JP6843750B2 - 哺乳類細胞の培養方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１４年１２月２２日に出願した、米国仮特許出願番号第６２／０９５，７３４号の優先権を主張するものである。

本発明は、バイオテクノロジー方法、および組み換えタンパク質の製造方法に関する。

組み換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳類細胞は、治療上または商業上重要なタンパク質を産生するためにしばしば使用される。多様な製品パイプラインの現在の環境において、バイオテクノロジー企業は、治療用タンパク質薬物物質の高度に柔軟な費用効果の高い製造のための革新的な解決策を見出すことをますます活発にしている。

本発明は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞が、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８（例えば、２．０ｇ／Ｌより高い、２．５ｇ／Ｌより高い、３．０ｇ／Ｌより高い、３．５ｇ／Ｌより高い、４．０ｇ／Ｌより高い、４．５ｇ／Ｌより高い、５．０ｇ／Ｌより高い、５．５ｇ／Ｌより高い、６．０ｇ／Ｌより高い、６．５ｇ／Ｌより高い、もしくは７．０ｇ／Ｌより高いポロクサマー−１８８）を含む培養培地において生存可能であり、増殖すること、最適な細胞成長が、特定の割合のポロクサマー−１８８と消泡剤にて達成されること、高い細胞密度が、生細胞密度に応じて細胞培養物中のポロクサマー−１８８濃度を増大させることにより達成されること、ならびに細胞増殖を促進するために細胞培養物に添加されるべき最適なポロクサマー−１８８濃度が、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群からの１つまたはそれ以上の因子に依存することという知見に、少なくとも一部、基づく。

本明細書において、哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で灌流培養することを含み、灌流培養は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー−１８８は、培地に存在する、および／または培養工程の前に培地に添加される、および／または培養工程中に培地に添加される、前記方法が提供される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、２．８ｇ／Ｌの濃度もしくは２．８ｇ／Ｌより高い濃度、４．０ｇ／Ｌの濃度もしくは４．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌの濃度もしくは６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌの濃度もしくは８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地は、消泡剤をさらに含み、培地中のポロクサマー−１８８（ｇ／Ｌ）に対する消泡剤（ｇ／Ｌ）の割合は、液体培地において約０．５％〜約６．０％（例えば、約１．０％〜約５．５％、または約１．５％〜約５．０％）である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー−１８８を培地に添加し、および／または培養工程中にポロクサマー−１８８を培地に添加して、培地中のポロクサマー−１８８を１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度にすることを含む。本明細書において提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ポロクサマー−１８８は培地に存在する。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー−１８８を培地に添加し、および／または培養工程中にポロクサマー−１８８を培地に添加して、培地中のポロクサマー−１８８を２．８ｇ／Ｌの濃度または２．８ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、４．０ｇ／Ｌの濃度もしくは４．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌの濃度もしくは６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌの濃度もしくは８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）にすることを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中のポロクサマー−１８８濃度を経時的に増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地中のポロクサマー−１８８濃度を経時的に増大させることは、培地中の生細胞密度に基づく。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約３５×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬである場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を１．８ｇ／Ｌより高く（例えば、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、または約２．３ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ）まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬである場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を３．０ｇ／Ｌより高く（例えば、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、または約３．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ）まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が９０×１０^６細胞／ｍＬより高い場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を６．０ｇ／Ｌより高く（例えば、７．０ｇ／Ｌより高く、８．０ｇ／Ｌより高く、または１０．０ｇ／Ｌより高く）まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度が約３５×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬである場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌまで増大させること；培地中の生細胞濃度密度が約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬである場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌまで増大させること；および培地中の生細胞密度濃度が９０×１０^６細胞／ｍＬより高い場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を６．０ｇ／Ｌより高くまで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養中の１つまたはそれ以上の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流培養は、第１の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意すること；容器を撹拌しながら、少なくとも約７日の培養期間、温度約３２℃〜約４０℃でインキュベートすること；および培養期間の最初の４８〜９６時間後、連続的または定期的に、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加することを含み、第１と第２の体積はほぼ等しい。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第２の液体培地は、第１の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー−１８８を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第１の液体培地は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌ未満の濃度のポロクサマー−１８８を含み、第２の液体培地は、１．８ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、２．８ｇ／Ｌより高い濃度、４．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加する前または後に、ポロクサマー−１８８を第２の液体培地に添加して、第２の培地中のポロクサマー−１８８を１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、２．８ｇ／Ｌより高い濃度、４．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）にすることを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質を哺乳類細胞から、第１の液体培地、もしくは第２の液体培地から、またはその任意の組み合わせから収集することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、収集は、培養が、３０×１０^６細胞／ｍＬより高い（例えば、５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１００×１０^６細胞／ｍＬより高い、１５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、または２００×１０^６細胞／ｍＬより高い）生細胞密度を達成した後、行われる。

哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、容器と、該容器内に配置された液体培地と、および該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系を用意すること；ならびに培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で灌流培養することを含み、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される１つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−１８８濃度を含む方法も、本明細書において提供される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、選択されたポロクサマー−１８８濃度は、培養工程の前にポロクサマー−１８８を培地に添加すること、および／または培養工程中にポロクサマー−１８８を培地に添加することにより達成される。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、因子は孔タイプであり、孔タイプは焼結孔、またはドリル孔である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約７５０μｍ〜約１．５ｍｍである場合は、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を、または孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約９００μｍ〜約１．１ｍｍである場合は、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約２５０μｍ〜約７５０μｍである場合は、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８、または孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約４００μｍ〜約６００μｍである場合は、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約１μｍ〜約２５０μｍ（例えば、約１μｍ〜約２００μｍ、約１６０μｍ〜約１９０μｍ、または約１７０μｍ〜約１８０μｍ）である場合は、４．３ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、５．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが１５０μｍより大きい場合は、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約８０μｍ〜約１５０μｍである場合は、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を、または孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約９０μｍ〜約１１０μｍである場合は、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌの濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約１μｍ〜約８０μｍである場合は、４．５ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、５．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、または１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流培養は、第１の液体培地を含む培養系を撹拌しながら、少なくとも約７日の培養期間、温度約３２℃〜約４０℃でインキュベートすること；および培養期間の最初の４８〜９６時間後、連続的または定期的に、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第２の液体培地は、第１の液体培地中のポロクサマー−１８８の濃度より高い濃度のポロクサマー−１８８を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第２の培地は、選択されたポロクサマー−１８８濃度を含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質を哺乳類細胞の内部から、第１の液体培地、もしくは第２の液体培地から、またはその任意の組み合わせから収集することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、容器は灌流バイオリアクターである。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流バイオリアクターは、約１．５Ｌ〜約２５，０００Ｌの体積を有する。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培養期間は１０日より長い。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ｃ）における、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第２の体積の第２の液体培地を添加することは、連続的に行われる。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ｃ）における、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第２の体積の第２の液体培地を添加することは、定期的に行われる。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ｃ）において、取り出される第１の液体培地の第１の体積、および添加される第２の液体培地の第２の体積は、経時的に増大される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第１の液体培地および／または第２の液体培地は、既知組成の液体培養培地、無血清の液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、およびタンパク質を含まない培地の群から選択される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、およそ最初の４８〜９６時間の時間後、それぞれ２４時間の期間において、（ｃ）における、取り出された第１の液体培地の第１の体積、および添加された第２の液体培地の第２の体積は、第１の液体培地の体積、または容器の体積の約０．３×〜約１０×である。

本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＴ−１０８０細胞株である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である。

本明細書において使用される通り、名詞の前の単語「ａ」は、１つまたはそれ以上の特定の名詞を表す。例えば、語句「哺乳類細胞」は、「１つまたはそれ以上の哺乳類細胞」を表す。

用語「哺乳類細胞」は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、もしくはウサギ）由来の、またはそれからもたらされる任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は不死化細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、分化した、または未分化の細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例が、本明細書において記載される。哺乳類細胞のさらなる例は、当該技術分野において公知である。

用語「培養」、または「細胞培養」は、制御されたセットの物理的条件下での哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。

用語「哺乳類細胞の培養物」、「培養物」、または「細胞培養物」は、制御されたセットの物理的条件下で維持されるか、または増殖する、複数の哺乳類細胞を含有する液体培地を意味する。

用語「液体培養培地」、または「液体培地」は、細胞（例えば、哺乳類細胞）がインビトロで成長または増殖することを可能にするのに十分な栄養分を含有する液体を意味する。例えば、液体培地は、アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、および重炭酸ナトリウムの１つまたはそれ以上を含有する。いくつかの実施形態において、液体培地は、哺乳類由来の血清を含有する。いくつかの実施形態において、液体培地は、哺乳類由来の血清または別の抽出物を含有しない（既知組成の液体培地）。いくつかの実施形態において、液体培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモン、および／または哺乳類成長因子を含有する。液体培地の別の例は、最小培地（例えば、無機塩、炭素源、および水のみを含有する培地）である。液体培地の非限定的な例が、本明細書において記載される。液体培地のさらなる例は、当該技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。液体培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含有する。例えば、本明細書において使用される通り、バイオリアクターから取り出されたある体積の液体培地は、哺乳類細胞を実質的に含まない。

用語「動物由来の成分を含まない液体培養培地」は、哺乳類に由来する成分（例えば、タンパク質、または血清）を全く含有しない液体培地を意味する。

用語「無血清の液体培養培地」は、哺乳類の血清を含有しない液体培地を意味する。

用語「血清を含有する液体培養培地」は、哺乳類の血清を含有する液体培地を意味する。

用語「既知組成の液体培養培地」は、当該技術分野の用語であり、化学的成分の全てが公知である、液体培地を意味する。例えば、既知組成の液体培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含有せず、なぜならこれらの調製物は、アルブミンと脂質の複雑な混合物を典型的に含有するからである。

用語「タンパク質を含まない液体培養培地」は、タンパク質（例えば、検出可能なタンパク質）を全く含有しない液体培地を意味する。

用語「撹拌」は、容器において液体培地の部分をかき混ぜること、またはそうでなければ動かすことを意味する。これは、例えば、バイオリアクターにおいて液体培地中の溶解したＯ_２濃度を増大させるために行われる。撹拌は、任意の、当該技術分野で公知の方法、例えば、機器、またはプロペラを使用して行われる。バイオリアクターにおいて液体培地の部分の撹拌を行うために使用される、代表的な装置および方法は、当該技術分野において公知である。

用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンタンパク質の少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸）のアミノ酸配列（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）を含有するポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸、例えば、重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸を含む。免疫グロブリンは、単離抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であってもい。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であってもよい。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、またはｓｃＦｖフラグメントであってもよい。免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または２量体、３量体、もしくは多量体抗体、または二特異性抗体、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンはまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する操作されたタンパク質（例えば、融合タンパク質）でもあり得る。免疫グロブリンの非限定的な例が、本明細書において記載され、免疫グロブリンのさらなる例が、当該技術分野において公知である。組み換え免疫グロブリンは、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。

用語「タンパク質フラグメント」、または「ポリペプチドフラグメント」は、少なくとももしくは約４個のアミノ酸長、少なくとももしくは約５個のアミノ酸長、少なくとももしくは約６個のアミノ酸長、少なくとももしくは約７個のアミノ酸長、少なくとももしくは約８個のアミノ酸長、少なくとももしくは約９個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１０個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１１個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１２個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１３個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１４個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１５個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１６個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１７個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１８個のアミノ酸長、少なくとももしくは約１９個のアミノ酸長、もしくは少なくとももしくは約２０個のアミノ酸長、または２０個より長いアミノ酸長である、ポリペプチド配列の部分を意味する。組み換えタンパク質フラグメントは、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。

用語「操作されたタンパク質」は、生物（例えば、哺乳類）内に存在する内在性核酸により天然でコードされないポリペプチドを意味する。操作されたタンパク質の例は、酵素（例えば、操作された酵素の安定性および／または触媒活性の増大をもたらす、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または付加を有する）、融合タンパク質、抗体（例えば、２価抗体、３価抗体、または二特異性抗体）、ならびに少なくとも１つの組み換えスキャフォールド配列を含有する抗原結合タンパク質を含む。組み換え操作されたタンパク質は、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。

用語「分泌されたタンパク質」、または「分泌された組み換えタンパク質」は、哺乳類細胞内で翻訳され、哺乳類細胞における分泌シグナル配列の少なくとも一部での、酵素的切断を通じて、細胞外の空間（例えば、液体培地）に少なくとも部分的に分泌されたときの、少なくとも１つの分泌シグナル配列を本来含有するタンパク質（例えば、組み換えタンパク質）を意味する。当業者は、「分泌された」タンパク質が、分泌されたタンパク質とみなされるために、細胞から完全に分離している必要はないことを理解するだろう。

用語「灌流バイオリアクター」は、バイオリアクターに存在する細胞の培養が、定期的または連続的に第１の液体培地を取り出し、同時またはその直後に、バイオリアクターに実質的に同じ体積の第２の液体培地を添加することを含む、第１の液体培地中に複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含有するバイオリアクターを意味する。いくつかの例では、培養期間（例えば、液体培地は、日常的に比率を再供給する）中の増加的期間（例えば、約２４時間の期間、約１分〜約２４時間の期間、または２４時間より長い期間）に渡り、取り出され、添加される第１の液体培地の体積の増加的変化（例えば、増大、または低減）が存在する。それぞれの日に取り出され、置き換えられる培地の分画は、培養される特定の細胞、開始播種密度、および特定の時間での細胞密度に依存して、変動する。「ＲＶ」、または「リアクター体積」は、培養プロセスの開始時に存在する液体培地の体積（例えば、播種後に存在する液体培地の総体積）を意味する。

用語「流加バイオリアクター（fed-batch bioreactor）」は、当該技術分野の用語であり、バイオリアクターに存在する細胞の培養が、細胞培養物から第１の液体培地または第２の液体培地を実質的にまたは有意に取り出すことなく、第２の液体培地の第１の液体培地に定期的または連続的に添加することを含む、第１の液体培地において複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含有するバイオリアクターを意味する。第２の液体培地は、第１の液体培地と同じであり得る。流加培養（fed-batch culture）のいくつかの例では、第２の液体培地は、第１の液体培地の濃縮された形態である。流加培養のいくつかの例では、第２の液体培地は、乾燥粉末として添加される。

用語「スパージャ」は、当該技術分野の用語であり、入口、本体、ならびに１つまたはそれ以上の孔を有する表面を有する装置であって、ガスが入口を通り、本体を通り、１つまたはそれ以上の孔から外に流れ出ることを可能にするように入口、本体、および１つまたはそれ以上の孔が設計されている装置を意味する。スパージャを細胞培養物において使用する場合、１つまたはそれ以上の孔の１つは細胞培養物と接触しており、その結果、ガスが少なくとも１つの孔から外に出て細胞培養物中に流れる。スパージャは、その孔サイズおよび孔タイプによりしばしば記載される。異なる組み合わせの孔サイズおよび孔タイプを有するスパージャの非限定的な例が、本明細書において記載される。

用語「孔サイズ」は、当該技術分野の用語であり、単一の孔を有するスパージャにおける単一の孔の直径、または２つまたはそれ以上の孔を有するスパージャにおける２つまたはそれ以上の孔の平均直径を指す。

用語「細胞ストレスに関連するマーカー」は、当該技術分野の用語であり、生理学的ストレス下で細胞（例えば、ネクローシス細胞死もしくはアポトーシス細胞死を起こす細胞）により液体培地に放出される生物学的分子、または生理学的ストレス下で細胞（例えば、ネクローシス細胞死もしくはアポトーシス細胞死を起こす細胞）において産生されるか、もしくはレベルが上昇する生物学的分子を意味する。生理学的ストレス下で細胞により放出される、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、タンパク質分解酵素（例えば、活性化カスパーゼ）、乳酸脱水素酵素、ゲノムＤＮＡ（例えば、ヌクレオソームＤＮＡ）、チトクロムｃ、および活性化ＰＡＲＰを含む。生理学的ストレス下で細胞において産生されるか、またはレベルが上昇す、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、活性化カスパーゼ、チトクロムｃ、活性化ＰＡＲＰ、および外在化ホスファチジルセリンを含む。

「比生産性」、または「ＳＰＲ」は、当該技術分野の用語であり、本明細書において使用する場合、１日当たり１つの哺乳類細胞当たり生産される組み換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組み換え治療用抗体についてのＳＰＲは、質量／細胞／日として通常測定される。組み換え治療用酵素についてのＳＰＲは、ユニット／細胞／日、または（ユニット／質量）／細胞／日として通常測定される。

「体積生産性」、または「ＶＰＲ」は、当該技術分野の用語であり、本明細書において使用する場合、１日当たりの培養物の体積当たり（例えば、バイオリアクター、容器、もしくはチューブ体積の１Ｌ当たり）の生産される組み換えタンパク質の質量、または酵素活性を指す。組み換え治療用抗体についてのＶＰＲは、質量／Ｌ／日として通常測定される。組み換え治療用酵素についてのＶＰＲは、ユニット／Ｌ／日、または質量／Ｌ／日として通常測定される。

語句「濃度のポロクサマー−１８８１」および「ポロクサマー−１８８濃度」は、本明細書において互換的に使用される。語句「Ｘｇ／Ｌまたはそれ以上のポロクサマー−１８８」、および「Ｘｇ／Ｌの濃度またはＸｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８」は、本明細書において互換的に使用される。

別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および化学用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のため本明細書において記載され；当該技術分野において公知の、他の、適当な方法および材料も使用される。材料、方法、および実施例は、説明のみであり、限定することを意図しない。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、全体として参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む、本明細書が支配する。

本発明の他の特性ならびに利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに請求項から明らかであろう。

培養期間の長さに渡り追加のポロクサマー−１８８を含有しない（培養期間の長さに渡り一定の１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度）液体培地を使用して行った灌流細胞培養ラン（灰色のデータ）、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する液体培養培地を使用して行った灌流細胞培養ラン（黒色のデータ）における、経時的な生細胞密度のグラフである。 培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８を含有する（培養期間中の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８まで増大する）液体培養培地を使用して行った灌流細胞培養ランにおける、経時的な比成長速度のグラフである。 培養期間の長さに渡り追加のポロクサマー−１８８を含有しない（培養期間の長さに渡り一定の１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度）液体培地を使用して行った、２回の灌流細胞培養ラン（灰色のデータ）、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する液体培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（黒色のデータ）における生細胞のパーセンテージのグラフである。 培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する液体培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ランにおける、経時的な体積測定生産性のグラフである。 培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する液体培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ランにおける、経時的な比生産性のグラフである。 ６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン１）；７日間、室温にてインキュベートした、６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン１ａ）；３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン２）；３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有し、７日間、室温にてインキュベートした、灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン２ａ）；６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度に達するようにポロクサマー−１８８を付加し、室温にて、９日間インキュベートした、３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン２ｂ）；３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン３）；３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有し、室温にて、７日間インキュベートした、灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン３ａ）；および６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度に達するようにポロクサマー−１８８を付加し、９日間、室温にてインキュベートした、３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する灌流細胞培養物から回収した清澄化液体培地（レーン３ｂ）：に存在する組み換え抗体の分解産物を示す、ビス−トリスゲルの図である。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）についての経時的な生細胞密度のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）についての経時的な比成長速度のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌ〜４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）についての経時的な比ラクトース脱水素酵素生産のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間に渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）についての経時的なパーセンテージ生細胞のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（塗りつぶしていない円形）；２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（塗りつぶした円形）についての経時的な比ラクトース脱水素酵素生産のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）につていの経時的な体積測定生産性のグラフである。 ２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（四角形）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（培養期間の長さに渡り１．８ｇ／Ｌから４．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（三角形）；ならびに５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ、および培養期間の長さに渡り増加量のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから３．８ｇ／Ｌに増大する）を含有する培養培地を使用して行った、灌流細胞培養ラン（円形）についての経時的な好気性グルコース消費のグラフである。 ポロクサマー−１８８に対して０％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした円形）、ポロクサマー−１８８に対して５．６％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶしていない円形）、ポロクサマー−１８８に対して１１．１％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした四角形）、ポロクサマー−１８８に対して２７．８％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶしていない四角形）、またはポロクサマー−１８８に対して５５．６％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした三角形）を含有するＣＤ−ＣＨＯ液体培地を使用して行った、異なるバッチ振盪フラスコ細胞培養ランについての経時的な生細胞密度のグラフである。 ポロクサマー−１８８に対して０％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした円形）、ポロクサマー−１８８に対して５．６％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶしていない円形）、ポロクサマー−１８８に対して１１．１％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした四角形）、ポロクサマー−１８８に対して２７．８％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶしていない四角形）、またはポロクサマー−１８８に対して５５．６％の消泡剤−ｃの割合（塗りつぶした三角形）を含有するＣＤ−ＣＨＯ液体培地を使用して行った異なるバッチ振盪フラスコ細胞培養ランについての経時的な比乳酸脱水素酵素生産性のグラフである。

本明細書において、哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で培養すること含み、培養は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー−１８８は、培地に存在する、および／または培養工程の前に培地に添加される、および／または培養工程中に培地に添加される、方法が提供される。哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、容器と、該容器内に配置された液体培地と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系を用意すること、ならびに培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で培養することを含み、培地が、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される１つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−１８８濃度を含む方法も提供される。これらの方法の代表的な非限定的な態様が、以下で記載される。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、２０×１０^６細胞／ｍＬより高い、２５×１０^６細胞／ｍＬより高い、３０×１０^６細胞／ｍＬより高い、３５×１０^６細胞／ｍＬより高い、４０×１０^６細胞／ｍＬより高い、４５×１０^６細胞／ｍＬより高い、５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、５５×１０^６細胞／ｍＬより高い、６０×１０^６細胞／ｍＬより高い、６５×１０^６細胞／ｍＬより高い、７０×１０^６細胞／ｍＬより高い、７５×１０^６細胞／ｍＬより高い、８０×１０^６細胞／ｍＬより高い、８５×１０^６細胞／ｍＬより高い、９０×１０^６細胞／ｍＬより高い、９５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１００×１０^６細胞／ｍＬより高い、１０５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１１０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１１５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１２０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１２５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１３０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１３５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１４０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１４５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１５５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１６０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１６５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１７０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１７５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１８０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１８５×１０^６細胞／ｍＬより高い、１９０×１０^６細胞／ｍＬより高い、１９５×１０^６細胞／ｍＬより高い、２００×１０^６細胞／ｍＬより高い、２０５×１０^６細胞／ｍＬより高い、２１０×１０^６細胞／ｍＬより高い、２１５×１０^６細胞／ｍＬより高い、２２０×１０^６細胞／ｍＬより高い、２２５×１０^６細胞／ｍＬより高い、２３０×１０^６細胞／ｍＬより高い、２３５×１０^６細胞／ｍＬより高い、２４０×１０^６細胞／ｍＬより高い、２４５×１０^６細胞／ｍＬより高い、または２５０×１０^６細胞／ｍＬより高い生細胞密度を有する細胞培養物を達成する。細胞培養物の生細胞密度を決定する方法は、当該技術分野において周知である。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、少なくとも５日（例えば、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、または少なくとも７０日）の培養期間に渡り、７５％より高い（例えば、８０％より高い、８５％より高い、または９０％より高い）パーセンテージ細胞生存率を有する細胞培養物をもたらす。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、培養期間中の任意の時間に開始する少なくとも５日（例えば、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、または少なくとも７０日）に渡り、少なくとも１．５ｇ／Ｌ／ｄ（例えば、少なくとも１．６ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも１．７ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも１．９ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．１ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．２ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．３ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．６ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．７ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．８ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも２．９ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．１ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．２ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．３ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．４ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．５ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．６ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．７ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．８ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも３．９ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも４．１ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも４．２ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも４．３ｇ／Ｌ／ｄ、少なくとも４．４ｇ／Ｌ／ｄ、または少なくとも４．５ｇ／Ｌ／ｄ）の体積測定生産性（volumetric productivity rate）（ＶＰＲ）を有する培養物に達する。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、収集されたとき、（１．８ｇ／Ｌもしくはそれ以上のポロクサマー−１８８を含む液体培地における培養を含まない、類似の方法で産生された組み換えタンパク質と比較して）低減したレベル（例えば、約５％もしくはそれ未満の低減、約１０％もしくはそれ未満の低減、約１５％もしくはそれ未満の低減、約２０％もしくはそれ未満の低減、約２５％もしくはそれ未満の低減、約３０％もしくはそれ未満の低減、約３５％もしくはそれ未満の低減、約４０％もしくはそれ未満の低減、約４５％もしくはそれ未満の低減、約５０％もしくはそれ未満の低減、約５５％もしくはそれ未満の低減、約６０％もしくはそれ未満の低減、約６５％もしくはそれ未満の低減、約７０％もしくはそれ未満の低減、約７５％もしくはそれ未満の低減、約８０％もしくはそれ未満の低減、約８５％もしくはそれ未満の低減、または約９０％もしくはそれ未満の低減）の分解を有する、組み換えタンパク質の産生をもたらす。細胞培養物から収集された組み換えタンパク質の分解のレベルは、例えば、ゲル電気泳動、および／または免疫ブロッティングを使用して、検出される。

いくつかの実施形態において、方法は、培養期間内の任意の時間にて開始する、少なくとも約５日（例えば、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、または少なくとも７０日）の連続する日に渡り、６０ｎＵ／細胞／日未満（例えば、５５ｎＵ／細胞／日未満、５０ｎＵ／細胞／日未満、４５ｎＵ／細胞／日未満、４０ｎＵ／細胞／日未満、３５ｎＵ／細胞／日未満、３０ｎＵ／細胞／日未満、２５ｎＵ／細胞／日未満、または２０ｎＵ／細胞／日未満）の比乳酸脱水素酵素生産を有する細胞培養物をもたらす。

いくつかの実施形態において、方法は、一定の状態（静止期）における、少なくとも５日（例えば、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、もしくは少なくとも５０日）間の、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約３５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約４０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約４５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約５０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約５５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約６０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約６５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約７０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約７５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約８０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約８５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約９０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約９５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１００×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１０５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１１０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１１５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１２０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１２５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１３０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１３５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１４０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１４５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１５０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１５５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１６０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１６５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１７０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１７５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１８０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１８５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１９０×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、約１９５×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い、または約２００×１０^６細胞／ｍＬもしくはそれより高い生細胞密度での細胞の維持をもたらす。

培養物体積
記載される方法のいずれかにおける培養工程（例えば、灌流培養工程）は、培養物における細胞維持、および増殖を可能にする条件下で、２０Ｌ〜約８，０００Ｌ（例えば、約２０Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約２，５００Ｌ、約２０Ｌ〜約２，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２０Ｌ〜約１，０００Ｌ、約２０Ｌ〜約５００Ｌ、約２０Ｌ〜約２００Ｌ、約２０Ｌ〜約１００Ｌ、約１００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約８００Ｌ、約１００Ｌ〜約７００Ｌ、約１００Ｌ〜約６００Ｌ、約１００Ｌ〜約５００Ｌ、約１００Ｌ〜約４００Ｌ、約１００Ｌ〜約３００Ｌ、約１００Ｌ〜約２００Ｌ、約５００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約７５０Ｌ、約１，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、または約７，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ）の体積を有する細胞培養物をインキュベートすることを含む。

当該技術分野において公知である通り、細胞培養物の体積は、培養期間（例えば、以下に記載される）中実質的に同じままであるか、または経時的に増大する。

培養期間
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養（例えば、灌流培養）は、約３日〜約１００日（例えば、約３日〜約９５日、約３日〜約９０日、約３日〜約８５日、約３日〜約８０日、約３日〜約７５日、約３日〜約７０日、約３日〜約６５日、約３日〜約６０日、約３日〜約５５日、約３日〜約５０日、約３日〜約４５日、約３日〜約４０日、約３日〜約３５日、約３日〜約３０日、約３日〜約２５日、約３日〜約２０日、約３日〜約１５日、約３日〜約１０日、約５日〜約１００日、約５日〜約９５日、約５日〜約９０日、約５日〜約８５日、約５日〜約８０日、約５日〜約７５日、約５日〜約７０日、約５日〜約６５日、約５日〜約６０日、約５日〜約５５日、約５日〜約５０日、約５日〜約４５日、約５日〜約４０日、約５日〜約３５日、約５日〜約３０日、約５日〜約２５日、約５日〜約２０日、約５日〜約１５日、約５日〜約１０日、約１０日〜約１００日、約１０日〜約９５日、約１０日〜約９０日、約１０日〜約８５日、約１０日〜約８０日、約１０日〜約７５日、約１０日〜約７０日、約１０日〜約６５日、約１０日〜約６０日、約１０日〜約５５日、約１０日〜約５０日、約１０日〜約４５日、約１０日〜約４０日、約１０日〜約３５日、約１０日〜約３０日、約１０日〜約２５日、約１０日〜約２０日、約１０日〜約１５日、約１５日〜約１００日、約１５日〜約９５日、約１５日〜約９０日、約１５日〜約８５日、約１５日〜約８０日、約１５日〜約７５日、約１５日〜約７０日、約１５日〜約６５日、約１５日〜約６０日、約１５日〜約５５日、約１５日〜約５０日、約１５日〜約４５日、約１５日〜約４０日、約１５日〜約３５日、約１５日〜約３０日、約１５日〜約２５日、約１５日〜約２０日、約２０日〜約１００日、約２０日〜約９５日、約２０日〜約９０日、約２０日〜約８５日、約２０日〜約８０日、約２０日〜約７５日、約２０日〜約７０日、約２０日〜約６５日、約２０日〜約６０日、約２０日〜約５５日、約２０日〜約５０日、約２０日〜約４５日、約２０日〜約４０日、約２０日〜約３５日、約２０日〜約３０日、約２０日〜約２５日、約２５日〜約１００日、約２５日〜約９５日、約２５日〜約９０日、約２５日〜約８５日、約２５日〜約８０日、約２５日〜約７５日、約２５日〜約７０日、約２５日〜約６５日、約２５日〜約６０日、約２５日〜約５５日、約２５日〜約５０日、約２５日〜約４５日、約２５日〜約４０日、約２５日〜約３５日、約２５日〜約３０日、約３０日〜約１００日、約３０日〜約９０日、約３０日〜約８０日、約３０日〜約７０日、約３０日〜約６０日、約３０日〜約５０日、約３０日〜約４０日、約４０日〜約１００日、約４０日〜約９０日、約４０日〜約８０日、約４０日〜約７０日、約４０日〜約６０日、約４０日〜約５０日、約５０日〜約１００日、約５０日〜約９０日、約５０日〜約８０日、約５０日〜約７０日、約５０日〜約６０日、約６０日〜約１００日、約６０日〜約９０日、約６０日〜約８０日、約６０日〜約７０日、約７０日〜約１００日、約７０日〜約９０日、約７０日〜約８０日、約８０日〜約１００日、約８０日〜約９０日、または約９０日〜約１００日）の期間に渡り行われる。

哺乳類細胞
本明細書において提供される方法において培養される（例えば、灌流培養される）哺乳類細胞は、懸濁液において成長する細胞、または接着細胞である。本明細書において記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳類細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、またはＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞）、Ｓｐ２．０、ミエローマ細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｅ、およびＨＥＫ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮（Ｖｅｒｏ）細胞、ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ならびにメイディンダービーイヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞を含む。接着細胞が培養されるいくつかの例では、培養物はまた、複数のマイクロキャリア（例えば、１つまたはそれ以上の孔を含有するマイクロキャリア）も含有する。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養されるさらなる哺乳類細胞は、当該技術分野において公知である。

哺乳類細胞は、組み換えタンパク質をコードする、組み換え核酸（例えば、哺乳類細胞のゲノムにおいて安定的に統合された核酸）を含有する。本明細書において記載される方法を使用して産生される組み換えタンパク質である、代表的な組み換えタンパク質をコードする組み換え核酸の非限定的な例が、以下に記載される。いくつかの場合に、バイオリアクター（例えば、本明細書において記載されるバイオリアクターのいずれか）において培養される哺乳類細胞は、より多くの培養物からもたらされた。

組み換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学において公知の多種多様な方法を使用して、哺乳類細胞に導入される。非限定的な例は、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションを含む。いくつかの場合に、組み換えタンパク質をコードする核酸は、哺乳類細胞の染色体に安定的に統合されない（一過性トランスフェクション）が、一方、他の場合で、核酸は統合される。あるいは、または加えて、組み換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、および／または哺乳類人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）に存在する。あるいは、または加えて、核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター）を使用して細胞に導入される。核酸は、プロモーター配列（例えば、β−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーター、または誘導可能なプロモーター）に作動可能に結合する。核酸を含有するベクターはまた、所望されるなら、選択可能なマーカー（例えば、哺乳類細胞にハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン抵抗性を与える遺伝子）も含有する。

いくつかの場合に、組み換えタンパク質は、分泌されたタンパク質であり、哺乳類細胞により、細胞外培地（例えば、灌流培養における第１および／もしくは第２の液体培地、またはフィードバッチ培養（feed batch culturing）における第１の液体培地および／もしくはフィード液体培地（feed liquid medium））に放出される。例えば、溶解可能な組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、哺乳類細胞に存在する酵素により切断され、細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培地）にその後放出される、組み換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に分泌シグナルペプチドをコードする、配列を含有する。

バイオリアクター
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養工程は、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター）を使用して行われる。培養工程を行うために使用されるバイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター）は、約２４Ｌ〜約２５，０００Ｌ（例えば、約２４Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約２，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約２，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約１，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約９００Ｌ、約２４Ｌ〜約８００Ｌ、約２４Ｌ〜約７００Ｌ、約２４Ｌ〜約６００Ｌ、約２４Ｌ〜約５００Ｌ、約２４Ｌ〜約４００Ｌ、約２４Ｌ〜約３００Ｌ、約２４Ｌ〜約２００Ｌ、約２４Ｌ〜約１００Ｌ、約１００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約９００Ｌ、約１００Ｌ〜約８００Ｌ、約１００Ｌ〜約７００Ｌ、約１００Ｌ〜約６００Ｌ、約１００Ｌ〜約５００Ｌ、約１００Ｌ〜約４００Ｌ、約１００Ｌ〜約３００Ｌ、約１００Ｌ〜約２００Ｌ、約２００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約９００Ｌ、約２００Ｌ〜約８００Ｌ、約２００Ｌ〜約７００Ｌ、約２００Ｌ〜約６００Ｌ、約２００Ｌ〜約５００Ｌ、約２００Ｌ〜約４００Ｌ、約２００Ｌ〜約３００Ｌ、約５００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約９００Ｌ、約５００Ｌ〜約８００Ｌ、約５００Ｌ〜約７００Ｌ、約５００Ｌ〜約６００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約６．０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、７，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１０，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、または約２０，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ）の内部体積（収容能力）を有する。

培養系
本明細書において記載される方法のいくつかは、容器と、該容器内に配置された液体培地（例えば、本明細書において記載される培養培地のいずれか）と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系（例えば、灌流培養系）を使用する。容器は、約２４Ｌ〜約２０，０００Ｌ（例えば、約２４Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約２，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約２，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２４Ｌ〜約１，０００Ｌ、約２４Ｌ〜約９００Ｌ、約２４Ｌ〜約８００Ｌ、約２４Ｌ〜約７００Ｌ、約２４Ｌ〜約６００Ｌ、約２４Ｌ〜約５００Ｌ、約２４Ｌ〜約４００Ｌ、約２４Ｌ〜約３００Ｌ、約２４Ｌ〜約２００Ｌ、約２４Ｌ〜約１００Ｌ、約１００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約１００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約９００Ｌ、約１００Ｌ〜約８００Ｌ、約１００Ｌ〜約７００Ｌ、約１００Ｌ〜約６００Ｌ、約１００Ｌ〜約５００Ｌ、約１００Ｌ〜約４００Ｌ、約１００Ｌ〜約３００Ｌ、約１００Ｌ〜約２００Ｌ、約２００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約２００Ｌ〜約９００Ｌ、約２００Ｌ〜約８００Ｌ、約２００Ｌ〜約７００Ｌ、約２００Ｌ〜約６００Ｌ、約２００Ｌ〜約５００Ｌ、約２００Ｌ〜約４００Ｌ、約２００Ｌ〜約３００Ｌ、約５００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約９００Ｌ、約５００Ｌ〜約８００Ｌ、約５００Ｌ〜約７００Ｌ、約５００Ｌ〜約６００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約３，０００Ｌ、約２，０００Ｌ〜約２，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約４，０００Ｌ、約３，０００Ｌ〜約３，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ〜約４，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約６，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約５，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約７，０００Ｌ、約６，０００Ｌ〜約６，５００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約８，０００Ｌ、約７，０００Ｌ〜約７，５００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約９，０００Ｌ、約８，０００Ｌ〜約８，５００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約９，０００Ｌ〜約９，５００Ｌ、約１０，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ〜約１５，０００Ｌ、または約１５，０００Ｌ〜約２０，０００Ｌ）の内部体積（収容能力）を有する。容器は、金属（例えば、ステンレススチール）、プラスチック、もしくはガラス、またはその任意の組み合わせから作られる。

いくつかの実施形態において、スパージャの１つまたはそれ以上の孔は、約７５０μｍ〜約１．５ｍｍ（例えば、約７５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．４ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．３ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．２ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．１ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．０ｍｍ、約７５０μｍ〜約９５０μｍ、約７５０μｍ〜約９００μｍ、約７５０μｍ〜約８５０μｍ、約７５０μｍ〜約８００μｍ、約８００μｍ〜約１．５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．４５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．４ｍｍ、約８００μｍ〜約１．３５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．３ｍｍ、約８００μｍ〜約１．２５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．２ｍｍ、約８００μｍ〜約１．１５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．１ｍｍ、約８００μｍ〜約１．０５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．０ｍｍ、約８００μｍ〜約９５０μｍ、約８００μｍ〜約９００μｍ、約８００μｍ〜約８５０μｍ、約８５０μｍ〜約１．５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．４ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．３ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．２ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．１ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．０ｍｍ、約８５０μｍ〜約９５０μｍ、約８５０μｍ〜約９００μｍ、約９００μｍ〜約１．５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．４５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．４ｍｍ、約９００μｍ〜約１．３５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．３ｍｍ、約９００μｍ〜約１．２５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．２ｍｍ、約９００μｍ〜約１．１５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．１ｍｍ、約９００μｍ〜約１．０５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．０ｍｍ、約９００μｍ〜約９５０μｍ、約９５０μｍ〜約１．５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．４ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．３ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．２ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．１ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．０ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．２ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．１ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．０５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．２ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．１ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．２ｍｍ、約１．１ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．２ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．２ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．３ｍｍ、約１．３ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．３ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．３ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．３ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．４ｍｍ、約１．４ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．４ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、または約１．４５ｍｍ〜約１．５ｍｍ）の孔サイズを有する。

いくつかの実施形態において、スパージャの１つまたはそれ以上の孔は、約２５０μｍ〜約７５０μｍ（例えば、約２５０μｍ〜約７００μｍ、約２５０μｍ〜約６５０μｍ、約２５０μｍ〜約６００μｍ、約２５０μｍ〜約５５０μｍ、約２５０μｍ〜約５００μｍ、約２５０μｍ〜約４５０μｍ、約２５０μｍ〜約４００μｍ、約２５０μｍ〜約３５０μｍ、約２５０μｍ〜約３００μｍ、約３００μｍ〜約７５０μｍ、約３００μｍ〜約６５０μｍ、約３００μｍ〜約６００μｍ、約３００μｍ〜約５５０μｍ、約３００μｍ〜約５００μｍ、約３００μｍ〜約４５０μｍ、約３００μｍ〜約４００μｍ、約３００μｍ〜約３５０μｍ、約３５０μｍ〜約７５０μｍ、約３５０μｍ〜約７００μｍ、約３５０μｍ〜約６５０μｍ、約３５０μｍ〜約６００μｍ、約３５０μｍ〜約５５０μｍ、約３５０μｍ〜約５００μｍ、約３５０μｍ〜約４５０μｍ、約３５０μｍ〜約４００μｍ、約４００μｍ〜約７５０μｍ、約４００μｍ〜約７００μｍ、約４００μｍ〜約６５０μｍ、約４００μｍ〜約６００μｍ、約４００μｍ〜約５５０μｍ、約４００μｍ〜約５００μｍ、約４００μｍ〜約４５０μｍ、約４５０μｍ〜約７５０μｍ、約４５０μｍ〜約７００μｍ、約４５０μｍ〜約６５０μｍ、約４５０μｍ〜約６００μｍ、約４５０μｍ〜約５５０μｍ、約４５０μｍ〜約５００μｍ、約５００μｍ〜約７５０μｍ、約５００μｍ〜約７００μｍ、約５００μｍ〜約６５０μｍ、約５００μｍ〜約６００μｍ、約５００μｍ〜約５５０μｍ、約５５０μｍ〜約７５０μｍ、約５５０μｍ〜約７００μｍ、約５５０μｍ〜約６５０μｍ、約５５０μｍ〜約６００μｍ、約６００μｍ〜約７５０μｍ、約６００μｍ〜約７００μｍ、約６００μｍ〜約６５０μｍ、約６５０μｍ〜約７５０μｍ、約６５０μｍ〜約７００μｍ、または約７００μｍ〜約７５０μｍ）の孔サイズを有する。

いくつかの実施形態において、スパージャの１つまたはそれ以上の孔は、約１μｍ〜約２５０μｍ（例えば、約１μｍ〜約２４０μｍ、約１μｍ〜約２３０μｍ、約１μｍ〜約２２０μｍ、約１μｍ〜約２１０μｍ、約１μｍ〜約２００μｍ、約１μｍ〜約１９０μｍ、約１μｍ〜約１８０μｍ、約１μｍ〜約１７０μｍ、約１μｍ〜約１６０μｍ、約１μｍ〜約１５０μｍ、約１μｍ〜約１４０μｍ、約１μｍ〜約１３０μｍ、約１μｍ〜約１２５μｍ、約１μｍ〜約１２０μｍ、約１μｍ〜約１１５μｍ、約１μｍ〜約１１０μｍ、約１μｍ〜約１０５μｍ、約１μｍ〜約１００μｍ、約１μｍ〜約９５μｍ、約１μｍ〜約９０μｍ、約１μｍ〜約８５μｍ、約１μｍ〜約８０μｍ、約１μｍ〜約７５μｍ、約１μｍ〜約７０μｍ、約１μｍ〜約６５μｍ、約１μｍ〜約６０μｍ、約１μｍ〜約５５μｍ、約１μｍ〜約５０μｍ、約１μｍ〜約４５μｍ、約１μｍ〜約４０μｍ、約１μｍ〜約３５μｍ、約１μｍ〜約３０μｍ、約１μｍ〜約２５μｍ、約１μｍ〜約２０μｍ、約１μｍ〜約１５μｍ、約１μｍ〜約１０μｍ、１μｍ〜約５μｍ、１０μｍ〜約２５０μｍ、約１０μｍ〜約２４０μｍ、約１０μｍ〜約２３０μｍ、１０μｍ〜約２２０μｍ、約１０μｍ〜約２１０μｍ、約１０μｍ〜約２００μｍ、約１０μｍ〜約１９０μｍ、１０μｍ〜約１８０μｍ、約１０μｍ〜約１７０μｍ、約１０μｍ〜約１６０μｍ、約１０μｍ〜約１５０μｍ、約１０μｍ〜約１４０μｍ、約１０μｍ〜約１３０μｍ、約１０μｍ〜約１２０μｍ、約１０μｍ〜約１１０μｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約１０μｍ〜約９０μｍ、約１０μｍ〜約８０μｍ、約１０μｍ〜約７０μｍ、約１０μｍ〜約６０μｍ、約１０μｍ〜約５０μｍ、約１０μｍ〜約４０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、約１０μｍ〜約２０μｍ、約２０μｍ〜約２５０μｍ、約２０μｍ〜約２４０μｍ、約２０μｍ〜約２３０μｍ、約２０μｍ〜約２２０μｍ、約２０μｍ〜約２１０μｍ、約２０μｍ〜約２００μｍ、約２０μｍ〜約１９０μｍ、約２０μｍ〜約１８０μｍ、約２０μｍ〜約１７０μｍ、約２０μｍ〜約１６０μｍ、約２０μｍ〜約１５０μｍ、約２０μｍ〜約１４０μｍ、約２０μｍ〜約１３０μｍ、約２０μｍ〜約１２０μｍ、約２０μｍ〜約１１０μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約９０μｍ、約２０μｍ〜約８０μｍ、約２０μｍ〜約７０μｍ、約２０μｍ〜約６０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約２０μｍ〜約４０μｍ、約２０μｍ〜約３０μｍ、約３０μｍ〜約２５０μｍ、約３０μｍ〜約２４０μｍ、約３０μｍ〜約２３０μｍ、約３０μｍ〜約２２０μｍ、約３０μｍ〜約２１０μｍ、約３０μｍ〜約２００μｍ、約３０μｍ〜約１９０μｍ、約３０μｍ〜約１８０μｍ、約３０μｍ〜約１７０μｍ、約３０μｍ〜約１６０μｍ、約３０μｍ〜約１５０μｍ、約３０μｍ〜約１４０μｍ、約３０μｍ〜約１３０μｍ、約３０μｍ〜約１２０μｍ、約３０μｍ〜約１１０μｍ、約３０μｍ〜約１１０μｍ、約３０μｍ〜約１００μｍ、約３０μｍ〜約９０μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ、約３０μｍ〜約７０μｍ、約３０μｍ〜約６０μｍ、約３０μｍ〜約５０μｍ、約３０μｍ〜約４０μｍ、約４０μｍ〜約２５０μｍ、約４０μｍ〜約２４０μｍ、約４０μｍ〜約２３０μｍ、約４０μｍ〜約２２０μｍ、約４０μｍ〜約２１０μｍ、約４０μｍ〜約２００μｍ、約４０μｍ〜約１９０μｍ、約４０μｍ〜約１８０μｍ、約４０μｍ〜約１７０μｍ、約４０μｍ〜約１６０μｍ、約４０μｍ〜約１５０μｍ、約４０μｍ〜約１４０μｍ、約４０μｍ〜約１３０μｍ、約４０μｍ〜約１２０μｍ、約４０μｍ〜約１１０μｍ、約４０μｍ〜約１００μｍ、約４０μｍ〜約９０μｍ、約４０μｍ〜約８０μｍ、約４０μｍ〜約７０μｍ、約４０μｍ〜約６０μｍ、約４０μｍ〜約５０μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約５０μｍ〜約２４０μｍ、約５０μｍ〜約２３０μｍ、約５０μｍ〜約２２０μｍ、約５０μｍ〜約２１０μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１９０μｍ、約５０μｍ〜約１８０μｍ、約５０μｍ〜約１７０μｍ、約５０μｍ〜約１６０μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約１４０μｍ、約５０μｍ〜約１３０μｍ、約５０μｍ〜約１２０μｍ、約５０μｍ〜約１１０μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約５０μｍ〜約９０μｍ、約５０μｍ〜約８０μｍ、約５０μｍ〜約７０μｍ、約５０μｍ〜約６０μｍ、約６０μｍ〜約２５０μｍ、約６０μｍ〜約２４０μｍ、約６０μｍ〜約２３０μｍ、約６０μｍ〜約２２０μｍ、約６０μｍ〜約２１０μｍ、約６０μｍ〜約２００μｍ、約６０μｍ〜約１９０μｍ、約６０μｍ〜約１８０μｍ、約６０μｍ〜約１７０μｍ、約６０μｍ〜約１６０μｍ、約６０μｍ〜約１５０μｍ、約６０μｍ〜約１４０μｍ、約６０μｍ〜約１３０μｍ、約６０μｍ〜約１２０μｍ、約６０μｍ〜約１１０μｍ、約６０μｍ〜約１００μｍ、約６０μｍ〜約９０μｍ、約６０μｍ〜約８０μｍ、約６０μｍ〜約７０μｍ、約７０μｍ〜約２５０μｍ、約７０μｍ〜約２４０μｍ、約７０μｍ〜約２３０μｍ、約７０μｍ〜約２２０μｍ、約７０μｍ〜約２１０μｍ、約７０μｍ〜約２００μｍ、約７０μｍ〜約１９０μｍ、約７０μｍ〜約１８０μｍ、約７０μｍ〜約１７０μｍ、約７０μｍ〜約１６０μｍ、約７０μｍ〜約１５０μｍ、約７０μｍ〜約１４０μｍ、約７０μｍ〜約１３０μｍ、約７０μｍ〜約１２０μｍ、約７０μｍ〜約１１０μｍ、約７０μｍ〜約１００μｍ、約７０μｍ〜約９０μｍ、約７０μｍ〜約８０μｍ、約８０μｍ〜約２５０μｍ、約８０μｍ〜約２４０μｍ、約８０μｍ〜約２３０μｍ、約８０μｍ〜約２２０μｍ、約８０μｍ〜約２１０μｍ、約８０μｍ〜約２００μｍ、約８０μｍ〜約１９０μｍ、約８０μｍ〜約１８０μｍ、約８０μｍ〜約１７０μｍ、約８０μｍ〜約１６０μｍ、約８０μｍ〜約１５０μｍ、約８０μｍ〜約１４０μｍ、約８０μｍ〜約１３０μｍ、約８０μｍ〜約１２０μｍ、約８０μｍ〜約１１０μｍ、約８０μｍ〜約１００μｍ、約８０μｍ〜約９０μｍ、約９０μｍ〜約２５０μｍ、約９０μｍ〜約２４０μｍ、約９０μｍ〜約２３０μｍ、約９０μｍ〜約２２０μｍ、約９０μｍ〜約２１０μｍ、約９０μｍ〜約２００μｍ、約９０μｍ〜約１９０μｍ、約９０μｍ〜約１８０μｍ、約９０μｍ〜約１７０μｍ、約９０μｍ〜約１６０μｍ、約９０μｍ〜約１５０μｍ、約９０μｍ〜約１４０μｍ、約９０μｍ〜約１３０μｍ、約９０μｍ〜約１２０μｍ、約９０μｍ〜約１１０μｍ、約９０μｍ〜約１００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約２４０μｍ、約１００μｍ〜約２３０μｍ、約１００μｍ〜約２２０μｍ、約１００μｍ〜約２１０μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約１９０μｍ、約１００μｍ〜約１８０μｍ、約１００μｍ〜約１７０μｍ、約１００μｍ〜約１６０μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約１４０μｍ、約１００μｍ〜約１３０μｍ、約１００μｍ〜約１２０μｍ、約１００μｍ〜約１１０μｍ、約１１０μｍ〜約２５０μｍ、約１１０μｍ〜約２４０μｍ、約１１０μｍ〜約２３０μｍ、約１１０μｍ〜約２２０μｍ、約１１０μｍ〜約２１０μｍ、約１１０μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約１９０μｍ、約１００μｍ〜約１８０μｍ、約１００μｍ〜約１７０μｍ、約１００μｍ〜約１６０μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約１４０μｍ、約１００μｍ〜約１３０μｍ、約１００μｍ〜約１２０μｍ、約１００μｍ〜約１１０μｍ、約１１０μｍ〜約２５０μｍ、約１１０μｍ〜約２４０μｍ、約１１０μｍ〜約２３０μｍ、約１１０μｍ〜約２２０μｍ、約１１０μｍ〜約２１０μｍ、約１１０μｍ〜約２００μｍ、約１１０μｍ〜約１９０μｍ、約１１０μｍ〜約１８０μｍ、約１１０μｍ〜約１７０μｍ、約１１０μｍ〜約１６０μｍ、約１１０μｍ〜約１５０μｍ、約１１０μｍ〜約１４０μｍ、約１１０μｍ〜約１３０μｍ、約１１０μｍ〜約１２０μｍ、約１２０μｍ〜約２５０μｍ、約１２０μｍ〜約２４０μｍ、約１２０μｍ〜約２３０μｍ、約１２０μｍ〜約２２０μｍ、約１２０μｍ〜約２１０μｍ、約１２０μｍ〜約２００μｍ、約１２０μｍ〜約１９０μｍ、約１２０μｍ〜約１８０μｍ、約１２０μｍ〜約１７０μｍ、約１２０μｍ〜約１６０μｍ、約１２０μｍ〜約１５０μｍ、約１２０μｍ〜約１４０μｍ、約１２０μｍ〜約１３０μｍ、約１３０μｍ〜約２５０μｍ、約１３０μｍ〜約２４０μｍ、約１３０μｍ〜約２３０μｍ、約１３０μｍ〜約２２０μｍ、約１３０μｍ〜約２１０μｍ、約１３０μｍ〜約２００μｍ、約１３０μｍ〜約１９０μｍ、約１３０μｍ〜約１８０μｍ、約１３０μｍ〜約１７０μｍ、約１３０μｍ〜約１６０μｍ、約１３０μｍ〜約１５０μｍ、約１３０μｍ〜約１４０μｍ、約１４０μｍ〜約２５０μｍ、約１４０μｍ〜約２４０μｍ、約１４０μｍ〜約２３０μｍ、約１４０μｍ〜約２２０μｍ、約１４０μｍ〜約２１０μｍ、約１４０μｍ〜約２００μｍ、約１４０μｍ〜約１９０μｍ、約１４０μｍ〜約１８０μｍ、約１４０μｍ〜約１７０μｍ、約１４０μｍ〜約１６０μｍ、約１４０μｍ〜約１５０μｍ、約１５０μｍ〜約２５０μｍ、約１５０μｍ〜約２４０μｍ、約１５０μｍ〜約２３０μｍ、約１５０μｍ〜約２２０μｍ、約１５０μｍ〜約２１０μｍ、約１５０μｍ〜約２００μｍ、約１５０μｍ〜約１９０μｍ、約１５０μｍ〜約１８０μｍ、約１５０μｍ〜約１７０μｍ、約１５０μｍ〜約１６０μｍ、約１６０μｍ〜約２５０μｍ、約１６０μｍ〜約２４０μｍ、約１６０μｍ〜約２３０μｍ、約１６０μｍ〜約２２０μｍ、約１６０μｍ〜約２１０μｍ、約１６０μｍ〜約２００μｍ、約１６０μｍ〜約１９０μｍ、約１６０μｍ〜約１８０μｍ、約１６０μｍ〜約１７０μｍ、約１７０μｍ〜約２５０μｍ、約１７０μｍ〜約２４０μｍ、約１７０μｍ〜約２３０μｍ、約１７０μｍ〜約２２０μｍ、約１７０μｍ〜約２１０μｍ、約１７０μｍ〜約２００μｍ、約１７０μｍ〜約１９０μｍ、約１７０μｍ〜約１８０μｍ、約１８０μｍ〜約２５０μｍ、約１８０μｍ〜約２４０μｍ、約１８０μｍ〜約２３０μｍ、約１８０μｍ〜約２２０μｍ、約１８０μｍ〜約２１０μｍ、約１８０μｍ〜約２００μｍ、約１８０μｍ〜約１９０μｍ、約１９０μｍ〜約２５０μｍ、約１９０μｍ〜約２４０μｍ、約１９０μｍ〜約２３０μｍ、約１９０μｍ〜約２２０μｍ、約１９０μｍ〜約２１０μｍ、約１９０μｍ〜約２００μｍ、約２００μｍ〜約２５０μｍ、約２００μｍ〜約２４０μｍ、約２００μｍ〜約２３０μｍ、約２００μｍ〜約２２０μｍ、約２００μｍ〜約２１０μｍ、約２１０μｍ〜約２５０μｍ、約２１０μｍ〜約２４０μｍ、約２１０μｍ〜約２３０μｍ、約２１０μｍ〜約２２０μｍ、約２２０μｍ〜約２５０μｍ、約２２０μｍ〜約２４０μｍ、約２２０μｍ〜約２３０μｍ、約２３０μｍ〜約２５０μｍ、約２３０μｍ〜約２４０μｍ、または約２４０μｍ〜約２５０μｍ）の孔サイズを有する。

スパージャの１つまたはそれ以上の孔は、例えば、ドリル孔、または焼結孔の孔タイプを有する。培養系は、容器内に分配された液体培地を撹拌するための装置（例えば、インペラー、およびインペラーを回転させるモーター）を含む。容器は、容器に配置された液体培地への材料（例えば、液体培地、ポロクサマー−１８８、塩基もしくは酸（ｐＨを調整するのに必要とされる）、および／もしくは消泡剤）を添加すること、ならびに／または液体培地（例えば、清澄化液体培地、もしくは細胞培養物のサンプル）を取り出すことを可能にする、１つまたはそれ以上の開口（および場合により、ポンプ）を含む。培養系はまた、培養期間中に液体培地中のｐＨ、ｄＯ_２、温度、およびｄＣＯ_２をモニターするための１つまたはそれ以上のセンサーも含む。培養系は、細胞を実質的に含まない、清澄化液体培地をもたらすようにある体積の細胞培養物を処理する、濾過装置（例えば、交互接線濾過または接線流濾過を行う装置）を含む。培養系は、容器に配置された液体培地の温度の調整を可能にする過熱／冷却装置を含む。細胞培養系のさらなる特性は、当該技術分野において周知である。

灌流培養
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、培養工程は、灌流培養である。当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、バイオリアクターから第１の体積の第１の液体培地を取り出すこと、およびバイオリアクターに第２の体積の第２の液体培地を添加することを含み、第１の体積と第２の体積はほぼ等しい。哺乳類細胞は、ある細胞保持装置により、またはコーン分級器における細胞沈殿のような、技術を介して、バイオリアクターにおいて保持される。

当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、フィードバッチ培養と異なり、灌流培養において使用される培養培地、および／または培養条件は、フィードバッチ培養において使用されるものとしばしば異なる。

灌流培養において培地を取り出すことおよび添加することは、同時もしくは連続的に、または２つのある組み合わせで行われる。さらに、取り出すことおよび添加することは、例えば、バイオリアクターの体積の０．１％〜８００％、１％〜７００％、１％〜６００％、１％〜５００％、１％〜４００％、１％〜３５０％、１％〜３００％、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、または４％〜３０％の体積を取り出し、置き換える比率で、連続的に行われる。

取り出された第１の液体培地の第１の体積、および添加された第２の液体培地の第２の体積は、いくつかの場合に、それぞれ２４時間の期間に渡り、およそ同じに保たれる。当該技術分野において公知である通り、第１の体積の第１の液体培地が取り出される比率（体積／単位時間）、および第２の体積の第２の液体培地が添加される比率（体積／単位時間）は、変動し、特定の細胞培養系の条件に依存する。第１の体積の第１の液体培地が取り出される比率（体積／単位時間）、および第２の体積の第２の液体培地が添加される比率（体積／単位時間）は、ほぼ同じであるか、または異なる。

あるいは、取り出され、添加された体積は、それぞれ２４時間の期間に渡り、徐々に増大させることにより、変化する。例えば、それぞれ２４時間の期間内に、取り出された第１の液体培地の体積、および添加された第２の液体培地の体積は、培養期間に渡り、増大される。体積は、培養期間に渡り、バイオリアクター体積の０．５％〜約２０％である体積から増大される。体積は、培養期間に渡り、バイオリアクター収容能力、または培養期間の開始時の細胞培養物の体積の約２５％〜約１５０％まで増大される。

本明細書において記載される方法のいくつかの例において、培養期間の最初の４８〜９６時間後、それぞれ２４時間の期間（培養期間内）において、取り出される第１の液体培地の第１の体積、および添加される第２の液体培地の第２の体積は、培養期間の開始時の細胞培養物の体積の約１０％〜約９５％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約８５％〜約９５％、約６０％〜約８０％、または約７０％である。

当業者は、第１の液体培地と第２の液体培地が、同じタイプの培地であり得ることを理解するだろう。他の場合に、第１の液体培地と第２の液体培地は異なり得る。第２の液体培地は、１種またはそれ以上の培地成分についてより濃縮されてもよい。

第１の体積の第１の液体培地は、任意の自動化システムを使用することにより、取り出され得る。例えば、交互接線流濾過が使用される。あるいは、第１の体積の第１の液体培地が、哺乳類細胞を除外する、分子量カットオフを有する滅菌したメンブレンを介して第１の体積の第１の液体培地を滲み出させることにより、またはその重力流出により、取り出される。あるいは、第１の体積の第１の液体培地は、少なくとも１分、少なくとも２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４０分、５０分、もしくは１時間の期間、撹拌を停止するか、または撹拌の速度を有意に低減し、バイオリアクターの上部から第１の体積の第１の液体培地を取り出すか、または吸引することにより、取り出される。

第２の体積の第２の液体培地は、ポンプにより第１の液体培地に添加される。第２の液体培地は、例えば、第２の体積の第２の液体培地を、第１の液体培地に直接ピペッティングするか、もしくは注入することにより、第１の液体培地に手動で、または自動化様式で添加される。

本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、（場合により、第１の液体培地に配置された哺乳類細胞を含有する容器を用意すること、および）容器を撹拌しながら、少なくとも約７日の培養期間、温度約３２℃〜約４０℃でインキュベートすること；ならびに培養期間の最初の４８〜９６時間後、連続的または定期的に、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加することを含み、第１と第２の体積はほぼ等しい。いくつかの実施形態において、培養期間の最初の４８〜９６時間後、それぞれ２４時間の期間において、取り出される第１の液体培地の第１の体積、および添加される第２の液体培地の第２の体積は、第１の液体培地の体積、または容器の体積の約０．３×〜約１０×である。

灌流培養のいくつかの例は、第１の液体培地を含有する培養系を撹拌しながら、少なくとも約７日の培養期間、温度約３２℃〜約４０℃でインキュベートすること；および培養期間の最初の４８〜９６時間後、連続的または定期的に、第１の体積の第１の液体培地を取り出し、第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加することを含む。

流加培養
本明細書において記載される方法における培養工程は、流加培養（fed-batch culturing）を含む。当該技術分野において公知である通り、流加培養は、細胞培養物から第１の液体培地を実質的にまたは著しく取り出すことなく、フィード液体培地を開始細胞培養物に増加的または連続的に添加することを含む。いくつかの場合に、フィード液体培地は、第１の液体培地と同じである。フィード培地（feed medium）は、液体形態（フィード液体培地）、または乾燥粉末のいずれかである。他の場合に、フィード液体培地は、第１の液体培地の濃縮された形態であるか、および／または乾燥粉末として添加される。

フィード液体培地は、培養期間中に、特定の時点で、または複数の時点で開始細胞培養物に添加される。例えば、フィード液体培地は、培養期間の開始後、６時間〜７日、約６時間〜約６日、約６時間〜約５日、約６時間〜約４日、約６時間〜約３日、約６時間〜約２日、約６時間〜約１日、約１２時間〜約７日、約１２時間〜約６日、約１２時間〜約５日、約１２時間〜約４日、約１２時間〜約３日、約１２時間〜約２日、約１日〜約７日、約１日〜約６日、約１日〜約５日、約１日〜約４日、約１日〜約３日、約１日〜約２日、約２日〜約７日、約２日〜約６日、約２日〜約５日、約２日〜約４日、約２日〜約３日、約３日〜約７日、約３日〜約６日、約３日〜約５日、約３日〜約４日、約４日〜約７日、約４日〜約６日、約４日〜約５日、約５日〜約７日、または約５日〜約６日である時点で、開始細胞培養物に添加される。

フィード液体培地は、開始細胞培養物に連続的に添加されるか、または培養期間中に開始細胞培養物に定期的に（例えば、毎日）添加される。フィード液体培地が、開始細胞培養物に定期的に添加される、いくつかの例では、フィード液体培地は、１回、２回、３回、４回、または５回添加される。開始細胞培養物に添加される、フィード液体培地の体積、またはフィード固体培地（feed solid medium）の量は、培養期間中に変化する（例えば、増大する）。培養期間中に任意の２４時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、バイオリアクターの収容能力のある分画である。培養期間中に任意の２４時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、培養物を含有するバイオリアクターの収容能力の０．０１×〜約０．３×（例えば、約０．０１×〜約０．２８×、約０．０１×〜約０．２６×、約０．０１×〜約０．２４×、約０．０１×〜約０．２２×、約０．０１×〜約０．２０×、約０．０１×〜約０．１８×、約０．０１×〜約０．１６×、約０．０１×〜約０．１４×、約０．０１×〜約０．１２×、約０．０１×〜約０．１０×、約０．０１×〜約０．０８×、約０．０１×〜約０．０６×、約０．０１×〜約０．０４×、約０．０２５×〜約０．３×、約０．０２５×〜約０．２８×、約０．０２５×〜約０．２６×、約０．０２５×〜約０．２４×、約０．０２５×〜約０．２２×、約０．０２５×〜約０．２０×、約０．０２５×〜約０．１８×、約０．０２５×〜約０．１６×、約０．０２５×〜約０．１４×、約０．０２５×〜約０．１２×、約０．０２５×〜約０．１０×、約０．０２５×〜約０．０８×、約０．０２５×〜約０．０６×、約０．０２５×〜約０．０４×、約０．０５×〜約０．３×、約０．０５×〜約０．２８×、約０．０５×〜約０．２６×、約０．０５×〜約０．２４×、約０．０５×〜約０．２２×、約０．０５×〜約０．２０×、約０．０５×〜約０．１８×、約０．０５×〜約０．１６×、約０．０５×〜約０．１４×、約０．０５×〜約０．１２×、約０．０５×〜約０．１０×、約０．１×〜約０．３×、約０．１×〜約０．２８×、約０．１×〜約０．２６×、約０．１×〜約０．２４×、約０．１×〜約０．２２×、約０．１×〜約０．２０×、約０．１×〜約０．１８×、約０．１×〜約０．１６Ｘ約０．１×〜約０．１４×、約０．１×、約０．１５×〜約０．３×、約０．１５×〜約０．２×、約０．２×〜約０．３×、または約０．２５×〜約０．３×）である。

他の実施形態において、培養期間において任意の２４時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、培養期間の開始時の細胞培養物の体積の０．０２×〜約１．０×（例えば、約０．０２×〜約０．９×、約０．０２×〜約０．８×、約０．０２×〜約０．７×、約０．０２×〜約０．６×、約０．０２×〜約０．５×、約０．０２×〜約０．４×、約０．０２×〜約０．３×、約０．０２×〜約０．２×、約０．０２×〜約０．１×、約０．０５×〜約１．０×、約０．０５×〜約０．８×、約０．０５×〜約０．７×、約０．０５×〜約０．６×、約０．０５×〜約０．５×、約０．０５×〜約０．４×、約０．０５×〜約０．３×、約０．０５×〜約０．２×、約０．０５×〜約０．１×、約０．１×〜約１．０×、約０．１×〜約０．９×、約０．１×〜約０．８×、約０．１×〜約０．７×、約０．１×〜約０．６×、約０．１×〜約０．５×、約０．１×〜約０．４×、約０．１×〜約０．３×、約０．１×〜約０．２×、約０．２×〜約１．０×、約０．２×〜約０．９×、約０．２×〜約０．８×、約０．２×〜約０．７×、約０．２×〜約０．６×、約０．２×〜約０．５×、または約０．２×〜約０．４×）である。

ポロクサマー−１８８
ポロクサマー−１８８は、当該技術分野において公知の分子である。ポロクサマー−１８８は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの非イオン性合成ブロック共重合体である。ポロクサマー−１８８は、約７６８０〜約９５１０の平均子量を有し、その組成の約８１．８重量％±１．９重量％は、オキシエチレンにより表される。例えば、ポロクサマー−１８８は、以下の式Ｉ（式中、ａは８０であり、ｂは２７である）において示される構造を有する。ポロクサマー−１８８は、９００３−１１−６のＣＡＳ番号を有する。

ポロクサマー−１８８は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＭＡＳＴ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ−６８ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）を含む、多数の異なる供給元から商業的に入手可能である。

本明細書において提供される方法は、約１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、約１．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１．９ｇ／Ｌより高い濃度、約２．０ｇ／Ｌの濃度もしくは２．０ｇ／Ｌより高い濃度、約２．１ｇ／Ｌの濃度もしくは２．１ｇ／Ｌより高い濃度、約２．２ｇ／Ｌの濃度もしくは２．２ｇ／Ｌより高い濃度、約２．３ｇ／Ｌの濃度もしくは２．３ｇ／Ｌより高い濃度、約２．４ｇ／Ｌの濃度もしくは２．４ｇ／Ｌより高い濃度、約２．５ｇ／Ｌの濃度もしくは２．５ｇ／Ｌより高い濃度、約２．６ｇ／Ｌの濃度もしくは２．６ｇ／Ｌより高い濃度、約２．７ｇ／Ｌの濃度もしくは２．７ｇ／Ｌより高い濃度、約２．８ｇ／Ｌの濃度もしくは２．８ｇ／Ｌより高い濃度、約２．９ｇ／Ｌの濃度もしくは２．９ｇ／Ｌより高い濃度、約３．０ｇ／Ｌの濃度もしくは３．０ｇ／Ｌより高い濃度、約３．１ｇ／Ｌの濃度もしくは３．１ｇ／Ｌより高い濃度、約３．２ｇ／Ｌの濃度もしくは３．２ｇ／Ｌより高い濃度、約３．３ｇ／Ｌの濃度もしくは３．３ｇ／Ｌより高い濃度、約３．４ｇ／Ｌの濃度もしくは３．４ｇ／Ｌより高い濃度、約３．５ｇ／Ｌの濃度もしくは３．５ｇ／Ｌより高い濃度、約３．６ｇ／Ｌの濃度もしくは３．６ｇ／Ｌより高い濃度、約３．７ｇ／Ｌの濃度もしくは３．７ｇ／Ｌより高い濃度、約３．８ｇ／Ｌの濃度もしくは３．８ｇ／Ｌより高い濃度、約３．９ｇ／Ｌの濃度もしくは３．９ｇ／Ｌより高い濃度、約４．０ｇ／Ｌの濃度もしくは４．０ｇ／Ｌより高い濃度、約４．１ｇ／Ｌの濃度もしくは４．１ｇ／Ｌより高い濃度、約４．２ｇ／Ｌの濃度もしくは４．２ｇ／Ｌより高い濃度、約４．３ｇ／Ｌの濃度もしくは４．３ｇ／Ｌより高い濃度、約４．４ｇ／Ｌの濃度もしくは４．４ｇ／Ｌより高い濃度、約４．５ｇ／Ｌの濃度もしくは４．５ｇ／Ｌより高い濃度、約４．６ｇ／Ｌの濃度もしくは４．６ｇ／Ｌより高い濃度、約４．７ｇ／Ｌの濃度もしくは４．７ｇ／Ｌより高い濃度、約４．８ｇ／Ｌの濃度もしくは４．８ｇ／Ｌより高い濃度、約４．９ｇ／Ｌの濃度もしくは４．９ｇ／Ｌより高い濃度、約５．０ｇ／Ｌの濃度もしくは５．０ｇ／Ｌより高い濃度、約５．１ｇ／Ｌの濃度もしくは５．１ｇ／Ｌより高い濃度、約５．２ｇ／Ｌの濃度もしくは５．２ｇ／Ｌより高い濃度、約５．３ｇ／Ｌの濃度もしくは５．３ｇ／Ｌより高い濃度、約５．４ｇ／Ｌの濃度もしくは５．４ｇ／Ｌより高い濃度、約５．５ｇ／Ｌの濃度もしくは５．５ｇ／Ｌより高い濃度、約５．６ｇ／Ｌの濃度もしくは５．６ｇ／Ｌより高い濃度、約５．７ｇ／Ｌの濃度もしくは５．７ｇ／Ｌより高い濃度、約５．８ｇ／Ｌの濃度もしくは５．８ｇ／Ｌより高い濃度、約５．９ｇ／Ｌの濃度もしくは５．９ｇ／Ｌより高い濃度、約６．０ｇ／Ｌの濃度もしくは６．０ｇ／Ｌより高い濃度、約６．１ｇ／Ｌの濃度もしくは６．１ｇ／Ｌより高い濃度、約６．２ｇ／Ｌの濃度もしくは６．２ｇ／Ｌより高い濃度、約６．３ｇ／Ｌの濃度もしくは６．３ｇ／Ｌより高い濃度、約６．４ｇ／Ｌの濃度もしくは６．４ｇ／Ｌより高い濃度、約６．５ｇ／Ｌの濃度もしくは６．５ｇ／Ｌより高い濃度、約６．６ｇ／Ｌの濃度もしくは６．６ｇ／Ｌより高い濃度、約６．７ｇ／Ｌの濃度もしくは６．７ｇ／Ｌより高い濃度、約６．８ｇ／Ｌの濃度もしくは６．８ｇ／Ｌより高い濃度、約６．９ｇ／Ｌの濃度もしくは６．９ｇ／Ｌより高い濃度、約７．０ｇ／Ｌの濃度もしくは７．０ｇ／Ｌより高い濃度、約７．１ｇ／Ｌの濃度もしくは７．１ｇ／Ｌより高い濃度、約７．２ｇ／Ｌの濃度もしくは７．２ｇ／Ｌより高い濃度、約７．３ｇ／Ｌの濃度もしくは７．３ｇ／Ｌより高い濃度、約７．４ｇ／Ｌの濃度もしくは７．４ｇ／Ｌより高い濃度、約７．５ｇ／Ｌの濃度もしくは７．５ｇ／Ｌより高い濃度、約７．６ｇ／Ｌの濃度もしくは７．６ｇ／Ｌより高い濃度、約７．７ｇ／Ｌの濃度もしくは７．７ｇ／Ｌより高い濃度、約７．８ｇ／Ｌの濃度もしくは７．８ｇ／Ｌより高い濃度、約７．９ｇ／Ｌの濃度もしくは７．９ｇ／Ｌより高い濃度、約８．０ｇ／Ｌの濃度もしくは８．０ｇ／Ｌより高い濃度、約８．１ｇ／Ｌの濃度もしくは８．１ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌの濃度もしくは８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．３ｇ／Ｌの濃度もしくは８．３ｇ／Ｌより高い濃度、約８．４ｇ／Ｌの濃度もしくは８．４ｇ／Ｌより高い濃度、約８．５ｇ／Ｌの濃度もしくは８．５ｇ／Ｌより高い濃度、約８．６ｇ／Ｌの濃度もしくは８．６ｇ／Ｌより高い濃度、約８．７ｇ／Ｌの濃度もしくは８．７ｇ／Ｌより高い濃度、約８．８ｇ／Ｌの濃度もしくは８．８ｇ／Ｌより高い濃度、約８．９ｇ／Ｌの濃度もしくは８．９ｇ／Ｌより高い濃度、約９．０ｇ／Ｌの濃度もしくは９．０ｇ／Ｌより高い濃度、約９．１ｇ／Ｌの濃度もしくは９．１ｇ／Ｌより高い濃度、約９．２ｇ／Ｌの濃度もしくは９．２ｇ／Ｌより高い濃度、約９．３ｇ／Ｌの濃度もしくは９．３ｇ／Ｌより高い濃度、約９．４ｇ／Ｌの濃度もしくは９．４ｇ／Ｌより高い濃度、約９．５ｇ／Ｌの濃度もしくは９．５ｇ／Ｌより高い濃度、約９．６ｇ／Ｌの濃度もしくは９．６ｇ／Ｌより高い濃度、約９．７ｇ／Ｌの濃度もしくは９．７ｇ／Ｌより高い濃度、約９．８ｇ／Ｌの濃度もしくは９．８ｇ／Ｌより高い濃度、約９．９ｇ／Ｌの濃度もしくは９．９ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．０ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．１ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．１ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．２ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．２ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．３ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．３ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．４ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．４ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．５ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．５ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．６ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．６ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．７ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．７ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．８ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．８ｇ／Ｌより高い濃度、約１０．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．９ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．０ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．１ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．１ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．２ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．２ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．３ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．３ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．４ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．４ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．５ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．５ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．６ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．６ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．７ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．７ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．８ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．８ｇ／Ｌより高い濃度、約１１．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１１．９ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．０ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．１ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．１ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．２ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．２ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．３ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．３ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．４ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．４ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．５ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．５ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．６ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．６ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．７ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．７ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．８ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．８ｇ／Ｌより高い濃度、約１２．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１２．９ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．０ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．１ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．１ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．２ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．２ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．３ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．３ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．４ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．４ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．５ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．５ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．６ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．６ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．７ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．７ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．８ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．８ｇ／Ｌより高い濃度、約１３．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１３．９ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．０ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．１ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．１ｇ／Ｌより高い濃度、約１４，２ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．２ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．３ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．３ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．４ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．４ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．５ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．５ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．６ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．６ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．７ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．７ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．８ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．８ｇ／Ｌより高い濃度、約１４．９ｇ／Ｌの濃度もしくは１４．９ｇ／Ｌより高い濃度、または約１５．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１５．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を含む液体培地において、哺乳類細胞（例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞）を培養することを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、約１．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ（例えば、約１．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ．約２．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ．約２．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、
約２．６ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、
約３．６ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、
約４．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．１ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約６．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約６．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約５．８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約５．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約６．９ｇ／Ｌ、約５．８ｇ／Ｌ〜約６．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、
約６．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約６．２ｇ／Ｌ〜約７．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約６．４ｇ／Ｌ〜約７．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約６．６ｇ／Ｌ〜約７．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約６．８ｇ／Ｌ〜約７．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約７．２ｇ／Ｌ〜約８．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約７．４ｇ／Ｌ〜約８．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約７．６ｇ／Ｌ〜約８．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、
約７．８ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約７．８ｇ／Ｌ〜約８．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１５．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１５．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１５．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１５．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１４．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１４．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１４．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１４．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１３．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１３．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１３．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１３．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１２．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１２．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１２．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１２．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１１．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１１．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１１．４ｇ／Ｌ、
約８．０ｇ／Ｌ〜約１１．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１０．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１０．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１０．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１０．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．８ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．６ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．４ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．２ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１１．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１０．５ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ〜約９．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１１．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１０．５ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１１．５ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ〜約１０．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１１．５ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ〜約１１．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１１．５ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌ、約１３．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１３．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１３．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１３．５ｇ／Ｌ〜約１４．５ｇ／Ｌ、約１４．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１４．０ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、約１４．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１４．５ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ、約１４．５ｇ／Ｌ〜約１５．５ｇ／Ｌ、または約１５．０ｇ／Ｌ〜約１６．０ｇ／Ｌ）の濃度のポロクサマー−１８８を含む液体培地において、哺乳類細胞（例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞）を培養することを含む。

いくつかの実施形態において、ポロクサマー−１８８は、培地に存在する、および／または培養工程の前に添加される、および／または培養工程中に培地に添加される。例えば、本明細書において提供される方法は、培養工程の前におよび／または培養工程中にポロクサマー−１８８を添加して、培地中１．８ｇ／Ｌまたはそれ以上の濃度（例えば、ポロクサマー−１８８の代表的な濃度のいずれか、または本明細書において記載されるポロクサマー−１８８の範囲）にすることをさらに含む。いくつかの例では、ポロクサマー−１８８を１．８ｇ／Ｌまたはそれ以上の濃度（例えば、ポロクサマー−１８８の代表的な濃度のいずれか、または本明細書において記載されるポロクサマー−１８８の範囲）にするために、あるポロクサマー−１８８を含む液体培地に追加のポロクサマー−１８８が添加される。例えば、ポロクサマー−１８８は、培養工程の前におよび／または培養工程中に、第１の液体培地、第２の液体培地、および／またはフィード液体培地に添加される。

いくつかの例では、ポロクサマー−１８８は、培養工程中に１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアリコートで培地に添加される。ポロクサマー−１８８は、連続的方法で培地に添加される。いくつかの例では、第１の液体培地は、ポロクサマー−１８８を含有し、追加のポロクサマー−１８８が、培養期間中に培地に添加される。いくつかの実施形態において、ポロクサマー−１８８は、培地に存在する。

培養工程が灌流培養を含むとき、第２の液体培地は、第１の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー−１８８を含む。例えば、第１の液体培地は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌ以下の濃度のポロクサマー−１８８を含み、第２の液体培地は、１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８（例えば、本明細書において記載されるポロクサマー−１８８の濃度または範囲のいずれか、例えば、１．９ｇ／Ｌより高い濃度、２．０ｇ／Ｌより高い濃度、２．１ｇ／Ｌより高い濃度、２．２ｇ／Ｌより高い濃度、２．３ｇ／Ｌより高い濃度、２．４ｇ／Ｌより高い濃度、２．５ｇ／Ｌより高い濃度、２．６ｇ／Ｌより高い濃度、２．７ｇ／Ｌより高い濃度、２．８ｇ／Ｌより高い濃度、２．９ｇ／Ｌより高い濃度、３．０ｇ／Ｌより高い濃度、３．１ｇ／Ｌより高い濃度、３．２ｇ／Ｌより高い濃度、３．３ｇ／Ｌより高い濃度、３．４ｇ／Ｌより高い濃度、３．５ｇ／Ｌより高い濃度、３．６ｇ／Ｌより高い濃度、３．７ｇ／Ｌより高い濃度、３．８ｇ／Ｌより高い濃度、３．９ｇ／Ｌより高い濃度、４．０ｇ／Ｌより高い濃度、４．１ｇ／Ｌより高い濃度、４．２ｇ／Ｌより高い濃度、４．３ｇ／Ｌより高い濃度、４．４ｇ／Ｌより高い濃度、４．５ｇ／Ｌより高い濃度、４．６ｇ／Ｌより高い濃度、４．７ｇ／Ｌより高い濃度、４．８ｇ／Ｌより高い濃度、４．９ｇ／Ｌより高い濃度、５．０ｇ／Ｌより高い濃度、５．１ｇ／Ｌより高い濃度、５．２ｇ／Ｌより高い濃度、５．３ｇ／Ｌより高い濃度、５．４ｇ／Ｌより高い濃度、５．５ｇ／Ｌより高い濃度、５．６ｇ／Ｌより高い濃度、５．７ｇ／Ｌより高い濃度、５．８ｇ／Ｌより高い濃度、５．９ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．１ｇ／Ｌより高い濃度、６．２ｇ／Ｌより高い濃度、６．３ｇ／Ｌより高い濃度、６．４ｇ／Ｌより高い濃度、６．５ｇ／Ｌより高い濃度、６．６ｇ／Ｌより高い濃度、６．７ｇ／Ｌより高い濃度、６．８ｇ／Ｌより高い濃度、６．９ｇ／Ｌより高い濃度、７．０ｇ／Ｌより高い濃度、７．１ｇ／Ｌより高い濃度、７．２ｇ／Ｌより高い濃度、７．３ｇ／Ｌより高い濃度、７．４ｇ／Ｌより高い濃度、７．５ｇ／Ｌより高い濃度、７．６ｇ／Ｌより高い濃度、７．７ｇ／Ｌより高い濃度、７．８ｇ／Ｌより高い濃度、７．９ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．１ｇ／Ｌより高い濃度、８．２ｇ／Ｌより高い濃度、８．３ｇ／Ｌより高い濃度、８．４ｇ／Ｌより高い濃度、８．５ｇ／Ｌより高い濃度、８．６ｇ／Ｌより高い濃度、８．７ｇ／Ｌより高い濃度、８．８ｇ／Ｌより高い濃度、８．９ｇ／Ｌより高い濃度、９．０ｇ／Ｌより高い濃度、９．１ｇ／Ｌより高い濃度、９．２ｇ／Ｌより高い濃度、９．３ｇ／Ｌより高い濃度、９．４ｇ／Ｌより高い濃度、９．５ｇ／Ｌより高い濃度、９．６ｇ／Ｌより高い濃度、９．７ｇ／Ｌより高い濃度、９．８ｇ／Ｌより高い濃度、９．９ｇ／Ｌより高い濃度、１０．０ｇ／Ｌより高い濃度、１０．１ｇ／Ｌより高い濃度、１０．２ｇ／Ｌより高い濃度、１０．３ｇ／Ｌより高い濃度、１０．４ｇ／Ｌより高い濃度、１０．５ｇ／Ｌより高い濃度、１０．６ｇ／Ｌより高い濃度、１０．７ｇ／Ｌより高い濃度、１０．８ｇ／Ｌより高い濃度、１０．９ｇ／Ｌより高い濃度、１１．０ｇ／Ｌより高い濃度、１１．１ｇ／Ｌより高い濃度、１１．２ｇ／Ｌより高い濃度、１１．３ｇ／Ｌより高い濃度、１１．４ｇ／Ｌより高い濃度、１１．５ｇ／Ｌより高い濃度、１１．６ｇ／Ｌより高い濃度、１１．７ｇ／Ｌより高い濃度、１１．８ｇ／Ｌより高い濃度、１１．９ｇ／Ｌより高い濃度、１２．０ｇ／Ｌより高い濃度、１２．１ｇ／Ｌより高い濃度、１２．２ｇ／Ｌより高い濃度、１２．３ｇ／Ｌより高い濃度、１２．４ｇ／Ｌより高い濃度、１２．５ｇ／Ｌより高い濃度、１２．６ｇ／Ｌより高い濃度、１２．７ｇ／Ｌより高い濃度、１２．８ｇ／Ｌより高い濃度、１２．９ｇ／Ｌより高い濃度、１３．０ｇ／Ｌより高い濃度、１３．１ｇ／Ｌより高い濃度、１３．２ｇ／Ｌより高い濃度、１３．３ｇ／Ｌより高い濃度、１３．４ｇ／Ｌより高い濃度、１３．５ｇ／Ｌより高い濃度、１３．６ｇ／Ｌより高い濃度、１３．７ｇ／Ｌより高い濃度、１３．８ｇ／Ｌより高い濃度、１３．９ｇ／Ｌより高い濃度、１４．０ｇ／Ｌより高い濃度、１４．１ｇ／Ｌより高い濃度、１４．２ｇ／Ｌより高い濃度、１４．３ｇ／Ｌより高い濃度、１４．４ｇ／Ｌより高い濃度、１４．５ｇ／Ｌより高い濃度、１４．６ｇ／Ｌより高い濃度、１４．７ｇ／Ｌより高い濃度、１４．８ｇ／Ｌより高い濃度、１４．９ｇ／Ｌより高い濃度、１５．０ｇ／Ｌより高い濃度、１５．１ｇ／Ｌより高い濃度、１５．２ｇ／Ｌより高い濃度、１５．３ｇ／Ｌより高い濃度、１５．４ｇ／Ｌより高い濃度、１５．５ｇ／Ｌより高い濃度、１５．６ｇ／Ｌより高い濃度、１５．７ｇ／Ｌより高い濃度、１５．８ｇ／Ｌより高い濃度、１５．９より高い濃度、または１６．０ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８）を含む。

培養工程がフィードバッチ培養を含むとき、フィード液体培地は、第１の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー−１８８を含む。例えば、第１の液体培地は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌ未満の濃度のポロクサマー−１８８を含み、フィード液体培地は、１．８ｇ／Ｌより高い濃度の（例えば、２．０ｇ／Ｌより高い濃度、２．５ｇ／Ｌより高い濃度、３．０ｇ／Ｌより高い濃度、３．５ｇ／Ｌより高い濃度、４．０ｇ／Ｌより高い濃度、４．５ｇ／Ｌより高い濃度、５．０ｇ／Ｌより高い濃度、５．５ｇ／Ｌより高い濃度、６．０ｇ／Ｌより高い濃度、６．５ｇ／Ｌより高い濃度、７．０ｇ／Ｌより高い濃度、７．５ｇ／Ｌより高い濃度、８．０ｇ／Ｌより高い濃度、８．５ｇ／Ｌより高い濃度、９．０ｇ／Ｌより高い濃度、９．５ｇ／Ｌより高い濃度、１０ｇ／Ｌより高い濃度、１０．５ｇ／Ｌより高い濃度、１１．０ｇ／Ｌより高い濃度、１１．５ｇ／Ｌより高い濃度、１２．０ｇ／Ｌより高い濃度、１２．５ｇ／Ｌより高い濃度、１３．０ｇ／Ｌより高い濃度、１３．５ｇ／Ｌより高い濃度、１４．０ｇ／Ｌより高い濃度、１４．５ｇ／Ｌより高い濃度、１５．０ｇ／Ｌより高い濃度、１５．５ｇ／Ｌより高い濃度、１６．０ｇ／Ｌより高い濃度、１６．５ｇ／Ｌより高い濃度、１７．０ｇ／Ｌより高い濃度、１７．５ｇ／Ｌより高い濃度、１８．０ｇ／Ｌより高い濃度、１８．５ｇ／Ｌより高い濃度、１９．０ｇ／Ｌより高い濃度、１９．５ｇ／Ｌより高い濃度、２０．０ｇ／Ｌより高い濃度、２０．５ｇ／Ｌより高い濃度、２１．０ｇ／Ｌより高い濃度、２１．５ｇ／Ｌより高い濃度、２２．０ｇ／Ｌより高い濃度、２２．５ｇ／Ｌより高い濃度、２３．０ｇ／Ｌより高い濃度、２３．５ｇ／Ｌより高い濃度、２４．０ｇ／Ｌより高い濃度、２４．５ｇ／Ｌより高い濃度、２５．０ｇ／Ｌより高い濃度、２５．５ｇ／Ｌより高い濃度、２６．０ｇ／Ｌより高い濃度、２６．５ｇ／Ｌより高い濃度、２７．０ｇ／Ｌより高い濃度、２８．０ｇ／Ｌより高い濃度、２８．５ｇ／Ｌより高い濃度、２９．０ｇ／Ｌより高い濃度、２９．５ｇ／Ｌより高い濃度、３０．０ｇ／Ｌより高い濃度、３０．５ｇ／Ｌより高い濃度、３１．０ｇ／Ｌより高い濃度、３１．５ｇ／Ｌより高い濃度、３２．０ｇ／Ｌより高い濃度、３２．５ｇ／Ｌより高い濃度、３３．０ｇ／Ｌより高い濃度、３３．５ｇ／Ｌより高い濃度、３４．０ｇ／Ｌより高い濃度、３４．５ｇ／Ｌより高い濃度、３５．０ｇ／Ｌより高い濃度、３５．５ｇ／Ｌより高い濃度、３６．０ｇ／Ｌより高い濃度、３６．５ｇ／Ｌより高い濃度、３７．０ｇ／Ｌより高い濃度、３７．５ｇ／Ｌより高い濃度、３８．０ｇ／Ｌより高い濃度、３８．５ｇ／Ｌより高い濃度、３９．０ｇ／Ｌより高い濃度、３９．５ｇ／Ｌより高い濃度、または４０．０ｇ／Ｌより高い濃度）ポロクサマー−１８８を含む。

本明細書において提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養物中のポロクサマー−１８８濃度を経時的に増大させることを含む。いくつかの実施形態において、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される１つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−１８８濃度を含む。これらの方法において、培地中の選択されたポロクサマー−１８８濃度は、培養工程の前にポロクサマー−１８８を培地に添加することにより、および／または培養工程中にポロクサマー−１８８を培地に添加することにより達成される。選択されたポロクサマー−１８８濃度は、本明細書において記載されるポロクサマー−１８８の代表的な濃度または範囲のいずれかである。

１つまたはそれ以上の因子に基づくポロクサマー−１８８の濃度の選択
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される１つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−１８８濃度を含む液体培地において、哺乳類細胞を培養することを含む。

孔タイプの異なる例は、当該技術分野において公知である。孔タイプの非限定的な例は、焼結孔、およびドリル孔である。

細胞培養に適当な様々なガス流速は、当該技術分野において公知である。一般に、ガス流速が速いほど、（より低いガス流速を使用した培養工程と比較して）高いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示し、ガス流速遅いほど、（より高いガス流速を使用した培養工程と比較して）低いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示す。

様々な非限定的な生細胞密度が、本明細書において記載される。一般に、生細胞密度が高いほど、（より低い生細胞密度を含有する培地と比較して）高いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示し、生細胞密度が低いほど、（より高い生細胞密度を含有する培地と比較して）低いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示す。

生理学的ストレス下で細胞により放出される、細胞ストレスの代表的なマーカーは、タンパク質分解酵素（例えば、活性化カスパーゼ）、乳酸脱水素酵素、ゲノムＤＮＡ（例えば、ヌクレオソームＤＮＡ）、チトクロムｃ、および活性化ＰＡＲＰを含む。生理学的ストレス下で細胞において産生されるか、または上昇したレベルを有する、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、活性化カスパーゼ、チトクロムｃ、活性化ＰＡＲＰ、および外在化ホスファチジルセリンを含む。対照値と比較して、細胞ストレスのこれらのマーカーのいずれかの１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）の上昇したレベルは、より高いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示す。対照値と同じであるか、もしくはそれ未満である、対照値と比較して、細胞ストレスの１つまたはそれ以上のマーカーのレベルは、より低いポロクサマー−１８８濃度が選択されるべきであることを示す。本明細書において記載される例のいずれかにおいて、対照レベルは、アポトーシスを経験しないか、またはネクローシスを引き起こすであろう条件下で培養されない対照細胞におけるレベルである。細胞ストレスの１つまたはそれ以上のマーカーのレベルの検出方法は、当該技術分野において周知である。商業的に入手可能なキットは、細胞ストレスの１つまたはそれ以上のマーカーを測定するために入手可能である。

本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、選択されるポロクサマー−１８８濃度は、培養工程の前にポロクサマー−１８８を培地に添加することにより、および／または培養工程中にポロクサマー−１８８を培地に添加することにより達成される。いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約７５０μｍ〜約１．５ｍｍ（例えば、約７５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．４０ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．３０ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．２０ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．１０ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約７５０μｍ〜約１．００ｍｍ、約７５０μｍ〜約９５０μｍ、約７５０μｍ〜約９００μｍ、約７５０μｍ〜約８５０μｍ、約７５０μｍ〜約８００μｍ、約８００μｍ〜約１．５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．４５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．４０ｍｍ、約８００μｍ〜約１．３５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．３０ｍｍ、約８００μｍ〜約１．２５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．２０ｍｍ、約８００μｍ〜約１．１５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．１０ｍｍ、約８００μｍ〜約１．０５ｍｍ、約８００μｍ〜約１．００ｍｍ、約８００μｍ〜約９５０μｍ、約８００μｍ〜約９００μｍ、約８００μｍ〜約８５０μｍ、約８５０μｍ〜約１．５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．４０ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．３０ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．２０ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．１０ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約８５０μｍ〜約１．００ｍｍ、約８５０μｍ〜約９５０μｍ、約８５０μｍ〜約９００μｍ、約９００μｍ〜約１．５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．４５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．４０ｍｍ、約９００μｍ〜約１．３５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．３０ｍｍ、約９００μｍ〜約１．２５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．２０ｍｍ、約９００μｍ〜約１．１５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．１０ｍｍ、約９００μｍ〜約１．０５ｍｍ、約９００μｍ〜約１．００ｍｍ、約９００μｍ〜約９５０μｍ、約９５０μｍ〜約１．５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．４５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．４０ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．３５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．３０ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．２５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．２０ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．１５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．１０ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．０５ｍｍ、約９５０μｍ〜約１．００ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．２０ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．１０ｍｍ、約１．０ｍｍ〜約１．０５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．２０ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．０５ｍｍ〜約１．１０ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．２０ｍｍ、約１．１０ｍｍ〜約１．１５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．１５ｍｍ〜約１．２０ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．２０ｍｍ〜約１．２５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．２５ｍｍ〜約１．３０ｍｍ、約１．３０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．３０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．３０ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．３０ｍｍ〜約１．３５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、約１．３５ｍｍ〜約１．４０ｍｍ、約１．４０ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約１．４０ｍｍ〜約１．４５ｍｍ、または約１．４５ｍｍ〜約１．５０）である場合は、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ（例えば、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、または約３．１ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ）のポロクサマー−１８８濃度を選択することを含む。

いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約２５０μｍ〜約７５０μｍ（例えば、約２５０μｍ〜約７００μｍ、約２５０μｍ〜約６５０μｍ、約２５０μｍ〜約６００μｍ、約２５０μｍ〜約５５０μｍ、約２５０μｍ〜約５００μｍ、約２５０μｍ〜約４５０μｍ、約２５０μｍ〜約４００μｍ、約２５０μｍ〜約３５０μｍ、約２５０μｍ〜約３００μｍ、約３００μｍ〜約７５０μｍ、約３００μｍ〜約７００μｍ、約３００μｍ〜約６５０μｍ、約３００μｍ〜約６００μｍ、約３００μｍ〜約５５０μｍ、約３００μｍ〜約５００μｍ、約３００μｍ〜約４５０μｍ、約３００μｍ〜約４００μｍ、約３００μｍ〜約３５０μｍ、約３５０μｍ〜約７５０μｍ、約３５０μｍ〜約７００μｍ、約３５０μｍ〜約６５０μｍ、約３５０μｍ〜約６００μｍ、約３５０μｍ〜約５５０μｍ、約３５０μｍ〜約５００μｍ、約３５０μｍ〜約４５０μｍ、約３５０μｍ〜約４００μｍ、約４００μｍ〜約７５０μｍ、約４００μｍ〜約７００μｍ、約４００μｍ〜約６５０μｍ、約４００μｍ〜約６００μｍ、約４００μｍ〜約５５０μｍ、約４００μｍ〜約５００μｍ、約４００μｍ〜約４５０μｍ、約４５０μｍ〜約７５０μｍ、約４５０μｍ〜約７００μｍ、約４５０μｍ〜約６５０μｍ、約４５０μｍ〜約６００μｍ、約４５０μｍ〜約５５０μｍ、約４５０μｍ〜約５００μｍ、約５００μｍ〜約７５０μｍ、約５００μｍ〜約７００μｍ、約５００μｍ〜約６５０μｍ、約５００μｍ〜約６００μｍ、約５００μｍ〜約５５０μｍ、約５５０μｍ〜約７５０μｍ、約５５０μｍ〜約７００μｍ、約５５０μｍ〜約６５０μｍ、約５５０μｍ〜約６００μｍ、約６００μｍ〜約７５０μｍ、約６００μｍ〜約７００μｍ、約６００μｍ〜約６５０μｍ、約６５０μｍ〜約７５０μｍ、約６５０μｍ〜約７００μｍ、または約７００μｍ〜７５０μｍ）である場合は、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ（例えば、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、または約４．１ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ）のポロクサマー−１８８濃度を選択することを含む。

方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約１μｍ〜約２５０μｍ（例えば、約１μｍ〜約２００μｍ、約１μｍ〜約１５０μｍ、約１μｍ〜約１００μｍ、約１μｍ〜約５０μｍ、約１μｍ〜約２５μｍ、約１０μｍ〜約２５０μｍ、約１０μｍ〜約２００μｍ、約１０μｍ〜約１５０μｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約１０μｍ〜約５０μｍ、約１０μｍ〜約２５μｍ、約２５μｍ〜約２５０μｍ、約２５μｍ〜約２００μｍ、約２５μｍ〜約１５０μｍ、約２５μｍ〜約１００μｍ、約２５μｍ〜約５０μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、約１５０μｍ〜約２５０μｍ、約１５０μｍ〜約２００μｍ、または約２００μｍ〜約２５０μｍ）である場合は、例えば、約４．３ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、約４．４ｇ／Ｌより高い濃度、約４．５ｇ／Ｌより高い濃度、約４．６ｇ／Ｌより高い濃度、約４．７ｇ／Ｌより高い濃度、約４．８ｇ／Ｌより高い濃度、約４．９ｇ／Ｌより高い濃度、約５．０ｇ／Ｌより高い濃度、約５．１ｇ／Ｌより高い濃度、約５．２ｇ／Ｌより高い濃度、約５．３ｇ／Ｌより高い濃度、約５．４ｇ／Ｌより高い濃度、約５．５ｇ／Ｌより高い濃度、約５．６ｇ／Ｌより高い濃度、約５．７ｇ／Ｌより高い濃度、約５．８ｇ／Ｌより高い濃度、約５．９ｇ／Ｌより高い濃度、約６．０ｇ／Ｌより高い濃度、約６．１ｇ／Ｌより高い濃度、約６．２ｇ／Ｌより高い濃度、約６．３ｇ／Ｌより高い濃度、約６．４ｇ／Ｌより高い濃度、約６．５ｇ／Ｌより高い濃度、約６．６ｇ／Ｌより高い濃度、約６．７ｇ／Ｌより高い濃度、約６．８ｇ／Ｌより高い濃度、約６．９ｇ／Ｌより高い濃度、約７．０ｇ／Ｌより高い濃度、約７．１ｇ／Ｌより高い濃度、約７．２ｇ／Ｌより高い濃度、約７．３ｇ／Ｌより高い濃度、約７．４ｇ／Ｌより高い濃度、約７．５ｇ／Ｌより高い濃度、約７．６ｇ／Ｌより高い濃度、約７．７ｇ／Ｌより高い濃度、約７．８ｇ／Ｌより高い濃度、約７．９ｇ／Ｌより高い濃度、約８．０ｇ／Ｌより高い濃度、約８．１ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．３ｇ／Ｌより高い濃度、約８．４ｇ／Ｌより高い濃度、約８．５ｇ／Ｌより高い濃度、約８．６ｇ／Ｌより高い濃度、約８．７ｇ／Ｌより高い濃度、約８．８ｇ／Ｌより高い濃度、約８．９ｇ／Ｌより高い濃度、約９．０ｇ／Ｌより高い濃度、約９．１ｇ／Ｌより高い濃度、約９．２ｇ／Ｌより高い濃度、約９．３ｇ／Ｌより高い濃度、約９．４ｇ／Ｌより高い濃度、約９．５ｇ／Ｌより高い濃度、約９．６ｇ／Ｌより高い濃度、約９．７ｇ／Ｌより高い濃度、約９．８ｇ／Ｌより高い濃度、約９．９ｇ／Ｌより高い濃度、または約１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

いくつかの例では、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約１６０μｍ〜約１９０μｍ（例えば、約１６０μｍ〜約１８５μｍ、約１６０μｍ〜約１８０μｍ、約１６０μｍ〜約１７５μｍ、約１６０μｍ〜約１７０μｍ、約１６０μｍ〜約１６５μｍ、約１６５μｍ〜約１９０μｍ、約１６５μｍ〜約１８５μｍ、約１６５μｍ〜約１８０μｍ、約１６５μｍ〜約１７５μｍ、約１６５μｍ〜約１７０μｍ、約１７０μｍ〜約１９０μｍ、約１７０μｍ〜約１８５μｍ、約１７０μｍ〜約１８０μｍ、約１７０μｍ〜約１７５μｍ、約１７５μｍ〜約１９０μｍ、約１７５μｍ〜約１８５μｍ、約１７５μｍ〜約１８０μｍ、約１８０μｍ〜約１９０μｍ、約１８０μｍ〜約１８５μｍ、または約１８５μｍ〜約１９０μｍ）である場合は、４．３ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、約４．４ｇ／Ｌより高い濃度、約４．５ｇ／Ｌより高い濃度、約４．６ｇ／Ｌより高い濃度、約４．７ｇ／Ｌより高い濃度、約４．８ｇ／Ｌより高い濃度、約４．９ｇ／Ｌより高い濃度、約５．０ｇ／Ｌより高い濃度、約５．１ｇ／Ｌより高い濃度、約５．２ｇ／Ｌより高い濃度、約５．３ｇ／Ｌより高い濃度、約５．４ｇ／Ｌより高い濃度、約５．５ｇ／Ｌより高い濃度、約５．６ｇ／Ｌより高い濃度、約５．７ｇ／Ｌより高い濃度、約５．８ｇ／Ｌより高い濃度、約５．９ｇ／Ｌより高い濃度、約６．０ｇ／Ｌより高い濃度、約６．１ｇ／Ｌより高い濃度、約６．２ｇ／Ｌより高い濃度、約６．３ｇ／Ｌより高い濃度、約６．４ｇ／Ｌより高い濃度、約６．５ｇ／Ｌより高い濃度、約６．６ｇ／Ｌより高い濃度、約６．７ｇ／Ｌより高い濃度、約６．８ｇ／Ｌより高い濃度、約６．９ｇ／Ｌより高い濃度、約７．０ｇ／Ｌより高い濃度、約７．１ｇ／Ｌより高い濃度、約７．２ｇ／Ｌより高い濃度、約７．３ｇ／Ｌより高い濃度、約７．４ｇ／Ｌより高い濃度、約７．５ｇ／Ｌより高い濃度、約７．６ｇ／Ｌより高い濃度、約７．７ｇ／Ｌより高い濃度、約７．８ｇ／Ｌより高い濃度、約７．９ｇ／Ｌより高い濃度、約８．０ｇ／Ｌより高い濃度、約８．１ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．３ｇ／Ｌより高い濃度、約８．４ｇ／Ｌより高い濃度、約８．５ｇ／Ｌより高い濃度、約８．６ｇ／Ｌより高い濃度、約８．７ｇ／Ｌより高い濃度、約８．８ｇ／Ｌより高い濃度、約８．９ｇ／Ｌより高い濃度、約９．０ｇ／Ｌより高い濃度、約９．１ｇ／Ｌより高い濃度、約９．２ｇ／Ｌより高い濃度、約９．３ｇ／Ｌより高い濃度、約９．４ｇ／Ｌより高い濃度、約９．５ｇ／Ｌより高い濃度、約９．６ｇ／Ｌより高い濃度、約９．７ｇ／Ｌより高い濃度、約９．８ｇ／Ｌより高い濃度、約９．９ｇ／Ｌより高い濃度、または約１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが１５０μｍより大きい（例えば、１５５μｍより大きい、１６０μｍより大きい、１６５μｍより大きい、１７０μｍより大きい、１７５μｍより大きい、約１８０μｍより大きい、１８５μｍより大きい、約１９０μｍより大きい、約１９５μｍより大きい、約２００μｍより大きい、約２０５μｍより大きい、約２１０μｍより大きい、約２１５μｍより大きい、約２２０μｍより大きい、約２２５μｍより大きい、約２３０μｍより大きい、約２３５μｍより大きい、約２４０μｍより大きい、約２４５μｍより大きい、約２５０μｍより大きい、約２５５μｍより大きい、約２６０μｍより大きい、約２６５μｍより大きい、約２７０μｍより大きい、約２７５μｍより大きい、約２８０μｍより大きい、約２９０μｍより大きい、約３００μｍより大きい、約３５０μｍより大きい、約４００μｍより大きい、約４５０μｍより大きい、または約５００μｍより大きい）場合は、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ（例えば、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．１ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．１ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約２．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約２．９ｇ／Ｌ〜約３．１ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、または約３．１ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ）の濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約８０μｍ〜約１５０μｍ（例えば、約８０μｍ〜約１４５μｍ、約８０μｍ〜約１４０μｍ、約８０μｍ〜約１３５μｍ、約８０μｍ〜約１３０μｍ、約８０μｍ〜約１２５μｍ、約８０μｍ〜約１２０μｍ、約８０μｍ〜約１１５μｍ、約８０μｍ〜約１１０μｍ、約８０μｍ〜約１０５μｍ、約８０μｍ〜約１００μｍ、約８０μｍ〜約９５μｍ、約８０μｍ〜約９０μｍ、約８０μｍ〜約８５μｍ、約８５μｍ〜約１５０μｍ、約８５μｍ〜約１４５μｍ、約８５μｍ〜約１４０μｍ、約８５μｍ〜約１３５μｍ、約８５μｍ〜約１３０μｍ、約８５μｍ〜約１２５μｍ、約８５μｍ〜約１２０μｍ、約８５μｍ〜約１１５μｍ、約８５μｍ〜約１１０μｍ、約８５μｍ〜約１０５μｍ、約８５μｍ〜約１００μｍ、約８５μｍ〜約９５μｍ、約８５μｍ〜約９０μｍ、約９０μｍ〜約１５０μｍ、約９０μｍ〜約１４５μｍ、約９０μｍ〜約１４０μｍ、約９０μｍ〜約１３５μｍ、約９０μｍ〜約１３０μｍ、約９０μｍ〜約１２５μｍ、約９０μｍ〜約１２０μｍ、約９０μｍ〜約１１５μｍ、約９０μｍ〜約１１０μｍ、約９０μｍ〜約１０５μｍ、約９０μｍ〜約１００μｍ、約９０μｍ〜約９５μｍ、約９５μｍ〜約１５０μｍ、約９５μｍ〜約１４５μｍ、約９５μｍ〜約１４０μｍ、約９５μｍ〜約１３５μｍ、約９５μｍ〜約１３０μｍ、約９５μｍ〜約１２５μｍ、約９５μｍ〜約１２０μｍ、約９５μｍ〜約１１５μｍ、約９５μｍ〜約１１０μｍ、約９５μｍ〜約１０５μｍ、約９５μｍ〜約１００μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約１４５μｍ、約１００μｍ〜約１４０μｍ、約１００μｍ〜約１３５μｍ、約１００μｍ〜約１３０μｍ、約１００μｍ〜約１２５μｍ、約１００μｍ〜約１２０μｍ、約１００μｍ〜約１１５μｍ、約１００μｍ〜約１１０μｍ、約１００μｍ〜約１０５μｍ、約１０５μｍ〜約１５０μｍ、約１０５μｍ〜約１４５μｍ、約１０５μｍ〜約１４０μｍ、約１０５μｍ〜約１３５μｍ、約１０５μｍ〜約１３０μｍ、約１０５μｍ〜約１２５μｍ、約１０５μｍ〜約１２０μｍ、約１０５μｍ〜約１１５μｍ、約１０５μｍ〜約１１０μｍ、約１１０μｍ〜約１５０μｍ、約１１０μｍ〜約１４５μｍ、約１１０μｍ〜約１４０μｍ、約１１０μｍ〜約１３５μｍ、約１１０μｍ〜約１３０μｍ、約１１０μｍ〜約１２５μｍ、約１１０μｍ〜約１２０μｍ、約１１０μｍ〜約１１５μｍ、約１１５μｍ〜約１５０μｍ、約１１５μｍ〜約１４５μｍ、約１１５μｍ〜約１４０μｍ、約１１５μｍ〜約１３５μｍ、約１１５μｍ〜約１３０μｍ、約１１５μｍ〜約１２５μｍ、約１１５μｍ〜約１２０μｍ、約１２０μｍ〜約１５０μｍ、約１２０μｍ〜約１４５μｍ、約１２０μｍ〜約１４０μｍ、約１２０μｍ〜約１３５μｍ、約１２０μｍ〜約１３０μｍ、約１２０μｍ〜約１２５μｍ、約１２５μｍ〜約１５０μｍ、約１２５μｍ〜約１４５μｍ、約１２５μｍ〜約１４０μｍ、約１２５μｍ〜約１３５μｍ、約１２５μｍ〜約１３０μｍ、約１３０μｍ〜約１５０μｍ、約１３０μｍ〜約１４５μｍ、約１３０μｍ〜約１４０μｍ、約１３０μｍ〜約１３５μｍ、約１３５μｍ〜約１５０μｍ、約１３５μｍ〜約１４５μｍ、約１３５μｍ〜約１４０μｍ、約１４０μｍ〜約１５０μｍ、約１４０μｍ〜約１４５μｍ、または約１４５μｍ〜約１５０μｍ）である場合は、例えば、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ（例えば、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、または約４．１ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ）の濃度のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約１μｍ〜約８０μｍ（例えば、約１μｍ〜約５０μｍ、約１μｍ〜約２５μｍ、約１μｍ〜約１０μｍ、約１μｍ〜約５μｍ、約５μｍ〜約８０μｍ、約５μｍ〜約５０μｍ、約５μｍ〜約２５μｍ、約５μｍ〜約１０μｍ、約１０μｍ〜約８０μｍ、約１０μｍ〜約５０μｍ、約１０μｍ〜約２５μｍ、約２５μｍ〜約８０μｍ、約２５μｍ〜約５０μｍ、または約５０μｍ〜約８０μｍ）である場合は、例えば、約４．５ｇ／Ｌの濃度または約４．５ｇ／Ｌより高い濃度（例えば、約４．６ｇ／Ｌの濃度もしくは４．６ｇ／Ｌより高い濃度、約４．７ｇ／Ｌの濃度もしくは４．７ｇ／Ｌより高い濃度、約４．８ｇ／Ｌの濃度もしくは４．８ｇ／Ｌより高い濃度、約４．９ｇ／Ｌの濃度もしくは４．９ｇ／Ｌより高い濃度、約５．０ｇ／Ｌの濃度もしくは５．０ｇ／Ｌより高い濃度、約５．１ｇ／Ｌの濃度もしくは５．１ｇ／Ｌより高い濃度、約５．２ｇ／Ｌの濃度もしくは５．２ｇ／Ｌより高い濃度、約５．３ｇ／Ｌの濃度もしくは５．３ｇ／Ｌより高い濃度、約５．４ｇ／Ｌの濃度もしくは５．４ｇ／Ｌより高い濃度、約５．５ｇ／Ｌの濃度もしくは５．５ｇ／Ｌより高い濃度、約５．６ｇ／Ｌの濃度もしくは５．６ｇ／Ｌより高い濃度、約５．７ｇ／Ｌの濃度もしくは５．７ｇ／Ｌより高い濃度、約５．８ｇ／Ｌの濃度もしくは５．８ｇ／Ｌより高い濃度、約６．０ｇ／Ｌの濃度もしくは６．０ｇ／Ｌより高い濃度、約６．１ｇ／Ｌの濃度もしくは６．１ｇ／Ｌより高い濃度、約６．２ｇ／Ｌの濃度もしくは６．２ｇ／Ｌより高い濃度、約６．３ｇ／Ｌの濃度もしくは６．３ｇ／Ｌより高い濃度、約６．４ｇ／Ｌの濃度もしくは６．４ｇ／Ｌより高い濃度、約６．５ｇ／Ｌの濃度もしくは６．５ｇ／Ｌより高い濃度、約６．６ｇ／Ｌの濃度もしくは６．６ｇ／Ｌより高い濃度、約６．７ｇ／Ｌの濃度もしくは６．７ｇ／Ｌより高い濃度、約６．８ｇ／Ｌの濃度もしくは６．８ｇ／Ｌより高い濃度、約６．９ｇ／Ｌの濃度もしくは６．９ｇ／Ｌより高い濃度、約７．０ｇ／Ｌの濃度もしくは７．０ｇ／Ｌより高い濃度、約７．１ｇ／Ｌの濃度もしくは７．１ｇ／Ｌより高い濃度、約７．２ｇ／Ｌの濃度もしくは７．２ｇ／Ｌより高い濃度、約７．３ｇ／Ｌの濃度もしくは７．３ｇ／Ｌより高い濃度、約７．４ｇ／Ｌの濃度もしくは７．４ｇ／Ｌより高い濃度、約７．５ｇ／Ｌの濃度もしくは７．５ｇ／Ｌより高い濃度、約７．６ｇ／Ｌの濃度もしくは７．６ｇ／Ｌより高い濃度、約７．７ｇ／Ｌの濃度もしくは７．７ｇ／Ｌより高い濃度、約７．８ｇ／Ｌの濃度もしくは７．８ｇ／Ｌより高い濃度、約７．９ｇ／Ｌの濃度もしくは７．９ｇ／Ｌより高い濃度、約８．０ｇ／Ｌの濃度もしくは８．０ｇ／Ｌより高い濃度、約８．１ｇ／Ｌの濃度もしくは８．１ｇ／Ｌより高い濃度、約８．２ｇ／Ｌの濃度もしくは８．２ｇ／Ｌより高い濃度、約８．３ｇ／Ｌの濃度もしくは８．３ｇ／Ｌより高い濃度、約８．４ｇ／Ｌの濃度もしくは８．４ｇ／Ｌより高い濃度、約８．５ｇ／Ｌの濃度もしくは８．５ｇ／Ｌより高い濃度、約８．６ｇ／Ｌの濃度もしくは８．６ｇ／Ｌより高い濃度、約８．７ｇ／Ｌの濃度もしくは８．７ｇ／Ｌより高い濃度、約８．８ｇ／Ｌの濃度もしくは８．８ｇ／Ｌより高い濃度、約８．９ｇ／Ｌの濃度もしくは８．９ｇ／Ｌより高い濃度、約９．０ｇ／Ｌの濃度もしくは９．０ｇ／Ｌより高い濃度、約９．１ｇ／Ｌの濃度もしくは９．１ｇ／Ｌより高い濃度、約９．２ｇ／Ｌの濃度もしくは９．２ｇ／Ｌより高い濃度、約９．３ｇ／Ｌの濃度もしくは９．３ｇ／Ｌより高い濃度、約９．４ｇ／Ｌの濃度もしくは９．４ｇ／Ｌより高い濃度、約９．５ｇ／Ｌの濃度もしくは９．５ｇ／Ｌより高い濃度、約９．６ｇ／Ｌの濃度もしくは９．６ｇ／Ｌより高い濃度、約９．７ｇ／Ｌの濃度もしくは９．７ｇ／Ｌより高い濃度、約９．８ｇ／Ｌの濃度もしくは９．８ｇ／Ｌより高い濃度、約９．９ｇ／Ｌの濃度もしくは９．９ｇ／Ｌより高い濃度、または約１０．０ｇ／Ｌの濃度もしくは１０．０ｇ／Ｌより高い濃度）のポロクサマー−１８８を選択することを含む。

培養が灌流培養である場合、第２の液体培地は、選択されたポロクサマー−１８８濃度を含む。

生細胞密度に基づくポロクサマー−１８８濃度の増大
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度に基づき、培地中のポロクサマー−１８８濃度を経時的に増大させることを含む。例えば、本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約２８×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約２６×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約２４×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜約２２×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約２８×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約２６×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜約２４×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約２８×１０^６細胞／ｍＬ、約２４×１０^６細胞／ｍＬ〜約２６×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約２６×１０^６細胞／ｍＬ〜約２８×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約２８×１０^６細胞／ｍＬ〜約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ〜約３２×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約３２×１０^６細胞／ｍＬ〜約３４×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約３４×１０^６細胞／ｍＬ〜約３６×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、
約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約３６×１０^６細胞／ｍＬ〜約３８×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約３８×１０^６細胞／ｍＬ〜約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ〜約４２×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約４２×１０^６細胞／ｍＬ〜約４４×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約４４×１０^６細胞／ｍＬ〜約４６×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約４６×１０^６細胞／ｍＬ〜約４８×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約４８×１０^６細胞／ｍＬ〜約５０×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ〜約５２×１０^６細胞／ｍＬ、約５２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約５２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約５２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約５２×１０^６細胞／ｍＬ〜約５４×１０^６細胞／ｍＬ、約５４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約５４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、約５４×１０^６細胞／ｍＬ〜約５６×１０^６細胞／ｍＬ、約５６×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約５６×１０^６細胞／ｍＬ〜約５８×１０^６細胞／ｍＬ、または約５８×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ）である場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を１．８ｇ／Ｌより高く（例えば、約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．１ｇ／Ｌ、約１．８ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約１．９ｇ／Ｌ〜約２．１ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．１ｇ／Ｌ〜約２．３ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．２ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．３ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．４ｇ／Ｌ〜約２．６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２．７ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、約２．６ｇ／Ｌ〜約２．８ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、約２．７ｇ／Ｌ〜約２．９ｇ／Ｌ、または約２．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ）まで増大させることを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７０×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６８×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６６×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６４×１０^６細胞／ｍＬ、約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約６２×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７０×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６８×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６６×１０^６細胞／ｍＬ、約６２×１０^６細胞／ｍＬ〜約６４×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７０×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６８×１０^６細胞／ｍＬ、約６４×１０^６細胞／ｍＬ〜約６６×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７０×１０^６細胞／ｍＬ、約６６×１０^６細胞／ｍＬ〜約６８×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約６８×１０^６細胞／ｍＬ〜約７０×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約７０×１０^６細胞／ｍＬ〜約７２×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約７２×１０^６細胞／ｍＬ〜約７４×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約７４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７６×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約７６×１０^６細胞／ｍＬ〜約７８×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約７８×１０^６細胞／ｍＬ〜約８０×１０^６細胞／ｍＬ、約８０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約８０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約８０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約８０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約８０×１０^６細胞／ｍＬ〜約８２×１０^６細胞／ｍＬ、約８２×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約８２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約８２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約８２×１０^６細胞／ｍＬ〜約８４×１０^６細胞／ｍＬ、約８４×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約８４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、約８４×１０^６細胞／ｍＬ〜約８６×１０^６細胞／ｍＬ、約８６×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ、約８６×１０^６細胞／ｍＬ〜約８８×１０^６細胞／ｍＬ、または約８８×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ）である場合、
培地中のポロクサマー−１８８濃度を約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ（例えば、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約３．２ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約３．１ｇ／Ｌ〜約３．３ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．２ｇ／Ｌ〜約３．４ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．３ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．４ｇ／Ｌ〜約３．６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．６ｇ／Ｌ〜約３．８ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．７ｇ／Ｌ〜約３．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約３．８ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約３．９ｇ／Ｌ〜約４．１ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約４．２ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約４．１ｇ／Ｌ〜約４．３ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約４．２ｇ／Ｌ〜約４．４ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約４．３ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、
約４．４ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．４ｇ／Ｌ〜約４．６ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約４．７ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．６ｇ／Ｌ〜約４．８ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．７ｇ／Ｌ〜約４．９ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約４．８ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約４．９ｇ／Ｌ〜約５．１ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約５．２ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約５．１ｇ／Ｌ〜約５．３ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約５．２ｇ／Ｌ〜約５．４ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約５．３ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．４ｇ／Ｌ〜約５．６ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ〜約５．７ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、約５．６ｇ／Ｌ〜約５．８ｇ／Ｌ、約５．７ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約５．７ｇ／Ｌ〜約５．９ｇ／Ｌ、または約５．８ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ）まで増大させることを含む。

本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が、約９０×１０^６細胞／ｍＬより高い（例えば、約９１×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９３×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９５×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９７×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９９×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１００×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０１×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０３×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０５×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０７×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０９×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１１×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１３×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１５×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１７×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１９×１０^６細胞／ｍＬより高い、または約１２０×１０^６細胞／ｍＬより高い）とき、培地中のポロクサマー−１８８濃度を、６．０ｇ／Ｌより高い（例えば、６．１ｇ／Ｌより高い、６．２ｇ／Ｌより高い、６．３ｇ／Ｌより高い、６．４ｇ／Ｌより高い、６．５ｇ／Ｌより高い、６．６ｇ／Ｌより高い、６．７ｇ／Ｌより高い、６．８ｇ／Ｌより高い、６．９ｇ／Ｌより高い、７．０ｇ／Ｌより高い、７．１ｇ／Ｌより高い、７．２ｇ／Ｌより高い、７．３ｇ／Ｌより高い、７．４ｇ／Ｌより高い、７．５ｇ／Ｌより高い、７．６ｇ／Ｌより高い、７．７ｇ／Ｌより高い、７．８ｇ／Ｌより高い、７．９ｇ／Ｌより高い、８．０ｇ／Ｌより高い、８．１ｇ／Ｌより高い、８．２ｇ／Ｌより高い、８．３ｇ／Ｌより高い、８．４ｇ／Ｌより高い、８．５ｇ／Ｌより高い、８．６ｇ／Ｌより高い、８．７ｇ／Ｌより高い、８．８ｇ／Ｌより高い、８．９ｇ／Ｌより高い、９．０ｇ／Ｌより高い、９．１ｇ／Ｌより高い、９．２ｇ／Ｌより高い、９．３ｇ／Ｌより高い、９．４ｇ／Ｌより高い、９．５ｇ／Ｌより高い、９．６ｇ／Ｌより高い、９．７ｇ／Ｌより高い、９．８ｇ／Ｌより高い、９．９ｇ／Ｌより高い、１０．０ｇ／Ｌより高い、約１０．１ｇ／Ｌより高い、約１０．２ｇ／Ｌより高い、約１０．３ｇ／Ｌより高い、約１０．４ｇ／Ｌより高い、約１０．５ｇ／Ｌより高い、約１０．６ｇ／Ｌより高い、約１０．７ｇ／Ｌより高い、約１０．８ｇ／Ｌより高い、約１０．９ｇ／Ｌより高い、または約１１．０ｇ／Ｌより高い）ポロクサマー−１８８まで増大させることを含む。

いくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約３５×１０^６細胞／ｍＬ〜約６０×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、または本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか）である場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を約１．８ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ（例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか）まで増大させること；培地中の生細胞濃度密度が約６０×１０^６細胞／ｍＬ〜約９０×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか）である場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ（例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか）まで増大させること；および培地中の生細胞密度濃度が９０×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、本明細書において記載される、９０×１０^６細胞／ｍＬより高い生細胞密度のいずれか）より高い場合、培地中のポロクサマー−１８８濃度を６．０ｇ／Ｌより高く（例えば、本明細書において記載される、６．０ｇ／Ｌより高い濃度のいずれか）まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養中の１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０）の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む。

消泡剤に対するポロクサマー−１８８の割合
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、液体培地は、消泡剤（例えば、消泡剤−ｃ）を含み、培地中のポロクサマー−１８８（ｇ／Ｌ）に対する消泡剤（ｇ／Ｌ）の割合は、約０．５％〜約６．０％（例えば、約０．５％〜約５．５％、約０．５％〜約５．０％、約０．５％〜約４．５％、約０．５％〜約４．０％、約０．５％〜約３．５％、約０．５％〜約３．０％、約０．５％〜約２．５％、約０．５％〜約２．０％、約０．５％〜約１．５％、約０．５％〜約１．０％、約１．０％〜約６．０％、約１．０％〜約５．５％、約１．０％〜約５．０％、約１．０％〜約４．５％、約１．０％〜約４．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．０％〜約３．０％、約１．０％〜約２．５％、約１．０％〜約２．０％、約１．０％〜約１．５％、約２．０％〜約６．０％、約２．０％〜約５．５％、約２．０％〜約５．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．０％〜約４．０％、約２．０％〜約３．５％、約２．０％〜約３．０％、約２．０％〜約２．５％、約２．５％〜約６．０％、約２．５％〜約５．５％、約２．５％〜約５．０％、約２．５％〜約４．５％、約２．５％〜約４．０％、約２．５％〜約３．５％、約２．５％〜約３．０％、約３．０％〜約６．０％、約３．０％〜約５．５％、約３．０％〜約５．０％、約３．０％〜約４．５％、約３．０％〜約４．０％、約３．０％〜約３．５％、約３．５％〜約６．０％、約３．５％〜約５．５％、約３．５％〜約５．０％、約３．５％〜約４．５％、約３．５％〜約４．０％、約４．０％〜約６．０％、約４．０％〜約５．５％、約４．０％〜約５．０％、約４．０％〜約４．５％、約４．５％〜約６．０％、約４．５％〜約５．５％、約４．５％〜約５．０％、約５．０％〜約６．０％、約５．０％〜約５．５％、または約５．５％〜約６．０％）である。

培養培地
液体培養培地は、当該技術分野において公知である。液体培養培地（例えば、第１および／もしくは第２の液体培地）は、哺乳類血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、ならびに／または成長ホルモンもしくは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮成長因子）を付加され得る。あるいは、または加えて、液体培養培地（例えば、第１および／もしくは第２の液体培地）は、既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、または血清を含有する液体培養培地であり得る。既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、および血清を含有する液体培養培地の非限定的な例が、商業的に入手可能である。

液体培地は、エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸とシステインの基本的セット）、低い濃度の必要とされるビタミンおよび／もしくは他の有機化合物、遊離脂肪酸、ならびに／または微量元素を典型的に含有する。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培地）は、所望されるなら、例えば、哺乳類ホルモンもしくは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子）、塩ならびに緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドならびに塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質ならびに組織加水分解産物、ならびに／またはこれらの添加剤の任意の組み合わせを付加される。

本明細書において記載される方法のいずれかにおいて細胞（例えば、哺乳類細胞）を培養するために使用される、多種多様な異なる液体培養培地は、当該技術分野において公知である。本プロセスにおいて有用でもある培地成分は、既知組成（ＣＤ）の加水分解産物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２個またはそれ以上のアミノ酸）、およびＣＤ成長因子を含むが、これらに限定されない。液体培地および培地成分のさらなる例が、当該技術分野において公知である。

当業者は、本明細書において記載される、第１の液体培地、および第２またはフィード液体培地が、同じタイプの培地、もしくは異なる培地であることを理解するだろう。

細胞培養物から得た液体培地を濾過、または清澄化して、細胞および／もしくはウイルスを実質的に含まない、液体培地を得る。細胞を取り出すために液体培地を濾過するか、または清澄化する方法は、当該技術分野において公知である（例えば、０．２μｍの濾過および交互接線流（ＡＴＦＴＭ）システムを使用した濾過）。哺乳類細胞はまた、遠心分離を使用し、細胞を実質的に含まない液体培地である上清を取り出して、または細胞を、液体培地を含有する容器もしくはバイオリアクターの重力的下部に定着させ、定着した組み換え細胞から離れた液体培地（細胞を実質的に含まない液体培地）を取り出すことにより、液体培地から取り出される。

温度
哺乳類細胞の培養の工程は、約３１℃〜約４０℃の温度にて行われる。当業者は、温度が、例えば、毎時または毎日を基準に、培養工程中の特定の時点で変化されることを理解するだろう。例えば、温度は、細胞（例えば、哺乳類細胞）を有するバイオリアクターの開始播種後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、もしくは約２０日もしくはそれ以上にて、変化されるか、またはシフトされる（例えば、増大させる、または低減させる）。例えば、温度は、上向きにシフトされる（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）。例えば、温度は、下向きにシフトされる（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃）。

ＣＯ_２
本明細書において記載される培養工程は、バイオリアクター中の液体培地を、最大または約１５％ＣＯ_２（例えば、最大もしくは約１４％ＣＯ_２、１２％ＣＯ_２、１０％ＣＯ_２、８％ＣＯ_２、６％ＣＯ_２、５％ＣＯ_２、４％ＣＯ_２、３％ＣＯ_２、２％ＣＯ_２、もしくは最大もしくは約１％ＣＯ_２）を含有する雰囲気に曝露させることをさらに含む。

組み換えタンパク質
本明細書において提供される方法により産生される組み換えタンパク質の非限定的な例は、免疫グロブリン（軽および重鎖免疫グロブリン、抗体、もしくは抗体フラグメント（例えば、本明細書において記載される抗体フラグメントのいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、ミオザイム、もしくはセレザイム）、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、もしくはインターフェロンアルファもしくはベータ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンにおいて使用するためのタンパク質）を含む。組み換えタンパク質は、少なくとも１つの多機能組み換えタンパク質スキャフォールドを含有する操作された抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３巻：２４５〜２５５頁、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（参照により全体として本明細書に組み込まれる）において記載される、組み換え抗原結合タンパク質）である。抗体である組み換えタンパク質の非限定的な例は、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマム（abagovomab）、アブシキシマブ、アクトクマブ（actoxumab）、アダリムマブ、アデカツムマブ（adecatumumab）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（alacizumab）、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモバム（altumomab）、アマツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ（anatumomab）、アヌルキンズマブ（anrukinzumab）、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ（atinumab）、トシリズマブ、バシリジマブ（basilizimab）、ベクツモブ（bectumomab）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ（bezlotoxumab）、ビシロマブ（biciromab）、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ（densumab）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（efungumab）、エプラツズマブ、エルツマクソマブ（ertumaxomab）、エタラシズマブ（etaracizumab）、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（igovomab）、イマガツズマブ（imgatuzumab）、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ（moxetumomab）、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ（tralokinumab）、ツコツズマブ（tucotuzumab）、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、およびザツキシマブ（zatuximab）を含む。本明細書において記載される方法により産生される組み換え抗体のさらなる例は、当該技術分野において公知である。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる非限定的な例は、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、第ＩＸ凝固因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、抗トロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−１１、ラロニダーゼ、イデュルスファーゼ（idursuphase）、ガルスルファーゼ、α−１−プロテアーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、サイロトロピンアルファ（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））、およびアルテプラーゼを含む。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる例は、酸性α−グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ（例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））、α−Ｌ−イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、およびＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼ−Ａ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、ならびにヘキソサミニダーゼＢを含む。

分泌された、溶解性組み換えタンパク質は、細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培地を取り出すか、またはそうでなければ物理的に分けることにより、液体培地（例えば、第１および／もしくは第２の液体培地）から回収される。例えば、遠心分離、濾過、ピペッティング、および／または吸引を含む、細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培地を取り出す、様々な異なる方法が、当該技術分野において公知である。次に、分泌された組み換えタンパク質は、種々のタイプのクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、もしくは陰イオン交換クロマトグラフィー）、および／または濾過（例えば、分子量カットオフ濾過）を含む、様々な生化学的技術を使用して、液体培地から回収され、さらに精製される。

組み換えタンパク質の収集
いくつかの実施形態は、組み換えタンパク質（例えば、本明細書において記載される組み換えタンパク質のいずれか）を収集することをさらに含む。いくつかの例では、収集は、哺乳類細胞を溶解することを含む。他の例では、収集は、組み換えタンパク質を培地（例えば、灌流培養が行われるとき、第１および第２の液体培地の１つもしくは両方、またはバッチ培養が行われるとき、第１の液体培地およびフィード液体培地の１つもしくは両方）から収集することを含む。

収集は、培養が、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約３２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約３４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約３６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約３８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約４０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約４２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約４４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約４６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約４８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約５２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約５４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約５６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約５８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約６０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約６２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約６４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約６６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約６８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約７０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約７２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約７４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約７６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約７８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約８０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約８２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約８４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約８６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約８８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約９８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１００×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１０８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１１８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１２０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１２２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１２４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１２６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１２８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１３０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１３２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１３４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１３６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１３８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１４０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１４２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１４４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１４６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１４８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１５０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１５２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１５４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１５６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１５８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１６０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１６２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１６４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１６６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１６８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１７０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１７２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１７４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１７６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１７８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１８０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１８２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１８４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１８６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１８８×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１９０×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１９２×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１９４×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１９６×１０^６細胞／ｍＬより高い、約１９８×１０^６細胞／ｍＬより高い、または約２００×１０^６細胞／ｍＬより高い）生細胞密度を達成した後、行われる。

組み換えタンパク質の製剤化
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質（例えば、収集された組み換えタンパク質）を医薬組成物に製剤化する工程をさらに含む。例えば、製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質（例えば、収集された組み換えタンパク質）に添加することを含む。製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質（例えば、収集された組み換えタンパク質）と混合することを含む。薬学的に許容し得る賦形剤（例えば、天然に存在しない薬学的に許容し得る賦形剤）の例は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、組み換えタンパク質（例えば、収集された組み換えタンパク質）は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のため製剤化される。

分泌された組み換え抗体を産生する灌流細胞培養に対するポロクサマー−１８８の濃度の増大の効果
このセットの実験を行い、組み換え抗体をコードする核酸を含有する哺乳類細胞を含む灌流細胞培養物における、細胞成長および組み換え抗体産生に対するポロクサマー−１８８の増加濃度の効果を試験した。これらの実験において、全培養期間に渡り、１．８ｇ／Ｌを含有するＣＤ−ＣＨＯ培地を使用する、第１の灌流細胞培養ラン、および培養期間に渡り、ポロクサマー−１８８の増加濃度（培養期間に渡り、１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地を使用した、第２の灌流細胞培養ランを行った。それぞれの細胞培養ランについて、培養の１２日〜３３日において４リアクター体積（ＲＶ）／日の速度で、灌流を行い、培養の３３日〜６３日において６ＲＶ／日の速度にスイッチし、培養の６３日〜７２日において７ＲＶ／日の速度にスイッチした。培養の０日〜１４日において１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地、培養の１５日〜３４日において２．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地、培養の３５日〜３９日において３．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地、培養の４０日〜５６日において４．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地、および培養の５７日〜７２日において５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地を使用して、第２の細胞培養ランを行った。

周知の方法を使用して、第１および第２の灌流培養の両方について、それぞれの日に、生細胞密度、比成長速度、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および比生産性を決定した。

データは、培養物中１．８ｇ／Ｌより高いポロクサマー−１８８濃度を確立することにより、１００×１０^６細胞／ｍＬを超える生細胞密度を達成することを示した（図１）。対照的に、培養物中１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８のみを使用した第１の細胞培養ランのみが、５０×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度を達成した（図１）。第２の細胞培養ランについてのデータはまた、細胞培養物が１００×１０^６細胞／ｍＬより高い生細胞密度を有するときでさえ、培地中の１．８ｇ／Ｌより高いポロクサマー−１８８濃度の確立が、着実な比成長速度をもたらすことも示した（図２）。図３におけるデータはまた、培地中の１．８ｇ／Ｌより高いポロクサマー−１８８濃度の確立が、培養期間を通じて１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する培養培地を使用した灌流細胞培養ランと比較して、高いおよび定常パーセンテージの生細胞（培養期間を通じて８０％より上）をもたらすことも示した（図３）。

図４および５におけるデータはまた、培養期間に渡り、増加濃度のポロクサマー−１８８（１．８ｇ／Ｌから６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８に増大する）を含有する培養培地で行った第２の灌流細胞培養ランは、それぞれ、高い体積測定生産性（３ｇ／Ｌ／ｄより高い）、および高い比生産性（１５ｐｇ／細胞／日〜４２ｐｇ／細胞／日）を有することも示した。

液体培地中の組み換え抗体の安定性に対するポロクサマー−１８８の増加濃度の効果
セットの実験を行い、増加濃度のポロクサマー−１８８が、細胞培養物からの回収後、清澄化液体培地に存在する組み換えタンパク質の分解を阻害するかどうかを決定した。これらの実験において、培養物が６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度を達成した後、培養物中のポロクサマー−１８８濃度を３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８まで低減し、次に、３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８まで再度低減したことを除き、実施例１において記載した第２の灌流細胞培養ランと類似する灌流細胞培養ランを行った。これらの実験において、次の時点：培養物が６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有したときの第１の時点、培養物が３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度を含有したときの第２の時点、および培養物が３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度を含有したときの第３の時点で培養物から、液体培地の２または３つのサンプルを取り出した。時点のそれぞれから収集した１つのサンプルを４℃で保存し、時点のそれぞれから収集した１つのサンプルを、４℃での保存の前に室温にて７日間インキュベートし、第２および第３の時点のそれぞれについて、サンプルにポロクサマー−１８８を付加して、それぞれのサンプルにおける６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度を達成し、次に、それぞれのサンプルを、４℃での保存の前に室温にて９日間インキュベートした。得られた無処理および処理したサンプルを、４〜２０％ビス−トリスゲルに泳動し、クーマシーブルーで染色した。

図６におけるデータは、６．８ｇ／Ｌ、３．９５ｇ／Ｌ、または３．０ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有する無処理サンプルが全て、類似の生産安定性を示したことを示す（レーン１、２、および３）。データはまた、６．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するサンプルが、室温にて７日間のインキュベーション後に実質的な分解を示さず、一方、３．０ｇ／Ｌまたは３．９５ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するサンプルの両方が、同じインキュベーション後に検出可能な分解を示したことも、驚くべきことに示した（図６；レーン１ａ、２ａ、および３ａ）。データはまた、少ないポロクサマー−１８８を含有するサンプルへのポロクサマー−１８８への添加が、生産安定性を改善しないことも示した（図６；レーン２ｂおよび３ｂ）。これらのデータは、培地中の１．８ｇ／Ｌより高い、ポロクサマー−１８８の濃度の使用が、培養物における組み換えタンパク質の分解を低減するか、または阻害することを示し、ポロクサマー−１８８が、健全な細胞培養物をもたらすことにより、この効果を達成することを示した。

細胞培養成長および生産性に対して有益な効果を達成するのに必要なポロクサマー−１８８の量に対するスパージャ孔タイプならびにサイズの効果
セットの実験を行い、灌流細胞培養物において有益な成長および生産性特性を達成するのに必要なポロクサマー−１８８の量に対するスパージャ孔タイプおよびサイズの効果を試験した。これらの実験において、異なるスパージャ：２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ（１つのリアクター）；２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ（２つのリアクター）；または５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ（１つのリアクター）を使用した、異なる灌流細胞培養ランを行った。それぞれの灌流培養は、１．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を含有するＣＤ ＣＨＯ培地を最初使用し、必要に応じて、細胞生存率を維持し、細胞溶解を最小にするために、漸増量で培養物にポロクサマー−１８８を添加した。周知の方法を使用して、培養期間中の異なる時点で、それぞれの細胞培養物について、生細胞密度、比成長速度、比乳酸脱水素酵素生産性、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および好気性グルコース消費を行った。

データは、５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、培養物中の３．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度が、生細胞密度を維持することができ、２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、４．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度が、生細胞密度を維持することができ、２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８の濃度が、生細胞密度を維持することができたことを示す（図７）。

データはまた、３．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８、および５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ラン、４．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８、および２００μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ラン、ならびに５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８、および２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランについて、類似の比成長速度（図８）、比ラクトース脱水素酵素生産性（図９および１１）、生細胞のパーセンテージ（図１０）、体積測定生産性（図１２）、ならびに好気性グルコース消費率（図１３）を達成したことも示す。

データは、ポロクサマー−１８８が、培養物中１．８ｇ／Ｌより高い濃度で存在するとき、全ての試験したスパージャを使用して、６０×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度を達成したことを示す。例えば、６０×１０^６細胞／ｍＬより高い生細胞密度を、培地中２．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を使用することによる、１ｍｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中３．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を使用することによる、５００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中４．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を使用することによる、２００μｍのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中３．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を使用することによる、１００μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、および培地中５．８ｇ／Ｌポロクサマー−１８８を使用することによる、２０μｍのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用した灌流培養において達成した。データは、孔サイズが小さいほど、健常な培養を維持するのによりポロクサマー−１８８を必要としたことを示す。

灌流培養細胞成長に対するスパージャ孔タイプ、孔サイズ、およびポロクサマー−１８８に対する消泡剤の割合の効果
さらなるセットの実験を行い、異なる孔タイプおよびサイズを有するスパージャ、ならびに培養物中のポロクサマー−１８８に対する消泡剤の異なる割合を使用した灌流培養において、一定の状態の細胞成長を決定した（以下の表１において示す）。

表１におけるデータは、孔サイズが小さいほど、より多くの消泡剤−ｃを、泡沫の生成を緩和するために培地に添加する必要があること、拡散速度が増大するにつれ、追加の消泡剤−ｃを必要とすること、およびポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの最適な割合が０〜＜５％（例えば、約１％〜約３％）であることを必要とすることを示す。

バッチ細胞培養ランにおける細胞成長に対するポロクサマー−１８８に対する消泡剤−Ｃの割合の効果
セットの実験を行い、ポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合０％、ポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合５．６％、ポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合１１．１％、ポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合２７．８％、またはポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合５５．６％を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地を使用したバッチ振盪フラスコ細胞培養ランにおいて、細胞成長に対するポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの割合の効果を試験した。振盪フラスコ細胞培養を調節し、泡を受動的に生成させて、バイオリアクターを刺激した。周知の方法を使用して、培養期間に渡るそれぞれの日で、それぞれの細胞培養ランにおける生細胞密度および比乳酸脱水素酵素生産性を決定した。

データは、ポロクサマー−１８８に対するより消泡剤−ｃの割合が少ないほど、改善した生細胞密度（図１４）、およびより遅い比乳酸脱水素酵素生産性（図１５）を示したことを示す。これらのデータは、培養物中のポロクサマー−１８８に対する消泡剤−ｃの最適な割合が０〜約５％未満（例えば、約１％〜約３％）であることをさらに示唆する。

他の実施形態
本発明が、その詳細な説明と結び付けて記載される一方、前述の説明が、添付の請求の範囲により定義される、本発明の範囲を説明し、制限しないことを意図することは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。

Claims (20)

1. 哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、（ａ）〜（ｄ）の各工程：
   （ａ）分泌される組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、分泌される組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で灌流培養すること、ここで、灌流培養は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８を含む液体培地において培養することを含む；
   （ｂ）工程（ａ）の後に、液体培地中の生細胞密度が３５×１０⁶細胞／ｍＬより高くかつ６０×１０⁶細胞／ｍＬ以下であることを決定し、その場合に、液体培地中のポロクサマー−１８８濃度を１．８ｇ／Ｌより高くなるよう増大させること；
   （ｃ）工程（ｂ）の後に、液体培地中の生細胞密度が６０×１０⁶細胞／ｍＬより高くかつ９０×１０⁶細胞／ｍＬ以下であることを決定し、その場合に、液体培地中のポロクサマー−１８８濃度を３．０ｇ／Ｌより高くなるよう増大させること；および
   （ｄ）工程（ｃ）の後に、液体培地中の生細胞密度が９０×１０⁶細胞／ｍＬより高いことを決定し、その場合に、液体培地中のポロクサマー−１８８濃度を６．０ｇ／Ｌより高くなるよう増大させること
   を含む、前記方法。
2. 液体培地は消泡剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 液体培地は、０．５％〜６．０％のポロクサマー−１８８（ｇ／Ｌ）に対する消泡剤（ｇ／Ｌ）の割合を有する、請求項２に記載の方法。
4. 培養工程の前にポロクサマー−１８８を液体培地に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
5. 培養工程中にポロクサマー−１８８を液体培地に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
6. 培養工程の前にポロクサマー−１８８を液体培地に添加することおよび培養工程中にポ
   ロクサマー−１８８を液体培地に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
7. ポロクサマー−１８８は液体培地に存在する、請求項１に記載の方法。
8. 灌流培養は、
   （ｉ）第１の液体培地において配置された哺乳類細胞を含む容器を用意すること；
   （ｉｉ）該容器を撹拌しながら、少なくとも７日の培養期間、温度３２℃〜４０℃でインキュベートすること；および
   （ｉｉｉ）培養期間の最初の４８〜９６時間後、連続的または定期的に、第１の体積の該第１の液体培地を取り出し、該第１の液体培地に第２の体積の第２の液体培地を添加することを含み、該第１および第２の体積がほぼ等しい、
   請求項１に記載の方法。
9. 第２の液体培地は、第１の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー−１８８を含む、請求項８に記載の方法。
10. 第１の液体培地は、１．８ｇ／Ｌの濃度または１．８ｇ／Ｌ未満の濃度のポロクサマー−１８８を含み、第２の液体培地は、１．８ｇ／Ｌより高い濃度のポロクサマー−１８８を含む、請求項８に記載の方法。
11. 分泌される組み換えタンパク質を第１の液体培地または第２の液体培地から収集することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
12. 収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 第１の液体培地および／または第２の液体培地は、既知組成の液体培養培地、無血清の液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、およびタンパク質を含まない液体培地からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
14. 哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨＴ−１０８０細胞株である、請求項１に記載の方法。
15. 哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. 分泌される組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 分泌される組み換えタンパク質は酵素である、請求項１６に記載の方法。
18. 酵素はガラクトシダーゼである、請求項１７に記載の方法。
19. ガラクトシダーゼはα−ガラクトシダーゼである、請求項１８に記載の方法。
20. α−ガラクトシダーゼはα−ガラクトシダーゼ−Ａである、請求項１９に記載の方法。

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