JP6841772B2

JP6841772B2 - 前立腺癌の処置におけるカバジタキセルの使用

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Publication number: JP6841772B2
Application number: JP2017561227A
Authority: JP
Inventors: ステファン・スライフェル; ウェンディー・オンステンク; アニタ・マリア・シーウェルツ
Original assignee: エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム
Priority date: 2015-02-17
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2021-03-10
Anticipated expiration: 2036-02-17
Also published as: EP3258931B1; WO2016133387A1; JP2018511651A; US10555926B2; PT3258931T; US20180064678A1; EP3258931A1; PL3258931T3; ES2817331T3

Description

本発明は、転移性であり得る前立腺癌の処置における、特に去勢抵抗性前立腺癌患者のための、カバジタキセルの新規な抗腫瘍的使用に関する。特に、本発明は、去勢抵抗性転移性前立腺癌患者の処置におけるカバジタキセルの使用であって、前記患者のアンドロゲン受容体スプライス変異体V7が陽性ステータスである、使用に関する。

前立腺癌は全世界の男性集団の大部分が罹患し、疾患が限局性である場合、又は、進行した疾患がアンドロゲン除去療法、免疫療法、化学療法、若しくは放射性医薬による根治術に不適格な症例では、一般に、アンドロゲン除去療法を併用して又は併用せずに、根治目的の治療法(根治的前立腺切除術(radical prostatectomy)又は放射線療法)による治療が行われる。

去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)患者における第一選択化学療法は、ドセタキセル(Taxotere (登録商標)の商品名で販売されている)のプレドニゾンとの組み合わせであり、2.4カ月の生存期間延長の効果が得られる。ドセタキセルは、エストラムスチン又はプラチナ系薬剤等の他の化学療法と組み合わせることができる。

今日では、プレドニゾンを追加したドセタキセルは、第一選択化学療法治療として、転移性CRPCの標準治療とみなされている。

全ての療法において重要な問題は、使用される薬剤、特にタキサンに対して癌が耐性となる場合があり、このために治療選択肢の候補が制限されることである。近年、前立腺癌の治療のための、特にドセタキセルベースのレジメンによる治療歴のある転移性去勢抵抗性前立腺癌(mCRPC)患者のための新規な治療選択肢が提供された。酢酸アビラテロン及びエンザルタミドはいずれもアンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達に作用し、ドセタキセル療法の前又は後の全生存期間(OS)を向上させる。次世代タキサンであるカバジタキセル(Jevtana (登録商標))は、ドセタキセル耐性を克服し、微小管の安定化を介して細胞分裂を阻止することを目的として開発が行われてきた。カバジタキセルは、エンザルタミド及び酢酸アビラテロンと同様に、ドセタキセルによる治療歴のあるmCRPC患者にOS延長の恩恵をもたらす。現在カバジタキセルは、ドセタキセル後の第二選択治療としてFDAによって承認されている。カバジタキセルに関しては、多数の臨床試験が実施されたか、現在進行中である。これらの試験全てにおいて、mCRPC患者のための一連の治療の順序を最適化する方法;カバジタキセルに適した患者を選択する最良の方法;そして、更に重要なこととして、治療の個別化を行う最善の方法が今日の重要な課題であることが強調されている。カバジタキセル並びに酢酸アビラテロン及びエンザルタミド等の新規のアンドロゲン受容体(AR)標的薬等の新薬に対する前立腺腫瘍の応答性/耐性を予測することができるバイオマーカーが必要とされている。

前臨床及び臨床データは、酢酸アビラテロン、エンザルタミド、及びドセタキセルの間に交差耐性があることを示している。ドセタキセルによる微小管安定化は、細胞分裂の阻害に続いてARの核内移行も阻害するため、ARシグナリングの阻害がこの交差抵抗に関与する3つの薬剤間に共通の作用機序と見られる。対照的に、酢酸アビラテロン、エンザルタミド、及びドセタキセルによる治療歴のある患者も、カバジタキセルからは依然として効果を得られるものと思われる。このように、以前の治療はその後の治療の転帰に影響を与えるものと見られ、腫瘍特性をリアルタイムで反映する信頼性のある予測因子の必要性が強調されている。

末梢血由来の循環腫瘍細胞(CTC)は過去10年間にわたり大きな注目を集めている。治療前及び治療中のCTCカウントは、mCRPCにおける無増悪生存期間(PFS)及びOSの強力な独立した予後因子であり、早期治療応答マーカーとしては前立腺特異抗原(PSA)測定値よりも優れている。CTCの計数よりも更に重要性が高い可能性があるのがCTCの特性評価である。近年、エンザルタミド又は酢酸アビラテロンを開始するmCRPC患者のCTCにおいて、トランケート型の構成的活性型ARをコードするAR mRNAスプライス変異体7 (AR-V7)の存在の評価が行われた(Antonarakisら、2014、N Engl J Med. 371:1028〜38頁)。調査された小規模の患者コホートでは、酢酸アビラテロン又はエンザルタミドに応答した患者は、AR-V7を有しない患者ではそれぞれ68%及び53%であるのに対し、CTC中にAR-V7転写産物を有しない患者では全くいなかった。AR-V7の存在は、AdnaTest (AdnaGen AG社、Langenhagen、Germany)により濃縮したCTCに対する逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を用いて測定されたが、これについては、mCRPCにおける妥当性に関しては限られたデータしか存在しない。上述の結果は、AR-V7陽性患者はエンザルタミド又は酢酸アビラテロンの投与を受けるべきではないことを強く示唆するものである。しかしながら、カバジタキセルがこれらの患者にとって依然として有効な治療選択肢であるかどうかは未だ解明されていない。

国際公開第96/30355号欧州特許第0817779号米国特許第5847170号国際公開第2005/028462号国際公開第2011/051894号米国特許第4348376号米国特許第4361544号米国特許第4331647号米国特許第4468457号米国特許第4444744号米国特許第4460559号米国特許第4460561号

Antonarakisら、2014、N Engl J Med. 371:1028〜38頁 Gregoryら、2001、J Mol Endocrinol 27:309〜19頁 Huら、2009、Cancer Res 69:16〜22頁 Ausubelら、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley、New York Sambrookら、2001、Molecular cloning: a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York J. Pharm. Sci、1975、64(8)、1269〜1288頁 Portellaら、2013、Cancer Res 73:4081頁 Thadani-Muleroら、2014、Cancer Res 74:2270〜82頁 Lu及びLuo、2013、Trans Androl Urol 2:178〜186頁 Karabacak、2014、Nature Protocols 9、694〜710頁 Harlow及びLane、「Antibodies, A Laboratory Manual」 Hollingerら、1993、PNAS USA 90:6444〜6448頁 Nordら、1995、Prot Eng 8:601〜608頁 Skerra、2008、FEBS J. 275:2677〜2683頁 Silvermanら、2005、Nat Biotechnol 23:1556〜1561頁 Sieuwertsら、2009、Breast Cancer Res Treat 118:455〜68頁 Sieuwertsら、2011、Clin Cancer Res 17:3600〜18頁 Scherら、2008、J Clin Oncol 26:1148〜59頁

本発明は、式:

のカバジタキセルの抗腫瘍医薬としての治療的使用の更なる医学的適応に関する。

特に、本発明は、第一の態様において、前立腺癌に罹患している患者の処置における医薬としての使用のためのカバジタキセルであって、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程と、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルをコルチコイドと組み合わせて前記患者へ投与する工程とを含む使用のためのカバジタキセルに関する。

別の態様では、本発明は、前立腺癌に罹患している患者を処置するための方法であって、該方法は、患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程と、前記患者に、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルをコルチコイドと組み合わせて投与する工程とを含む、方法に関する。

別の態様では、本発明は、前立腺癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造のための、コルチコイドと組み合わせた塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルの使用であって、前記使用は、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程を含む、使用に関する。

上記態様の好ましい実施形態では、前立腺癌は、転移性去勢抵抗性前立腺癌(mCRPC)である。しかしながら、AR-V7はまた、転移性非去勢抵抗性前立腺癌並びに限局性の去勢抵抗性若しくは非去勢抵抗性前立腺癌においても検出され得る。

上記態様の他の好ましい実施形態では、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程は、単離腫瘍細胞に対して実施される。好ましい実施形態では、前記単離腫瘍細胞は循環腫瘍細胞(CTC)である。

上記態様の非常に好ましい実施形態では、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程は、単離CTCに対して、CELLSEARCH (登録商標)循環腫瘍細胞試験(Circulating Tumor Cell Test) (CELLSEARCH (登録商標) Circulating Tumor Cell Kit (Epithelial)、Janssen Diagnostics, LLC社)を用いて実施される。

上述の態様のいくつかの好ましい実施形態では、患者は、ドセタキセルベースのレジメンによる治療歴を有する。

本発明の上記態様のいくつかの他の好ましい実施形態では、患者は、ドセタキセル、並びに、酢酸アビラテロン及び/若しくはエンザルタミド等の新規のAR標的薬に対して耐性であるか、/又は、患者は、ドセタキセル及び/若しくは新規のAR-アゴニストによる治療歴を有する場合、ドセタキセル及び/若しくは新規のAR標的薬に対してまだ耐性になっていない。そのような実施形態では、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルは、コルチコイドと組み合わせて、前立腺癌、好ましくはmCRPCの処置のための第二選択細胞傷害性化学療法の一部として使用される。

或いは、本発明の上記態様の他の好ましい実施形態では、患者は、ドセタキセル及び/又はAR標的薬による治療歴を有しない。そのような実施形態では、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルは、コルチコイドと組み合わせて、前立腺癌、好ましくはmCRPCの処置のための第一選択細胞傷害性化学療法の一部として使用される。

本発明の上述の態様では、前立腺癌患者を処置する工程は、好ましくは、有効量の抗腫瘍薬カバジタキセルを前記患者に投与する工程を含む。

この抗腫瘍薬は、前立腺癌、特にドセタキセルベースのレジメンによる治療歴のある患者を処置することを意図した、無水塩基、水和物、又は溶媒和物の形態であってよい。この化合物は、好ましくは、既に去勢抵抗性となっている転移性疾患患者に投与される。カバジタキセルは、好ましくは、コルチコイド、特にプレドニゾン及びプレドニゾロンから選択されるコルチコイドと組み合わせて投与される。このコルチコイドは、好ましくは、1日用量10mgで経口投与される。

本発明のいくつかの態様では、カバジタキセルは、ドセタキセルベースのレジメンによる治療歴のあるホルモン不応性前立腺癌患者の処置における医薬としての使用のために、プレドニゾンと組み合わせて投与される。

本発明のいくつかの態様では、カバジタキセルは、20から25mg/m²の間の(投与毎に規定された)用量で投与される。カバジタキセルは、アセトン溶媒和物の形態であってよい。より詳細には、カバジタキセルのアセトン溶媒和物は、5質量%から8質量%の間、好ましくは5質量%から7質量%の間のアセトンを含有する。

本発明のいくつかの態様では、カバジタキセルは、15から25mg/m²の間の用量で静脈内注入によって投与することができ、この抗腫瘍薬の投与サイクルは、各カバジタキセル投与の間に3週間の間隔をあけて繰り返されるが、この間隔は、先行するカバジタキセル投与に対する忍容性に応じて1から2週間延長することができる。

いくつかの実施形態では、有効量のカバジタキセルは、全生存期間の延長、部分奏功、腫瘍サイズの縮小、転移の減少、完全寛解、部分寛解、病勢安定、又は完全奏功からなる群から選択される少なくとも1つの治療効果をもたらす。

本発明はまた、臨床的に証明された安全かつ有効な量のカバジタキセルを含有する、前立腺癌患者を処置する医薬組成物に関する。

本発明の更なる実施形態は、カバジタキセルの使用方法、処置方法、促進方法、及び提供方法を含む。

本発明はまた、患者における前立腺癌、好ましくはmCRPCを処置する方法であって、患者からの生物学的試料中の循環腫瘍細胞のAR-V7ステータスを検査する工程と、試料の結果がAR-V7陽性である場合に、治療有効量の塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルを、コルチコイドと組み合わせて患者に投与する工程とを含む、方法を提供する。

好ましい実施形態では、本発明に係る、患者における前立腺癌、好ましくはmCRPCを処置する方法は、
(a) 患者から得られた血液、血清、又は尿試料のうちの1つ中の単離腫瘍細胞、好ましくは単離循環腫瘍細胞におけるAR-V7ステータスを決定する工程であって、
- 上皮細胞接着を標的とする抗体を備えた磁性流体ナノ粒子、好ましくは磁性流体ナノ粒子を搭載した抗EpCAM抗体を用いて、試料中の本質的に全ての他の細胞から前記腫瘍細胞を磁気的に分離して、濃縮腫瘍細胞試料を提供する工程、
- 任意に、前記濃縮腫瘍細胞試料中の前記単離腫瘍細胞を、核DNA染色、好ましくはDAPI、及び、上皮細胞に特異的なサイトケラチンモノクローナル抗体、好ましくは抗サイトケラチン8/18/19を用いて前記試料中の前記腫瘍細胞を染色することにより、そして、任意に、白血球特異的抗CD45モノクローナル抗体染色を用いて前記試料中の染色された白血球から前記二重染色された腫瘍細胞を区別しながら、計数する工程、並びに
- 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によって前記濃縮腫瘍細胞試料中の腫瘍細胞中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7転写産物の存在を決定する工程であって、それによって、前記腫瘍細胞中のAR-V7転写産物の存在が前記患者のAR-V7陽性ステータスを示す、工程
を含む、工程、並びに
(b) 前記患者がAR-V7陽性ステータスを有する場合に該患者の前立腺癌を処置する工程であって、前記患者に、治療有効量の塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルを、コルチコイド、好ましくはプレドニゾン又はプレドニゾロンと組み合わせて投与する工程を含む、工程
を含む。

本発明はまた、前立腺癌に罹患しているAR-V7陽性患者を処置するための方法であって、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルを、それを必要とするAR-V7陽性患者に、任意にコルチコイドと組み合わせて投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明はまた、コルチコイドと組み合わせた塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルによる処置に適格な前立腺癌、好ましくはmCRPC患者を同定する方法であって、上記のとおり、循環腫瘍細胞中のAR-V7の存在について患者からの生物学的試料を検査する工程を含み、AR-V7が前記循環腫瘍細胞中に存在する場合、患者は前記カバジタキセルによる処置に適格である、方法を提供する。

本発明はまた、パッケージ及び製品に関する。

特に、本発明は、前立腺癌患者から得られた血液、血清又は尿試料のうちの1つ中の単離腫瘍細胞、好ましくは単離循環腫瘍細胞におけるAR-V7ステータスを決定するための診断キットであって、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によって腫瘍細胞中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7転写産物を増幅するための増幅プライマーを含み、更に、磁性分離により患者試料中の本質的に全ての他の細胞から腫瘍細胞を濃縮するための、上皮細胞接着を標的とする抗体を備えた磁性流体ナノ粒子、好ましくは磁性流体ナノ粒子を搭載した抗EpCAM抗体を、任意に、カベジタキセルによる処置に対する前立腺癌患者の適格性を得られたAR-V7ステータスに対する診断検査の結果に基づいて決定するための指示書と組み合わせて含む、キットを提供する。

分析のための患者の選択を示す試験フローチャートである。カバジタキセルに対する12週間後のPSA応答のウォーターフォールプロットである。破線は、PSAがベースラインレベルに対して30%及び50%減少したことを示す。AR-V7陽性患者とAR-V7陰性患者との間でPSA応答に差は認められなかった。カラムの上又は下のアスタリスクは、カバジタキセルの前に酢酸アビラテロンにより処置された患者を示す。カバジタキセルに対する処置終了時のPSA応答のウォーターフォールプロットである。破線は、PSAがベースラインレベルに対して30%及び50%減少したことを示す。AR-V7陽性患者とAR-V7陰性患者との間でPSA応答に差は認められなかった。カラムの上又は下のアスタリスクは、カバジタキセルの前に酢酸アビラテロンにより処置された患者を示す。ベースラインにおけるCTC中のAR-V7の関数としての全生存期間を示す図である。報告したP値はログ-ランク検定のものである。患者3例の追跡調査データは、臨床試験がまだ進行中であり募集中であったため、分析時にはまだ欠落していた。アッセイの感度及び特異性を示す図である。mCRPC患者40例からの材料を用いて、CellSearchによる濃縮後のCTCカウントと、対応するRNA試料におけるEPCAMとKRT19との平均Cq値との間の線形相関を評価した。アッセイの感度及び特異性を示す図である。RT-qPCRに4から580個のVCAP細胞からのRNAを投入した個別の62実験のデータを用いて、AR-V7のCq値と、EPCAM+KRT19の平均Cq値との間の線形相関を評価した。EPCAM+KRT19の平均Cq値が26.5 Cqより低い試料は、これらの細胞中のAR-V7を測定するのに十分な上皮シグナルを含むものとみなした。丸: スパイクされていないVCAP細胞; 正方形: HBD血液中にスパイクされたVCAP細胞。図４Ｃ−１は、アッセイの感度及び特異性を示す図である。HBD中にスパイキングする前と後、CellSearchによる濃縮の前と後、及び予備増幅の前と後の、RT-qPCRによるVCAP細胞中のAR-WT及びAR-V7測定の感度及び特異性。データを、これらの調製物において測定したEPCAM+KRT19の平均発現(ΔCq)に対して表す。±1.1Cqの範囲内で、わずか2個のVCAP細胞から得られた材料で両転写産物を再現性良く測定することができる。紺青色の円: ΔC_q AR-WT; 四角; 薄青色の円: ΔC_q AR-V7。図４Ｃ−２は、図4C−１の続きであり、初期細胞密度を示す15個のカラムは、図４Ｃ−１と対応している。図4C-2では、4行目(予備増殖)の最初の11個のセルは「あり(yes)」を示し、残りの4個のセルは「なし(no)」を示す。図4C-2では、5行目(WBC存在)の最初の4個のセルは「あり(yes)」を示し、残りの11個のセルは「なし」no)」を示す。 (A.). AR-WT 対 AR-V7の転写レベルを示す図である。相関は認められなかった(Spearmanのr=0.30、P=0.12)。(B.). CTC中にAR-V7を有しない(absent)患者(左パネル)及びAR-V7を有する(present)患者(右パネル)におけるAR-WTの転写レベルを示す図である。水平の線は中央値を表す。転写レベルに差はなかった(Mann Whitney U、P=0.20)。カバジタキセルの前に酢酸アビラテロンの投与を受けた患者又は受けなかった患者の全生存期間を示す図である。患者5例の以前の治療に関する臨床データは、臨床試験がまだ進行中であり募集中であったためまだ欠落していた。患者1例の追跡調査データはまだ入手できていなかった。カバジタキセルの後に酢酸アビラテロン又はエンザルタミドの投与を受けた患者又は受けなかった患者の全生存期間を示す図である。患者5例の以前の治療に関する臨床データは、臨床試験がまだ進行中であり募集中であったためまだ欠落していた。患者1例の追跡調査データはまだ入手できていなかった。 GenBankアクセッション番号FJ235916により提供されるAR-V7 mRNAコード領域のヌクレオチド配列を示す図である。ヌクレオチド2216から開始するAR-V7特異的CE3領域の配列に下線を付す。2263-2265位のインフレーム停止コドンを太字で示す。

定義
本明細書で使用される用語「有効量」は、処置すべき癌に効果をもたらす医薬化合物、例えばカバジタキセル等の量を意味する。

本明細書で使用される用語「臨床的に証明された」は、FDAの承認基準を満たすのに十分な臨床的有効性の結果を意味する。

本明細書で使用される用語「去勢抵抗性前立腺癌」は、ホルモン不応性前立腺癌と同義であり、アンドロゲンレベルを去勢レベルまで低下させることを目的とした治療が不良であった前立腺癌患者を指す。

本明細書で使用される用語「患者」は、ヒト及び動物の両方を包含する。一実施形態では、患者はヒトである。

用語「アンドロゲン受容体」又は「AR」は、その保存アミノ酸コード配列によって定義される、活性型又は天然型の構造的立体配座にあるアンドロゲン受容体タンパク質を指す。アンドロゲン受容体をコードする核酸配列は、多数の生物からクローニング及び配列決定されてきた。ヒトアンドロゲン受容体配列のGenBank (登録商標)アクセッション番号は、NM_000044.3 (PRI 11-MAY-2014)である。アンドロゲン受容体(AR)は、真核生物の遺伝子発現を制御し、標的細胞の増殖及び分化に影響を及ぼすホルモン活性化型転写因子である。完全長のタンパク質は、ホルモンの非存在下では細胞質に存在するが、テストステロン又はジヒドロテストステロンのいずれかが結合すると核に移行する。アンドロゲン受容体は、X染色体アンドロゲン受容体遺伝子によってコードされている。AR遺伝子は、8個のエクソン及び7個のイントロンを含む。2個のARアイソフォーム、A及びBが知られており、そのうちAR-Bは完全長受容体を表し、AR-Aは、インビトロにおけるタンパク質分解により最初の187個のアミノ酸が欠損しているN末端トランケート型タンパク質を表す(Gregoryら、2001、J Mol Endocrinol 27:309〜19頁)。プロトタイプのARタンパク質は110kDaの完全長タンパク質の約60%を構成し、該タンパク質の転写調節領域である、エクソン1によってコードされるNH2末端(N末端)ドメイン(NTD)を含む。中央DNA結合ドメイン(DBD)はエクソン2及び3によってコードされ、一方、エクソン4から8はCOOH末端リガンド結合ドメイン(LBD)をコードする(Huら、2009、Cancer Res 69:16〜22頁)。

本明細書で使用される用語「アンドロゲン受容体(AR)標的薬」又は「AR標的薬」は、アンドロゲン受容体に対する親和性を有し、特に、アンドロゲン受容体に対するテストステロン及びジヒドロテストステロンのような男性ホルモンの結合を阻害できることからアンタゴニストとして機能する薬剤を指す。これらの薬剤は、例えば、抗テストステロン療法等の抗ホルモン療法において特定の用途がある。酢酸アビラテロン又はエンザルタミドは、AR標的薬の非限定的な例である。

本明細書で使用される用語「アンドロゲン受容体スプライス変異体V7」及びその略語AR-V7は、エクソン1によってコードされるN末端転写/調節ドメインと、エクソン2及び3によってコードされる2個のDNA結合ドメインの大部分とを含むが、エクソン4によってコードされるヒンジ領域並びにエクソン5〜8によってコードされるC末端ホルモン結合ドメイン及びC末端領域を欠くアンドロゲン受容体(AR)のスプライス変異体を指す。その代わりに、エクソン3が、「CE3領域」と呼ばれるイントロン3内の領域にスプライシングされている。AR-V7(AR3とも呼ばれる)変異体は構成的活性型であり、このことは、テストステロン及びジヒドロテストステロンの非存在下でも遺伝子転写を活性化することを意味する。GenBankアクセッション番号FJ235916によって提供されるAR-V7 mRNAコード領域のヌクレオチド配列を図7に示す。ヌクレオチド2216から開始するAR-V7特異的CE3領域の配列に下線を付す。2263-2265位のインフレーム停止コドンを太字で示す。

用語「AR-V7ステータス」は、患者の状態に関して、前立腺癌細胞、好ましくはCTCにおける、RNA又はタンパク質の形態のAR-V7変異体のアンドロゲン受容体遺伝子発現産物の存在又は非存在を指す。

本明細書で使用される用語「陽性AR-V7ステータス」は、試料中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7転写産物の存在を(陰性ステータスの場合の非存在に対して)指す。検出にPCRを使用する場合、AR-V7転写産物の存在は、AR-V7のCq値(すなわち、定量サイクル、又は検出可能な(蛍光)シグナルが得られるサイクル)と、参照転写産物のCq値、例えば、上皮マーカーEPCAM及び/若しくはKRT19、又は、参照遺伝子GUSB、HMBS及びHPRT1、好ましくはEPCAM及び/若しくはKRT19について得られたCq値等との間の差として検出される。一例として、陰性AR-V7ステータスの試料では、AR-V7標的を検出するために上皮マーカーEPCAMを検出するよりもより多くのサイクルが必要である。

本明細書で使用される用語「PCR反応」は、標的核酸テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、及び新たな核酸鎖の伸長(合成)の繰り返しサイクルを特徴とする増幅反応を指す。PCR反応の特異性は、実質的に、標的核酸テンプレートに対するプライマーの同一性率(%)及びアニーリング温度によって決まる。本明細書で使用される用語「リアルタイムPCR反応」は、シグナルを生成するために標識プローブ又は色素が添加されたPCR増幅反応を指す。シグナルの強度は生成された生成物の量の尺度である。リアルタイムでシグナルを検出することにより、出発物質の量を定量化することが可能となる。リアルタイムPCR反応は、シグナルを検出する検出システムを備えた特殊なサーマルサイクラー、例えば、LightCycler 480II (Roche Diagnostics社、Almere、The Netherlands)、Mastercycler Realplex Ep Real-Time PCR System (Eppendorf A.G.社、Hamburg、Germany)、又はStepOne (商標) Plus (Thermo Fisher Scientific Inc.社、Waltham、MA USA)で実施される。しかしながら、別個のプローブが存在する必要はない。いくつかのリアルタイムPCR反応では、プライマーに色素が組み込まれており(例えば、Scorpion (登録商標) primers; Premier Biosoft社、Palo Alto、CA、USA)、これらは本発明の範囲に含まれる。

本明細書で使用される用語「フォワードプライマー」及び「リバースプライマー」は、増幅すべき領域に隣接する核酸配列に相補的な、15〜50塩基、好ましくは16〜30塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物を指す。フォワードプライマー及びリバースプライマーの配列により増幅反応の特異性が決まる。好ましいプライマーは、標的核酸テンプレート中の2つのプライマー間の領域のみが増幅されるように、標的核酸テンプレート上の領域と好ましくは約100%同一である。標的核酸テンプレート上のプライマー結合部位間の距離により、増幅産物のサイズが決まることになる。

本明細書で使用される用語「プローブ」は、PCRアンプリコン等の標的核酸内の核酸配列に相補的な、15〜50塩基、好ましくは16〜30塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣体を指す。好ましいプローブは、標的核酸の標的領域と約100%同一である。プローブは、一般に、その3'-末端又は5'-末端に検出可能な標識を含む。

本明細書で使用される用語「標的DNA分子」、「標的核酸(テンプレート)」、及び「テンプレートDNA分子」は、2つのプライマー、好ましくはフォワードプライマー及びリバースプライマーの間の領域が増幅される核酸である。標的核酸テンプレートは、遺伝子、若しくはRNA産物等の遺伝子産物、又は、該遺伝子の一部若しくは該遺伝子産物の一部である。

本明細書で使用される用語「アンプリコン」は、前記2つのプライマー、好ましくはフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅される標的核酸テンプレート上の領域を指す。アンプリコンは、好ましくは、前記アンプリコンを特異的に認識するプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を含む。

本明細書で使用される用語「特異的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントな条件下で二本鎖核酸分子を形成する核酸分子を指す。

用語「ストリンジェンシー」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、pH等を指す。これらの条件は、その標的核酸配列に対するプライマー又はプローブの特異的結合を最大にし、非特異的結合を最小にするために経験的に最適化される。使用される該用語は、プローブ又はプライマーが、その標的配列に、他の配列に対するよりも検出可能な程度に強く(例えば、バックグラウンドに対して少なくとも2倍)ハイブリダイズする条件に対する言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であってよく、また、環境によって異なることとなる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHにおいて特定配列の熱融点(thermal melting point) (Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、相補的標的配列の50%が、それと完全に一致したプローブ又はプライマーにハイブリダイズする(規定されたイオン強度及びpHにおける)温度である。ハイブリダイゼーションの手順は当技術分野でよく知られており、また例えば、Ausubelら、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley、New York; 及び、Sambrookら、2001、Molecular cloning: a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに記載されている。

本明細書で使用される用語「カバジタキセル」は、タキソイドファミリーに属し、そして、式:

の構造を有する化合物を指す。

カバジタキセルの化学名は、4α-アセトキシ-2α-ベンゾイルオキシ-5β,20-エポキシ-1β-ヒドロキシ-7β,10β-ジメトキシ-9-オキソ-11-タキセン-13α-イル(2R,3S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオナートである。カバジタキセルは、(2α,5β,7β,10β,13α)-4-アセトキシ-13-({(2R,3S)-3-[(tertブトキシカルボニル)アミノ]-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロパノイル}オキシ)-1-ヒドロキシ-7 ,10 -ジメトキシ-9-オキソ-5 ,20-エポキシタックス-11-エン-2-イルベンゾアートの同義語であることが知られている。

カバジタキセル化合物及びその調製方法は、国際公開第96/30355号、欧州特許第0 817 779号B1、及び米国特許第5 847 170号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。カバジタキセルは、塩基形態で(上記式を参照されたい)、又は水和物の形態で投与することができる。カバジタキセルはまた、溶媒和物、すなわち、活性成分分子の結晶中への結晶化溶媒の組み込みを特徴とする分子複合体であってもよい(この点に関しては、J. Pharm. Sci、1975、64(8)、1269〜1288頁の1276頁を参照されたい)。特に、カバジタキセルはアセトン溶媒和物であってもよく、より詳細には、国際公開第2005/028462号に記載の溶媒和物であってもよい。カバジタキセルは、5質量%から8質量%の間、好ましくは5質量%から7質量%の間のアセトンを含有するカバジタキセルのアセトン溶媒和物であってもよい(%は、アセトンの含有量/アセトン+カバジタキセルの含有量×100を意味する)。アセトン含有量の平均値は7%であり、これは、概ね、アセトン1分子を含む溶媒和物において6.5%であるアセトンの化学量論量を表す。以下の手順により、カバジタキセルのアセトン溶媒和物の調製が可能となる: 940mlの精製水を、20±5℃(室温)で、207gの4α-アセトキシ-2α-ベンゾイルオキシ-5β,20-エポキシ-1β-ヒドロキシ-7β,10β-ジメトキシ-9-オキソ-11-タキセン-13α-イル(2R,3S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオナートを約2リットルのアセトン中に約92質量%で含む溶液に添加し、その後、アセトン/水から単離した2gの4α-アセトキシ-2α-ベンゾイルオキシ-5β,20-エポキシ-1β-ヒドロキシ-7β,10β-ジメトキシ-9-オキソ-11-タキセン-13α-イル(2R,3S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオナートを水20mlとアセトン20mlとの混合物中に含む懸濁液を播種する。得られた混合物を約10から22時間撹拌し、1.5リットルの精製水を4から5時間かけて添加する。この混合物を60から90分間撹拌し、次いで懸濁液を減圧濾過する。ケークをフィルター上で450mlのアセトン及び550mlの精製水から調製した溶液を用いて洗浄し、次いで、減圧(0.7kPa)下55℃で4時間オーブン乾燥させる。水0.1%及びアセトン7.2%(理論量:化学量論的溶媒和物で6.5%)を含有する197gの4α-アセトキシ-2α-ベンゾイルオキシ-5β,20-エポキシ-1β-ヒドロキシ-7β,10β-ジメトキシ-9-オキソ-11-タキセン-13α-イル(2R,3S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオナートアセトンが得られる。

カバジタキセルは、静脈内投与等により、非経口的に投与することができる。静脈内注入による投与に好適なカバジタキセルのガレヌス製剤(galenical form)は、カバジタキセルが、界面活性剤、共溶媒、グルコース、又は塩化ナトリウム等から選択される賦形剤の存在下で水に溶解されている製剤である。例えば、カバジタキセルのガレヌス製剤は、滅菌バイアル中に入れられたカバジタキセルのプレミックス溶液(80mgのカバジタキセル+ 2mlの溶媒+ポリソルベート80)を、6mlの水とエタノールの溶液(95%エタノール 13質量%)を含む滅菌バイアルを用いて希釈して、灌流バッグ中でそのまま再希釈可能な(ready-to-be-rediluted) 8mlの溶液を得ることより調製することができる。このそのまま再希釈可能な溶液中のカバジタキセル濃度は約10mg/mlである。次いで、このそのまま再希釈可能な溶液を、水及びグルコース(約5%)又は塩化ナトリウム(約0.9%)を含有する灌流バッグに適量注入することによって灌流液を調製する。

カバジタキセルは、プレドニゾン又はプレドニゾロン等のコルチコイドと組み合わせて、2つの異なる医薬製剤として投与することができる。またプレドニゾンを組み合わせずに投与してもよい。

したがって、本発明の一態様は、有効量のカバジタキセルを、プレドニゾン又はプレドニゾロン等のコルチコイドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、前立腺癌を処置する方法である。

該組み合わせは、熟練した医師が決定することができる、処置すべき患者(年齢、体重、治療歴等)に応じたプロトコルに従って反復投与される。本発明の一態様では、カバジタキセルは、各投与の間に3週間の間隔をあけた断続的プログラムに従って灌流により患者に投与されるが、この間隔は、先行する投与に対する忍容性に応じて1から2週間延長してもよい。サイクル数の中央値は6である。プレドニゾン又はプレドニゾロンは、処置継続期間を通して、毎日、例えば、1日当たり1用量摂取の形態で投与することができる。2種類の抗腫瘍薬の用量の例を「実施例」の項に示す。現在推奨されている用量は、1時間の注入として投与されるカバジタキセルが25mg/m²、及び経口投与されるプレドニゾン又はプレドニゾロンが1日当たり10mgである。

本発明のいくつかの態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している処置すべき患者は、ホルモン療法に耐性(すなわち、ホルモン不応性)の前立腺癌を有し、かつドセタキセルによる治療歴を有する。いくつかの態様では、患者は、ドセタキセルによる処置中又は処置後に進行した前立腺癌を有する。いくつかの態様では、患者は、少なくとも225mg/m²の累積投与量のドセタキセルによる治療歴を有する。特定の態様では、患者は、ホルモン療法後の6カ月間に、又はドセタキセル処置中に、又はドセタキセル処置後に、疾患の進行を示した。別の特定の態様では、患者は、ホルモン療法後の6カ月間に、又はドセタキセル処置後に疾患の進行を示した。

本発明のいくつかの態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している処置すべき患者は、測定可能な腫瘍を有しており、そして、MRIにより又は体軸断層撮影(axial tomographic scan) (CTスキャン)により測定される少なくとも1cmの内臓又は軟組織の転移性病変により疾患の進行を示し得る。

本発明のいくつかの態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している処置すべき患者は、測定不可能な腫瘍を有し、そして、1週間の間隔をあけた3回の測定によるPSAレベルの増加、又は新たな病変の出現を示し得る。

本発明のいくつかの態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している処置すべき患者は、精巣切除による去勢若しくはLHRHアゴニストを用いた去勢、アンドロゲンの除去、又はエストラムスチンによる単剤療法を受けたことがある。

好ましい態様では、処置すべき患者の平均余命は、少なくとも2カ月であるべきである。

いくつかの態様では、ミトキサントロンの投与歴のある患者、又は225mg/m²未満のドセタキセルを投与されたことがある患者、又は骨髄の40%以上を除去する放射線療法を受けたことがある患者、試験前4週間以内に処置を受けた患者、脳若しくは髄膜に関与する神経障害若しくは口内炎を有する患者、ポリソルベート若しくはプレドニゾンに対する重症の過敏症を示したことがある患者、血液分析において、好中球、ヘモグロビン、若しくは血小板の認識可能な減少、ビリルビン及び/若しくは肝臓酵素並びにクレアチニンの増加を示す患者、又は心臓障害若しくは抗生物質を必要とする感染症を有する患者は処置に組み入れない。

本発明の一態様は、臨床的に証明された有効量のカバジタキセルを、任意にプレドニゾン又はプレドニゾロンと組み合わせて、それを必要とする患者に投与する工程を含む、ホルモン不応性転移性前立腺癌患者の生存期間を延長させる工程を含む。本発明のいくつかの好ましい態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している患者は、ドセタキセル含有レジメンによる治療歴を有する。別の好ましい態様では、アンドロゲン受容体V7変異体を発現している患者は、ドセタキセル含有レジメンによる治療歴を有しない。

アンドロゲン受容体V7変異体(AR-V7)は、構成的活性型の変異体であり、このことは、AR-V7がテストステロン及びジヒドロテストステロンの非存在下でも遺伝子転写を活性化することを意味する。AR-V7は、N末端転写/調節ドメインとDNA結合ドメインの大部分とを含むが、ヒンジ領域及びC末端ホルモン結合ドメイン及びC末端領域を欠いている。近年、Antonarakisら(Antonarakisら、2014、N Engl J Med 371:1028〜1038頁)により、mCRPCの男性からのCTC中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7(AR-V7)の検出がエンザルタミド及び酢酸アビラテロンに対する耐性に関連していることが報告された。したがって、AR-V7ステータスを、AR標的薬に対する耐性を予測するためのバイオマーカーとして使用し、治療選択を容易にすることができる。更に、AR-V7は微小管結合ドメインも欠くことになり、これにより、このAR-V7陽性細胞が、ドセタキセル化学療法等のタキサン媒介性治療に対しても耐性となることが示唆された(Portellaら、2013、Cancer Res 73:4081頁; Thadani-Muleroら、2014、Cancer Res 74:2270〜82頁)。

ここに、AR-V7は微小管結合ドメインを欠いておりAR-V7陽性細胞はドセタキセル等のタキサン媒介性治療に抵抗性であるが、AR-V7陽性細胞は、タキサンであるカバジタキセルには感受性であることを示す。したがって、患者がドセタキセルに抵抗性となった症例でも、依然としてカバジタキセルをAR-V7陽性前立腺癌患者の有効な処置として使用することができる。

AR-V7と同様に、N末端転写/調節ドメインとDNA結合ドメインの大部分とを含むが、ヒンジ領域及びC末端ホルモン結合ドメイン及びC末端領域を欠いているアンドロゲン受容体の更なる変異体が報告されている。これらの変異体としては、AR-V1、AR-V2、AR-V3、AR-V4、AR-V5、AR-V6、AR-V9、AR-V10、及びAR-V11が挙げられ、これらの中で、AR-V3、AR-V4は、AR-V7と同様に、構成的活性型であることが示されている(Lu及びLuo、2013、Trans Androl Urol 2:178〜186頁)。

カバジタキセル療法の副作用並びにこれらの副作用を回避及び/又は管理するための予防的手段は、当業者によく知られており、例えば、国際公開第2011/051894号に詳細に示されており、該公報はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

アンドロゲン受容体ステータス
患者におけるアンドロゲン受容体変異体V7のステータスは、好ましくは、前立腺癌患者の癌細胞を含む試料において決定される。前記試料は、好ましくは、例えば生検試料等の組織試料、又は体液試料、好ましくは尿、リンパ、若しくは血清等の血液である。前記ステータスは、最も好ましくは、血液中に存在するか、又は血液から単離された循環腫瘍細胞(CTC)において決定される。

CTCは、例えば、白血球等の血液細胞に比べて、サイズがより大きいことや、密度、電荷及び移動性の差等の物理的特性に基づき、CTCのマーカーフリー(marker-free)の単離法を用いて、血液から捕捉又は単離することができる(Karabacak、2014、Nature Protocols 9、694〜710頁)。CTCは、好ましくは、正常な血液細胞には存在しない特異的細胞表面マーカーを用いて血液試料から単離される。上皮腫瘍細胞の好ましいマーカーは上皮細胞接着分子(EpCAM: Epithelial Cell Adhesion Molecule)であるが、これは、該マーカーが上皮起源の細胞により発現されるが、血液細胞又は血球には存在しないという理由による。EpCAMに対する抗体の磁気ビーズへの結合と、それに続く、磁場を介した捕捉された細胞の精製は、乳癌、前立腺癌、及び大腸癌(colon cancer)の患者の血液からCTCを濃縮するために使用されてきた。CytoQuest (商標) cell retrieval system (Abnova社、Taipei City、Taiwan)、Adna Test Prostate Cancer Select kit (AdnaGen社、Langenhagen、Germany)、及びCellSearch (登録商標) system (Janssen Diagnostics社; South Raritan、NJ (USA))等の、血液からCTCを単離するための方法及び手段は当業者に知られている。これらの中で、CellSearch (登録商標) systemは、血液からの循環腫瘍細胞(CTC)の同定、単離、及び計数のための、臨床的に検証され、そしてFDA基準をクリアしているシステムであり、その感度(本明細書に記載のAR-V7アッセイの検出限界は、RT-qPCRに利用できる最終調製物中の上皮CTC 3個以上であった)により、本発明の態様において好ましい。CellSearch (登録商標) systemにより、CELLSEARCH (登録商標)循環腫瘍細胞試験によるCTCの計数が可能となり、これは、上皮細胞接着を標的とする抗体を備えた磁性流体ナノ粒子を使用することによる、血液中の他の細胞全体からのCTCの磁気分離; 上皮細胞特異的サイトケラチンモノクローナル抗体によるCTCの染色; 抗CD45モノクローナル抗体染色の使用による、試料に混入している可能性のある白血球の同定; CTCと白血球の両方の核を標識するためのDAPI DNA染色; 細胞を単一の焦点深度に引き寄せる磁力を印加する磁石カートリッジ内での細胞の濃縮; 並びに、サイトケラチン及びDAPIが陽性である腫瘍細胞候補を表示する分析器におけるカートリッジ内の染色されたCTCの走査と、その後の任意の、作業者による候補細胞の最終確認、を含む。

捕捉された細胞は、好ましくは、細胞質上皮サイトケラチン(8、18、及び/又は19)並びに白血球特異的マーカーCD45に対する抗体のカクテルで染色することによって可視化される。CD45が陽性の細胞は計数から除外される。前立腺CTCは、4μm以上であり、円形から長円形の形態であり、そして、サイトケラチンが陽性でありかつCD45が陰性である、EpCAM捕捉細胞のサブセットとして定義される。

血液試料は、試料の提供から96時間以内に処理することが好ましい。前記試料は、好ましくは、細胞の形態及び細胞表面抗原の発現を維持する保存剤を含む容器に採取される。好ましい容器はCellSave (登録商標) Tube (Janssen Diagnostics社; South Raritan、NJ (USA))である。

前記V7変異体ステータスは、前立腺癌細胞、好ましくはCTCからのRNA発現産物及び/又はタンパク質発現産物の分析によって決定される。RNA発現産物及び/又はタンパク質発現産物を得るために、前立腺癌細胞は、好ましくは、RNA及び/又はタンパク質の質を保存する条件下で溶解される。これらの保存的条件の例は、RNAsin (登録商標) (Pharmingen社)又はRNasecure (登録商標) (Ambion社)等のRNase阻害剤、RNAlater (登録商標) (Assuragen社)、Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect (HOPE)、及びRCL2(Alphelys)等の水性溶液、並びにUniversal Molecular Fixative (Sakura Finetek USA Inc.社)等の非水性溶液である。

様々な試料からタンパク質を抽出するための方法及び手段が当技術分野において知られており、これらに限定されるものではないが、デオキシコール酸等の穏やかな界面活性剤、並びに又は塩化グアニジニウム及びドデシル硫酸ナトリウム等のカオトロピック剤による細胞の溶解が挙げられる。タンパク質単離緩衝液中に含まれ得る追加試薬は、EGTA及び/又はEDTA等のキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、並びにホスファターゼ阻害剤である。生物学的試料からタンパク質を単離するための既知のキットとしては、PARIS (商標) (Life Technologies社、Carlsbad、USA)、ReadyPrep protein extraction kit (BioRad社、Hercules、USA)、及びDetergent-Free Total Protein Isolation Kit (商標) (Norgen Biotek社、Ontario、Canada)が挙げられる。タンパク質レベルでのAR-V7の存在又は非存在は、二次元ゲル電気泳動等のポリアクリルアミドゲル電気泳動、多次元タンパク質同定技術、ELISA、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析(MALDI-TOF)により決定することができる。AR-V7変異体に特異的な抗体は、Precision Antibody社、Columbia (USA)、及びAbcam社、Cambridge (UK)から市販されている。

前記V7変異体ステータスは、特に好ましい実施形態では、転写産物の形態のアンドロゲン受容体遺伝子のRNA発現産物の増幅によって決定される。このために、RNAを、限定されるものではないが、Trizol (Invitrogen社; Carlsbad、California)、RNAqueous (登録商標) (Applied Biosystems/Ambion社、Austin、Tx)、Qiazol (登録商標) (Qiagen社、Hilden、Germany)、AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社、Hilden、Germany)、Agilent Total RNA Isolation Kits (Agilent社; Santa Clara、California)等の当技術分野で知られている任意の技術によって、前立腺癌細胞、好ましくはCTCから単離することができる。好ましいRNA単離法は、AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社、Hilden、Germany)の使用を伴う。

腫瘍細胞中のAR-V7の存在又は非存在は、ノーザンブロッティング、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)、マイクロアレイ分析、及びRNAシークエンシング等の当技術分野で知られている任意の方法、好ましくは次世代シークエンシングによって決定することができる。マイクロアレイ分析のために、RNAを抽出及び標識することによりハイブリダイゼーション混合物を調製する。抽出されたRNAは、好ましくは、逆転写酵素及び標識ヌクレオチドを用いて、相補的DNA (cDNA)又はcRNAのいずれかを含む標識試料に変換される。好ましい標識法では、限定されるものではないが、シアニン-3-CTP又はシアニン-5-CTP等の蛍光標識ヌクレオチドが導入される。標識化法の例は当技術分野で知られており、Low RNA Input Fluorescent Labelling Kit (Agilent Technologies社)、MessageAmp Kit (Ambion社)、及びMicroarray Labelling Kit (Stratagene社)が挙げられる。アンドロゲン受容体のRNA発現産物を検出するためにAR-V7変異体のN末端転写/調節ドメイン及び/又はDNA結合ドメインをコードするmRNAの部分に特異的にハイブリダイズする1又は複数のプローブを使用することができ、一方、AR-V7変異体のRNA発現産物を検出するためにC末端のAR-V7特異的領域をコードするmRNAの部分に特異的にハイブリダイズするプローブを使用することができる。

AR-V7の存在又は非存在は、好ましくはqPCRによって決定される。このために、メッセンジャーRNA (mRNA)は逆転写酵素を用いて相補的DNA (cDNA)に変換される。変換されたcDNAは、続いて、増幅すべき標的DNAに特異的にハイブリダイズする一対のプライマーを用いてPCRにより増幅される。増幅された生成物の量は、例えば、TaqMan (登録商標) (Applied Biosystems社、Foster City、CA、USA)、Molecular Beacons、Scorpions (登録商標)、及びSYBR (登録商標) Green (Molecular Probes社)を用いて定量することができる。定量的核酸配列ベース増幅(Quantitative nucleic acid sequence based amplification) (qNASBA)を、qPCRの代替法として使用することができる。

標的DNAに特異的にハイブリダイズするプライマー対は、好ましくは、AR-V7のN末端転写/調節ドメイン及び/又はDNA結合ドメイン、好ましくはAR-V7のDNA結合ドメインをコードするmRNAの領域に、より好ましくはエクソン3内の領域に特異的にハイブリダイズするプライマー、並びに図7に示すCE3領域に特異的にハイブリダイズするプライマーを含む。好ましいプライマー及びプローブをTable 1 (表1)に示す。

本発明は、前立腺癌に罹患しているAR-V7陽性患者を処置するための方法であって、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程と、塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルを、AR-V7陽性患者に、コルチコイドと組み合わせて投与する工程とを含む、方法を提供する。好ましくは、前記前立腺癌は、転移性去勢抵抗性前立腺癌(mCRPC)である。

上記の前立腺癌に罹患しているAR-V7陽性患者を処置するための方法の別の好ましい実施形態では、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程は、単離腫瘍細胞、好ましくはCTCに対して実施される。

前立腺癌に罹患しているAR-V7陽性患者を処置するための方法の更に別の好ましい実施形態では、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程は、CELLSEARCH (登録商標)循環腫瘍細胞試験を用いて、単離CTCに対して実施される。患者を処置するためのこのような方法において、患者は、好ましくは、ドセタキセルベースのレジメンによる治療歴を有しており、前記患者は、好ましくは、ドセタキセル、並びに/又は、酢酸アビラテロン及び/若しくはエンザルタミドに対して耐性である。

上記の方法の別の好ましい実施形態では、患者は、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬による治療歴を有しないか、又は、前記患者は、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬による治療歴を有する場合、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬に対してまだ耐性になっていない。

本発明はまた、前立腺癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造のための、コルチコイドと組み合わせた塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルの使用であって、前記患者はAR-V7陽性患者であり、前記使用は、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する工程を更に含み、好ましくは、前記前立腺癌は転移性去勢抵抗性前立腺癌(mCRPC)である、カバジタキセルの使用を提供する。

本発明に係る、別の好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者におけるAR-V7ステータスは、単離腫瘍細胞、好ましくはCTCに対して決定される。本発明に係る、更に別の好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する前記工程は、CELLSEARCH (登録商標)循環腫瘍細胞試験を用いて、単離CTCに対して実施される。

本発明に係る、更に別の好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者はドセタキセルベースのレジメンによる治療歴を有する。

本発明に係る、更に別の好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者はドセタキセルに対して耐性である。

本発明に係る、更に別の好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者は酢酸アビラテロン及び/又はエンザルタミドに対して耐性である。

本発明に係る、より更に好ましい医薬の製造のためのカバジタキセルの使用では、前記患者は、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬による治療歴を有しないか、又は、前記患者は、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬による治療歴を有する場合、ドセタキセル及び/若しくはAR標的薬に対してまだ耐性になっていない。

本発明は更に、コルチコイドと組み合わせた塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルによる処置に適格な前立腺癌患者、特にmCRPC患者を同定する方法であって、該方法は、AR-V7腫瘍細胞の存在について患者からの生物学的試料を検査する工程を含み、前記試料中の前記腫瘍細胞の結果がAR-V7陽性である場合、患者は前記カバジタキセルによる処置に適格である、方法を提供する。前記方法は、コルチコイドと組み合わせた塩基形態の又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルによる処置の恩恵を受ける可能性のある患者の同定及び/又は分類に役立ち得る。

前記腫瘍細胞は、患者の体液、好ましくは、尿、及び/又は血清等の血液中を循環している循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞は、好ましくは、腫瘍細胞では発現されるが、前記試料中の他の全ての細胞では発現されないか、又は検出可能なレベルでは発現されないマーカーを用いて、前記試料中の本質的に全ての他の細胞から分離される。

したがって、本発明の好ましい方法は、患者からの血液、血清、及び/又は尿試料の提供と、腫瘍細胞では発現されるが、前記試料中の他の全ての細胞では発現されないか、又は検出可能なレベルでは発現されないマーカーを用いた、前記試料中に存在する他の細胞からの腫瘍細胞の分離とを含む。

前記マーカーは、好ましくは、腫瘍細胞の表面上、好ましくは全て又は大部分の腫瘍細胞上に発現されるマーカーである。前立腺細胞等の上皮腫瘍細胞の好ましいマーカーは、EpCAMである。前記マーカーは、好ましくは、抗体によって特異的に認識される。用語「特異的に認識される」は、BIAcoreアッセイ等の当業者に知られているアッセイを用いて測定される、該マーカーに対する抗体の結合のKdが、例えば、関連のないマーカーに対する結合のKdの約10倍、50倍、又は100倍未満であることを意味する。

特定の抗体がマーカーに特異的に結合することは、代替的には、通常の手順を使用又は適用することによって容易に決定することができる。1つの好適なアッセイはウェスタンブロット法(Harlow及びLaneによる「Antibodies, A Laboratory Manual」等の多くの標準的なテキストに記載されている)を利用するものである。所与のマーカー結合抗体がマーカーに特異的に結合することを決定するために、該マーカーをコードする核酸分子で形質転換されている、例えばリンパ系細胞等の非上皮細胞等の該マーカーを発現しない細胞から全細胞性タンパク質を抽出する。陰性対照として、対応する非形質転換細胞からも全細胞性タンパク質を抽出する。次いで、これらのタンパク質調製物を、非変性又は変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その後、ウェスタンブロッティングによりタンパク質を膜(例えば、ニトロセルロース膜)に移行させ、試験すべき薬剤を膜とインキュベートする。膜を洗浄して非特異的に結合した薬剤を除去した後、酵素アルカリホスファターゼ等の検出薬と結合した試験薬に対する抗体を使用することにより、結合している薬剤の存在を検出する(基質5-ブロモ-5 4-クロロ-3-インドリルホスファート/ニトロブルーの適用により、免疫局在性のアルカリホスファターゼによる高密度青色化合物が生成する)。マーカーに特異的に結合する薬剤は、この技術により、形質転換細胞からの抽出物の中の(分子量によって決まるゲル上の所定の位置に局在する)マーカーバンドに結合することが示されることとなるが、形質転換されていない細胞からの抽出物では結合はほとんど又は全く認められない。他のタンパク質に対する抗体の非特異的結合が起こる場合があり、ウェスタンブロット上で弱いシグナルとして検出される場合がある。ウェスタンブロットにおいて、特異的抗体-マーカー結合から生じる強い主要シグナルに対して、この結合で得られるのは弱いシグナルであることから、当業者であれば、この結合が非特異性のものであることを認識するであろう。理想的には、マーカー結合抗体は、非形質転換細胞から抽出されたタンパク質には結合しない。抽出タンパク質を用いた結合アッセイに加えて、抗体を蛍光タグ(FITC等)に結合させ、上皮細胞及び例えばリンパ系細胞等の非上皮細胞に対する該抗体の結合
を蛍光活性化細胞選別(FACS: Fluorescence Acrivated Cell Sorting)により分析することによって、マーカー結合抗体と推定される抗体が、インビボにおいて実質的に前記マーカーのみに結合できることを試験して確認してもよい。実質的にマーカーのみに結合する抗体は、上皮細胞のみを染色することとなる。

本明細書で使用される用語「抗体」は、ポリクローナル若しくはモノクローナル全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgE等、又は免疫グロブリンフラグメント、例えば単離CDR領域; VHドメイン及びVLドメインが、該2つのドメインを会合させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーによって連結されている単鎖Fv分子(「scFv」)、ダイアボディ(diabody) (Hollingerら、1993、PNAS USA 90:6444〜6448頁)、F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fab'等、又はそれらの混合物を指すことが理解されよう。多種多様なリガンドに特異的に結合する抗体及び抗体断片が知られており、その多くは特許に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。腫瘍関連マーカーに特異的に結合する数多くの抗体及び抗体断片が、例えば、米国特許第4,348,376号、米国特許第4,361,544号、米国特許第4,331,647号、米国特許第4,468,457号、米国特許第4,444,744号、米国特許第4,460,559号、及び米国特許第4,460,561号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。更に、用語「抗体」は、AFFIBODY (登録商標) molecules (Nordら、1995、Prot Eng 8:601〜608頁)、ANTICALINS (登録商標) (Skerra、2008、FEBS J. 275:2677〜2683頁)、及びAVIMERS (登録商標) (Silvermanら、2005、Nat Biotechnol 23:1556〜1561頁)等の人工抗体様分子又は抗体模倣物を包含する。

前記抗体は、好ましくは、抗体に結合した細胞を捕捉し、それにより、当技術分野で知られている任意の方法によって、前記試料中の他の細胞から腫瘍細胞を分離するために使用される。例えば、マーカー抗体と反応する抗体を表面に結合させ、マーカー-抗体複合体及び関連細胞を表面上に捕捉させることができる。別法として、特にマーカー抗体がIgG抗体である場合、プロテインA又はプロテインGを使用することができる。

前記マーカー抗体は、好ましくは、検出可能な標識で標識される。前記検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段により検出可能な標識である。例えば、有用な標識としては、放射性標識、蛍光標識、高電子密度試薬、(ELISAにおいて一般的に使用される)酵素、ビオチン、又は、抗血清若しくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテン及びタンパク質が挙げられる。

前記標識は、好ましくは、前記腫瘍細胞を磁気的に分離させる標識である。このために、抗体は、好ましくは磁性流体ナノ粒子で標識される。好ましい磁性流体ナノ粒子は、ポリマーとともにカプセル化又はポリマーに接着されていてもよい、ナノメートルサイズの酸化鉄粒子からなる。好適な磁性粒子としては、DYNABEADS (登録商標) (Life Technologies社、Carlsbad、CA、USA)、例えばMACS (登録商標) Column Technology (Miltenyi Biotec Inc.社、Auburn、CA、USA)と組み合わせたMICROBEADS (登録商標)、及びストレプトアビジン結合NanoLink (商標)及びMagnaLink (商標) Beads (Solulink Inc.社、San Diego、CA、USA)が挙げられる。

捕捉された腫瘍細胞の分画では、患者の生物学的試料中に存在する他の細胞に対して腫瘍細胞を濃縮することになる。前記捕捉された腫瘍細胞は、任意に、捕捉された濃縮腫瘍細胞を含む試料中の腫瘍細胞を、核DNA染色、好ましくはDAPI、及び上皮細胞に特異的なサイトケラチン特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、好ましくは抗サイトケラチン8/18/19で染色することにより、そして任意に、白血球特異的抗CD45モノクローナル抗体染色を用いて、前記試料中の染色された白血球から前記二重染色された腫瘍細胞を区別しながら、計数することができる。核DNA染色及び/又は抗体を用いて細胞を染色するための方法及び手段は当技術分野で知られており、例えば、Life Technologies社(Life Technologies社、Carlsbad、CA)、Abcam社(Cambridge、MA、USA)、及びDako社(Agilent Technologies社、Glostrup、Denmark)から入手することができる。

前記濃縮腫瘍細胞中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7転写産物の存在は、Precision Antibody社、Columbia (USA)、及びAbcam社、Cambridge (UK)製のもの等のAR-V7変異体に特異的な市販の抗体の使用等の当技術分野で知られている方法によって決定することができる。

前記V7変異体ステータスは、好ましくは、アンドロゲン受容体遺伝子のRNA発現産物の増幅によって決定される。このために、RNAは、前立腺癌細胞、好ましくはCTCから、これらに限定されるものではないが、Trizol (Invitrogen社; Carlsbad、California)、RNAqueous (登録商標) (Applied Biosystems/Ambion社、Austin、Tx)、Qiazol (登録商標) (Qiagen社、Hilden、Germany)、AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社、Hilden, Germany)、Agilent Total RNA Isolation Kits (Agilent社; Santa Clara、California)等の当技術分野で知られている任意の技術によって単離することができる。好ましいRNA単離法は、AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社、Hilden、Germany)の使用を伴う。

単離後、RNA発現産物は、M-MLV逆転写酵素等のRNA依存性DNAポリメラーゼ、又は、Superscript (登録商標) reverse transcriptase (Invitrogen社; Carlsbad、California)、Superscript (登録商標) VILO (商標) cDNA synthesis (Invitrogen社; Carlsbad、California)、及びQuantiscript Reverse Transcriptase (Qiagen社、Hilden、Germany)等の改変逆転写酵素によって相補的DNA (cDNA)に逆転写される。前記cDNAは、ランダムプライマー、例えば、ヘキサマー若しくはノナマー、又は、図7において下線を付したAR-V7特異的CE3領域に相補的なプライマー等の遺伝子特異的プライマーを用いて合成することができる。相補的DNA (cDNA)の生成、予備増幅、及びRT-qPCRは、好ましくは、既述のように実施される(Sieuwertsら、2009、Breast Cancer Res Treat 118:455〜68頁; Sieuwertsら、2011、Clin Cancer Res 17:3600〜18頁; これらは参照により本明細書に組み込まれる)。

本発明は、更に、前立腺癌に罹患している患者の体液中の単離腫瘍細胞、好ましくは単離循環腫瘍細胞におけるAR-V7ステータスを決定するためのパーツキットを提供する。前記体液は、好ましくは、前記患者から得られた血液、血清、又は尿試料のうちの1つである。前記キットは、好ましくは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写(RT-qPCR)による、アンドロゲン受容体mRNAスプライスバリアント7転写産物の相補的DNA産物の逆転写及び増幅のための増幅プライマーを含む。前記キットは、好ましくは、磁気分離によって患者試料中の本質的に全ての他の細胞から腫瘍細胞を濃縮するための、上皮細胞マーカーを標的とする抗体、好ましくは磁性流体ナノ粒子を搭載した抗EpCAM抗体を含む。前記キットは、任意に、カバジタキセルによる処置に対する前立腺癌患者の適格性を得られたAR-V7ステータスの診断試験の結果に基づいて決定するための指示書、及び/又は前記患者をカバジタキセルにより処置するための指示書を更に含む。

明瞭化及び簡潔な説明のために、本明細書において、特徴は、同一又は別々の態様及びその好ましい実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載された特徴の全て又はいくつかの組み合わせを有する実施形態を包含し得ることが理解されるであろう。

本発明を以下の実施例によってここに説明するが、これは、限定ではなく例示を目的として提供されるものであり、本発明の精神及び添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、記載された方法及び指示された量における様々な変更が可能であることが理解されよう。

序論
本試験では、ドセタキセルによる治療歴を有するmCRPC患者のカバジタキセルへの応答に関するCTC中のAR-V7の予測値を検討した。我々は、CellSearch System (Janssen Diagnostics LLC社、Raritan、NJ)により濃縮したCTC中の野生型AR (AR-WT)及びAR-V7のmRNA発現レベルを測定するための非常に特異的なRT-qPCRアッセイを構築した。この比較的広く利用可能であり、米国食品医療品局(FDA: Food and Drug Administration)の承認を受けた技術によりmCRPC患者から計数したCTCの臨床的意義に関しては、広範かつ確固としたデータが入手可能である。次に、我々は、カバジタキセルがAR陽性患者にとって依然として有効な治療選択肢であるかどうかを立証する目的で、カバジタキセルの開始前に採取したCTC中のAR-V7の存在の予測値及び予後値を調査した。

方法
患者
mCRPC患者は、カバジタキセルの毒性に対する経口ブデソニドの有効性を調査する、進行中の多施設無作為化第II相試験(CABARESC、オランダ試験登録番号NTR2991)から募集した。全患者がドセタキセルの投与歴を有しており、また、少なくとも2週間の間隔をあけた3回のPSA測定値の上昇、又は2.0μg/L以上のPSA上昇、又は放射線学的疾患進行によって定義される疾患の進行を有することを要件とした。完全な組み入れ基準及び除外基準は以下のとおりである。

組み入れ基準:
・以下に規定される疾患の進行が記録されている、転移性去勢抵抗性前立腺癌:
・PSAレベルの上昇; 参照値を超え、かつ少なくとも1週間の間隔をあけた少なくとも2回の連続的上昇、又は2.0μg/L以上のPSA上昇
・新たな病変の出現、又はCTスキャン若しくは骨スキャンにおける疾患の進行の記録
・ドセタキセルによる治療歴
・18歳以上
・WHOパフォーマンスステータスが1以下
・無作為化前21日以内における十分な腎機能(血清クレアチニンが基準値上限(ULN)の1.5倍以下、及び/又は、MDRD計算によるクレアチニンクリアランスが50mL/分以上)、及び肝機能(総ビリルビンがULNの1.0倍以下、アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼがULNの2.5倍以下、又は肝臓転移がULNの5倍以下、及びアルカリホスファターゼがULNの5倍未満である場合、又は骨転移がULNの10倍未満である場合)
・無作為化前21日以内における十分な血液学的血球数(絶対好中球数が1.5×10⁹/L以上、及び血小板が100×10⁹/L以上)
・外科手術又は継続的LHRHアゴニスト療法のいずれかによる去勢
・ICH-GCPに準拠した書面によるインフォームドコンセント

除外基準:
・経口薬を摂取できない、又は摂取しない者
・処置を要する重篤疾患又は医学的不安定状態、インフォームドコンセントの理解又は取得を妨げる中枢神経系の転移又は精神障害の既往
・CYP3Aを誘導又は阻害することが知られている医薬又は栄養補助食品の使用
・GnRHアゴニスト以外のホルモン剤の使用
・コルチコステロイドに対する既知の過敏症
・活動性の全身性又は限局性の細菌性、ウイルス性、又は真菌性感染症
・潰瘍性大腸炎、クローン病、又はセリアック病(現在活動性のもの又は病歴)
・オストミー
・黄熱病ワクチンの同時接種が予定されている又は接種中である
・追跡調査を妨げる地理的、心理的、又はその他の非医学的条件

両処置群の全患者に25mg/m²の標準用量のカバジタキセルを投与する。カバジタキセル処置を、(治療医師の裁量により)病勢進行が確認されるか、許容できない毒性が生じるか、又は10サイクルが投与されるまで継続した。CTC試料をCABARESC試験の副試験として収集した。この試験では、ロバストかつCTC特異的なダウンストリーム分析を確実に行うために、2012年8月から2014年8月までに組み入れられ、かつ、カバジタキセルの開始前に血液7.5mL当たり10個以上のCTCを有する患者を選択した(図1)。試験は、エラスムス大学医療センター(Erasmus MC)及び地域の施設内治験審査委員会の承認を受けた(METC 11-324)。全患者から、主試験及びCTCの計数及び特性評価に関する副試験のための書面によるインフォームドコンセントが提供された。

試料処理
カバジタキセルの第1サイクル及び第3サイクルの開始前に静脈穿刺により血液を採取した。CTCの計数を以前に詳細に記載されているように実施した(Sieuwertsら、2009、Breast Cancer Res Treat 118:455〜68頁; Sieuwertsら、2011、Clin Cancer Res 17:3600〜18頁)。簡潔には、CellSave Preseration tube (Janssen Diagnostics社)中に採取した7.5mLの血液からCTCを計数した。血液試料は、CellSearch SystemにおいてEpithelical Cell Kit (ともにJanssen Diagnostics社)を用いて96時間以内に処理した。この系では、磁性流体ナノ粒子を搭載した抗EpCAM抗体を用いて全血から上皮細胞を免疫磁気的に濃縮した。濃縮細胞を、核色素4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、フィコエリトリン(PE)標識抗サイトケラチン8/18/19、及びアロフィコシアニン(APC)標識抗CD45で染色し、続いてCellTracks Analyzer (Janssen Diagnostics社)を用いて走査した。4μm以上であり、円形から長円形の形態を有し、サイトケラチン及びDAPIが陽性であり、DAPIシグナルとサイトケラチンシグナルとが少なくとも50%重複しており、そしてCD45が陰性である全ての細胞をCTCとみなした。全試料を2名の独立した熟練したレビュアーが分析した。

CTCの分子特性評価のために、EDTAチューブからの7.5mLの血液を、CellSearch Profile Kit (Janssen Diagnostics社)を用いてmRNA分解を制限するために24時間以内に処理した。免疫磁気的濃縮後に染色工程は実施しなかった。代わりに、インキュベート後に手持ち磁石の中でバッファーを吸引し、濃縮細胞をバッファーRLT+ (Qiagen社、Valencia、CA)に溶解した後、後にAllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社)を用いてRNA単離を行うまで-80℃で保存した。cDNA合成及び予備増幅用に希釈した後、Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems社、Carlsbad、CA: Table 1 (表1))を用いて元の出発物質の11%アリコートにおいてRT-qPCRによりAR-WT及びAR-V7の発現レベルを測定した。相補的DNA (cDNA)の生成、予備増幅、及びRT-qPCRは、本質的には既述されているように実施した(Sieuwertsら、2009、Breast Cancer Res Treat 118:455〜68頁; Sieuwertsら、2011、Clin Cancer Res 17:3600〜18頁)。この試験の詳細は以下のとおりである: CTCの分子特性評価のために、EDTAチューブからの7.5mLの血液を、CellSearch Profile Kit (Janssen Diagnostics社)を用いてmRNA分解を制限するために24時間以内に処理した。免疫磁気的濃縮後に染色工程は実施しなかった。代わりに、インキュベート後に手持ち磁石の中でバッファーを吸引し、濃縮細胞をバッファーRLT+ (Qiagen社、Valencia、CA)を用いて溶解した後、後にAllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen社)を用いてRNA単離を行うまで-80℃で保存した。

200bpを超えるRNAを含む得られた12μLの試料のうち、5μLを10μLのcDNAを生成するために使用し(RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit、Thermo Fisher Scientific社製、Waltham、MA)、続いてRNAse H工程(Ambion, Life Technologies社)により残りのRNAを分解した。次に、cDNAのうち3μLを用いて、Table 1 (表1)に示す9個のTaqman assayにより生成した転写産物を特異的に予備増幅したが、これは、Taqman PreAmp Master Mix kit (Life Technologies社、Carlsbad、CA)の製造業者によって提供されたプロトコルに従って14サイクルで実施した。予備増幅後、得られた12μLの試料を先に15倍希釈してから、Mx3000P Real-Time PCR System (Agilent社、Amsterdam、The Netherlands)を用いたRT-qPCR 35サイクルを行った。各試料について、5μLの希釈した予備増幅cDNA、30〜50%(V/V)のTaqman Universal Mastermix (4326614、Life Technologies社)、及び0.5〜1μLのTaqman gene expression assayを含有する20μLの最終容量中で、9個の独立したPCR反応を実施したが、これは、Taqman assayの製造業者により提供されたプロトコルに従って35サイクルで行った。

3つの参照遺伝子(GUSB、HMBS、及びHPRT1)を単離したmRNA及びcDNAの量及び質の内部対照とした。我々のRNA調製物中に存在する上皮細胞の最終数を推定するためにEPCAMとKRT19との平均シグナルを使用したが、これは、CellSearchにより評価したCTCカウントと相関していた(Pearson r=0.71; P<0.01;図4A)。次いで、プロファイリングに使用したRNAのアリコート中の最終上皮腫瘍細胞投入量を、相関プロットの回帰直線から導かれた方程式を用い、元の試料の11%のみを使用したことを考慮して算出した。平均参照遺伝子Cq値が、RNA/cDNA品質が低い及び/又は不良であることの指標である26.5を超える、及び/又は、平均上皮遺伝子Cq値が、最終RNA/cDNA試料中の上皮性CTC投入量が少ない/無いことの指標である26.5を超える試料は分析から除外した。

CTCカウント及び上皮腫瘍細胞投入量を補正するために、AR-V7及びAR-WTのC_q値を、同一のPCRプレートで測定した上皮遺伝子EPCAMとKRT19との平均C_q値に対して以下のように正規化した: ΔC_q AR = EPCAMとKRT19との平均C_q値マイナス AR-V7又はAR-WTのC_q値

アッセイの感度及び特異性を、5例の健康なドナー(HBD)並びに前立腺癌(22RV1、LNCaP、PC3、及びVCaP)及び乳癌(CAMA1、MDA-MB-415、MDA-MB-453、MPE600、SUM185PE、及びZR75.1)の細胞株を分析することにより検証した。この目的のために、以下の細胞株の細胞100個を7.5mLのHBD血液中にスパイクし、CellSearchにより濃縮して陰性対照及び陽性対照とした: 22RV1 (WT_高/V7_陰性)、CAMA1 (WT_高/V7_陰性)、LNCaP (WT_高/V7_低)、MDA-MB-415 (WT_高/V7_陰性)、MDA-MB-453 (WT_高/V7_陰性)、MPE600(WT_低/V7_陰性)、PC3 (WT_陰性/V7_陰性)、SUM185PE (WT_高/V7_低)、VCaP(WT_高/V7_高)、ZR75.1 (WT_低/V7_低)。全試料を患者の血液試料と同様に処理した。

正規化及び統計解析
3つの参照遺伝子(GUSB、HMBS、及びHPRT1)を単離したmRNAの量及び質の内部対照とした。CTCカウント及び上皮腫瘍細胞投入量を補正するために、AR-V7及びAR-WTのCq値を、CTCカウントと相関している上皮遺伝子EPCAMとKRT19との平均Cqに対して正規化した(図4A)。プロファイリングに使用したRNAのアリコート中の最終上皮腫瘍細胞投入量を、上皮遺伝子とCTCカウントとの間の相関の回帰直線から導き出された式を使用し、それにより元の試料の11%のみを使用したことを考慮に入れて算出した。平均参照遺伝子Cq値が、RNAの質が低い及び/若しくは不良であることの指標である26.5を超える、並びに/又は、平均上皮遺伝子Cq値が、最終RNA試料中の上皮CTC投入量が低い/無いことの指標である26.5を超える試料は臨床分析から除外した。AR-V7が陽性であることのカットオフ値を細胞株実験に基づいて決定した(Table 2 (表2))。

この試験の主要評価項目は、2回の処置サイクル後に、血液7.5ml当たりのCTCが10個以上から5個未満に減少することとして定義される、カバジタキセルに対するCTC応答率(RR)とした。副次的目的は、PSA応答(ベースラインから第12週までに、処置中止の場合はそれより早く、PSAが30%又は50%減少すること)、処置中の最良のPSA応答(best PSA response)、及びOS (登録日と死亡日又は生存最終確認日との間隔)とした。報告した評価項目は、前立腺癌ワーキンググループ2 (PCWG2: Prostate Cancer Working Group 2)ガイドライン(Scherら、2008、J Clin Oncol 26:1148〜59頁)に準拠している。

カテゴリ変数間の差についてはχ²検定、正規分布についてはStudent t検定、そして、他の連続変数についてはMan-Whitney U検定を統計的検定として適用した。相関関係は、分布に応じてPearson検定又はノンパラメトリックSpearman検定によって検定した。Kaplan Meierプロットを用いて生存期間を視覚化し、差をログ-ランク検定によって算出した。統計的検定は全て両側とした。P値0.05未満を統計的有意とみなした。

結果
CTC中のAR-WT及びAR-V7
最初に我々のアッセイの感度及び特異性を検証した。EPCAMとKRT19との平均シグナルは、CellSearchによって評価したCTCカウントと相関しており(Pearson r=0.71; P<0.01; 図4A)、これを我々のRNAアリコート中に存在する上皮細胞の最終数を推定するために使用した。患者間の上皮投入量の差を補正するために、ARステータスをEPCAMとKRT19との平均シグナルの発現に対して評価した。純粋な(pure)乳癌及び前立腺癌細胞株の細胞、及びスパイク(7.5mLのHBD血液中に100細胞)され、その後CellSearchにより濃縮された該細胞株の細胞から単離したRNA画分を比較すると、スパイクされた上皮細胞3個以上から単離した材料のRT-qPCRによってAR-V7ステータスを決定することが可能であった。このカットオフは、我々の臨床試料において、CTC3個からのRNAを有する患者2例がAR-V7陽性であったが、CTCが3個未満の患者は誰も陽性AR-V7シグナルを示さなかったことにより裏付けられた(Table 2 (表2))。スパイキングの前と後、及びCellSearch濃縮の前と後で、AR-WT及びAR-V7の発現レベルが強く相関していたことから、白血球のバックグラウンドは我々の分析の結果に影響していなかった(図4B/C)。そのため、我々のAR-V7アッセイの検出下限を、RT-qPCRに利用可能な最終調製物中、上皮性CTC3個以上と設定した。男性5例のHBDを検証したが、このうち4例はAR-WT及びAR-V7の発現が陰性であった(Table 2 (表2))。67歳の男性1例のHBDは末梢血中に検出可能なAR-WTを有していた。このドナーは匿名であったため、追跡調査や更なる診断は実施しなかった。

次に患者試料を検証した。この探索的試験では、CTCの計数と単離との間の確率的変動を制限してRT-qPCR分析における上皮投入量を確保するために、ベースライン時に10個以上のCTCを有する患者を選択した。CTC試料中のRNAの質及び量が十分な患者29例を同定した(図1)。患者特性をTable 3 (表3)に示す。

患者5例は、登録前に酢酸アビラテロンの投与を受けていた。全患者においてCTCにおけるAR-WTの発現が検出された。患者16例(55%)においてAR-V7の発現が測定された。酢酸アビラテロンの投与を受けていない患者では20例中7例(35%)であったのに対し、酢酸アビラテロンによる治療歴のある患者は5例全員がAR-V7を発現していた(P=0.009)。AB-V7陽性CTCを有する患者は、AR-V7陰性患者よりも高いPSAレベル中央値を有していた(698μg/L対107μg/L; P=0.04)。CTCにおけるAR-V7の発現レベルはAR-WTとは相関していなかった(Spearman r=0.30、P=0.12; 図5A)。CTC中にAR-V7を含む患者と含まない患者との間でAR-WT発現レベルに差はなかった(P = 0.20; 図5B)。

AR-V7とカバジタキセルに対する応答
この試験の主要評価項目は、血液7.5mL当たりのCTCがベースライン時の10個以上から2サイクル後に5個未満に減少することとして定義される、カバジタキセル2サイクル後のCTC応答とした。患者25例から二次CTC試料を入手することができたが、患者3例では2回目の採取が欠落しており、患者1例は疾患非関連事象により2サイクル後に死亡した。これらの患者25例のうち15例がAR-V7陽性であり、10例がAR-V7陰性であった。患者25例のうち5例(20%)においてカバジタキセルに対するCTC応答が観察され、そのうち3例はベースラインCTCにおいてAR-V7が発現していた。AR-V7陽性患者群及びAR-V7陰性患者群のいずれにおいてもCTC-RRは20%であった(Table 4 (表4))。

12週間後のPSA応答及び処置終了時の最大PSA応答の評価のために、患者26例から、カバジタキセル期間中の連続的なPSAレベルを入手することができた。12週間の処置後、5例(17%)及び3例(10%)の患者がそれぞれ30%以上及び50%以上のPSA応答を達成した。処置終了時において、最良のPSA応答は、患者7例(24%)で30%以上であり、患者3例(10%)で50%以上であった。CTC中にAR-V7を含む患者と含まない患者の間の12週間後及び処置終了時における30%と50%PSA-RRの間の差は統計的に有意ではなかった(Table 4 (表4)、図2)。酢酸アビラテロンによる治療歴は、カバジタキセル処置中のCTC-RR及びPSA-RRに影響を与えなかった。

AR-V7と生存期間
OS分析のために患者28例が利用可能であった。生存中の患者12例の登録日からの追跡調査期間の中央値は6.6カ月(1.7〜26.7カ月の範囲)であった。患者4例はまだカバジタキセル処置を受けていた。全患者のOS中央値は9.5(95% CI 5.8〜13.2)カ月であった。ベースラインにおけるCTC中のAR-V7の存在はOSに関与していなかった(図3)。AR-V7を含まない患者におけるOS中央値が7.7(95% CI 3.3〜12.1)カ月であったのに対し、AR-V7を含む患者におけるOS中央値は9.5(95% CI 4.5〜14.5)であった(ログ-ランクΡ=0.45)。カバジタキセルの前又は後における酢酸アビラテロンによる処置はOSに影響を与えなかった(図6)。

本明細書では、腫瘍特性が経時的に変化する可能性があり、これらの変化が全身的治療への転帰に影響を及ぼし得るため、治療経過(treatment trajectory)の間に(循環)腫瘍細胞の分子特性の反復分析を行うことが、個別化治療のために非常に有益である場合があることが示されている。CTCの特性評価は、腫瘍内及び腫瘍間で病変が不均一である可能性のある転移性腫瘍部位の特性変化をモニターするための低侵襲の方法をもたらす。しかしながら、循環系中のCTCの数が少ないことから、CTCの単離及び特性評価のための、高度な、そして非常に高感度な方法が必要とされている。開発された数多くの分離アッセイの中でも、CellSearch systemは臨床で用いるために唯一FDA承認を受けているものである。これまでにCTCの特性評価アッセイは検証されていない。

しかしながら、最近、エンザルタミド又は酢酸アビラテロンによる処置を受けたmCRPC患者のCTC中のAR-V7測定の実現可能性及び臨床的意義が示された(Antonarakisら、2014)。この研究では、CTCは、mRNAベースの単離法を用いて末梢血から濃縮されているが、これについてのmCRPCにおける臨床的意義に関するデータは限られている。本試験において、我々は、末梢血からCellSearch assayにより濃縮した後のCTC中のAR-WT及びAR-V7の測定の実現可能性を検討した。癌細胞株を用いたスパイキング実験によれば、血液7.5mL中3個以上のCTC中のAR-V7を確実に検出することが可能であった。AR-V7陽性のカットオフを細胞株実験に基づいて確立し、患者試料に適用した。上皮投入量の差はCTCカウントと強く相関する上皮マーカーを用いた正規化により補正した。総合すると、我々は、CellSearch Systemを用いて単離したCTC中のAR-WT及びAR-V7を測定するロバストな方法について報告する。

続いて我々は、最近報告された酢酸アビラテロン、エンザルタミド、及びドセタキセルに対する耐性に関するAR-V7の予測的役割を考慮して、CTC中のAR-V7の存在とカバジタキセルに対する転帰との間の関連性を評価した。酢酸アビラテロン及びエンザルタミドとの交差耐性が報告されているドセタキセルとは対照的に、前述の治療が不良であった患者も依然としてカバジタキセルの効果を得られるものと見られる。ドセタキセルによる治療歴のある、10個以上のCTCを有するmCRPC患者の我々のコホートでは患者29例中16例(55%)においてAR-V7が検出されたが、これは、エンザルタミド及び酢酸アビラテロン処置患者(このうち、40%がドセタキセルによる治療を受けていた)において先に見出された29%よりも高い比率である。我々の試験においてAR-V7を有する比率が高いことは、CTCが10個未満である患者も含まれていた先の試験群に比べて、我々の患者群の予後が全体として不良であったことを反映している可能性がある。先行研究と同様に、AR-V7を有する比率は酢酸アビラテロン耐性患者において有意に高かった。AR-V7の存在により酢酸アビラテロン及びエンザルタミドに対する耐性が予測されることが見出されている(Antonarakisら、2014)。本明細書において我々は、処置前に採取したCTC中のAR-V7の存在は、AR-V7を含む患者及び含まない患者のいずれにおいてもCTC-RRが20%であるカバジタキセルに対する転帰とは関連がなかったことを示している。また、エンザルタミド及び酢酸アビラテロン処置患者の所見とは対照的に、カバジタキセル処置後のOSは、CTC中のAR-V7の存在とは関連していなかった。我々の結果は、カバジタキセルがAR-V7陽性患者にとって依然として有効な治療選択肢であることを示す。

我々は、CTC-RR(カバジタキセル2サイクル後にCTCカウントが血液7.5mL当たり5個未満に減少することとして定義される)を治療有効性の主要評価項目として使用することを選択した。この評価項目の安定性(robustness)は、CTC数がmCRPC患者のPFS及びOSに強く関連していること、並びに、ベースラインCTC数が血液7.5mL当たりCTC5個以上と高いが5個未満まで減少する患者の転帰が、高いCTC数を維持した患者に比べて良好であることを示すいくつかの先行研究において確立されている。更に、CTC数と乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルとの組み合わせが生存期間の代替性(survival surrogacy)に関する全ての基準を満たすことが示され、臨床試験において、CTCをOSの代用評価項目(surrogate endpoint)として使用することの根拠となっている。PSA-RRは依然として広く使用されているため、これを副次的評価項目として分析した。AR-V7陽性患者とAR-V7陰性患者との間、及び、12週間と処置終了時との間のPSA応答に差は認められなかった。

カバジタキセルに対する応答に関して、ベースラインCTC中のAR-V7の予測値が存在しないことは新規かつ驚くべきことであり、カバジタキセルがAR-V7陽性患者のための、場合によっては試料中に上皮CTCを3個以上含むという現行のAR-V7の検出限界よりも少ないCTCを有する患者にとってさえ有効な治療選択肢であることが示される。

結論として、本明細書において我々は、mCRPC患者のCellSearchによる濃縮後のCTC中のAR-V7測定が実現可能であることを実証した。我々は、これらの患者におけるカバジタキセルに対する転帰はこの特定のスプライス変異体の存在とは関連がないことを示した。これらの結果は、CTCが、癌治療を個別化するため、そして最適な治療シークエンスを可能にすることによりmCRPC患者の予後を改善するための貴重なツールを提供するという既存のエビデンスに重要な情報を追加するものである。

Claims

前立腺癌に罹患しているアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7(AR-V7)陽性患者の処置方法における使用のための、カバジタキセルを含む組成物であって、
前記患者に対するAR-V7ステータスを、AR-V7循環腫瘍細胞の存在について前記患者からの生物学的試料を検査することにより決定して、前記患者がAR-V7について陽性であるか検査され、
カバジタキセルが塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態である、
コルチコイドと組み合わせた使用のための組成物。
前記前立腺癌が転移性去勢抵抗性前立腺癌である、請求項1に記載の使用のための組成物。
前記コルチコイドがプレドニゾン又はプレドニゾロンである、請求項1又は請求項2に記載の使用のための組成物。
前記患者のAR-V7ステータスを決定する前記工程が、単離腫瘍細胞に対して実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記患者におけるAR-V7ステータスを決定する前記工程が、単離CTCに対して、CELLSEARCH (登録商標)循環腫瘍細胞試験を用いて実施される、請求項4に記載の使用のための組成物。
前記患者がドセタキセルベースのレジメンによる治療歴を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記患者がドセタキセルに対して耐性である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記患者が酢酸アビラテロン及び/若しくはエンザルタミドによる治療歴を有し、且つ/又は、酢酸アビラテロン及び/若しくはエンザルタミドに対して耐性である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記カバジタキセルがアセトン溶媒和物の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
アセトン溶媒和物が5%から8%の間のアセトンを含有する、請求項9に記載の使用のための組成物。
カバジタキセルを15mg/m²から25mg/m²の間の用量で含み、プレドニゾン又はプレドニゾロンを10mg/日の用量で含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
カバジタキセルを25mg/m²の用量で含む、請求項11に記載の使用のための組成物。
3週間毎に新たなサイクルとして投与を繰り返すための、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
サイクル数の中央値が6である、請求項13に記載の使用のための組成物。
コルチコイドと組み合わせた塩基形態又は水和物若しくは溶媒和物の形態のカバジタキセルによる処置に適格な前立腺癌患者を同定する方法であって、AR-V7循環腫瘍細胞の存在について患者からの生物学的試料を検査する工程を含み、前記試料中の循環腫瘍細胞の結果がAR-V7陽性である場合、該患者は前記カバジタキセルによる処置に適格である、方法。
AR-V7循環腫瘍細胞の存在について患者からの生物学的試料を検査する工程が、
(a) 患者から調製された血液、血清、又は尿試料のうちの1つを提供する工程、
(b) 上皮細胞接着を標的とする抗体を備えた磁性流体ナノ粒子を用いて、前記試料中の本質的に全ての他の細胞から前記腫瘍細胞を磁気的に分離して、濃縮腫瘍細胞試料を提供する工程、
(c) 任意に、前記濃縮腫瘍細胞試料中の前記単離腫瘍細胞を、核DNA染色及び上皮細胞特異的サイトケラチンモノクローナル抗体を用いて前記試料中の前記腫瘍細胞を染色することにより、そして、任意に、白血球特異的抗CD45モノクローナル抗体染色を用いて前記試料中の染色された白血球から前記二重染色された腫瘍細胞を区別しながら、計数する工程、並びに、
(d) 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によって前記濃縮腫瘍細胞試料中の腫瘍細胞中のアンドロゲン受容体mRNAスプライス変異体7転写産物の存在を決定する工程
を含む、請求項15に記載の方法。