JP6836760B2

JP6836760B2 - Ｒｓｖ融合前ｆタンパク質に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体

Info

Publication number: JP6836760B2
Application number: JP2017565829A
Authority: JP
Inventors: サレンス，グザビーアー; スケペンス，ベルト; ロッジー，イーベ; グラハム，バーニー; マクレラン，ジェイソン; ギルマン，モーガン
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2021-03-03
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: IL256315A; RU2730671C2; CN108472343B; MA42246A; CA2989378A1; PH12017502356B1; MY192870A; IL256315B2; US20180179266A1; IL256315B1; RU2018101662A; HK1254779A1; WO2016203052A1; EP3313432A1; US11248039B2; US10501528B2; AU2016277887B2; JP2018524979A; UA123584C2; PH12017502356A1

Description

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）に関する。より具体的には、ＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質の融合前形態に結合するＩＳＶＤに関する。本発明は、ＲＳＶ感染の予防および／または処置に対するこれらＩＳＶＤの使用、ならびにこれらＩＳＶＤを含む医薬組成物にさらに関する。

呼吸器合胞体ウイルスは、乳児および幼児における急性気道感染の最も重大な原因である。ほとんど全ての子供が、２歳までに少なくとも１回呼吸器合胞体ウイルス感染を経験したことになる。通常は軽度の疾患のみを起こすが、一部の患者（１〜２％）では、ＲＳＶ感染は、入院が必要となる重篤な細気管支炎に至る。毎年１６０，０００人の子供が、ＲＳＶ感染により死亡すると推定されている。有効な予防的ワクチンおよびＲＳＶ特異的治療小分子は、臨床的に開発されない。高リスク乳児を、予想されるＲＳＶ感染に起因する重症疾患から部分的に保護できる唯一の方法は、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前および融合後コンホメーションに対するヒト化マウスモノクローナル抗体（パリビズマブ）による毎月の注射である。しかし、この抗体による処置は高額であり、予防的設定においてのみ使用される。融合前特異的モノクローナル抗体（Ｇｉｌｍａｎｓら、２０１５年；ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３年）、およびＲＳＶＦタンパク質結合ＩＳＶＤを含めた他のいくつかのＲＳＶＦタンパク質結合薬剤が開発されている。しかしながら、上述のＩＳＶＤは、ＲＳＶ血清型Ｂに対する中和活性が弱く、および／またはＩＳＶＤを強力にするには多価形式が必要とされる（ＷＯ２００９１４７２４８；ＷＯ２０１０１３９８０８；ＷＯ２０１１０６４３８２；Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、２０１１年；Ｈｕｌｔｂｅｒｇら、２０１１年）。

近年では、ＲＳＶＦタンパク質の融合前コンホメーションに特異的に結合する従来通りの抗体が、Ｆの融合後および融合前コンホメーションの両方を結合する抗体よりはるかに強力なインビトロＲＳＶ中和剤であることが示された（ＷＯ２００８１４７１９６、ＵＳ２０１２０７０４４６、ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３年）。しかしながら、従来通りの抗体は、産生することが厄介なことがあり、それらの安定性が限定される場合もある。さらにまた、比較的大きなサイズのため、従来通りの抗体は、複合サンプル中でのそれら同族エピトープの認識において、または他の抗体およびリガンドがそれらエピトープ付近の部位を占有している場合に、妨げられる可能性がある。

したがって、広く受け入れられている利用可能な処置が存在しないので、ＲＳＶ感染の有効な処置および／または予防に使用できる強力な抗ＲＳＶ薬の満たされていない需要が存在する。

国際公開第２００９／１４７２４８号国際公開第２０１０／１３９８０８号国際公開第２０１１／０６４３８２号国際公開第２００８／１４７１９６号米国特許出願公開第２０１２／０７０４４６号明細書

驚くべきことに、一価のＩＳＶＤが、ＲＳＶ血清型（ＡおよびＢ）両方に対する強い中和活性を有し得ることが、本明細書において示される。文献は、ＲＳＶの両方の血清型の強力な阻害には多価構築物が必要なことを示唆しているので、これは予想外のことである。したがって、融合前コンホメーションに固有の、ＲＳＶＦタンパク質のエピトープに対するＩＳＶＤを提供し、それによりＲＳＶ感染の処置および／または予防のための非常に強力なＩＳＶＤを提供することが本発明の目的である。

一価形式でＲＳＶ血清型ＡおよびＢに対する類似の中和活性を示すことを特徴とする、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に特異的に結合するＩＳＶＤを提供することが、本発明の一態様である。

一実施形態において、本発明は、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３が、先述のそれぞれの配列番号のいずれかと１、２もしくは３アミノ酸の差異を有するＩＳＶＤを想定する。

別の態様によれば、本発明は、上記のＩＳＶＤを少なくとも１つ含むＲＳＶ結合構築物にも関する。

別の態様によれば、本発明は、上記のＩＳＶＤを少なくとも１つコードする核酸を想定する。

なお別の態様によれば、本発明は、上記の核酸を形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。上記のＩＳＶＤを産生するための上記宿主細胞の使用も、想定される。

医薬として使用する、特にＲＳＶ感染の治療的処置または予防に使用するための上記のＩＳＶＤまたは上記のＲＳＶ結合構築物も想定される。

別の態様によれば、本発明は、上記のＩＳＶＤを少なくとも１つ含む医薬組成物を想定する。医薬としての、特にＲＳＶ感染の治療的処置または予防における前記医薬組成物の使用が、さらに想定される。

本発明の目的は、続く説明から明らかになる。

ＤＳ−Ｃａｖ１で免疫したラマ由来血漿における中和活性を示す図である。ＲＳＶＡ２（Ａ）およびＲＳＶＢ４９（Ｂ）に対する中和活性を、ＤＳ−Ｃａｖ１による異なる免疫化の後に得られた血漿において試験した。９６ウェルプレートに播種した単層のベロ細胞に、Ｘ軸に示すように８倍希釈物から開始してさらに３倍ずつ希釈したラマ血漿の存在下で、ＲＳＶＡ２またはＲＳＶＢ４９を感染させた。各ウェル内のプラークの数を計数し、Ｙ軸に図示した。ＰｒｅＤＳ−Ｃａｖ１は、免疫したラマの免疫前血清に対応する。精製した組換えＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）に結合するＶＨＨの選択を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートを、ＤＳ−Ｃａｖ１（灰色バー、融合前Ｆ）、融合後Ｆ（黒色バー）またはＢＳＡでコーティングした。プレートを、ＤＳ−Ｃａｖ１免疫したラマのＰＢＭＣから生成されたＶＨＨ提示ファージライブラリによるＤＳ−Ｃａｖ１に対する１回転のパニング後に得られたｐＨＥＮ４−ＶＨＨ形質転換ＴＧ１エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から調製した細菌ペリプラズム腔抽出物と培養した。グラフにおいて、Ｆタンパク質との結合は、ＢＳＡとの結合に対するＯＤ４５０値のｌｏｇ２比として図示される。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）上清におけるＲＳＶ中和活性の検出を示す図である。ｐＫａｉ６１−ＶＨＨＰ．パストリス形質転換体を、２４ウェル形式で、ＹＰＮＧ培地２ｍｌ中で２４時間前培養した。その後細胞を、ＹＰＮＭ培地中に４８時間置き、ＶＨＨ発現を誘導した。１／６０、１／６００および１／６０００希釈の清澄な培養上清を、単層のベロ細胞に接種するために使用したＲＳＶＡ２（３０ＰＦＵ／ウェル）と混合することにより中和活性について試験した。四角は、中和活性を持つＰ．パストリスクローンを示す。（Ａ）固有のｐＫａｉ６１−ＶＨＨプラスミドの選抜組による形質転換後に得られたＰ．パストリスクローンを示す図であり、数字により指定される。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）上清におけるＲＳＶ中和活性の検出を示す図である。ｐＫａｉ６１−ＶＨＨＰ．パストリス形質転換体を、２４ウェル形式で、ＹＰＮＧ培地２ｍｌ中で２４時間前培養した。その後細胞を、ＹＰＮＭ培地中に４８時間置き、ＶＨＨ発現を誘導した。１／６０、１／６００および１／６０００希釈の清澄な培養上清を、単層のベロ細胞に接種するために使用したＲＳＶＡ２（３０ＰＦＵ／ウェル）と混合することにより中和活性について試験した。四角は、中和活性を持つＰ．パストリスクローンを示す。（Ｂ）候補Ｆ特異的ＶＨＨのライブラリをクローニングしたｐＫａｉ６１による形質転換後に得られたＰ．パストリスクローンを示す図である。Ｌ３、Ｌ１３等は、個々のＰ．パストリス形質転換体を指す。囲まれたウェルは、ＲＳＶ中和活性を持つサンプルを示す。ピキア・パストリスにおいて産生されたＶＨＨの精製を示す図である。ｐＫａｉ−ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ｐＫａｉ−ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６、ｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ２またはｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ５８によって形質転換されたＰ．パストリス細胞の培養培地を、メタノールで９６時間誘導した後に回収した。無細胞培地に再溶解した硫酸アンモニウム沈殿物を、ＨｉｓＴｒａｐカラムにロードし、洗浄後にカラムを、上昇する濃度勾配のイミダゾールで溶出した（左）。その後、ＨｉｓＴｒａｐカラムから溶出されたピーク画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過カラムにロードした（右）。クロマトグラフを、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４（Ａ）、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６（Ｂ）、ＶＨＨ−Ｆ２（Ｃ）およびＶＨＨ−Ｆ５８（Ｄ）について示す。ピキア・パストリスにおいて産生されたＶＨＨの精製を示す図である。ｐＫａｉ−ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ｐＫａｉ−ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６、ｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ２またはｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ５８によって形質転換されたＰ．パストリス細胞の培養培地を、メタノールで９６時間誘導した後に回収した。無細胞培地に再溶解した硫酸アンモニウム沈殿物を、ＨｉｓＴｒａｐカラムにロードし、洗浄後にカラムを、上昇する濃度勾配のイミダゾールで溶出した（左）。その後、ＨｉｓＴｒａｐカラムから溶出されたピーク画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲルろ過カラムにロードした（右）。クロマトグラフを、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４（Ａ）、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６（Ｂ）、ＶＨＨ−Ｆ２（Ｃ）およびＶＨＨ−Ｆ５８（Ｄ）について示す。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４（Ａ）およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６（Ｂ）の核酸配列ならびにＰ．パストリスにおいて産生される組換えＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の予測されるアミノ酸配列（Ｃ）を示す図である。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＨｉｓタグ（６×ＨＩＳ）を、標識した四角により示す。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、強力なＲＳＶ中和活性を有することを示す図である。ベロ細胞に、精製したＶＨＨ（ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６または陰性対照ＮＢ１．１４）、モノクローナル抗体Ｄ２５またはモノクローナル抗体ＡＭ２２の存在下でＲＳＶＡ２（Ａ）もしくはＲＳＶＢ４９（Ｂ）を感染させた。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体を、３０００ｎｇ／ｍｌの濃度で開始して３倍希釈系列でアプライした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＡおよびＢに示されるプラーク減少に基づいて算出し、（Ｃ）に図示する。Ｆ−ＶＨＨ−４（ＤＳ−Ｃａｖ１−４）およびＦ−ＶＨＨ−Ｌ６６（ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６）のＩＣ_５０値を、対照ＶＨＨおよびＨＭＰＶ−Ａ１−ＧＦＰ、ｈＭＰＶ−Ｂ１−ＧＦＰおよびＲＳＶＡ２−ＧＦＰに対するｍＡｂと比較した（Ｄ）。ＧＦＰ発現ｈＭＰＶ組換えウイルス（ＮＬ／１／００Ａ１傍系またはＮＬ／１／９９Ｂ１傍系、ＢｅｒｎａｄｅｔｔｅｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎおよびＲｏｎＦｏｕｃｈｉｅｒ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、オランダから親切にも贈られた物）またはＧＦＰ−ｈＲＳＶ（Ａ２株、ＭａｒｋＰｅｅｐｌｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ、米国から親切にも贈られた物）（ＭＯＩ０．３ｆｆｕ／細胞）の既定量を、ＶＨＨもしくはｍＡｂの段階希釈物と混合し、Ｖｅｒｏ−１１８（ｈＭＰＶ）もしくはＨＥｐ−２細胞いずれかの培養に添加し、９６ウェルプレート内で増殖させた。３６時間後に、培地を除去し、ＰＢＳを添加し、各ウェルのＧＦＰ蛍光をＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーＭ２００で測定した。蛍光値を、抗体を含まないウイルス対照のパーセントとしてプロットし、それを使用して対応するＩＣ５０値を算出した。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、強力なＲＳＶ中和活性を有することを示す図である。ベロ細胞に、精製したＶＨＨ（ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６または陰性対照ＮＢ１．１４）、モノクローナル抗体Ｄ２５またはモノクローナル抗体ＡＭ２２の存在下でＲＳＶＡ２（Ａ）もしくはＲＳＶＢ４９（Ｂ）を感染させた。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体を、３０００ｎｇ／ｍｌの濃度で開始して３倍希釈系列でアプライした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＡおよびＢに示されるプラーク減少に基づいて算出し、（Ｃ）に図示する。Ｆ−ＶＨＨ−４（ＤＳ−Ｃａｖ１−４）およびＦ−ＶＨＨ−Ｌ６６（ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６）のＩＣ_５０値を、対照ＶＨＨおよびＨＭＰＶ−Ａ１−ＧＦＰ、ｈＭＰＶ−Ｂ１−ＧＦＰおよびＲＳＶＡ２−ＧＦＰに対するｍＡｂと比較した（Ｄ）。ＧＦＰ発現ｈＭＰＶ組換えウイルス（ＮＬ／１／００Ａ１傍系またはＮＬ／１／９９Ｂ１傍系、ＢｅｒｎａｄｅｔｔｅｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎおよびＲｏｎＦｏｕｃｈｉｅｒ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、オランダから親切にも贈られた物）またはＧＦＰ−ｈＲＳＶ（Ａ２株、ＭａｒｋＰｅｅｐｌｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ、米国から親切にも贈られた物）（ＭＯＩ０．３ｆｆｕ／細胞）の既定量を、ＶＨＨもしくはｍＡｂの段階希釈物と混合し、Ｖｅｒｏ−１１８（ｈＭＰＶ）もしくはＨＥｐ−２細胞いずれかの培養に添加し、９６ウェルプレート内で増殖させた。３６時間後に、培地を除去し、ＰＢＳを添加し、各ウェルのＧＦＰ蛍光をＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーＭ２００で測定した。蛍光値を、抗体を含まないウイルス対照のパーセントとしてプロットし、それを使用して対応するＩＣ５０値を算出した。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、ＤＳ−Ｃａｖ１に結合するが、融合後Ｆに結合しない事を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートを、ＤＳ−Ｃａｖ１（上のパネル）または融合後Ｆ（下のパネル）でコーティングした。プレートを、３０，０００ｎｇ／ｍｌから開始する精製したＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６およびＶＨＨ−Ｆ５８の１／３希釈系列と培養した。ＯＤ４５０値が図示される。（Ｂ）固定した融合前または融合後Ｆタンパク質に対するＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）センサグラムを示す図である。融合前ＦのＳＰＲセンサグラムを図示する上のパネルにおいて、緩衝液のみのサンプルを、ＤＳ−Ｃａｖ１（融合前Ｆ）および参照フローセルに注入し、続いて５ｎＭ〜３９．１ｐＭの範囲の２倍段階希釈のＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４またはＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６を、１．２５ｎＭ濃度については２連で、注入した。データを二重参照減算し、１：１結合モデルに当てはめた（赤色線）。下のパネルは、固定した融合後Ｆに対するＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合のＳＰＲセンサグラムを図示する。緩衝液のみのサンプルを、融合後Ｆおよび参照フローセルに注入し、続いて１μＭおよび５００ｎＭ濃度のＤＳ−Ｃａｖ１−４またはＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６を注入した。データを二重参照減算したが、融合後Ｆに対する結合が検出されなかったので、データを結合モデルに当てはめなかった。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、ＤＳ−Ｃａｖ１に結合するが、融合後Ｆに結合しない事を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートを、ＤＳ−Ｃａｖ１（上のパネル）または融合後Ｆ（下のパネル）でコーティングした。プレートを、３０，０００ｎｇ／ｍｌから開始する精製したＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６およびＶＨＨ−Ｆ５８の１／３希釈系列と培養した。ＯＤ４５０値が図示される。（Ｂ）固定した融合前または融合後Ｆタンパク質に対するＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）センサグラムを示す図である。融合前ＦのＳＰＲセンサグラムを図示する上のパネルにおいて、緩衝液のみのサンプルを、ＤＳ−Ｃａｖ１（融合前Ｆ）および参照フローセルに注入し、続いて５ｎＭ〜３９．１ｐＭの範囲の２倍段階希釈のＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４またはＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６を、１．２５ｎＭ濃度については２連で、注入した。データを二重参照減算し、１：１結合モデルに当てはめた（赤色線）。下のパネルは、固定した融合後Ｆに対するＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合のＳＰＲセンサグラムを図示する。緩衝液のみのサンプルを、融合後Ｆおよび参照フローセルに注入し、続いて１μＭおよび５００ｎＭ濃度のＤＳ−Ｃａｖ１−４またはＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６を注入した。データを二重参照減算したが、融合後Ｆに対する結合が検出されなかったので、データを結合モデルに当てはめなかった。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、哺乳動物細胞の表面でＦに結合することを示す図である。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＧＦＰ−ＮＬＳ発現ベクター（ｐｅＧＦＰ−ＮＬＳ）と共にＲＳＶＡ２Ｆタンパク質発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｓｙｎ）をトランスフェクトし、またはＧＦＰ−ＮＬＳ発現ベクターだけをトランスフェクトした。グラフは、ＲＳＶＦタンパク質を発現する（上方のグラフ）または発現しない（下方のグラフ）ＧＦＰ陽性細胞に対する指示したＶＨＨおよびＲＳＶＦ特異的マウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ８５８−１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の蛍光強度（ＦＩ）の中央値を示す。バイオレイヤー干渉法を使用することにより分析したＤＳ−Ｃａｖ１結合に対する抗体交差競合を示す図である。ＤＳ−Ｃａｖ１を、酢酸緩衝液中でアミンカップリング反応によってＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定した。反応を、１Ｍエタノールアミンにより失活させ、次いでＤＳ−Ｃａｖ１固定バイオセンサーを、アッセイ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で平衡化した。バイオセンサーを、競合抗体／ＶＨＨに浸漬し、続いて分析抗体／ＶＨＨに浸漬する２つの抗体／ＶＨＨ工程を行い、この間に短いベースライン工程（ｓｈｏｒｔｂａｓｅｌｉｎｅｓｔｅｐ）を挟んだ。パーセント阻害を、各競合剤の非存在および存在下における分析物抗体／ＶＨＨの最大結合を比較することにより定義した。ＮＢ：結合なし。ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の予防的投与が、インビボでのＲＳＶ複製を減少させることを示す図である。ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６またはＦ２３０μｇおよびパリビズマブ３０μｇを、ＲＳＶＡ２で抗原接種（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）する４時間前にＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与した。感染２４時間後に、全てのマウスは、Ｆ２３０μｇを鼻腔内投与された。マウスを、抗原接種後５日目に屠殺し、肺におけるウイルス負荷をプラークアッセイ（Ａ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）により決定した。各データポイントは、１匹のマウスを表し、水平な線は中央値を図示する。＃：肺ホモジネートにおいて検出限界以下のウイルス力価を持つマウス。グラフ（Ｂ）は、示した群の各マウスサンプルに存在するｍＲＰＬ１３ＡｍＲＮＡレベルに対して標準化されたＲＳＶＲＮＡの相対的発現を表す。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、構造的保存の高い、ＲＳＶＦ上の同じエピトープを結合することを示す図である。（Ａ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４に接触される融合前安定化ＲＳＶＦ（配列番号１６）における埋没表面積および残基（太字体で示される）を示す図である。（Ｂ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６に接触される融合前安定化ＲＳＶＦ（配列番号１６）における埋没表面積および残基（太字体で示される）を示す図である。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、構造的保存の高い、ＲＳＶＦ上の同じエピトープを結合することを示す図である。（Ｃ）インビボプロセシング前にＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６両方に接触される融合前安定化ＲＳＶＦタンパク質の完全オープンリーディングフレームのアミノ酸残基（配列番号１７）を、下線を引いて示す。（Ｄ）ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質と両方のＩＳＶＤとの共結晶構造は、ＩＳＶＤの高い構造的保存および同じエピトープへの結合を示す。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４の結合特性を示す図である。（Ａ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４のＣＤＲ３ループは、ＲＳＶＦの２つのプロトマーによって形成されるポケットに結合する。（Ｂ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４のＣＤＲ２ループは、部位ＩＩと相互作用し、ジスルフィド結合によってＣＤＲ３に結びつけられる。Ｐ１＝プロトマー１；Ｐ２＝プロトマー２。ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合特性を示す図である。（Ａ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６のＣＤＲ３ループは、ＲＳＶＦの２つのプロトマーによって形成されるポケットに結合する。（Ｂ）ＶＨＨ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６のＣＤＲ２ループは、部位ＩＩと相互作用し、ジスルフィド結合によってＣＤＲ３に結びつけられる。Ｐ１＝プロトマー１；Ｐ２＝プロトマー２。モタビズマブ、ＡＭ１４、１０１ＦおよびＤＳ−Ｃａｖ１−４との複合体における融合前コンホメーションのＦタンパク質の構造を示す図である。モタビズマブ、ＡＭ１４、１０１ＦおよびＤＳ−Ｃａｖ１−４との複合体における融合前コンホメーションのＦタンパク質のモデルである。ＡＭ１４−Ｍｏｔａ融合前Ｆ構造（４ＺＹＰ）およびペプチドに結合している１０１ＦＦａｂ構造（３Ｏ４１）を、ＤＳ−Ｃａｖ１−４に結合している融合前Ｆ構造のＦと並べた。ＤＳ−Ｃａｖ１−４のエピトープならびにＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６のエピトープは、ＡＭ１４、モタビズマブおよび１０１Ｆのエピトープの間に位置し、これらのそれぞれで部分的に重複している。

定義
本発明は、特定の実施形態に関しておよびいくつかの図面を参照して記述されることになるが、本発明は、それに制限されず、請求項によってのみ制限される。請求項におけるいかなる参照符号も、範囲を制限するものとして解釈されないものとする。記述されている図面は、単なる概要であり、非限定的である。図面において、いくつかの要素のサイズは、例示の目的のために誇張され、正しい縮尺で描かれていない場合がある。用語「含む」が本説明および請求項において使用される場合、その用語は他の要素または工程を除外しない。単数名詞を指す際に不定冠詞もしくは定冠詞、例えば「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、他に特に記載されない限り、これは、その名詞の複数形を含む。

さらにまた、本説明および請求項において用語第１、第２、第３等は、類似の要素同士を区別するために使用され、必ずしも連続順または時間順について述べているわけではない。そのように使用される用語は、適当な状況下で互換性があること、及び本明細書に記述される本発明の実施形態が、本明細書に記述または例示される順序とは違う順序で操作できることは、理解されよう。

以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためだけに提供される。本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される用語の全ては、本発明の分野の当業者が意味するものと同じ意味を有する。実践者は、当該分野の定義および用語について、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（補足４７）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９年）に導かれる。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるより小さい範囲を有すると解釈されるべきでない。

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「ＩＳＶＤ」は、単一の可変抗体ドメインからなる抗体断片である。全抗体のように、これは特異的な抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２〜１８ｋＤａであるＩＳＶＤは、２本の重鎖および２本の軽鎖タンパク質で構成される従来通りの抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）より非常に小さく、Ｆａｂ断片（およそ５０ｋＤａ、１本の軽鎖および半分の重鎖）および一本鎖可変断片（およそ２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、一方は軽鎖由来、一方は重鎖由来）よりさらに小さい。一般に、ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を有することになり、好ましくは以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４、に従う。本明細書では用語「ＩＳＶＤ」は、これに限定されないが、ナノボディ（商標）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）とも称されるラクダ科動物の重鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインおよびサメから得られるＩＳＶＤ（ＩｇＮＡＲドメイン）を含む。

本明細書では用語「ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に特異的に結合する」とは、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に測定可能な程度で結合し、ＲＳＶのＦタンパク質の融合後形態に結合しないＲＳＶ結合ポリペプチド（例えば抗体、ＩＳＶＤ）の能力を指す。

「ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態」とは、ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３年に記載の通り、ウイルス−細胞相互作用の前にとられるＲＳＶＦタンパク質の準安定な融合前コンホメーションを指す。融合前形態は、ウイルスおよび細胞性膜の融合と同時にとられる非常に安定な融合後形態すなわち融合後コンホメーションと異なる。

本明細書では抗体の「一価形式」とは、１つの抗原決定基のみ認識できる抗体形式を指す。一価形式は、二価、三価または四価形式など（これらに限られない）の２つ以上の抗原決定基を認識できる多価抗体形式を除外する。

本明細書では用語「中和活性」とは、ＩＳＶＤが、プラーク減少アッセイなど（これに限定されない）のインビトロウイルス中和アッセイで測定されるウイルス感染を阻害できるという事実を指す。阻害とも称される中和は、完全な中和（ウイルス感染が観察できない）を意味しても、または部分的な中和を意味してもよい。例えば、中和は１０％中和、２０％中和、２５％中和、３０％中和、４０％中和またはより高い中和を意味することができる。特に、中和は少なくとも５０％、例えば５０％中和、６０％中和、７０％中和、７５％中和、８０％中和、９０％中和、９５％中和またはより高い中和になる。中和活性は、一般には、当業者によって容易に選ばれるような適切な対照（例えば無関係なＩＳＶＤによる処置）に対して評価される。既知の濃度を持つＩＳＶＤの場合、中和活性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として表すことができる。ＩＣ５０は、５０％阻害（または中和）が実現されるＩＳＶＤ濃度である。ＩＣ５０は、ＩＳＶＤの潜在力とも称される阻害潜在性の尺度である。

本明細書では「類似の中和活性」とは、ＩＣ５０として表され、一般に、比較される中和活性と相違が１０倍以下であり中和活性を指す。より具体的には、相違は５倍以下、またはさらに２倍以下である。

用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリンのＨ（重）もしくはＬ（軽）鎖いずれかの可変領域内にある可変ループを指し、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域が、特定の抗原決定基構造に対する抗体または抗体断片の基本的な特異性の主因である。

用語「エピトープ」とは、抗原または抗原構造にある特異的結合部位を指し、ＩＳＶＤのようなポリペプチドは、その部位に対して特異性および親和性を有する。

用語「コンホメーションエピトープ」とは、ＩＳＶＤのようなポリペプチドに正確にはまり込み、結合できるようにする、抗原の３次元的表面特徴を持つエピトープを指す。対照的に、直鎖状エピトープは、タンパク質の３Ｄ形状（三次構造）ではなくアミノ酸配列（一次構造）により決定される。

本明細書では「ＲＳＶ感染の治療的処置」とは、対象がＲＳＶ感染に罹った後に前記対象に投与される、ＲＳＶ感染を処置する任意の形態を意味する。

本明細書では「ＲＳＶ感染の予防」とは、対象がＲＳＶ感染に罹る前に前記対象に投与されるＲＳＶ感染の予防的処置を意味する。予防的処置は、ワクチンとしての本発明の使用を含み得る。

本明細書では「医薬組成物」は、全身、経口、鼻腔内送達用の組成物を含むがそれには限らない、当業者に公知の任意の医薬組成物であり得る。

「ＩＳＶＤを少なくとも１つ含むＲＳＶ結合構築物」とは、本明細書では、１つ以上のＩＳＶＤを含む、ＲＳＶに結合する任意の結合構築物を指す。

本明細書では「宿主細胞」は、ＩＳＶＤまたはＲＳＶ結合構築物の産生に適切な任意の細胞であり得る。

第１の態様によれば、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に対するＩＳＶＤ、および／またはそれに特異的に結合するＩＳＶＤを提供することが、本発明の目的である。ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に対する特異的結合とは、ＩＳＶＤが、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に測定可能な程度で結合し、ＲＳＶのＦタンパク質の融合後形態に結合しないことを意味する。特異的結合は、例えばＩＳＶＤの親和性およびＩＳＶＤの濃度に影響され得る。当業者は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）もしくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づく結合アッセイのような適切な結合アッセイ（これらに限定されない）におけるＩＳＶＤの滴定のような本明細書に記述されるＩＳＶＤの結合能力を評価できる適当な条件を決定することができる。一般に、ＲＳＶのＦタンパク質の融合前形態に対する結合とは、ＩＳＶＤが、Ｆタンパク質の野生型形態に結合すること、およびＦタンパク質が融合前コンホメーションである限りＦタンパク質の任意の突然変異形態に結合することを意味する。これは、ＲＳＶの両方のサブタイプ（ＡおよびＢ）のＦタンパク質への結合も含む。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、配列番号１８に記載したＲＳＶＡＦタンパク質共通配列に結合する。配列番号１８に記載した共通配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースに挙げられている９２個のＲＳＶＡＦタンパク質完全長配列に基づいて当業者に公知の方法で算出された。したがって、上記のＩＳＶＤは、配列番号１８の共通配列を得るために含めた９２個の代表的なＲＳＶＡＦタンパク質配列のいずれにも結合する。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、配列番号１９に記載したＲＳＶＢＦタンパク質共通配列に結合する。配列番号１９に記載した共通配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースに挙げられている１１４個のＲＳＶＢＦタンパク質完全長配列に基づいて当業者に公知の方法で算出された。したがって、上記のＩＳＶＤは、配列番号１９の共通配列を得るために含めた１１４個の代表的なＲＳＶＢＦタンパク質配列のいずれにも結合する。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、配列番号１８に記載したＲＳＶＡＦタンパク質および配列番号１９に記載したＲＳＶＢＦタンパク質の両方に結合する。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、Ｆタンパク質の融合前形態に排他的に結合する。さらなる特定の実施形態によれば、上記のＩＳＶＤは、Ｆタンパク質の融合前形態に排他的に結合し、Ｆタンパク質の融合後形態に結合しない。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、配列番号１６の融合前安定化ＲＳＶＦタンパク質に結合する。特定の実施形態において、ＩＳＶＤは、さらなる部分に融合されてもよい。

特定の実施形態によれば、上記のＩＳＶＤは、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のエピトープに結合する。特に、それらは、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のコンホメーションエピトープに結合する。特定の実施形態において、上記のＩＳＶＤは、アミノ酸残基Ｔ５０、Ｇ５１、Ｗ５２、Ｓ１８０、Ｇ１８４、Ｖ１８５、Ｐ２６５、Ｉ２６６、Ｔ２６７、Ｎ２６８、Ｄ２６９、Ｑ２７０、Ｌ３０５、Ｇ３０７、Ｖ３０８、Ｎ３４５、Ａ３４６、Ｇ３４７、Ｋ４２１、Ｓ４２５、Ｋ４２７、Ｎ４２８、Ｒ４２９、Ｇ４３０、Ｉ４３１、Ｓ４５１、Ｇ４５３、Ｎ４５４、Ｌ４５６、Ｙ４５８を含むＲＳＶ融合前Ｆコンホメーションエピトープを結合する。特に、それらは、配列番号１７に記載したＲＳＶ融合前Ｆのアミノ酸残基Ｔ５０、Ｇ５１、Ｗ５２、Ｓ１８０、Ｇ１８４、Ｖ１８５、Ｐ２６５、Ｉ２６６、Ｔ２６７、Ｎ２６８、Ｄ２６９、Ｑ２７０、Ｌ３０５、Ｇ３０７、Ｖ３０８、Ｎ３４５、Ａ３４６、Ｇ３４７、Ｋ４２１、Ｓ４２５、Ｋ４２７、Ｎ４２８、Ｒ４２９、Ｇ４３０、Ｉ４３１、Ｓ４５１、Ｇ４５３、Ｎ４５４、Ｌ４５６、Ｙ４５８を含むＲＳＶ融合前Ｆコンホメーションエピトープを結合する。

特定の実施形態によれば、ＩＳＶＤは、一価形式でＲＳＶ血清型ＡおよびＢに対する類似の中和活性を示す。一般にそのことは、ＩＳＶＤが、ウイルスが細胞に感染する能力を妨げる／阻害する／予防する／後退させるまたは遅らせることを意味する。これら特定の実施形態によれば、ＩＳＶＤは、ＡおよびＢＲＳＶ血清型の両方と類似の程度でウイルスが細胞に感染する能力に干渉する／これを阻害する／予防する／後退させるまたは遅らせる。

特定の実施形態によれば、ＩＳＶＤは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は、先述のそれぞれの配列番号のいずれかと１、２または３アミノ酸の差異を有する。ＩＳＶＤＤＳ−Ｃａｖ１−４の場合、ＣＤＲの配列は、配列番号１、配列番号３および配列番号５である。ＩＳＶＤＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の場合、ＣＤＲの配列は、配列番号２、配列番号４および配列番号６である。

さらなる態様によれば、ＲＳＶ結合構築物が提供され、前記ＲＳＶ結合構築物が、少なくとも１つのＩＳＶＤを含むことを特徴とする。少なくとも１つのＩＳＶＤとは、ＲＳＶ結合構築物が１つより多いＩＳＶＤを含有してもよいことを意味する。１つ以上のＩＳＶＤに隣接して、ＲＳＶ結合構築物は、ＩＳＶＤに連結された他の部分を含有してもよい。前記さらなる部分は、ＲＳＶに結合してもしなくてもよい。非限定的な例として、前記ＲＳＶ結合構築物は、ＲＳＶＦタンパク質に結合するＩＳＶＤを含むことができ、半減期を延長する１つ以上の基または部分（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または血清アルブミン結合ＶＨＨなどであるがこれらだけに限らない）に（化学的または別の方法で）連結して、半減期が増加した本発明のＩＳＶＤの誘導体を提供することもできる。一般に、前記ＲＳＶ結合構築物は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に結合する。特定の実施形態において、上記のＲＳＶ結合構築物は、配列番号１７および／または配列番号１８および／または配列番号１９に結合する。前記ＲＳＶ結合構築物は、１つまたは１つより多いＲＳＶ結合ＩＳＶＤを含む任意の構築物であり得る。

さらなる態様によれば、ＩＳＶＤは、それ自体が提供されるのではなく、核酸、すなわち本明細書に記述されるＲＳＶＦタンパク質、特にＦタンパク質の融合前形態に対するＩＳＶＤをコードしている核酸分子として提供される。そのような核酸または核酸分子を含むベクターも、提供される。なおさらなる態様によれば、宿主細胞は、そのような核酸またはそのようなベクターを含む形で提供される。一般に、核酸は、トランスフェクションまたは形質転換により宿主細胞に導入されることになる。但し、本発明は、核酸が宿主細胞に導入される方法に限られない。

なおさらなる実施形態によれば、宿主細胞は、そのような核酸を含有して提供される。一般に、そのような宿主細胞は、核酸を形質転換またはトランスフェクトされている。これら宿主細胞に対して想定される特定の使用は、ＩＳＶＤの産生である。したがって、産生のためのこれらの使用が、本明細書において明確に想定される。これは、ＩＳＶＤをコードする核酸分子を形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を使用してＩＳＶＤを産生できることを意味する。

さらなる態様によれば、本明細書に提供されるＩＳＶＤは、医薬品用である。すなわち、ＲＳＶＦタンパク質に対するＩＳＶＤが、医薬用として提供される。ＩＳＶＤをコードしている核酸またはそのような核酸を含有するベクターについても同じことが言え、すなわちＩＳＶＤをコードしている核酸分子またはベクターが、医薬用として提供されると想定される。ＲＳＶＦタンパク質に結合するＩＳＶＤを少なくとも１つ含むＲＳＶ結合構築物も、医薬用として提供される。特定の実施形態によれば、ＩＳＶＤ（またはそれらを含むＲＳＶ結合構築物もしくはそれらを含む医薬組成物もしくはそれらをコードしている核酸、もしくはそのような核酸を含むベクター）が、ＲＳＶ感染の処置または予防用として提供される。これは、必要とする対象にＲＳＶＦタンパク質に対するＩＳＶＤを投与する工程を含む方法が、ＲＳＶ感染の処置または予防のために前記対象に提供されることの言及と等しい。ここでまた、ＩＳＶＤは、タンパク質として（ＲＳＶ結合構築物または医薬組成物の一部として、単一ドメインタンパク質として）提供されてもよく、またはＲＳＶＦタンパク質に対するＩＳＶＤをコードしている核酸分子としてもしくはそのような核酸分子を含むベクターとして投与されてもよい。ＩＳＶＤ（またはＲＳＶ結合構築物）がタンパク質として投与される場合、異なる投与経路を想定することができる。非限定的な例としては、ＩＳＶＤは、全身、経口、または例えば鼻吸入によるような鼻腔内投与することができる。ＩＳＶＤが、核酸またはベクターとして提供される場合、ＩＳＶＤは、遺伝子治療によって投与されることが特に想定される。

さらなる態様によれば、医薬組成物は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に対するＩＳＶＤを少なくとも１つ含む形で提供される。一般に、そのような医薬組成物は、ＲＳＶＦタンパク質の融合前形態に対するＩＳＶＤを少なくとも１つ含む。前記医薬組成物は、さらなる部分を含んでもよい。前記さらなる部分は、ＲＳＶに結合してもしなくてもよい。医薬組成物が、医薬用として提供されることが本明細書において想定される。特にそれらは、ＲＳＶ感染の治療的処置または予防用として提供される。これは、記載した通り、必要とする対象に本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法が、ＲＳＶ感染の治療的処置または予防のために前記対象に提供されることの言及と等しい。

さらなる実施形態によれば、方法は、ＲＳＶ感染の治療的処置または予防を提供し、この方法は、必要とする対象に上記のＩＳＶＤ、上記のＲＳＶ結合構築物または上記の医薬組成物を投与する工程を含む。前記方法は、前記対象にＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に対するＩＳＶＤを投与する工程を含む。そのような方法は一般に、前記対象に感染の症候の改善または予防をもたらすことになる。ここでまた、ＩＳＶＤは、タンパク質として（ＲＳＶ結合構築物または医薬組成物の一部として、単一ドメインタンパク質として）提供されてもよく、またはＲＳＶＦタンパク質に対するＩＳＶＤをコードしている核酸分子として、もしくはそのような核酸分子を含むベクターとして、もしくはそのような抗体を含有する医薬組成物として、投与されてもよい。また、本明細書に記載のＲＳＶ結合構築物は、ＲＳＶ感染の治療的処置または予防の方法において、必要とする対象への投与が想定される。

特定の実施形態、特定の構成ならびに材料および／または分子が、本発明による細胞ならびに方法に関して本明細書で考察されてきたが、形態および詳細の様々な変更または改変が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく行われ得ることは理解されよう。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく例示するために提供されているのであり、本出願を限定すると考えられるべきでない。本出願は、請求項によってのみ限定される。

実施例のための材料および方法
免疫化およびＶＨＨライブラリ作製
ラマに、０、７、１４、２１、２８および３５日目に、精製されたＲＳＶＦタンパク質ＤＳ−Ｃａｖ１１６７μｇを各回皮下に注射した。ＤＳ−Ｃａｖ１は、融合前コンホメーションで安定化される組換えＲＳＶＦタンパク質である（ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３年）。最初の２回の注射は、アジュバントとしてポリ−ＩＣ（注射１回当たり３７５μｇ）と共に実行し、一方で最後の４回の注射に対してはＧｅｒｂｕＬＱ＃３０００を、アジュバントとして使用した。全ての免疫化の前に採血し、血漿を調製して血清転換を評価した。４０日目に、抗凝固処理血液１００ｍｌを採取して、リンパ球を調製した。

末梢血リンパ球からのトータルＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーによる第１鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。このｃＤＮＡを使用して、ＶＨＨをコードしている配列をＰＣＲによって増幅し、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミドベクターｐＨＥＮ４のＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングした。エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞に、組換えｐＨＥＮ４ベクターを形質転換し、約５×１０^８個の独立した形質転換体のＶＨＨライブラリを得た。９５個の独立した形質転換体のＰＣＲ分析によって明示されるように、形質転換体の８７％は、正しい挿入サイズでベクターを保有した。

ライブラリ貯蔵物５００μｌに、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを感染させて、ファージ表面にＶＨＨ配列を（Ｍ１３ＰＩＩＩとの融合で）提示させ、その配列を生物パニングに使用した。

細胞
Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２３）、ベロ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８１）およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（Ｍ．Ｈａｌｌ博士からの贈与物）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウムで補充されたＤＭＥＭ培地中で増殖させた。

ウイルス
ＲＳＶのＡサブタイプであるＲＳＶＡ２（ＶＲ−１５４０、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）およびＲＳＶのＢサブタイプであるＲＳＶＢ４９（ＢＥ／５６４９／０８臨床株、Ｍ．ＶａｎＲａｎｓｔ教授から得た、Ｔａｎら、２０１３年）を、１％ＦＣＳを含有する増殖培地の存在下で、ＭＯＩ０．１で単層のＨｅｐ−２細胞に感染させることにより増やした。感染５日後に、細胞および増殖培地を採取し、プールし、遠心分離（４５０×ｇ）によって澄ませた。ウイルスを濃縮するために、澄ませた上清を、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）の存在下で、４℃で４時間培養した。遠心分離（３０００×ｇで３０分間）後に、ペレットを、２０％スクロースを含有するハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁し、分注し、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で貯蔵した。

ＲＳＶ中和活性アッセイ
ラマ血漿を、プラークアッセイによってＲＳＶＡ２およびＲＳＶＢ４９に対する中和活性について試験した。ベロ細胞を、９６ウェルプレート（１５０００個細胞／ウェル）に播種した。次の日、血漿サンプルの希釈系列を、１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシンで補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に調製した（１／４希釈で開始する１／３希釈系列）。同体積のＲＳＶＡ２懸濁液（１．４ＰＦＵ／μｌに希釈した）またはＲＳＶＢ４９（２．８ＰＦＵ／μｌに希釈した）を、血漿サンプルに添加し、得られた混合物を、３７℃で３０分間培養した。その後、混合物５０μｌを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄したベロ細胞に添加し、細胞を、３７℃で３時間培養した。次に、２％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸および１ｍＭピルビン酸ナトリウムで補充されたＤＭＥＭ培地中の１．２％アビセル５０μｌを各ウェルに添加し、感染を３７℃で３日間継続させた。ウェルに２％パラホルムアルデヒド溶液５０μｌを添加することによって、細胞を、室温で３０分間固定した。固定後に、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ５０μｌで１０分間透過化し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。その後、ポリクローナルヤギ抗ＲＳＶ血清（ＡＢ１１２５、ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した（０．５％ＢＳＡおよび０．００１％トライトンＸ−１００を含有するＰＢＳ［ＰＢＳ／ＢＳＡ］に１／２０００）。ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞を、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギＩｇＧ（ＳＣ２０２０、サンタクルーズ）と３０分間培養した。その後ウェルを、ＰＢＳ／ＢＳＡで４回およびＰＢＳで１回洗浄した。最後に、プラークを、ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、ゲイサーズバーグ）をアプライすることによって可視化した。粗ピキア・パストリス上清および精製したＶＨＨのＲＳＶ中和活性（下記参照）も、このアッセイで決定した。

ＤＳ−Ｃａｖ１結合ＶＨＨの単離
パニングを１回転実行して、融合前Ｆ（ＤＳ−Ｃａｖ１）結合ファージを富化した。マイクロタイタープレート（ＩＩ型、Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）の１ウェル（ウェルＡ１）を、ＰＢＳ中のＤＳ−Ｃａｖ１２０μｇで終夜コーティングした。このウェルを、コーティングしていない陰性対照ウェル（ウェルＡ１２）とともにＳＥＡＢＬＯＣＫブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間ブロッキングした。次に、ＳＥＡＢＬＯＣＫブロッキング緩衝液１００μｌ体積中の１０１２ファージを、これら２つのウェルに添加した。１時間後に、結合していないファージ粒子を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０回洗浄した。次いで、保持されているファージを、ウェルにＴＥＡ溶液（１４％トリエチルアミン［Ｓｉｇｍａ］ｐＨ１０）１００μｌからなるアルカリ性溶液を正確に１０分間アプライすることによって溶出させた。次いで、解離したファージを、１ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ８．０１００μｌを含む滅菌チューブに移した。ＰＢＳ中の溶出したファージの１０倍段階希釈物を調製し、この希釈系列１０μｌを使用して、ＴＧ１細胞（ファージディスプレイコンピテント大腸菌細胞）９０μｌに感染させた。感染を、３７℃で３０分間させておき、その後細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グルコースを含むＬＢ／寒天プレートに播いた。このパニング手順による抗原特異的ファージの富化を、陰性対照ウェルから溶出されたファージミド粒子の数と抗原コートウェルから溶出されたファージミド粒子の数を比較することによって評価した。

９０個のアンピシリン抵抗性コロニーを、ペリプラズム中のＦ特異的ＶＨＨの存在に対するＥＬＩＳＡによるさらなる分析のために無作為に選択した。これらのコロニーを、アンピシリンを含む新しいＬＢ寒天プレートに先ず移し、次いでそれを使用して、２４ディープウェルプレート中の１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）培地１ｍｌに接種した。接種したプレートを、振盪しながら３７℃で５時間培養した。ＶＨＨ発現を、１ｍＭ濃度までイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導した。その後プレートを、振盪しながら３７℃で終夜培養した。次の日、細菌細胞を、遠心分離（３２００ｒｐｍで１２分間）によってペレット化し、上清を除去した。細胞ペレットを、ＴＥＳ緩衝液（０．２ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ８、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース）２００μｌに再懸濁し、プレートを４℃で３０分間振盪した。次に、再懸濁した細胞に水を添加して、浸透圧ショックを誘導した。浸透圧ショックは、ＶＨＨを含むペリプラズムタンパク質の放出をもたらす。ディープウェルプレートを、振盪しながら４℃で１時間培養し、遠心分離し、ペリプラズム抽出物を含有する上清を回収した。４枚のマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中で、１ウェル当たりタンパク質１００ｎｇで終夜コーティングした。２枚は、融合後コンホメーションのＦ（ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１１年）とＢＳＡの交互の列、他の２枚は、ＤＳ−Ｃａｖ１とＢＳＡの交互の列を含む。コーティングしたマイクロタイタープレートを、次いで洗浄し、ＰＢＳ中の１％粉乳でブロッキングした。マイクロタイタープレートを洗浄した後、ペリプラズム抽出物１００μｌをウェルに添加し、続いて４℃で１時間培養した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の１／２０００希釈抗ＨＡモノクローナル抗体（ＭＭＳ−１０１ＰＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）５０μｌを、プレートに室温で添加し１時間放置した。洗浄後、ＰＢＳ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結抗マウスＩｇＧ（ＮＸＡ９３１、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）１／２０００希釈物を添加し、プレートを１時間培養した。次に、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン、ＢＤＯｐｔＥＩＡ［商標］）５０μｌを、全てのウェルに添加した。反応を、１ＭＨ_２ＳＯ_４５０μｌの添加によって停止させ、その後４５０ｎｍの吸光度を、ｉＭａｒｋＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＡｂｓｏｒｂａｎｃｅＲｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。ＤＳ−Ｃａｖ１または融合後Ｆに対して得られたＯＤ４５０値が、ＢＳＡに対して得られたＯＤ４５０値より少なくとも２倍高かった全ペリプラズム画分を、さらなる分析のために選択した。対応する細菌を、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するプラスミド単離のために１／２０００アンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で増殖させた。クローニングしたＶＨＨのｃＤＮＡ配列を、Ｍ１３ＲＳプライマー（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ３’）を使用してサンガー配列決定法によって決定した。

ピキア・パストリス発現ベクターへのＶＨＨのクローニングおよびピキア・パストリスの形質転換
ＶＨＨ配列、ならびにパニング後に保持されたＶＨＨ配列を、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマー（５’ＧＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ３’；５’ＣＴＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧ３’）を使用してそれぞれのｐＨＥＮ４プラスミドからＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化したｐＫａｉ６１骨格にライゲートした。ｐＫａｉ６１ベクターの起原については、Ｓｃｈｏｏｎｏｏｇｈｅら、２００９年に記述されている。ＶＨＨ配列を、Ｓ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａ接合因子シグナル配列のわずかに修飾されたバージョンとフレームを合わせてクローニングする。このシグナル配列は、酵母分泌系へタンパク質を導き、ＥＲおよびゴルジにおいてさらにプロセシングされ、細胞外培地への分泌前に完全に除去される。野生型プレプロシグナルとは対照的に、この修飾されたバージョンは、ＧｌｕＡｌａリピートをコードする配列を含有しない。（ここでシグナルペプチドは、このリピートを必要とせずにＫｅｘ２エンドペプチダーゼによって効率的に切断される。）コードされている遺伝子は、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを含有し、メタノール誘導可能なＡＯＸ１プロモーターの制御下にある。プラスミドは、細菌および酵母細胞における選択のためにゼオシン抵抗性マーカーを含有する。Ｐ．パストリスに形質転換する前に、ベクターを、ＡＯＸ１プロモーターにおいて（Ｐｍｅｌで）直鎖化して、ゲノムへの安定的な組み込みのために内在性のＡＯＸ１遺伝子座における相同組換えを促進させた。得られたベクターを、ｐＫａｉ−ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ｐＫａｉ−ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６、ｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ２およびｐＫａｉ−ＶＨＨ−Ｆ５８と命名し、これらを使用して、Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、２００５年に記述されているコンデンス形質転換（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）プロトコルを使用してピキア・パストリスＧＳ１１５株の形質転換を行った。

ピキア・パストリスによって産生されるＶＨＨの精製
形質転換したピキア・パストリスクローンによるＶＨＨの発現を、２ｍｌ培養物で最初に分析した。１日目に、個々の形質転換体を使用して、１００μｇ／ｍｌゼオシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＹＰＮＧ培地（２％ペプトン、１％バクト酵母抽出物、１．３４％ＹＮＢ、０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ６、０．００００４％ビオチン、１％グリセロール）２ｍｌを接種し、振盪しながら２８℃で２４時間培養した。次の日、細胞を、遠心分離（５００ｇで８分間）によってペレット化し、ＹＰＮＧ培地をＹＰＮＭ培地（２％ペプトン、１％バクト酵母エキス、１．３４％ＹＮＢ、０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ６、０．００００４％ビオチン、１％メタノール）で置き換えて、ＶＨＨ発現を誘導し、培養物を、振盪しながら２８℃で７２時間培養した。５０％メタノール５０μｌを、７２時間、８０時間および９６時間にて培養物に添加した。メタノール含有培地に移した１００時間後に、酵母細胞を、遠心分離（５００ｇで８分間）によってペレット化し、上清を保持してＶＨＨの存在を評価した。粗培地（２５μｌ）を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、その後タンパク質の存在を、クーマシーブリリアントブルー染色によって分析した。ＲＳＶ中和活性を持つＶＨＨを選択するために、上記のプラークアッセイに上清の段階希釈物をアプライすることにより個々のピキア・パストリス形質転換体の粗ＹＰＮＭ上清中のＲＳＶ中和活性を決定した。

培地中に高レベルのＶＨＨを産したかもしくは高いＲＳＶ中和活性を持つピキア・パストリス形質転換体を選択して、１００または３００ｍｌピキア培養物を使用して拡大した。増殖およびメタノール誘導条件、および培地の回収は、２ｍｌ培養物について上述したものと類似した。清澄な培地を、硫酸アンモニウム沈殿（８０％飽和）に４℃で４時間供した。不溶性画分を、２００００ｇでの遠心分離によってペレット化し、ＨｉｓＴｒａｐ結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）１０ｍｌに可溶化し、４℃で１０分間遠心分離し、その後上清をＨｉｓＴｒａｐ結合緩衝液で事前に平衡化したＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍｌにロードした。少なくとも１０カラム体積のＨｉｓＴｒａｐ結合緩衝液でカラムを洗浄した後（吸光度が安定したベースラインに達するまで）、結合しているタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ結合緩衝液中のイミダゾール２０ｍＭから開始し、５００ｍＭで終了する合計体積２０ｍｌにわたる線形のイミダゾール勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、ＶＨＨを含有する画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラム（５ｋＤａカットオフ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２ｍｌに濃縮した。次いで、これらの濃縮画分を、ＰＢＳ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにロードし（１６０ｍｌ、０．８ｍｌ／分）、ピーク画分をプールし、５ｋＤａカットオフのＶｉｖａｓｐｉｎカラムで濃縮した。プールされた画分のタンパク質濃度を、各ＶＨＨにカスタマイズしたパーセント溶液吸光係数を用いてＮａｎｏＤｒｏｐ１０００によるＡ２８０測定で決定した。プールした濃縮画分を分注し、さらなる使用の前に−８０℃で貯蔵した。

精製したＶＨＨの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の算出
ピキア・パストリスによって産生された精製したＶＨＨのＩＣ５０を決定するために、これらＶＨＨの、Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ中に調製した３倍段階希釈物を、上記のＲＳＶ中和アッセイで評価した。モノクローナルＩｇＧＤ２５およびＡＭ２２（Ｂｅａｕｍｏｎｔら、２０１２年、Ｓｐｉｔｓら、２０１３年）（両方ともＦの融合前コンホメーションに対して特異的である）を、陽性対照として使用した。α−マクログロブリンに対するＶＨＨであるＮＢ１．１２を、陰性対照として使用した。ＩＣ５０値を、手作業で算出した。

ＤＳ−Ｃａｖ１および融合後Ｆに対するＶＨＨのインビトロ結合
ＤＳ−Ｃａｖ１および融合後Ｆに対する精製したＶＨＨの結合を、直接ＥＬＩＳＡで試験した。マイクロタイタープレート（ＩＩ型、Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌＤＳ−Ｃａｖ１溶液または１μｇ／ｍｌ融合後Ｆ溶液１００μｌでコーティングした。洗浄後に、プレートを、ＰＢＳ中の４％ミルク２００μｌで１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳで１回再び洗浄した。次いで、ＶＨＨの１／３希釈系列（３０μｇ／ｍｌから開始する）を、タンパク質でコーティングしたウェルにアプライした。１時間後に、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の抗ヒスチジンＴａｇ抗体（ＡＤ１．１．１０ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）１／２０００希釈物を添加し１時間放置した。洗浄し、ＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ（１／２０００希釈物）を添加し１時間放置した後に、上述したＰＥ−ＥＬＩＳＡと同じ方法でＥＬＩＳＡを展開した。親和性決定のために、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩおよび６×ＨｉｓＴａｇを持つ精製したＤＳ−Ｃａｖ１を、ＢｉａｃｏｒｅＸ１００（ＧＥ）を使用して各サイクルにつきおよそ５３７反応単位（ＲＵ）でＮＴＡセンサーチップに捕捉した。ＮＴＡセンサーチップを、０．２５ＭＥＤＴＡ及びその次に０．５ｍＭＮｉＣｌ２を使用してサイクルの合間に再生した。緩衝液のみのサンプルを、ＤＳ−Ｃａｖ１および参照フローセルに注入し、続けてＨＢＳ−Ｐ＋中に５ｎＭ〜３９．１ｐＭに２倍段階希釈したＮｂ４またはＮｂ６６（１．２５ｎＭ濃度については２連）を注入した。データを二重参照減算し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒを使用して１：１結合モデルに当てはめた。

ＲＳＶＦｃＤＮＡ発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞の表面に発現されるＦに対するＶＨＨの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、１５０ｍｍ組織培養プレート当たり４，０００，０００個細胞で播種し、ＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｓｙｎ（コドン最適化したＲＳＶＦｃＤＮＡをコードする）６．４μｇによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を追跡するために、トランスフェクションを、ｐｅＧＦＰ−ＮＬＳ６．４μｇの存在下で実行した。対照トランスフェクションを、ｐｅＧＦＰ−ＮＬＳだけで実行した。トランスフェクション１８時間後に、細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン、０．５ｍＭＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）１５ｍｌで剥離し、ＰＢＳで１回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で３０分間培養した。その後、細胞を、図８に示す異なる濃度で、示したＶＨＨまたはＲＳＶ−Ｆ特異的マウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ８５８−１、ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と共に、培養した。１時間後に、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に１／３０００希釈した抗ヒスチジンＴａｇ抗体と共に１時間培養した。次に、細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、抗マウスＩｇＧＡｌｅｘａ６３３を３０分間添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して分析した。ＧＦＰを発現している細胞の１つを、側方散乱シグナルのピーク表面（ｐｅａｋｓｕｒｆａｃｅ）、前方散乱シグナルのピーク表面およびピーク高ならびに緑色蛍光シグナルのピーク表面に基づいて選択した。最後に、これらＧＦＰ陽性単一細胞のＡｌｅｘａ６３３蛍光強度シグナルを、測定した。

マウス
特定病原体未感染の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＷｉｇａ、ズルツフェルト、ドイツ）から入手した。動物を、温度制御環境において１２時間明／暗サイクルで飼育し；飼料および水は適宜提供した。動物施設は、フレミッシュ政府ライセンス番号ＬＡ１４００５３６の下で運営する。全ての実験は、法律によって指定され、実験動物に関する施設倫理委員会（倫理出願ＥＣ２０１５−０１９）によって認可された条件下で行われた。

ＶＨＨおよびモノクローナル抗体の投与ならびにマウスのＲＳＶ抗原接種
マウスを、イソフルランによってわずかに麻酔した後、ＶＨＨ、パリビズマブまたはＲＳＶ抗原接種ウイルスを鼻腔内投与した。ＶＨＨ、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）およびＲＳＶウイルスを、ＰＢＳ中に処方した合計体積５０μｌで投与し、それらは２つの鼻孔に対して等しく分配した。１，０００，０００ＰＦＵのＲＳＶＡ２による感染の４時間前に、５匹のマウスの各群は、ＤＳ−Ｃａｖ１−４３０μｇ、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６３０μｇ、ＶＨＨ−Ｆ２（陰性対照として）３０μｇまたはパリビズマブ（陽性対照として）３０μｇを投与した。全ての群が、感染の２４時間後に陰性対照ＶＨＨ−Ｆ２３０μｇも投与した。

プラークアッセイによる肺ウイルス力価の決定
抗原接種の５日後に、マウスを、頚椎脱臼によって屠殺した。マウス肺を、無菌的に除去し、２０％スクロースを含有し１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシンで補充されたＨＢＳＳ１ｍｌ中の滅菌した金属ビーズの存在下でＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ２０００（Ｒｅｔｓｃｈ）による激しい振盪によりホモジナイズした。その後、肺ホモジネートを、４℃での遠心分離（２５００ｒｐｍで１０分間）によって清澄にし、ベロ細胞におけるウイルス滴定用として２連で使用した。単層のベロ細胞を、９６ウェルプレート中のペニシリンおよびストレプトマイシンで補充された無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の肺ホモジネートの段階１：３希釈物５０μｌにより感染させた。プラークアッセイを、上記の通りさらに処理した。各ウェル内のプラークを計数し、各希釈物について肺（１ｍｌ）当たりのＰＦＵ数を以下の通り算出した：希釈物中に存在するプラーク数×希釈×２０（＝合計上清体積１０００μｌ／希釈系列の第１ウェルに感染させるために使用した上清５０μｌ）。次いで、各肺におけるＰＦＵ数を、２連の平均として算出した。

ｑＲＴ−ＰＣＲによる肺ウイルス力価の決定
ｑＲＴ−ＰＣＲによって肺ＲＳＶ負荷を決定するために、清澄な肺ホモジネートのトータルＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＨｉｇｈＰｕｒｅＲＮＡｔｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム）を使用することによって調製した。ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマープライマーおよびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム）の使用により調製した。ゲノムＲＳＶＭｃＤＮＡの相対的レベルを、ＲＳＶＡ２Ｍ遺伝子に特異的なプライマー（５’ＴＣＡＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡ３’および５’ＧＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＣ３’）ならびに５’末端でフルオレセイン（ＦＡＭ）によって、および３’末端付近で暗消光色素によって標識されている、ヌクレオチドプローブ（＃１５０ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータを、各マウスのサンプルに存在するｍＲＰＬ１３ＡｍＲＮＡレベルに対して標準化した。

ＤＳ−Ｃａｖ１−結合に対する抗体交差競合
ＤＳ−Ｃａｖ１タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中でアミンカップリング反応によってＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定した。反応を、１Ｍエタノールアミンにより失活させ、次いで、ＤＳ−Ｃａｖ１固定バイオセンサーを、アッセイ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で平衡化した。バイオセンサーを、２つの抗体工程の間の短いベースライン工程で競合抗体（アッセイ緩衝液中に３５μｇ／ｍｌ）に浸漬し、続いて分析抗体（アッセイ緩衝液中に３５μｇ／ｍｌ）に浸漬した。

［実施例１］
ラマ血漿におけるＲＳＶ中和活性
ＤＳ−Ｃａｖ１による免疫化後のラマにおける体液性抗ＲＳＶ反応の誘導を評価するために、各免疫化の前後に得られた血漿サンプルを、ＲＳＶ中和アッセイで試験した。サンプルを、ＲＳＶ−Ａ２およびＲＳＶＢ４９（ＲＳＶＢの臨床株）に対する中和活性について試験した。図１は、４回目の免疫化後に得られる血漿サンプルの全てが、ＲＳＶＡ２およびＲＳＶＢ４９に対する高い中和活性を有することを例示する。

［実施例２］
ＤＳ−Ｃａｖ１特異的ＶＨＨの単離
ＶＨＨファージライブラリを、ＤＳ−Ｃａｖ１タンパク質に対する１回のパニングに供した。ＤＳ−Ｃａｖ１特異的ファージの富化を、コーティングしていないウェルから溶出されたファージの数とＤＳ−Ｃａｖ１コーティングしたウェルから溶出されたファージの数を比較することによって評価した。溶出されたファージの数は、アンピシリン抵抗性形質導入単位、すなわちパニング工程において溶出されたファージで形質導入されたＴＧ１のコロニーの数を決定することによって間接的に推定された。この実験は、ファージ集団が、ＤＳ−Ｃａｖ１特異的ファージについて約１４０倍富化されたことを示唆した。９０個のコロニーを無作為に選択し、これらのペリプラズム抽出物中にあるＦの融合後コンホメーションに対するＦの融合前コンホメーション（ＤＳ−Ｃａｖ１）に特異的なＶＨＨの存在についてＥＬＩＳＡによって分析した。このＥＬＩＳＡの結果を、図２に図示する。９０個のコロニーのうち、３７個のコロニーが、陽性を記録した（１０個は、融合前および融合後の両方のＦへの結合について陽性を記録し、１９個は、融合前Ｆだけへの結合について陽性を記録し、８個は、融合後Ｆだけへの結合について陽性を記録した）。融合前または融合後のＦへの結合を示唆した全てのコロニーのＶＨＨ配列を、決定した。３７個中２８個のクローンが、固有のＶＨＨ配列を有し、さらなる使用ために選択された。これらクローンのＶＨＨ配列を、ピキア・パストリス発現ベクターにクローニングし、得られたプラスミドをその後使用してピキア・パストリスの形質転換を行った。

［実施例３］
ピキア・パストリス上清における中和活性試験
また、ＤＳ−Ｃａｖ１に対して１回パニングした後に得られたＶＨＨｃＤＮＡライブラリを、ピキア・パストリス発現ベクターｐＫａｉ６１にクローニングすることを試みた。この戦略を使用して、個々のピキア・パストリス形質転換体の上清におけるＲＳＶ中和活性に基づいて生物学的に関連のあるＶＨＨ候補を選択しようと試みた。Ｆへの結合に基づいて選択した２０個の個々のピキア・パストリス形質転換体から、５つがＲＳＶＡ２に対する中和活性を有し（ＤＳ−Ｃａｖ１−４が最も強力な１つである）、一方ｐＫａｉ６１へのライブラリクローニングから得られた１８個のクローンからは、１つ（ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６）のみ中和活性を示した（図３）。

ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６のｃＤＮＡ配列を、サンガー配列決定法によって決定し、核酸配列および導き出されたアミノ酸配列を図５に示す。

［実施例４］
精製したＶＨＨの産生およびＩＣ５０の決定
精製の前に、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、最も強力な、ＲＳＶ中和ＶＨＨを有し、これら２つのＶＨＨならびに陰性対照ＶＨＨＦ２およびＦ５８を、ピキア・パストリス培養物３００ｍｌ中で産生し、ＨｉｓＴｒａｐ精製により精製した後に、ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５サイズ排除クロマトグラフィーを行った（図４）。ＶＨＨＦ２およびＶＨＨＦ５８は、不活化フニンウイルスで免疫した異なるラマ由来のＶＨＨライブラリから得られた無関係な対照ＶＨＨである。インビトロでＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６はそれぞれ、０．０２１ｎＭおよび０．０３２ｎＭのＩＣ５０でＲＳＶＡ２を中和した。ＲＳＶＢ４９の中和の場合、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６はそれぞれ、０．０１５ｎＭおよび０．０３２ｎＭのＩＣ５０を示した。ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、ヒトメタ肺炎ウイルスＡおよび／またはＢ血清型を中和し得るかどうか評価するために、ＧＦＰ発現ｈＭＰＶ組換えウイルス（ＮＬ／１／００Ａ１傍系またはＮＬ／１／９９Ｂ１傍系、ＢｅｒｎａｄｅｔｔｅｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎおよびＲｏｎＦｏｕｃｈｉｅｒ、ロッテルダム、オランダから親切にも贈られた物）またはＧＦＰ−ｈＲＳＶ（Ａ２株、ＭａｒｋＰｅｅｐｌｅｓ、コロンバス、オハイオ州、米国から親切にも贈られた物）（ＭＯＩ０．３ｆｆｕ／細胞）の既定の量を、ＶＨＨもしくはｍＡｂの段階希釈物と混合し、Ｖｅｒｏ−１１８（ｈＭＰＶ）もしくはＨＥｐ−２細胞いずれかの培養物に添加し、９６ウェルプレート内で増殖させた。３６時間後に、培地を除去し、ＰＢＳを添加し、ウェル当たりＧＦＰの蛍光強度をＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーＭ２００で測定した。蛍光値を、抗体を含まないウイルス対照のパーセントとしてプロットし、それを使用して、対応するＩＣ５０値を算出した。

［実施例５］
ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、融合前状態のＲＳＶＦに結合するが、融合後状態のＲＳＶＦに結合しない。

融合前および融合後のＦに対するＤＳ−Ｃａｖ１−４ならびにＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合能力を評価するために、いずれかのコンホメーションのＦをマイクロタイタープレートに直接コーティングし、ＶＨＨの３倍希釈系列を、このプレートに添加するＥＬＩＳＡを実行した（図７Ａ）。ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、コーティングされた融合前Ｆに特異的に結合し、コーティングされた融合後コンホメーションであるＦには結合しないことが判明した。融合前Ｆタンパク質に対する結合親和性をさらに特徴づけるために、ＳＰＲに基づく結合実験を実行した。両方のＩＳＶＤが、ピコモル濃度の親和性で融合前ＲＳＶＦに結合することが判明した。本来二価であるパリビズマブまたはＡＭ１４（Ｇｉｌｍａｎら、２０１５年）のような従来通りのモノクローナル抗体に反してＩＳＶＤは一価なので、標的に対してそのような高親和性を示すことは、驚くべきことである。特に、ＤＳ−Ｃａｖ１−４の解離速度は、極めて低い。

哺乳動物細胞によって発現されたＦへのＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の結合も、評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、コドン最適化したＦｃＤＮＡをコードしているｐＣＡＧＧＳ−ＦｓｙｎとｐｅＧＦＰ−ＮＬＳとを同時トランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの１８時間後に回収し、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６、陰性対照ＶＨＨＦ５８およびＦ２ならびにＲＳＶ−Ｆに特異的なモノクローナルマウスＩｇＧ抗体で染色した。同時トランスフェクション設定におけるＧＦＰ陽性細胞へのＶＨＨの結合を、ＧＦＰ発現ベクターだけによってトランスフェクトしたＧＦＰ陽性細胞への結合と比較した。明らかな結合が、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の全ての希釈物でならびにＲＳＶＦに対する陽性対照モノクローナル抗体の最大から３つ目までの濃度で観察された（図８）。

［実施例６］
ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６は、ＲＳＶＦの新たなエピトープに結合する
ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、最近記述された融合前Ｆ特異的エピトープΦに結合するかどうか調査するために、これらのＶＨＨが、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質への結合に関してエピトープΦ特異的Ｄ２５抗体と競合し得るかどうかバイオレイヤー干渉法によって調査した（図９）。競合アッセイは、いずれのＶＨＨもＤ２５と競合しないことを示す。対照的に、両方のＶＨＨは、互いに競合した。これらの結果は、両方のＶＨＨは、一部重なるエピトープに結合するが、これらのエピトープはＤ２５エピトープΦと異なることを示す。

ＩＳＶＤエピトープのさらなる特徴づけから、ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が、ＲＳＶＦ上で構造的保存が高い同じエピトープを結合することが確認された（図１１Ａ−Ｄ）。図１１Ｃにおいて、ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の両方に接触される融合前安定化ＲＳＶＦタンパク質（完全オープンリーディングフレーム、インビボプロセシング前、配列番号１７）の残基に下線を引く。特に、ＲＳＶＦタンパク質の以下のアミノ酸残基は、ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６のエピトープの部分を形成する：Ｔ５０、Ｇ５１、Ｗ５２、Ｓ１８０、Ｇ１８４、Ｖ１８５、Ｐ２６５、Ｉ２６６、Ｔ２６７、Ｎ２６８、Ｄ２６９、Ｑ２７０、Ｌ３０５、Ｇ３０７、Ｖ３０８、Ｎ３４５、Ａ３４６、Ｇ３４７、Ｋ４２１、Ｓ４２５、Ｋ４２７、Ｎ４２８、Ｒ４２９、Ｇ４３０、Ｉ４３１、Ｓ４５１、Ｇ４５３、Ｎ４５４、Ｌ４５６、Ｙ４５８。これらの残基は、ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６両方のエピトープを表す。ＣＤＲ２ループおよびＣＤＲ３ループの結合のさらなる詳細については、図１２（ＤＳ−Ｃａｖ１−４）および図１３（ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６）に示される。

モタビズマブ、ＡＭ１４、１０１ＦおよびＤＳ−Ｃａｖ１−４との複合体における融合前コンホメーションのＦタンパク質の構造から、新たな結合エピトープが明らかになった（図１４）。ＲＳＶＦとの共結晶構造が公知である他の全ての抗体は、ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６が結合するエピトープと異なるエピトープに結合する。融合前安定化ＲＳＶＦへの結合に関してＤＳ−Ｃａｖ１−４（すなわちＡＭ１４およびパリビズマブ）およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６（すなわちＡＭ１４、パリビズマブおよび１０１Ｆ）と競合し、結合エピトープが、共結晶構造分析によって疑いの余地なく決定されている抗体でも、ＲＳＶＦ中の異なるエピトープに結合する。これは、図１４に示される。パリビズマブおよびモタビズマブが、ＲＳＶＦにある同じエピトープに結合すること、およびこのエピトープが、ＲＳＶＦの融合前および融合後状態に存在することに、留意する。

［実施例７］
インビボでのＶＨＨの予防的抗ＲＳＶ活性試験
ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４またはＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６の予防的投与が、インビボでＲＳＶ抗原接種から保護できるかどうか試験するために、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たり５匹のマウス）に、１．１０６ＰＦＵのＲＳＶＡ２による感染の４時間前に、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＶＨＨＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６、Ｆ２ＶＨＨまたはパリビズマブ３０μｇを鼻腔内投与した。抗原接種の２４時間後に、全てのマウスに、Ｆ２ＶＨＨ３０μｇを鼻腔内投与した。抗原接種の５日後に、マウスを屠殺し、肺を、２０％スクロース、ペニシリンおよびストレプトマイシンで補充されたＨＢＳＳ１ｍｌ中でホモジナイズした。肺に高レベルの複製ウイルス（約１×１０^５ＰＦＵ）を示したＦ２ＶＨＨで処置した群とは対照的に、ＤＳ−Ｃａｖ１−４、ＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６またはパリビズマブで処置したマウスは、それらの肺に検出可能な複製ウイルスを有さなかった（パリビズマブで処置した１匹のマウスを除く）（図１０Ａ）。肺内の複製ウイルスのレベルを定量化するために使用されるプラークアッセイは、中和抗体またはＶＨＨの存在による影響を受ける可能性があるので、肺ホモジネート中のＲＳＶＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに定量化した。ＤＳ−Ｃａｖ１−４およびＤＳ−Ｃａｖ１−Ｌ６６で処置したマウスは、Ｆ２処置対照マウスと比較して、平均して３０００分の１より少ないウイルスＲＮＡを示した。パリビズマブで処置したマウスは、Ｆ２処置対照マウスと比較して、平均して約１００分の１のウイルスＲＮＡを示した。

参考文献

Claims

ＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質の融合前形態に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）であって、
一価形式で呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）血清型ＡとＢに対して類似の中和活性を示し、ここで、ＲＳＶ血清型ＡとＢの中和活性はＩＣ５０として表される比較される中和活性と１０倍以下の相違であり、
配列番号１７のアミノ酸５０〜５２、１８０、１８４、１８５、２６５〜２７０、３０５、３０７、３０８、３４５〜３４７、４２１、４２５、４２７〜４３１、４５１、４５３、４５４、４５６及び４５８を含むＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のコンホメーションエピトープに結合することを特徴とする、ＩＳＶＤ。
ａ．配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号３のＣＤＲ２配列、及び配列番号５のＣＤＲ３配列を含む、又は、
ｂ．配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号４のＣＤＲ２配列、及び配列番号６のＣＤＲ３配列を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載のＩＳＶＤ。
請求項１または２に記載のＩＳＶＤを少なくとも１つ含むことを特徴とするＲＳＶ結合構築物。
請求項１または２に記載のＩＳＶＤを少なくとも１つコードすることを特徴とする核酸。
請求項４に記載の核酸により形質転換またはトランスフェクトされていることを特徴とする宿主細胞。
前記ＩＳＶＤを産生するための、請求項５に記載の宿主細胞の使用。
医薬として使用するための、請求項１もしくは２に記載のＩＳＶＤまたは請求項３に記載のＲＳＶ結合構築物。
ＲＳＶ感染の治療的処置または予防に使用するための、請求項１もしくは２に記載のＩＳＶＤまたは請求項３に記載のＲＳＶ結合構築物。
請求項１または２に記載のＩＳＶＤを少なくとも１つ含むことを特徴とする医薬組成物。
医薬として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
ＲＳＶ感染の治療的処置または予防に使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。