JP6837242B2 - Diagnosis and treatment of brain malaria - Google Patents
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Description
本発明は、脳マラリア（本明細書中「ＣＭ」と称することがある。）の診断および治療に関する。 The present invention relates to the diagnosis and treatment of brain malaria (sometimes referred to herein as "CM").
脳マラリア（ＣＭ）は、突然の昏睡状態、死、または、神経障害によって特徴づけられる、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染の最も致命的な合併症である。脳が重度に冒されるが、ＣＭがどのように生じるかについて、脳の位置と空間時間的機構はあまり理解されていない。 Cerebral malaria (CM) is the most deadly complication of Plasmodium falciparum (P. falciparum) infection, characterized by sudden coma, death, or neuropathy. Although the brain is severely affected, the location and spatiotemporal mechanisms of the brain are poorly understood as to how CM occurs.
脳マラリア（ＣＭ）は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫によって引き起こされるヒトにおけるマラリア感染症の重篤な合併症であり、高い死亡率または長期の身体障害を伴う痙攣や昏睡状態のような突然の臨床症状によって特徴づけられる（非特許文献１＝Idro, R.ら(2010). Pediatr Res 68,267-274.；非特許文献２＝Taylor,T.E.ら(2004). Nat Med 10, 143-145.）。ＣＭは非特異的な症状を呈するため、ＣＭの早期診断は容易でなく、しばしば、ＣＭ治療があまり効果的でない時点で疾患の症状が顕在化する（非特許文献３＝Miller, L.H.ら(2013). Nat Med 19,156-167.）。それゆえ、適時のインターベンションを可能にする、ＣＭの早期の迅速かつ安価な診断が必要とされている。 Brain malaria (CM) is described in P.I. It is a serious complication of malaria infection in humans caused by Plasmodium falciparum parasites and is characterized by sudden clinical symptoms such as convulsions and coma with high mortality or long-term disability (Non-Patent Document 1). = Idro, R. et al. (2010). Pediatr Res 68,267-274 .; Non-Patent Document 2 = Taylor, TE et al. (2004). Nat Med 10, 143-145.). Since CM presents non-specific symptoms, early diagnosis of CM is not easy, and the symptoms of the disease often become apparent when CM treatment is not very effective (Non-Patent Document 3 = Miller, LH et al. (2013). ). Nat Med 19,156-167.). Therefore, there is a need for early, rapid and inexpensive diagnosis of CM that allows for timely intervention.
脳マラリア（ＣＭ）の病理を理解するために、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）寄生虫を使用したＣＭのマウスモデル（実験的脳マラリア、ＥＣＭとして知られる）が広く用いられている（非特許文献４＝Langhorne, J.ら(2011). Malar J 10,23.）。脳は、密な内皮細胞が特定の血管にしっかりと固定された血液脳関門（ＢＢＢ）を形成しており、外来性病原体の侵入を防止する特権的な部位であるが、ＥＣＭは、ＢＢＢの破壊と、その後の炎症性応答および脳内の細胞蓄積から生じると考えられている。実際、多数の研究が、様々な細胞（その大部分は白血球）が、脳の血管に多数蓄積し、そこで、感染赤血球（ｉＲＢＣ）と、ＣＤ８α＋樹状細胞（ＤＣ）によってクロスプライミングされた寄生虫特異的な病原性ＣＤ８ Ｔ細胞がＥＣＭの発病において重要な役割を担うことに言及している（非特許文献５＝Baptista, F.G.ら(2010). InfectImmun 78, 4033-4039.；非特許文献６＝Haque, A.ら(2011). J Immunol 186, 6148-6156.；非特許文献７＝Howland, S.W.ら(2013). Brainmicrovessel cross-presentation is a hallmark of experimental cerebral malaria.EMBO Mol Med. (2013年5月16日オンライン版公開，doi:10.1002/emmm.201202273)；非特許文献８＝Lundie, R.J.ら(2008). Proc NatlAcad Sci U S A 105, 14509-14514.；非特許文献９＝McQuillan, J.A.ら(2011). Int J Parasitol 41,155-163.；非特許文献１０＝Renia,L.ら(2012). Virulence 3, 193-201.；非特許文献１１＝Yui, K. (2013). EMBO Mol Med. (2013年6月5日オンライン版公開，doi:10.1002/emmm.201302849)）。さらに、最近の研究は、ＰｂＡ感染中の活性化ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＤ１１ｃの発現を報告しているが、ＥＣＭの間のその正確な役割については十分に研究されていない（非特許文献１２＝Tamura,T.ら、(2011).Infect Immun 79,3947-3956.）。ＢＢＢ機能不全は、ＥＣＭの主な特徴であり、全身性ならびに局所性の事象がこれに寄与している（非特許文献１３＝Combes,V.ら、(2012). Trends Parasitol 28,311-319.；非特許文献１４＝Nacer,A.ら、(2012).PLoS Pathog 8, e1002982.）。 To understand the pathology of cerebral malaria (CM), P. A mouse model of CM using the berghey ANKA (PbA) parasite (experimental brain malaria, known as ECM) is widely used (Non-Patent Document 4 = Langhorne, J. et al. (2011). Malar J 10, twenty three.). The brain is a privileged site that prevents the invasion of foreign pathogens by forming the blood-brain barrier (BBB), where dense endothelial cells are firmly anchored in specific blood vessels. It is believed to result from destruction followed by an inflammatory response and cell accumulation in the brain. In fact, numerous studies have shown that various cells (mostly white blood cells) accumulate in the blood vessels of the brain, where infected red blood cells (iRBC) and parasites cross-primed by CD8α + dendritic cells (DC). It is mentioned that specific pathogenic CD8 T cells play an important role in the pathogenesis of ECM (Non-Patent Document 5 = Baptista, FG et al. (2010). InfectImmun 78, 4033-4039 .; Non-Patent Document 6 = Haque, A. et al. (2011). J Immunol 186, 6148-6156 .; Non-Patent Document 7 = Howland, SW et al. (2013). Brainmicrovessel cross-presentation is a hallmark of experimental cerebral malaria. EMBO Mol Med. (2013) Published online on May 16, 2014, doi: 10.1002 / emmm.201202273); Non-Patent Document 8 = Lundie, RJ et al. (2008). Proc NatlAcad Sci USA 105, 14509-14514 .; Non-Patent Document 9 = McQuillan, JA Et al. (2011). Int J Parasitol 41,155-163 .; Non-Patent Document 10 = Renia, L. et al. (2012). Virulence 3, 193-201 .; Non-Patent Document 11 = Yui, K. (2013). EMBO Mol Med. (Online version released on June 5, 2013, doi: 10.1002 / emmm.201302849)). In addition, recent studies have reported the expression of CD11c in activated CD8 T cells during PbA infection, but their exact role during ECM has not been fully studied (Non-Patent Document 12 = Tamura). , T. et al., (2011). Infect Immun 79,3947-3956.). BBB dysfunction is a major feature of ECM, and systemic and local events contribute to it (Non-Patent Document 13 = Combes, V. et al., (2012). Trends Parasitol 28,311-319 .; Non-Patent Document 14 = Nacer, A. et al. (2012). PLoS Pathog 8, e1002982.).
本発明者らは、最初のＢＢＢ破壊が、脳全体の血管において同時に生じるのか、脳内にＢＢＢをｉＲＢＣおよび病原性免疫細胞に対して寛容にさせる特定の場所が存在するのかは、理解するために鋭意研究を進めた。同様に、特定の脳領域および／または細胞における免疫応答の空間時間的制御についても解明するために鋭意研究を進めた。 To understand whether the initial BBB destruction occurs simultaneously in blood vessels throughout the brain, or if there is a specific site in the brain that makes BBB tolerant to iRBC and pathogenic immune cells. Diligently proceeded with research. Similarly, diligent research was undertaken to elucidate the spatiotemporal regulation of immune responses in specific brain regions and / or cells.
本発明者らは、強力なイメージング技術である、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩおよび多光子（ＭＰ）顕微鏡法の組み合わせを用いて、マウスならびに非ヒト霊長類のＣＭの病態生理学的機構および免疫学的機構の空間時間的制御を調べた。本発明者らは、ＰｂＡ（マウスＣＭモデル）およびＰ．ｃｏａｔｎｅｙｉ（サルＣＭモデル）による全身感染の間にＢＢＢが破壊され、寛容となる、基礎的な機構を解明した。本発明者らは、独特な放射状および接線方向に密な微小毛細管構造から構成される嗅球（ＯＬＦ）が、寄生虫ならびに細胞の移動に適切な環境として機能し、マラリア感染を最初に検知する場所であり、そして、脳と活性化された免疫系との間の「クロストーク」を可能にすることを見出した。このことは、ＯＬＦを、嗅覚の喪失、高熱、星状細胞、ＣＣＬ２１、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３およびＣＤ８ Ｔ細胞と関連づける。 We use a combination of powerful imaging techniques, ultra-high magnetic field 11.7T MRI and polyphoton (MP) microscopy, to pathophysiological mechanisms and immunology of CM in mice and non-human primates. The spatiotemporal control of the mechanism was investigated. The present inventors have PbA (mouse CM model) and P.I. We elucidated the basic mechanism by which BBB is destroyed and tolerated during systemic infection with coatneyi (monkey CM model). We find that the olfactory bulb (OLF), which consists of unique radial and tangentially dense microcapillary structures, acts as an appropriate environment for parasite and cell migration and is the first place to detect malaria infection. And found that it enables "crosstalk" between the brain and the activated immune system. This correlates OLF with olfactory loss, high fever, astrocytes, CCL21, CCR7, CXCR3 and CD8 T cells.
本明細書において、発明者らは、ＣＭのマウスモデルならびにサルモデルにおいて、嗅球（ＯＬＦ）がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって物理的に破壊され、機能的に障害を受ける（嗅覚の喪失）領域であり（嗅覚の喪失）、次いで高熱が生じることを明らかにした。２つの強力な画像化技術、超高磁場ＭＲＩと生体内多光子顕微鏡法によって、ＯＬＦが寄生虫の蓄積および細胞閉塞を受け、その後、柵状微小毛細血管構造に起因した微小出血が生じる様子が可視化された。ＯＬＦの血管内を循環する寄生虫は、ＯＬＦの糸球および血管周囲の星状細胞によって、感染の初期段階で検知され、ＣＸＣＲ３を介してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞を誘引し得るＣＣＬ２１を放出する。このように、嗅覚喪失の早期検出と、病理学的な細胞の補充の即時妨害は、ＥＣＭのための新規治療を提供し得る。したがって、本発明は以下をも提供する。
（１）被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を脳マラリアの指標とする方法。
（２）前記状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像から選択される少なくとも１つにより判定されることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（３）前記嗅覚異常は、基準嗅覚検査および静脈的嗅覚検査からなる群より選択される試験における異常である、項目２に記載の方法。（４）前記診断画像は、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によるものである、項目２または３に記載の方法。
（５）前記ＭＲＩは、７Ｔ以上の磁力で撮影される、項目４に記載の方法。
（６）前記診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である、項目２〜５のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記細胞検査は、染色または免疫組織化学法で検査される、項目２〜６のいずれか１項に記載の方法。
（８）前記被験体の嗅球の異常は、罹患早期の指標である、項目１〜７のいずれか１項に記載の検出法。
（９）被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を測定することを包含する、脳マラリアを診断する方法。
（１０）前記被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標である、項目９に記載の方法。
（１１）嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置。
（１２）前記手段は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手段である、項目１１に記載の装置。
（１３）前記ＭＲＩは、７Ｔ以上のＭＲＩである、項目１２に記載の装置。
（１４）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤。
（１５）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも１つ因子の阻害剤を含む、項目１４に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１６）前記阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目１４または１５に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１７）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１６のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１８）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも２種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１９）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体の３種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１８のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（２０）脳マラリアの予防または治療のための、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤。
（２１）項目１５〜１９のいずれか１項または複数の項における特徴をさらに含む、項目２０に記載の阻害剤。
（２２）有効量のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法。
（２３）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子を含む、脳マラリアのマーカー。
（２４）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目２３に記載の脳マラリアのマーカー。
（２５）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９
（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ８Ｔ細胞および他のＴ細胞
からなる群より選択される、少なくとも１つの因子を含む、
項目２３または２４に記載の脳マラリアのマーカー。
（２６）（Ａ）嗅球におけるＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９の発現上昇；
（Ｂ）皮質におけるＩＦＮ−γの発現上昇；
（Ｃ）前記ＣＤ８α樹状細胞は、ＣＣＲ７依存的にプライミングされるものが観察されること；および／または
（Ｄ）脳または脾臓において活性化ＣＤ８Ｔ細胞が観察されること
を脳マラリアの発症の指標とする、項目２３〜２５のいずれか１項に記載の脳マラリアのマーカー。
（２７）前記脳マラリアは、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の脳マラリアのマーカー。
（２８）前記脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものである、項目２３〜２７のいずれか１項に記載のマーカー。
（２９）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、配列番号１、３または５に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体または配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体を含む、項目２３〜２８のいずれか１項に記載のマーカー。
（３０）（１）ＣＣＬ２１タンパク質またはこれをコードする核酸；
（２）ＣＸＣＲ３またはこれをコードする核酸；および／または
（３）ＣＣＲ７タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む項目２３〜２９のいずれか１項に記載のマーカー。
（３１）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤。
（３２）前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸である、項目３１に記載の検出剤または診断剤。
（３３）前記検出剤または診断剤は、標識されたものである、項目３１または３２に記載の検出剤または診断剤。
（３４）前記検出剤または診断剤は、核酸であり、該核酸はプローブまたはプライマーである、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の検出剤または診断剤。
（３５）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別する方法。
（３６）対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断されることを特徴とする、項目３５に記載の方法。
（３７）前記識別は、項目３１〜３４のいずれか１項に記載の検出剤または診断剤を用いて行われる、項目３５または３６に記載の方法。
In the present specification, the inventors in the mouse model and monkey model of CM are regions in which the olfactory bulb (OLF) is physically destroyed by Plasmodium parasites and functionally impaired (loss of olfaction) (olfaction). Loss of), followed by high fever. Two powerful imaging techniques, ultra-high magnetic field MRI and in vivo multiphoton microscopy, show that OLF undergoes parasite accumulation and cell occlusion, followed by microbleeding due to palisade microcapillary structure. It was visualized. Parasites circulating in the blood vessels of the OLF are detected by the glomeruli of the OLF and the astrocytes around the blood vessels in the early stages of infection and release CCL21, which can attract CD11c + CD8 T cells via CXCR3. Thus, early detection of olfactory loss and immediate obstruction of pathological cell replacement may provide new therapies for ECM. Therefore, the present invention also provides:
(1) A method in which the state of the olfactory bulb (OLF) of a subject is used as an index of brain malaria.
(2) The method according to item 1, wherein the condition is determined by at least one selected from olfactory abnormalities, cell tests and diagnostic images of the olfactory bulb.
(3) The method according to item 2, wherein the olfactory abnormality is an abnormality in a test selected from the group consisting of a standard olfactory test and an intravenous olfactory test. (4) The method according to item 2 or 3, wherein the diagnostic image is by magnetic resonance imaging (MRI).
(5) The method according to item 4, wherein the MRI is imaged with a magnetic force of 7T or more.
(6) The method according to any one of items 2 to 5, wherein spot observation in the diagnostic image is an index of brain malaria.
(7) The method according to any one of items 2 to 6, wherein the cell test is performed by staining or immunohistochemistry.
(8) The detection method according to any one of items 1 to 7, wherein the abnormality of the olfactory bulb of the subject is an index of the early stage of illness.
(9) A method for diagnosing brain malaria, which comprises measuring the state of the olfactory bulb (OLF) of a subject.
(10) The method according to item 9, wherein the abnormal olfactory bulb of the subject is an index of the subject suffering from cerebral malaria.
(11) A device for detecting or diagnosing brain malaria, which comprises means for measuring the state of the olfactory bulb.
(12) The apparatus according to item 11, wherein the means is a magnetic resonance imaging (MRI) means.
(13) The apparatus according to item 12, wherein the MRI is an MRI of 7T or more.
(14) A prophylactic or therapeutic agent for cerebral malaria, which comprises an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
(15) The inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system includes an inhibitor of at least one factor selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, and nucleic acids encoding them. , The prophylactic or therapeutic agent for brain malaria according to item 14.
(16) The inhibitor is a small molecule compound, an antibody or a fragment or a functional equivalent thereof, siRNA, ThenRNA, an antisense nucleic acid, an aptamer, a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable product thereof. The prophylactic or therapeutic agent for brain malaria according to item 14 or 15, which comprises at least one solvate of an acceptable salt.
(17) Any of items 14 to 16, wherein the inhibitor comprises at least one antibody selected from the group consisting of anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody, or a fragment or functional equivalent thereof. The prophylactic or therapeutic agent for brain malaria according to item 1.
(18) The inhibitor is any of items 14 to 17, which comprises at least two antibodies selected from the group consisting of anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody and anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof. The prophylactic or therapeutic agent for brain malaria according to item 1.
(19) The brain malaria according to any one of items 14 to 18, wherein the inhibitor comprises three antibodies, an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody and an anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof. Preventive or therapeutic agent.
(20) An inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system for the prevention or treatment of cerebral malaria.
(21) The inhibitor of item 20, further comprising the features of any one or more of items 15-19.
(22) A method for preventing or treating brain malaria in a subject, comprising administering to the subject in need an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system in an effective amount.
(23) A marker for brain malaria, which comprises at least one factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
(24) At least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system is at least one selected from the group consisting of CCL21, CXCR3, CCR7, nucleic acids encoding them, expression products thereof and their derivatives. 23. The marker for brain malaria according to item 23.
(25) At least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is selected from the group consisting of (1) IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG). At least one selected from the group consisting of one inflammatory cytokine, the nucleic acid encoding them, its expression product and its origin;
(2) CCL21 and / or CCL19
Includes at least one factor selected from the group consisting of (3) CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) CD8 T cells and other T cells.
The marker for brain malaria according to item 23 or 24.
(26) (A) Increased expression of CCL21 and / or CCL19 in the olfactory bulb;
(B) Increased expression of IFN-γ in the cortex;
(C) The CD8α dendritic cells are observed to be primed in a CCR7-dependent manner; and / or (D) activated CD8T cells are observed in the brain or spleen, which is an indicator of the development of brain malaria. The marker for brain malaria according to any one of items 23 to 25.
(27) The brain malaria is described in P.I. The marker for brain malaria according to any one of items 23 to 26, which is produced by a human malaria protozoan corresponding to a malaria protozoan selected from the group consisting of falciparum.
(28) The marker according to any one of items 23 to 27, wherein the brain malaria is of rodents or primates.
(29) At least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system is the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or a fragment or variant thereof, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4 or 6. The marker according to any one of items 23 to 28, which comprises a fragment or a variant thereof.
(30) (1) CCL21 protein or nucleic acid encoding it;
(2) The marker according to any one of items 23 to 29, which comprises (2) CXCR3 or a nucleic acid encoding the same; and / or (3) the CCR7 protein or the nucleic acid encoding the same.
(31) Brain malaria comprising at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system and a substance that binds to at least one selected from the group consisting of nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. Detective or diagnostic agent.
(32) The detection agent or diagnostic agent according to item 31, wherein the detection agent is an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid.
(33) The detection agent or diagnostic agent according to item 31 or 32, wherein the detection agent or diagnostic agent is labeled.
(34) The detection agent or diagnostic agent according to any one of items 31 to 33, wherein the detection agent or diagnostic agent is a nucleic acid, and the nucleic acid is a probe or primer.
(35) A method for identifying brain malaria using a substance that binds to any one of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system or an expression product thereof.
(36) If the expression of any one of the factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system of the target sample is increased as compared with that of the normal sample, the target sample is diagnosed as having brain malaria. 35. The method of item 35.
(37) The method according to item 35 or 36, wherein the identification is performed using the detection agent or diagnostic agent according to any one of items 31 to 34.
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。 In the present invention, it is intended that the above one or more features may be provided in combination in addition to the specified combinations. Further embodiments and advantages of the present invention will be appreciated by those skilled in the art upon reading and understanding the following detailed description, if necessary.
本発明は従来存在しなかった、脳マラリアの診断および治療技術を提供する。 The present invention provides a technique for diagnosing and treating brain malaria, which has not existed in the past.
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 Hereinafter, the present invention will be described while showing the best mode. Throughout the specification, it should be understood that the singular representation also includes its plural concept, unless otherwise stated. Therefore, it should be understood that singular articles (eg, "a", "an", "the", etc. in English) also include the concept of their plural, unless otherwise noted. It should also be understood that the terms used herein are used in the meaning commonly used in the art unless otherwise noted. Thus, unless otherwise defined, all terminology and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, this specification (including definitions) takes precedence.
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。 Definitions of terms specifically used herein will be described below as appropriate.
本明細書において「脳マラリア」とは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアの最も致命的な合併症であり、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊に起因して生じるとされる。意識低下、言語のもつれなどの神経症状が起こるとされており、進行すると昏睡状態に陥り、死亡するとされている。脳マラリア（ＣＭ）の病理を理解するために、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）寄生虫を使用したＣＭのマウスモデルが広く用いられており（Langhorne, J.ら(2011). Malar J 10,23.）、このマウスモデルにおける結果は、当該分野においてヒトに外挿可能であるとされている。 As used herein, "brain malaria" is the most deadly complication of Plasmodium falcipalum (P. falcipalum) malaria and is attributed to the destruction of the blood-brain barrier (BBB). It is said that neurological symptoms such as decreased consciousness and entanglement of language occur, and as it progresses, it falls into a coma and is said to die. To understand the pathology of cerebral malaria (CM), P. A mouse model of CM using the berghey ANKA (PbA) parasite has been widely used (Langhorne, J. et al. (2011). Malar J 10,23.), And the results in this mouse model have been shown to humans in this field. It is said that it can be extrapolated.
本明細書において「嗅球（ＯＬＦと略称することがある）」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味で用いられ、嗅葉前端の隆起であり、終脳の前端に位置し球状に突出した構造をしている。内部は層構造を示す主嗅球および副嗅球があり、それぞれ化学感覚受容器である嗅覚器からの嗅神経と鋤鼻器官からの鋤鼻神経が終始するとされている。嗅覚情報処理において重要な役割を果たすとされる。 As used herein, the term "olfactory bulb (sometimes abbreviated as OLF)" is used in the same meaning as commonly used in the art, and is a bulge at the anterior end of the olfactory lobe, which is located at the anterior end of the telencephalon and is spherical. It has a protruding structure. Inside, there are a main olfactory bulb and an accessory olfactory bulb that show a layered structure, and it is said that the olfactory nerve from the olfactory organ, which is a chemical sensory receptor, and the vomeronasal nerve from the vomeronasal organ, respectively, are all the same. It is said to play an important role in olfactory information processing.
本明細書において「嗅球の状態」は、嗅球の外見上、構造上または機能上の状態を包含する。より詳細には、嗅球の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等によって判定することができるが、これに限定されない。 As used herein, the term "olfactory bulb state" includes the apparent, structural or functional state of the olfactory bulb. More specifically, the state of the olfactory bulb can be determined by olfactory dysfunction, cell test, diagnostic image of the olfactory bulb, and the like, but is not limited thereto.
本明細書において「超高磁場」の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）とは、現在臨床用として使用されている３テスラの磁場を超える高い磁場でのＭＲＩをいい、例えば、約４テスラ以上、約５テスラ以上、約６テスラ以上、約７テスラ以上などをさす。実施例では、１１．７テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。 In the present specification, "ultra-high magnetic field" magnetic resonance imaging (MRI) refers to MRI in a high magnetic field exceeding the magnetic field of 3 tesla currently used for clinical use, for example, about 4 tesla or more. It refers to about 5 Tesla or more, about 6 Tesla or more, about 7 Tesla or more, and so on. In the example, the one of 11.7 Tesla is used, and the state of the olfactory bulb can be determined.
本明細書において診断画像における「スポット」とは、正常な状態で見出される嗅球においては密に詰まった映像において、斑点状のものが見えることをいう。機能不全が推定される。 As used herein, the term "spot" in a diagnostic image means that in an olfactory bulb found in a normal state, a spot-like object can be seen in a densely packed image. Dysfunction is presumed.
本明細書において、「細胞検査」は当該分野において慣用されるのと同じ意味を持ち、染色（例えば、ＨＥ染色）や免疫組織化学法等の染色が含まれる。 As used herein, "cell test" has the same meaning as commonly used in the art, and includes staining (eg, HE staining), staining such as immunohistochemistry.
本明細書において、「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」または「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７軸」とは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいう。その模式図は図７に示される。「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」の因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７のほか、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）， ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１２ｐ４０、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＫＣ、ＭＣＰ−１（ＣＣＲ２リガンド）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳからなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞などもこの因子として考慮することができる。いったん宿主がマラリア原虫に感染すると、血液や脾臓などの末梢において免疫細胞が活性化される。脾臓における感染により活性化されたＣＤ８α＋樹状細胞が、ＣＣＲ７の発現を介してＣＤ８ Ｔ細胞に対して抗原をクロスプライミングする能力を獲得する。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の一部は、ＣＤ１１ｃおよび／またはＣＸＣＲ３を発現することによって、エフェクターの表現型となる。これらの活性化された免疫細胞、感染赤血球（ｉＲＢＣ）または寄生虫の産生物が、ＯＬＦの糸球内の血管付近の星状細胞およびその周囲のエンドフィートによって感知され、これにより、星状細胞からの段階的なＣＣＬ２１分泌を誘導し、プライムされた免疫細胞に対するＢＢＢ出入口を開口すると考えられる。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＬＦへと特異的に移動し、ここでＣＣＬ２１が分泌され、ＯＬＦにおける発熱および出血につながると考えられる。 In the present specification, the "CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system" or "CCL21-CXCR3-CCR7 axis" refers to a signal transduction pathway having CCL21, CXCR3 and CCR7 as pathways, and refers to the onset mechanism of brain malaria. To say. The schematic diagram is shown in FIG. Factors of "CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system" include CCL21, CXCR3 and CCR7, as well as IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), CXCL9 (MIG), interleukin (IL) -6, CD8α dendritic cells, at least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IL-12p40, interferon (IFN) -γ, KC, MCP-1 (CCR2 ligand), MIP-1α, MIP-1β, and RANTES ( DC), CD11c + CD8T cells, etc. can also be considered as this factor. Once the host is infected with Plasmodium malaria, immune cells are activated in the periphery such as blood and spleen. Infection-activated CD8α + dendritic cells in the spleen acquire the ability to cross-prime antigens against CD8 T cells via expression of CCR7. Some of the activated CD8 T cells become an effector phenotype by expressing CD11c and / or CXCR3. The products of these activated immune cells, infected red blood cells (iRBC) or parasites are sensed by the stellate cells near the blood vessels in the glomerule of the OLF and the end feet around them, thereby causing the stellate cells. It is believed to induce gradual CCL21 secretion from and open the BBB gateway to primed immune cells. Activated CD8 T cells are thought to specifically migrate to OLF, where CCL21 is secreted, leading to fever and bleeding in OLF.
本明細書において「ＣＣＬ２１」とは、CCR7の内因性リガンドであり、高内皮細静脈（そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管）にみられるとされるケモカインリガンドであり、ＣＣサブファミリーのメンバーである。６Ｃｋｉｎｅ、ＣＫｂ９、ＥＣＬ、ＳＣＹＡ２１、ＳＬＣ、ＴＣＡ４ともいわれる。ヒトＣＣＬ２１の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００２９８９（配列番号１）およびＮＰ＿００２９８０（配列番号２）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＭ＿０１１１２４およびＮＰ＿０３５２５４に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＣＬ２１としては、OMIM: 602737とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＣＬ２１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 As used herein, "CCL21" is an endogenous ligand for CCR7 and is said to be found in high endothelial venules (blood vessels specialized for lymphocytes to leave blood and enter lymph nodes through them). It is a chemokine ligand and a member of the CC subfamily. Also called 6Ckine, CKb9, ECL, SCYA21, SLC, TCA4. The nucleic acid and amino acid sequences of human CCL21 are disclosed in NCBI Registry Nos. NM_002989 (SEQ ID NO: 1) and NP_002980 (SEQ ID NO: 2), respectively, and the nucleic acid and amino acid sequences of mice are disclosed in NM_011124 and NP_035254, respectively. This information is also incorporated herein by reference. CCL21 can be identified by the accession number with OMIM: 602737. As used herein, "CCL21" is functionally active as well as a protein (or nucleic acid encoding it) having the amino acid sequence set forth in a particular SEQ ID NO: or Accession Number. Derivatives, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high stringency or low stringency conditions. , Meaning is understood.
なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なin vitroアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。 The same applies to all the other proteins mentioned in the present invention. Thus, the name of the default protein or nucleic acid not only refers to the protein or nucleic acid as shown in the sequence listing, but also a functionally active derivative, or a functionally active fragment thereof, or a homologue thereof, or a high stringin. It also refers to a nucleic acid-encoded variant that hybridizes to a nucleic acid encoding the protein under conditions of gency or low stringency, preferably as described above. As used herein, "derivatives" or "similars of component proteins" or "variants" are preferably not intended to be limiting, but include regions that are substantially homologous to the component proteins. Including molecules, such molecules are at least 30% compared to sequences aligned over amino acid sequences of the same size or by computer homology programs known in the art in various embodiments. , 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99%, or nucleic acids encoding such molecules are stringent, moderately stringent. It is possible to hybridize to a sequence encoding a component protein under various or non-stringent conditions. This is the product of modifying a naturally occurring protein by amino acid substitutions, deletions and additions, respectively, and its derivatives still exhibit the biological function of the naturally occurring protein, although not necessarily to the same extent. means. For example, it is also possible to investigate the biological function of such proteins by appropriate and available in vitro assays described herein or known in the art.
ヒト以外の多くの哺乳動物が本発明のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１タンパク質）を発現していることが知られているため、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。 Since it is known that many mammals other than humans express the factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system of the present invention (for example, CCL21 protein), these mammals are also described in the present invention. It is understood that it falls within the range.
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。本発明において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１）のフラグメントとは、タンパク質または核酸の場合、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の任意の領域を含むポリペプチドであり、本発明の目的を達成し得る限り天然のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の生物学的機能を有していなくてもよい。 As used herein, "functionally active" is the structural function of a protein, such as biological activity, according to the embodiments in which the polypeptide of the invention, ie, a fragment or derivative, is associated herein. Refers to a polypeptide, ie, a fragment or derivative, having a regulatory or biochemical function. In the present invention, a fragment of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor (eg, CCL21) is, in the case of a protein or nucleic acid, a polypeptide comprising any region of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor. , It is not necessary to have the biological function of the factors of the natural CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system as long as the object of the present invention can be achieved.
ＣＣＬ２１の代表的なヌクレオチド配列は、
（a）配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（e）配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（f）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（g）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＬ２１の有する活性をいう。
A typical nucleotide sequence of CCL21 is
(A) A polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment sequence thereof;
(B) A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof;
(C) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, one or more amino acids is a modified polypeptide or fragment thereof having one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and biology. A polynucleotide encoding a variant polypeptide having a specific activity;
(D) A polynucleotide that is a splice variant or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof;
(E) A polynucleotide encoding a species homologue or fragment thereof of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(F) A polynucleotide that hybridizes to any one of the polynucleotides (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to It can be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 70% identity to any one of the polynucleotides (e) or its complementary sequence and encoding a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically refers to the activity of CCL21.
ＣＣＬ２１のアミノ酸配列としては、
（a）配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（b）配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および
欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（c）配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（d）配列番号2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（e）（a）〜（d）のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＬ２１の有する活性をいう。
The amino acid sequence of CCL21 is as follows.
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof;
(B) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a polypeptide in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and have biological activity;
(C) A polypeptide encoded by a splice or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(D) A polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; or an amino acid sequence that has at least 70% identity to any one of the polypeptides (e) (a)-(d). Polypeptide, which has and has biological activity
Can be. Here, the biological activity typically refers to the activity of CCL21.
本明細書において「ＣＸＣＲ３」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、Ｇタンパク質共役受容体であるＣＸＣケモカインレセプターファミリーの１つである。Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）やＣＤ１８３のほか、ＣＤ１８２；ＣＫＲ−Ｌ２；ＣＭＫＡＲ３；ＩＰ１０−Ｒ；Ｍｉｇ−Ｒ；ＭｉｇＲなどとも呼ばれることがある。２つの変異体があるとされており、ＣＸＣＲ３−ＡおよびＣＸＣＲ３−Ｂの二種類がある。ＣＸＣＲ３−Ａは、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）に結合するとされており、ＣＸＣＲ３−Ｂは、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＸＣＬ１１ （Ｉ−ＴＡＣ）に加えてＣＸＣＬ４にも結合し得るとされている。ヒトＣＸＣＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号NM_001142797（配列番号３）およびNP_001136269（配列番号４）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、NM_009910およびNP_034040に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＸＣＲ３としては、OMIM:300574とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＸＣＲ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 As used herein, "CXCR3" has the same meaning as commonly used in the art and is one of the CXC chemokine receptor family, which is a G protein-coupled receptor. In addition to G protein-coupled receptor 9 (GPR9) and CD183, it may also be called CD182; CKR-L2; CMKAR3; IP10-R; Mig-R; MigR and the like. It is said that there are two mutants, and there are two types, CXCR3-A and CXCR3-B. CXCR3-A is said to bind to CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) and CXCL11 (I-TAC), and CXCR3-B is CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) and CXCL11 (I). It is said that it can bind to CXCL4 in addition to -TAC). The nucleic acid and amino acid sequences of human CXCR3 are disclosed in NCBI Registry Nos. NM_001142797 (SEQ ID NO: 3) and NP_001136269 (SEQ ID NO: 4), respectively, and the nucleic acid and amino acid sequences of mice are disclosed in NM_009910 and NP_034040, respectively. This information is also incorporated herein by reference. CXCR3 can be identified by the accession number with OMIM: 300574. As used herein, "CXCR3" is functionally active as well as a protein (or nucleic acid encoding it) having the amino acid sequence set forth in a particular SEQ ID NO: or Accession Number. Derivatives, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high stringency or low stringency conditions. , Meaning is understood.
ＣＸＣＲ３の代表的なヌクレオチド配列は、
（a）配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（e）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（f）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（g）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＸＣＲ３の有する活性をいう。
A typical nucleotide sequence of CXCR3 is
(A) A polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a fragment sequence thereof;
(B) A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof;
(C) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, one or more amino acids is a modified polypeptide or fragment thereof having one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and biology. A polynucleotide encoding a variant polypeptide having a specific activity;
(D) A polynucleotide that is a splice variant or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof;
(E) A polynucleotide encoding a species homologue or fragment thereof of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
(F) A polynucleotide that hybridizes to any one of the polynucleotides (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to It can be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 70% identity to any one of the polynucleotides (e) or its complementary sequence and encoding a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically refers to the activity of CXCR3.
ＣＸＣＲ３のアミノ酸配列としては、
（a）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（b）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（c）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（d）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（e）（a）〜（d）のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＸＣＲ３の有する活性をいう。
The amino acid sequence of CXCR3 is
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof;
(B) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, a polypeptide in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and have biological activity;
(C) A polypeptide encoded by a splice or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(D) A polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or an amino acid sequence that has at least 70% identity to any one of the polypeptides (e) (a)-(d). Polypeptide, which has and has biological activity
Can be. Here, the biological activity typically refers to the activity of CXCR3.
本明細書において「ＣＣＲ７」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、chemokine (C-C motif)receptor 7の略称であり、ケモカインレセプターの一つである。CCR7には2種類の内因性リガンドが存在する。1つはCCL21で、これは高内皮細静脈（そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管）にみられる。もう1つはCCL19で、これはリンパ節のT細胞域（T細胞がB細胞とは分かれて集合している部位）に存在するとされている。ＢＬＲ２；ＣＤ１９７；ＣＤｗ１９７；ＣＭＫＢＲ７；ＥＢＩ１などとも呼ばれることがある。ヒトＣＣＲ７の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号NM_001838（配列番号５）およびNP_001829（配列番号６）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、NM_007719およびNP_031745に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＣＲ７としては、OMIM:600242とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＣＲ７」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 As used herein, "CCR7" has the same meaning as commonly used in the art, is an abbreviation for chemokine (C-C motif) receptor 7, and is one of the chemokine receptors. There are two types of endogenous ligands in CCR7. One is CCL21, which is found in high endothelial venules, the blood vessels that specialize through which lymphocytes leave the blood and enter the lymph nodes. The other is CCL19, which is said to be present in the T cell region of the lymph node (the site where T cells are separated from B cells and gather). It may also be called BLR2; CD197; CDw197; CMKBR7; EBI1 and the like. The nucleic acid and amino acid sequences of human CCR7 are disclosed in NCBI Registry Nos. NM_001838 (SEQ ID NO: 5) and NP_001829 (SEQ ID NO: 6), respectively, and the nucleic acid and amino acid sequences of mice are disclosed in NM_007719 and NP_031745, respectively. This information is also incorporated herein by reference. CCR7 can be identified by the accession number with OMIM: 600242. As used herein, "CCR7" is functionally active as well as a protein (or nucleic acid encoding it) having the amino acid sequence set forth in a particular SEQ ID NO: or Accession Number. Derivatives, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high stringency or low stringency conditions. , Meaning is understood.
ＣＣＲ７の代表的なヌクレオチド配列は、
（a）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（e）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（f）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（g）（a）〜（e）のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＲ７の有する活性をいう。
A typical nucleotide sequence of CCR7 is
(A) A polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a fragment sequence thereof;
(B) A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof;
(C) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, one or more amino acids is a modified polypeptide or fragment thereof having one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and biology. A polynucleotide encoding a variant polypeptide having a specific activity;
(D) A polynucleotide that is a splice variant or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a fragment thereof;
(E) A polynucleotide encoding a species homologue or fragment thereof of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(F) A polynucleotide that hybridizes to any one of the polynucleotides (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to It can be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 70% identity to any one of the polynucleotides (e) or its complementary sequence and encoding a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically refers to the activity of CCR7.
ＣＣＲ７のアミノ酸配列としては、
（a）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（b）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（c）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（d）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（e）（a）〜（d）のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＲ７の有する活性をいう。
The amino acid sequence of CCR7 is
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof;
(B) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, a polypeptide in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitutions, additions and deletions, and have biological activity;
(C) A polypeptide encoded by a splice or allelic variant of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
(D) A polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; or an amino acid sequence that has at least 70% identity to any one of the polypeptides (e) (a)-(d). Polypeptide, which has and has biological activity
Can be. Here, the biological activity typically refers to the activity of CCR7.
このほかにも、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子は存在し、例えば、以下を挙げることができる：
（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ８Ｔ細胞および他のＴ細胞。
In addition, there are other factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, such as:
(1) At least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG), nucleic acids encoding them, their expression products and their origins. At least one selected from the group of things;
(2) CCL21 and / or CCL19 (3) CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) CD8 T cells and other T cells.
これらはいずれも、当該分野で公知の手法を用いて同定することができる。
そのような手法として参考にできる文献として本明細書において他に言及した文献等を挙げることができる。
All of these can be identified using techniques known in the art.
References mentioned elsewhere in the present specification can be cited as references that can be referred to as such a method.
本発明の関連において、「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合する物質」または「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の相互作用分子」は、少なくとも一時的にＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に結合する物質はＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、siRNA、低分子量分子（LMW）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（peptidomimetic）等を挙げることができ、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対して向けられる、特にＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の活性部位に対して指向される、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の遺伝子（核酸）に対して指向される核酸も含まれる。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対する核酸は、例えばＣＣＬ２１遺伝子の発現またはＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、siRNA（低分子干渉RNA）およびリボザイムを含む。本明細書において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。 In the context of the present invention, "substances that bind to CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors" or "CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors interacting molecules" are at least temporarily CCL21, CXCR3, CCR7. It is a molecule or substance that binds to and preferably indicates that it has bound (eg, labeled or in a labelable state) to a factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, such as. Substances that bind to CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) are inhibitors of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). Examples thereof include antibodies, antisense oligonucleotides, siRNAs, low molecular weight molecules (LMW), binding peptides, aptamers, ribozymes and peptide mimetics (peptidomimetic), and CCL21-CXCR3. -For active sites of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) that are directed against CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) Also included are directed, binding proteins or peptides, as well as nucleic acids that are directed against genes (nucleic acids) of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). RNA for CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) can be, for example, CCL21 gene expression or CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). Refers to double-stranded or single-stranded DNA or RNA, or modifications or derivatives thereof, which inhibit the activity of, and includes, without limitation, antisense nucleic acids, aptamers, siRNAs (small interfering RNAs) and ribozymes. In the present specification, regarding the factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.), the “binding protein” or “binding peptide” refers to the factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Refers to a type of protein or peptide that binds to and is directed against factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) and a polyclonal antibody or monoclonal antibody, antibody fragment and protein backbone. Including, but not limited to.
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。 As used herein, "protein", "polypeptide", "oligopeptide" and "peptide" are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acids of any length. The polymer may be linear, branched or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural, or may be a modified amino acid. The term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also includes naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (including, for example, unnatural amino acids), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Will be done. As used herein, the "amino acid" may be natural or non-natural as long as it satisfies the object of the present invention.
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine−modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzeret al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossoliniet al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。 As used herein, "polynucleotide", "oligonucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably herein to refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes "oligonucleotide derivatives" or "polynucleotide derivatives". The "oligonucleotide derivative" or "polynucleotide derivative" refers to an oligonucleotide or polynucleotide containing a derivative of a nucleotide or having an unusual bond between nucleotides, and is used interchangeably. Specifically, such an oligonucleotide includes, for example, 2'-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphate diester bond in an oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphate diester bond in an oligonucleotide. Is an oligonucleotide derivative converted to N3'-P5'phosphoroamidate bond, an oligonucleotide derivative in which ribose and phosphate diester bond in the oligonucleotide are converted into peptide nucleic acid bond, and uracil in the oligonucleotide is C- 5 Oligonucleotide derivatives substituted with propynyl uracil, oligonucleotide derivatives in which uracil in the oligonucleotide is replaced with C-5 thiazole uracil, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with C-5 propynyl citosine, oligonucleotides Oligonucleotide derivatives in which cytosine in nucleotides is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which ribose in DNA is replaced with 2'-O-propylribose, and ribose in oligonucleotides are 2 Examples include oligonucleotide derivatives substituted with'-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, certain nucleic acid sequences are also conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complementary sequences, as are the explicitly indicated sequences. Is intended to be included. Specifically, degenerate codon substitutions create sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosin residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). As used herein, "nucleic acid" is also used interchangeably with genes, cDNAs, mRNAs, oligonucleotides, and polynucleotides. As used herein, the "nucleotide" may be natural or non-natural.
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。 As used herein, the term "gene" refers to a factor that defines a genetic trait, and the "gene" may refer to a "polynucleotide", an "oligonucleotide" and a "nucleic acid".
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50％同一である場合、好ましくは少なくとも70％同一である場合、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。 In the present specification, "homology" of a gene means the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally, having "homology" means a high degree of identity or similarity. Say. Therefore, the higher the homology of two genes, the higher the identity or similarity of their sequences. Whether or not the two genes are homologous can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization under stringent conditions. When comparing two gene sequences directly, the DNA sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, and more preferably at least 80%, 90%. , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% if they are identical, the genes are homologous. Thus, as used herein, a "homologous" or "homologous gene product" is a protein in another species, preferably a mammal, that exerts the same biological functions as the protein components of the complex further described herein. Means. Such homologues are also sometimes referred to as "ortholog gene products." It is understood that such homologues, homologous gene products, ortholog gene products and the like can also be used as long as they meet the object of the present invention.
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST2.2.28（2013.4.2発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。 Amino acids may be referred to herein by either their generally known three-letter symbols or the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides can also be referred to by the generally accepted one-letter code. In the present specification, comparison of amino acid sequence and base sequence similarity, identity and homology is calculated using default parameters using BLAST, which is a tool for sequence analysis. The identity search can be performed using, for example, NCBI's BLAST 2.2.28 (issued April 2013). The value of identity in the present specification usually refers to the value when the above BLAST is used and aligned under the default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is set as the identity value. When identity is evaluated in multiple regions, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a number that takes into account similar amino acids in addition to identity.
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、または2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Market al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al.,Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun29;224(4656):1431-1433.）。欠失等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD-Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。 In one embodiment of the present invention, the "several pieces" may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, 3, or two pieces, or may be less than or equal to any one of them. It is known that a polypeptide that has been deleted, added, inserted, or replaced by another amino acid with one or several amino acid residues maintains its biological activity (Market al., Proc Natl). Acad Sci US A.1984 Sep; 81 (18): 5662-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10 (20): 6487-6500., Wang et al., Science. 1984 Jun29 224 (4656): 1431-1433.). The deleted antibody can be produced, for example, by a site-specific mutagenesis method, a random mutagenesis method, biopanning using an antibody phage library, or the like. As a site-specific mutagenesis method, for example, KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.) Can be used. It is possible to select an antibody having the same activity as the wild type from the mutant antibody into which the deletion or the like has been introduced by performing various characterizations such as FACS analysis and ELISA.
本発明の一実施形態において「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、または100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。 In one embodiment of the present invention, "90% or more" may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more, and is within the range of any two of them. May be good. The above-mentioned "homology" may be calculated by calculating the ratio of the number of amino acids homologous in the amino acid sequence between two or a plurality of amino acids according to a method known in the art. Before calculating the proportions, align the amino acid sequences of the amino acid sequences to be compared and introduce gaps in part of the amino acid sequences if necessary to maximize the proportion of the same amino acids. Methods for alignment, method of calculating percentages, methods of comparison, and related computer programs are well known in the art (eg, BLAST, GENETYX, etc.). As used herein, "homology" can be expressed as a value measured by NCBI's BLAST unless otherwise specified. Blastp can be used by default for algorithms when comparing amino acid sequences with BLAST. The measurement results are quantified as Positives or Identities.
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1〜2倍濃度のSSC（saline-sodiumcitrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular Cloning2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford UniversityPress(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０°Cでの、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２°Cでの約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０°C、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。 As used herein, the term "polynucleotide that hybridizes under stringent conditions" refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using a polynucleotide selected from the polynucleotides of the present invention as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Specifically, using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized, hybridization is performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, and then the concentration is 0.1 to 2 times higher. It means a polynucleotide that can be identified by washing the filter under 65 ° C. conditions using an SSC (saline-sodium citrate) solution (the composition of the 1-fold SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). .. For the "stringent condition", for example, the following conditions can be adopted. (1) use low ion intensity and high temperature for washing (eg, at 50 ° C., 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulphate), (2) during hybridization Use a denaturant such as formamide (eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficol / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium chloride buffer, pH 6.5, And 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), or (3) 20% formamide, 5 x SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 x denhard solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / ml denaturation. Incubate overnight at 37 ° C. in a solution containing shear salmon sperm DNA, then wash the filter with 1 × SSC at about 37-50 ° C. The formamide concentration may be 50% or more. The wash time may be 5, 15, 30, 60, or 120 minutes, or longer. Multiple factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors that affect the stringency of the hybridization reaction, and details can be referred to in Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Examples of "highly stringent conditions" are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 65-68 ° C, or 0.015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide, 42. ℃. Hybridization, Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. It can be carried out. Here, sequences containing only the A sequence or only the T sequence are preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. Moderate stringent conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art, eg, based on DNA length, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Vol. 1, 7.42-7.45 Cold Spring Hybrid Laboratory Press, 2001, and with respect to nitrocellulose filters, a pre-wash solution of 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), Other similar such as Stark's solution in about 50% formamide at about 40-50 ° C, 2xSSC-6xSSC (or about 50% formamide at about 42 ° C). Includes the use of hybridization conditions (hybridization solution) and washing conditions at about 60 ° C, 0.5 × SSC, 0.1% SDS. Thus, the polypeptides used in the present invention are encoded by nucleic acid molecules that hybridize under highly or moderately stringent conditions to the nucleic acid molecules encoding the polypeptides specifically described in the present invention. Polypeptides are also included.
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。 As used herein, a "purified" substance or biological factor (eg, nucleic acid or protein) is one in which at least some of the factors naturally associated with the substance or biological factor have been removed. .. Therefore, the purity of the biological factor in the purified biological factor is usually higher (ie, enriched) than in the state in which the biological factor is normally present. The term "purified" as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight. It means that the same type of biological factor is present. The substance or biological factor used in the present invention is preferably a "purified" substance. As used herein, an "isolated" substance or biological factor (eg, nucleic acid or protein) is substantially depleted of a factor naturally associated with that substance or biological factor. Say something. The term "isolated" as used herein varies depending on its purpose and therefore does not necessarily have to be expressed in purity, but if necessary, preferably at least 75% by weight, more preferably. Means that there are at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight of the same type of biological factor. The substance used in the present invention is preferably an "isolated" substance or biological factor.
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７）において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいい、複合分子にあっては対応する部分（例えば、ヘパラン硫酸等）をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、S−S結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。このような対応する領域またはドメインは、本発明において複合分子を設計する場合に有用である。 As used herein, a "corresponding" amino acid or nucleic acid or moiety is a given amino acid or moiety in a polypeptide or polynucleotide that serves as a reference for comparison in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule (eg, CCL21, CXCR3, CCR7). Amino acids or nucleotides that have or are expected to have the same action as or expected to have a nucleotide or moiety, especially in the case of an enzyme molecule, which is present at a similar position in the active site and contributes similarly to catalytic activity. It refers to an amino acid, and in the case of a complex molecule, it refers to the corresponding moiety (for example, heparan sulfate). For example, if it is an antisense molecule, it can be a similar part in the ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule. The corresponding amino acids are specified to be, for example, cysteineized, glutathioneized, SS bond formed, oxidized (eg, methionine side chain oxidation), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc. Can be an amino acid. Alternatively, the corresponding amino acid can be the amino acid responsible for dimerization. Such "corresponding" amino acids or nucleic acids may be regions or domains over a range. Thus, such cases are referred to herein as "corresponding" regions or domains. Such corresponding regions or domains are useful when designing complex molecules in the present invention.
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒトのＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７は、それぞれ、他の動物（特に哺乳動物）において、対応するＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）は、配列番号１、３、５または配列番号２、４、６等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。 As used herein, a "corresponding" gene (eg, a polynucleotide sequence or molecule) has, or is expected to have, in some species, similar action to a given gene in the species of reference for comparison. A gene (for example, a polynucleotide sequence or a molecule), which has the same evolutionary origin when there are multiple genes having such an action. Therefore, the gene corresponding to a gene can be the ortholog of that gene. Therefore, human CCL21, CXCR3, and CCR7 can find the corresponding CCL21, CXCR3, and CCR7 in other animals (particularly mammals), respectively. Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Thus, for example, the corresponding gene in an animal (eg, mouse) is the reference gene for the corresponding gene (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) and is SEQ ID NO: 1, 3, 5 or SEQ ID NO: 2, 4 , 6 etc. can be found by searching the database containing the sequence of the animal using the sequence as a query sequence.
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがn）に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。 As used herein, the term "fragment" refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length from 1 to n-1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length n). The length of the fragment can be appropriately changed according to its purpose. For example, in the case of a polypeptide, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Amino acids such as 15, 20, 25, 30, 40, 50 and above are mentioned, and lengths represented by integers not specifically listed here (eg, 11) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides are mentioned, and are specifically listed here. A length represented by a non-integer (eg, 11) can also be a suitable lower bound. As used herein, such fragments fall within the scope of the invention, for example, if the full length functions as a marker or target molecule, as long as the fragment itself also functions as a marker or target molecule. Is understood.
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活
性は、その二分子の間の結合およびそれによって生じる生物学的変化であり得、そして、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
According to the present invention, the term "activity" refers to the function of a molecule in the broadest sense herein. Activities are not intended to be limiting, but generally include the biological, biochemical, physical or chemical functions of the molecule. The activity, for example, activates, promotes, stabilizes, inhibits, suppresses, or destabilizes enzymatic activity, the ability to interact with other molecules, and the function of other molecules. Includes the ability to do, stability, and the ability to localize to specific intracellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of protein complexes in the broadest sense. As used herein, the term "biological function" refers to a specific function that a gene, nucleic acid molecule or polypeptide can have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples include, but are not limited to, specific antibody production, enzymatic activity, and resistance imparting. As used herein, the term "biological activity" refers to the activity that a certain factor (for example, polynucleotide, protein, etc.) can have in vivo, and exerts various functions (for example, transcription promoting activity). Activities include, for example, the activity of activating or inactivating another molecule by interacting with one molecule. When two factors interact, their biological activity can be the binding between the two molecules and the resulting biological changes, and, for example, one molecule was precipitated with an antibody. Sometimes when other molecules also coprecipitate, the two molecules are considered to be bound. Therefore, seeing such coprecipitation is one of the judgment methods. For example, if a factor is an enzyme, its biological activity comprises that enzymatic activity. In another example, when a factor is a ligand, the ligand comprises binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art. Thus, "activity" indicates or reveals binding (either direct or indirect); affects the response (ie, has a measurable effect in response to some exposure or stimulus). Various measurable indicators, such as the affinity of a compound that directly binds to a polypeptide or polynucleotide of the invention, or, for example, the amount of upstream or downstream protein or other after some stimulation or event. A similar functional scale can be mentioned.
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍRNAを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のmRNAの量、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質の量、そしてＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のmRNAやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。 As used herein, the term "expression" of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form. Preferably, a gene, polynucleotide, or the like is transcribed and translated into the form of a polypeptide, but transcribing to produce mRNA is also an aspect of expression. Thus, as used herein, an "expression product" includes such a polypeptide or protein, or mRNA. More preferably, the form of such a polypeptide can be post-translationally processed. For example, the expression level of CCL21, CXCR3, CCR7 and the like can be determined by any method. Specifically, by evaluating the amount of mRNA such as CCL21, CXCR3, CCR7, the amount of protein such as CCL21, CXCR3, CCR7, and the biological activity of proteins such as CCL21, CXCR3, CCR7, CCL21, CXCR3, The expression level of CCR7 and the like can be known. Such measurements can be used in companion diagnostics. The amount of mRNA or protein such as CCL21, CXCR3, CCR7 can be determined by methods as detailed elsewhere herein or by other methods known in the art.
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等」またはその抗体の機能的等価物は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体ではないが、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体またはこのＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson& Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:2444-2448(1988)）、Smith and Waterman法（Smithand Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman and Wunsch法（Needlemanand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索として
は、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびinsituハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
As used herein, the term "functional equivalent" refers to any entity that has the same intended function but a different structure with respect to the original entity of interest. Therefore, the functional equivalent of "CCL21, CXCR3, CCR7, etc." or its antibody is not CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or its antibody itself, but a variant or variant of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or its antibody ( For example, amino acid sequence variants) that have the biological action of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies, and at the time of action, CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies themselves or their antibodies. Those that can be transformed into variants or variants of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies themselves or CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or variants or variants of their antibodies. It is understood that includes nucleic acids encoding the body and vectors, cells, etc. containing the nucleic acids). It is understood that in the present invention, functional equivalents of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies can be used in the same manner as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or their antibodies, without particular mention. Functional equivalents can be found by searching databases and the like. As used herein, the term "search" refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property by utilizing one nucleobase sequence electronically, biologically, or by some other method. Say. Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J.Mol.Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-2448). (1988)), Smith and Waterman method (Smithand Waterman, J.Mol.Biol.147: 195-197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48: 443-453 (). 1970)), but not limited to them. Biological searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA attached to nylon membranes, or microarrays attached to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, and the like. Not limited. As used herein, it is intended that the genes used in the present invention should also include corresponding genes identified by such electronic and biological searches.
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のアミノ酸配列において1または複数個（好ましくは1もしくは数個または1、2、3、もしくは4個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。 As the functional equivalent of the present invention, one or more amino acids inserted, substituted or deleted, or added to one or both ends of the amino acid sequence can be used. In the present specification, "insertion, substitution or deletion of one or more amino acids in an amino acid sequence, or addition to one or both ends" is a well-known technical technique such as a site-specific mutagenesis method. It means that the modification has been made by a method or by a natural mutation, such as by substituting a plurality of amino acids that can occur naturally. The modified amino acid sequence includes, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 2 amino acids inserted, substituted, or missing. It can be lost, or added to one or both ends. The modified amino acid sequence preferably has one or more (preferably one or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the amino acid sequence such as CCL21, CXCR3, CCR7. It may be an amino acid sequence having. As used herein, "conservative substitution" means substituting one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, there is a case where one hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue, a case where one polar residue is replaced with another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids capable of making such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, lysine and the like. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
本明細書において「阻害剤」とは、対象となる実体（例えば、レセプターまたは細胞）に対してそのレセプターまたは細胞の生物学的作用を阻害する物質または因子をいい、抑制剤等ともいう。本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の阻害剤としては、対象となるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を発現する細胞等の機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子である。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、機能的等価物、アンチセンス、siRNA等のRNAi因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現またはそれを増強する物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。
本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用の発現を抑制または阻害する物質をいう。天然のアンタゴニストのほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に抑制または阻害するもののほか、非競合的に抑制または阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を抑制または阻害することから、アンタゴニストは阻害剤（抑制剤）または阻害（抑制）（する）因子の概念に包含されうる。したがって、本明細書においては実質的にアンタゴニストは「阻害剤」と同義で用いられる。
As used herein, the term "inhibitor" refers to a substance or factor that inhibits the biological action of a receptor or cell on a target entity (for example, a receptor or cell), and is also referred to as an inhibitor or the like. The inhibitors of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. of the present invention may temporarily or permanently reduce or eliminate the functions of the target CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It is a factor that can be done. Such factors include, but are not limited to, antibodies, antigen-binding fragments thereof, derivatives thereof, functional equivalents, antisense, nucleic acid forms such as RNAi factors such as siRNA, and the like.
As used herein, the term "agonist" refers to a substance that expresses or enhances the biological action of a receptor on a target entity (for example, a receptor). In addition to natural agonists (also called ligands), synthetic ones and modified ones can be mentioned.
As used herein, the term "antagonist" refers to a substance that suppresses or inhibits the expression of the biological action of a receptor on a target entity (for example, a receptor). In addition to natural antagonists, synthetic and modified ones can be mentioned. In addition to those that competitively suppress or inhibit agonists (or ligands), there are those that suppress or inhibit non-competitively. It can also be obtained by modifying the agonist. Antagonists can be included in the concept of inhibitors (inhibitors) or inhibitors (inhibitors) (inhibitors) because they suppress or inhibit physiological phenomena. Therefore, in the present specification, an antagonist is used substantially synonymously with "inhibitor".
本発明の一実施形態において「抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等」は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に結合性を有する抗体を含む。この抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の生産方法は特に限定されないが、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を哺乳類または鳥類に免疫することによって生産してもよい。 In one embodiment of the present invention, "anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc." includes an antibody having binding property to CCL21, CXCR3, CCR7, etc. The production method of the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like is not particularly limited, but for example, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like may be produced by immunizing mammals or birds.
また、「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対する抗体（抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等）、または、そのフラグメント」の「機能的等価物」は、例えば、抗体の場合、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の結合活性、必要であれば抑制活性を有する抗体自体およびそのフラグメント自体のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（oligospecific）抗体、単鎖抗体、scFV、ダイアボディー、sc（Fv）2（single chain （Fv）2）、scFv−Fcなども包含されることが理解される。 Further, the "functional equivalent" of "antibody against CCL21, CXCR3, CCR7, etc. (anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc.) or a fragment thereof" is, for example, CCL21, CXCR3, in the case of an antibody. In addition to the antibody itself and its fragment itself having binding activity such as CCR7 and, if necessary, inhibitory activity, chimeric antibody, humanized antibody, multifunctional antibody, bispecific or oligospecific antibody, single chain antibody. , ScFV, diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), scFv−Fc, etc. are also included.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、悪性腫瘍の増殖が特に強く抑制される観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の特定のエピトープに特異的に結合する抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等であることが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention are specific to specific epitopes such as CCL21, CXCR3 and CCR7 from the viewpoint of particularly strongly suppressing the growth of malignant tumors. It is preferably an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, or the like that binds.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対して作用させることができる。抗ＣＣＬ２１モノクローナル抗体、抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体、抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体等を効率的に生産する観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等をニワトリに免疫することが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be monoclonal antibodies. A monoclonal antibody can act on CCL21, CXCR3, CCR7, etc. more efficiently than a polyclonal antibody. From the viewpoint of efficiently producing anti-CCL21 monoclonal antibody, anti-CXCR3 monoclonal antibody, anti-CCR7 monoclonal antibody and the like, it is preferable to immunize chickens with CCL21, CXCR3, CCR7 and the like.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の抗体クラスは特に限定されないが、例えばIgM、IgD、IgG、IgA、IgE、またはIgYであってもよい。 The antibody class such as anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody according to one embodiment of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, or IgY.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、抗原結合活性を有する抗体フラグメント（以下、「抗原結合性フラグメント」と称することもある）であっても良い。この場合、安定性または抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be an antibody fragment having antigen-binding activity (hereinafter, may be referred to as “antigen-binding fragment”). In this case, there are effects such as increased stability or antibody production efficiency.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、融合タンパク質であってもよい。この融合タンパク質は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等のNまたはC末端に、ポリペプチドまたはオリゴペプチドが結合したものであってもよい。ここで、オリゴペプチドは、Hisタグであってもよい。また融合タンパク質は、マウス、ヒト、またはニワトリの抗体部分配列を融合したものであってもよい。それらのような融合タンパク質も、本実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の一形態に含まれる。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be fusion proteins. This fusion protein may be one in which a polypeptide or oligopeptide is bound to the N- or C-terminal of an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, or the like. Here, the oligopeptide may be a His tag. The fusion protein may also be a fusion of mouse, human, or chicken antibody partial sequences. Fusion proteins such as these are also included in one form of the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to the present embodiment.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、例えば、精製ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞、またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体であってもよい。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention include, for example, purified CCL21, CXCR3, CCR7 and the like, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like expressing cells, or CCL21, CXCR3, CCR7 and the like. It may be an antibody obtained through a step of immunizing an organism with a containing lipid membrane. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3 and CCR7, it is preferable to use cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7 and the like for immunity.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、精製ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体の、CDRセットを有する抗体であってもよい。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。CDRセットとは、重鎖CDR1、2、および3、並びに、軽鎖CDR1、2、および3のセットである。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention can be obtained from purified CCL21, CXCR3, CCR7 or the like, CCL21, CXCR3, CCR7 or the like expressing cells or a lipid membrane containing CCL21, CXCR3, CCR7 or the like. It may be an antibody having a CDR set of the antibody obtained through the step of immunizing an organism. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3 and CCR7, it is preferable to use cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7 and the like for immunity. A CDR set is a set of heavy chain CDRs 1, 2, and 3, and light chain CDRs 1, 2, and 3.
本発明の一実施形態において「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞」は、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入後、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を発現させることによって得てもよい。ここでＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態において「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等含有脂質膜」は、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等と脂質二重膜を混合することによって得てもよい。ここでＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、抗原をニワトリに免疫する工程を経て得られる抗体、またはその抗体のCDRセットを有する抗体が好ましい。 In one embodiment of the present invention, "cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc." is expressed, for example, by introducing a polynucleotide encoding CCL21, CXCR3, CCR7, etc. into a cell and then expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. You may get it. Here, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like include fragments such as CCL21, CXCR3 and CCR7. Further, in one embodiment of the present invention, the "lipid membrane containing CCL21, CXCR3, CCR7, etc." may be obtained, for example, by mixing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. with a lipid bilayer membrane. Here, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like include fragments such as CCL21, CXCR3 and CCR7. Further, the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention are subjected to a step of immunizing a chicken with an antigen from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3 and CCR7. The antibody obtained through the above, or an antibody having a CDR set of the antibody is preferable.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、目的を達成する限り、どのような結合力を有していてもよく、例えば、少なくとも１．０×１０６以上、２．０×１０６以上、５．０×１０６以上、１．０×１０７以上を挙げることができるがこれらに限定されず、通常は、KD値が、1.0×107以上であってもよい。 Anti CCL21 antibody according to an embodiment of the present invention, an anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody or the like, as far as it achieves the object may have any binding force, for example, at least 1.0 × 10 6 above, 2.0 × 10 6 or more, 5.0 × 10 6 or more, there may be mentioned a 1.0 × 10 7 or more without being limited to, usually, KD values, 1.0 × 10 7 or more There may be.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ADCCまたはCDC活性を有していてもよい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may have ADCC or CDC activity.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の野生型または変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のDNA配列の差異に起因するものを含む。野生型または変異型のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６等に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の相同性を有している。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be an antibody that binds to a wild type or a mutant type such as CCL21, CXCR3, CCR7. Mutants include those due to differences in DNA sequences between individuals. The wild-type or mutant amino acid sequences such as CCL21, CXCR3, and CCR7 are preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% with respect to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and the like. As described above, the homology is particularly preferably 98% or more.
本明細書において「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団を含む。また抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、全長抗体（Fab領域とFc領域を有する抗体）、Fv抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、diabody、一本鎖抗体（例えば、scFv）、dsFv、多価特異的抗体（例えば、二価特異的抗体）、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド、キメラ抗体（例えば、マウス-ヒトキメラ抗体、ニワトリ-ヒトキメラ抗体等）、マウス抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらの同等物（または等価物）からなる群から選ばれる1種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。 As used herein, an "antibody" includes a molecule or population thereof capable of specifically binding to a particular epitope on an antigen. Further, the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Antibodies can exist in various forms, for example, full-length antibody (antibody having Fab region and Fc region), Fv antibody, Fab antibody, F (ab') 2 antibody, Fab'antibody, diabody, one. Chain antibody (eg, scFv), dsFv, multivalent specific antibody (eg, bivalent specific antibody), antigen-binding peptide or polypeptide, chimeric antibody (eg, mouse-human chimeric antibody, chicken-human chimeric antibody, etc.) ), Mouse antibody, chicken antibody, humanized antibody, human antibody, or one or more forms selected from the group consisting of their equivalents (or equivalents). Antibodies also include antibody-modified or antibody-unmodified products. The antibody-modified product may have various molecules such as polyethylene glycol bonded to the antibody. The antibody-modified product can be obtained by chemically modifying the antibody using a known method. Further, such an antibody may be covalently linked or recombinantly fused to an enzyme such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, α-galactosidase, or the like. The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like used in the present invention may bind to proteins such as CCL21, CXCR3 and CCR7, regardless of their origin, type and shape. Specifically, known antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be used. In the present invention, monoclonal or polyclonal can be used as an antibody, but a monoclonal antibody is preferable. The binding of the antibody to proteins such as CCL21, CXCR3, and CCR7 is preferably a specific binding. Antibodies also include antibody-modified or antibody-unmodified products. The antibody-modified product may have various molecules such as polyethylene glycol bonded to the antibody. The antibody-modified product can be obtained by chemically modifying the antibody using a known method.
本発明の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):86-91.）。 In one embodiment of the present invention, the "polyclonal antibody" is used in mammals (eg, rats, mice, rabbits, cows, monkeys, etc.), birds, etc., for example, in order to induce the production of an antigen-specific polyclonal antibody. It can be produced by administering an immunogen containing the antigen of interest. The immunogen may be administered by injecting one or more immunosuppressants and, if desired, an adjuvant. The adjuvant may be used to increase the immune response and may include a Freund's adjuvant (complete or incomplete), a mineral gel (such as aluminum hydroxide), or a detergent (such as lysolecithin). .. Immune protocols are known in the art and may be carried out by any method that elicits an immune response, depending on the host organism of choice (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 86-91). .).
本発明の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、"Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、"Clacksonet al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628."、または"Marks et al., JMol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法でよって作製してもよい。 In one embodiment of the invention, a "monoclonal antibody" is an antibody that corresponds to a substantially single epitope, except for antibodies in which the individual antibodies that make up the population have mutations that can occur spontaneously in small amounts. Including the case where. Alternatively, the individual antibodies that make up the population may be substantially identical, except for antibodies that have mutations that can occur spontaneously in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and differ from conventional polyclonal antibodies, which typically contain different antibodies corresponding to different epitopes. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are useful in that they can be synthesized from hybridoma cultures that are not contaminated with other immunoglobulins. The description "monoclonal" may indicate that it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, but does not imply that the antibody must be produced in any particular way. For example, the monoclonal antibody may be prepared by a method similar to the hybridoma method described in "Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug7; 256 (5517): 495-497.". Alternatively, the monoclonal antibody may be prepared by a method similar to the recombinant method described in US Pat. No. 4,816,567. Alternatively, the monoclonal antibody is "Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628.", Or "Marks et al., JMol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-597. It may be isolated from the phage antibody library using a technique similar to that described in. ". Alternatively, it may be prepared by the method described in "Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 92-96.".
抗体の大量生産については、当該分野で公知の任意の手法を用いることができるが、例えば、代表的な抗体の大量生産系の構築および抗体製造としては、以下を例示することができる。すなわち、CHO細胞にH鎖抗体発現ベクターおよびL鎖抗体発現ベクターをトランスフェクションし、選択試薬であるG418およびZeocinを用いて培養を行い、限界希釈法によるクローニングを行う。クローニング後、安定的に抗体を発現しているクローンをELISA法により選択する。選択したCHO細胞を用いて拡大培養し、抗体を含む培養上清を回収する。回収した培養上清からProteinAもしくはProtein G精製により抗体を精製することができる。 For mass production of antibodies, any method known in the art can be used, and for example, the following can be exemplified as the construction of a typical mass production system for antibodies and antibody production. That is, CHO cells are transfected with an H-chain antibody expression vector and an L-chain antibody expression vector, cultured using the selection reagents G418 and Zeocin, and cloned by the limiting dilution method. After cloning, a clone that stably expresses the antibody is selected by the ELISA method. The selected CHO cells are expanded and cultured, and the culture supernatant containing the antibody is collected. Antibodies can be purified from the collected culture supernatant by Protein A or Protein G purification.
本発明の一実施形態において「Fv抗体」は、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。 In one embodiment of the present invention, the "Fv antibody" is an antibody containing an antigen recognition site. This region contains a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain by non-covalent binding. In this configuration, the three CDRs of each variable domain can interact to form an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer.
本発明の一実施形態において「Fab抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られるフラグメントのうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Fabは、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を、タンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。 In one embodiment of the present invention, the "Fab antibody" is, for example, about half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain among the fragments obtained by treating the antibody containing the Fab region and the Fc region with the proteolytic enzyme papain. Is an antibody bound via some disulfide bonds. Fab can be obtained, for example, by treating the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to the embodiment of the present invention containing the Fab region and the Fc region with the proteolytic enzyme papain.
本発明の一実施形態において「F(ab’)2抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られるフラグメントのうち、Fabに相当する部位を2つ含む抗体である。F(ab’)2は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を、タンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のFab’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。 In one embodiment of the present invention, the "F (ab') 2 antibody" is, for example, a fragment obtained by treating an antibody containing a Fab region and an Fc region with the proteolytic enzyme pepsin, in which a site corresponding to Fab is 2 It is an antibody containing one. F (ab') 2 can be obtained, for example, by treating an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, etc. according to the embodiment of the present invention containing a Fab region and an Fc region with the proteolytic enzyme pepsin. .. Further, for example, it can be produced by forming the following Fab'by a thioether bond or a disulfide bond.
本発明の一実施形態において「Fab’抗体」は、例えば、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、F(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。 In one embodiment of the present invention, the "Fab'antibody" is, for example, an antibody obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2. For example, F (ab') 2 can be obtained by treating with the reducing agent dithiothreitol.
本発明の一実施形態において「scFv抗体」は、VHとVLとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。scFv抗体は、例えば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、VH-ペプチドリンカー-VLをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。 In one embodiment of the present invention, the "scFv antibody" is an antibody in which VH and VL are linked via an appropriate peptide linker. For the scFv antibody, for example, the cDNA encoding VH and VL of the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. according to the embodiment of the present invention is obtained, and a polynucleotide encoding VH-peptide linker-VL is constructed. Then, the polynucleotide can be incorporated into a vector and produced using cells for expression.
本発明の一実施形態において「diabody」は、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、例えば、scFvをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。 In one embodiment of the invention, the "diabody" is an antibody having divalent antigen binding activity. The divalent antigen-binding activities can be the same, or one of them can have different antigen-binding activities. For example, diabody constructs a polynucleotide encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, incorporates the obtained polynucleotide into a vector, and produces it using cells for expression. it can.
本発明の一実施形態において「dsFv」は、VHおよびVL中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はReiterらにより示された方法(Reiteret al., Protein Eng. 1994 May;7(5):697-704.)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。 In one embodiment of the present invention, "dsFv" is an antibody in which a polypeptide having a cysteine residue introduced into VH and VL is bound via a disulfide bond between the cysteine residues. The position to be introduced into the cysteine residue can be selected based on the conformational prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Reiteret al., Protein Eng. 1994 May; 7 (5): 697-704.). it can.
本発明の一実施形態において「抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド」は、抗体のVH、VL、またはそれらのCDR1、2、もしくは3を含んで構成される抗体である。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。 In one embodiment of the present invention, an "antigen-binding peptide or polypeptide" is an antibody composed of VH, VL of an antibody, or CDR1, 2, or 3 thereof. Peptides containing multiple CDRs can be linked either directly or via a suitable peptide linker.
上記のFv抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、scFv抗体、diabody、dsFv抗体、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド（以下、「Fv抗体等」と称することもある）の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等におけるFv抗体等の領域をコードするDNAを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。または、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBOC法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって生産してもよい。なお本発明の一実施形態に係る抗原結合性フラグメントは、上記Fv抗体等の1種以上であってもよい。 The above Fv antibody, Fab antibody, F (ab') 2 antibody, Fab' antibody, scFv antibody, diabody, dsFv antibody, peptide or polypeptide having antigen-binding property (hereinafter, may be referred to as "Fv antibody or the like"). ) Is not particularly limited in production method. For example, DNA encoding a region such as an Fv antibody in an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, etc. according to an embodiment of the present invention can be incorporated into an expression vector and produced using expression cells. Alternatively, it may be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBOC method (t-butyloxycarbonyl method). The antigen-binding fragment according to one embodiment of the present invention may be one or more of the above-mentioned Fv antibody and the like.
本発明の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス-ヒトキメラ抗体は、例えば、"Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994Feb 1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域のフラグメントは、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, the "chimeric antibody" is, for example, a link between a variable region of an antibody between different organisms and a constant region of an antibody, and can be constructed by gene recombination technology. The mouse-human chimeric antibody can be prepared, for example, by the method described in "Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1994Feb 1; 91 (3): 969-973.". The basic method for making mouse-human chimeric antibodies is to encode, for example, the mouse leader and variable region sequences present in the cloned cDNA and the human antibody constant regions already present in the expression vector of mammalian cells. Concatenate to the sequence to be used. Alternatively, the mouse leader sequence and variable region sequence present in the cloned cDNA may be ligated to the sequence encoding the human antibody constant region and then ligated to the mammalian cell expression vector. Fragments of the human antibody constant region can be those of the H chain constant region of any human antibody and the L chain constant region of a human antibody, for example Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 for human H chains. For the L chain, Cλ or Cκ can be mentioned respectively.
本発明の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（FR）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagroet al., FRont Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング（Ozaki et al.,Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.）、Re-surfacing (Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973.)、またはFRシャッフル（Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-327.）。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。 In one embodiment of the invention, the "humanized antibody" comprises, for example, one or more CDRs derived from a non-human species, a framework region (FR) derived from human immunoglobulin, and a constant region derived from human immunoglobulin. It is an antibody that binds to a desired antigen. Humanization of antibodies can be performed using a variety of techniques known in the art (Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1; 13: 1619-1633.). For example, CDR graphing (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.), Re-surfacing (Roguska et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Feb 1; 91 ( 3): 969-973.), Or FR shuffle (Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.). To modify (preferably improve) antigen binding, amino acid residues in the human FR region may be replaced with corresponding residues from the CDR donor antibody. This FR substitution can be performed by methods well known in the art (Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162): 323-327.). For example, FR residues important for antigen binding may be identified by modeling the interaction between CDR and FR residues. Alternatively, sequence comparison may identify anomalous FR residues at specific positions.
本発明の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberget al., Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコートタンパク質（g3p、g10p等）のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughanet al., Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。 In one embodiment of the present invention, the "human antibody" is derived from, for example, a gene in which a variable region and a constant region of a heavy chain and a region including a variable region and a constant region of a light chain constituting the antibody encode human immunoglobulin. It is an antibody that The main production methods include a transgenic mouse method for producing human antibodies and a phage display method. In the transgenic mouse method for producing human antibodies, if a functional human Ig gene is introduced into a mouse in which endogenous Ig is knocked out, a human antibody having various antigen-binding ability is produced instead of the mouse antibody. Furthermore, if this mouse is immunized, a human monoclonal antibody can be obtained by a conventional hybridoma method. For example, it can be prepared by the method described in "Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995; 13 (1): 65-93.". The phage display method typically fuses a foreign gene on the N-terminal side of the coat protein (g3p, g10p, etc.) of a fibrous phage such as M13 or T7, which is one of the Escherichia coli viruses, so as not to lose the infectivity of the phage. It is a system that is expressed as a protein. For example, it can be prepared by the method described in "Vaughanet al., Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14 (3): 309-314.".
また抗体は、CDR-grafting(Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.)によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをグラフティングすることで作製してもよい。または、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをコードするDNAと、公知のヒトまたはヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域をコードするDNAとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法（例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、またはファージディスプレイ法等）を用いて、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、FRシャッフル（Damschroderet al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.）、またはバーニヤゾーンのアミノ酸残基またはパッケージング残基を置換する方法（特開2006-241026、またはFooteet al., J Mol Biol.1992 Mar 20;224(2):487-499.）を用いて、FR領域を最適化してもよい。 In addition, the antibody was subjected to CDR-grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.) To any antibody according to the embodiment of the present invention, anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CXCR3 antibody. It may be prepared by graphing a heavy chain CDR such as a CCR7 antibody or a light chain CDR. Alternatively, a heavy chain of a DNA encoding a heavy chain CDR or a light chain CDR such as an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody according to an embodiment of the present invention, and a known human or non-human organism-derived antibody. It can be obtained by ligating a DNA encoding a region other than CDR or light chain CDR to a vector according to a method known in the art and then expressing it using known cells. At this time, in order to increase the efficiency of action on target antigens such as anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody, a method known in the art (for example, the amino acid residue of the antibody is randomly mutated to make the antibody reactive. Areas excluding heavy or light chain CDRs may be optimized using methods of screening for higher ones, phage display methods, etc.). Also, for example, FR shuffle (Damschroderet al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.), or a method of substituting amino acid residues or packaging residues in the vernier zone ( The FR region may be optimized using Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-241026 or Foote et al., J Mol Biol.1992 Mar 20; 224 (2): 487-499.).
本発明の一実施形態において「重鎖」は、典型的には、全長抗体の主な構成要素である。重鎖は、通常、軽鎖とジスルフィド結合および非共有結合によって結合している。重鎖のN末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域（VH）と呼ばれる領域が存在し、一般的に、VHが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、"Reiteret al., J Mol Biol. 1999 Jul 16;290(3):685-98."にはVHのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、"Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec;13(12):1243-1244."には、ラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。 In one embodiment of the invention, a "heavy chain" is typically a major component of a full-length antibody. Heavy chains are usually linked to light chains by disulfide and non-covalent bonds. In the domain on the N-terminal side of the heavy chain, there is a region called a variable region (VH) in which the amino acid sequence is not constant even for the same type of antibody of the same class, and in general, VH has a large specificity and affinity for an antigen. It is known to contribute. For example, in "Reiteret al., J Mol Biol. 1999 Jul 16; 290 (3): 685-98.", When a molecule containing only VH was prepared, it was found that it bound specifically to the antigen with high affinity. Have been described. Furthermore, in "Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec; 13 (12): 1243-1244.", It is found that among camel antibodies, there are only heavy chain antibodies without light chains. Have been described.
本発明の一実施形態において「CDR（相補性決定領域）」は、抗体において、実際に抗原に接触して結合部位を形成している領域である。一般的にCDRは、抗体のFv（可変領域:重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む）上に位置している。また一般的にCDRは、5〜30アミノ酸残基程度からなるCDR1、CDR2、CDR3が存在する。そして、特に重鎖のCDRが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またCDRの中でも、CDR3が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、"Willy et al., Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 356, Issue1, 27 April 2007, Pages 124-128"には、重鎖CDR3を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。CDR以外のFv領域はフレームワーク領域（FR）と呼ばれ、FR1、FR2、FR3およびFR4からなり、抗体間で比較的よく保存されている（Kabatet al.,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health andHuman Services, 1983.）。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因はCDRにあり、特に重鎖CDRにあるといえる。 In one embodiment of the invention, the "CDR (complementarity determining regions)" is a region of an antibody that is actually in contact with an antigen to form a binding site. Generally, the CDRs are located on the Fv of the antibody, which includes the variable region: heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL). In general, CDRs include CDR1, CDR2, and CDR3 consisting of about 5 to 30 amino acid residues. In particular, it is known that the CDR of the heavy chain contributes to the binding of the antibody to the antigen. Among the CDRs, CDR3 is known to have the highest contribution to the binding of the antibody to the antigen. For example, "Willy et al., Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 356, Issue 1, 27 April 2007, Pages 124-128" states that modifying heavy chain CDR3 increased antibody binding capacity. ing. The non-CDR Fv region, called the framework region (FR), consists of FR1, FR2, FR3 and FR4 and is relatively well conserved among the antibodies (Kabat et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" US. Dept. Health and Human Services, 1983.). That is, it can be said that the factor that characterizes the reactivity of the antibody lies in the CDR, especially in the heavy chain CDR.
CDRの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Kabatの定義(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public HealthService,
National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))、またはChothiaの定義(Chothiaet al., J. Mol. Biol.,1987;196:901-917)を採用してもよい。本発明の一実施形態においては、Kabatの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるCDRの重複部分を、または各々の定義によるCDRの両方を含んだ部分をCDRとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268-9272）がある。このようなCDRの情報を用いて、本発明に使用されうる変異体を生産することができる。このような抗体の変異体では、もとの抗体のフレームワークに１または数個（例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個）の置換、付加もしくは欠失を含むが、該CDRには変異を含まないように生産することができる。
Several methods have been reported to determine the definition of CDR and its location. For example, Kabat's definition (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service,
The National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) or the definition of Chothia (Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987; 196: 901-917) may be adopted. In one embodiment of the invention, the definition of Kabat is adopted as a preferred example, but is not necessarily limited to this. In some cases, both the Kabat definition and the Chothia definition may be taken into consideration when deciding. For example, the overlapping part of the CDR according to each definition or the part including both the CDR according to each definition may be determined. It can also be a CDR. As a concrete example of such a method, Martin et al.'S method using Oxford Molecular's AbM antibody modeling software, which is a compromise between Kabat's definition and Chothia's definition (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86). : 9268-9272). Such CDR information can be used to produce variants that can be used in the present invention. In such antibody variants, one or several (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9, 10) in the original antibody framework. ) Is included, but the CDR can be produced without mutations.
本明細書において「抗原」（antigen）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。本発明の抗体は、エピトープが同じであれば、他の配列を有する抗体であっても同様に利用することができることが理解される。 As used herein, the term "antigen" refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule. As used herein, the term "immunogen" refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response. As used herein, the term "epitope" or "antigen determinant" refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well-known conventional techniques when the primary sequence of nucleic acid or amino acid is provided. It is understood that the antibody of the present invention can be similarly utilized even if the antibody has another sequence as long as the epitope is the same.
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられる限り、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。 It is understood that the antibody used herein may be of any specificity as long as false positives are reduced. Therefore, the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。 As used herein, the term "means" means a tool that can be an arbitrary tool for achieving a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment), and in particular, in the present specification, the term "means for selectively recognizing" is used. , A means by which an object can be recognized differently from another.
本明細書において「マーカー（物質または遺伝子）」とは、ある状態（例えば、脳マラリアの疾患状態、障害状態、あるいは悪性状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、脳マラリア等の疾患の状態）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「発現産物」（遺伝子産物ともいう）とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはmRNAをいう。本明細書では、脳マラリアへの関連が示されていない遺伝子産物（ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）が脳マラリアの指標として使用可能であることが見出された。 As used herein, the term "marker (substance or gene)" refers to whether or not a person is in a certain state (for example, a disease state, a disordered state, or a malignant state level, presence or absence, etc.) of brain malaria. A substance that serves as a marker to be tracked. Examples of such markers include genes, gene products, metabolites, enzymes and the like. In the present invention, detection, diagnosis, preliminary detection, prediction or pre-diagnosis of a condition (eg, a condition of a disease such as brain malaria) is an agent, agent, factor or means specific to a marker associated with that condition. , Or using a composition, kit, system or the like containing them. As used herein, the term "expression product" (also referred to as a gene product) refers to a protein or mRNA encoded by a gene. Here, it has been found that gene products (CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) that have not been shown to be associated with brain malaria can be used as indicators of brain malaria.
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。 As used herein, the term "subject (person)" refers to an organism such as a human being or a subject (for example, cells, blood, serum, etc.) to be diagnosed, detected, or treated according to the present invention. ..
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、血清等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。 As used herein, the term "sample" refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, serum or the like. One of ordinary skill in the art can appropriately select a preferable sample based on the description in the present specification.
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、70％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, "drug", "drug" or "factor" (both corresponding to agents in English) are used interchangeably in any sense as long as they can achieve their intended purpose. It may also be a substance or other element (eg, energy such as light, radioactivity, heat, electricity). Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including, for example, cDNA, DNA such as genomic DNA, RNA such as mRNA), poly. Saccharides, oligosaccharides, lipids, organic small molecules (eg, hormones, ligands, signaling substances, organic small molecules, molecules synthesized with combinatorial chemistries, small molecules that can be used as pharmaceuticals (eg, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules include, but are not limited to. Factors specific to a polynucleotide typically include polynucleotides that have a certain degree of sequence homology (eg, 70% or more sequence identity) and complementarity to the sequence of the polynucleotide. Examples include, but are not limited to, polypeptides such as transcription factors that bind to the promoter region. Factors specific to a polypeptide typically include an antibody or derivative thereof or an analog thereof (eg, a single chain antibody) specifically directed to the polypeptide, and the polypeptide is a receptor. Alternatively, a specific ligand or receptor in the case of a ligand, a substrate thereof when the polypeptide thereof is an enzyme, and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態（例えば、脳マラリア）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。 As used herein, the term "diagnosis" refers to identifying various parameters associated with a disease, disorder, condition (eg, brain malaria), etc. in a subject to determine the current or future of such disease, disorder, condition. Say that. By using the methods, devices, and systems of the present invention, conditions within the body can be investigated and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment or prevention to be administered in a subject. Alternatively, various parameters such as a method can be selected. In the present specification, in a narrow sense, "diagnosis" means diagnosing the current state, but in a broad sense, it includes "early diagnosis", "predictive diagnosis", "pre-diagnosis" and the like. As a general rule, the diagnostic method of the present invention is industrially useful because it can be used from the body and can be carried out without the hands of a medical worker such as a doctor. In the present specification, in particular, "predictive diagnosis, pre-diagnosis or diagnosis" may be referred to as "support" in order to clarify that it can be carried out without the hands of medical personnel such as doctors.
本明細書において「検出薬（剤）」または「検査薬（剤）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。 As used herein, the term "detecting agent (agent)" or "testing agent (agent)" means, in a broad sense, any agent capable of detecting or inspecting an object of interest.
本明細書において「診断薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。 As used herein, the term "diagnostic agent (drug)" broadly refers to any drug capable of diagnosing a desired condition (for example, a disease such as brain malaria).
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。 As used herein, the term "treatment" refers to a disease or disorder (eg, brain malaria) that, in the event of such a condition, prevents the exacerbation of such disease or disorder, preferably maintains the status quo. It preferably refers to alleviation, more preferably withdrawal, and includes the ability to exert a symptom-improving effect or a preventive effect on a patient's disease or one or more symptoms associated with the disease. Diagnosis in advance and appropriate treatment is called "companion treatment", and the diagnostic agent for that purpose is sometimes called "companion diagnostic agent".
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいい、本発明が提供するような阻害剤（例えば、抗体）をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。 As used herein, the term "therapeutic agent (agent)" broadly refers to any agent capable of treating a desired condition (for example, a disease such as brain malaria), and an inhibitor (for example, an inhibitor) as provided by the present invention. , Antibodies). In one embodiment of the invention, the "therapeutic agent" may be a pharmaceutical composition comprising an active ingredient and one or more pharmacologically acceptable carriers. The pharmaceutical composition can be produced, for example, by mixing the active ingredient with the above carrier and using any method known in the technical field of pharmaceutics. Further, the therapeutic agent is not limited in the form of use as long as it is used for treatment, and may be the active ingredient alone or a mixture of the active ingredient and an arbitrary ingredient. The shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、脳マラリア等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。 As used herein, the term "prevention" refers to preventing a disease or disorder (eg, brain malaria) from becoming such a condition before it becomes such a condition. The agent of the present invention can be used for diagnosis, and if necessary, the agent of the present invention can be used to prevent, for example, brain malaria, or to take preventive measures.
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。 As used herein, the term "preventive drug (drug)" broadly refers to any drug that can prevent a desired condition (for example, a disease such as brain malaria).
本明細書において「相互作用」とは、2つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした2つの物質は、会合または結合している状態にある。本発明の検出、検査および診断は、このような相互作用を利用して実現することができる。 As used herein, the term "interaction" refers to two substances, that is, a force (for example, an intermolecular force (Van der Waals force), a hydrogen bond, or a hydrophobic interaction) between one substance and the other substance. Etc.). Normally, two interacting substances are in an associated or bound state. The detection, examination and diagnosis of the present invention can be realized by utilizing such an interaction.
本明細書中で使用される用語「結合」は、2つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 As used herein, the term "bond" means a physical or chemical interaction between two substances, or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions and the like. Physical interactions (bindings) can be direct or indirect, the indirect being through or due to the effects of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and is not accompanied by other substantial chemical intermediates.
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が30％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 Thus, as used herein, a "factor" (or drug, detector, etc.) that "specifically" interacts with (or binds to) a biological factor, such as a polynucleotide or polypeptide, is that poly. Affinity for biological factors such as nucleotides or their polypeptides is typically equivalent or better than affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides. Includes those that are high or preferably significantly (eg, statistically significant) high. Such affinity can be measured, for example, by hybridization assay, binding assay and the like.
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の反応、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。2種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、抗体と、その抗原との間の相互作用（または結合）が包含される。このような特異的な相互作用または結合の反応を利用することにより、試料中の対象物の検出または定量を行うことができる。 As used herein, a first substance or factor "specifically" interacts with (or binds to) a second substance or factor when the first substance or factor interacts with (or binds to) a second substance or factor. To interact (or bind) with a higher affinity for a substance or factor other than the second substance or factor, especially other substances or factors present in the sample containing the second substance or factor. Say that. Specific interactions (or bindings) with respect to substances or factors include nucleic acid and protein reactions, protein-lipid interactions, nucleic acid-lipids, such as, for example, hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, enzyme-substrate reactions, etc. Interactions, etc., but are not limited to them. Therefore, when a substance or factor is both nucleic acids, the first substance or factor "specifically interacts" with the second substance or factor means that the first substance or factor is the second substance. Alternatively, it includes having complementarity to at least a part of the factor. Also, for example, when both substances or factors are proteins, the first substance or factor "specifically" interacts with (or binds to) the second substance or factor, for example, by an antigen-antibody reaction. Interactions include, but are not limited to, receptor-ligand interactions, enzyme-substrate interactions, and the like. When two substances or factors include proteins and nucleic acids, the first substance or factor to "specifically" interact with (or bind to) the second substance or factor is an antibody and its antigen. Interactions (or bindings) with are included. By utilizing such a specific interaction or binding reaction, it is possible to detect or quantify an object in a sample.
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、検出剤、検査剤または診断剤への結合または相互作用を含む、mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはPCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるELISA法、RIA法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（LIA）、免疫沈降法（IP）、免疫拡散法（SRID）、免疫比濁法（TIA）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ELISA法またはRIA法などが例示される。アレイ（例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、NatGenet．2002 Dec;32 Suppl:526−532に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、invitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（2002）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。 As used herein, "detection" or "quantification" of polynucleotide or polypeptide expression includes methods for measuring mRNA and immunological measurement, including, for example, binding or interaction with a detection agent, test agent or diagnostic agent. It can be achieved using appropriate methods. Examples of the molecular biological measurement method include Northern blotting, dot blotting, and PCR. Examples of immunological measurement methods include ELISA method using a microtiter plate, RIA method, immunofluorescence method, luminescent immunoassay (LIA), immunoprecipitation method (IP), immunodiffusion method (SRID), and immunity. Examples include immunofluorescence (TIA), Western blotting, and immunohistochemical staining. Moreover, as a quantitative method, an ELISA method, an RIA method and the like are exemplified. It can also be performed by a gene analysis method using an array (for example, a DNA array or a protein array). DNA arrays are widely outlined in (Shujunsha ed., Cell Engineering Separate Volume "DNA Microarrays and Latest PCR Methods"). For protein arrays, see NatGenet. It is detailed in 2002 Dec; 32 Suppl: 526-532. In addition to the above, gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, and in vitro translation. Such further analytical methods are described, for example, in the Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Lab Manual, edited by Yusuke Nakamura Yodosha (2002), and all of these descriptions are incorporated herein by reference. Will be done.
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはmRNA等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのmRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはmRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。 As used herein, the term "expression level" refers to the amount at which a polypeptide, mRNA, or the like is expressed in a target cell, tissue, or the like. Such expression levels are evaluated using the antibody of the present invention by any suitable method including immunological measurement methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blotting method, and immunohistological staining method. The expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level, or the poly used in the present invention evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR. The expression level of the peptide at the mRNA level can be mentioned. "Change in expression level" is the expression of the polypeptide used in the present invention at the protein level or mRNA level, which is evaluated by any suitable method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. It means that the amount increases or decreases. By measuring the expression level of a certain marker, various detections or diagnoses based on the marker can be performed.
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「消失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいい、特に「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「減少」または「抑制」に包含される。 As used herein, "reduction" or "suppression" of an activity, expression product (eg, protein, transcript (RNA, etc.)) or a synonym thereof is a reduction in the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. , Or the activity to reduce. When "disappeared" out of the decrease, it means that the activity, expressed product, etc. are below the detection limit, and it may be particularly called "disappeared". As used herein, "disappearance" is included as "reduction" or "suppression".
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。 As used herein, an "increase" or "activation" of an activity, expression product (eg, protein, transcript (RNA, etc.)) or a synonym thereof refers to the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. An activity that increases or increases.
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、DNAまたはRNAなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。 As used herein, the term "(nucleic acid) primer" refers to a substance necessary for initiating the reaction of a polymer compound to be synthesized in a polymer synthase reaction. In the nucleic acid molecule synthesis reaction, a nucleic acid molecule (eg, DNA or RNA, etc.) that is complementary to a part of the sequence of the polymer compound to be synthesized can be used. Primers can be used herein as marker detection means.
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出、検査または診断の手段としてもちいられる。 As used herein, the term "probe" refers to a substance used as a means of searching used in biological experiments such as in vitro and / or in vivo screening, for example, a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a specific substance. Examples include, but are not limited to, peptides containing amino acid sequences, specific antibodies or fragments thereof. Probes are used herein as a means of marker detection, testing or diagnosis.
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、RI（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、10nm以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、AlexaTM Fluorが望ましい。AlexaTMFluorは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またpH感受性が低い。蛍光極大波長が10nm以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、AlexaTM555とAlexaTM633の組み合わせ、AlexaTM488とAlexaTM555の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、CyDyeTMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、2−アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が10nm以上である蛍光物質としては、例えば、Cy5とローダミン6G試薬との組み合わせ、Cy3とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン6G試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。 As used herein, the term "label" refers to an entity (eg, substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for identifying a molecule or substance of interest from others. Examples of such a labeling method include an RI (radioisotope) method, a fluorescence method, a biotin method, and a chemiluminescence method. When a plurality of markers or factors or means for capturing the marker of the present invention are labeled by the fluorescence method, the markers are labeled with fluorescent substances having different fluorescence maximum wavelengths. The difference in fluorescence emission maximum wavelength is preferably 10 nm or more. When labeling the ligand, any substance that does not affect the function can be used, but Alexa TM Fluor is preferable as the fluorescent substance. Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series that supports a wide range of fluorescent wavelengths. Stable, bright and low pH sensitivity. Examples of the combination of fluorescent dyes having a maximum fluorescence wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like. When labeling a nucleic acid, any one that can bind to the base portion can be used, but cyanine pigments (for example, Cy3, Cy5, etc. of CyDye TM series), rhodamine 6G reagent, 2-acetylaminofluorene (for example) It is preferable to use AAF), AAIF (iodamine derivative of AAF) and the like. Examples of the fluorescent substance having a difference in fluorescence emission maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like. In the present invention, such a label can be used to modify the target object so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art and those skilled in the art can appropriately implement such methods depending on the label and the subject of interest.
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、mycタグ、Hisタグ、HA、Aviタグなど
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカーの検出剤、検査剤、診断剤（プライマーまたはプローブ等であり得る）にはこのようなタグを結合させてもよい。
As used herein, a "tag" is a substance for selecting a molecule by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, a binding for binding a specific substance. A substance that acts as a partner (eg, having a relationship such as biotin-avidin, biotin-streptavidin) and may be included in the category of "label". Thus, for example, a specific substance to which a tag is bound can be selected by contacting a base material to which a binding partner of the tag sequence is bound. Such tags or signs are well known in the art. Typical tag sequences include, but are not limited to, myc tags, His tags, HA, Avi tags, and the like. Such a tag may be bound to the marker of the present invention or a marker detector, test agent, diagnostic agent (which may be a primer, a probe, etc.).
本明細書において「インビボ」（in vivo）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。 As used herein, the term "in vivo" refers to the inside of a living body. In a particular context, "in vivo" refers to the location where a substance of interest should be placed.
本明細書において「インビトロ」（in vitro）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。 As used herein, the term "in vitro" refers to a condition in which a portion of a living body has been removed or released "in vitro" (eg, in vitro) for a variety of research purposes. A term that contrasts with in vivo.
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。 As used herein, the term "exovibo" refers to a series of actions that are performed outside the body but are intended to be returned to the body afterwards for a certain procedure. Also in the present invention, it is possible to envision an embodiment in which cells in a living body are treated with the agent of the present invention and returned to a patient again.
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。 As used herein, a "kit" is a unit in which parts to be provided (for example, a test drug, a diagnostic drug, a therapeutic drug, an antibody, a label, an instruction manual, etc.) are usually divided into two or more sections. To say. The form of this kit is preferred when the purpose is to provide a composition that should not be mixed and provided for stability and the like, but is preferably mixed and used immediately before use. Such kits are preferably instructions or instructions describing how to use the provided parts (eg, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, or how reagents should be treated). When the kit is used as a reagent kit in the present specification, the kit usually includes an instruction manual or the like that describes how to use a test drug, a diagnostic drug, a therapeutic drug, an antibody, or the like. Is included.
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。 As used herein, the "instruction" describes the method of using the present invention to a doctor or another user. This instruction sheet contains words instructing the detection method of the present invention, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like. In addition, the instruction sheet may include a wording instructing the administration site to be administered orally or to the esophagus (for example, by injection). This instruction is prepared and approved by the regulatory agency of the country in which the invention is implemented (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.). It is clearly stated that it has been received. Instructions are so-called package inserts, usually provided in paper media, but are not limited to, for example, in the form of electronic media (eg, homepages provided on the Internet, e-mail). But can be provided.
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
(Preferable embodiment)
A preferred embodiment of the present invention will be described below. It is understood that the embodiments provided below are provided for a better understanding of the invention and the scope of the invention should not be limited to the following description. Therefore, it is clear that a person skilled in the art can appropriately make modifications within the scope of the present invention in consideration of the description in the present specification. It is also understood that the following embodiments of the present invention may be used alone or in combination.
（嗅球の状態に基づく脳マラリアの診断）
１つの局面において、本発明は、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を脳マラリアの指標とする方法を提供する。あるいは、本発明は、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を判定する工程を包含する、脳マラリアの診断方法を提供する。ここで、被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標であることが本発明において見出された。このような診断は、脳マラリアの他の症状が出る前に見出すことができることから、脳マラリアの早期診断を可能にするものとして注目されるべきである。すなわち、被験体の嗅球の異常は、脳マラリアの罹患早期の指標といえる。また、嗅球の状態の判定は、種々の手法で行うことが可能であり、脳マラリアの早期診断、および本発明が初めて提供するもののような脳マラリアの予防または治療薬を投与することで、脳マラリアの本格的な処置を可能にするという点でも注目される。
(Diagnosis of brain malaria based on the condition of the olfactory bulb)
In one aspect, the present invention provides a method of indexing a subject's olfactory bulb (OLF) status as an indicator of brain malaria. Alternatively, the present invention provides a method for diagnosing brain malaria, which comprises the step of determining the state of the olfactory bulb (OLF) of a subject. Here, it was found in the present invention that the abnormality of the olfactory bulb of the subject is an index of the subject suffering from brain malaria. Such a diagnosis should be noted as enabling an early diagnosis of cerebral malaria, as it can be found before other symptoms of cerebral malaria appear. That is, the abnormality of the subject's olfactory bulb can be said to be an index of the early stage of cerebral malaria. In addition, the state of the olfactory bulb can be determined by various methods, and by early diagnosis of cerebral malaria and administration of a prophylactic or therapeutic agent for cerebral malaria such as that provided for the first time in the present invention, the brain. It is also noteworthy that it enables full-scale treatment of malaria.
１つの実施形態において、本発明が判定する被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明の診断方法は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等から選択される少なくとも１つを行う工程を包含し、その結果によって、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を判定することができ、それによって、脳マラリアの罹患早期の指標とすることができる。 In one embodiment, the state of the olfactory bulb (OLF) of the subject determined by the present invention may include, but is not limited to, olfactory abnormalities, cell tests, diagnostic images of the olfactory bulb, and the like. Therefore, the diagnostic method of the present invention includes a step of performing at least one selected from olfactory abnormality, cell test, diagnostic image of olfactory bulb, etc., and determines the state of the olfactory bulb (OLF) of the subject based on the result. It can be an indicator of early onset of cerebral malaria.
本明細書において、嗅覚は、食品に対する反応、芳香剤に対する反応、（他の可能な試験をご列挙ください）等があり、嗅覚測定法としては、例えば、各種におい物質に対する基準嗅覚検査、アリナミンなどを用いる静脈的嗅覚検査、ＡＳＴＭ注射器法，無臭室法，セントメータ法，食塩水平衡法，三点比較式臭袋法などによって試験することができる。 In the present specification, olfaction includes reaction to food, reaction to air freshener, (list other possible tests), etc., and olfactory measurement methods include, for example, standard olfactory test for various odorous substances, arinamin, and the like. It can be tested by intravenous olfactory test using, ASTM syringe method, odorless chamber method, centimeter method, saline equilibrium method, three-point comparison type odor bag method, and the like.
本明細書において、嗅球の診断画像は核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって得られたものであり得るが、これに限定されない。本発明が使用する「超高磁場」の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）としては、現在臨床用として使用されている３テスラ（Ｔ）の磁場またはそれを超える高い磁場、例えば、少なくとも３テスラ以上、少なくとも４テスラ以上、少なくとも５テスラ以上、少なくとも６テスラ以上、少なくとも７テスラ以上、少なくとも８テスラ以上、少なくとも９テスラ以上、少なくとも１０テスラ以上、少なくとも１１テスラ以上、少なくとも１２テスラ以上でのＭＲＩを挙げることができる。実施例では、１１．７テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。 As used herein, diagnostic images of the olfactory bulb can be, but are not limited to, those obtained by magnetic resonance imaging (MRI). The "ultra-high magnetic field" magnetic resonance imaging (MRI) used in the present invention includes a magnetic field of 3 tesla (T) currently used clinically or a higher magnetic field, for example, at least 3 tesla or more. MRI at least 4 Tesla, at least 5 Tesla, at least 6 Tesla, at least 7 Tesla, at least 8 Tesla, at least 9 Tesla, at least 10 Tesla, at least 11 Tesla, at least 12 Tesla be able to. In the example, the one of 11.7 Tesla is used, and the state of the olfactory bulb can be determined.
本発明の判定において、診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である。このようなスポットは、嗅球に異常があることが示されるものであり、脳マラリアの感染の指標であることが本発明において明らかになった。 In the determination of the present invention, the observation of spots on the diagnostic image is an index of cerebral malaria. It has been clarified in the present invention that such spots indicate abnormalities in the olfactory bulb and are indicators of infection with brain malaria.
本発明では、嗅球の状態は、細胞検査によって判定してもよく、そのような判定は、染色（例えば、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色）または免疫組織化学法で検査される。 In the present invention, the condition of the olfactory bulb may be determined by cytological examination, such determination by staining (eg, hematoxylin-eosin (HE) staining) or immunohistochemistry.
１つの局面では、本発明は、嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置を提供する。このような装置は、上記方法を実現するものであれば、どのようなものでもよいことが理解される。 In one aspect, the invention provides a device for detecting or diagnosing brain malaria, including means for measuring the condition of the olfactory bulb. It is understood that such an apparatus may be any device as long as it realizes the above method.
１つの実施形態では、本発明の装置において用いられる手段は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手段である。好ましくは、本発明において用いられるＭＲＩは、超高磁場ＭＲＩである。通常のMRIでは、嗅球の異常をとらえることができなかったが、本発明では、超高磁場のMRIを用いることによって、はじめて、嗅球の異常を脳マラリアとの関係を解明することができた。したがって、本発明は、超高磁場によるMRIを用いるという点でも顕著性を示すといえる。 In one embodiment, the means used in the apparatus of the present invention are magnetic resonance imaging (MRI) means. Preferably, the MRI used in the present invention is an ultra-high magnetic field MRI. Although ordinary MRI could not detect olfactory bulb abnormalities, in the present invention, the relationship between olfactory bulb abnormalities and brain malaria could be elucidated for the first time by using ultra-high magnetic field MRI. Therefore, it can be said that the present invention is also remarkable in that it uses MRI using an ultra-high magnetic field.
（ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系に基づく治療剤）
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤、予防薬または治療薬、予防または治療のための医薬もしくは医薬組成物（これらの用語は、本明細書において特に断らない限り相互に交換可能に使用され同じ対象を指す。）を提供する。あるいは、本発明は、脳マラリアの予防または治療のための、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を提供する。この治療または予防薬または特定の治療または予防用の阻害剤を用いれば、脳マラリアを治療または予防することができる。またこの予防または治療薬は、これまで治療・予防法がなかった脳マラリアに初めて予防および治療薬を提供するという点で優れており、好ましい実施形態で使用される場合は抗体を使用するため、安全性の観点から優れている。
(Therapeutic agent based on CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system)
In another aspect, the invention is a prophylactic or therapeutic agent, a prophylactic or therapeutic agent, a prophylaxis or a therapeutic agent for the prevention or treatment of brain malaria, which comprises an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Provided are pharmaceutical compositions (these terms are used interchangeably and refer to the same subject unless otherwise specified herein). Alternatively, the invention provides an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system for the prevention or treatment of cerebral malaria. Brain malaria can be treated or prevented with this therapeutic or prophylactic agent or a specific therapeutic or prophylactic inhibitor. In addition, this preventive or therapeutic agent is excellent in that it provides the first preventive and therapeutic agent for brain malaria for which there has been no cure or preventive method, and when used in a preferred embodiment, an antibody is used. Excellent from a safety point of view.
１つの実施形態では、本発明が使用するＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも１つ因子の阻害剤を含む。 In one embodiment, the inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention is at least one selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, and nucleic acids encoding them. Includes one factor inhibitor.
より特定した実施形態では、本発明の阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。これらは、２種以上使用してもよい。 In a more specific embodiment, the inhibitors of the invention are small molecule compounds, antibodies or fragments or functional equivalents thereof, siRNA, shRNA, antisense nucleic acids, aptamers, pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof. It comprises at least one solvate of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Two or more of these may be used.
好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。より好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも２種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。理論に束縛されることを望まないが、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系のうちの２か所以上で阻害効果を発揮させることによって脳マラリアのより顕著な効果がおいて示されており、より効果を望む場合には２種類以上の因子の阻害が好ましいと想定される。 In a preferred embodiment, the inhibitor used in the present invention comprises at least one antibody selected from the group consisting of anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody, or a fragment or functional equivalent thereof. .. In a more preferred embodiment, the inhibitor used in the present invention comprises at least two antibodies selected from the group consisting of anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody and anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof. .. Although not bound by theory, more pronounced effects of brain malaria have been shown by exerting inhibitory effects in more than one of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling systems. Inhibition of two or more factors is presumed to be preferable if an effect is desired.
さらに別の実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体の３種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。 In yet another embodiment, the inhibitors used in the present invention include three antibodies, an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody and an anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、重鎖CDR1、2、および3、ならびに軽鎖CDR１、２および３のアミノ酸配列のセットを含み、さらに、重鎖FR1、2、3、4、軽鎖FR1、2、3、および4のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、あるいはすべてのフレームワークが特定されたもののいずれかのものと同一または実質的に同一あるいは保存的置換を除き同一であるものであり得る。1種以上の抗体であってもよい。また本発明の別の実施形態は、上に列挙した重鎖FR1、2、3、および4のアミノ酸配列のセットのうち、少なくとも1つのセットを含む抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等である。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. according to one embodiment of the present invention contain a set of amino acid sequences of heavy chain CDR1, 2, and 3, and light chain CDR1, 2, and 3, and further, heavy. At least one, preferably two, three, four, five, six, seven, or all frameworks of chain FR1, 2, 3, 4, light chain FR1, 2, 3, and 4. Can be identical or substantially identical to any of those identified or identical except for conservative substitutions. It may be one or more antibodies. Another embodiment of the present invention includes an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, etc., which comprises at least one set of the amino acid sequences of the heavy chains FR1, 2, 3, and 4 listed above. Is.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、scFvの形態であってもよく、その場合、重鎖と軽鎖間のリンカーは、重鎖と軽鎖との間のアミノ酸配列を有していてもよい。上に列挙したアミノ酸配列は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等が所望の効果を有する限り、(i)上記のアミノ酸配列において、1または数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加しているアミノ酸配列、(ii)上記のアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列、および(iii)上記のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列、からなる群から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列であってもよい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. according to one embodiment of the present invention may be in the form of scFv, in which case the linker between the heavy chain and the light chain is the heavy chain and the light chain. It may have an amino acid sequence between. As long as the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like have the desired effects, the amino acid sequences listed above are (i) deleted or substituted with one or several base sequences in the above amino acid sequence. The inserted or added amino acid sequence, (ii) an amino acid sequence having 90% or more homology to the above amino acid sequence, and (iii) a base complementary to the base sequence encoding the above amino acid sequence. It may be one or more amino acid sequences selected from the group consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that specifically hybridizes to a polynucleotide consisting of a sequence under stringent conditions.
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入することによって、形質転換体を作成できる。この形質転換体を用いれば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を作製できる。形質転換体は、ヒトまたはヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等）の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、サル細胞COS-7などが挙げられる。または、形質転換体はEscherichia属菌、酵母等であってもよい。 A transformant can be prepared by introducing into a cell a polynucleotide or vector encoding an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, etc. according to an embodiment of the present invention. By using this transformant, an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody and the like according to the embodiment of the present invention can be produced. The transformant may be a cell of a human or a mammal other than human (for example, rat, mouse, guinea pig, rabbit, cow, monkey, etc.). Examples of mammalian cells include Chinese hamster ovary cells (CHO cells) and monkey cells COS-7. Alternatively, the transformant may be Escherichia spp., Yeast or the like.
上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばpET-Blue）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110）、酵母由来プラスミド（例えばpSH19）、動物細胞発現プラスミド（例えばpA1-11、pcDNA3.1-V5/His-TOPO）、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、または抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。 Examples of the above vector include Escherichia coli-derived plasmid (for example, pET-Blue), bacteriophage-derived plasmid (for example, pUB110), yeast-derived plasmid (for example, pSH19), and animal cell expression plasmid (for example, pA1-11, pcDNA3.1-). V5 / His-TOPO), bacteriophage such as λ phage, virus-derived vector, etc. can be used. These vectors may contain components required for protein expression, such as promoters, replication origins, or antibiotic resistance genes. The vector may be an expression vector.
上記のポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる（改訂第4版 新 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社(2003):152-179.）。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):128-142."に記載の方法を使用できる。抗体の精製においては、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインA、プロテインG、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、またはレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):27-52.）。 As a method for introducing the above-mentioned polynucleotide or vector into cells, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, an adenovirus method, a retrovirus method, microinjection, or the like can be used (revised 4th edition). New Genetic Engineering Handbook, Yodosha (2003): 152-179.). As a production method using antibody cells, for example, the method described in "Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 128-142." can be used. In the purification of antibodies, for example, ammonium sulfate, ethanol precipitation, protein A, protein G, gel filtration chromatography, anion, cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyl Apatite chromatography, lectin chromatography, etc. can be used (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 27-52.).
別の実施形態では、前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の阻害剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物である。抗体は、全長配列のＣＤＲを含む任意の配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは、特定の配列の可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、そのフレームワーク領域において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、もしくは、２０個、またはそれ以上の置換、不可、もしくは、欠失を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の製造等については、本明細書の他の箇所に記載された実施形態および／または当該分野で公知の手法を用いることができる。なお、本発明の治療または予防の目的では、このような抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物は、好ましくは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の下流の阻害活性を有することが好ましい。 In another embodiment, the inhibitor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor is an antibody or fragment or functional equivalent thereof. An antibody is an antibody or an antigen-binding fragment thereof containing an arbitrary sequence containing a full-length CDR, or an antibody or an antigen-binding fragment thereof containing a variable region of a specific sequence, and one in the framework region thereof. Replacement, impossible, or replacement of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 12, 15, 17, or 20 or more. , An antibody containing a deletion or an antigen-binding fragment thereof. For the production of antibodies and the like, embodiments described elsewhere herein and / or methods known in the art can be used. For therapeutic or prophylactic purposes of the present invention, such antibodies or fragments or functional equivalents thereof preferably have inhibitory activity downstream of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
本発明を実施するために、本発明の核酸形態の抑制剤としてはアンチセンス活性を指標に核酸を選択することができる。ここで、「アンチセンス活性」とは、標的となる遺伝子の発現を特異的に抑制または減少させることができる活性をいう。より具体的には細胞内に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、その配列と相補的なヌクレオチド配列領域をもつ遺伝子のｍＲＮＡ量を特異的に低下させることで、タンパク発現量を減少させ得る活性をいう。手法としては、標的となる遺伝子からつくられるｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子を直接的に細胞に導入する方法と、細胞内に目的遺伝子と相補的なＲＮＡを発現させ得る構築ベクターを導入する方法に大別される。 In order to carry out the present invention, a nucleic acid can be selected as an inhibitor of the nucleic acid form of the present invention using the antisense activity as an index. Here, the "antisense activity" refers to an activity capable of specifically suppressing or reducing the expression of a target gene. More specifically, an activity capable of reducing protein expression by specifically reducing the amount of mRNA of a gene having a nucleotide sequence region complementary to that sequence, depending on a certain nucleotide sequence introduced into the cell. To say. As a method, there are a method of directly introducing an RNA molecule complementary to mRNA produced from a target gene into a cell and a method of introducing a construction vector capable of expressing RNA complementary to the target gene into the cell. It is roughly divided.
アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２１の連続するヌクレオチド長の、２２の連続するヌクレオチド長の、２３の連続するヌクレオチド長の、２４の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。したがって、本明細書において、アンチセンス活性には、遺伝子の発現量の減少が含まれるがそれらに限定されない。 Antisense activity is usually achieved by a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotide lengths that is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest. Such nucleic acid sequences preferably have at least 9 contiguous nucleotide lengths, more preferably 10 contiguous nucleotide lengths, even more preferably 11 contiguous nucleotide lengths, 12 contiguous nucleotide lengths, 13 Contiguous nucleotide length, 14 contiguous nucleotide lengths, 15 contiguous nucleotide lengths, 16 contiguous nucleotide lengths, 17 contiguous nucleotide lengths, 18 contiguous nucleotide lengths, 19 contiguous Nucleotide length, 20 contiguous nucleotide lengths, 21 contiguous nucleotide lengths, 22 contiguous nucleotide lengths, 23 contiguous nucleotide lengths, 24 contiguous nucleotide lengths, 25 contiguous nucleotide lengths. Can be a nucleic acid sequence of 30 contiguous nucleotide lengths, 40 contiguous nucleotide lengths, 50 contiguous nucleotide lengths. Such nucleic acid sequences include at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, even more preferably 90% homologous, 95% homologous to the above sequences. Such antisense activity is preferably complementary to the 5'end sequence of the nucleic acid sequence of the gene of interest. Such antisense nucleic acid sequences also include those having one or several or more nucleotide substitutions, additions and / or deletions to the sequences described above. Thus, as used herein, antisense activity includes, but is not limited to, reduced gene expression.
一般的なアンチセンス技術については、教科書に記載されている（Ｍｕｒｒａｙ，ＪＡＨ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，１９９２）。さらに最新の研究でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が明らかになり、アンチセンス技術の発展をもたらした。 General antisense techniques are described in textbooks (Murray, JAH eds., Antisense RNA and DNA, Wiley-Liss Inc, 1992). Furthermore, the latest research has revealed a phenomenon called RNA interference (RNAi), which has led to the development of antisense technology.
本明細書において「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、当該分野で一般に知られており、ＲＮＡｉを引き起こす因子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する生物学的プロセスである。例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において「ＲＮＡｉ」はまた、場合によっては、「ＲＮＡｉを引き起こす因子」、「ＲＮＡｉを起こす因子」、「ＲＮＡｉ因子」などと同義に用いられ得る。ＲＮＡｉについては、例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際公開第９９／０７４０９号およびＬｉ他、国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照。）。また、本明細書では、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉の記述に用いられる他の用語と同義のものを示すものとして理解される。本明細書では、「ＲＮＡｉを起こす因子」は「ＲＮＡｉ」を起こす限りどのようなものであってもよい。 As used herein, "RNA interference" or "RNAi" is an abbreviation for RNA interference, an organism commonly known in the art that inhibits or downregulates gene expression in cells mediated by factors that cause RNAi. It is a scientific process. For example, by introducing an RNAi-causing factor such as double-stranded RNA (also called dsRNA) into a cell, a phenomenon in which homologous mRNA is specifically degraded and gene product synthesis is suppressed, and a technique used for the phenomenon. To say. In the present specification, "RNAi" may also be used synonymously with "factor that causes RNAi", "factor that causes RNAi", "RNAi factor" and the like in some cases. For RNAi, for example, Zamore and Haley, 2005 Science, 309, 1519-1524; Vaughn and Martienssen, 2005 Science, 309, 1525-1526; Zamore et al. , 2000, Cell, 101,25-33; Bass, 2001, Nature, 411,428-249; Elbashiretal. , 2001, Nature, 411,494-498; and Kreutzer et al., International Publication No. 00/4895; Zernicka-Goets et al., International Publication No. 01/36646; Fire, International Publication No. 99/32619; Publication No. 00/01846; Mello and Fire, International Publication No. 01/29058; Deschamps-Depirette, International Publication No. 99/07409 and Li et al., International Publication No. 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al. , 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; and Hall et al. , 2002 Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al. , 2002, RNA, 8,842-850; Reinhard et al. , 2002, gene & Dev. , 16, 1616-1626; and Reinhard & Bartel, 2002, Science, 297, 1831. ). Also herein, the term RNAi is meant to be synonymous with other terms used to describe sequence-specific RNA interference such as post-transcriptional gene silencing, translational inhibition, transcriptional inhibition, epigenetics. Understood. In the present specification, the "factor that causes RNAi" may be anything as long as it causes "RNAi".
本明細書では「ＲＮＡｉを起こす因子」としては、「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」等が挙げられ、これらの用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールも表し得る。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。 In the present specification, the "factors that cause RNAi" include "small interfering nucleic acid", "siNA", "small interfering RNA", "siRNA", "small interfering nucleic acid molecule", and "small interfering oligonucleotide molecule". Or "chemically modified small interfering nucleic acid molecules" and the like, these terms inhibit or downregulate gene expression or viral replication by sequence-specific mediating RNA interference "RNAi" or gene silencing. Refers to any nucleic acid molecule that can be. These terms may also represent individual nucleic acid molecules, multiple such nucleic acid molecules, or pools of such nucleic acid molecules. These molecules can be double-stranded nucleic acid molecules containing a self-complementary sense region and an antisense region.
本発明で代表的に用いられる「ｓｉＲＮＡ」は、短い長さ、通常、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。 The "siRNA" typically used in the present invention is a double-stranded RNA having a short length, usually about 20 bases (eg, typically about 21-23 bases) or less. .. Such siRNA can be used for the treatment, prevention, prognosis, etc. of diseases because it suppresses gene expression by expressing it in cells and suppresses the expression of the pathogenic gene that is the target of the siRNA. The siRNA used in the present invention may take any form as long as it can cause RNAi.
本発明において、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉを起こす因子では、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖または二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約１５から約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対でありうるが、これらより長くてもよい。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、その分子の約１５から約２５個またはそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に相補的である）。あるいは、これらの分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、これらの分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカーまたは非核酸リンカーによって連結されている。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸（ｓｔｅｍ）とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性な分子を生成し得る。これらの因子は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る（例えば、これらの因子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がこれらの因子内に存在する必要がない。）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８参照）、５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当該分野で公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、またはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および／またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。ある実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態においては、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、２’ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いていてもよいく。ある実施形態において、本発明はＲＮＡｉを媒介するのに２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸でありうる。したがって、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを維持するのにＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤内のリボヌクレオチドの存在が不要である場合は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、または他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を阻害する因子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０または５０％においてリボヌクレオチドを含み得る。本明細書ではＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）であってもよい。 In the present invention, in an RNAi-causing factor such as siRNA, the antisense region is a nucleotide sequence complementary to or a part of the nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule, and a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a part thereof. Includes a sense region with. These molecules can be assembled from two separate oligonucleotides, one strand being the sense strand and the other being the antisense strand. Here, the antisense and sense strands are self-complementary (ie, each strand is in the nucleotide sequence in the other strand, such as the antisense and sense strands forming a double or double strand structure. Containing nucleotide sequences that are complementary, where, for example, the double-stranded region is about 15 to about 30, eg, about 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. , 26, 27, 28, 29 or 30 base pairs, but may be longer than these. The antisense strand comprises a nucleotide sequence that is complementary to or a portion of the nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule. The sense strand comprises a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof (eg, about 15 to about 25 or more nucleotides of the molecule are complementary to the target nucleic acid or a portion thereof). , These molecules are assembled from a single oligonucleotide, and the self-complementary sense and antisense regions of these molecules are linked by a nucleic acid linker or a non-nucleic acid linker. These molecules are self-complementary. It can be a duplex having a double-stranded, asymmetric double-stranded, hairpin or asymmetric hairpin secondary structure that includes a typical sense region and an antisense region, where the antisense region is in a separate target nucleic acid molecule. It contains a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence or part thereof, and a sense region that has the nucleotide sequence or part thereof corresponding to the target nucleic acid sequence. These molecules are self-complementary to two or more loop structures. It can be a cyclic single-stranded polynucleotide having a good sense region and a stem containing the antisense region, where the antisense region is complementary to or a portion of the nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule. Containing a sense region having a nucleotide sequence and a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof, the cyclic polynucleotide can be processed in vivo or in vitro to produce an active molecule capable of mediating RNAi. These factors may also include single-stranded polynucleotides having a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule or a portion thereof (eg, these factors may be in the target nucleic acid sequence or a portion thereof). Corresponding nucleotide sequences need not be present within these factors. Single-stranded polynucleotides are 5'phosphates (eg, Martinez et.). al. , 2002, Cell. , 110, 563-574 and Schwarz et al. , 2002, Molecular Cell, 10, 537-568), which may further contain terminal phosphate groups such as 5', 3'-diphosphate. In certain embodiments, inhibitors such as CCL21, CXCR3, CCR7 of the present invention contain separate sense and antisense sequences or regions. Here, the sense and antisense regions are covalently linked by nucleotide or non-nucleotide linker molecules known in the art, or ion interactions, hydrogen bonds, van der Waals interactions, hydrophobic interactions and / or. Alternating non-covalent bonds due to stacking interactions. In certain embodiments, inhibitors such as CCL21, CXCR3, CCR7 of the invention comprise a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of the target gene. In another embodiment, inhibitors such as CCL21, CXCR3, CCR7 of the present invention interact with the nucleotide sequence of the target gene so as to inhibit the expression of the target gene. As used herein, inhibitors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 are not necessarily limited to molecules containing only RNA, but also include chemically modified nucleotides and non-nucleotides. In certain embodiments, if the invention is a low molecular weight interfering nucleic acid molecule, it may lack 2'hydroxy (2'-OH) -containing nucleotides. In certain embodiments, the present invention can be a small interfering nucleic acid that does not require the presence of nucleotides having a 2'hydroxyl group to mediate RNAi. Therefore, when the present invention is a small interfering nucleic acid molecule, it does not have to contain a ribonucleotide (for example, a nucleotide having a 2'-OH group). However, if the presence of ribonucleotides in inhibitors such as CCL21, CXCR3, CCR7 is not required to maintain RNAi, then a bound linker, or an attached linker, containing one or more nucleotides having a 2'-OH group. It may have other bonded or associated groups, moieties or chains. In some cases, factors that inhibit CCL21, CXCR3, CCR7, etc. of the invention may include ribonucleotides at about 5, 10, 20, 30, 40 or 50% of nucleotide positions. In the present specification, inhibitors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 are nucleic acid molecules capable of mediating sequence-specific RNAi, such as small interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), and the like. It may be short hairpin RNA (shRNA), small interfering oligonucleotide, small interfering nucleic acid, small interfering modified oligonucleotide, chemically modified siRNA, posttranscription gene silencing RNA (ptgsRNA).
本明細書においてＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。 Factors that cause RNAi herein include, for example, at least 10 sequences that have at least about 70% homology to a portion of the nucleic acid sequence of the target gene or sequences that hybridize under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNA containing a double-stranded portion of nucleotide length or a variant thereof. Here, the factor preferably comprises a 3'protruding end, and more preferably the 3'protruding end can be a DNA of 2 nucleotides or longer in length (eg, a DNA of 2 to 4 nucleotides in length).
あるいは、本発明において用いられるＲＮＡｉとしては、例えば、短い逆向きの相補的配列（例えば、１５ｂｐ以上であり、例えば、２４ｂｐなど）のペアが挙げられるがそれらに限定されない。 Alternatively, RNAi used in the present invention includes, but is not limited to, for example, a pair of short inverted complementary sequences (eg, 15 bp or higher, eg, 24 bp, etc.).
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものを、ＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。 Without being bound by theory, one possible mechanism by which RNAi works is that when a molecule that causes RNAi, such as dsRNA, is introduced into a cell, helicases for relatively long (eg, 40 base pairs or more) RNA. In the presence of ATP, a domain-bearing RNaseIII-like nuclease called Dicer cuts out the molecule from the 3'end by about 20 base pairs, yielding short dsRNA (also called siRNA). As used herein, "siRNA" is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially chemically synthesized, biochemically synthesized, or synthesized in an organism, or about 40. A short double-stranded RNA of 10 base pairs or more formed by degrading a double-stranded RNA of bases or more in the body. It usually has a structure of 5'-phosphate, 3'-OH, and 3 'The end protrudes about 2 bases. A protein specific to this siRNA binds to form RISC (RNA-induced-silencing-complex). This complex recognizes and binds to mRNAs that have the same sequence as the siRNA and cleaves the mRNA in the central part of the siRNA by RNaseIII-like enzymatic activity. The relationship between the siRNA sequence and the mRNA sequence to be cleaved as a target is preferably 100% consistent. However, for base mutations at positions off-center of siRNA, RNAi cleaving activity does not completely disappear, but partial activity remains. On the other hand, mutation of the base in the central part of siRNA has a large effect, and the cleavage activity of mRNA by RNAi is extremely reduced. Taking advantage of such properties, for mRNA having a mutation, siRNA having the mutation in the center can be synthesized and introduced into cells to specifically decompose only the mRNA containing the mutation. Therefore, in the present invention, siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that produces siRNA (for example, dsRNA of about 40 bases or more is typically used) can be used as such a factor. it can.
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。 Also, although not bound by theory, siRNA acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) by binding the antisense strand of siRNA to mRNA, apart from the above pathway, and dsRNA is synthesized. Then, it is also planned that this dsRNA becomes a substrate of the dicer again to generate a new siRNA and amplify the action. Therefore, in the present invention, the siRNA itself and the factors that give rise to the siRNA are also useful. In fact, in insects and the like, for example, 35 dsRNA molecules almost completely degrade intracellular mRNA having 1,000 copies or more, so it is understood that siRNA itself and factors that produce siRNA are useful. Will be done.
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。 In another embodiment, the factor that causes RNAi of the present invention can be a short hairpin structure (SHRNA; short hairpin RNA) having a protrusion at the 3'end. In the present specification, "SHRNA" is a single-stranded RNA having a double-stranded structure in a molecule by partially containing a palindromic base sequence, and has a hairpin-like structure of about 20 base pairs. Refers to the above molecules. Such shRNA is artificially chemically synthesized. Alternatively, such shRNA can be produced by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase, which has a hairpin structure in which the DNA sequences of the sense strand and the antisense strand are linked in the reverse direction. Although not bound by theory, such shRNAs are approximately 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 bases) in length after being introduced into a cell. It should be understood that it is degraded into RNAi as well as siRNA and has the therapeutic effect of the present invention. It should be understood that such effects are exerted in a wide range of organisms such as insects, plants and animals (including mammals). As described above, shRNA causes RNAi in the same manner as siRNA, and therefore can be used as the active ingredient of the present invention. The shRNA may also preferably have a 3'protruding end. The length of the double-stranded portion is not particularly limited, but may be preferably about 10 nucleotides or longer, more preferably about 20 nucleotides or longer. Here, the 3'protruding end can be preferably DNA, more preferably DNA having a length of at least 2 nucleotides or more, and even more preferably DNA having a length of 2 to 4 nucleotides. The factor that causes RNAi used in the present invention can be either artificially synthesized (for example, chemically or biochemically) or naturally occurring, and the effect of the present invention is between the two. There is no essential difference. Chemically synthesized products are preferably purified by liquid chromatography or the like.
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法等の任意の適切な方法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明において有用である。 The RNAi-causing factor used in the present invention can also be synthesized in vitro. In this synthesis system, T7 RNA polymerase and T7 promoter are used to synthesize antisense and sense RNA from template DNA. When they are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is triggered through the mechanism as described above, and the effects of the present invention are achieved. Here, such RNA can be introduced into cells by any suitable method, such as the calcium phosphate method. Factors that cause RNAi of the invention also include single strands capable of hybridizing with mRNA, or factors such as all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the present invention.
本発明の一実施形態は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対するRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性脳マラリアの治療薬である。このRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを用いれば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性脳マラリア細胞の増殖を抑制することができる。本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、10以上のヌクレオチドを有する、ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物であってもよい。 One embodiment of the present invention is a therapeutic agent for CCL21, CXCR3, CCR7 and the like-positive brain malaria, which comprises an RNAi molecule for CCL21, CXCR3, CCR7 and the like, or a polynucleotide encoding the RNAi molecule. By using this RNAi molecule or a polynucleotide encoding the RNAi molecule, it is possible to suppress the proliferation of CCL21, CXCR3, CCR7 and other positive brain malaria cells. In one embodiment of the present invention, the "polynucleotide" may be a polymer compound in which nucleotides are linearly polymerized, having 10 or more nucleotides.
本発明の一実施形態において「RNAi分子」は、RNAi作用を有するRNA鎖であり、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、またはRNAi作用を有するsmallRNA等を挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, the "RNAi molecule" is an RNA strand having an RNAi action, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, and small RNA having an RNAi action.
本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、miRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは2本鎖RNA、またはそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、またはサイレンシングされる現象を含む。 In one embodiment of the present invention, "RNAi" is a function of a target gene or mRNA by one or more of siRNA, shRNA, miRNA, short or long chain RNA, or a modification thereof. Includes the phenomenon that is suppressed or silenced.
RNAi分子のデザインには、例えば、siDirect2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等を使用できる。また、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）に委託してもよい。RNAi作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対するsiRNAまたはshRNAを生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）から購入することができる。
For the design of RNAi molecules, for example, siDirect2.0 (Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30; 10: 392.) Can be used. Alternatively, it may be outsourced to a consignment company (for example, Takara Bio Inc.). The RNAi action can be confirmed by quantifying the RNA chain expression level by real-time RT-PCR. Alternatively, it can also be performed by methods such as analysis of RNA chain expression level by Northern blot, analysis of protein level by Western blotting, and observation of phenotype. In addition, a plasmid that produces siRNA or shRNA for a specific gene can be purchased from, for example, a contractor (for example, Takara Bio Inc.).
本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。上記ガイド鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、そのガイド鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。 In one embodiment of the invention, "siRNA" comprises an RNA strand capable of inducing RNAi. Generally, the double strand of siRNA can be divided into a guide strand and a passenger strand, and the guide strand is incorporated into RISC. Guide strands incorporated into RISC are used to recognize the target RNA. In RNAi research, artificially created ones are mainly used, but those that are endogenously present in the living body are also known. The guide strand may be composed of RNA of 15 bases or more. If it is 15 bases or more, the possibility of accurately binding to the target polynucleotide increases. Moreover, the guide strand may be composed of RNA of 40 bases or less. If it is 40 bases or less, the risk of adverse phenomena such as interferon response is lower.
本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。 In one embodiment of the invention, the "shRNA" comprises a single strand RNA strand capable of inducing RNAi and forming a hairpin-like folded structure (hairpin-like structure). Typically, the shRNA is cleaved intracellularly by the Dicer and the siRNA is excised. It is known that this siRNA causes cleavage of the target RNA. The shRNA may be composed of 35 or more nucleotides. If it is 35 or more, the possibility of accurately forming the appin-like structure peculiar to shRNA increases. Moreover, the above-mentioned shRNA may be composed of RNA of 100 bases or less. If it is 100 bases or less, the risk of adverse phenomena such as interferon response is low. However, since most pre-miRNAs, which are generally similar in structure and function to shRNA, have a length of about 100 nucleotides or more, the length of shRNA is not necessarily 100 bases or less. However, it is thought that it can function as an shRNA.
本発明の一実施形態において「miRNA」は、siRNAと類似の機能を有しているRNA鎖を含み、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。 In one embodiment of the present invention, "miRNA" contains an RNA strand having a function similar to that of siRNA, and is known to suppress translation or degrade the target RNA strand. The differences between miRNAs and siRNAs generally lie in their production pathways and detailed mechanisms.
本発明の一実施形態において「small RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、1または2本鎖の低分子RNAなどを挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, "small RNA" refers to a relatively small RNA strand, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, antisense RNA, one- or double-stranded small RNA, and the like.
上記RNAi分子は、5’末端または3’末端に1〜5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、または10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、または3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。塩基配列は、所望の効果を有する限り、1または複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加していてもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5’末端、右側が3’末端である。 The RNAi molecule may contain an overhang consisting of 1 to 5 bases at the 5'end or 3'end. In this case, the efficiency of RNAi is considered to increase. This number may be, for example, 5, 4, 3, 2, or 1 base, and may be in the range of any two of these values. Further, when the RNAi molecule is double-stranded, a mismatched RNA may be present between each RNA strand. The number may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 10 or less, and may be within the range of any two of them. Further, the RNAi molecule may contain a hairpin loop, and the number of bases in the hairpin loop may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, or 3 bases, and the value of any two of them may be used. It may be within the range. The base sequence may be deleted, substituted, inserted, or added as long as it has a desired effect. The notation of each base sequence is that the left side is the 5'end and the right side is the 3'end.
上記RNAi分子の長さは、例えば、15、18、20、25、30、40、50、60、80、100、200、または400塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、15以上、または100以下が好ましい。 The length of the RNAi molecule may be, for example, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, or 400 bases, within the range of any two of these values. It may be. This number is preferably 15 or more, or 100 or less, from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3, and CCR7.
本発明の一実施形態において「RNA鎖」は、RNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。また本発明の一実施形態において「DNA鎖」は、DNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。このRNA鎖またはDNA鎖は、1本鎖または複数本鎖（例えば、2本鎖）の形態のRNA鎖またはDNA鎖を含む。RNA鎖またはDNA鎖は、細胞取込促進物質（例えば、PEGまたはその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、またはリンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）等と結合していてもよい。RNA鎖またはDNA鎖は、核酸合成装置を用いて合成可能である。その他、受託会社（例えば、インビトロジェン社等）から購入することもできる。生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、塩または溶媒和物を形成することがある。また、生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、化学修飾を受けることがある。RNA鎖またはDNA鎖の用語は、例えば、塩もしくは溶媒和物を形成しているRNA鎖もしくはDNA鎖、または化学修飾を受けているRNA鎖もしくはDNA鎖等を含む。またRNA鎖またはDNA鎖は、RNA鎖のアナログ、またはDNA鎖のアナログであってもよい。 In one embodiment of the present invention, the "RNA strand" includes a form in which a plurality of RNAs or their equivalents are linked. Further, in one embodiment of the present invention, the "DNA strand" includes a form in which a plurality of DNAs or their equivalents are bound to each other. The RNA or DNA strand comprises a single or multiple strand (eg, double strand) form of the RNA or DNA strand. The RNA or DNA strand may be bound to a cell uptake promoter (eg, PEG or a derivative thereof), a labeling tag (eg, a fluorescent labeling tag, etc.), a linker (eg, a nucleotide drinker, etc.), and the like. The RNA or DNA strand can be synthesized using a nucleic acid synthesizer. In addition, it can be purchased from a contractor (for example, Invitrogen). RNA or DNA strands in vivo may form salts or solvates. In addition, RNA or DNA strands in vivo may undergo chemical modification. The term RNA or DNA strand includes, for example, an RNA or DNA strand forming a salt or solvate, or a chemically modified RNA or DNA strand. Further, the RNA strand or the DNA strand may be an analog of the RNA strand or an analog of the DNA strand.
上記RNAi分子は、安定的にRNAi作用を発揮する観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のmRNAの塩基配列の一部に対して、相補的な塩基配列を含むことが好ましい。上記「一部」は、例えば、5、10、15、18、20、22、24、26、28、30、35、40、または50塩基以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。 From the viewpoint of stably exerting RNAi action, the RNAi molecule preferably contains a base sequence complementary to a part of the base sequence of mRNA such as CCL21, CXCR3, and CCR7. The "part" may be, for example, 5, 10, 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, or 50 or more bases, and any two of these values. It may be within the range.
本発明の一実施形態において「タンパク質の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からmRNAへの転写機構を阻害、またはmRNAからタンパク質への翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、mRNA、またはタンパク質の分解を誘導することによって、結果的にタンパク質量を減少させることを含む。本発明の一実施形態において「タンパク質の機能を阻害すること」は、タンパク質に構造変化を生じさせ、タンパク質の活性を低下させることを含む。また、例えば、遺伝子の発現を阻害した結果、mRNAまたはタンパク質の生成量が低下することを含む。 In one embodiment of the present invention, "inhibiting protein expression" includes, for example, inhibiting the transcription mechanism from a gene to mRNA, or inhibiting the translation mechanism from mRNA to protein. It also includes reducing the amount of protein as a result, for example by inducing degradation of a gene, mRNA, or protein. In one embodiment of the present invention, "inhibiting the function of a protein" includes causing a structural change in the protein to reduce the activity of the protein. It also includes, for example, a decrease in the amount of mRNA or protein produced as a result of inhibiting gene expression.
本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。発現量はmRNA量、またはタンパク質量を指標としてもよい。本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定（片側または両側）を使用して評価し、p＜0.05であるときを含んでいてもよい。または、実質的に差異が生じている状態を含む。本発明の一実施形態において「機能が阻害されている状態」は、活性が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。 In one embodiment of the present invention, the "state in which expression is inhibited" includes a state in which the expression level is significantly reduced as compared with the normal state. The expression level may be indexed by the amount of mRNA or the amount of protein. In one embodiment of the invention, "significantly" may include, for example, when statistically significant differences are evaluated using Student's t-test (one-sided or two-sided) and p <0.05. Alternatively, it includes a state in which there is a substantial difference. In one embodiment of the present invention, the "state in which the function is inhibited" includes a state in which the activity is significantly reduced as compared with the normal state.
別の局面において、本発明は、有効量のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤またはこれを含む組成物または医薬（治療薬または予防薬）を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法を提供する。これまでは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系が脳マラリアの予防または治療に適用され得ることは知られておらず、有効量についても、当然知られるところではなかった。他方、本発明では、本明細書において得られた知見に基づき、使用される阻害剤に応じて有効量を当業者が選択することができる。 In another aspect, the invention presents a subject in need of an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system in an effective amount or a composition or drug (therapeutic or prophylactic agent) containing the inhibitor. Provided are methods for preventing or treating brain malaria in the subject, including administration. So far, it has not been known that the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system can be applied to the prevention or treatment of cerebral malaria, and the effective amount is of course unknown. On the other hand, in the present invention, those skilled in the art can select an effective amount depending on the inhibitor used, based on the findings obtained herein.
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体またはポリヌクレオチドを投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、またはNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。 The administration route of the therapeutic agent is preferably one that is effective for treatment, and may be, for example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or oral administration. The administration form may be, for example, an injection, a capsule, a tablet, a granule, or the like. When administering an antibody or polynucleotide, it is effective to use it as an injection. The aqueous solution for injection may be stored, for example, in a vial or a stainless steel container. Further, the aqueous solution for injection may contain, for example, physiological saline, sugar (for example, trehalose), NaCl, or NaOH. Further, the therapeutic agent may contain, for example, a buffer (for example, a phosphate buffer), a stabilizer, or the like.
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E．W．Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。 In general, the compositions, pharmaceuticals, therapeutic agents, prophylactic agents and the like of the present invention include therapeutically effective amounts of therapeutic or active ingredients and pharmaceutically acceptable carriers or excipients. As used herein, "pharmaceutically acceptable" is used in animals, and more specifically in humans, for use in government regulatory authorities, or in the pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeia. It means that it is listed. As used herein, "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle to which a therapeutic agent is administered together. Such carriers can also be sterile liquids such as water and oils, including but not limited to petroleum, animal, plant or synthetic origins, sesame oil, soybean oil, minerals. Includes oil, sesame oil, etc. Water is the preferred carrier for oral administration of the drug. For intravenous administration of the pharmaceutical composition, saline and aqueous dextrose are the preferred carriers. Preferably, saline solution, as well as aqueous dextrose and glycerol solutions, are used as liquid carriers for the injectable solution. Suitable excipients include light anhydrous silicic acid, crystalline cellulose, mannitol, starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, choke, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, chloride. Sodium, defatted milk powder, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinyl acetal diethylaminoacetate, polyvinyl pyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride, polyoxyethylene hardening Includes castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts and the like. The composition can also contain small amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffers, if desired. These compositions can also take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. It is also possible to formulate the composition as a suppository using traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations can also include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, saccharin sodium, cellulose, magnesium carbonate and the like. Examples of suitable carriers are E.I. W. Listed in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.). Such compositions contain a therapeutically effective amount of a therapeutic agent, preferably a purified form, along with an appropriate amount of carrier to provide a form for appropriate administration to the patient. The formulation should be suitable for the mode of administration. In addition to these, for example, surfactants, excipients, colorants, fragrances, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity It may contain an accelerator, a flavoring agent and the like.
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、 Berge et al., J.Pharm.Sci.,1977, 66, 1-19に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、J.Honig et al., The Van Nostrand Chemist’s Dictionary P650 (1953)を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、PEGもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。 In one embodiment of the invention, the "salt" includes, for example, an anionic salt formed of any acidic (eg, carboxyl) group, or a cationic salt formed of any basic (eg, amino) group. Salts include inorganic or organic salts and include, for example, the salts described in Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19. Further, for example, a metal salt, an ammonium salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid and the like can be mentioned. In one embodiment of the invention, a "solvate" is a compound formed by a solute and a solvent. For solvates, see, for example, J. Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953). If the solvent is water, the solvate formed is a hydrate. The solvent is preferably one that does not interfere with the biological activity of the solute. Examples of such preferred solvents include, but are not limited to, water or various buffers. In one embodiment of the present invention, "chemical modification" includes, for example, modification with PEG or a derivative thereof, fluorescein modification, biotin modification and the like.
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位（例えば、食道）に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（bolus）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が脳（例えば、嗅球）領域で使用される場合、さらに、脳（例えば、嗅球）に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。 When the present invention is administered as a drug, various delivery systems are known, and such systems can also be used to administer the therapeutic agent of the present invention to an appropriate site (eg, esophagus). Such systems include, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, and microcapsules: the use of recombinant cells capable of expressing therapeutic agents (eg, polypeptides), receptor-mediated endocytosis. Use; such as the construction of therapeutic nucleic acids as part of a retroviral vector or other vector. Induction methods include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. It is also possible and necessary to administer the drug by any of the preferred routes, eg by injection, by bolus injection, by absorption through the epithelium or mucocutaneous lining (eg, oral, rectal and intestinal mucosa). Inhalers or nebulizers can be used, depending on the aerosolizing agent, and can also be administered with other bioactive agents. Administration can also be systemic or topical. When the present invention is used in the brain (eg, olfactory bulb) region, it can be further administered by any suitable route, such as direct injection into the brain (eg, olfactory bulb).
治療剤が核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をin vivo投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞DNA内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。 In certain embodiments where the therapeutic agent is a nucleic acid, the nucleic acid is encoded in vivo by constructing the nucleic acid as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it to be present intracellularly. It is also possible to promote protein expression, for example by the use of retroviral vectors, by direct injection, or by the use of microparticle guns, or with nucleic acids in lipids, cell surface receptors or transfection agents. This can be done by coating or by administering a nucleic acid linked to a tag sequence known to enter the nucleus. Alternatively, the nucleic acid therapeutic agent can be introduced into cells and incorporated into host cell DNA by homologous recombination for expression.
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。 In a preferred embodiment, the composition can be formulated as a pharmaceutical composition adapted for administration to humans according to known methods. Such compositions can be administered by injection. Typically, the composition for injection administration is a solution in a sterile isotonic aqueous buffer. If desired, the composition can also include a solubilizer and a local anesthetic such as lidocaine to relieve pain at the injection site. Generally, the ingredients are fed separately or mixed together in a unit dosage form and lyophilized powder or water-free concentrate in a sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of activator. It can be supplied as a thing. If the composition is to be administered by infusion, it can also be dispensed using an infusion bottle containing sterile drug grade water or saline. If the composition is to be administered by injection, it is also possible to provide an ampoule of sterile water or saline for injection so that the ingredients can be mixed prior to administration.
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。 It is also possible to formulate the compositions, pharmaceuticals, therapeutic agents and prophylactic agents of the present invention in neutral or salt forms or other prodrugs (eg, esters, etc.). Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free carboxyl groups derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, etc., isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, prokine. It includes those formed with a free amine group such as those derived from such as, and those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide and the like.
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、in vitroアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.001、1、5、10、15、100、または1000mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1、7、14、21、または28日あたりに1または2回投与してもよく、それらいずれか2つの値の範囲あたりに1または2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。 The amount of therapeutic agent of the invention effective in treating a particular disorder or condition may vary depending on the nature of the disorder or condition, but one of ordinary skill in the art can determine by standard clinical techniques as described herein. In addition, in vitro assays can optionally be used to assist in identifying optimal dosage ranges. The exact dose to be used in the formulation may also vary depending on the route of administration and the severity of the disease or disorder and should be determined according to the judgment of the attending physician and the circumstances of each patient. However, the dose is not particularly limited, and may be, for example, 0.001, 1, 5, 10, 15, 100, or 1000 mg / kg body weight per dose, and is within the range of any two of these values. May be good. The dosing interval is not particularly limited, but may be administered once or twice per 1, 7, 14, 21, or 28 days, for example, once or twice per range of any two of these values. May be good. The dose, administration interval, and administration method may be appropriately selected depending on the age and weight of the patient, symptoms, target organ, and the like. In addition, the therapeutic agent preferably contains a therapeutically effective amount or an effective amount of the active ingredient that exerts a desired action. If the malignant tumor marker is significantly reduced after administration, it may be judged that there is a therapeutic effect. Effective doses can be estimated from dose-response curves obtained in vitro or from animal model test systems.
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の1種以上）を含む。また患者または被験体は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現が異常であると判断または診断された患者または被験体であってもよい。このとき、判断または診断は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のタンパク質レベルを検出することにより行われることが好ましい。 In one embodiment of the invention, the "patient" or "subject" is a human or non-human mammal (eg, mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, etc. One or more species such as cats, dogs, marmosets, monkeys, or chimpanzees). Further, the patient or subject may be a patient or subject who is judged or diagnosed to have abnormal expression of CCL21, CXCR3, CCR7 or the like. At this time, the judgment or diagnosis is preferably made by detecting the protein level of CCL21, CXCR3, CCR7 or the like.
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。 The pharmaceutical composition or therapeutic or prophylactic agent of the present invention can be provided as a kit.
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の1以上の成分が充填された、1以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。 In certain embodiments, the present invention provides a drug pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the composition or pharmaceutical of the present invention. Manufacture, use or sale for human administration by Government, as prescribed by Government, which regulates the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products, optionally incidental to such containers. It is also possible to provide information indicating the authorization of.
本発明のキットはまた、本発明の組成物、治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための指示書（添付文書）、並びに／あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。 The kit of the present invention can also contain an expression vector encoding a protein used as a composition, therapeutic agent, prophylactic agent or pharmaceutical of the present invention, and the protein is biologically after being expressed. It can also be reconstituted to form an active complex. Such kits preferably also contain the necessary buffers and reagents. In some cases, accompanying such containers, instructions (attachments) for the use of the kit and / or in the form prescribed by a government agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products. It is also possible to provide information indicating the approval of manufacture, use or sale for human administration by a government agency.
特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。 In certain embodiments, pharmaceutical compositions containing the nucleic acids of the invention can be administered via liposomes, microparticles, or microcapsules. In various aspects of the invention, it may be useful to use such compositions to achieve sustained release of nucleic acids.
（ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系に基づく脳マラリアの診断）
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子を含む、脳マラリアのマーカーを提供する。あるいは、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別または診断する方法を提供する。ここでは、対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断される。このような診断は、以下に説明するような結合剤ないし検出剤を用いて行うことができる。したがって、本発明の方法は、対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現を調べる工程を包含し、その結果によって、脳マラリアの罹患の指標とすることができる。
(Diagnosis of cerebral malaria based on CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system)
In another aspect, the invention provides markers for brain malaria, including at least one factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Alternatively, the present invention provides a method of identifying or diagnosing brain malaria using any of the at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system or a substance that binds to an expression product thereof. Here, if the expression of any one of the factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system of the target sample is elevated compared to that of the normal sample, the target sample is diagnosed as having brain malaria. .. Such a diagnosis can be made using a binder or detection agent as described below. Therefore, the method of the present invention includes the step of examining the expression of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system of the target sample, and the result can be used as an index of cerebral malaria morbidity. it can.
このＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系は、本明細書の他の箇所で説明されるように、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいい、その模式図は図７に示される。「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」の因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７のほか、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン；ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９、ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）および他の樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞（ヒトの場合ＣＤ８Ｔ細胞）および他のＴ細胞などもこの因子として考慮することができる。 This CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system refers to a signal transduction pathway routed through CCL21, CXCR3 and CCR7, and refers to the pathogenic mechanism of cerebral malaria, as described elsewhere in this specification. , The schematic diagram is shown in FIG. Factors of the "CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system" are selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, as well as IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG). One inflammatory cytokine; CCL21 and / or CCL19, CD8α dendritic cells (DCs) and other dendritic cells, CD11c + CD8T cells (CD8T cells in humans) and other T cells should also be considered as this factor. Can be done.
典型的な実施形態としては、本発明で使用されるＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つを含む。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７の各因子については、脳マラリアとの関連が知られておらず、本発明は、このゆな経路および各々の因子を脳マラリアの診断または検出の指標として使用することができることを初めて提供する。 In a typical embodiment, at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention is from CCL21, CXCR3, CCR7, and the nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. Includes at least one selected from the group of The association of each factor of CCL21, CXCR3, and CCR7 with brain malaria is not known, and the present invention can use this path and each factor as an index for diagnosis or detection of brain malaria. Offer for the first time.
別の実施形態では、本発明において使用されるＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに加えて、或いはそれと代替的に以下：
（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９
（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞（ヒトの場合ＣＤ８Ｔ細胞）および他のＴ細胞
からなる群より選択される、少なくとも１つの因子を含む。
In another embodiment, at least one factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention consists of CCL21, CXCR3, CCR7, and the nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. In addition to, or in lieu of, at least one of the more selected:
(1) At least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG), nucleic acids encoding them, their expression products and their origins. At least one selected from the group of things;
(2) CCL21 and / or CCL19
It contains at least one factor selected from the group consisting of (3) CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) CD11c + CD8T cells (CD8T cells in humans) and other T cells.
より詳細な実施形態では、本発明の検出または診断は、以下：
（Ａ）嗅球におけるＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９の発現上昇；
（Ｂ）皮質におけるＩＦＮ−γの発現上昇；
（Ｃ）前記ＣＤ８α樹状細胞は、ＣＣＲ７依存的にプライミングされるものが観察されること；および／または
（Ｄ）脳または脾臓においてＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞が観察されること
を脳マラリアの発症の指標とすることができるがこれらに限定されない。
In a more detailed embodiment, the detection or diagnosis of the invention is as follows:
(A) Increased expression of CCL21 and / or CCL19 in the olfactory bulb;
(B) Increased expression of IFN-γ in the cortex;
(C) The CD8α dendritic cells are observed to be CCR7-dependently primed; and / or (D) CD11c + CD8T cells are observed in the brain or spleen, which is an indicator of the development of brain malaria. However, it is not limited to these.
前記脳マラリアは、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる。 The brain malaria is described in P.I. It is caused by the human Plasmodium corresponding to the Plasmodium selected from the group consisting of falcipalum.
１つの特定の実施形態では、本発明が対象とする脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものを包含する。 In one particular embodiment, the brain malaria of the present invention includes those of rodents or primates.
特定の実施形態では、本発明は、本発明が使用するＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、配列番号１、３、５等に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物または配列番号２、４、６等に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物を含む。 In certain embodiments, the present invention comprises at least one factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention as the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, etc. or a fragment thereof or an equivalent thereof. Alternatively, the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, etc., a fragment thereof, or an equivalent thereof is included.
特定の実施形態では、本発明のマーカーは
（１）ＣＣＬ２１タンパク質またはこれをコードする核酸；
（２）ＣＸＣＲ３またはこれをコードする核酸；および／または
（３）ＣＣＲ７タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む。
In certain embodiments, the markers of the invention are: (1) CCL21 protein or nucleic acid encoding it;
It comprises (2) CXCR3 or a nucleic acid encoding it; and / or (3) a CCR7 protein or a nucleic acid encoding it.
別の局面では、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤を提供する。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系が脳マラリアに関連していることは本発明において初めて見出されたものであり、これを利用した検出、検査、または診断も本発明によって初めて実現された。 In another aspect, the invention binds to at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, as well as at least one selected from the group consisting of nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. Provided are a detection agent or a diagnostic agent for brain malaria containing a substance. It was first discovered in the present invention that the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is associated with cerebral malaria, and detection, examination, or diagnosis using this was also realized for the first time by the present invention.
本発明において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の異常（発現増加等）は、脳マラリアの指標となることが見出された。従って、本発明によれば、対象となる被験者またはそれに由来する試料（例えば、細胞試料、脳髄液、血清等）においてＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することにより、脳マラリアを検出または選択することができる。また、従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、脳マラリア治療を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。 In the present invention, it has been found that abnormalities (increased expression, etc.) of factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system are indicators of brain malaria. Therefore, according to the present invention, brain malaria is detected by detecting the expression of a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system in a target subject or a sample derived from the subject (for example, cell sample, cerebrospinal fluid, serum, etc.). Can be detected or selected. Further, therefore, it is understood that a drug for treating brain malaria can be detected and screened by using the regulatory ability such as reduction, suppression, increase or activation of the marker of the present invention as an index.
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合または相互作用する物質を含む、脳マラリアを識別するための検出剤、検査剤または診断剤を提供する。このような検出、検査または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。 In another aspect, the invention provides a detector, test or diagnostic agent for identifying brain malaria, which comprises a substance that binds to or interacts with a factor in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. For such detection, testing or diagnosis, the binding of substances is preferably specific.
このような検出剤、検査剤または診断剤は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸、特にＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を増幅し得る核酸プライマーもしくはＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合もしくは相互作用し得るプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。 As such a detection agent, a test agent or a diagnostic agent, any substance may be utilized as long as it can bind to or interact with a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system, and for example, a representative thereof. Examples include antibodies or fragments or functional equivalents of these factors, or nucleic acids encoding these factors, particularly nucleic acid primers or CCL21-CXCR3- capable of amplifying factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Probes capable of binding or interacting with factors in the CCR7 signaling system can be mentioned, but not limited to.
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出キット、検査キットまたは診断キットとして利用することができる。 The detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention can be used as a detection kit, test kit or diagnostic kit.
１つの実施形態では、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出、検査または診断可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、2以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する2以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。2以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。 In one embodiment, the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention is a complex in which another substance (for example, a label) is bound to a portion (for example, an antibody) that can be detected, tested or diagnosed. Alternatively, it may be a complex molecule. As used herein, "complex" or "complex molecule" means any construct that includes two or more moieties. For example, if one portion is a polypeptide, the other portion may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.). .. In the present specification, two or more portions constituting the complex may be bonded by covalent bonds or other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). It may have been done. When two or more parts are polypeptides, it can also be called a chimeric polypeptide. Therefore, in the present specification, the "complex" includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現は脳マラリアの指標であり、指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、脳マラリアを識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、1つの実施形態では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖cDNAも組織insituハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖cDNAも含まれる。組織中のRNAの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、RNAプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。 The detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention can take the form of a probe and a primer. The probes and primers of the present invention can specifically hybridize with factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7. As described herein, the expression of factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7 is an indicator of brain malaria and is useful as an indicator. Therefore, the probes and primers according to the invention can be used to identify brain malaria. The probes and primers of the present invention, in one embodiment, need only be able to detect the expression of factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, and multiple deoxyribonucleic acid (DNA) or ribo. Refers to a polymer consisting of bases or base pairs such as nucleic acid (RNA). Double-stranded cDNAs are also known to be available for tissue in situ hybridization, and the probes and primers of the invention also include such double-stranded cDNAs. RNA probes (riboprobes) can be mentioned as particularly preferable probes and primers for detecting RNA in tissues.
特定の実施形態において、本発明はプライマーの形態をとることができる。通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70％相同な、より好ましくは、少なくとも80％相同な、さらに好ましくは、少なくとも90％相同な、少なくとも95％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。 In certain embodiments, the invention can take the form of a primer. Nucleic acid molecules commonly used as primers include those having a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotide lengths that is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest (eg, SEQ ID NO: 1). Such nucleic acid sequences preferably have at least 12 contiguous nucleotide lengths, preferably at least 9 contiguous nucleotide lengths, more preferably at least 10 contiguous nucleotide lengths, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotide lengths. Of at least 13 contiguous nucleotide lengths, at least 14 contiguous nucleotide lengths, at least 15 contiguous nucleotide lengths, at least 16 contiguous nucleotide lengths, at least 17 contiguous nucleotide lengths, at least 18 Contiguous nucleotide length, at least 19 contiguous nucleotide lengths, at least 20 contiguous nucleotide lengths, at least 25 contiguous nucleotide lengths, at least 30 contiguous nucleotide lengths, at least 40 contiguous nucleotide lengths , Can be a nucleic acid sequence of at least 50 contiguous nucleotide lengths. Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, even more preferably at least 90% homologous, and at least 95% homologous to the sequences described above. Is included. The sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence for which synthesis (amplification) is intended, but those skilled in the art can appropriately design the primer according to the intended sequence. The design of such primers is well known in the art and may be done manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
特定の実施形態において、本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。特定の実施形態において、本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in situ PCR法、LAMP法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。 In certain embodiments, the primers according to the invention can also be used as a primer set consisting of two or more of the primers. In a specific embodiment, the primer and primer set according to the present invention are known to detect a target gene by utilizing a nucleic acid amplification method such as PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, in situ PCR method, LAMP method and the like. In the method, it can be utilized as a primer and a primer set according to a conventional method.
本発明によるプライマーセットはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、PCR法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質の二本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖DNAのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、LAMP法（WO00／28082号公報）においては、標的遺伝子に対して3’末端側からF3c、F2c、F1cという3つの領域を、5’末端側からB1、B2、B3という3つの領域を、それぞれ規定し、この6つの領域を用いて4種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”MolecularCloning， A Laboratory Manual 2nd ed．”（Cold Spring Harbor Press（1989））、”CurrentProtocols in Molecular Biology”（John Wiley ＆ Sons（1987-1997））に従って実施することができる。 The primer set according to the present invention can be selected so that the nucleotide sequence of a target protein such as a factor of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7 can be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR method. Nucleic acid amplification methods are well known, and the selection of primer pairs in the nucleic acid amplification method is obvious to those skilled in the art. For example, in the PCR method, one of the two primers (primer pairs) is paired with the positive strand of the double-stranded DNA of the target protein such as a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7. , The primer can be selected so that the other primer pairs with the negative strand of the double-stranded DNA and the other primer pairs with the extension strand extended by one primer. In addition, in the LAMP method (WO00 / 28082), three regions of F3c, F2c, and F1c from the 3'end side and three regions of B1, B2, and B3 from the 5'end side are defined with respect to the target gene. , Each can be specified, and four types of primers can be designed using these six regions. The primers of the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequences disclosed herein. Preparation of the primer is well known, for example, carried out "MolecularCloning, A Laboratory Manual 2 nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989)), in accordance with "CurrentProtocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)) can do.
特定の実施形態において、本発明は「プローブ」の形態をとることができる。通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相同なまたは相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70％相同な、より好ましくは、少なくとも80％相同な、さらに好ましくは、少なくとも90％相同な、少なくとも95％相同な核酸配列が含まれる。 In certain embodiments, the invention can take the form of a "probe". Nucleic acid molecules commonly used as probes include those having at least 8 consecutive nucleotide length nucleic acids that are homologous or complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest (eg, SEQ ID NO: 1). Such nucleic acid sequences preferably have at least 12 contiguous nucleotide lengths, preferably at least 9 contiguous nucleotide lengths, more preferably at least 10 contiguous nucleotide lengths, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotide lengths. Of at least 13 contiguous nucleotide lengths, at least 14 contiguous nucleotide lengths, at least 15 contiguous nucleotide lengths, at least 16 contiguous nucleotide lengths, at least 17 contiguous nucleotide lengths, at least 18 Contiguous nucleotide length, at least 19 contiguous nucleotide lengths, at least 20 contiguous nucleotide lengths, at least 25 contiguous nucleotide lengths, at least 30 contiguous nucleotide lengths, at least 40 contiguous nucleotide lengths , At least a nucleic acid sequence of at least 50 contiguous nucleotide lengths. Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, even more preferably at least 90% homologous, and at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
1つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、タグを結合させたものであってもよい。本発明で使用される標識またはタグは、本明細書において説明された任意の形態をとることができる。 In one embodiment, the detection agent of the present invention can be labeled. Alternatively, the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention may have a tag bound thereto. The markers or tags used in the present invention can take any form described herein.
1つの局面において、本発明は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするための方法、あるいは脳マラリアを検出、検査または診断する方法を提供する。 In one aspect, the present invention presents a method for using CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7 as indicators for identifying brain malaria, or for detecting, testing or diagnosing brain malaria. Provide a method.
１つの実施形態では、本発明の方法では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするために、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAに結合する物質を含む検出剤、検査剤または診断剤を用いることができる。そのような検出剤、検査剤または診断剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、必要に応じて当該分野で公知の技術を用いて当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。 In one embodiment, in the method of the present invention, in order to use a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7 as an index for identifying brain malaria, for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc. CCL21-CXCR3-CCR7 can be carried out by performing a step of detecting an expression product of a factor of the signal transduction system, for example, protein or mRNA in vivo. For example, at that time, an expression product of a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7, for example, a detection agent, a test agent or a diagnostic agent containing a substance that binds to a protein or mRNA may be used. it can. Such a detection agent, a test agent or a diagnostic agent is described in the present specification, and a person skilled in the art implements the method of the present invention based on the description, if necessary, using a technique known in the art. It is understood that it can be done.
本発明の方法は、本発明の検出剤、検査剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAがあるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。 In the method of the present invention, the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention is brought into contact with a target sample, and CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc., which is the target object in the sample. The presence or absence of an expression product of a factor of the system, eg, protein or mRNA, or its level or amount is measured.
本発明において「接触」は、複数の物質の間の相互作用または結合が生じるようにその複数の物質を配置することであり、本発明では、検出剤、検査剤、診断剤として機能し得る物質（たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカーまたはそれを含む試料に対して物理的に近接させることによって達成することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。具体的なＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出する方法は、試料（例えば、血清等）におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。ここで、試料として使用されるものとしては、発現産物を含むと考えられる試料であればよく、例えば、血清を用いることができる。血清は慣用の方法により取得することができる。 In the present invention, "contact" is to arrange the plurality of substances so as to cause an interaction or bond between the plurality of substances, and in the present invention, a substance that can function as a detection agent, a test agent, and a diagnostic agent. It can be achieved either directly or indirectly by physical proximity (eg, a polypeptide or polynucleotide) to the marker of the invention or a sample containing it. The polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, a microtiter plate, a cell culture flask or a microarray (eg, a gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof. Specific methods for detecting CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction factor expression products such as CCL21, CXCR3, CCR7, for example, protein or mRNA can be described in CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in a sample (eg, serum). The expression product of the factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system, for example, a method capable of detecting a protein or mRNA is not particularly limited, and examples thereof include a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method. Here, the sample used may be any sample that is considered to contain an expression product, and for example, serum can be used. Serum can be obtained by conventional methods.
特定の実施形態では、本発明による検出、検査または診断は、本発明によるプローブを核酸試料（mRNA、またはそれから転写された相補的DNA（cDNA）等）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection9.47-9.58)、”Current Protocols in Molecular Biology”(John Wiley &Sons(1987-1997)、特にSection 6.3-6.4)、”DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.”(Oxford University(1995)、条件については特にSection 2．10）を参照しうる。 In certain embodiments, detection, testing or diagnosis according to the invention hybridizes a probe according to the invention to a nucleic acid sample (such as mRNA or complementary DNA (cDNA) transcribed from it) and hybridizes, ie, a hybridization complex. By directly or indirectly detecting nucleotide double strands, the expression of factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 in cell samples can be detected. For detailed procedures for hybridization techniques, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989), in particular Section9.47-9.58), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997), in particular Section 6.3-6.4), "DNA Cloning 1 :. Core Techniques, a Practical Approach 2 nd ed" (Oxford University (1995), may in particular refer to Section 2.10) are the conditions.
ハイブリダイゼーション法を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、ｍRNAの検出は、例えば、：（a）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（b）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（a）において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、32P、14C、および35S）、蛍光（例えば、FITC、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された試料は、被験者の組織がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。 The detection of expression products of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factors such as CCL21, CXCR3, CCR7 and the like using the hybridization method, for example, mRNA can be described, for example: It can be carried out by the step of contacting with the probe according to (b) and (b) the step of detecting the hybridization complex. In step (a), the mRNA prepared from the target test sample or the complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be contacted with the probe as a polynucleotide derived from the test cell sample. In the detection method using a probe, the probe can be labeled and used. As the label, for example, radioactive activity (eg, 32 P, 14 C, and 35 S), fluorescence (eg, FITC, europium), enzymatic reaction such as chemical color development (eg, peroxidase, alkaline phosphatase), etc. were used. Signs are mentioned. Detection of hybridization products can be performed using well-known methods such as Northern hybridization, Southern hybridization, and colony hybridization. The sample in which the hybridization complex is detected indicates that the tissue of the subject expresses a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7. It can be determined that the possibility of brain malaria is high.
本発明による検出、検査または診断の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（mRNAまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。 According to another embodiment of detection, testing or diagnosis according to the present invention, a nucleic acid sample (mRNA or a transcript thereof) is amplified by a nucleic acid amplification method using a primer or a primer set according to the present invention to detect the amplification product. Therefore, the expression of factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 in the sample can be detected, examined, or diagnosed using the same.
核酸増幅法を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、（i）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ii）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。 The detection of the expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 using the nucleic acid amplification method uses, for example, (i) a polynucleotide derived from a test sample as a template, and a primer or primer according to the present invention. It can be carried out by the step of carrying out the nucleic acid amplification method using the set; and (ii) the step of detecting the formed amplification product.
工程（i）において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP法等の核酸増幅法を用いて実施できる。この試料中に増幅産物が検出されることは、被験者の組織がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。 In step (i), mRNA prepared from the target test sample or complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be used as a template. The amplification product can be detected by using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, or a LAMP method. The detection of the amplification product in this sample indicates that the tissue of the subject expresses factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7, and therefore the subject from which the sample is derived. It can be determined that there is a high possibility of brain malaria.
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。 According to another embodiment of the detection according to the present invention, the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7 in the sample by contacting the antibody according to the present invention with the sample and detecting the antigen-antibody reaction. The expression of a factor can be detected, tested or diagnosed using it.
抗原抗体反応を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、（I）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（II）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、血清中のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。抗原抗体複合体が検出される試料は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現している細胞を含むので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。 Detection of the expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 using the antigen-antibody reaction is described, for example, in (I) contacting a protein derived from a test cell sample with an antibody according to the present invention. Steps; and (II) the step of measuring the antigen-antibody complex can be carried out. Methods for detecting antigen-antibody reactions are well known to those skilled in the art, and for example, factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 in serum can be detected by immunological methods. Immunological methods include immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, Western blotting, agglutination, and competition for samples that have undergone appropriate treatment of cell samples as needed, such as cell separation and extraction. Known methods such as method and sandwich method can be applied. The immunohistochemical staining method can be carried out by, for example, a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody against the antibody, or the like. As the labeling agent, known labeling substances such as fluorescent substances, radioactive substances, enzymes, metals and pigments can be used. Since the sample in which the antigen-antibody complex is detected includes cells expressing factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7, brain malaria is possible for the subject from which the sample is derived. It can be determined that the sex is high.
前記の各検出工程は1回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出、検査または診断方法によれば、前記の工程を2回以上行うことにより、脳マラリアの診断をより高精度に行うことができる。 The diagnostic accuracy of cerebral malaria can be improved by performing each of the above-mentioned detection steps not only once but also by repeating or combining the same steps. Therefore, when such an embodiment is adopted, according to the detection, inspection or diagnosis method according to the present invention, the diagnosis of brain malaria can be performed with higher accuracy by performing the above steps twice or more.
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の増殖マーカー遺伝子（例えば、既知のマーカーであるSCCまたはCEA等）あるいはこれらの因子を併用することにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。 In addition, other marker genes, preferably growth marker genes other than CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 (for example, known markers such as SCC or CEA) or these factors are used in combination. By doing so, the diagnostic accuracy of brain malaria can be improved.
本発明の診断薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。 The procedure for formulating the diagnostic agent of the present invention as a medicine or the like is known in the art, and is described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia, the United States Pharmacopeia, and the Pharmacopoeia of other countries. Therefore, those skilled in the art can determine an embodiment such as an amount to be used without undue experimentation, if described in the present specification.
1つの実施形態では、質量分析によってマーカーの濃度を測定することができる。この場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix−assisted laser desorption／ionization、MALDI）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ESI）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないMALDIが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time−of−flight mass spectromer、TOF）と組み合わせたMALDI−TOF−MSによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、2台の質量分析計を用いたMS／MSによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。 In one embodiment, the concentration of the marker can be measured by mass spectrometry. As the ionization method in this case, either matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) or electrospray ionization (ESI) can be applied, but the generation of polyvalent ions is small. MALDI is preferred. In particular, according to MALDI-TOF-MS combined with a time-of-flight mass spectromer (TOF), the marker concentration can be measured more accurately. Furthermore, according to MS / MS using two mass spectrometers, the marker concentration can be measured more accurately.
電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。SDS−PAGEだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（IEF）と組み合わせた2次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウェスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。 When measuring the concentration of a marker by electrophoresis, for example, the test material is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate the target marker, and the gel is stained with an appropriate dye or fluorescent substance. , The density and fluorescence intensity of the band corresponding to the target marker may be measured. If SDS-PAGE alone is not sufficient for marker separation, two-dimensional electrophoresis combined with isoelectric focusing (IEF) can also be used. In addition, Western blotting can be performed to measure the amount of markers on the membrane rather than detecting directly from the gel.
クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（HPLC）による方法を用いることができる。すなわち、試料をHPLCに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカーの濃度を測定することができる。 When measuring the concentration of a marker by chromatography, for example, a method by liquid high performance liquid chromatography (HPLC) can be used. That is, the concentration of the marker in the sample can be measured by subjecting the sample to HPLC to separate the target marker and measuring the peak area of the chromatogram.
1つの局面において、本発明によれば、本発明による検出、検査および／または診断のための方法を実施するための検出、検査および／または診断のためのキットが提供される。このキットは、本発明の検出剤、検査剤および／または診断剤を含む。その実施形態としては、本明細書において記載された任意の実施形態を単独または組み合わせ用いることができる。 In one aspect, the invention provides a kit for detection, examination and / or diagnosis for carrying out a method for detection, examination and / or diagnosis according to the invention. The kit contains the detection agent, test agent and / or diagnostic agent of the present invention. As the embodiment, any of the embodiments described herein can be used alone or in combination.
1つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。 In one embodiment, examples of the detection kit according to the present invention include a detection kit for carrying out the detection according to the present invention, and specifically, CCL21-CXCR3-CCR7 signals such as CCL21, CXCR3, and CCR7. Examples thereof include a kit for detecting the expression of a transmission system factor, which comprises at least the probe according to the present invention. The probe may be labeled. This detection kit detects the expression of factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7 by a hybrid forming method. Thus, the detection method of the first embodiment may optionally further include various reagents for carrying out the hybrid formation method, such as substrate compounds used in the detection of labels, hybridization buffers, instructions, and / or instruments. Can include.
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子（例えば、SCC、CEA等）の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を更に検出する。 The detection kit of this embodiment according to the present invention is a marker gene for brain malaria other than factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7 (for example, SCC, CEA) in order to perform highly accurate detection. Etc.) may be further included with a probe, primer, primer set, or antibody capable of detecting expression. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled. This detection kit expresses marker genes for brain malaria other than CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 by any of the hybrid formation method, nucleic acid amplification method, and antigen-antibody reaction method. Is further detected.
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、PCRが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。 In another embodiment, the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the detection of another embodiment according to the present invention, and specifically, CCL21-CXCR3 such as CCL21, CXCR3, and CCR7. -A kit for detecting the expression of a factor of the CCR7 signal transduction system, which includes at least the primer according to the present invention or the primer set according to the present invention. This detection kit detects the expression of factors in the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 by the nucleic acid amplification method. Thus, the detection method of the second aspect may optionally include various reagents for performing the nucleic acid amplification method, such as buffers, internal standards, instructions, and / or instruments indicating that PCR can proceed normally. Can be further included.
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカーの発現を更に検出する。 The detection kit of this embodiment according to the present invention can detect the expression of a marker gene for brain malaria other than the factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 in order to perform highly accurate detection. Additional probes, primers, primer sets, or antibodies may be included. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled. This detection kit expresses markers of brain malaria other than CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 by any of the hybrid formation method, nucleic acid amplification method, and antigen-antibody reaction method. Further detect.
さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばELISA法等に用いる2次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。 In a further embodiment, the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the detection of the further embodiment according to the present invention, and specifically, CCL21-CXCR3-CCR7 signals such as CCL21, CXCR3 and CCR7. Examples thereof include a kit for detecting a protein of a transmission system factor, which comprises at least an antibody according to the present invention. This antibody may be labeled. This detection kit detects the expression of factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, and CCR7 by detecting the antigen-antibody reaction. The detection method of this embodiment further comprises, if desired, various reagents for carrying out the antigen-antibody reaction, such as secondary antibodies used in the ELISA method and the like, color-developing reagents, buffers, instructions, and / or instruments. be able to.
これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。 These kits, compositions or systems are in samples from any subject as long as the markers of the invention (eg, factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7) can be identified. It can be understood that a marker, a factor that specifically interacts with the marker, or a means of selectively recognizing the marker can be used. Therefore, only the factors or means specifically described herein can be used. However, it is understood that any equivalent factor or means known in the art can be used.
1つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。 In one embodiment, the factor used in the present invention is selected from the group consisting of nucleic acid molecules, polypeptides, lipids, sugar chains, organic small molecules and complex molecules thereof, preferably the factor is a protein or complex. It is a molecule (eg, sugar protein, lipid protein, etc.). Preferably, the factor is an antibody (eg, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody). Such factors are preferably labeled or labelable. This is because it is easier to diagnose.
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、X線解析装置、SPR、クロマトグラフィー（例えば、HPLC、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、EIA（エンザイムイムノアッセイ）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素連結イムノソルベントアッセイ））、生化学的手段（例えば、pI電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（2DE−DIGE）、同位体標識法（ICAT）、タンデムアフィニティ精製法（TAP法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。 In a preferred embodiment of the invention, the means used are a mass analyzer, a nuclear magnetic resonance measuring instrument, an X-ray analyzer, SPR, chromatography (eg, HPLC, thin layer chromatography, gas chromatography), immunology. Target means (eg, western blotting, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radio-immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosolvent assay)), biochemical means (eg, pI electrophoresis, southern blotting, two-dimensional electrophoresis), Electrophoresis equipment, chemical analysis equipment, two-dimensional fluorescence differential electrophoresis (2DE-DIGE), isotope labeling method (ICAT), tandem affinity purification method (TAP method), physical means, laser microdissection and these. It is selected from the group consisting of the combination of.
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。 In a preferred embodiment of the invention, the system or kit of the invention further comprises a standard of markers. Such standards can be used to ascertain whether a marker's detection means (such as a factor that specifically interacts with the marker, or a means that selectively recognizes the marker) is functioning normally. preferable.
好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。 In a preferred embodiment, the invention may further comprise means for purifying the sample of interest. Examples of such purification means include chromatography and the like. Purification can be used in preferred embodiments because it can improve the accuracy of diagnosis, but this is not essential.
1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。 In one embodiment, the factors or means used in the present invention have the ability to quantify the markers of the present invention. Such quantification should be a means or factor that allows the calibration curve to be drawn properly when a standard curve is drawn. Preferably, for example, antibody, mass spectrometry, chromatography analysis and the like can be mentioned. Therefore, in certain embodiments, the system of the present invention further comprises a quantification means for quantifying the marker.
1つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。 In one embodiment, the quantification means includes a determination means that compares the standard curve with the measurement result to determine if the marker is within the normal range. Such a determination means can be realized by using a computer.
1つの実施形態では、本発明のキットまたはシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する因子を含む組成物を含む。 In one embodiment, the kit or system of the invention comprises a marker or a composition comprising a marker-specific interacting factor.
1つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態の予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、試料の取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、本明細書の他の場所において記載される任意の1または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（MS）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。 In one aspect, the invention presents the level or state of differentiation of a marker in a sample derived from a subject, a factor that specifically interacts with the marker, or a means of selectively recognizing the marker. Provided are its use in the manufacture of pharmaceuticals for predictive diagnosis, pre-diagnosis, prediction, detection or diagnosis of a disease, disorder or condition associated therewith. Here, the sample may be obtained by any means. Usually, when a person other than the doctor engages in the measurement, it may have been obtained by the doctor in some way. From the measurement results, whether the determination of the level of proliferative capacity or differentiation status, or the disease, disorder or condition associated therewith, or the possibility thereof, is abnormal compared to the normal value and compared to each marker. It can be carried out by determining. It is understood that the markers and the like used in the methods of the invention may have any one or more features described elsewhere herein as long as they do not conflict. In the detection or diagnosis of the present invention, as a method for measuring the concentration of a marker, a method generally used for quantification of a protein can be used as it is as long as the concentration of the marker can be specifically measured. For example, various immunoassays, mass spectrometry (MS), chromatography, electrophoresis and the like can be used.
本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。 One of the preferred embodiments in the detection or diagnosis of the present invention is to capture a marker on a carrier and measure the concentration of the captured marker. That is, a substance having an affinity for the marker is immobilized on the carrier, and the marker is captured on the carrier via the substance having the affinity. According to this embodiment, the influence of contaminants contained in the sample can be reduced, and the marker concentration can be measured with higher sensitivity and accuracy.
1つの実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を1次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる2種類の抗体を用意し、一方を1次抗体として担体に固定化し、他方を2次抗体として酵素標識し、サンドイッチEIAの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。 When an immunoassay is used as a marker measurement method in one embodiment, it is preferable to use an antibody-immobilized carrier. In this way, it is possible to easily construct an immunoassay system using an antibody immobilized on a carrier as a primary antibody. For example, two types of antibodies that are specific to markers and have different epitopes can be prepared, one can be immobilized on a carrier as a primary antibody, and the other can be enzymatically labeled as a secondary antibody to construct a sandwich EIA system. In addition, it is possible to construct an immunoassay system by a binding inhibition method or a competitive method. Furthermore, when a substrate is used as a carrier, immunoassay using an antibody chip is possible. According to the antibody chip, the concentrations of a plurality of markers can be measured at the same time, and rapid measurement is possible.
一方、1つの実施形態において、マーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（本明細書中「SELDI−TOF−MS」と称する）を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。 On the other hand, in one embodiment, when mass spectrometry is used as the method for measuring the marker, the marker can be captured on the carrier by ionic bonding or hydrophobic interaction in addition to the antibody. Ionic bonds and hydrophobic interactions are not as specific as bioaffinity between antigens and antibodies, and substances other than markers are also captured, but mass spectrometry is quantified by a mass spectrometer spectrum that reflects the molecular weight. No problem. In particular, using a protein chip using a substrate as a carrier, surface-enhanced laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (“SELDI” in the present specification. By performing (referred to as "-TOF-MS"), the concentration of the marker can be measured more accurately. As the types of substrates that can be used, cation exchange substrates, anion exchange substrates, normal phase substrates, reverse phase substrates, metal ion substrates, antibody substrates, etc. can be used, but cation exchange substrates, especially weak cation exchange, can be used. A substrate and a metal ion substrate are preferably used.
イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（DE）、ジエチルアミノエチル（DEAE）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、4級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（QA）、4級アミノエチル（ジエチル，モノ・2−ヒドロキシブチルアミノエチル）（QAE）、4級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（QMA）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（CM）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（SP）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、C4〜C20のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。 When the marker is captured on the carrier by ionic bonding, the ion exchanger is immobilized on the carrier. In this case, either an anion exchanger or a cation exchanger can be used as the ion exchanger, and further, a strong anion exchanger, a weak anion exchanger, a strong cation exchanger, and a weak cation exchanger can be used. Any of these can be used. For example, examples of the weak anion exchanger include those having a weak anion exchange group such as dimethylaminoethyl (DE) and diethylaminoethyl (DEAE). Examples of strong anion exchangers include quaternary ammonium (trimethylaminomethyl) (QA), quaternary aminoethyl (diethyl, mono-2-hydroxybutylaminoethyl) (QAE), and quaternary ammonium (trimethylammonium). ) (QMA) and the like having a strong anion exchange group. Further, examples of the weak cation exchanger include those having a weak cation exchange group such as carboxymethyl (CM). Further, examples of the strong cation exchanger include those having a strong cation exchange group such as sulfopropyl (SP). On the other hand, when the marker is captured on the carrier by hydrophobic interaction, a substance having a hydrophobic group is immobilized on the carrier. Examples of the hydrophobic group include an alkyl group of C4 to C20, a phenyl group and the like. Furthermore, the marker can be captured on a carrier on which metal ions such as Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ , Ca 2+ , Co 2+ , and Mg 2+ are immobilized.
1つの実施形態において、用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。 As an example of the carrier used in one embodiment, known ones such as beads, a microtiter plate, and a resin can be used. In particular, beads and a microtiter plate have been conventionally used in immunoassays, and it is easy to construct a measurement system. On the other hand, a carrier having a flat portion such as a substrate can also be used. In this case, it is preferable to immobilize a substance having an affinity for the marker on a part of the flat surface portion. An example is a carrier in which a chip is used as a base and a marker-specific antibody is immobilized on a plurality of spots on the surface thereof.
本発明による検出、検査または診断方法は、脳マラリアの予防または治療に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質をＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子またはそれをコードする核酸分子に対する結合または相互作用を指標に、有効な物質をスクリーニングすることができる。使用されうる被験物質としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、RNAi等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。被験物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、脳マラリアの治療または予防に有効な物質として用いることができる。 The detection, testing or diagnostic method according to the present invention can be applied to the screening of substances effective for the prevention or treatment of brain malaria. That is, an effective substance can be screened by using the test substance as an index for binding or interaction with a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7 or a nucleic acid molecule encoding the same. Test substances that can be used include synthetic low molecular weight compounds, proteins, synthetic peptides, purified or partially purified polypeptides, antibodies, bacterial release substances (including bacterial metabolites), nucleic acids (antisense, ribozyme, RNAi, etc.) and the like. These include, preferably, but are not limited to, compounds or salts thereof or solvates thereof (eg, hydrates). The test substance may be a novel substance or a known substance. The substance identified by the screening method according to the present invention can be used as an effective substance for the treatment or prevention of brain malaria.
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989). Short Protocols inMolecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates; Ausubel,F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates; Innis,M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press;Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley,and annual updates;Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
(General technology)
The molecular biological, biochemical, and microbiological methods used herein are well known and commonly used in the art, eg, Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning. : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, FM (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, FM (1989). Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, MA (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, FM (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, FM (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis , MA et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, FM (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , Wiley, and annual updates; Suninsky, JJ et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press These are incorporated herein by reference in their relevant parts (which may be all).
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait, M.J.(1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press; Gait,M.J.(1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press;Adams, R.L. et al.(1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova,Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M.et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T.(I996). Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。 For DNA synthesis techniques and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, MJ (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, MJ (1990). Oligonucleotide Synthesis: A. Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, RL et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, GM et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, GT (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, etc. These are incorporated herein by reference in the relevant parts.
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化DNA合成装置（Biosearch、Applied Biosystems等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Steinら（Stein et al., 1988,Nucl. Acids Res. 16:3209）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Sarin et al.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。 For example, in the present specification, it is also possible to synthesize the oligonucleotide of the present invention by a standard method known in the art, for example, by using an automated DNA synthesizer (commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). is there. For example, phosphorothioate oligonucleotides can be synthesized by the method of Stein et al. (Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209), or a regulatory pore glass polymer support (Sarin et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451), etc., can also be used to prepare methylphosphonate oligonucleotides.
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。 As used herein, "or" is used when "at least one" of the matters listed in the text can be adopted. The same applies to "or". When the specification "within the range of two values" is specified in the present specification, the range also includes the two values themselves.
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。 References such as scientific literature, patents, and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety to the same extent as each specifically described.
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described above by showing preferred embodiments for ease of understanding. Hereinafter, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided for purposes of illustration only, and are not provided for the purpose of limiting the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the embodiments and examples specifically described in the present specification, but is limited only by the scope of claims.
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、医薬基盤研究所において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D Systems、USCN Life Science INC等）の同等品でも代用可能である。
（材料および方法）
Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）
２種類の異なるＰｂＡ系統を使用した。これらのＰｂＡ系統の詳細（ＧＦＰ有、無）については、以前に記載されている（Coban, C.ら(2007). Int Immunol 19,67-79.；Ishino, T.ら(2006).Mol Microbiol 59, 1175-1184.；Zhao, H.ら(2012). Cell Host Microbe 12, 705-716.）。
Examples are described below. If necessary, the handling of animals used in the following examples was performed, if necessary, in compliance with the standards stipulated by the National Institute of Biomedical Innovation and based on the Declaration of Helsinki. Specifically, the products described in the examples were used as the reagents, but equivalent products of other manufacturers (Sigma-Aldrich, Wako Junyaku, Nakarai, R & D Systems, USCN Life Science INC, etc.) can be substituted.
(Materials and methods)
P. bergei ANKA (PbA)
Two different PbA strains were used. Details of these PbA strains (with and without GFP) have been previously described (Coban, C. et al. (2007). Int Immunol 19,67-79 .; Ishino, T. et al. (2006). Mol Microbiol 59, 1175-1184 .; Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705-716.).
動物および抗体によるインビボケモカインブロッキング
マウス
年齢と性別をマッチさせたＣ５７ＢＬ／６（ＣＬＥＡ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）または同腹仔マウス（Ｃｃｒ７＋／−）を野生型（ＷＴ）群として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＣｃｒ７−／−マウスは、Ｍ．ＭｉｙａｓａｋａおよびＭ．Ｈ．Ｊａｎｇ（大阪大学）によって提供され、以前に記載されたとおりに作製された（Forster, R.ら(1999). Cell 99,23-33.）。Ｂａｔｆ３−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させて、＋／−表現型を作製した。
Animal and antibody in vivo chemokine blocking mice Age- and gender-matched C57BL / 6 (CLEA, Osaka, Japan) or littermate mice (Ccr7 +/- ) were used as the wild-type (WT) group. C57BL / 6 background Ccr7 − / − mice were M.M. Miyasaka and M.M. H. Provided by Jang (Osaka University) and made as previously described (Forster, R. et al. (1999). Cell 99, 23-33.). Batf3 − / − mice were purchased from Jackson Laboratories and mated with C57BL / 6 mice to create a +/- phenotype.
野生型マウスに、ＰｂＡ感染の開始から３日間、エンドトキシンフリーの抗ＣＣＬ２１抗体またはアイソタイプコントロール（毎日マウス１匹あたり５０μｇ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を毎日静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。あるいは、感染後４日目および５日目に２回、抗ＣＸＣＲ３抗体（ＬＥＡＦ精製抗マウスＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３），マウス１匹あたり１００μｇ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を注射した。組み合わせ治療は、感染後４日目に抗ＣＸＣＲ３および抗ＣＣＬ２１抗体混合物を用いて行い、感染後５日目に抗ＣＣＬ２１抗体の注射を繰り返した。 Wild-type mice were injected daily intravenously (iv) with endotoxin-free anti-CCL21 antibody or isotype control (50 μg per mouse daily, Peprotech) for 3 days from the onset of PbA infection. Alternatively, anti-CXCR3 antibody (LEAF purified anti-mouse CD183 (CXCR3), 100 μg per mouse, BioLegend) was injected twice on the 4th and 5th days after infection. The combination therapy was performed with an anti-CXCR3 and anti-CCL21 antibody mixture on the 4th day after infection, and repeated injections of the anti-CCL21 antibody on the 5th day after infection.
サル
体重５ｋｇの雌性ニホンザル（Ｍａｃａｃａｆｕｓｃａｔａ）に、以前に記載されたように、１×１０９の凍結Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染赤血球（ＣＤＣ系統）をｉ．ｖ．接種し、毎日追跡した（Kawai, S.およびSugiyama, M. (2010).Acta Trop 114, 152-156.）。サルが重篤なマラリアの症状を示し、意識不明となった感染後１４日目の終わりに、ケタミン−ＨＣｌ（１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔をかけた後に検死解剖を行った。コントロールとして、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉｉを感染させたニホンザル１頭と、非感染コントロールとしてのカニクイザル１頭を用いた。
Monkeys Female Japanese macaques weighing 5 kg (Macacafuscata) were subjected to 1 × 10 9 frozen P. cerevisiae as previously described. Coatneyi-infected erythrocytes (CDC strain) i. v. Inoculated and followed daily (Kawai, S. and Sugiyama, M. (2010). Acta Trop 114, 152-156.). At the end of the 14th day after infection, when monkeys showed severe malaria symptoms and became unconscious, autopsy was performed after anesthesia by intramuscular injection of ketamine-HCl (15 mg / kg). As a control, P.I. One Japanese macaque infected with knowlesii and one cynomolgus monkey as a non-infection control were used.
全てのマウスおよびサルの実験は、独立行政法人 医薬基盤研究所および大阪大学のガイドライン、ならびに、日本実験動物学会公認の実験動物の使用に関する指針に従って行った。 All mouse and monkey experiments were conducted in accordance with the guidelines of the National Institute of Biomedical Innovation and Osaka University, and the guidelines for the use of laboratory animals officially recognized by the Japanese Society of Laboratory Animal Science.
ＭＲＩ脳イメージング
マウス頭部のＭＲＩイメージングは、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩスキャナ（ＡＶＡＮＣＥ−ＩＩ ５００ ＷＢ；Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）を用いて行った。ナイーブなマウスを、ＭＲＩ処理手順の間に１．０〜１．５％イソフルランで麻酔することにより、生体からの最初の像と、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定した死亡マウスからの像とを比較した。この比較から、両者に有意な差がないことが示唆された（図１Ｅ）。それゆえ、この後の実験においては、深麻酔をかけた感染マウスを、ＰＦＡ中で固定し、ＭＲＩによって可視化した。以下のパラメーターでＴ２＊強調画像（ＦＬＡＳＨシーケンス）および拡散強調画像（ＤＷＩ；スピンエコーシーケンス）を用いて出血を検出した：１）Ｔ２＊強調細密画像：視野，１５ｍｍ×１５ｍｍ；マトリックスサイズ，５１２×５１２；スライス厚，０．３ｍｍ；繰り返し時間，４５０ｍｓ；エコー時間，６．０ｍｓ；平均，６４；スキャン時間，４時間５分。２）Ｔ２＊強調通常画像：視野，２０ｍｍ×２０ｍｍ；マトリックスサイズ，２５６×２５６；スライス厚，０．５ｍｍ；繰り返し時間，４００ｍｓ；エコー時間，６．０ｍｓ；平均，１６；スキャン時間，２７分。３）ＤＷＩ：視野，１５ｍｍ×１５ｍｍ；マトリックスサイズ，５１２×５１２；スライス厚，０．３ｍｍ；繰り返し時間，６０００ｍｓ；エコー時間，２１．０ｍｓ；ｂ値，１０００ｓ／ｍｍ２；平均，９；スキャン時間，７時間４１分。
MRI Brain Imaging MRI imaging of the mouse head was performed using an ultra-high magnetic field 11.7T MRI scanner (AVANCE-II 500 WB; Bruker BioSpin). Naive mice were anesthetized with 1.0-1.5% isoflurane during the MRI treatment procedure to produce initial images from living organisms and images from dead mice fixed with 4% paraformaldehyde (PFA). Compared. This comparison suggested that there was no significant difference between the two (Fig. 1E). Therefore, in subsequent experiments, deeply anesthetized infected mice were fixed in PFA and visualized by MRI. Bleeding was detected using T2 * weighted image (FLASH sequence) and diffusion weighted image (DWI; spin echo sequence) with the following parameters : 1) T2 * weighted detailed image: visual field, 15 mm x 15 mm; matrix size, 512 x 512; slice thickness, 0.3 mm; repeat time, 450 ms; echo time, 6.0 ms; average, 64; scan time, 4 hours and 5 minutes. 2) T2 * emphasized normal image: field of view, 20 mm x 20 mm; matrix size, 256 x 256; slice thickness, 0.5 mm; repeat time, 400 ms; echo time, 6.0 ms; average, 16; scan time, 27 minutes. 3) DWI: Field of view, 15 mm x 15 mm; Matrix size, 512 x 512; Slice thickness, 0.3 mm; Repeat time, 6000 ms; Echo time, 21.0 ms; b value, 1000 s / mm 2 ; Average, 9; Scan time , 7 hours 41 minutes.
薄型頭蓋外科手術および多光子イメージング
生体マウス内のＯＬＦを可視化するために、マウスを、ケタミン（０．１３ｍｇ／ｇ）およびキシラジン（０．０１ｍｇ／ｇ）の筋肉内注射により絶えず麻酔しながら、以前に記載された外科的「薄型頭蓋（ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ）」技術をＯＬＦ領域用に改良した（Sawada,M.ら、(2011). J Neurosci 31,11587-11596.；Wake,H.ら(2009). J Neurosci 29, 3974-3980.）。簡単に述べると、定位固定ステージ上にイヤーバーを用いてマウスの頭部を固定した。双眼実体顕微鏡下で、高速ドリル（Ｍｉｎｉｍｏ，ミニター株式会社）および手術用メスを用いて、ＯＬＦ上の頭蓋を注意深く薄く（約２０〜３０μｍ）した。その領域上の頭蓋に金属リングを取り付け、実験の間、薄くした領域を湿った状態に維持した。イメージングは、１〜２．５倍のデジタルズームにて、水浸対物レンズ（ＸＬＰＬＮ２５ＸＷＭＰ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた顕微鏡（ＦＶ１０００ＭＰＥ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて行った。ＯＬＦの血管構造をテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）−デキストラン（５ｍｇ／マウス）（Ｔ１２８７，Ｓｉｇｍａ）を静脈内注射することにより可視化し、Ｔ細胞を、ブリリアントバイオレット４２１を結合させたＴＣＲ−β（Ｈ５７−５９７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１０μｇ、またはＣＤ８α（５３−６．７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）５μｇにより標識した。チタンサファイアレーザー（ＭａｉＴａｉ Ｈｐ，Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ）をＴ細胞および血管用に８００ｎｍの励起波長にチューニングし、そして、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）をＧＦＰ−ＰｂＡ用に９５０ｎｍの励起波長にチューニングした。３０〜８０のｚ平面を含む蛍光画像スタックを連続的に繰り返し取得することによって、小さなＯＬＦ領域のコマ撮りイメージング［１．１０９５秒あたり５０７．９３４μｍ（ｘ），５０７．９３４μｍ（ｙ），５μｍ（ｚ）］を行った（１つのスタック画像の取得には、取得するｚ平面の数に応じて約４０〜９０秒を要する）。典型的なイメージングの深さは、軟膜表面から８０〜１５０μｍであり、これは、糸球層に対応していた（図２Ａ〜Ｂ）（Chaigneau,E.ら、(2003). Proc Natl Acad Sci U SA 100, 13081-13086.）。ケタミンおよびキシラジンの混合物の断続的な筋肉内注射は、動物を１〜２時間にわたりモニタリングすることを可能にした。各マウスについて１回だけイメージングを行った。全てのイメージングデータは、Ｖｅｌｏｃｉｔｙソフトウェアを用いて処理および分析した。
Thin Cranial Surgery and Multiphoton Imaging Previously, mice were constantly anesthetized with intramuscular injections of ketamine (0.13 mg / g) and xylazine (0.01 mg / g) to visualize OLF in living mice. The surgical "thinned-skull" technique described in is improved for the OLF region (Sawada, M. et al., (2011). J Neurosci 31,11587-11596 .; Wake, H. et al. (2009). ). J Neurosci 29, 3974-3980.). Briefly, the mouse head was fixed on the stereotaxic stage using ear bars. Under a binocular stereomicroscope, the skull on the OLF was carefully thinned (about 20-30 μm) using a high-speed drill (Minimo, Minitor Co., Ltd.) and a scalpel. A metal ring was attached to the skull over the area to keep the thinned area moist during the experiment. Imaging was performed using a microscope (FV1000MPE, Olympus) equipped with a water immersion objective lens (XLPLN25XWMP, Olympus) at a digital zoom of 1 to 2.5 times. The vascular structure of the OLF was visualized by intravenous injection of tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) -dextran (5 mg / mouse) (T1287, Sigma), and T cells were visualized by TCR-β (TCR-β) to which brilliant violet 421 was bound. Labeled with 10 μg of H57-597, BioLegend) or 5 μg of CD8α (53-6.7, BioLegend). A titanium sapphire laser (MaiTai Hp, Spectral Physics) was tuned to an excitation wavelength of 800 nm for T cells and blood vessels, and a Chameleon laser (Coherent) was tuned to an excitation wavelength of 950 nm for GFP-PbA. Time-lapse imaging of small OLF regions by continuously and repeatedly acquiring a stack of fluorescent images containing 30-80 z-planes [507.934 μm (x), 507.934 μm (y), 5 μm per 1.1095 seconds. z)] was performed (it takes about 40 to 90 seconds to acquire one stack image, depending on the number of z planes to be acquired). A typical imaging depth was 80-150 μm from the pia mater surface, which corresponded to the glomerular layer (Figs. 2A-B) (Chaigneau, E. et al., (2003). Proc Natl Acad Sci. U SA 100, 13081-13086.). Intermittent intramuscular injections of a mixture of ketamine and xylazine made it possible to monitor animals for 1-2 hours. Imaging was performed only once for each mouse. All imaging data was processed and analyzed using Velocity software.
血管直径の測定
糸球に近い深部層における血管の直径を、Ｚ像スタックの取得し、これを二次元画像へと投影することによって測定した。次いで、血管の内径を、以前に記載されたとおりに測定した（Chaigneau,E.ら、(2003). Proc Natl Acad Sci U SA 100, 13081-13086.）。
ＢＢＢ透過性の評価
示す時点において、マウスに、１％エバンスブルー染料（Ｓｉｇｍａ）２００μｌをｉ．ｖ．注射した。２時間後にマウスを屠殺し、脳を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、そして、解剖顕微鏡下で脳の像を撮影した。
Measurement of blood vessel diameter The diameter of blood vessels in the deep layer near the filament was measured by acquiring a Z-image stack and projecting it onto a two-dimensional image. The inner diameter of the blood vessel was then measured as previously described (Chaigneau, E. et al. (2003). Proc Natl Acad Sci U SA 100, 13081-13086.).
Evaluation of BBB Permeability At the time of indication, mice were given 200 μl of 1% Evans Blue Dye (Sigma) i. v. I injected it. After 2 hours, the mice were sacrificed, the brains were removed, washed with PBS and images of the brains were taken under an anatomical microscope.
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析
脳サンプルをホモジナイズし、総ＲＮＡを単離し、そして、ｑ−ＰＣＲを以前に記載されたとおりに実施した（Zhao, H.ら(2012). Cell HostMicrobe 12, 705-716.）。マラリア感染を、ＰｂＡ １８Ｓ ｒＲＮＡに特異的なプライマーを用いて定量した。全てのプライマーは、Ａｓｓａｙｓ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。
Quantitative real-time reverse transcription PCR analysis Brain samples were homogenized, total RNA was isolated, and q-PCR was performed as previously described (Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705- 716.). Malaria infection was quantified using primers specific for PbA 18S rRNA. All primers were purchased from Assays on Demand (Applied Biosystems).
食料埋設試験
食料埋設試験を、以前に記載されたとおりに実施した（Yang, M.およびCrawley, J.N. (2009).Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24.）。簡単に述べると、マウスを、１８時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ１ｃｍ下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。１５分が経過してもマウスが埋設された食料を見つけられなかった場合、試験を中止し、その時間を９００秒（潜伏スコア，＞＞＞）として記録した。
Food burial test A food burial test was performed as previously described (Yang, M. and Crawley, JN (2009). Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24.). Briefly, mice were left food-free for 18 hours and then transferred to new cages, including bedding, at random corners of the cage, with food buried approximately 1 cm below the surface. The time it took for the mice to find the buried food was recorded. If the mice did not find the buried food after 15 minutes, the test was discontinued and the time was recorded as 900 seconds (latent score, >>>).
組織学
脳を摘出し、以前に報告されたとおりに免疫組織化学（ＩＨＣ）のために調製した（Zhao, H.ら(2012). Cell HostMicrobe 12, 705-716.）。以下の抗体を使用した：抗マウスＴＥＲ１１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＺＯ−１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＣＬ２１抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＰＥＣＡＭ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＧＦＡＰ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。切片は、蛍光またはＬＳＭ ７８０共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
Histology The brain was removed and prepared for immunohistochemistry (IHC) as previously reported (Zhao, H. et al. (2012). Cell HostMicrobe 12, 705-716.). The following antibodies were used: anti-mouse TER119 antibody (Biolegend), ZO-1 antibody (Invitrogen), CCL21 antibody (Peprotech), PECAM antibody (BD Harmingen) and GFAP antibody (DakoCytomation). Sections were observed using a fluorescence or LSM 780 confocal laser scanning microscope (Zeiss, Germany).
温度のモニタリング
継続的な発熱を記録するために、内製のサーマルモニタリングシステムを備えたマウスのケージを開発した（Aoshiら、論文投稿準備中、特開２０１２−２３１７２５参照）。ケージは、１２時間−１２時間の明暗サイクルを持ち、そして、食料および水への自由なアクセスが可能な、環境温度が３０℃に制御されたインキュベーターのように調製した。マウスの背の毛を電気バリカンで取り除き、背の皮膚温度を、インキュベーターの内側に備え付けたＦＬＩＲ ｂ６０サーマルカメラによって１分間隔で連続的に記録し、そして、データを、ＱｕｉｃｋＰｌｏｔソフトウェア（ＦＬＩＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）により分析した。
Temperature monitoring A mouse cage equipped with an in-house thermal monitoring system was developed to record continuous fever (Aoshi et al., Preparing to submit a paper, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-231725). The cage was prepared like an incubator with an environmental temperature controlled to 30 ° C. with a 12-12 hour light-dark cycle and free access to food and water. The hair on the back of the mouse was removed with an electric clipper, the skin temperature on the back was continuously recorded at 1 minute intervals by a FLIR b60 thermal camera installed inside the incubator, and the data was recorded by the QuickPlot software (FLIR Systems, Inc.). ) Was analyzed.
フローサイトメトリー分析
脾臓および脳の細胞を、以前に記載されたとおりに精製した（Coban, C.ら(2007). Int Immunol 19,67-79.；Zhao, H.ら(2012).Cell Host Microbe 12, 705-716.）。細胞表面を、ＡＰＣ−ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＰＥ−ＣＤ４（ＲＭ ４−５）、ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５−ＣＤ８α（５３−６．７）、ＰＥ Ｃｙ７−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＡＰＣ Ｃｙ７−ＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）、ＡＰＣ−ＣＣＲ７（４Ｂ１２）、ＡＰＣ−ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＰＥ ＣＹ７−ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）およびＡＰＣ Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）で染色した。これらの抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。サンプルを、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上に取り込み、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。細胞内ＩＦＮγ染色には、脾細胞をブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）の存在下で２時間インキュベートし、細胞を回収して、細胞内染色プロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってＩＦＮγで染色した。
Flow cytometric analysis Spleen and brain cells were purified as previously described (Coban, C. et al. (2007). Int Immunol 19,67-79 .; Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705-716.). APC-CD11c (HL3), PE-CD4 (RM 4-5), PerCp Cy5.5-CD8α (53-6.7), PE Cy7-CD3 (145-2C11), APC Cy7-TCRβ ( H57-597), APC-CCR7 (4B12), APC-CD44 (IM7), PE CY7-CD11c (HL3) and APC Cy7-CD11b (M1 / 70). These antibodies were purchased from BD Biosciences (San Jose, CA) and BioLegend (San Diego, CA). Samples were captured on BD LSRFortessa flow cytometers and analyzed using FlowJo software. For intracellular IFNγ staining, splenocytes were incubated for 2 hours in the presence of Breferdin A (10 μg / ml, Sigma), cells were harvested and stained with IFNγ according to the intracellular staining protocol (eBioscience).
トランスウェル移動アッセイ
４８ウェルのトランスウェルプレート（５μｍ孔径，Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）を、以前に記載されたとおりに、化学走性アッセイに使用した（Rappert,A.ら、(2002). J Immunol 168,3221-3226.）。簡単に述べると、無血清ＤＭＥＭ中に指定した濃度で希釈した組換えタンパク質ＣＣＬ２１および／または抗ＣＣＬ２１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、下側の区画に充填した。感染後６日目の感染動物由来の、Ｂ細胞およびＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ４＋細胞を枯渇させた後に濃縮された脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞を、上側のウェルに三連で加え（５×１０６／ウェル）、３７℃にて２時間無血清ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。リンパ球に対する強力な化学走性リガンドであるヒトＳＤＦ−１α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）をポジティブコントロールとして使用した。ＣＤ１１ｃ＋ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の移動率を、フローサイトメーターにより全細胞をカウントすることによって計算した。ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール群の移動に対して標準化し、コントロールに対する割合（％）として表した。
Transwell Transfer Assay A 48-well transwell plate (5 μm pore size, Costar, Corning Inc.) was used in the chemotaxis assay as previously described (Rappert, A. et al., (2002). J Immunol. 168,3221-3226.). Briefly, the lower compartment was filled with recombinant protein CCL21 and / or anti-CCL21 antibody (R & D Systems) diluted in serum-free DMEM to the specified concentration. Day 6 from infected animals after infection, B cells and CD11b + spleen CD8 T cells enriched after the cells and CD4 + cells were starved, added in triplicate to the upper wells (5 × 10 6 / well ), Infected in serum-free DMEM medium at 37 ° C. for 2 hours. Human SDF-1α (Peprotech, Inc.), a potent chemotactic ligand for lymphocytes, was used as a positive control. The migration rate of CD11c + CXCR3 + CD8 T cells was calculated by counting all cells with a flow cytometer. Chemokine-induced migration was standardized for migration of the unstimulated control group and expressed as a percentage of control.
血清サイトカイン
感染後５日目に採血を行い、マウスＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によってサイトカインおよびケモカインの検出を行った。
Serum Cytokines Blood was collected 5 days after infection, and cytokines and chemokines were detected by mouse Bio-Plex (Bio-rad).
養子免疫実験
ＰｂＡＮＫＡ感染後５日目のＲａｇ２−／−マウスから総脾細胞を調製し、脾臓ＣＤ８α＋ＤＣを濃縮した。簡単に述べると、抗マウスＣＤ１１ｂマイクロビーズ（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＤ１１ｂ−集団をネガティブ選択し、その後、ＣＤ４＋集団を除去した（Ｌ３Ｔ４，ＭＡＣＳ）。残った濃縮ＣＤ８α＋ＤＣ（２０×１０６細胞）を、０日目にＰｂＡ感染の２時間前にレシピエントマウスにｉ．ｖ．注入した。ポジティブ選択したＣＤ８α＋ＤＣ細胞集団の純度および表現型は、養子免疫の前にフローサイトメトリーにより評価し、典型的には、９５％超の純度であることが分かった（図６Ｉ）。
統計解析
２群間の差は、両側対応無しのStudentのｔ検定またはノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｐｒｉｓｍソフトウェア）のいずれかを用いて統計的有意差について解析した。生存曲線については、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
Adoptive immunoassay Experiment Total splenocytes were prepared from Rag2 − / − mice 5 days after PbANKA infection , and spleen CD8α + DC was concentrated. Briefly, anti-mouse CD11b microbeads (MACS, Miltenyi Biotec., Germany) were used to negatively select the CD11b- population, followed by removal of the CD4 + population (L3T4, MACS). The remaining concentrated CD8α + DC (20 × 10 6 cells), the recipient mice 2 hours before PbA infected on day 0 i. v. Injected. The purity and phenotype of the positively selected CD8α + DC cell population was evaluated by flow cytometry prior to adoption and was typically found to be> 95% pure (FIG. 6I).
Statistical analysis Differences between the two groups were analyzed for statistically significant differences using either Student's t-test without bilateral correspondence or nonparametric Mann-Whitney test (Prism software). For the survival curve, a Log-rank (Mantel-Cox) test was performed. p <0.05 was considered statistically significant.
（実施例１：脳マラリアと嗅球の関係性の解明）
実施例１では、マウスモデルを用いて、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を行った。
(Example 1: Elucidation of the relationship between brain malaria and the olfactory bulb)
In Example 1, a mouse model was used to perform an experiment on the relationship between brain malaria and the olfactory bulb.
（超高磁場ＭＲＩイメージング）
本実施例ではまず、超高磁場ＭＲＩイメージングは嗅球をＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ寄生虫より引き起こされる脳マラリア中の脳における微小出血の場所として同定した。
(Ultra-high magnetic field MRI imaging)
In this example, first, ultra-high magnetic field MRI imaging uses the olfactory bulb as a P. It was identified as the location of microhemorrhages in the brain during cerebral malaria caused by the berghei ANKA parasite.
マウスの脳内の変化を研究し、ＥＣＭに関連する病理を可視化するために、本発明者らは、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩ（Mori, Y.ら(2011). Magn Reson MedSci 10, 219-227.）を行った。方向感覚の喪失や麻痺といった特定のＥＣＭ症状が始まったＰｂＡ感染から６日後に、１１．７Ｔ ＭＲＩは、両側のＯＬＦにおいて暗いはっきりとしたスポットを示し（図１Ａの冠状断面および図１Ｅ）、大脳または小脳を含む脳の他の部分はこのようなスポットを示さなかった（図１Ａの矢状断面）。拡散強調画像（ＤＷＩ）を取得すると、ＯＬＦ領域の細部がより明らかとなり、これは、組織学的な詳細と顕著に類似しており、低密度の領域がヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色による出血部位と対応していた（図１Ｂおよび１Ｃ）。本発明者らはまた、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、出血（ＴＥＲ１１９＋赤血球）とＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫がＯＬＦの同じ領域に存在し、その領域が顆粒細胞層（ＧＧＬ）と同じくらい深部であったことを確認した（図１Ｄ）。本発明者らは、より早い時点のＯＬＦ内のＭＲＩを追加で行ったが、感染後６日目よりも前には変化は検出されなかった（図１Ｆ）。さらに、症状発症後のいくつかのＭＲＩ画像は、おそらく進行性の疾患状態を引き起こしているＯＬＦにおいて、異なる程度の微小出血の重症度を示した（図３Ｈ、Ｉ）。これに対し、ＯＬＦにおいて重度の出血が生じていても、ＭＲＩでは脳の他の部分における微小出血の明らかな証拠は見られなかった（図３Ｈ、Ｉ）。加えて、致死性の寄生虫Ｐ．ｙｏｅｌｉｉＬ（ＰｙＬ）に感染したマウスは、ＭＲＩではそのＯＬＦにおける微小出血が検出されなかった（図３Ｈ、Ｉ）。それゆえ、より低磁場のＭＲＩではなく、本発明者らの超高磁場ＭＲＩセッティングが、嗅球を、ＰｂＡ感染の間に攻撃されやすく、脳の他の部分と比較して出血が起こりやすい領域として同定することを可能にしたと考えるのが合理的である。 To study changes in the brain of mice and visualize pathologies associated with ECM, we have ultra-high magnetic field 11.7T MRI (Mori, Y. et al. (2011). Magn Reson MedSci 10, 219). -227.) Was performed. Six days after PbA infection, when certain ECM symptoms such as disorientation and paralysis began, 11.7T MRI showed dark, distinct spots in bilateral OLFs (coronal section of FIG. 1A and FIG. 1E), cerebrum. Alternatively, other parts of the brain, including the cerebellum, did not show such spots (sagittal section of FIG. 1A). Diffusion-weighted imaging (DWI) reveals more details in the OLF region, which is strikingly similar to histological details, with low-density regions being hematoxylin-eosin (HE) -stained bleeding sites. (FIGS. 1B and 1C). We also use immunohistochemistry (IHC) to present bleeding (TER119 + erythrocytes) and GFP-PbA parasites in the same region of the OLF, as deep as the granule cell layer (GGL). It was confirmed that it was present (Fig. 1D). We performed additional MRI within the OLF at an earlier point in time, but no changes were detected prior to day 6 after infection (Fig. 1F). In addition, some MRI images after the onset of symptoms showed varying degrees of microbleeding severity in OLF, which probably caused a progressive disease state (FIGS. 3H, I). In contrast, MRI showed no clear evidence of microbleeding in other parts of the brain, even though severe bleeding occurred in OLF (FIGS. 3H, I). In addition, the lethal parasite P. elegans. Mice infected with yoeliiL (PyL) did not detect microbleeding in their OLF by MRI (FIGS. 3H, I). Therefore, rather than lower magnetic field MRI, our ultra-high magnetic field MRI settings make the olfactory bulb more susceptible to attack during PbA infection and bleeding compared to other parts of the brain. It is reasonable to think that it made it possible to identify.
（ＯＬＦの柵状微小血管内の寄生虫の生体内多光子イメージング）
本発明者らは次に、ＢＢＢ崩壊の潜在的な関与を含めて、ＥＣＭの間にＯＬＦ領域からの出血が何故、そして、どのようにして生じるかを調べた。ＯＬＦは、高密度でかつ様々な方向（放射状および接線方向）を向いた柵状の微小血管構造から構成される。このような複雑な血管構造は、神経細胞およびグリア細胞と一緒に糸球内でシナプス性の相互作用を行い、組織内での神経細胞移動のための適切な足場環境として機能し得る（Bovetti, S.ら(2007). J Neurosci 27,5976-5980.；Danielyan,L.ら(2009). Eur J Cell Biol 88, 315-324.）。このＯＬＦの独特な血管構造が、ＰｂＡ感染赤血球ならびに感染に関連する事象のための「脆弱な」スポットとなり得るかどうかを調べるために、ＯＬＦを生体内ＭＰ顕微鏡により可視化した。ＧＬ程度に深い（約１５０μｍ）ＯＬＦ毛細管が可視化され得るＯＬＦのＭＰイメージングは、これまでに、げっ歯類を用いて実施されている（Chaigneau,E.ら、(2003). Proc Natl Acad Sci USA100, 13081-13086.；Petzold,G.C.ら、(2008).Neuron 58, 897-910.；Sawada,M.ら、(2011).J Neurosci 31, 11587-11596.）（図２Ａ）。本発明者らは、以前に記載されたとおり（Sawada,M.ら、上掲）にマウスの背部ＯＬＦの上で薄型頭蓋外科手術を行い、組織をインタクトなまま維持した。ＯＬＦ血管の生体画像は、この領域が解剖学的に複雑な毛細管構造（直径＜５μｍ）を有しており（Petzold,ら、上掲）、感染から５日後に、ＰｂＡ寄生虫内で発現されるＧＦＰシグナルとして示される、循環ｉＲＢＣの付着／閉塞に適していることを示した（図２Ｂ、また動画Ｓ１（本明細書では示さない）でも確認している）。動画Ｓ１では、生体内多光子顕微鏡によって可視化したマウスの嗅球を確認した。マウスにＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させた。感染後５日目、マウスは目に見えるＥＣＭの症状を示さなかったが、血管を赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識し、図２Ａに示されるように、３０分間にわたって像を取得した。一部の寄生虫が減速し、血管に付着しているのが観察された。撮影した動画は５つあったが、感染後５日目の５匹のマウスにおいて同様であった。この動画Ｓ１に見られるように、一部のＧＦＰ標識された寄生虫の速度は低減および／または停止され、最終的には閉塞を引き起こした。これは、脳の他の部分と比較して、感染後６日目のＯＬＦにおいて１８Ｓ ｒＲＮＡレベルならびにＴ細胞の蓄積によって測定される寄生虫負荷量が有意により高かったことと一致していた（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＯＬＦが、おそらくはその柵状の毛細管構造に起因して、ＥＣＭ発病に特有の領域となり、それによって、循環ｉＲＢＣが減速し、付着し、そして／または、隔離され得、最終的には出血へと至ることを示唆している。
(In vivo multiphoton imaging of parasites in OLF palisade microvessels)
We then investigated why and how bleeding from the OLF region occurs during ECM, including the potential involvement of BBB collapse. The OLF is composed of a high-density, fence-like microvascular structure oriented in various directions (radial and tangential). Such complex vasculatures engage in synaptic interactions within the filament with neurons and glial cells and can serve as a suitable scaffolding environment for neural cell migration within tissues (Bovetti, S. et al. (2007). J Neurosci 27,5976-5980 .; Danielyan, L. et al. (2009). Eur J Cell Biol 88, 315-324.). The OLF was visualized with an in vivo MP microscope to investigate whether this unique vascular structure of the OLF could be a "vulnerable" spot for PbA-infected erythrocytes and infection-related events. MP imaging of OLF, which can visualize OLF capillaries as deep as GL (about 150 μm), has been performed using rodents (Chaigneau, E. et al., (2003). Proc Natl Acad Sci USA 100. , 13081-13086 .; Petzold, GC et al., (2008) .Neuron 58, 897-910 .; Sawada, M. et al., (2011) .J Neurosci 31, 11587-11596.) (Fig. 2A). We performed thin cranial surgery on the back OLF of mice as previously described (Sawada, M. et al., Supra) to maintain tissue intact. Biological images of OLF vessels show that this region has an anatomically complex capillary structure (diameter <5 μm) (Petzold, et al., Supra) and is expressed within PbA parasites 5 days after infection. It was shown to be suitable for attachment / occlusion of circulating iRBC, which is shown as a GFP signal (also confirmed in FIG. 2B and video S1 (not shown herein)). In the moving image S1, the olfactory bulb of the mouse visualized by the in-vivo multiphoton microscope was confirmed. Mice were infected with the GFP-PbA parasite. Five days after infection, mice showed no visible ECM symptoms, but blood vessels were labeled with red TRITC-dextran and images were taken over 30 minutes, as shown in FIG. 2A. Some parasites were observed to slow down and attach to blood vessels. Five videos were taken, but the same was true for the five mice 5 days after infection. As seen in this video S1, the rate of some GFP-labeled parasites was reduced and / or stopped, eventually causing obstruction. This was consistent with significantly higher parasite loadings measured by 18S rRNA levels and T cell accumulation in OLF 6 days post-infection compared to other parts of the brain (Figure). 2C). Taken together, these results indicate that the OLF may become a region specific to ECM pathogenesis, probably due to its palisade capillary structure, thereby slowing, adhering, and / or isolating the circulating iRBC. It suggests that it will eventually lead to bleeding.
（ＯＬＦ内の血管を介したＣＤ８ Ｔ細胞の往来）
脳内のＣＤ８ Ｔ細胞の血管内蓄積は、ＥＣＭの発病において重要な役割を有することが示された（Belnoue, E.ら(2002). J Immunol 169,6369-6375.；Miyakoda, M.ら、(2008).J Immunol 181, 1420-1428.）。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞の補充が、ＯＬＦの生体内ＭＰイメージングによって、観察され得るかどうか、そして／または、ＰｂＡ感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのＯＬＦにおける標識ＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＦＰ発現ＰｂＡ寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐毛細管において生じていることをはっきりと示した（図２Ｄ、動画Ｓ２でも確認している（本明細書では示さない））。動画Ｓ２では、嗅球毛細管における新たな微小出血部位を示す、ＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させたマウスの代表的な３Ｄ像を撮影した。感染マウスを、感染後６日目に約１時間、生体内多光子顕微鏡によって可視化した。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＣＤ８α抗体で標識したＣＤ８ Ｔ細胞。一部の赤色領域は、血管の完全性が失われた既に出血した領域を示している；Ｔ細胞は組織中をクロールしている。中心部の血管の完全性の突然の喪失は新たな出血が示された。動画Ｓ２に見られるように、微小出血の発生中に、赤色のデキストラン標識された毛細管が変更された（赤色色素がほとんど組織内に放出された）。重要なことには、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＥＣＭの発症中、血管内を前後に「クロール」し、数が増加することが分かり（図２Ｄ、動画Ｓ２、Ｓ３およびＳ４（本明細書では示さない）でも確認している）、一部は、出血領域周囲に付着することが分かった（動画Ｓ２（本明細書では示さない））。これらのＯＬＦ内でのＣＤ８ Ｔ細胞の挙動は、ＥＣＭの末期における不安定な血流に受動的に従い得るが、比較的大きな血管（１０μｍ前後）における感染後５日目に本願発明者らが構築した３Ｄ動画は、ＣＤ８ Ｔ細胞が、血管に付着し、血管壁に沿って活発にクロールしている様子をはっきりと示した（動画Ｓ３（本明細書では示さない））。動画３Ｓでは、Ｔ細胞が嗅球内の微小血管に沿ってクロールする様子が示され、感染後５日目のＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させたマウスの嗅球の３Ｄ構築した多光子動画が示される。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＴＣＲβ抗体で標識したＴ細胞が示される。Ｔ細胞は、微小血管（直径約１０μｍ）の壁に付着し、壁に沿って移動していることが分かった。これらのＴ細胞によるクロール挙動は、インビボでの抗ＴＣＲβまたは抗ＣＤ８抗体（これらの抗体は、ナイーブな動物のＴ細胞に対して影響を有さなかった）標識に因るものではなかった（動画Ｓ４（本明細書では示さない）、データ示さず）。それどころか、完全に活性化されたＴ細胞は、感染後５日目にＯＬＦ毛細管内に蓄積し始め、クロールの動きによってその数を大いに増加させた（動画Ｓ４（本明細書では示さない））。動画Ｓ４では、Ｔ細胞が活性化され、嗅球毛細管内をクロールする様子を示す、感染後４〜６日目のナイーブマウスおよびＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫感染マウスの嗅球生体内多光子イメージングが示される。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＴＣＲβ抗体で標識したＴ細胞であるが、これらの動画では、青色チャンネルのみが示される。各動画は約１時間撮影した。青色の円は、血管内で速く流れるＴ細胞を示し、赤色の円は、減速し、血管内をクロールするＴ細胞を示す。ナイーブなマウスにおいてＴ細胞の動きを捉えるのは困難であったが、Ｔ細胞数は感染後の日数と共に増加した。その動きはクロール挙動を示す。まとめると、これらのＯＬＦの生体画像は、クロールするＣＤ８ Ｔ細胞の数の増加とともに、蓄積したｉＲＢＣが、最終的には小さなＯＬＦ毛細血管の微小出血によって血管から出ていくにちがいないことを示す。
(Traffic of CD8 T cells via blood vessels in OLF)
Intravascular accumulation of CD8 T cells in the brain has been shown to play an important role in the pathogenesis of ECM (Belnoue, E. et al. (2002). J Immunol 169,6369-6375 .; Miyakoda, M. et al. , (2008). J Immunol 181, 1420-1428.). Therefore, we investigated whether CD8 T cell supplementation could be observed by in vivo MP imaging of OLF and / or could be associated with microbleeding after PbA infection. .. In vivo imaging of labeled CD8 T cells and GFP-expressing PbA parasites in infected mouse OLFs clearly showed that microhemorrhages occurred in bifurcated capillaries (FIG. 2D, video S2 also confirmed (present). Not shown in the book)). In video S2, a representative 3D image of a mouse infected with the GFP-PbA parasite showing a new microbleeding site in the olfactory bulb capillary was taken. Infected mice were visualized by in vivo multiphoton microscopy for about 1 hour 6 days after infection. Red, red TRITC-dextran-labeled blood vessels; green, GFP-expressing PbA parasites; blue, anti-CD8α antibody-labeled CD8 T cells. Some red areas indicate areas of already bleeding that have lost vascular integrity; T cells are crawling throughout the tissue. Sudden loss of central vascular integrity showed new bleeding. As seen in video S2, the red dextran-labeled capillaries were altered during the development of microbleeding (most of the red pigment was released into the tissue). Importantly, CD8 T cells were found to "crawl" back and forth in blood vessels and increase in number during the onset of ECM (FIGS. 2D, moving images S2, S3 and S4 (not shown herein). ), It was found that a part of the blood adhered around the bleeding area (Video S2 (not shown in the present specification)). The behavior of CD8 T cells in these OLFs can passively follow the unstable blood flow at the end of ECM, but was constructed by the inventors of the present application on the 5th day after infection in a relatively large blood vessel (around 10 μm). The 3D video clearly showed how CD8 T cells attached to the blood vessel and actively crawled along the blood vessel wall (Video S3 (not shown herein)). Video 3S shows T cells crawling along microvessels in the olfactory bulb, and a 3D constructed multiphoton video of the olfactory bulb of mice infected with the GFP-PbA parasite 5 days after infection. .. Red, red TRITC-dextran-labeled blood vessels; green, GFP-expressing PbA parasites; blue, anti-TCRβ antibody-labeled T cells are shown. It was found that T cells attached to the wall of microvessels (about 10 μm in diameter) and migrated along the wall. The crawl behavior by these T cells was not due to in vivo anti-TCRβ or anti-CD8 antibody labeling (these antibodies had no effect on naive animal T cells) (video). S4 (not shown herein), no data shown). On the contrary, fully activated T cells began to accumulate in the OLF capillaries 5 days after infection and were greatly increased in number by the movement of crawls (Video S4 (not shown herein)). Video S4 shows olfactory bulb in vivo polyphoton imaging of naive mice and GFP-PbA parasite-infected mice 4-6 days after infection, showing how T cells are activated and crawl in the olfactory bulb capillaries. Red, red TRITC-dextran-labeled blood vessels; green, GFP-expressing PbA parasites; blue, anti-TCRβ antibody-labeled T cells, but only blue channels are shown in these videos. Each video was shot for about 1 hour. Blue circles indicate T cells that flow fast in the blood vessels, and red circles indicate T cells that slow down and crawl in the blood vessels. Although it was difficult to capture T cell movement in naive mice, the number of T cells increased with the number of days after infection. The movement shows crawl behavior. Taken together, these OLF bioimaging shows that as the number of CD8 T cells crawling increases, the accumulated iRBC must eventually exit the vessel due to microbleeding of small OLF capillaries. ..
脳内のＣＤ８ Ｔ細胞の血管内蓄積は、脳マラリアの発病において重要な役割を有することが示された（Belnoue, E.ら(2002). J Immunol 169,6369-6375.）。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞の補充が、ＯＬＦの生体内ＭＰイメージングによって、観察され得るかどうか、そして／または、ＰｂＡ感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのＯＬＦにおける標識ＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＦＰ発現ＰｂＡ寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐血管において生じていることをはっきりと示した（図２Ｃおよび動画Ｓ２（本明細書では示さない））。重要なことには、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＬＦ血管内の寄生虫を「追跡する」かのように、血管内を前後に行き来することが分かった（図２Ｄおよ動画Ｓ３（本明細書では示さない））。さらに、構築した３Ｄ動画は、ＣＤ８ Ｔ細胞が、血管に付着し、血管壁に沿ってクロールし得ることを示唆した（動画Ｓ４（本明細書では示さない））。まとめると、これらのＯＬＦの生体画像は、ＯＬＦ内に蓄積した寄生虫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって追跡され、小さなＯＬＦ血管の微小出血によって血管から出ていくことを示す。 Intravascular accumulation of CD8 T cells in the brain has been shown to play an important role in the pathogenesis of cerebral malaria (Belnoue, E. et al. (2002). J Immunol 169, 6369-6375.). Therefore, we investigated whether CD8 T cell supplementation could be observed by in vivo MP imaging of OLF and / or could be associated with microbleeding after PbA infection. .. In vivo imaging of labeled CD8 T cells and GFP-expressing PbA parasites in the OLF of infected mice clearly showed that microbleeding occurred in bifurcated vessels (FIGS. 2C and S2 (not shown herein)). ). Importantly, CD8 T cells were found to traverse back and forth within the vessels as if they "tracked" parasites within the OLF vessels (Fig. 2D and Video S3 (as used herein)). Not shown)). Furthermore, the constructed 3D video suggested that CD8 T cells could attach to the blood vessel and crawl along the blood vessel wall (Video S4 (not shown herein)). Taken together, these OLF bioimaging shows that parasites that have accumulated within the OLF are tracked by CD8 T cells and exit the blood vessels due to microbleeding of small OLF vessels.
（嗅覚機能は脳マラリア中に破壊されることの確認）
ｉＲＢＣならびにＣＤ８ Ｔ細胞の蓄積が、ＥＣＭの間に段階的に生じ、ＯＬＦ内の微小出血をもたらすという上記の知見を考慮して、本発明者らは、ＯＬＦが化学感受性のための複雑な生理学的シナプスを形成する嗅覚神経を含んでいるために、ＯＬＦの機能（嗅覚）が影響を受けると仮説を立てた。ＯＬＦの機能を評価するために、本発明者らは、単純な「食料埋設試験」を実施した（Yang, M.およびCrawley, J.N. (2009).Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24.）。簡単に述べると、マウスを、１８時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ１ｃｍ下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。ＯＬＦ機能は、食料を見つけるまでの時間の遅延によって決定した場合、ＢＡＬＢ／ｃまたはＲａｇ２−／−マウスまたは致死性のＰｙＬ寄生虫に感染したマウスのようなＥＣＭに対して抵抗性の正常なマウス（図３Ｂ）と比較して、早くも感染後４日目には有意に損なわれていた（図３Ａ）。このように、ＯＬＦ機能の喪失は、ＯＬＦ内の出血およびＢＢＢの完全性の潜在的な喪失といったＥＣＭの顕在化の予測を可能にし得る。
(Confirmation that olfactory function is destroyed during brain malaria)
Given the above findings that iRBC and CD8 T cell accumulation occurs stepwise during the ECM, resulting in microbleeding within the olf, we consider the complex physiology of the olf for chemical susceptibility. It was hypothesized that the function of OLF (olfaction) is affected because it contains the olfactory nerves that form synapses. To evaluate the function of OLF, we performed a simple "food burial test" (Yang, M. and Crawley, JN (2009). Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24.). Briefly, mice were left food-free for 18 hours and then transferred to new cages, including bedding, at random corners of the cage, with food buried approximately 1 cm below the surface. The time it took for the mice to find the buried food was recorded. OLF function is normal mice resistant to ECM, such as BALB / c or Rag2-/- mice or mice infected with the lethal PyL parasite, as determined by the delay in time to find food. Compared with (FIG. 3B), it was significantly impaired as early as 4 days after infection (FIG. 3A). Thus, loss of OLF function can make it possible to predict the manifestation of ECM, such as bleeding within the OLF and a potential loss of BBB integrity.
ＯＬＦ機能の喪失がＢＢＢの完全性の喪失（ＢＢＢ漏出）と直接相関するかどうかを評価するために、感染後の早い時点（３〜６日目）にマウスにエバンスブルー染料を注射し、脳組織への青色染料の滲出をモニターした。ｉＲＢＣが血管内で減速し停止したＭＰイメージングの観察によれば、脳組織への青色染料の滲出は、早くも感染後５日目にＯＬＦから出現し、一方で、脳全体は感染後６〜７日目に青くなった（図３Ｃ）。ＢＢＢは、密着結合および密着帯−１（ＺＯ−１）のようなタンパク質に起因して拘束性であるので、本発明者らは次に、ＯＬＦにおけるＺＯ−１染色がＢＢＢ漏出と関係するかどうかを調べた。ＺＯ−１は、嗅上皮、嗅覚ニューロン、ならびに、嗅球僧帽細胞層に局在することが示されている（Miragall,F.ら、(1994). J Comp Neurol 341,433-448.）。感染後６日目に、本発明者らは、ＧＦＰ発現寄生虫の蓄積（ｉＲＢＣ）と一致した、ＯＬＦ ＭＣＬにおけるＺＯ−１免疫染色の有意な中断を観察し（図３Ｄ）、これは、ＯＬＦの密着結合におけるＺＯ−１発現の中断が、ＥＣＭ中のＢＢＢの完全性の喪失と関連し得ることを示唆している。 To assess whether loss of OLF function directly correlates with loss of BBB integrity (BBB leakage), mice are injected with Evans blue dye early after infection (3-6 days) and the brain The exudation of the blue dye into the tissue was monitored. According to the observation of MP imaging in which iRBC slowed down and stopped in the blood vessels, exudation of blue dye into brain tissue appeared from OLF as early as 5 days after infection, while the whole brain was 6 to 6 to after infection. It turned blue on the 7th day (Fig. 3C). Since BBB is restrictive due to tight junctions and proteins such as Tight Junction-1 (ZO-1), we next indicate whether ZO-1 staining in OLF is associated with BBB leakage. I checked. ZO-1 has been shown to be localized in the olfactory epithelium, olfactory neurons, and the olfactory bulb mitral cell layer (Miragall, F. et al., (1994). J Comp Neurol 341, 433-448.). Six days after infection, we observed a significant interruption of ZO-1 immunostaining in OLF MCL, consistent with the accumulation of GFP-expressing parasites (iRBC), which is OLF. It is suggested that interruption of ZO-1 expression in tight junctions may be associated with loss of BBB integrity during ECM.
（実施例２：脳マラリアとケモカインとの関係）
次に、本実施例では脳マラリアとケモカインとの関係を確認し、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系と脳マラリアとの関係性を解明した。
(Example 2: Relationship between brain malaria and chemokines)
Next, in this example, the relationship between brain malaria and chemokines was confirmed, and the relationship between the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system and brain malaria was elucidated.
（脳マラリア中の高熱およびケモカインストームはＯＬＦの機能不全および物理的ダメージと関連する）
本発明者らは次に、ＥＣＭの間のＯＬＦ機能不全に寄与する潜在的な因子を探索した。高熱は、ＢＢＢ機能喪失の促進因子の一つであることが示された（Kiyatkin, E.A.およびSharma, H.S.(2009). Neuroscience 161, 926-939.）。高熱がマラリア性昏睡状態の重要な症状であることを考慮し、本発明者らは、サーマルカメラを用いてＰｂＡ感染マウスの体温の連続的な測定を可能にする実験システムを開発した。感染マウスの体温の連続的かつ非侵襲性の測定は、高熱の攻撃が、ＥＣＭ症状の発症の２４時間前（ＰｂＡ感染後５日目付近）に始まり、２４時間持続し、その後、熱損により終結し、最終的には次の１２〜２４時間以内に死に至ることを明らかにした（図３、動画Ｓ５（本明細書では示さない））。動画Ｓ５では、サーマルモニターカメラによる、感染／非感染マウスの継続的な発熱の記録がなされた。１０日間にわたってケージを継続的にモニターした。動は３２秒間撮影され、感染後５〜７日目に対応する。非感染のナイーブコントロールマウス（＃１、右上、黄色）、感染マウス（＃２、左上；＃３、右下；＃４、左下）。感染マウス＃４は、最終的には熱を失って早期に死亡し、カメラから消えている。感染マウス＃３は、感染マウス＃４が死亡した翌日に死亡した。動画は、少なくとも１０匹のマウスで撮影したところほぼ同様の様子を示した。
脳マラリアを発症しない免疫不全マウスであるＲａｇ２−／−マウスに感染させると、これらのマウスは、感染の全体を通じて高熱の徴候を示さず、ＯＬＦがインタクトであることがＭＲＩによって確認された（図３Ｆおよび図３Ｉ）。さらに、致死性のＰｙＬまたは非致死性のＰ．ｙｏｅｌｉｉ−ＮＬを感染させたマウスは、感染の間に発熱せず（図３Ｇおよび図５Ｆ〜Ｇ）、感染後５日目の熱の上昇はＰｂＡ特異的であり得ることが示唆された。高熱がＢＢＢの崩壊とその後のＯＬＦ機能不全および出血をトリガーし、そして／または、促進する正確な機構は明らかでないが、データは、高熱がＥＣＭ関連死の２４時間前に生じ、ＯＬＦが機能不全となり、出血が促進された後のＢＢＢ漏出と相関し得ることを示唆する。特筆すべきことは、ＰｂＡ感染後５日目に、全身血清サイトカインレベル（大部分は炎症促進性サイトカイン）が上昇しており、サイトカインストームが高熱を伴うという考えを裏付けている（図５Ｆ〜Ｇ）。
(High fever and chemokine storms in brain malaria are associated with OLF dysfunction and physical damage)
We then searched for potential factors that contribute to OLF dysfunction during ECM. High fever has been shown to be one of the promoters of BBB loss of function (Kiyatkin, EA and Sharma, HS (2009). Neuroscience 161, 926-939.). Given that high fever is an important symptom of malaria coma, we have developed an experimental system that allows continuous measurement of body temperature in PbA-infected mice using a thermal camera. Continuous and non-invasive measurements of body temperature in infected mice show that a high fever attack begins 24 hours before the onset of ECM symptoms (around 5 days after PbA infection) and lasts for 24 hours, followed by heat loss. It was revealed that it was terminated and eventually died within the next 12 to 24 hours (Fig. 3, Video S5 (not shown herein)). In video S5, a thermal monitor camera recorded continuous fever in infected / non-infected mice. The cage was continuously monitored for 10 days. The movement is photographed for 32 seconds and corresponds to 5-7 days after infection. Non-infected naive control mice (# 1, upper right, yellow), infected mice (# 2, upper left; # 3, lower right; # 4, lower left). Infected mouse # 4 eventually lost its fever and died prematurely and disappeared from the camera. Infected mouse # 3 died the day after infected mouse # 4 died. The video showed almost the same appearance when shot with at least 10 mice.
When infected with Rag2 − / − mice, immunodeficient mice that do not develop cerebral malaria, these mice showed no signs of high fever throughout the infection and MRI confirmed that OLF was intact (Figure). 3F and FIG. 3I). In addition, lethal PyL or non-lethal P.L. Mice infected with yoelii-NL did not develop fever during infection (FIGS. 3G and 5F-G), suggesting that the increase in fever 5 days after infection may be PbA-specific. The exact mechanism by which high fever triggers and / or promotes BBB collapse and subsequent OLF dysfunction and bleeding is unclear, but data show that high fever occurs 24 hours before ECM-related death and OLF dysfunction. This suggests that it can correlate with BBB leakage after bleeding is promoted. Notably, systemic serum cytokine levels (mostly pro-inflammatory cytokines) are elevated 5 days after PbA infection, supporting the idea that cytokine storms are associated with high fever (Figs. 5F-G). ).
（ＣＣＬ２１は感染の初期段階でＯＬＦにおいて高度に発現される）
本発明者らはさらに、ＰｂＡ感染の初期段階における嗅覚の喪失と関連し得る要因を調べた。ケモカインは、感染または炎症の初期メディエーターであり、次第に、発熱の発生に貢献するものと認識されている（Machado, R.R.ら(2007). Brain Res 1161,21-31.）。一部のケモカインおよびサイトカインは、ＥＣＭの発症において重要な役割を有するので、本発明者らは、ＯＬＦにおいて、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＭＣＰ−１（ＣＣＲ２リガンド）、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１（ＣＣＲ７リガンド）を含むいくつかのサイトカイン／ケモカインｍＲＮＡの発現レベルを測定した。ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９のｍＲＮＡおよびタンパク質は、ＯＬＦにおいて、早くも感染後３日目に高度に発現されており（図４Ａ〜Ｂ）、ケモカインリガンド、特にＣＣＬ２１の早期発現が、脳への免疫細胞の補充に重要であり得ることが示唆された。
(CCL21 is highly expressed in OLF in the early stages of infection)
We further investigated factors that may be associated with olfactory loss in the early stages of PbA infection. Chemokines are early mediators of infection or inflammation and are increasingly recognized to contribute to the development of fever (Machado, RR et al. (2007). Brain Res 1161, 21-31.). Since some chemokines and cytokines have important roles in the development of ECM, we have interferon (IFN) -γ, IP-10 (CXCR3 ligand), MCP-1 (CCR2 ligand) in OLF. , CCL19 and CCL21 (CCR7 ligand), and the expression levels of several cytokines / chemokine mRNAs were measured. CCL21 and CCL19 mRNAs and proteins are highly expressed in OLF as early as 3 days after infection (FIGS. 4A-B), and early expression of chemokine ligands, especially CCL21, replenishes immune cells to the brain. It was suggested that it could be important.
上記の結果から、本発明者らは、ＣＣＲ７が、ＯＬＦを介して脳内にＣＣＲ７発現細胞を補充することによって、ＥＣＭの病理に関与するかどうかを調べることにした。本発明者らは、ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）および同腹仔のＣｃｒ７＋／−およびＣｃｒ７−／−マウスにＰｂＡを感染させ、その生存を追跡した。Ｃｃｒ７−／−マウスの生存率の有意な増加が生じ、死は最終的には高寄生虫血症によって引き起こされたが、両群間で寄生虫レベルに違いはなかった（図４Ｃ、データ示さず）。Ｃｃｒ７−／−マウスにおけるＯＬＦ機能がインタクトであったかどうかを評価するために、食料埋設試験を実施したところ、ＷＴマウスと比較してインタクトなＯＬＦ機能が観察された（図４Ｄ）。興味深いことに、Ｃｃｒ７−／−マウスでは、ＷＴマウス（２４時間）と比較して、高熱発生の遅延（約４８時間）が生じており（図４Ｅ）、ＭＲＩおよびエバンスブルー染色によって決定した場合、感染後６日目に、ＯＬＦにおける出血の徴候はなかった（図５ＨおよびＩ）。エバンスブルー染色は、８日目以降のＣｃｒ７−／−マウスの脳の約８０％において徐々に生じた（図５ＨおよびＩ）。これらのデータは、ＣＣＲ７がＥＣＭの発病において役割を有しており、ＯＬＦ機能不全、微小出血および高熱にも寄与していることを示唆した。 From the above results, we decided to investigate whether CCR7 is involved in the pathology of ECM by replenishing CCR7-expressing cells in the brain via OLF. We infected WT (C57BL / 6) and littermate Ccr7 +/- and Ccr7 − / − mice with PbA and followed their survival. There was a significant increase in survival in Ccr7 − / − mice, and death was ultimately caused by hyperparasitemia, but there was no difference in parasite levels between the two groups (Fig. 4C, data shown). Z). When a food burial test was conducted to evaluate whether the OLF function in Ccr7 − / − mice was intact, an intact OLF function was observed as compared with WT mice (Fig. 4D). Interestingly, Ccr7 − / − mice had a delayed high fever development (approximately 48 hours) compared to WT mice (24 hours) (FIG. 4E), as determined by MRI and Evans blue staining. Six days after infection, there were no signs of bleeding in OLF (FIGS. 5H and I). Evans blue staining occurred gradually in approximately 80% of the brains of Ccr7 − / − mice after day 8 (FIGS. 5H and I). These data suggested that CCR7 has a role in the pathogenesis of ECM and also contributes to OLF dysfunction, microbleeding and high fever.
（ＣＣＲ７の発現はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８α ＤＣ活性化にとって重要であるが、その脳内への移動にとっては重要ではない）
本発明者らは次に、ＥＣＭからのＣｃｒ７−／−マウスの生存率の増加を担う基礎的な機構を調べた。ＣＣＲ７は、ＤＣおよびＴ細胞のような免疫細胞の二次リンパ系器官への移動において重要なケモカイン受容体であるので、本発明者らは、脳内でのＴ細胞の補充を調べた。ＰｂＡ感染後６日目の脳から得た免疫細胞のフローサイトメトリー分析は、脳内のＣＤ８ Ｔ細胞蓄積が、ＷＴマウスと比較して、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて５０％減少することを示した（＊ｐ＜０．０５；図５Ａ）。特筆すべきことに、近年の報告は、脳内に補充されたＣＤ８ Ｔ細胞の中でも、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞が、高度に活性化されており、おそらくはＩＦＮ−γおよびグランザイム−Ｂを産生することによって発病に関与していると示唆した（Tamura, T.ら(2011). Infect Immun 79,3947-3956.）。この報告と一致して、本発明者らは、ＰｂＡ感染したＷＴマウスの脳におけるＣＤ８ Ｔ細胞の大部分がＣＤ１１ｃ＋であり、この集団は、Ｃｃｒ７−／−マウスの感染脳（図５Ａ；＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１）ならびに脾臓（図５Ｂ；＊＊ｐ＜０．０１）においてパーセンテージおよび数が著しく減少していたが、ＷＴマウスとＣｃｒ７−／−マウスの間で、脾臓内のＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージおよび数は同等であったことを見い出した。脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化もまた、同じ細胞集団からのＩＦＮ−γ分泌の減少を伴って、ＣＣＲ７の非存在（ＣＤ４４の発現によって決定）下で損なわれた（図５Ｃ〜Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＣＣＲ７が、ＣＤ８Ｔ細胞のごく特定の部分集団である活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＰｂＡ感染脳内への誘導および／または移動に関与し、そして、ＥＣＭの発病において重要な役割を有し得ることを示唆し得る。このことを確認するために、本発明者らはさらに、ＰｂＡ感染中のＣｃｒ７−／−マウスの脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージの低下が、脾臓における以前のプライミングにおける欠陥によって引き起こされたかどうかを決定した。ＣＤ８α＋ＤＣは、ＣＤ８ Ｔ細胞応答をクロスプライミングし得るので、マウス脳マラリアの発病においてＣＤ８ Ｔ細胞を病気に罹りやすくすることが示唆されている（Lundie, R.J.ら(2008). Proc NatlAcad Sci U S A 105, 14509-14514.；Piva, L.ら(2012). J Immunol 189,1128-1132.）。このことと一致して、本発明者らは、脾臓内にＣＤ８α ＤＣを持たない塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様−３（Ｂａｔｆ３）欠失マウス（Hildner,K.ら(2008). Science 322,1097-1100.）を用いて、ＰｂＡに感染させたときに、脾臓における活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の数および脳におけるその蓄積は、Ｂａｔｆ３＋／−コントロールと比較してＢａｔｆ３−／−マウスにおいて有意に損なわれていた（図６ＥおよびＦ）。また、Ｂａｔｆ３−／−マウスが生存率の改善を示したことを確認した（図６Ｇ）。他方、Ｃｃｒ７−／−マウスが、ＷＴマウスの脾臓内のものとほぼ同等数のＣＤ８α ＤＣを有したことを考慮し（図６Ｅ）、本発明者らは、ＣＤ８α ＤＣ上の機能的なＣＣＲ７発現がＣＤ８ Ｔ細胞活性化に必要とされるかどうかを理解するための実験を設計した。
(Expression of CCR7 is important for CD8α DC activation of CD11c + CD8 T cells, but not for its migration into the brain)
We then investigated the underlying mechanisms responsible for increasing the survival of Ccr7 − / − mice from ECM. Since CCR7 is a chemokine receptor important in the migration of immune cells such as DC and T cells to secondary lymphoid organs, we investigated T cell replenishment in the brain. Flow cytometric analysis of immune cells obtained from the brain 6 days after PbA infection showed that CD8 T cell accumulation in the brain was reduced by 50% in Ccr7 − / − mice compared to WT mice. ( * P <0.05; FIG. 5A). Notably, recent reports have shown that among the CD8 T cells replenished in the brain, CD11c + CD8 T cells are highly activated, presumably producing IFN-γ and granzyme-B. (Tamura, T. et al. (2011). Infect Immun 79, 3947-3956.). Consistent with this report, we found that the majority of CD8 T cells in the brains of PbA-infected WT mice were CD11c + , and this population was infected brains of Ccr7 − / − mice (Fig. 5A; * * P <0.01 and *** p <0.001) and spleen (Fig. 5B; ** p <0.01) showed markedly reduced percentages and numbers, but WT and Ccr7 − / − mice. Among them, it was found that the percentage and number of CD8 T cells in the spleen were comparable. Activation of CD11c + CD8 T cells in the spleen was also impaired in the absence of CCR7 (determined by expression of CD44), with reduced IFN-γ secretion from the same cell population (FIGS. 5C-D). .. Taken together, these data indicate that CCR7 is involved in the induction and / or migration of active CD11c + CD8 T cells into the PbA-infected brain, which is a very specific subpopulation of CD8 T cells, and in the pathogenesis of ECM. It may suggest that it may have an important role. To confirm this, we further determine whether the reduction in the percentage of CD11c + CD8 T cells in the spleen of Ccr7 − / − mice infected with PbA was caused by a defect in previous priming in the spleen. It was determined. Since CD8α + DC can cross-prime the CD8 T cell response, it has been suggested to make CD8 T cells susceptible to disease in the pathogenesis of mouse brain malaria (Lundie, RJ et al. (2008). Proc NatlAcad Sci USA). 105, 14509-14514 .; Piva, L. et al. (2012). J Immunol 189, 1128-1132.). Consistent with this, we conclude that basic leucine zipper transcription factor ATF-like-3 (Batf3) -deficient mice lacking CD8α DC in the spleen (Hildner, K. et al. (2008). Science 322, The number of active CD11c + CD8 T cells in the spleen and their accumulation in the brain when infected with PbA using 1097-1100.) In Batf3 − / − mice compared to Battf3 +/- controls. It was significantly impaired (FIGS. 6E and F). It was also confirmed that Battf3 − / − mice showed an improvement in survival rate (Fig. 6G). On the other hand, considering that Ccr7 − / − mice had approximately the same number of CD8α DCs as those in the spleen of WT mice (Fig. 6E), we present functional CCR7 expression on CD8α DCs. We designed an experiment to understand whether is required for CD8 T cell activation.
（機能的なＣＣＲ７は、脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングに必要とされる）
本発明者らは、インタクトなＤＣを有するがＴ／Ｂ細胞を有さない感染Ｒａｇ２−／−マウスからＣＤＲ８α ＤＣを精製した（McLellan, A.D.ら(2002). Blood 99,2084-2093.）。Ｒａｇ２−／−マウスからの脾臓ＣＤ８α＋ＤＣは、感染後５日目に高レベルのＣＣＲ７を発現したが、ＣＤ８α−ＤＣはこれを発現しなかった（図６ＨおよびＩ）。これらのＤＣを精製するために、ＣＤ８α＋ＤＣをまず、ＣＤ１１ｂ＋ビーズを用いてネガティブ選択によって濃縮し、次いで、ＮＫ細胞、マクロファージおよび顆粒球を除去し、そして、さらなるＣＤ４＋細胞枯渇の後に純粋なＣＤ８α＋ＤＣ集団を得た（９５％超の純度、図６Ｂ）。その後、高度に濃縮したＣＣＲ７＋ＣＤ８α＋ＤＣを、Ｃｃｒ７−／−マウスに養子免疫した。濃縮ＣＤ８α＋ＤＣの養子免疫は、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて、脳内の活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｃｃｒ７−／−マウス起源のもの）の補充を効率的に復活させ、ＥＣＭを加速させた（図５Ｅ）。まとめると、これらの知見は、ＰｂＡ感染中の活性型ＣＤ８α＋ＤＣ上の高レベルでの機能的ＣＣＲ７発現が、おそらくは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８Ｔ細胞とその膨張を活性化することによって、ＥＣＭの発病において重要な役割を有することを示唆する。しかしながら、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＣＲ７発現は、脳内へのこれらの病原性細胞の移動には不必要である。
(Functional CCR7 is required for priming CD11c + CD8 T cells in the spleen)
We purified CDR8α DC from infected Rag2 − / − mice with intact DC but no T / B cells (McLellan, AD et al. (2002). Blood 99, 2084-2093.). Spleen CD8α + DC from Rag2-/- mice expressed high levels of CCR7 5 days after infection, but CD8α - DC did not (FIGS. 6H and I). To purify these DCs, CD8α + DCs are first concentrated by negative selection with CD11b + beads, then NK cells, macrophages and granulocytes are removed and then pure after further CD4 + cell depletion. CD8α + DC population was obtained (purity> 95%, FIG. 6B). Then, highly concentrated CCR7 + CD8α + DC was adopted into Ccr7 − / − mice. Adoptive concentration CD8a + DC is, CCR7 - / - in mouse, activated CD11c + CD8 T cells in the brain (CCR7 - / - of mouse origin) supplemented efficiently revive the accelerated the ECM (Fig. 5E). Taken together, these findings are important in the pathogenesis of ECM by high levels of functional CCR7 expression on active CD8α + DC during PbA infection, presumably by activating CD11c + CD8T cells and their swelling. It is suggested that it has a role. However, CCR7 expression on CD11c + CD8 T cells is not necessary for the migration of these pathogenic cells into the brain.
（ＯＬＦ内で発現されるＣＣＬ２１は、星状細胞の活性化と一致しており、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＯＬＦ内への移動にとって重要であり得る）
ＣＣＲ７がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＯＬＦ内への移動に不必要であるとの知見は、ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミング中のＣＣＬ２１の重要性を意味している。しかしながら、ＣＣＬ２１の発現もまた、３日目から最終段階までＰｂＡ感染したＯＬＦにおいて観察されたので、本発明者らはさらに、ＣＣＬ２１が、ＣＣＲ７以外の代替的なケモカイン受容体相互作用を介してＯＬＦ内へのＣＤ８ Ｔ細胞の補充に関してさらなる役割を有し得るという仮説を立てた。ＣＸＣＲ３が、特に小膠細胞および星状細胞においてＣＣＬ２１の代替的ケモカイン受容体となり得ること（Rappert,A.ら、(2002). J Immunol 168,3221-3226.；vanWeering, H.R.ら(2010). Brain Behav Immun 24, 768-775.）、そして、ＣＤ８ Ｔ細胞の脳内への移動を担う重要なケモカイン受容体であること（Campanella, G.S.ら(2008). ProcNatl Acad Sci U S A 105, 4814-4819.；Hansen, D.S.ら(2007). J Immunol 178,5779-5788.；Van denSteen, P.E.ら(2008). Eur J Immunol 38, 1082-1095.）を考慮し、本発明者らはさらに、感染したＯＬＦにおけるＣＣＬ２１の局在性および／または供給源を分析した。ＯＬＦ内でＣＣＬ２１を発現する細胞型を扱うことは困難であったが、ＣＣＬ２１染色は、星状細胞がしばしば同時局在化する炎症を起こした血管の内皮に限定されていた（図６Ａ）。星状細胞は、そのエンドフィートを介して血管の変化を監視し、感知する特殊化された細胞であり、ＥＣＭの間には、網膜におけるその再分配が関係付けられている（Medana,I.M.ら、(1996). Glia 16, 51-64.）。感染後６日目には、ＯＬＦにおける星状細胞の形態変化（例えば、不十分な分布、厚くより長い突起）が明らかとなり、星状細胞とＰＥＣＡＭ染色との相互関係は、大きく乱されていた（図６Ｂ）。興味深いことに、特にその線維様構造によるＣＣＬ２１染色は、ＯＬＦ内のＣＤ８ Ｔ細胞と密接に相互関係していた（図は示さず、この省略した図ではＣＤ８ Ｔ細胞がＯＬＦ内のＣＣＬ２１と関連する様子が示される。感染後６日目の、ＰｂＡ感染したＷＴマウスからのＯＬＦ切片を、抗ＣＣＬ２１（緑色）および抗ＣＤ８（赤色）抗体で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）により可視化した。スケールバーは１０μｍである。）矢印はＣＤ８ Ｔ細胞と相互作用するＣＣＬ２１の線維様構造を示す。ＣＣＬ２１とＣＸＣＲ３発現ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞との間に化学走性相互作用が存在するかどうかを検討するために、本発明者らは次に、インビトロトランスウェル移動アッセイを行った。その結果に見られるように、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞はＣＣＬ２１に向かって用量依存性に移動したが、この移動は、抗ＣＣＬ２１抗体によって特異的にブロックされ（図は省略する）、ＣＣＬ２１が、ＥＣＭの間にＣＸＣＲ３にとっての代替的ケモカインリガンドとして機能し得ることを示唆する。省略した図では、増加する濃度（０、０．１、１および２μｇ／ｍｌ）のＣＣＬ２１に応じた、感染したＷＴマウスからの精製脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の移動を示される。ポジティブコントロールとしてヒトＳＤＦ１−α（８０ｎｇ／ｍｌ）を使用し、（Ｅ）ＣＣＬ２１（１μｇ／ｍｌ）および／または抗ＣＣＬ２１抗体（１および５μｇ／ｍｌ）に対する応答を検討した。移動した細胞を三連のウェルから回収し、フローサイトメーターでカウントし、そして、ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール（灰色の点線）に対して標準化し、非刺激コントロールの移動に対する割合（％）として示し、抗ＣＣＬ２１抗体によって特異的にブロックされることが示された。
(CCL21 expressed in OLF is consistent with astrocyte activation and may be important for the migration of CD11c + CD8 T cells into OLF)
The finding that CCR7 is unnecessary for the migration of CD11c + CD8 T cells into the OLF implies the importance of CCL21 during priming of CD8 T cells. However, since expression of CCL21 was also observed in PbA-infected OLFs from day 3 to the final stage, we further see that CCL21 is mediated by alternative chemokine receptor interactions other than CCR7. We hypothesized that it could have an additional role in the replacement of CD8 T cells inward. CXCR3 can be an alternative chemokine receptor for CCL21, especially in microglial and astrocytes (Rappert, A. et al. (2002). J Immunol 168,3221-3226 .; vanWeering, HR et al. (2010). Brain Behav Immun 24, 768-775.) And being an important chemokine receptor responsible for the migration of CD8 T cells into the brain (Campanella, GS et al. (2008). ProcNatl Acad Sci USA 105, 4814-4819. .; Hansen, DS et al. (2007). J Immunol 178,5779-5788 .; Van den Steen, PE et al. (2008). Eur J Immunol 38, 1082-1095.) The localization and / or source of CCL21 in the OLF was analyzed. Although it was difficult to handle cell types expressing CCL21 within the OLF, CCL21 staining was confined to the endothelium of inflamed blood vessels, where astrocytes often co-localize (Fig. 6A). Astrocytes are specialized cells that monitor and sense changes in blood vessels through their end feet, and their redistribution in the retina is associated between ECMs (Medana, IM et al.). , (1996). Glia 16, 51-64.). Six days after infection, morphological changes in astrocytes in OLF (eg, inadequate distribution, thicker and longer protrusions) were apparent, and the interrelationship between astrocytes and PECAM staining was significantly disturbed. (Fig. 6B). Interestingly, CCL21 staining, especially due to its fibrous structure, was closely interrelated with CD8 T cells within the OLF (not shown, in this omitted figure the CD8 T cells are associated with CCL21 within the OLF. The appearance is shown. OLF sections from PbA-infected WT mice 6 days after infection were stained with anti-CCL21 (green) and anti-CD8 (red) antibodies. Nuclei were visualized by DAPI (blue). Scale. The bar is 10 μm.) The arrow indicates the fibrous structure of CCL21 that interacts with CD8 T cells. To investigate the presence of chemotactic interactions between CCL21 and CXCR3 expressed CD11c + CD8 T cells, we then performed an in vitro transwell transfer assay. As can be seen in the results, CXCR3 + CD11c + CD8 T cells migrated dose-dependently towards CCL21, but this migration was specifically blocked by anti-CCL21 antibody (not shown) and CCL21 , Suggests that it may function as an alternative chemokine ligand for CXCR3 during ECM. The omitted figure shows the migration of purified splenic CD11c + CXCR3 + CD8 T cells from infected WT mice in response to increasing concentrations (0, 0.1, 1 and 2 μg / ml) of CCL21. Human SDF1-α (80 ng / ml) was used as a positive control and the response to (E) CCL21 (1 μg / ml) and / or anti-CCL21 antibody (1 and 5 μg / ml) was examined. Migrated cells were harvested from the triple wells, counted with a flow cytometer, and chemokine-induced migration was standardized for non-stimulated controls (gray dotted line), and the ratio of non-stimulated controls to migration. Shown as (%), it was shown to be specifically blocked by the anti-CCL21 antibody.
（実施例３：脳マラリアの予防及び治療）
次に、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系をブロックすることで、脳マラリアが予防および治療することができるのではないかと考え、その例として抗体を用いた実験を行った。
(Example 3: Prevention and treatment of brain malaria)
Next, we thought that blocking the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system could prevent and treat brain malaria, and conducted an experiment using an antibody as an example.
（ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７−ＣＸＣＲ３軸のブロックはＥＣＭ治療のための新規ストラテジーである）
ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７−ＣＸＣＲ３軸がＣＤ８α ＤＣ−ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性のＥＣＭ免疫病理において重要な役割を有することを考慮し、本発明者らは、ＣＣＬ２１がＥＣＭの治療のための治療標的として利用されうるかどうかを評価した。感染の最初の３日間の、抗ＣＣＬ２１抗体でのＯＰｂＡ感染マウスのインビボ処置は、アイソタイプコントロールで処置したマウスと比較して、マウスにおける有意に良好な生存につながった（図６Ｆ、＊＊ｐ＜０．０１）。しかしながら、感染後４日目の抗ＣＣＬ２１抗体処置は、ＥＣＭの進行に対して顕著な効果を有さず（データ示さず）、ＥＣＭの後期段階の間のＣＣＬ２１の関与が、他のエフェクター機構の活性化によって損なわれ得ることが示唆された。それゆえ、本発明者らは、ＣＣＲ２１とＣＸＣＲ３の標的化の組み合わせを行った。概念実証として、感染後４日目および５日目における準最適用量の抗体（１００μｇ）によるＣＸＣＲ３のブロッキングは、ＷＴの対応マウスと比較して、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいてＥＣＭからの有意な生存をもたらした（図６Ｄ）。同様に、嗅覚を喪失した日（感染後４日目）の抗ＣＸＣＲ３＋ＣＣＬ２１抗体混合物による組み合わせ抗体治療は、抗ＣＸＣＲ３抗体単独治療よりも良好なＥＣＭからの生存をもたらした（図は示さず）。これらのデータは、ケモカインの組み合わせブロッキングがＥＣＭからの脱出を導き得る新規治療ストラテジーとして活用され得ることを示唆した。省略した図では、組み合わせ抗ケモカイン抗体治療の生存曲線を示が示される。抗ＣＸＣＲ３および抗ＣＣＬ２１抗体の混合物を、嗅覚の喪失が始まった感染後４日目に注射した。抗ＣＣＬ２１抗体注射は５日目にも繰り返した。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、コントロール 対 抗ＣＸＣＲ３抗体群、そして、コントロール 対 組合せ治療群で＊ｐ＜０．０５（各群ｎ＝５）。その結果、抗ＣＸＣＲ３抗体単独治療よりも良好なＥＣＭからの生存をもたらしたことが示された。
(CCL21-CCR7-CXCR 3-axis block is a new strategy for ECM treatment)
Given that the CCL21-CCR7-CXCR3 axis has an important role in CD8α DC-CD8 T cell-mediated ECM immunopathology, we consider that CCL21 can be utilized as a therapeutic target for the treatment of ECM. I evaluated it. In vivo treatment of OPbA-infected mice with anti-CCL21 antibody during the first 3 days of infection led to significantly better survival in mice compared to mice treated with isotype control (Fig. 6F, ** p < 0.01). However, anti-CCL21 antibody treatment 4 days after infection had no significant effect on the progression of ECM (data not shown), and the involvement of CCL21 during the late stages of ECM was associated with other effector mechanisms. It was suggested that activation could impair it. Therefore, we made a combination of targeting CCR21 and CXCR3. As a proof of concept, blocking of CXCR3 with suboptimal doses of antibody (100 μg) on days 4 and 5 after infection resulted in significant survival from ECM in Ccr7 − / − mice compared to WT-compatible mice. Brought about (Fig. 6D). Similarly, combined antibody treatment with an anti-CXCR3 + CCL21 antibody mixture on the day of olfactory loss (4th day after infection) resulted in better survival from ECM than anti-CXCR3 antibody monotherapy (not shown). These data suggest that combined blocking of chemokines can be utilized as a novel therapeutic strategy that can lead to escape from ECM. The omitted figure shows the survival curve for combined anti-chemokine antibody treatment. A mixture of anti-CXCR3 and anti-CCL21 antibodies was injected 4 days after infection when olfactory loss began. Anti-CCL21 antibody injection was repeated on day 5. By Log-rank (Mantel-Cox) test, * p <0.05 (n = 5 in each group) in the control-anti-CXCR3 antibody group and the control-combination therapy group. The results showed that they resulted in better survival from ECM than anti-CXCR3 antibody monotherapy.
（実施例４：霊長類での確認：脳マラリアと嗅球の関係性）
次に、本実施例では、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を霊長類で行う。
(Example 4: Confirmation in primates: Relationship between brain malaria and olfactory bulb)
Next, in this example, an experiment on the relationship between brain malaria and the olfactory bulb is performed in primates.
（嗅球は脳マラリアのサルモデルにおいて標的化される）
本発明者らは最後に、我々の知見が非ヒト霊長類のＯＬＦのＭＲＩを行うことによって、ヒトにも応用可能であるかどうかを検討する。ニホンザル（Ｍａｃａｃａ ｆｕｓｃａｔａ）のＰ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染は、脳マラリアの霊長類モデルである（Kawai, S.およびSugiyama, M. (2010).Acta Trop 114, 152-156.）。Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染した赤血球のｉ．ｖ．接種後、サルを毎日追跡し、血液スメアから寄生虫血症レベルをカウントする。寄生虫血症レベルが低く、おそらくは毛細血管内に隔離されており、サルが典型的な症状を示し、昏睡状態となった終わりに、検死解剖を行う。頭蓋を摘出した後、頭部を４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、７Ｔ ＭＲＩを用いて全頭部のイメージングを行う。７Ｔ ＭＲＩは、ＯＬＦ内でいくつかの疑わしい出血スポットを検出すること、および脳の他の部分には出血の徴候を確認することができる。出血スポットの存在を確認するために、ＯＬＦを取り出し、１１．７Ｔ ＭＲＩによるイメージングを行う。超高磁場イメージングは、マウスと同様に、Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染後のサルのＯＬＦ内で出血が生じることを確認することができる。これに対して、ナイーブなサル、ならびに、重篤なマラリアモデルであるが脳マラリアではないＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉｉ感染サルからのＯＬＦでは低密度な領域は存在しないことを確認することが出来る（White, N.J. (2008). Clin Infect Dis 46, 172-173.）。
(The olfactory bulb is targeted in a monkey model of brain malaria)
Finally, we examine whether our findings can be applied to humans by performing MRI of non-human primate OLFs. Japanese macaque (Maca fuscata) P.M. Coatneyi infection is a primatological model of brain malaria (Kawai, S. and Sugiyama, M. (2010). Acta Trop 114, 152-156.). P. cotneyi Infected erythrocytes i. v. After inoculation, monkeys are followed daily and parasitemia levels are counted from blood smears. Autopsy is performed at the end of the monkey's typical symptoms, coma, with low levels of parasitemia, probably isolated within capillaries. After removal of the skull, the head is fixed in 4% paraformaldehyde and the entire head is imaged using 7T MRI. 7T MRI can detect some suspicious bleeding spots within the OLF and show signs of bleeding in other parts of the brain. To confirm the presence of bleeding spots, the OLF is removed and imaged by 11.7T MRI. Ultra-high magnetic field imaging is performed in the same manner as in mice. It can be confirmed that bleeding occurs in the OLF of monkeys after coatneyi infection. On the other hand, naive monkeys and P. cerevisiae, which is a serious malaria model but not brain malaria. It can be confirmed that there are no low-density regions in OLF from Knowlesii-infected monkeys (White, NJ (2008). Clin Infect Dis 46, 172-173.).
予備的な実験結果では、サルでもマウスと同様の結果が出ていることが確認されている。 Preliminary experimental results have confirmed that monkeys have similar results to mice.
（考察）
脳は、ＢＢＢの破壊、血管漏出、免疫細胞の蓄積（特に、ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤）といった多数の病理学的事象に起因してＥＣＭ中に重度に機能不全となるが、脳が破壊される正確な位置はあまり理解されていない。本研究において、本発明者らは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、ＯＬＦ領域がＥＣＭ中の血管漏出の攻撃を受けやすい場所であることを同定したが、この発見は、超高磁場ＭＲＩを、ＭＰ生体イメージング顕微鏡と組み合わせて用いることによってのみ可能となり得た。本発明者らはさらに、ＥＣＭにおいて昏睡状態の開始前に、初期の症状である嗅覚の喪失が存在することを同定した。１日でも早いマラリア性昏睡の検出が治療の成功率を劇的に増大させ得ることを考慮すると、マラリア感染中のこの以前には気付かれていなかった真に見過ごされていた位置と、嗅覚の喪失の検出は、ＥＣＭの早期の安価でかつ容易な診断を提供し得、昏睡状態とその後の状態が確立する前の早期治療を可能にし得る。ＯＬＦを介したＥＣＭの病理の基礎的機構の探求において、本発明者らは、ＯＬＦの星状細胞から分泌されたＣＣＬ２１が、ＣＸＣＲ３ケモカイン軸を利用することにより、病理学的なＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の脳内への補充において役割を有し得ることを見い出した（図７）。本発明者らはさらに、この新たな理解を、ＥＣＭの初期症状である嗅覚の喪失が顕らかとなった時点で、抗体の組み合わせによりケモカイン−受容体相互作用をブロックすることによる新規治療ストラテジーへと発展させた。
(Discussion)
The brain becomes severely dysfunctional during ECM due to numerous pathological events such as BBB destruction, vascular leakage, and immune cell accumulation (particularly CD8 T cell infiltration), but the brain is destroyed. The exact location is not well understood. In this study, we identified that the OLF region is vulnerable to vascular leakage during ECM in both mice and non-human primates, a finding of which is an ultra-high magnetic field MRI. Could only be made possible by using in combination with an MP bioimaging microscope. We further identified in ECM that there is an early symptom of olfactory loss prior to the onset of coma. Given that detection of malaria coma as early as one day can dramatically increase the success rate of treatment, this previously unnoticed, truly overlooked position during malaria infection and olfaction Detection of loss can provide an early, inexpensive and easy diagnosis of ECM and can enable early treatment of coma and subsequent conditions before they are established. In the search for the basic mechanism of ECM pathology via OLF, we found that CCL21 secreted from the astrocytes of OLF utilizes the CXCR3 chemokine axis to provide pathological CD11c + CD8 T. We have found that it may play a role in the replenishment of cells into the brain (Fig. 7). We further extend this new understanding to new therapeutic strategies by blocking chemokine-receptor interactions with antibody combinations when olfactory loss, an early symptom of ECM, becomes apparent. And developed.
興味深い疑問は、何故ＯＬＦがＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって影響を受ける最初の場所なのか、ということである。ＯＬＦは、様々な方向（放射状および接線方向）を向いた高密度の毛細血管から構成され（図２Ａ〜ＢおよびムービーＳ１）、このような構造は、血管を取り囲む星状細胞の細いエンドフィートとの密着結合のネットワークを呈し、ＢＢＢの「ガーディアン」を形作っている。これが血液と神経組織との間の物質の流れを制限するが、これはおそらく、密着結合が星状細胞間で情報を伝達する能力を介するものであり得る（Bailey, M.S.およびShipley, M.T. (1993). J Comp Neurol 328, 501-526.；Chen,Y.ら、(2013).J Biomed Opt 18, 126012.；Whitman, M.C.ら(2009). J Comp Neurol 516, 94-104.）。本研究において、ＯＬＦの神経層（ＯＮＬ）、糸球層（ＧＬ）周囲の血管足場、ならびに、僧帽細胞層（ＭＣＬ）程度の深さが、ＰｂＡ感染赤血球または寄生虫に関連した免疫学的事象による標的とされた。現在、本発明者らは、どの寄生虫または関連する因子がこのことに貢献し得るかを理解していないが、ＥＣＭの間に、ＯＬＦ内の密着結合ネットワーク（ＺＯ−１）が標的とされ、おそらくは破壊されていた可能性がある。末梢の寄生虫負荷量が非常に少ない場合でも、感染後３日目には、ＧＬおよびＭＣＬにおいて豊富な血管周囲の星状細胞エンドフィートが血管の変化を感知する可能性がある（Bailey, M.S.およびShipley, M.T. (1993). J Comp Neurol 328, 501-526.；De Saint Jan, D.およびWestbrook, G.L. (2005). J Neurosci 25, 2917-2924.；Petzold,G.C.ら、(2008). Neuron 58, 897-910.）。ＥＣＭ発病の際にも、毛細管細静脈および／または細動脈後の脳において同様の事象が報告された（Cabrales,P.ら、(2010). Am J Pathol 176,1306-1315.；Nacer,A.ら、(2012).PLoS Pathog 8, e1002982.）が、ＥＣＭ発病の際に異なる解剖学的構造に異なる役割が存在するかどうかについては、さらなる検討が必要である。 An interesting question is why OLF is the first place to be affected by Plasmodium parasites. The OLF is composed of dense capillaries oriented in various directions (radial and tangential) (FIGS. 2A-B and movie S1), such a structure with the thin end feet of astrocytes surrounding the blood vessels. It presents a tight junction network of, forming the BBB's "guardian". This limits the flow of material between blood and nervous tissue, probably through the ability of tight junctions to transmit information between astrocytes (Bailey, MS and Shipley, MT (1993). ). J Comp Neurol 328, 501-526 .; Chen, Y. et al. (2013). J Biomed Opt 18, 126012 .; Whitman, MC et al. (2009). J Comp Neurol 516, 94-104.). In this study, the depth of the OLF neural layer (ONL), vascular scaffolding around the glomerular layer (GL), and mitral cell layer (MCL) is immunologically associated with PbA-infected erythrocytes or parasites. Targeted by the event. Currently, we do not understand which parasites or related factors can contribute to this, but during ECM, tight junction networks (ZO-1) within the OLF are targeted. , Probably destroyed. Even with very low peripheral parasite loading, astrocyte perivascular astrocytes abundant in GL and MCL may sense vascular changes 3 days after infection (Bailey, MS). And Shipley, MT (1993). J Comp Neurol 328, 501-526 .; De Saint Jan, D. and Westbrook, GL (2005). J Neurosci 25, 2917-2924 .; Petzold, GC et al., (2008). Neuron 58, 897-910.). Similar events were reported in the brain after capillary venules and / or arterioles during the onset of ECM (Cabrales, P. et al. (2010). Am J Pathol 176,1306-1315 .; Nacer, A. Et al. (2012). PLoS Pathog 8, e1002982.) Need further investigation as to whether different anatomical structures have different roles in the onset of ECM.
ＯＬＦは、ＯＬＦの神経投射、特に、化学感受性の動的な位置として知られる。ＯＬＦ神経は、鼻粘膜から始まり、篩板を経由して嗅球で終わる。リンパ管や血管がこれらの神経を取り囲み、これらの管を通じて、分子、細胞、そして病原体さえもが、脳の実質へのアクセスを獲得し得る（Danielyan, L.ら(2009). Eur J CellBiol 88, 315-324.）。近年の研究は、神経細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）から神経を介して、脳血管に沿ってＯＬＦに向かって移動することを明らかにしており（Bovetti, S.ら(2007). J Neurosci 27,5976-5980.）、ＯＬＦが外的環境とＣＮＳとの間の動的な細胞移動の出入口となり得ることを示唆している。それゆえ、神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病、そして、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患を罹患する患者が、初期症状としてＯＬＦの機能不全を経験するのは合理的である（Mesholam, R.I.ら(1998). ArchNeurol 55, 84-90.；Perricone, C.ら(2012). Smell and Autoimmunity: A Comprehensive Review.Clin Rev Allergy Immunol. (2012年12月13日オンライン版公開，doi:10.1007/s12016-012-8343-x)；Talamo, B.R.ら(1989). Nature 337,736-739.）。同様に、本発明者らの知見は、ｉＲＢＣが血管の内部を移動したとしても、これらの密集した様々な方向に構造化された毛細血管が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の付着／閉塞に適した環境ともなり、これらの連続した事象が、嗅覚の喪失の理由となり得ることを意味している。 OLF is known as the neural projection of OLF, in particular the dynamic location of chemical sensitivity. The OLF nerve begins at the nasal mucosa and ends at the olfactory bulb via the lamina cribrosa. Lymphatic vessels and blood vessels surround these nerves, through which molecules, cells, and even pathogens can gain access to the parenchyma of the brain (Danielyan, L. et al. (2009). Eur J CellBiol 88). , 315-324.). Recent studies have shown that nerve cells migrate from the central nervous system (CNS) via nerves to the OLF along the cerebrovascular disease (Bovetti, S. et al. (2007). J Neurosci). 27,5976-5980.), Suggesting that OLF can be a gateway for dynamic cell migration between the external environment and the CNS. Therefore, it is reasonable for patients with neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) to experience OLF dysfunction as an initial symptom. (Mesholam, RI et al. (1998). ArchNeurol 55, 84-90 .; Perricone, C. et al. (2012). Smell and Autoimmunity: A Comprehensive Review. Clin Rev Allergy Immunol. doi: 10.1007 / s12016-012-8343-x); Talamo, BR et al. (1989). Nature 337,736-739.). Similarly, our findings indicate that even if the iRBC moves inside the blood vessels, these densely structured capillaries in various directions are suitable environments for attachment / occlusion of Plasmodium parasites. This means that these consecutive events can be the reason for the loss of olfaction.
本研究は、ＯＬＦからのＢＢＢ開口に先行して関与し得る因子を同定した。ＢＢＢ漏出に関与する因子の一つは、高熱であり得る。マウス敗血症モデルと同様に、マウスマラリアモデルにおいて体温調節が存在するはずであると推測されるが、現在、マウスマラリアにおいてる熱から起こる反応は報告されていない（Lamb, T.J.ら(2006). Expert RevMol Med 8, 1-22.）。さらに、マウスの脳マラリアは、ヒトの感染とは対照的に、低体温症を引き起こすと考えられる（Grau, G.E.ら(1991). Eur J Immunol21, 2265-2267.）。サーマルカメラを用いることによって、最近開発された新しいが比較的単純な技術（AoshiおよびIshii、論文投稿準備中、特開２０１２−２３１７２５参照）が、熱損や死といった、疾患の最終的な顕在化の２４時間前に、別の発熱期間が生じることを検出した。重要なことに、この発熱期間は、重篤な嗅覚の喪失と相関していた。マウスのサーカディアンリズムが、単一時点における正確な発熱の測定を妨げることを考慮すると、以前の研究が、疾患の最終段階における最終的な熱損しか測定できなかったことは驚くべきことではない。本発明者らは、全身性および局所性のサイトカインおよびケモカインストームが、ヒトの脳マラリアの場合と同様に、マウスにおいて高熱の攻撃を引き起こし得、そしておそらくは、ＢＢＢの完全性の喪失において主要な役割を有したと結論付けた。重要なことに、Ｒａｇ２−／−マウスならびに非致死性および致死性のＰｙ感染において高熱が存在しないことは、発熱がＥＣＭに関連しており、脳マラリアの間のＢＢＢ漏出に関連し得るという本発明者らの知見を確認し得る。しかしながら、ＥＣＭの間に発熱を引き起こすメディエーターとそのＢＢＢ破壊に対する直接的な役割は、現在未知のままである。発熱の機構とそのサイトカイン血症との関連性の科学的な理解は、ＬＰＳのような大部分は細菌性の生成物と、発熱がサイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦαとよく相関することが知られるＬＰＳチャレンジモデルとを用いてしか行われていない（Netea,M.G.ら、(2000). Clin Infect Dis 31 Suppl5, S178-184.）。これに対し、これらとまったく同じサイトカインが上昇し、マラリア性の発熱を引き起こすマウスマラリアにおいて入手可能な明確な情報および直接的な相関性は存在しない。明らかに、この領域にはさらなる検討が必要である。 This study identified factors that could precede BBB opening from OLF. One of the factors involved in BBB leakage can be high fever. Similar to the mouse sepsis model, it is speculated that thermoregulation should be present in the mouse malaria model, but no response from heat in mouse malaria has been reported at present (Lamb, TJ et al. (2006). Expert. RevMol Med 8, 1-22.). In addition, mouse brain malaria is thought to cause hypothermia, as opposed to human infection (Grau, GE et al. (1991). Eur J Immunol21, 2265-2267.). By using a thermal camera, a new but relatively simple technology recently developed (Aoshi and Ishii, preparing to submit a paper, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-231725) finally reveals diseases such as heat loss and death. It was detected that another fever period occurred 24 hours before. Importantly, this period of fever correlated with severe olfactory loss. Given that mouse circadianism interferes with accurate measurement of fever at a single point in time, it is not surprising that previous studies could only measure final heat loss in the final stages of the disease. We find that systemic and local cytokines and chemokine storms can cause high fever attacks in mice, as in human brain malaria, and perhaps a major role in the loss of BBB integrity. It was concluded that it had. Importantly, the absence of high fever in Rag2-/- mice and non-lethal and lethal Py infections states that fever is associated with ECM and may be associated with BBB leakage during brain malaria. The findings of the inventors can be confirmed. However, the direct role of mediators causing fever during ECM and their BBB destruction remains unknown at present. A scientific understanding of the mechanism of fever and its association with cytokineemia is that mostly bacterial products such as LPS and fever are known to correlate well with the cytokines IL-1β and TNFα. It has only been done using a challenge model (Netea, MG et al. (2000). Clin Infect Dis 31 Suppl5, S178-184.). In contrast, there is no clear information or direct correlation available for mouse malaria in which the exact same cytokines are elevated and cause malaria fever. Obviously, this area needs further study.
星状細胞は、血流の調節とＢＢＢの維持に必須の一般的なＣＮＳ駐在細胞である。星状細胞はまた、生理学的状態および病理学的状態の間に広範な種々のケモカインを発現することによって、ＣＮＳの免疫防御においても重要な働きを有する（de Haas, A.H.ら(2007). MolNeurobiol 36, 137-151.；Medana,I.M.ら、(1996). Glia 16, 51-64.）。さらに、星状細胞は、ＣＮＳ損傷および感染に応答してＣＣＬ２１発現を増加させる（Lalor, S.J.およびSegal, B.M.(2010). J Neuroimmunol 224, 56-61.；Noor, S.ら(2010). Infect Immun 78,2257-2263.）。ＯＬＦ、特に、非常に多数の星状細胞が存在するＧＬにおけるＣＣＬ２１発現の勾配が増加していることから、本発明者らは、Ｃｃｒ７欠失マウスを検討することにした。なぜならば、ＣＣＲ７は、そのリガンドであるＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１との相互作用を介して、ＣＮＳの免疫監視のためのリンパ球の往来を調節しているからである（Noor, S.およびWilson, E.H. (2012).J Neuroinflammation 9, 77.）。加えて、これまでの研究が、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ１のようなケモカイン受容体が、脳内への細胞の移動にとって重要であり得ること（Miu, J.ら(2008). J Immunol 180,1217-1230.）、そして、ケモカイン／ケモカイン受容体を欠失するマウスにおいて、ＣＣＲ１およびＣＣＲ２がＥＣＭの発病に不必要であったのに対し、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ３は、脳マラリアの最中に脳内へのＣＤ８ Ｔ細胞の移動を増強したこと（Belnoue, E.ら(2003). Infect Immun71, 3648-3651.；Belnoue, E.ら(2003). Blood 101, 4253-4259.；Hansen, D.S. (2012). PLoS Pathog 8, e1003045.；Miu, J.ら(2008).J Immunol 180, 1217-1230.）を報告している。抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーＣＴＬ応答の誘導および維持におけるＣＣＲ７の役割は、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて徹底的に検討されているが（Junt, T.ら(2004). J Immunol 173,6684-6693.）、ＥＣＭなどの重篤なマラリアモデルにおけるＣＣＲ７の役割はこれまでに検討されていなかった。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染モデルにおいて、ＣＣＲ７は、抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーＣＴＬの移動および増殖の協調にとって重要であった（Junt, T.ら(2004). J Immunol 173,6684-6693.）。同様に、本発明者らは、ＣＤ１１ｃを発現するエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の増殖および移動が、ＣＣＲ７の非存在下において、脾臓ならびに脳でひどく損なわれていることを見い出した。しかしながら、Ｒａｇ２−／−マウスからのＣＤ８α ＤＣを用いた本発明者らの詳細な分析からは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が、脾臓におけるＣＤ８α ＤＣからの抗原性刺激を必要とし、ＣＣＲ７の存在お必要としたと結論付けるに至った。ＣＤ８α ＤＣは、抗原、特に、死細胞からの抗原をＴ細胞に対してクロスプレゼンテーションし得ることが示唆された（Shortman, K.およびHeath, W.R.(2010). Immunol Rev 234, 18-31.）。他方で、Ｂａｔｆ３−／−マウスが部分的（約５０％）にしかＥＣＭから逃れることができないことを考慮すると、ＥＣＭの間に、ＢＡＴＦ３、ＢＡＴＦおよびＢＡＴＦ２の組み合わさった作用の結果としてＤＣ発症におけるＢＡＴＦファミリーのメンバー間で代償が生じるのか、あるいは、他のＤＣタイプの間で代償が生じるのかについては、さらなる検討が必要である（Edelson,B.T.ら、(2011). Immunity 35, 236-248.；Murphy,T.L.ら、(2013). Nat Rev Immunol 13,499-509.）。それにもかかわらず、これらの結果は、ＰｂＡ感染中のＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８α ＤＣクロスプライミングが、エフェクターＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導するＣＣＲ７を必要とし、これらのＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞がＯＬＦを介して脳内に移動し、最終的にはＥＣＭを引き起こすことを示した。しかしながら、活性化されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞は、エフェクター期に、ＩＰ−１０およびＣＸＣＲ３のようないくつかのケモカインおよびケモカイン受容体を含む複数の分子を介して脳に移動する。ＣＣＬ２１がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングに関与していることは明らかであるが、感染後３日目という感染早期のＯＬＦにおけるＣＣＬ２１の存在は、Ｔ細胞の移動についての化学走性の裏付けとのその関連性を意味した。本発明者らの仮説の裏付けとして、ＣＸＣＲ３は、特に星状細胞および小膠細胞において、ＣＣＬ２１の代替的ケモカイン受容体として認識されている（van Weering, H.R.ら(2010).BrainBehav Immun 24, 768-775.）。さらに、ＣＣＬ２１が、トキソプラズマ感染後に脳において急速に増加し、Ｔ細胞の移動を裏付けることが示されている（Wilson, E.H.ら(2009). Immunity 30,300-311.）。それゆえ、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞もまた、ＣＣＬ２１が関与する同様の機構によってＯＬＦに移動し得る可能性がある。本発明者らによるインビトロのトランスウェル移動アッセイは、これらの仮説を裏付けるが、ＯＬＦ機能不全の発症時（４日目）における抗ＣＣＬ２１抗体治療の効果が限られていることから、インビボでＥＣＭのエフェクター期に病理を引き起こす他の機構による代償が示唆され得る。とはいえ、本発明者らは、本明細書において、ＣＣＬ２１のブロッキング、抗ＣＣＬ２１治療、ならびに、ＣＣＲ７−ＣＣＬ２１軸およびＣＸＣＲ３−ＣＣＬ２１軸の妨害の組み合わせという新たな治療アプローチは、ＥＣＭ処置のための新規ストラテジーとして開発され得るという「概念実証」を示す。嗅覚の喪失が、ＥＣＭ症状の新たな早期診断マーカーとなり得、ＰｂＡ感染後早くも４日目には、マウスの治療を可能にし得ることは特筆すべきである。 Astrocytes are common CNS-resident cells essential for the regulation of blood flow and maintenance of BBB. Astrocytes also play an important role in the immune defense of CNS by expressing a wide variety of chemokines during physiological and pathological conditions (de Haas, AH et al. (2007). Mol Neurobiol. 36, 137-151 .; Medana, IM et al., (1996). Glia 16, 51-64.). In addition, astrocytes increase CCL21 expression in response to CNS injury and infection (Lalor, SJ and Segal, BM (2010). J Neuroimmunol 224, 56-61 .; Noor, S. et al. (2010). Infect Immun 78,2257-2263.). Due to the increased gradient of CCL21 expression in OLFs, especially in GLs with a very large number of astrocytes, we decided to examine Ccr7 deficient mice. This is because CCR7 regulates lymphocyte traffic for immune surveillance of CNS through its interaction with its ligands, CCL19 and CCL21 (Noor, S. and Wilson, EH (Noor, S. and Wilson, EH). 2012). J Neuroinflammation 9, 77.). In addition, previous studies have shown that chemokine receptors such as CCR1, CCR2, CCR5, CCR7, CCR8, CXCR3 and CXCR1 may be important for cell migration into the brain (Miu, J. et al. (Miu, J. et al. 2008). J Immunol 180,1217-1230.) And in mice lacking chemokines / chemokine receptors, CCR1 and CCR2 were not required for the development of ECM, whereas CCR5 and CXCR3 were brain. Enhanced migration of CD8 T cells into the brain during malaria (Belnoue, E. et al. (2003). Infect Immun71, 3648-3651 .; Belnoue, E. et al. (2003). Blood 101, 4253- 4259 .; Hansen, DS (2012). PLoS Pathog 8, e1003045 .; Miu, J. et al. (2008). J Immunol 180, 1217-1230.). The role of CCR7 in inducing and maintaining antiviral effectors and memory CTL responses has been thoroughly investigated in Ccr7 − / − mice (Junt, T. et al. (2004). J Immunol 173,6684-6693. The role of CCR7 in severe malaria models such as ECM has not been investigated so far. In a model of lymphocytic choriomeningitis virus infection, CCR7 was important for coordination of migration and proliferation of antiviral effectors and memory CTLs (Junt, T. et al. (2004). J Immunol 173,6684- 6693.). Similarly, we have found that the proliferation and migration of effector CD8 T cells expressing CD11c is severely impaired in the spleen and brain in the absence of CCR7. However, a detailed analysis by the inventors using CD8α DC from Rag2 − / − mice shows that the proliferation of CD11c + CD8 T cells requires antigenic stimulation from CD8α DC in the spleen and the presence of CCR7. I came to the conclusion that I needed it. It has been suggested that CD8α DC can cross-present antigens, especially those from dead cells, to T cells (Shortman, K. and Heath, WR (2010). Immunol Rev 234, 18-31.). .. On the other hand, considering that Battf3 − / − mice can only partially (about 50%) escape from ECM, in DC onset as a result of the combined action of BATF3, BATF and BATF2 during ECM. Further consideration is needed as to whether there is a price between members of the BATF family or between other DC types (Edelson, BT et al., (2011). Immunity 35, 236-248. Murphy, TL et al. (2013). Nat Rev Immunol 13,499-509.). Nonetheless, these results show that CD8α DC crosspriming of CD8 T cells during PbA infection requires CCR7 to induce proliferation of effector CD11c + CD8 T cells, and these CD11c + CD8 T cells produce OLF. It has been shown to migrate through the brain and eventually cause ECM. However, activated CD11c + CD8 T cells migrate to the brain during the effector phase via multiple molecules, including several chemokines and chemokine receptors such as IP-10 and CXCR3. Although it is clear that CCL21 is involved in the priming of CD11c + CD8 T cells, the presence of CCL21 in the early infection OLF, 3 days after infection, supports chemotaxis for T cell migration. It meant that relevance. In support of our hypothesis, CXCR3 has been recognized as an alternative chemokine receptor for CCL21, especially in astrocytes and microglia (van Weering, HR et al. (2010). BrainBehav Immun 24, 768. -775.). Furthermore, CCL21 has been shown to increase rapidly in the brain after Toxoplasma infection, supporting T cell migration (Wilson, EH et al. (2009). Immunity 30,300-311.). Therefore, CXCR3 + CD8 T cells may also migrate to OLF by a similar mechanism involving CCL21. The in vitro transwell transfer assay by the present inventors supports these hypotheses, but due to the limited effect of anti-CCL21 antibody treatment at the onset of OLF dysfunction (day 4), ECM in vivo. Compensation by other mechanisms that cause pathology during the effector phase may be suggested. Nonetheless, we present in this specification a new therapeutic approach, a combination of blocking CCL21, anti-CCL21 treatment, and interference of the CCR7-CCL21 axis and CXCR3-CCL21 axis, for ECM treatment. Shows a "proof of concept" that can be developed as a new strategy. It is noteworthy that loss of olfaction can be a new early diagnostic marker for ECM symptoms and can enable treatment of mice as early as 4 days after PbA infection.
まとめると、本研究は、ＯＬＦが、マウスおよびサルの両方において、多くの病原菌が脳に侵入するための「弱点」であり、それゆえ、その複雑な毛細管構造がＥＣＭを引き起こすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の標的となり得ることを実証する。マウスの研究はまた、病原性ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のような免疫細胞がＯＬＦにおける微小出血を介して脳に侵入すると結論付けた。感染初期のＯＬＦのＧＬにおけるＣＣＬ２１は、病原性ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の蓄積の基礎的な機構の一つとなり得、ＣＣＬ２１の発現は、ＥＣＭの発症にとってのリスクファクターとなり得る（図７）。これらの結果は、ＯＬＦの機能不全がＥＣＭの発症および早期診断の有用なマーカーであるという証拠を提供する。現在、マウスにおけるこれらの知見がヒトにも適用可能であるかどうかは不明である。特筆すべきことに、「幻嗅」（Perry,T.L.ら、(2009). Open Med 3, e10-16.）のように、ヒトにおけるＯＬＦが関与する症状は、マウスのものとは異なり得る。嗅覚の喪失の新たな試験や、改良されたヒトＯＬＦ ＭＲＩイメージング（Wang,J.ら、(2011). AJNR Am J Neuroradiol 32,677-681.）のような技術が将来必要とされるのは明らかである。さらに、ＯＬＦ、早期のＢＢＢ漏出および出血の位置は、脳マラリアにとって、ならびに、ヒトにおける自己免疫疾患および炎症性疾患を含む様々な神経免疫学的疾患にとって、有用な治療標的であることが証明され得る（Barresi,M.ら、(2012). J Neurol Sci 323, 16-24.）。 In summary, the study studies that OLF is a "weakness" for many pathogens to invade the brain in both mice and monkeys, and therefore its complex capillary structure is the target of Plasmodium parasites that cause ECM. Demonstrate that it can be. Mice studies also concluded that immune cells, such as pathogenic CD11c + CD8 T cells, invade the brain via microhemorrhages in OLF. CCL21 in the GL of OLF in the early stages of infection can be one of the basic mechanisms of accumulation of pathogenic CD11c + CD8 T cells, and expression of CCL21 can be a risk factor for the development of ECM (Fig. 7). These results provide evidence that OLF dysfunction is a useful marker for the onset and early diagnosis of ECM. At present, it is unclear whether these findings in mice are also applicable to humans. Notably, the symptoms associated with OLF in humans, such as "phantosmia" (Perry, TL et al., (2009). Open Med 3, e10-16.), Can differ from those in mice. It is clear that new trials of olfactory loss and techniques such as improved human OLF MRI imaging (Wang, J. et al. (2011). AJNR Am J Neuroradiol 32,677-681.) Will be needed in the future. is there. In addition, the location of OLF, early BBB leakage and bleeding has proven to be a useful therapeutic target for brain malaria and for various neuroimmunological disorders, including autoimmune and inflammatory disorders in humans. Obtain (Barresi, M. et al., (2012). J Neurol Sci 323, 16-24.).
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As described above, the present invention has been illustrated using the preferred embodiments of the present invention, but it is understood that the scope of the present invention should be interpreted only by the scope of claims. The patents, patent applications and documents cited herein are to be incorporated by reference in their content as they are specifically described herein. Understood.
脳マラリアの診断・検出マーカーおよび脳マラリアの制御技術が提供され、脳マラリアの診断、治療および予防に関連する技術に関与する産業（試薬、製薬等）において利用可能な技術が提供される。 Diagnostic and detection markers for cerebral malaria and control techniques for cerebral malaria are provided, and technologies available in industries (reagents, pharmaceuticals, etc.) involved in technologies related to diagnosis, treatment and prevention of cerebral malaria are provided.
配列番号１：ＣＣＬ２１の代表的核酸配列
配列番号２：ＣＣＬ２１の代表的アミノ酸配列
配列番号３：ＣＸＣＲ３の代表的核酸配列
配列番号４：ＣＸＣＲ３の代表的アミノ酸配列
配列番号５：ＣＣＲ７の代表的核酸配列
配列番号６：ＣＣＲ７の代表的アミノ酸配列
SEQ ID NO: 1: Representative nucleic acid sequence of CCL21 SEQ ID NO: 2: Representative amino acid sequence of CCL21 SEQ ID NO: 3: Representative nucleic acid sequence of CXCR3 SEQ ID NO: 4: Representative amino acid sequence of CXCR3 SEQ ID NO: 5: Representative nucleic acid sequence of CCR7 SEQ ID NO: 6: Representative amino acid sequence of CCR7
Claims (12)
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９
（３）ＣＤ８α樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ８Ｔ細胞
からなる群より選択される、少なくとも１つの因子をさらなる脳マラリアの指標とする、
請求項１に記載の使用。 (1) A group consisting of at least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG), a nucleic acid encoding them, and an expression product thereof. At least one selected from;
(2) CCL21 and / or CCL19
At least one factor selected from the group consisting of (3) CD8α dendritic cells; and (4) CD8T cells is used as an index of further brain malaria.
Use according to claim 1.
（Ｂ）皮質におけるＩＦＮ−γの発現上昇；
（Ｃ）前記ＣＤ８α樹状細胞は、ＣＣＲ７依存的にプライミングされるものが観察されること；および／または
（Ｄ）脳または脾臓において活性化ＣＤ８Ｔ細胞が観察されること
を脳マラリアの発症のさらなる指標とする、請求項１に記載の使用。 (A) Increased expression of CCL21 and / or CCL19 in the olfactory bulb;
(B) Increased expression of IFN-γ in the cortex;
Further development of brain malaria is that (C) the CD8α dendritic cells are observed to be CCR7-dependently primed; and / or (D) activated CD8T cells are observed in the brain or spleen. Use according to claim 1 as an index.
（２）ＣＸＣＲ３タンパク質またはこれをコードする核酸；および
（３）ＣＣＲ７タンパク質またはこれをコードする核酸
からなる群から選択される少なくとも２つの因子を指標とする、請求項１に記載の使用。 (1) CCL21 protein or nucleic acid encoding it;
The use according to claim 1, wherein at least two factors selected from the group consisting of (2) CXCR3 protein or nucleic acid encoding it; and (3) CCR7 protein or nucleic acid encoding it are used as indicators.
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