JP6850360B2

JP6850360B2 - 臨床使用可能な細胞凍結保存液

Info

Publication number: JP6850360B2
Application number: JP2019555541A
Authority: JP
Inventors: ワン，フェイ; フー，ジアピン; ヂャオ，ディージュン; リュウ，ヴィクター; ヤン，ディンヂュー
Original assignee: セルラーバイオメディスングループ（シャンハイ）エルティーディー．; セルラーバイオメディスングループ（ウーシー）エルティーディー．
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2021-03-31
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: EP3560334A1; CN108235981B; US11363812B2; EP3560334A4; JP2020502284A; US12356981B2; WO2018113796A1; US20190357525A1; CN108235981A; US20220272965A1

Description

本発明は、生物技術分野に関し、具体的に、細胞の長期間保存およびその臨床使用のための凍結保存液に関する。

細胞培養が所要量または目的に達した後、培養して得られた細胞を収集・保存する必要がある。しかしながら、常温と４℃の条件はいずれも細胞の長期間保存に不十分で、細胞に対して超低温の凍結保存を行う必要があり、これは凍結保存液の使用に関わる。

現在、通常の凍結保存液はいずれも血清、または動物由来のタンパク質、または臨床使用に満足できない通常の化学試薬からなるもので、このような凍結保存液は細胞の生存率や機能維持の効果が劣るだけでなく、その成分は統一できないため、臨床使用の基準に達するようにするのが困難である。

上記のように、本分野では、品質が均一で、臨床使用に適する細胞凍結保存液が未だに欠けている。

本発明の目的は、品質が均一で、臨床使用に適する細胞凍結保存液を提供することである。

本発明の第一の側面では、臨床使用可能な細胞凍結保存液であって、
（１）ヒトアルブミン、
（２）ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールの１種または複数種の組み合わせを含む凍結保護剤、
（３）Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋、Ｃｌ⁻およびＣＨ_３ＣＯＯ⁻イオンを含む塩緩衝液、
（４）ビタミン、ならびに
（５）アミノ酸を含み、
ここで、前記ヒトアルブミンの濃度は１％〜２０％（ｗ／ｖ）である、
細胞凍結保存液を提供する。

もう一つの好適な例において、前記のヒトアルブミンの濃度は３〜１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは４〜１２％（ｗ／ｖ）である。

もう一つの好適な例において、前記の凍結保護剤の濃度は０．４ｍｏｌ／Ｌ〜２．２ｍｏｌ／Ｌである。

もう一つの好適な例において、前記の凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記の凍結保護剤はジメチルスルホキシドである。

もう一つの好適な例において、前記の細胞凍結保存液は、
Ｎａ^＋イオンの濃度は０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌであること、
Ｋ^＋イオンの濃度は５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであること、
Ｍｇ^２＋イオンの濃度は１．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌであること、
Ｃｌ⁻イオンの濃度は０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌであること、
ＣＨ_３ＣＯＯ⁻イオンの濃度は４０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌであること、
からなる群から選ばれる１つまたは複数の特徴を有する。

もう一つの好適な例において、前記塩緩衝液は多電解質注射液である。

もう一つの好適な例において、前記のビタミンの濃度は５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、および／または前記のアミノ酸の濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌである。

もう一つの好適な例において、前記のヒトアルブミンは、血漿由来ヒトアルブミン、遺伝子組換えヒトアルブミン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記のビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記のビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記のビタミンは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれ、好ましくはリジン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記のアミノ酸は、グリシン、アルギニン、ロイシン、フェニルアラニン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

本発明の第二の側面では、
細胞、および
本発明の第一の側面に記載の細胞凍結保存液を含み、
好ましくは、前記の細胞はＣａｒ−Ｔ細胞、間葉幹細胞、またはそれらの組み合わせである、
細胞混合物を提供する。

もう一つの好適な例において、前記の細胞混合物は、凍結した細胞混合物である。

もう一つの好適な例において、前記の細胞混合物は、細胞の長期間保存および／または細胞ライブラリーの構築に使用される。

本発明の第三の側面では、
（ｉ）凍結保存される細胞を本発明の第一の側面に記載の細胞凍結保存液と混合し、細胞混合物を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞混合物を降温させた後、液体窒素で保存する工程と、
を含む細胞の凍結保存方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）における凍結保存される細胞は、
（ｉ−１）生細胞を提供し、そして生存率および細胞密度を計算する工程と、
（ｉ−２）工程（ｉ−１）の細胞を遠心した後、上清液を除去し、細胞の沈殿を分散させる工程と、
で製造されたものである。

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）では、プログラム降温法によって温度を勾配に−８０度に降下させる。

本発明の第四の側面では、細胞の凍結保存のためのキットであって、本発明の第一の側面に記載の細胞凍結保存液を含むキットを提供する。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

実施例１におけるＣａｒ−Ｔ細胞の生存率と凍結保存時間の関係図である。実施例１におけるＣａｒ−Ｔの機能発現能と凍結保存時間の関係図である。実施例２における間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係図である。実施例２における凍結保存１か月と３か月後の間葉幹細胞と凍結保存前の新鮮な細胞の分化の比較図である。実施例３における間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係図である。実施例３における間葉幹細胞の軟骨形成分化の状況の比較図である。実施例４における間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係図である。実施例４における間葉幹細胞の軟骨形成分化の状況の比較図である。比較例１における間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係図である。比較例１における間葉幹細胞の軟骨形成分化の状況の比較図である。

本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、ヒトアルブミン、ビタミン、アミノ酸を含む凍結保存液で細胞、たとえば間葉幹細胞を保存すると、長期間保存後も、細胞は良い生存率と機能発現能を有することを見出した。これに基づき、本発明を完成させた。

用語
ヒトアルブミン
本明細書で用いられるように、用語「ヒトアルブミン」は血漿由来ヒトアルブミンおよび遺伝子組換えヒトアルブミンを含むが、本発明の具体的な実施例および比較例で使用された「ヒトアルブミン」とは血漿由来ヒトアルブミンで、「組換えヒトアルブミン」とは遺伝子組換えヒトアルブミンである。

間葉幹細胞
本明細書で用いられるように、用語「間葉幹細胞」とは発育早期の内胚葉由来の高度の自己更新能および多分化能を有する多能性幹細胞で、全身の多くの組織に幅広く存在し、体外で培養して増幅することが可能で、かつ特定の条件の制御で神経細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などに分化することができる。

ＣＡＲ−Ｔ細胞
本明細書で用いられるように、「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞で、ある腫瘍抗原を認識する抗体の抗原結合部とＣＤ３−ζ鎖またはＦｃεＲＩγの細胞内部分が体外でカップリングしてなるキメラタンパク質で、遺伝子形質導入の方法によって患者のＴ細胞に形質移入し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。

細胞凍結保存
細胞凍結保存技術は生物学において生物種を保存する重要な手段である。何らかの条件も加えずにそのまま細胞を凍結保存すると、細胞内と外部環境における水はいずれも氷結晶になり、細胞内の機械的損傷、電解質の上昇、浸透圧の変化、脱水、ｐＨの変化、タンパク質の変性などが生じ、深刻な場合、細胞の死亡につながる。培養液に保護剤を入れると、凍結点が低下する。緩和な凍結条件において、細胞内における水分は凍結前に細胞から浸出し、低温で保存すると、氷結晶の形成が減少する。

細胞凍結保存において最も重要な部分は細胞凍結保存液である。従来の細胞凍結保存液は動物の血清を含有し、主にウシ胎児血清および／または仔ウシ血清である。血清は、血漿からフィブリンを除去してなる非常に複雑な混合物で、その一部の成分はまだ不明で、かつ血清の構成および含有量はよく供血動物の性別、年齢、生理条件および栄養条件によって異なる。血清には、様々な血漿タンパク質、ポリペプチド、脂肪、炭水化物、ホルモン、無機物などが含まれている。

細胞蘇生
本明細書で用いられるように、「細胞蘇生」とう言葉とは休眠の細胞を再び活性化させる過程である。通常、当業者に熟知のプロトコール、すなわち、快速蘇生法を使用し、凍結管を迅速に液体窒素から温水浴に移し、好ましくは３７℃〜４０℃にし、適当に撹拌して解凍を加速させ、細胞が完全に解凍した後、凍結管を消毒し、解凍後、細胞を洗浄して再懸濁させ、細胞培養瓶に移し、ＣＯ_２インキュベーターで培養し、細胞の生存率および活力を検出する。

細胞凍結保存方法
本発明の具体的な実施形態において、Ｃａｒ−Ｔ細胞の凍結保存と蘇生の工程は以下の通りである。
１．１４日まで懸濁培養されたＣａｒ−Ｔ細胞を１袋取り、生存率および細胞密度を計算し、生細胞量４×１０^８で遠心・収集する。
２．遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり２０ｍＬの凍結保存液を入れる。
３．均一に混合し、２つの２０ｍＬ凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−８０度に降温させる。
４．液体窒素で保存し、そして１週、６週でそれぞれサンプリングして細胞の活力および機能発現能の検出・分析を行う。

本発明の具体的な実施形態において、間葉幹細胞の凍結保存と蘇生の工程は以下の通りである。
１．付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が８０％〜９０％で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量４×１０^７で遠心・収集する。
２．遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり３ｍＬの凍結保存液を入れる。
３．均一に混合し、２つの２ｍＬ凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−８０度に降温させる。
４．液体窒素で保存し、そして１か月、３か月でそれぞれサンプリングして細胞の生存率および分化能の検出・分析を行う。

細胞凍結保存液
細胞の維持環境は等張溶液が必要である。塩緩衝液、たとえば生理食塩水、多電解質注射液などは細胞の浸透圧を維持することができる。細胞は、凍結保存時、凍結保護剤で細胞内における水を置換し、凍結保存の過程で水が氷結晶になって細胞内小器官を損傷することを防止し、細胞の凍結保存・蘇生後の代謝はビタミンおよびアミノ酸を消耗する必要がある。

本発明者は、意外に、生理食塩水に塩緩衝液、ヒトアルブミン、ビタミン、アミノ酸および凍結保護剤を入れて細胞凍結保存液を調製すると、長期間で細胞を凍結保存し、かつ細胞の蘇生後の高い生存率および強い機能発現と分化能を維持することができる。

本発明の細胞凍結保存液は、以下の成分を含む：
（１）塩緩衝液、
（２）ヒトアルブミン、
（３）ビタミン、
（４）アミノ酸、
（５）凍結保護剤。

前記の塩緩衝液は、生理食塩水、多電解質注射液、リン酸塩緩衝液の１種または複数の組み合わせを含むが、これらに限定されない。前記の凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールの１種または複数の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明の細胞凍結保存液は、以下のことに使用することができる：
（ａ）細胞の保存、
（ｂ）細胞ライブラリーの構築、または
（ｃ）細胞の活力の維持。

細胞混合物
本発明の細胞混合物は、以下の成分を含む：
（ａ）細胞、および
（ｂ）以下の成分を含む細胞凍結保存液：
（１）塩緩衝液、
（２）ヒトアルブミン、
（３）ビタミン、
（４）アミノ酸、
（５）凍結保護剤。

本発明の細胞凍結保存液の主な利点は以下のことを含む。
（１）長期間で細胞を凍結保存することができ、蘇生後の細胞も高い生存率を有する。
（２）凍結保存後蘇生した細胞も良い機能発現能および分化能を有する。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。

実施例１
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。

具体的な凍結保存および蘇生の操作工程は、以下の通りである。
１．１４日まで懸濁培養されたＣａｒ−Ｔ細胞を１袋取り、生存率および細胞密度を計算し、生細胞量４×１０^８で遠心・収集した。
２．遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり２０ｍＬの凍結保存液を入れた。
３．均一に混合し、２つの２０ｍＬ凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−８０度に降温させた。
４．液体窒素で保存し、そして１週、６週でそれぞれサンプリングして検出した。

凍結保存後のＣａｒ−Ｔ細胞の生存率の結果を図１に示す。実験の統計では、凍結保存１〜６週後の生存率の低下はいずれも１０％以内で、かつ１〜６週の結果は安定で、凍結保存液の効果は要求に満足することが示された。

Ｃａｒ−Ｔの機能発現能と凍結保存時間の関係の結果を図２に示すが、図では、Ｏ、Ｎ、Ｐの各群はそれぞれ以下の意味を表す。
Ｏ：Ｃａｒ−Ｔ細胞のみ
Ｎ：Ｃａｒ−Ｔ細胞＋ＣＤ１９陰性腫瘍細胞
Ｐ：Ｃａｒ−Ｔ細胞＋ＣＤ１９陽性腫瘍細胞

図から、Ｏ、Ｎ組は対照群および陰性群で、ほとんど発現がなく、Ｐ群は強い発現能をしたため、Ｐ群のみが見えたことがわかる。当該結果から、凍結保存１〜６週後の細胞も強い機能発現能を有し、凍結保存前と比べて低下した幅が顕著ではなかったことが示された。

実施例２
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。

具体的な凍結保存および蘇生の操作工程は、以下の通りである。
１．付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が８０％〜９０％で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量４×１０^７で遠心・収集する。
２．遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり３ｍＬの凍結保存液を入れた。
３．均一に混合し、２つの２ｍＬ凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−８０度に降温させた。
４．液体窒素で保存し、そして１か月、３か月でそれぞれサンプリングして検出した。

間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係は図３に示すように、結果から、細胞は凍結保存１〜３か月後の生存率の低下が５％以内で、９５％以上に達し、臨床使用の要求に満足することがわかる。

凍結保存後の間葉幹細胞の分化能の機能検出結果を図４に示す。結果から、凍結保存１か月と３か月後それぞれ凍結保存前の新鮮な細胞と対照して分化実験を行い、細胞の脂肪形成、骨形成、軟骨形成の能力は影響されなかったことがわかる。

実施例３
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。

生存率の分析は図５に示すように、結果から、細胞は組換えヒトアルブミン含有で凍結保存１〜３か月後の生存率の低下が７％以内で、９３％以上に達し、臨床使用の要求に満足することがわかる。

分化能の機能検出結果を図６に示す。図から、分化実験において、組換えヒトアルブミンの凍結保存液で１か月凍結保存した後、凍結保存前の新鮮な細胞と比べ、分化能が基本的に一致したことがわかる。

実施例４
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。

凍結保存後の間葉幹細胞の生存率と凍結保存時間の関係は図７に示す。結果から、細胞は組換えヒトアルブミン含有で凍結保存１〜３か月後の生存率の低下が５％以内で、９５％以上に達し、臨床使用の要求に満足することがわかる。

分化能の機能検出結果を図８に示す。図から、分化実験において、ほかのビタミンおよびアミノ酸を含有する凍結保存液で１か月凍結保存した後、凍結保存前の新鮮な細胞と比べ、分化能が基本的に一致したことがわかる。

比較例１
本比較例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。

具体的な凍結保存および蘇生の操作工程は、以下の通りである。
１．付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が８０％〜９０％で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量４×１０^７で遠心・収集した。
２．遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり３ｍＬの凍結保存液を入れた。
３．均一に混合し、２つの２ｍＬ凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−８０度に降温させた。
４．液体窒素で保存し、そして１か月、３か月でそれぞれサンプリングして検出した。

本比較例に記載の凍結保存液で凍結保存された後、間葉幹細胞の生存率の分析結果は図９に示す。図から、ヒトアルブミンおよびジメチルスルホキシドの濃度が高すぎると、細胞は凍結保存１〜３か月内、特に１か月内で大幅に減少し、凍結保存の過程でこの凍結保存液は細胞の生存率を維持することができなかったことが示された。

分化能の機能検出結果を図１０に示す。図から、分化実験において、高濃度のジメチルスルホキシドの凍結保存液で１か月凍結保存した後、凍結保存前の新鮮な細胞と比べ、軟骨形成能が顕著に低下したことがわかる。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims

臨床使用可能な細胞凍結保存液であって、
（１）ヒトアルブミン、
（２）ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールのうちの１種または複数種の組み合わせを含む凍結保護剤、
（３）Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｌ⁻およびＣＨ_３ＣＯＯ⁻イオンを含む塩緩衝液、
（４）ビタミン、ならびに
（５）アミノ酸
を含み、
ここで、前記ヒトアルブミンの濃度は１％〜２０％（ｗ／ｖ）であり、前記アミノ酸は、グリシンおよびアルギニンの組み合わせ、または、ロイシンおよびフェニルアラニンの組み合わせであり、前記アミノ酸の濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌである
ことを特徴とする細胞凍結保存液。
前記の凍結保護剤の濃度は０．４ｍｏｌ／Ｌ〜２．２ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
Ｎａ^＋イオンの濃度は０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌであること、
Ｋ^＋イオンの濃度は５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであること、
Ｍｇ^２＋イオンの濃度は１．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌであること、
Ｃｌ⁻イオンの濃度は０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌであること、
ＣＨ_３ＣＯＯ⁻イオンの濃度は４０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌであること、
からなる群から選ばれる１つまたは複数の特徴を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
前記のビタミンの濃度は５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
前記のヒトアルブミンは、血漿由来ヒトアルブミン、遺伝子組換えヒトアルブミン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
前記のビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
前記のビタミンは、ビタミンＣまたはビタミンＥであることを特徴とする請求項１に記載の細胞凍結保存液。
細胞、および
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞凍結保存液
を含み、
好ましくは、前記の細胞はＣａｒ−Ｔ細胞、間葉幹細胞、またはそれらの組み合わせである
ことを特徴とする細胞混合物。
細胞の凍結保存方法であって、
（ｉ）凍結保存される細胞を請求項１〜７のいずれかに記載の細胞凍結保存液と混合し、細胞混合物を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞混合物を降温させた後、液体窒素で保存する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
細胞の凍結保存のためのキットであって、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞凍結保存液を含むことを特徴とするキット。