプシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造し；
前記プシコース−含有生産物を脱色または脱塩し；
前記脱色物または脱塩物を高純度分離装置を利用して分離してプシコース含有量９０％以上のプシコース分画とプシコース含有量５％以下の糖組成を有するラフィネート分画を分離し；
分離されたプシコース分画を濃縮し；
濃縮物をプシコースの過飽和状態でプシコースを結晶化し；
結晶化されたプシコースを脱水させて結晶母液と分離して乾燥する段階を含む、プシコース−含有粉末の製造方法に関するものである。

本発明の方法によりフルクトースから収得されたプシコース−含有生産物は、通常の方法により脱塩、脱色、濃縮、ＳＭＢクロマトグラフィーを利用した高純度分離精製、結晶化、遠心分離、濾過などの一つ以上の方法により行われてもよい。前記結晶化段階は、プシコースを過飽和状態に作って結晶化することができ、過飽和状態に到達する方法の一例は、プシコース含有溶液を冷却する方法があるが、これに限定されるのではない。

ＳＭＢクロマトグラフィーを利用した精製段階に用いられるＳＭＢの基本原理は、カラムの間の位置を一定時間の間隔で動くことによって固定相と移動相の向流の流れを模写し、連続的な分離を可能にすることである。吸着剤と親和力が弱くて速く動く物質は、液状の流れ方向に動いて分離された高純度プシコースを含む分画に集まり、吸着剤と親和力が強くて遅く動く物質は、固定相の流れ方向に動いて分離されたプシコース含有量５％以下の糖組成を有するラフィネート分画に集まる。カラムは連続的に連結されており、入口は混合物と移動相、出口は高純度プシコース分画と低い含有量のプシコースを含む分画で構成される。ＳＭＢは、通常４個の区域から構成され、入口と出口の位置により区分される。ＳＭＢ技術は、連続的な分離が可能であり、回分式分離工程に比べて高濃度および高収率の生産物を得ることができる。ＳＭＢ実験は、分離しようとする各物質の吸着度、拡散および分散などの基本的な因子を考慮して具体的条件を設定して行うことができる。

前記分画された高純度プシコースと分離されたプシコース含有量５％以下の糖組成を有するラフィネート分画を分離して、連続的にプシコースを製造することができる。

本発明は、プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物の製造方法および前記方法で得られたプシコース−含有生産物を分離して液状または粉末状のプシコースを連続的に製造する方法であって、産業的規模に短時間内に高い生産性でプシコースを得ることができるという長所がある。

本発明の一実施例によりプシコース生産細胞を含むビーズが充填された固定化反応を利用したプシコース生産において、液状フルクトース含有量が７５％乃至９５％範囲、グルコースとプシコースの合計含有量が５％乃至２０％未満である範囲でのカラム流速による反応物内のプシコース含有量変化を示すグラフである。 本発明の一実施例によりプシコース生産細胞を含むビーズが充填された固定化反応を利用したプシコース生産において、液状フルクトース含有量が７５％乃至９５％範囲、グルコースとプシコースの合計含有量が５％乃至２０％未満（％）範囲でのカラム流速による反応物内のプシコース含有量変化を示す数式である。 本発明のプシコースシロップ製造のための発現組換えベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）の一例を示した図面である。 本発明の一実施例によるプシコース生産手続を示す工程図である。

実施例
実施例１：プシコースの製造システム確立
１−１：プシコース生産菌株の製造
クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｉｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ ３５７０４）に由来するプシコースエピマー化酵素のコード遺伝子（ＤＰＥ ｇｅｎｅ；Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ：ＥＤＳ０６４１１．１）を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチドで合成してＣＤＰＥと命名した。大腸菌に最適化されたポリヌクレオチドとｐＥＴ２１ａベクターから確保したｓｏｄプロモーターとＴ７ターミネーターをＰＣＲを通じてそれぞれの鋳型で確保し、これをオーバーラップＰＣＲ法で一つの鋳型で連結してＴ−ベクタークローニング（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）を通じてｐＧＥＭ Ｔ−イージーベクター（ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングして、ｓｏｄプロモーター（配列番号１）、配列番号８の最適化ＣＤＰＥ配列およびＴ７−ターミネーターを含むポリヌクレオチドの配列を確認した。

前記確認されたポリヌクレオチド全体を制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩ（ＮＥＢ）を用いて発現ベクターであるｐＣＥＳ２０８（Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８：６３９−６４７、２００８）の同一の制限酵素部位に挿入して組換えベクターｐＣＥＳ２０８／プシコースエピマー化酵素（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）を製造した。前記製造された組換えベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）の切断地図を図１に開示した。

前記製造された組換えベクター（ｐＣＥＳ＿ｓｏｄＣＤＰＥ）プラスミドを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換させた。コロニーをピッキング（ｐｉｃｋｉｎｇ）してカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を最終濃度１５ｕｇ／ｍｌに添加したＬＢ培地（トリプトーン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ）４ｍｌに接種した後、培養条件３０℃および２５０ｒｐｍで約１６時間培養した。その後、前記培養液中の１ｍｌを収得して１５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいる１００ｍｌのＬＢ培地に接種して本培養を１６時間以上行った。ビーズビーター（Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）を利用して培養した細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、上澄液だけを取得してサンプルバッファーと１：１に混合後、１００℃で５分間加熱する。準備したサンプルは１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ｇｅｌ）（組成：分離ゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ ｇｅｌ） −３．３ｍｌ Ｈ２Ｏ、４．０ｍｌ ３０％ アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、２．５ｍｌ １．５Ｍ トリスバッファー（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．８）、１００μｌ １０％ ＳＤＳ、１００μｌ、１０％ ＡＰＳ、４μｌ ＴＥＭＥＤ／濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ） −１．４ｍｌ Ｈ２Ｏ、０．３３ｍｌ ３０％ アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、０．２５ｍｌ １．０Ｍ トリスバッファー（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ６．８）、２０μｌ １０％ ＳＤＳ、２０μｌ １０％ ＡＰＳ、２μｌ ＴＥＭＥＤ）に１８０Ｖで約５０分間電気泳動して蛋白質発現を確認した。ＣＤＰＥの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認後、正確な発現量の測定のためにＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ｒｅｓｉｎ）を利用したＨｉｓ−ｔａｇ精製を行い、計算式（発現率（％）＝（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ）／Ｔｏｔａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ））＊１００）を利用して発現率を計算した。前記製造された形質転換コリネバクテリウムグルタミクムは全体水溶性蛋白質を１６．６２ｍｇおよび精製された酵素蛋白質１．７４ｍｇを生産した。

１−２：固定化ビーズの製造
製造例１−１で得られたプシコースエピマー化酵素を生産する組換え菌株を利用してフルクトースからプシコースを製造するために、菌株培養で遠心分離により細胞を回収した。

その後、前記細胞懸濁液に最終体積に乳化剤（Ｒｙｏｔｏ（ｔｋＳｕｇａｒ Ｅｓｔｅｒ、Ｍ−１６９５）を０．０５％（ｗ／ｖ）処理して３５℃（±５℃）で６０分間処理した。反応が完了した菌体は再び遠心分離機を利用して乳化剤が含まれている上澄液は除去した後に菌体を回収した。

固定化ビーズの製造のために、前記回収された菌体は、蒸溜水と混合して最終菌体濃度５％（ｗ／ｖ）に合わせ、水に溶解された４％（ｗ／ｖ）アルギン酸と回収された菌体５％（ｗ／ｖ）を１：１に混合し、混合時に生成された気泡を除去するために４℃で冷蔵保管した。前記冷蔵保管された混合液は、ニードル（Ｎｅｄｄｌｅ）（内径０．２０〜０．３０ｍｍ）を通じて混合液が射出されて滴形態で形成され、重量により落下するようになり、落下された混合液は予め製造された１００ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）溶液で落として硬化して球形または楕円形のビーズ（直径２．０〜２．２ｍｍ）を形成した。前記形成されたビーズは１００ｍＭの塩化カルシウム溶液に浸して撹拌機により均一に混合されながらより硬化するようにした。

前記混合液が全部射出された後に、４〜６時間冷蔵保管しながらビーズをより硬化した後に新たな１００ｍＭの塩化カルシウム溶液と交換して冷蔵状態で約６時間程度硬化させた。硬化が完了したビーズはすくって水気を完全に除去した後、ビーズ体積に対して３倍体積の水を投入した後に１０分間攪拌し、このような過程を３回処理して塩化カルシウム溶液を除去した。洗浄されたビーズは水気を完全除去した後、フルクトース含有基質（１ｍＭ ＭｎＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ包含重量５０ｂｒｉｘフルクトース含有基質）のビーズ体積に対して３倍体積で投入した後に１０分間攪拌し、このような処理を２回以上処理して反応基質として用いられるフルクトース含有基質に交換した。反応基質はｐＨ６．８〜７．２に３ＮのＮａＯＨにより調節され、生産物の種類により液状フルクトースまたは結晶フルクトースが反応基質になることができる。

反応基質に交換されたビーズは、固定化反応カラムに充填後、プシコースシロップ生産に利用した。

１−３：プシコースシロップの製造
実施例１−２で製造されたビーズを固定化反応カラムに充填後、下記のような反応条件でプシコースシロップを生産した。下記の固定化反応カラムに、反応気質溶液が５０％固形分を含み、固形分５０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトースを含有基質（ｐＨ６．８〜７．２）の糖類全体の固形分１００重量％中、フルクトース８８．８重量％およびグルコース４．８重量％を含み、糖類全体の固形分含有量が１００重量％である時、フルクトースの含有量が８８．８重量％以上の重量％で含む原料を提供して２種類の組成の混合糖であるプシコースシロップを製造した。
＜固定化カラム反応条件＞
（１）反応温度：カラムジャケット内部温度５０℃
（２）反応基質：固形分５０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有基質全体固形分中のフルクトース８８．８重量％とグルコース４．８重量％を含み、以外にＤＰ（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が１以上の糖類６．４重量％未満含有基質
（３）生産基準：生産物内の糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２４重量％シロップ生産

前記反応結果、反応液からグルコース：フルクトース：プシコース：オリゴ糖の重量比でグルコース：フルクトース：プシコース：オリゴ糖＝５：６５：２４：６である２４（ｗ／ｗ）％プシコースシロップを収得した。

実施例２：反応流速増加によるプシコース生産
実施例１−２で製造されたビーズを固定化反応カラムに充填後、下記のような反応条件でカラム流速別プシコースシロップの生産量を各流速増加比によりカラム体積５倍数の反応基質を１時間通液してカラム内のプシコース含有量（％）が安定化された地点で比較した。反応気質溶液が５０％（ｗ／ｗ）の固形分を含み、糖類全体の固形分含有量が１００重量％である時、フルクトースの含有量が８８．８重量％およびグルコース４．８重量％で含む原料を供給した。

前記糖含有量分析は、Ｂｉｏｒａｄ社のＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃカラム（８０℃）を用いて水溶媒を０．６ｍｌ／ｍｉｎ流速で適切に希釈されたサンプルを１０μｌ注入してＲＩで検出し、分析時間３０分以内にフルクトース、プシコースおよびその他ＤＰ１以上の糖類が積分されて各面積を分析した。また、各糖類組成別含有量を分析するために、分析時間３０分以内に現れたフルクトース、プシコースおよびその他ＤＰ１以上糖類の全体面積を合わせた値を１００にした時、各糖類組成別面積に該当する値を各糖類の含有量に分析した。
＜固定化カラムの反応条件＞
（１）反応温度：カラムジャケット内部温度５０℃
（２）反応基質：固形分５０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有基質（ｐＨ６．８〜７．２）糖類全体の固形分１００重量％中のフルクトース８８．８重量％およびグルコース４．８重量％を含み、以外にＤＰ１以上の糖類６．４％未満で含有する基質であって、フルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量１００重量％を基準に換算すると、原料基質内のフルクトースの含有量が９４．９％およびグルコース５．１％で含む原料である
（３）カラム流速：実施例１で生産物内の糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上のシロップを生産する反応流速１を基準にして、反応流速を１乃至２０倍に増加させて反応を進行しながら、流速増加比による生産物内のプシコース含有量の評価
（４）生産基準：生産物内のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、グルコースおよびプシコースの合計含有量が９重量％以上〜２０重量％未満の範囲

前記実験結果を下記表２と図１に示した。表２には生産物内の糖類全体の固形分含有量中、フルクトース、グルコースおよびプシコースの合計を１００重量％を基準に各糖類の含有量を示したものである。

表２に示したように、反応基質に含まれているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計固形分含有量が１００重量％である時、フルクトースの含有量が９４．９％およびグルコース５．１％で含む原料を用い、このうちフルクトースがプシコースに転換されるため、転換反応が進行されながらグルコース含有量は５．１％に同一で、基質であるフルクトース含有量９４．９％は漸次に減少しながらプシコース含有量が増加した。

カラム流速の増加によりプシコース転換率は漸次に減少して表２のプシコース含有量２７．１％生産流速に対して２０倍増加流速で反応時、プシコース含有量４．６％を示し、流速を実施例１プシコース含有量２５％生産流速に対して１０倍増加流速で反応した時、グルコースとプシコースの合計含有量が２０重量％未満のシロップ組成物が生産された。

表２のカラム流速別プシコース含有量変化を図１に示してカラム流速増加率による反応物内のプシコース含有量の変化を示した。

図２に示すように、前記数式にカラム流速数値を代入した時、生産物のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、グルコースとプシコースの合計固形分含有量が９．７重量％以上〜２０重量％未満で含まれるシロップ組成物の生産条件は、実施例１プシコース含有量２５重量％生産流速の８．５乃至２０倍で調節が可能なことが分かった。このような結果は、実施例１で２５重量％プシコースシロップ生産条件で使用されたカラム流速よりも約１０倍増加した流速で、グルコースを含むプシコース含有量２０重量％未満のシロップ組成物の生産に使用可能なカラム流速は、実施例１の２５％プシコースシロップ生産流速に比べて約８．５倍増加した結果である。

また、図２の数式を利用して前記固定化カラム反応条件でカラム流速が１０倍増加された反応で生産が完了した生成物の含有量を分析した結果、糖類全体固形分含有量１００重量％を基準にフルクトース７６．５重量％、プシコース１２．３重量％、グルコース４．８重量％およびＤＰ１以上の糖類６．４％を含有する組成物を得ており、これをフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％に換算すると、プシコースとグルコース含有量の合計が１８．２重量％で生産することができた。

実施例３：反応の安定性評価
実施例１−２で製造されたビーズを固定化反応カラムに充填後、実施例２で実施した反応条件と同一のフルクトース−含有基質を用いた。

図２の数式を利用して、生産物に含まれている糖類中のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、プシコースとグルコースの合計含有量が２０重量％未満のカラム流速区間中の流速を選定して固定し、反応日数による生産物内のプシコースの含有量変化を測定した。具体的に、実施例１の糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上生産流速よりも８．５倍高い流速で固定して、１５日間反応して生産物内のプシコースの含有量変化を測定した結果を下記表３に示した。
＜固定化反応条件＞
（１）反応温度：５０℃
（２）反応基質：実施例２の反応気質と同一である
（３）カラム条件：実施例１の糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上生産流速に対して８．５倍増加流速
（４）生産基準：生産物内のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１５重量％以上〜２０未満の重量％範囲

表３に示したように、高い反応流速で１５日間反応する間に生産物内のプシコース含有量をみると、生産物に含まれているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、プシコース含有量１０重量％以上乃至１５重量％未満であり、プシコースとグルコースの合計含有量が１５重量％以上乃至２０重量％未満の組成物が１５日間安定的に生産されることができた。

実施例５：プシコースの連続再循環生産
生産物内に含有されているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、グルコースおよびプシコースの合計含有量２０重量％未満であるプシコースシロップを連続的に生産し、前記生産物からプシコースを分離する工程とフルクトースラフィネート分画で分離して、連続生産工程でプシコース生産システムを樹立した。

具体的に、生産物内に含有されているフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％基準にグルコースおよびプシコース含有量２０重量％未満で生産される条件でプシコース転換反応カラムの流速を調節してプシコース転換反応を行い、高純度分離工程を利用してプシコース−含有生産物からプシコース純度９０％以上の分画とフルクトースが多量含有されているラフィネート分画を分離した。

前記プシコース生産の反応工程全体の模式図を図４に示し、前記図示された工程は生産品質または生産工程により挿入または排除することができる。詳しい生産工程は下記のとおりである。

固形分重量７５Ｂｒｉｘ（％）液状フルクトース（全体固形分含有量が１００重量％である時、フルクトースの含有量が８８．８重量％含有）に水を添加して固形分重量５０Ｂｒｉｘ（％）に合わせた後、５ＮのＮａＯＨを添加してｐＨ７．０に調節して反応原料を製造した。前記反応原料を製造例１−２で製造された菌体固定化ビーズが満たされた反応カラム（５０℃恒温）に供給し、実施例３と実質的に同様な方法で反応原料のフルクトースがプシコースに転換されて反応原料のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量が１００重量％である時、グルコースおよびプシコース含有量２０重量％未満含有シロップを生産した。

前記生産されたプシコースシロップを分離する工程として、生産されたプシコース含有シロップをシロップ内の固形分含有量に対して０．０５％（ｗ／ｗ）の活性炭をシロップに添加して５０℃で３０分間脱色し、脱色が完了したプシコース含有シロップを微細濾過機を通過させて、活性炭を除去した。

活性炭が除去された前記プシコース含有シロップをイオン成分などの不純物を除去するために陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂および陽イオンと陰イオン交換樹脂が混合された樹脂で充填された常温のカラムに時間当りイオン交換樹脂２倍（１〜２倍）体積の速度で通液させて脱塩させた。カルシウム（Ｃａ^２＋）タイプのイオン交換樹脂で充填されたＳＭＢ（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｖｉｎｇ ｂｅｄ）でプシコース：フルクトースの分離比率が０．７：１、流速０．０６ＳＶでプシコース転換反応に使用された原料の総固形分重量が１である時、０．１５比率でプシコースを分離して純度９６％の高純度プシコース分画を固形分含有量４Ｂｒｉｘ（％）で収得した。移動相は食品として用いられるための目的であるため、３次蒸留水を用いた。

同時に高純度プシコース分画以外の組成物の含有量がグルコース５．５％、フルクトース８３．９％、プシコース３．４％、その他糖類４．２％を含むラフィネート分画をプシコース転換反応に使用された原料の総固形分重量が１である時、０．８５比率で収得した。前記分画されたラフィネートは、プシコース転換反応のフルクトース−含有基質に移送されて固形分含有量５０Ｂｒｉｘ（％）に合わせた後、５ＮのＮａＯＨを添加してｐＨ７．０に調節、反応カラムに供給されて再循環されてプシコース転換反応を行った。

前記ＳＭＢで分離された高純度プシコースは、貯蔵槽に移送されて、６０℃で固形分重量８０Ｂｒｉｘ（％）以上に濃縮させ、濃縮された過飽和状態プシコースシロップを冷却決定方法でプシコース結晶を生成させ、遠心脱水後、乾燥する方式で最終的に純度９９％プシコース粉末を８１％収率に収得した。

Claims (14)

1. プシコース生産用生体触媒を利用した固定化反応によりフルクトース−含有基質からプシコース−含有生産物を製造する方法であって、
   ここで、前記生体触媒が固定化反応のためのカラムに充填されたビーズに含まれ、
   ここで、前記生体触媒がプシコースエピマー化酵素またはプシコースエピマー化酵素を発現する菌体であり、かつフルクトースからプシコースへの２０％乃至２９％の転換率を有し、
   ここで転換率がｐＨ６．８乃至７．２および５０乃至６０℃の温度、前記ビーズにおける２．５％（ｗ／ｖ）の濃度の前記生体触媒で５ｈ ^−１ ＳＶの流速で１時間以内の転換を実施することにより測定され、ここで前記基質はフルクトース−含有基質内糖類全体の固形分含有量１００重量％中の８８．８％（ｗ／ｗ）のフルクトースを含む、
   前記固定化反応は、プシコース−含有生産物内に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上で生産する反応流速１を基準にして、８．５乃至２０の反応流速で行い、
   前記プシコース−含有生産物は、生産物内に含まれているプシコース、グルコースおよびフルクトースの固形分含有量１００重量％を基準にして、プシコースおよびグルコースの固形分含有量が９−２０重量％であるプシコース−含有生産物を製造する方法。
2. 前記固定化反応は、プシコース−含有生産物内に含まれている糖類全体の固形分含有量１００重量％中のプシコース含有量２５重量％以上で生産する反応流速１を基準にして、１０乃至１８の反応流速で行うものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記固定化反応は、プシコース−含有生産物内のフルクトース、グルコースおよびプシコースの合計含有量１００重量％を基準にして、プシコースおよびグルコースの合計固形分含有量が９重量％以上乃至２０重量％未満であり、フルクトース含有量が８０重量％乃至９１重量％となるよう行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記フルクトース−含有基質は、基質内糖類全体の固形分含有量１００重量％中の７５重量％乃至９５重量％のフルクトースを含有するものである、請求項１に記載の方法。
5. 前記固定化反応は、フルクトース−含有基質からプシコース転換率が２０乃至２９％を有するプシコース生産用生体触媒と、フルクトース−含有基質内糖類全体の固形分含有量１００重量％中で８０重量％乃至９５重量％のフルクトースを含有する基質を利用して行うものである、請求項１に記載の方法。
6. 前記フルクトース−含有基質は、異性化糖シロップである、請求項１に記載の方法。
7. 前記固定化反応は、菌体または酵素が含有されているビードを２価金属イオンで処理し、キトサン、キチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キト−オリゴ糖（Ｃｈｉｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）およびポリリジンからなる群より選択される１種以上の膨潤抑制剤でコーティングされたビードを用いるものである、請求項１に記載の方法。
8. 前記固定化反応は、プシコース生産用酵素またはプシコース生産菌体を含有するビードを凍結乾燥して圧縮処理されたビードを用いるものである、請求項１に記載の方法。
9. 前記プシコースを生産する菌体は、プシコースエピマー化酵素の遺伝子に形質転換されたコリネバクテリウム菌株である、請求項１に記載の方法。
10. 前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムグルタミクム、コリネバクテリウムアセトグルタミクム（ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアセトアシドフィラム（ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムメラセコラ（ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）およびコリネバクテリウムエフィシエンス（ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）からなる群より選択された１種以上のコリネバクテリウム属菌株である、請求項９に記載の方法。
11. 前記プシコースを生産する菌体は、プシコースエピマー化酵素を生産する菌株である、請求項１に記載の方法。
12. 前記固定化反応は、４０乃至８０℃で０．５乃至４８時間行われるものである、請求項１に記載の方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法によりプシコース−含有生産物を得、
    生産されたプシコース−含有生産物を脱色または脱塩し、
    前記脱色物または脱塩物を、プシコースの固形分含有量７５Ｂｒｉｘ（％）以上に濃縮する段階を含む、プシコース−含有液状製品を得るプシコースの製造方法。
14. 請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法によりプシコース−含有生産物を得、
    生産されたプシコース−含有生産物を脱色または脱塩し、
    前記脱色物または脱塩物を分離してプシコース含有量９０重量％以上のプシコース分画とラフィネート分画を分離し、
    分離されたプシコース分画を濃縮し、
    濃縮物をプシコース過飽和状態で製造してプシコースを結晶化し、
    結晶化されたプシコースを結晶母液と分離して乾燥する段階を含む、
    プシコース−含有粉末を製造する段階を含むプシコースの製造方法。