JP6835899B2 - Method for culturing UCP1-expressing cells - Google Patents
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Description
本発明は，ＵＣＰ１発現細胞の培養技術に関する。 The present invention relates to a technique for culturing UCP1-expressing cells.
脂肪細胞には，エネルギーの蓄積に関わる白色脂肪細胞と，エネルギー消費に関わる褐色脂肪細胞があることが知られている。また，褐色脂肪細胞と同様に，エネルギー消費に関わるベージュ細胞という細胞も知られている。これらの細胞（褐色脂肪細胞及び／又はベージュ細胞：ＵＣＰ１発現細胞）は，たんぱく質「ＵＣＰ１」を発現するという特徴を有している。たんぱく質ＵＣＰ１は脂肪に由来するエネルギーを燃焼させ，熱に変換する性質を有する。自力で暖を取ることが出来ない新生児は多くの褐色脂肪を持つが，成長するにつれ褐色脂肪は減少する。
ここで，成人の体内にＵＣＰ１発現細胞が存在すれば，エネルギーが多く消費され，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームが改善することが期待されている。
It is known that adipocytes include white adipocytes involved in energy storage and brown adipocytes involved in energy consumption. In addition, like brown adipocytes, beige cells, which are involved in energy consumption, are also known. These cells (brown adipose cells and / or beige cells: UCP1-expressing cells) are characterized by expressing the protein "UCP1". The protein UCP1 has the property of burning energy derived from fat and converting it into heat. Newborns who cannot keep warm on their own have a lot of brown fat, but as they grow up, the brown fat decreases.
Here, if UCP1-expressing cells are present in the body of an adult, a large amount of energy is consumed, and it is expected that obesity and metabolic syndrome associated with obesity will be improved.
成人の体内にＵＣＰ１発現細胞を存在させるために，各種幹細胞をＵＣＰ１発現細胞に分化誘導した後，移植する手法が考えられる。
公知技術としてｉＰＳ細胞から褐色脂肪細胞を誘導する技術が提案されている。しかし，未分化のｉＰＳ細胞は奇形腫（腫瘍）を生じる恐れがあり，未分化のｉＰＳ細胞を完全に除去する技術は現時点では確立していない。そのため，ｉＰＳ細胞を移植する手法は安全面で問題がある。
In order to allow UCP1-expressing cells to exist in the body of an adult, a method of inducing differentiation of various stem cells into UCP1-expressing cells and then transplanting them can be considered.
As a known technique, a technique for inducing brown adipocytes from iPS cells has been proposed. However, undifferentiated iPS cells may cause teratomas (tumors), and a technique for completely removing undifferentiated iPS cells has not been established at this time. Therefore, the method of transplanting iPS cells has a safety problem.
ここで，間葉系幹細胞は白色脂肪，骨，軟骨等に分化することが知られている。そして間葉系幹細胞は，移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療薬として静脈内に投与されており，歯茎内への移植の実績が多々存在する。そのため，間葉系幹細胞の投与或いは移植は，安全面で問題がないと考えられている。そのため，間葉系幹細胞から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来れば，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームに対して画期的な治療を行うことが可能である。
しかし，現状では間葉系幹細胞から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養する技術は提案されていない。
また，間葉系幹細胞以外の組織或いは細胞を培養してＵＣＰ１発現細胞を得ることも可能であるが，その様なＵＣＰＩ発現細胞を比較的容易且つ大量に培養する技術も未だに提案されていない。
Here, mesenchymal stem cells are known to differentiate into white adipose tissue, bone, cartilage, and the like. Mesenchymal stem cells are intravenously administered as a therapeutic agent for graft-versus-host disease (GvHD), and there are many achievements in transplantation into the gums. Therefore, administration or transplantation of mesenchymal stem cells is considered to have no safety problem. Therefore, if a large amount of UCP1-expressing cells can be cultured from mesenchymal stem cells relatively easily, it is possible to perform epoch-making treatment for obesity and metabolic syndrome associated with obesity.
However, at present, no technique has been proposed for culturing a large amount of UCP1-expressing cells from mesenchymal stem cells relatively easily.
Further, although it is possible to obtain UCP1-expressing cells by culturing tissues or cells other than mesenchymal stem cells, a technique for culturing such UCPI-expressing cells in a relatively easy and large amount has not yet been proposed.
その他の従来技術として，生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で熱発生性脂肪細胞を増加させる作用剤が提案されているが（特許文献１参照），係る従来技術は生体外部で熱発生性脂肪細胞を培養することを意図してはいない。
また，線維芽細胞を薬剤で処理してたんぱく質ＵＣＰ１の発現を誘導できることが報告されているが（非特許文献１参照），一般的な脂肪分化誘導培地に対して４種類の薬剤を添加するという煩雑な操作を必要とする。
As another prior art, an agent that increases thermogenic adipocytes in vivo has been proposed (see Patent Document 1), but the prior art involves culturing thermogenic adipocytes in vitro. Not intended to be.
In addition, it has been reported that fibroblasts can be treated with drugs to induce the expression of protein UCP1 (see Non-Patent Document 1), but four types of drugs are added to a general adipose differentiation-inducing medium. It requires complicated operations.
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり，間葉系幹細胞或いはその他の細胞（或いは組織）から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来るＵＣＰ１発現細胞の培養方法の提供を目的としている。 The present invention has been proposed in view of the above-mentioned problems of the prior art, and UCP1 expression capable of culturing a large amount of UCP1-expressing cells from mesenchymal stem cells or other cells (or tissues) relatively easily. The purpose is to provide a method for culturing cells.
本発明のＵＣＰ１発現細胞の培養方法は，Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加した培地により培養することを特徴としている。
また本発明のＵＣＰ１発現細胞は，培地（１−１，１−２）にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加して培養されたことを特徴としている。
ここで，ＩＳＸ９における「（２−チエニル）」なる文言は，イソキサゾールに結合している炭素（Ｃ）から数えて２番目がＳ（硫黄）になっているチエニル基を意味している。
The method for culturing UCP1-expressing cells of the present invention is characterized by culturing in a medium supplemented with N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide (ISX9).
The UCP1-expressing cells of the present invention were cultured by adding N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide (ISX9) to the medium (1-1, 1-2). It is characterized by that.
Here, the word "(2-thienyl)" in ISX9 means a thienyl group in which the second is S (sulfur) counting from the carbon (C) bonded to isoxazole.
本発明において，前記培地（１−１，１−２）は，血清培地或いは無血清培地が好ましい。
また本発明において，前記培地（１−１）は，血清培地或いは無血清培地に対して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等），環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）経路を活性化する薬剤（フォルスコリン，３−イソブチル−１−メチルキサンチン等），インドメタシン，インスリン，トリヨードサイロニン，又は，糖質コルチコイドを添加した培地であるのが好ましい。
さらに，前記ＵＣＰ１発現細胞は脂肪由来の間葉系幹細胞であるのが好ましい。
そして，ＵＣＰ１発現細胞は線維芽細胞から培養されるのが好ましい。
或いは，ＵＣＰ１発現細胞は脂肪組織から培養されるのが好ましい。
In the present invention, the medium (1-1, 1-2) is preferably a serum medium or a serum-free medium.
Further, in the present invention, the medium (1-1) is a drug (forsulin) that activates a thiazolidine-based drug (rosiglitazone, etc.) or a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) pathway with respect to a serum medium or a serum-free medium. Choline, 3-isobutyl-1-methylxanthin, etc.), indomethacin, insulin, triiodosilonine, or sugar corticoid is preferably added to the medium.
Furthermore, the UCP1-expressing cells are preferably adipose-derived mesenchymal stem cells.
Then, the UCP1-expressing cells are preferably cultured from fibroblasts.
Alternatively, UCP1-expressing cells are preferably cultured from adipose tissue.
本発明の実施に際して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等）を添加した血清培地或いは無血清培地（１−１）で間葉系幹細胞（２Ｓ）を培養し，その後，当該培地（１−１）にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミドを添加してさらに培養を続けることが出来る。 In carrying out the present invention, mesenchymal stem cells (2S) were cultured in a serum medium or serum-free medium (1-1) supplemented with a thiazolidine-based drug (rosiglitazone, etc.), and then the medium (1-1). N-Cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide can be added to the culture medium to continue the culture.
上述の構成を具備する本発明によれば，培地（１−１）に脂肪滴が形成され，脂肪分化培地による脂肪分化誘導が好適に行われる。
そして，形成された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）において，たんぱく質ＵＣＰ１（脱共役たんぱく質の一つのパターン）の遺伝子発現が確認されるので，形成された脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞である。
すなわち本発明によれば，生体外で幹細胞からＵＣＰ１発現細胞を簡単に培養することが出来る。
According to the present invention having the above-mentioned structure, lipid droplets are formed on the medium (1-1), and the induction of adipose differentiation by the adipose differentiation medium is preferably performed.
Then, since the gene expression of protein UCP1 (one pattern of uncoupling protein) is confirmed in the cells (adipocytes) having the formed lipid droplets, the formed adipocytes are UCP1-expressing cells.
That is, according to the present invention, UCP1-expressing cells can be easily cultured from stem cells in vitro.
ここで，培養に用いられる培地（１−１）は一般的な脂肪誘導培地であり，添加されるのはＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）のみであるため，複雑な操作或いは処理を必要とせず，簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来る。
そして，生体外で簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養出来る本発明によれば，大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが可能であり，培養されたＵＣＰ１発現細胞を移植することにより，安全且つ効果的に，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームに対して治療することが出来る。
Here, the medium (1-1) used for culturing is a general fat-inducing medium, and N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide (ISX9) is added. ) Only, so UCP1-expressing cells can be easily cultured without requiring complicated operations or treatments.
According to the present invention, which can easily culture UCP1-expressing cells in vitro, it is possible to culture a large amount of UCP1-expressing cells, and by transplanting the cultured UCP1-expressing cells, it is safe and effective. , Can be treated for obesity and metabolic syndrome associated with obesity.
最初に図１，図２を参照して，本発明の第１実施形態について説明する。
本発明の第１実施形態に係る培養方法の概要を示す図１において，培養容器３には一般的な脂肪誘導培地１−１が充填されており，当該培地で被験者Ｍから採取した細胞２（例えば脂肪細胞）を処理設備１０で処理して得た脂肪由来の幹細胞２Ｓが培養される。ここで，幹細胞２Ｓは脂肪由来の間葉系幹細胞に限定される訳ではなく，臍帯由来の間葉系幹細胞，歯髄由来の間葉系幹細胞，骨髄由来の間葉系幹細胞，羊膜由来の間葉系幹細胞，胎盤由来の間葉系幹細胞であっても良い。
一般的な脂肪誘導培地１−１は，血清培地或いは無血清培地に対して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等），環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）経路を活性化する薬剤（フォルスコリン，３−イソブチル−１−メチルキサンチン等），インドメタシン，インスリン，トリヨードサイロニン，又は，糖質コルチコイドの何れかを添加した培地を採用することが出来る。
First, the first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2.
In FIG. 1 showing an outline of the culture method according to the first embodiment of the present invention, the
General fat induction medium 1-1 is a drug that activates the thiazolidine-based drug (rosiglitazone, etc.) and the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) pathway (forskolin, 3) with respect to the serum medium or serum-free medium. -Isobutyl-1-methylxanthin, etc.), indomethacin, insulin, triiodosilonine, or a medium containing any of sugar corticoid can be adopted.
図示の実施形態において，脂肪誘導培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを培養する工程で，薬剤Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加する。上述した様に，ＩＳＸ９における「（２−チエニル）」なる文言は，イソキサゾールに結合しているＣ（炭素）から数えて２番目がＳ（硫黄）になっているチエニル基を意味している。
培養した間葉系幹細胞２Ｓにおいて脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が生成されたか否か，すなわち，培養されたのが脂肪細胞に分化した細胞であるか否かを確認するため，例えば顕微鏡４が使用される。もちろん，顕微鏡以外の手段であって，脂肪への分化を確認する機能を有する機器であれば，顕微鏡４に代えて使用することができる。
In the illustrated embodiment, the drug N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide (ISX9) was added in the step of culturing the mesenchymal stem cells 2S in the fat induction medium 1-1. To do. As described above, the word "(2-thienyl)" in ISX9 means a thienyl group in which the second is S (sulfur) counting from C (carbon) bonded to isoxazole.
In order to confirm whether or not cells having adipocytes (adipocytes) were generated in the cultured mesenchymal stem cells 2S, that is, whether or not the cultured cells were differentiated into adipocytes, for example, a
第１実施形態において，間葉系幹細胞を培養して分化した脂肪細胞がＵＣＰ１発現細胞であるか否かは，脱共役たんぱく質の一つのパターンであるＵＣＰ１の遺伝子発現の有無で判定する。そして，たんぱく質ＵＣＰ１の発現の有無を確認する手法として，定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いている。図１において，符号ＰＣＲは，定量ＰＣＲ法を実施する設備を示す。
定量ＰＣＲ法の前処理として，脂肪細胞よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応（すなわち，ＲＮＡからｃＤＮＡの合成）を行ってｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）の調製を行う。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い，たんぱく質ＵＣＰ１の発現量を測定する。
上述した様に，たんぱく質ＵＣＰ１はＵＣＰ１発現細胞にのみ存在し，白色脂肪細胞には存在しない。そしてＵＣＰ１発現細胞は，たんぱく質ＵＣＰ１の作用によって脂肪を燃焼させ，高効率で熱に変換する（エネルギーを消費する）。
定量ＰＣＲ法による確認の結果，間葉系幹細胞を培養して形成された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）において，ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認されれば，形成された脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞であることが確認できる。
なお，定量ＰＣＲ法を実施する設備に代えて，ウエスタンブロット法を実施する設備，或いは免疫染色法を実施する設備を用いても良い。
In the first embodiment, whether or not the adipocytes differentiated by culturing mesenchymal stem cells are UCP1-expressing cells is determined by the presence or absence of UCP1 gene expression, which is one pattern of uncoupling protein. Then, as a method for confirming the presence or absence of expression of the protein UCP1, a quantitative PCR (polymerase chain reaction) method is used. In FIG. 1, code PCR indicates equipment for carrying out the quantitative PCR method.
As a pretreatment of the quantitative PCR method, RNA (ribonucleic acid) is extracted from fat cells and reverse transcription reaction (that is, synthesis of cDNA from RNA) is performed to prepare cDNA (DNA complementary to mRNA). A PCR reaction is carried out using the obtained cDNA to measure the expression level of the protein UCP1.
As mentioned above, the protein UCP1 is present only in UCP1-expressing cells and not in white adipocytes. Then, UCP1-expressing cells burn fat by the action of protein UCP1 and convert it into heat with high efficiency (consume energy).
As a result of confirmation by the quantitative PCR method, if UCP1 gene expression is confirmed in cells (adipocytes) having lipid droplets formed by culturing mesenchymal stem cells, the formed adipocytes are UCP1-expressing cells. It can be confirmed that there is.
In addition, instead of the equipment for carrying out the quantitative PCR method, the equipment for carrying out the Western blotting method or the equipment for carrying out the immunostaining method may be used.
次に，主として図２を参照して，第１実施形態で間葉系幹細胞を培養してたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現を確認する手順について説明する。
図２において，ステップＳ１では，培養容器３に一般的な脂肪誘導培地１−１を充填する。そしてステップＳ２に進む。
ステップＳ２では，一般的な脂肪誘導培地１−１が充填された培養容器３に，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する。この幹細胞２Ｓは，処理設備１０において，被験者から採取した脂肪細胞２に公知の処理を施すことにより得られる。図示の実施形態では，幹細胞２Ｓは脂肪由来の間葉系幹細胞であるが，上述した様にその他の幹細胞であっても良い。
Next, a procedure for confirming the gene expression of the protein UCP1 by culturing mesenchymal stem cells in the first embodiment will be described mainly with reference to FIG.
In FIG. 2, in step S1, the
In step S2, the fat-derived mesenchymal stem cells 2S are supplied to the
ステップＳ３では，前記培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを培養する。培養する際に，培地１−１に，薬剤ＩＳＸ９（Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド）を添加する。
ステップ３における培養期間と薬剤ＩＳＸ９を添加する時期については，例えば，培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養する。そして薬剤ＩＳＸ９を添加して，添加後，さらに１週間培養する。ここで，培養期間（例えば，薬剤ＩＳＸ９添加前の１週間と，添加後の１週間），薬剤ＩＳＸ９の添加時期は，培養実験等によりケース・バイ・ケースで決定することが出来る。
In step S3, the mesenchymal stem cells 2S are cultured in the medium 1-1. Upon culturing, the drug ISX9 (N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide) is added to medium 1-1.
Regarding the culture period in
ステップＳ４では，上述した培養期間の経過後（例えば，薬剤ＩＳＸ９を添加後，１週間培養した後）に，培養した間葉系幹細胞２Ｓに脂肪滴が形成されか否か，すなわち，培養された幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認する。幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認するのは，例えば顕微鏡４を使用して行うことが出来る。図示の実施形態では，培養した間葉系幹細胞２Ｓの顕微鏡写真を解析して，脂肪滴の有無を確認している。
ここで，ステップＳ４で脂肪滴が確認されても，当該脂肪細胞がＵＣＰ１発現細胞であるか，或いは，白色脂肪細胞であるかを確認する必要がある。そのため，ステップＳ５においては，培養した間葉系幹細胞２Ｓに形成された脂肪滴が，脱共役たんぱく質の一つのパターンであるＵＣＰ１の遺伝子を発現しているか否かを確認している。ＵＣＰ１の遺伝子が発現していれば，分化した脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞であることが確認出来る。
なお，ＵＣＰ１の遺伝子が発現したか否かは，定量ＰＣＲ法により判断される。
In step S4, whether or not adipocytes were formed in the cultured mesenchymal stem cells 2S after the lapse of the above-mentioned culture period (for example, after adding the drug ISX9 and culturing for 1 week), that is, the cells were cultured. Check if the stem cells have differentiated into adipocytes. Whether or not the stem cells have differentiated into adipocytes can be confirmed by using, for example, a
Here, even if lipid droplets are confirmed in step S4, it is necessary to confirm whether the adipocytes are UCP1-expressing cells or white adipocytes. Therefore, in step S5, it is confirmed whether or not the lipid droplets formed on the cultured mesenchymal stem cells 2S express the UCP1 gene, which is one pattern of uncoupling protein. If the UCP1 gene is expressed, it can be confirmed that the differentiated adipocytes are UCP1-expressing cells.
Whether or not the UCP1 gene is expressed is determined by the quantitative PCR method.
ここで，ステップＳ３で培養中に薬剤ＩＳＸ９を添加することにより，ＵＣＰ１の遺伝子の発現が促進される。
薬剤ＩＳＸ９の添加時期については，培地（例えば一般的な脂肪分化誘導培地）の組成により，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを一般的な脂肪分化誘導培地１−１を充填した培養容器３に供給する以前の段階で，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。
換言すれば，ステップＳ１の一般的な脂肪分化誘導培地１−１の充填と同時に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。そして，培養容器３に一般的な脂肪分化誘導培地１−１を充填した（ステップＳ１）後，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する（ステップＳ２）以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。さらにステップＳ２で脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する際に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子を発現させることが可能である。
Here, by adding the drug ISX9 during the culture in step S3, the expression of the UCP1 gene is promoted.
Regarding the timing of addition of the drug ISX9, fat-derived mesenchymal stem cells 2S are supplied to a
In other words, the protein UCP1 can be expressed even if the drug ISX9 is added at the same time as the filling of the general adipose differentiation-inducing medium 1-1 in step S1. Then, after filling the
次に，図１，図２の実施形態であって，被験者Ｍから採取した脂肪細胞２から得た脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを培養する実験例について説明する。
［実験例１］
２つの培養容器３のそれぞれに，後述する組成の一般的な脂肪分化誘導培地１−１（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者Ｍから採取した脂肪細胞２を処理設備１０で処理して得た幹細胞２Ｓを培養した。そして，当該幹細胞２Ｓにより試料１，試料２を作成した。
試料１では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料２では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加せずに，さらに１週間培養を行った。
培養後，試料１，試料２の双方において，脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が確認された。すなわち，試料１，試料２の双方において，間葉系幹細胞２Ｓは脂肪細胞に分化したことが確認できた。
試料１，試料２の双方において確認された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応を行ってＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）を調製した。得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料１，試料２の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
Next, an experimental example of culturing fat-derived mesenchymal stem cells 2S obtained from
[Experimental Example 1]
Each of the two
In Sample 1, mesenchymal stem cells 2S were cultured for 1 week, the drug ISX9 was added to a general adipose differentiation-inducing medium 1-1, and the cells were further cultured for 1 week. On the other hand, in
After culturing, cells having lipid droplets (adipocytes) were confirmed in both Sample 1 and
RNA (ribonucleic acid) is extracted from cells (adipocytes) having lipid droplets confirmed in both sample 1 and
試料１，試料２の顕微鏡写真から脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）の形成が明確に確認され，脂肪分化培地１−１による脂肪分化誘導は良好に行われたことが分かった。
定量ＰＣＲ法の結果を図３に示すが，ＵＣＰ１の遺伝子発現は薬剤ＩＳＸ９を添加した試料１のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料２ではたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。なお，図３で，縦軸の「Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ」はたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現量を示すパラメータであり，試料１（ＩＳＸ９を添加した試料）におけるたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現量を１とする相対的な数値である。
図３では明示されていないが，実験例１において，脂肪分化誘導培地１−１に間葉系幹細胞２Ｓを供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合，及び，脂肪分化誘導培地１−１に間葉系幹細胞２Ｓを供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を脂肪分化誘導培地１−１に添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
実験例１で使用した一般的な脂肪分化誘導培地１−１の組成を，以下で示す。
ＤＭＥＭ‐ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ５００ｍｌ
デキサメサゾン １μＭ
インドメタシン ５０μＭ
インスリン ０．０１ｍｇ／ｍｌ
３‐イソブチル‐メチルキサンチン ０．５ｍＭ
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） １０％
From the micrographs of
The results of the quantitative PCR method are shown in FIG. 3. The gene expression of UCP1 was confirmed only in the sample 1 to which the drug ISX9 was added, and the gene expression of the protein UCP1 was not confirmed in the
Although not explicitly shown in FIG. 3, in Experimental Example 1, when the drug ISX9 was added to the adipose differentiation-inducing medium 1-1 before supplying the mesenchymal stem cells 2S, and the adipose differentiation-inducing medium 1-1. The gene expression of the protein UCP1 was also confirmed when the drug ISX9 was added to the adipose differentiation-inducing medium 1-1 at the same time as supplying the mesenchymal stem cells 2S.
The composition of the general fat differentiation-inducing medium 1-1 used in Experimental Example 1 is shown below.
DMEM-high glucose 500ml
Dexamethasone 1 μM
Indomethacin 50 μM
Insulin 0.01 mg / ml
3-Isobutyl-Methylxanthine 0.5 mM
FBS (fetal bovine serum) 10%
［実験例２］
２つの培養容器３のそれぞれに，市販されている無血清培地（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＢ−ＣＤ」）に対して，チアゾリジン系の薬剤であるロシグリタゾンを５μＭ添加したものを一般的な脂肪誘導培地１−１として充填した。
その後，それぞれに被験者Ｍから採取した脂肪細胞２を処理設備１０で処理して得た幹細胞２Ｓを培養した。そして，当該幹細胞２Ｓにより試料３，試料４を作成した。
試料３では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，間葉系幹細胞２Ｓをさらに１週間培養した。一方，試料４では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，薬剤ＩＳＸ９を添加することなく，間葉系幹細胞２Ｓをさらに１週間培養を行った。
培養後，試料３，試料４の双方において，脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が確認された。すなわち，試料３，試料４の双方において，間葉系幹細胞２Ｓは脂肪細胞に分化したことが確認できた。
試料３，試料４の双方において確認された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応を行ってＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）を調製した。得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料３，試料４の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
[Experimental Example 2]
Generally, 5 μM of thiazolidine-based drug rosiglitazone is added to each of the two
Then, the stem cells 2S obtained by treating the
In
After culturing, cells having lipid droplets (adipocytes) were confirmed in both
RNA (ribonucleic acid) is extracted from cells (adipocytes) having lipid droplets confirmed in both
試料３，試料４の顕微鏡写真から脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）の形成が明確に確認され，脂肪分化培地１−１による脂肪分化誘導は良好に行われたことが分かった。
定量ＰＣＲ法の結果を図４に示すが，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料３のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料４ではＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。
From the micrographs of
The results of the quantitative PCR method are shown in FIG. 4. The gene expression of the protein UCP1 was confirmed only in the
実験結果が図示されてはいないが，発明者による実験では，脂肪由来の間葉系幹細胞のみならず，臍帯由来の間葉系幹細胞，歯髄由来の間葉系幹細胞，骨髄由来の間葉系幹細胞，羊膜由来の間葉系幹細胞，胎盤由来の間葉系幹細胞についても，図３，図４で示すのと同様に，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料ではＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。 Although the experimental results are not shown, in the experiments by the inventor, not only adipose-derived mesenchymal stem cells, but also umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells As for the mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord and the mesenchymal stem cells derived from the placenta, the gene expression of the protein UCP1 was confirmed only in the sample to which the drug ISX9 was added, as shown in FIGS. No UCP1 gene expression was confirmed in the sample to which ISX9 was not added.
図１〜図４の実施形態においては，被験者Ｍから例えば脂肪細胞２を採取して，処理設備１０で処理して幹細胞２Ｓを得た。そして，当該幹細胞２Ｓを培養して，ＵＣＰ１発現細胞を得ている。
発明者は，幹細胞以外の細胞，例えば線維芽細胞，或いは脂肪組織を被験者から採取し，処理設備１０により幹細胞を得ることなく，ＵＣＰ１発現細胞を大量に培養出来ることを確認している。
被験者から線維芽細胞或いは脂肪組織を採取し，ＵＣＰ１発現細胞を培養する実施形態について，図５，図６を参照して説明する。
In the embodiments of FIGS. 1 to 4, for example,
The inventor has confirmed that cells other than stem cells, for example, fibroblasts or adipose tissue, can be collected from a subject, and a large amount of UCP1-expressing cells can be cultured without obtaining stem cells by the
An embodiment in which fibroblasts or adipose tissue is collected from a subject and UCP1-expressing cells are cultured will be described with reference to FIGS. 5 and 6.
図５において，培養容器３には一般的な培地１−２（例えば無血清培地或いは血清培地）が充填されており，当該培地で被験者Ｍから採取した組織２０（例えば線維芽細胞或いは脂肪組織）を培養する。ここで，組織２０は線維芽細胞、脂肪組織に限定される訳ではなく、その他の組織或いは細胞，例えば臍帯，歯髄，骨髄，羊膜，胎盤，その他であっても良い。培地１−２にはＩＳＸ９が添加されている。
図５では明示されていないが，培養された組織或いは細胞がＵＣＰ１を発現しているか否か（ＵＣＰ１細胞であるか否か）は，第１実施形態と同様に，ＵＣＰ１の遺伝子発現の有無を，定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて行う。定量ＰＣＲ法の前処理として，培養された細胞よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応（すなわち，ＲＮＡからｃＤＮＡの合成）を行ってｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）の調製を行い，得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い，たんぱく質ＵＣＰ１の発現量を測定することは，図１，図２で説明したのと同様である。
そして第１実施形態と同様に，定量ＰＣＲ法を実施する設備に代えて，ウエスタンブロット法を実施する設備，或いは免疫染色法を実施する設備を用いても良い。
In FIG. 5, the
Although not explicitly shown in FIG. 5, whether or not the cultured tissue or cell expresses UCP1 (whether or not it is a UCP1 cell) is determined by whether or not the UCP1 gene is expressed, as in the first embodiment. , Quantitative PCR (polymerase chain reaction) method is used. As a pretreatment for the quantitative PCR method, RNA (ribonucleic acid) is extracted from cultured cells and a reverse transcription reaction (that is, synthesis of cDNA from RNA) is performed to prepare cDNA (DNA complementary to mRNA). , Performing a PCR reaction using the obtained cDNA and measuring the expression level of the protein UCP1 is the same as described in FIGS. 1 and 2.
Then, as in the first embodiment, instead of the equipment for performing the quantitative PCR method, the equipment for performing the Western blotting or the equipment for performing the immunostaining method may be used.
次に，主として図６を参照して，第２実施形態でＵＣＰ１発現細胞培養の手順を説明する。
図６において，ステップＳ１１では，培養容器３に一般的な培地１−２を充填し、培地１−２に薬剤ＩＳＸ９を添加する。そしてステップＳ１２に進む。
ステップＳ１２では，被験者Ｍから採取した組織（或いは細胞）２０を供給して，培養する。ここで，薬剤ＩＳＸ９は組織２０の培養時に培地に添加しても良い。例えば、組織２０を１週間培養し、それからＩＳＸ９を添加し，さらに１週間培養する。
ステップＳ１２に続くステップＳ１３では，培養された細胞２０がＵＣＰ１発現細胞であるか否かを，定量ＰＣＲ法により確認する。
Next, the procedure for culturing UCP1-expressing cells will be described in the second embodiment, mainly with reference to FIG.
In FIG. 6, in step S11, the
In step S12, the tissue (or cell) 20 collected from the subject M is supplied and cultured. Here, the drug ISX9 may be added to the medium when the
In step S13 following step S12, it is confirmed by a quantitative PCR method whether or not the
次に，図５，図６の実施形態において，被験者Ｍから採取した細胞２０を用いた実験例３，実験例４について説明する。
［実験例３］
２つの培養容器３（図５参照）のそれぞれに，一般的な培地１−２（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者から採取した表皮由来の線維芽細胞を培養容器３に供給して，試料５，試料６を作成した。
試料５では，表皮由来線維芽細胞を１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料６では，表皮由来線維芽細胞を１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加せず，さらに１週間培養を行った。
培養後，試料５，試料６の双方の細胞（脂肪細胞）よりｃＤＮＡを調製し，得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料５，試料６の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
Next, in the embodiments of FIGS. 5 and 6, Experimental Examples 3 and 4 using the
[Experimental Example 3]
Each of the two culture vessels 3 (see FIG. 5) was filled with a general medium 1-2 (serum medium containing serum). Then, epidermis-derived fibroblasts collected from the subjects were supplied to the
In Sample 5, epidermis-derived fibroblasts were cultured for 1 week, then the drug ISX9 was added to the general adipose differentiation-inducing medium 1-1, and the cells were further cultured for 1 week. On the other hand, in Sample 6, epidermis-derived fibroblasts were cultured for 1 week, and then the general adipose differentiation-inducing medium 1-1 was cultured for another week without adding the drug ISX9.
After culturing, cDNA is prepared from both cells (adipocytes) of Sample 5 and Sample 6, and quantitative PCR method is performed using the obtained cDNA to determine the gene expression level of UCP1 from the adipocytes of Sample 5 and Sample 6. It was measured.
試料５，試料６について，定量ＰＣＲ法の結果を図７に示すが，ＵＣＰ１の遺伝子発現は薬剤ＩＳＸ９を添加した試料５で強く誘導され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料６ではたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は僅かに確認されるのみであった。
なお，実験例３，４と同様に，実験例５において，培地１−２に表皮由来線維芽細胞を供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合と，培地１−１に表皮由来線維芽細胞を供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を脂肪分化誘導培地１−１に添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
The results of the quantitative PCR method for Samples 5 and 6 are shown in FIG. 7. The gene expression of UCP1 is strongly induced in Sample 5 to which the drug ISX9 is added, and the gene expression of the protein UCP1 is not found in Sample 6 to which the drug ISX9 is not added. Only a few were confirmed.
Similar to Experimental Examples 3 and 4, in Experimental Example 5, the drug ISX9 was added to the medium 1-2 before supplying the epidermis-derived fibroblasts, and the epidermis-derived fibroblasts were added to the medium 1-1. The gene expression of protein UCP1 was also confirmed when the drug ISX9 was added to the adipose differentiation induction medium 1-1 at the same time as supplying the cells.
［実験例４］
２つの培養容器３（図５参照）のそれぞれに，実験例１で用いられた培地と同様な組成を有する一般的な脂肪分化誘導培地（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者から採取した脂肪組織（間葉系幹細胞を取り出す処理を行っていない脂肪細胞）を培養容器３に供給して，試料７，試料８を作成した。
試料７では，脂肪組織を１週間培養し，その後，培地に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料８では，脂肪組織を１週間培養し，その後，培地に薬剤ＩＳＸ９を添加することなく，脂肪組織をさらに１週間培養を行った。
[Experimental Example 4]
Each of the two culture vessels 3 (see FIG. 5) was filled with a general adipose differentiation-inducing medium (serum containing serum) having the same composition as the medium used in Experimental Example 1. Then, the adipose tissue collected from the subject (adipocytes not subjected to the treatment for extracting mesenchymal stem cells) was supplied to the
In
培養後，試料７，試料８の双方からｃＤＮＡを調製し，定量ＰＣＲ法により，試料７，試料８の脂肪組織からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
定量ＰＣＲ法の結果を図８に示すが，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料７で強く誘導され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料８ではＵＣＰ１の遺伝子発現は僅かに確認されるのみであった。
実験例４においても、培地に脂肪組織を供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合と，培地に脂肪組織を供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
After culturing, cDNA was prepared from both
The results of the quantitative PCR method are shown in FIG. 8. The gene expression of the protein UCP1 is strongly induced in the
In Experimental Example 4, the gene expression of protein UCP1 was also observed when the drug ISX9 was added before the adipose tissue was supplied to the medium and when the drug ISX9 was added at the same time as the adipose tissue was supplied to the medium. I was able to confirm.
図示の実施形態によれば，一般的な培地１−１，１−２に被験者Ｍから採取して処理した間葉系幹細胞２Ｓ，或いは被験者Ｍから採取された線維芽細胞，脂肪組織を供給し，薬剤ＩＳＸ９（Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド）のみを添加して培養することにより，複雑な操作或いは処理を必要とせず，簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来る。
そして，生体外で簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養出来るので，大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが可能であり，培養されたＵＣＰ１発現細胞を移植することにより，安全且つ効果的に，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドローム，その他の疾病に対して効果的に治療することが可能となることが期待される。
According to the illustrated embodiment, mesenchymal stem cells 2S collected and processed from subject M, or fibroblasts and adipose tissue collected from subject M are supplied to general media 1-1 and 1-2. , Drug ISX9 (N-cyclopropyl-5- (2-thienyl) -3-isoxazolecarboxyamide) is added and cultured, so that no complicated operation or treatment is required, and UCP1-expressing cells can be easily obtained. Can be cultivated.
Since UCP1-expressing cells can be easily cultured in vitro, a large amount of UCP1-expressing cells can be cultured. By transplanting the cultured UCP1-expressing cells, obesity and obesity can be safely and effectively performed. It is expected that it will be possible to effectively treat the associated metabolic syndrome and other diseases.
図示の実施形態はあくまでも例示であり，本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。 It should be added that the illustrated embodiment is merely an example and is not a description intended to limit the technical scope of the present invention.
１−１，１−２・・・一般的な脂肪誘導培地
２０・・・脂肪組織
２Ｓ・・・間葉系幹細胞
1-1, 1-2 ... General fat induction medium 20 ... Adipose tissue 2S ... Mesenchymal stem cells
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