JP6829466B2

JP6829466B2 - 分光蛍光光度計

Info

Publication number: JP6829466B2
Application number: JP2017059577A
Authority: JP
Inventors: 純堀込; 有香岩谷
Original assignee: Hitachi High Tech Science Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Analysis Corp
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2021-02-10
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: JP2018163006A

Description

本発明は、試料容器内の試料を非破壊で測定する分光蛍光光度計に関する。

試料容器に封入（収容）された密封材料や液体などを分析する方法が知られている（特許文献１〜３）。また、高感度、情報量の観点から蛍光を用いる分光蛍光光度計が知られている（非特許文献１）。

特許文献１には、密封容器内のガス組成を非破壊的に測定する方法で特別形状の容器を用いていることが開示されている。特許文献２には、試験管に液体試料を入れて吸光光度計で液体試料を測定することが開示されている。特許文献３には、液体類が充填された液体充填製品に対して容器や内容物や付属物に欠陥がないことを検査する装置が開示されている。

特開平９−１２７００１号公報特開２００１−３３３８７号公報特開２００３−１３０８０５号公報

日本分光学会測定法シリーズ３「蛍光測定―生物科学の応用」、４５頁から７７頁、１９８３年１月２０日、株式会社学会出版センター

特許文献１〜３に示される測定、検査方法は、所定の容器のみに適用され、特に特許文献２では、測定の都度、試料を開封する必要があり、分析精度を低下させる可能性があった。また、異なる形状の試料容器に対応できない、試料容器に貼られたラベル、バーコード、刻印などの測定上の障害物を回避できないという課題があった。

本発明は、光の通過路（光路）に試料容器の表面にある障害物がなく最適位置で試料容器の試料の蛍光を検出することができる分光蛍光光度計を提供することを目的とする。

本発明の分光蛍光光度計は、光源と、前記光源の光から分光して励起光を生成する励起側分光器と、測定対象の試料を収容した試料容器を保持するとともに、前記励起光の照射位置と前記試料容器が相対的に所定の位置関係になるように、前記試料容器の位置を調整可能な位置調整機構と、前記試料から放出された蛍光を検知する検知器と、を備える。

本発明の分光蛍光光度計の一態様として例えば、前記位置調整機構が、前記試料容器の平面内位置を調整可能な面内調整機構と、前記試料容器の高さ位置を調整可能な高さ調整機構と、前記試料容器を回転させて周方向位置を調整可能な周方向調整機構とのうち少なくともいずれか一つを含む。

本発明の分光蛍光光度計の一態様として例えば、前記位置調整機構が、前記試料容器を回転させて周方向位置を調整しながら、高さも同時に調整可能な回転式高さ調整機構を含む。

本発明の分光蛍光光度計の一態様として例えば、前記位置調整機構は、前記励起光と前記試料容器の断面中央部が一致する様に、前記試料容器の位置を調整可能である。

本発明の分光蛍光光度計の一態様として例えば、前記検知器にて検知された蛍光の強度を演算する制御部を有し、前記制御部は、前記蛍光の強度に基づき前記位置調整機構を制御して、前記試料容器を位置決めする。

本発明の分光蛍光光度計は、試料容器の異なる外形や試料容器の外周に施された刻印やラベルなどの測定妨害因子に対して、位置調整機構でそれぞれの設置位置における散乱光または蛍光を検出することで、蛍光特性を評価する上で最適な位置に試料容器を設定することができる。

本発明に係る分光蛍光光度計の一例を示す構成ブロック図。本発明に係る分光蛍光光度計の位置調整機構の第１実施形態の一例を示し、（ａ）正面図、（ｂ）側面図。本発明に係る分光蛍光光度計の位置調整機構の第２実施形態の一例を示し、（ａ）正面図、（ｂ）側面図。位置調整機構の第１実施形態を用いて試料容器の高さ位置の相違による強度と時間変化を示すグラフ。位置調整機構の第２実施形態を用いて試料容器の高さ位置の相違による強度と時間変化を示すグラフ。本発明に係る分光蛍光光度計の測定において、励起波長に対する蛍光の強度を示すグラフ。本発明に係る分光蛍光光度計の測定において、特定の蛍光波長の強度を示すグラフ。本発明に係る分光蛍光光度計の測定において、特定波長の励起光に対応した特定は長の蛍光の強度を示すグラフ。

以下、本発明に係る分光蛍光光度計の好適な実施形態を、図１〜図８に基づいて詳述する。

図１は、本発明に係る分光蛍光光度計の一例を示す構成ブロック図である。図１を用いて本実施形態の分光蛍光光度計の構成を詳述する。

本実施形態の分光蛍光光度計１は、試料容器１００に収容した試料の測定を行う装置であり、光度計部１０と、光度計部１０内に配置され、試料容器１００の試料を測定するために試料容器１００を適切な位置に調整する位置調整機構２０と、光度計部１０をコントロールし試料を分析するデータ処理部３０と、入出力を行う操作部４０とを備える。

光度計部１０は、光源１１と、光源１１の光から分光して励起光を生成する励起側分光器１２と、励起側分光器１２からの光を分光するビームスプリッタ１３と、ビームスプリッタ１３で分光された一部の光の強度を測定するモニタ検知器１４と、試料から放出された蛍光を単色光に分光する蛍光側分光器１５と、単色の蛍光の電気信号を検知する検知器（蛍光検知器）１６と、励起側分光器１２の回折格子を駆動する励起側パルスモータ１７と、蛍光側分光器１５の回折格子を駆動する蛍光側パルスモータ１８とを備える。

位置調整機構２０は、測定対象の試料を収容した試料容器１００を載置保持する試料設置部２１と、試料設置部２１を駆動する駆動部２２とを備える。

データ処理部３０は、コンピュータ３１と、コンピュータ３１内に配置される制御部３２と、試料からの蛍光をデジタル変換するＡ／Ｄ変換器３３を備える。また、操作部４０は、コンピュータ３１の処理に必要な入力信号を入力する操作パネル４１と、コンピュータ３１により処理された各種分析結果を表示する表示部４２と、操作パネル４１及び表示部４２とコンピュータ３１とを連結するインターフェイス４３とを備える。

図２は、位置調整機構２０の第１実施形態の一例を示し、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。図３は、位置調整機構２０の第２実施形態の一例を示し、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。図２及び図３を用いて、位置調整機構２０を詳述する。

図２に示される第１実施形態において、位置調整機構２０の上部には試料容器１００を載置保持する試料設置部２１が設けられ、試料設置部２１は、試料容器１００の底部を保持するために略円形状の凹部２１ａと、凹部２１ａを取り囲む保持部２１ｂとを有する。本実施形態では、位置調整機構２０は、面内調整機構２３、高さ調整機構２４、周方向調整機構２５を含んでおり、試料設置部２１は、試料容器１００の平面内位置を調整可能な面内調整機構２３に固定されている（図２（ａ）のＸ―Ｙ方向参照）。

また、位置調整機構２０の駆動部２２は、コンピュータ３１の制御部３２に電気的に接続され、第１実施形態では、高さパルスモータ２２ａと周パルスモータ２２ｂとを有している。そして、面内調整機構２３は、高さ調整機構２４上に固定され、高さ調整機構２４は、高さパルスモータ２２ａの駆動により高さ方向（図２（ａ）Ｚ方向参照）に移動することにより、試料容器１００の高さ位置を調整可能としている。また、周方向調整機構２５は、高さ調整機構２４上に固定され、周方向調整機構２５は、周パルスモータ２２ｂの駆動により周方向（図２（ａ）θ方向参照）に回転することにより、試料容器１００の周方向位置を調整可能としている。

図３に示される第２実施形態において、試料設置部２１と面内調整機構２３は、第１実施形態と同様であるが、位置調整機構２０は、高さ調整機構２４と周方向調整機構２５とが組み合わさった回転式高さ調整機構２６を備えている。また、駆動部２２は、第１実施形態と同様にパルスモータである。回転式高さ調整機構２６は、試料容器１００を回転させて周方向位置を調整しながら高さも同時に調整できる機構であり、例えば、ネジの組み合わせで延び縮みし、らせん状に試料容器１００が回転しながら上下するらせん状にねじ切りされた駆動機構であるが、空気圧式、油圧式などの機構もあり、特に限定しない。

上述の位置調整機構２０は、試料容器１００の設置について最適な測定部位を設定する機構である。試料容器１００は、例えばバイアル瓶やアンプル瓶であり、試料容器１００内に収容された溶液などの試料内容を示すラベルや刻印が試料容器１００の表面に施されている。また、形状も種々で有り、試料容器１００を未開封状態で試料の蛍光特定を正確に取得するため、本実施形態の位置調整機構２０は非破壊検査の有力な手段である。即ち、試料容器１００の異なる形状における測定誤差の影響やラベルや刻印による光量ロス、再現性低下の影響を最小限にする位置調整機構２０である。

位置調整機構２０を用いて、励起側分光器１２で生成された励起光の照射位置と試料容器１００が相対的に所定の位置関係（例えば、検知器１６の検知が最大となる位置）になる試料容器１００の設置方法及び調整方法の手順の一例を述べる。

（１）密封された試料容器１００を位置調整機構２０の試料設置部２１に載置する。その際、試料設置部２１の保持部２１ｂが試料容器１００の外周と周接して、試料容器１００が試料設置部２１に安定した状態で載置される。試料容器１００は、医薬品や試料を封入（収容）してあるアンプル瓶やバイアル瓶等であり、励起光と蛍光を透過させるため、基本的に透明な試料容器１００であり、着色した試料容器１００を対象としていない。

（２）次に、面内調整機構２３で試料容器１００を面内方向（Ｘ−Ｙ方向）で調整し、試料容器１００の底面中央部と光軸中心とを一致させる。

（３）そして、ビームスプリッタ１３と位置調整機構２０との間に励起光マスク５０を挿入した後、０次光（透過光）の白色光を試料容器１００に照射する。０次光を照射し、その散乱光にて位置検出を行う。尚、０次光はレーザー光などであっても良い。

（４）高さ調整機構２４で高さ方向（Ｚ軸方向）に試料設置部２１をＺ軸原点に移動する。

（５）Ｚ軸原点にて、周方向調整機構２５で周方向（θ方向）に試料設置部２１を回転させ、０次光における検知器１６の出力を測定する。

（６）高さ調整機構２４でＺ軸を変更し、周方向調整機構２５で周方向に試料設置部２１を回転させ検知器１６の出力を測定する。第２実施形態では、当該（４）〜（６）の調整を回転式高さ調整機構２６で、高さ位置と周方向を同時に移動（例えばらせん状）させて行う。例えば、試料容器１００の高さ（入力値）とＺ軸方向の移動距離（入力値）にてＺ軸測定回数を算出し、回数分実施する。

検知器１６の最大の出力値となった位置が、高さ方向の位置及び周方向の位置において試料容器１００の試料を測定する最適な位置となり、当該位置で励起光の９０度方向から生じる蛍光を最適状態で測定することができる。最も確実に励起光が試料を透過する位置（最適位置）は、ラベル、刻印など、試料容器１００の表面に存在する障害物がなく、励起光の光軸中心と試料容器１００の断面中央部、特に底面中央部が一致する位置である。

上述の実施形態において０次光で説明したが、予め測定する試料の励起波長、蛍光波長が分かっている場合は、試料に最適な励起波長、蛍光波長で位置検出しても良い。また、０次光を使用できない励起側分光器１２を利用する場合は、励起光として試料の吸収が少ない単色光を照射し、検知器１６で同一の単色光の波長を検知しても良い。そして、同一形状の試料容器１００を用意できる場合は、純水や蛍光試薬を用いて粗調整することで最適位置を狭めても良い。さらに、試料容器１００に封入された純水を用いる場合は、ラマン散乱を位置検出に用いても良い。

本実施形態の試料設置部２１は、略円形の凹部２１ａと凹部２１ａを取り囲む保持部２１ｂとを有している例を説明しているが、試料容器１００が安定して載置できれば良く、略円形状に限らず略楕円形状や略四角形状でも良く、また、試料容器１００の外周を保持可能な保持部２１ｂであれば良く、弾性変形するゴムやシリコンでの周接保持、複数の爪等の保持、絞り形状保持、スライドバー式保持などがあり、本実施形態に限定されない。

最適位置を求めるために、位置調整機構２０を駆動させることを上述したが、位置調整は自動式でも手動式でも良い。自動式の場合は、検知器１６にて検知された蛍光の強度を演算する制御部３２を用いて、蛍光の強度に基づき位置調整機構２０を制御することが可能である。

高さ調整機構２４は、ネジ送り式、ラックピニオン式、ジャッキ式などの機構があり、自動式の場合はステッピングモータを使用することも可能である。周方向調整機構２５では、ネジ送り式などの機構があり、自動式の場合はステッピングモータを使用することも可能である。高さ調整機構２４、周方向調整機構２５、回転式高さ調整機構２６の機構は種々あり機構方式に限定されない。

励起光の９０度方向に設置された検知器１６にて最適位置を検知しているが、透過率測定をする際には、励起光と１８０度方向に透過検知器を設置して、同様のフローにて最適位置を検出しても良い。また、主に励起側分光器１２及び蛍光側分光器１５に回折格子を用い、検知器１６にはホトマルを使用するが、透過検知器ではシリコンフォトダイオードやホトマルを用い、蛍光側分光器１５を搭載していなくても良い。

ビームスプリッタ１３と位置調整機構２０との間に挿入される励起光マスク５０は、位置の確認精度を高めるために励起光束を小さくする目的で使用する。通常の励起光は１０ｍｍ角セルのサイズに合うように、横方向１０ｍｍ、縦方向５ｍｍ程度である。励起光出射レンズと試料容器１００との間に励起光マスク５０を入れることで励起光束を小さくすることができる。サイズとしては、試料容器１００の直径の１／５以下とすることが望ましい（例えば、試料容器１００の外径が２０ｍｍの場合、４ｍｍ程度である）。ただし、励起光束が小さすぎるとノイズが大きくなるため、下限を設けた方が良いことがある（例えば２ｍｍ程度）。

試料容器１００に収容された試料を測定するための最適位置を決めるために、それぞれの高さにおける検知器１６の出力を調べた結果のグラフを図４及び図５に示す。縦軸に強度（Ｉ）、横軸に時間（ｓ）を取り、高さ位置は、Ｚ１からＺ６までの６カ所を選定した。

試料容器１００を位置調整機構２０に載置し、それぞれの高さ位置（Ｚｎ：ｎ＝１〜６）において周方向に回転させ強度の変化をグラフ化した。図４は、第１実施形態における位置調整機構２０での測定であり、各高さ位置Ｚｎの変化位置に置いて不連続なグラフとなる。また、図５は、第２実施形態における位置調整機構２０であり、各高さ位置Ｚｎの変化位置においても連続なグラフとなる。図４及び図５に示されるグラフの結果に基づいて、測定対象となる試料容器１００は、ピークの周方向の位置θ（例では１８０度付近）において最も強度の高いＺ２の高さ位置で、測定が行われることが最適であることが理解される。

以上の方法により、試料容器１００は、本実施形態の位置調整機構２０により、測定上の最適位置で試料の品質確認や疑似試料の判別など、非破壊検査において継続的な安定性評価を行うことが可能となる。また、同一試料を用いて追加の検討や別の試験を行うことも可能である。

位置調整機構２０で最適位置にセットされた試料容器１００を用いて、本実施形態の分光蛍光光度計１で分析が行われる。分析方法の一例を図１及び図６〜図８を用いて説明する。

分光蛍光光度計１のキセノンランプなど光源１１から発せられた連続光は、励起側分光器１２により励起光として分光され、ビームスプリッタ１３を経て位置調整機構２０に設置された試料容器１００の試料に照射される。この時、ビームスプリッタ１３で一部が分光された励起光は、モニタ検知器１４にて光量（光の強度）が測定され、光源１１の変動補正がなされる。

試料から放出された蛍光は、蛍光側分光器１５にて単色光に分光され、検知器１６にてその蛍光の強度に応じた電気信号として検出される。当該蛍光の強度信号は、Ａ／Ｄ変換器３３を介してデジタルデータに変換され、コンピュータ３１に信号強度として取り込まれ、表示部４２に測定結果が表示される。

本実施形態の分光蛍光光度計１は、波長駆動系であり、コンピュータ３１の指令により制御部３２を介して励起側パルスモータ１７が駆動することで、目的の波長位置に励起側分光器１２がセットされる。また、蛍光側分光器１５もコンピュータ３１の指令により制御部３２を介して蛍光側パルスモータ１８が駆動することで、目的の波長位置にセットされる。

励起側分光器１２や蛍光側分光器１５は、回折格子やプリズムなどの光学素子が用いられており、励起側パルスモータ１７や蛍光側パルスモータ１８を動力とし、例えばギヤとカムなどの機構により、回折格子やプリズムなどを回転運動させることでスペクトルスキャンすることができる。

一般に、試料容器１００内の測定試料に対し励起光の励起波長を変化させた際の蛍光強度を測定する励起スペクトルは、励起側分光器１２により励起波長を測定開始波長から測定終了波長まで変化させ、各波長の励起光を測定試料に照射し、その時の固定波長に設定されている蛍光側分光器１５を経て特定波長の蛍光の変化を検知器１６で検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。

表示部４２には、測定結果として、励起波長と蛍光強度の図６に示されるような２次元のスペクトルが表示される。図６のグラフは、特定の蛍光波長において励起波長を変化させた際の蛍光強度を示している。

また、試料容器１００内の測定試料に対し、固定波長の励起光を照射し、蛍光波長を変化させた際の波長毎の蛍光強度を測定する蛍光スペクトルは、固定波長に設定された励起側分光器１２からの励起光を測定試料に照射し、その時の蛍光を蛍光側分光器１５にて、測定開始波長から測定終了波長まで変化させ波長毎の蛍光の変化を検知器１６で検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。

表示部４２には、測定結果として、励起波長と蛍光強度の図７に示されるような２次元のスペクトルが表示される。図７のグラフは、励起光が特定波長であり、拡がりのある波長帯域の蛍光の強度を検知した結果を示している。

一方、試料容器１００内の測定試料に対し、固定波長の励起光を照射し、固定波長の蛍光の強度を単位時間毎に測定する時間変化スペクトルは、固定波長に設定された励起側分光器１２からの励起光を測定試料に照射し、その時に生じる蛍光を蛍光側分光器１５の波長を固定し、時間毎の蛍光の強度変化を検知器１６で検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。

表示部４２には、測定結果として、励起波長と蛍光強度の図８に示されるような２次元のスペクトルが表示される。図８のグラフは、特定波長の励起光に対応した特定波長の蛍光の強度を検知した結果を示している。試料容器１００の位置関係の変動や試料の分解などが無ければパターンは実質的に一定である。

尚、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、適宜、変形、改良、等が可能である。その他、上述した実施形態における各構成要素の材質、形状、寸法、数値、形態、数、配置箇所、等は本発明を達成できるものであれば任意であり、限定されない。

本発明に係る分光蛍光光度計は、形状が異なりラベルや刻印などがなされた試料容器内の試料を非破壊検査で行う場合、試料容器を最適な位置で測定を行う分野に適用可能である。

１分光蛍光光度計
１０光度計部
１１光源
１２励起側分光器
１３ビームスプリッタ
１４モニタ検知器
１５蛍光側分光器
１６検知器
２０位置調整機構
２１試料設置部
２２駆動部
２３面内調整機構
２４高さ調整機構
２５周方向調整機構
２６回転式高さ調整機構
３０データ処理部
３１コンピュータ
３２制御部
４０操作部
１００試料容器

Claims

光源と、
前記光源の光から分光して励起光を生成する励起側分光器と、
測定対象の試料を収容した試料容器を保持するとともに、前記励起光の照射位置と前記試料容器が相対的に所定の位置関係になるように、前記試料容器の位置を調整可能な位置調整機構と、
前記試料から放出された蛍光を検知する検知器と、
前記検知器にて検知された蛍光の強度を演算する制御部と、
を備える分光蛍光光度計であって、
前記位置調整機構が、前記試料容器の高さ位置を調整可能な高さ調整機構と、前記試料容器を回転させて周方向位置を調整可能な周方向調整機構とを含み、
前記制御部は、前記高さ調整機構により調整された各高さ位置において、前記周方向調整機構により前記試料容器を回転させ、得られた前記蛍光のピークの前記周方向位置において最も強度の高い高さ位置を検出し、前記試料容器を位置決めする、分光蛍光光度計。
請求項１に記載の分光蛍光光度計であって、
前記位置調整機構が、前記試料容器の平面内位置を調整可能な面内調整機構を含む、分光蛍光光度計。
請求項１に記載の分光蛍光光度計であって、
前記位置調整機構が、前記試料容器を回転させて周方向位置を調整しながら、高さも同時に調整可能な回転式高さ調整機構を含む、分光蛍光光度計。
請求項１に記載の分光蛍光光度計であって、
前記位置調整機構は、前記励起光の光軸中心と前記試料容器の底面に平行な断面の中央部が一致する様に、前記試料容器の位置を調整可能である、分光蛍光光度計。