JP6854904B2 - 血管新生剤およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、間葉系幹細胞および間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜を含む、血管新生剤に関する。本発明はさらに、血管新生剤の製造方法に関する。

近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた再生医療および細胞治療の研究が盛んになされている。例えば、特許文献１にはＭＳＣを経静脈的に投与することによって、炎症性腸疾患を予防・治療するための方法が開示されている。いくつかの臨床研究や臨床試験も実施されている。しかしながら、現実的には十分な治療効果を示せていないことが分かってきた（非特許文献１）。また、特許文献２には、低酸素培養されたＭＳＣを投与することによって、肝疾患を治療するための方法が開示されている。さらに、特許文献３には、模擬微小重力環境下で培養したＭＳＣが中枢神経系疾患治療に好適であることが開示されている。さらに虚血性疾患に対する血管新生用途は広く研究がなされ、例えば、特許文献４には、脂肪由来間葉系幹細胞を含む虚血性肢疾患治療剤が開示されている。

産業利用を考えた際に、工業的にＭＳＣを取得していくことが課題である。その解決として、患者自身の細胞ではなく、他人の細胞（他家細胞）を用いることが現実的であるといわれており、実際の臨床研究や臨床試験においても他家ＭＳＣを用いた検討が多く実施されている。しかしながら、古くからの臓器移植の課題と同様、他家細胞を用いた治療では、患者自身の免疫反応により、移植された他家ＭＳＣが拒絶され排除されることが大きな課題となる。ＭＳＣ自体が比較的免疫拒絶を受けにくい性質を有するとも言われるが、現実的には拒絶を受けることは当然のことであり、時間とともに体内から排除されてしまう。免疫抑制剤を併用することは臓器移植の場合と同様に一つの解決手段となるが、免疫抑制剤による副作用と永続的な使用が大きな負担となり、望ましい解決手段ではない。

そこで、免疫抑制剤を用いずに免疫反応を逃れる方法が求められていた。一つの方法として免疫隔離膜という選択透過性の膜が、主に糖尿病治療を想定した膵島移植用デバイスとして研究されてきた。例えば、特許文献５には、インスリンを産生する膵島を移植するための免疫隔離膜デバイスが開示されているが、ＭＳＣを移植する方法は開示されていない。

また、特許文献６には、生物活性物質を、それを必要とする対象に提供する埋め込み可能なデバイスであって、生物活性物質を産生可能な1種または複数の細胞をカプセル化している生体適合性の半透性ポーチと接触している微小血管構造体を備えたデバイスが記載されている。特許文献６記載のデバイスは、移植細胞の生存能及び機能を向上させるためのものであり、免疫隔離デバイスでもよいことが記載されている。

特開２００９−７３２１号公報 特開２０１６−１３８０９２号公報 特許第５６０６００８号公報 特許第５２９０２８１号公報 特表平７−５０８１８７号公報 特表２００８−５４１９５３号公報

Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１７；４５：２０５−２２１

本発明は、宿主の細胞を透過させずに免疫拒絶反応からは保護された状態で、間葉系幹細胞による血管新生効果を十分に発揮できる血管新生剤、およびその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、間葉系幹細胞を免疫隔離膜に内包させることによって、免疫拒絶反応からは保護された状態で、間葉系幹細胞による血管新生効果を十分に発揮できる血管新生剤を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む血管新生剤。
（２）上記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、（１）に記載の血管新生剤。
（３）上記免疫隔離膜が、ポリマーを含む多孔質膜である、（１）または（２）に記載の血管新生剤。

（４）上記多孔質膜の最小孔径が０．０２μｍ〜１．５μｍである、（３）に記載の血管新生剤。
（５）上記多孔質膜の厚みが１０μｍ〜２５０μｍである、（３）または（４）に記載の血管新生剤。
（６）上記多孔質膜が、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、上記緻密部位から上記多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している、（３）から（５）の何れか一に記載の血管新生剤。

（７）上記緻密部位の厚みが０．５μｍ〜３０μｍである、（６）に記載の血管新生剤。
（８）上記多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比が３．０〜２０．０である、（３）から（７）の何れか一に記載の血管新生剤。
（９）上記多孔質膜が少なくとも一種のポリスルホンおよびポリビニルピロリドンを含む、（３）から（８）の何れか一に記載の血管新生剤。

（１０）間葉系幹細胞が、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の上記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも１個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体として、含まれている、（１）から（９）の何れか一に記載の血管新生剤。
（１１）上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、（１０）に記載の血管新生剤。
（１２）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、（１０）または（１１）に記載の血管新生剤。

（１３）上記生体親和性高分子ブロックが不定形である、（１０）から（１２）の何れか一に記載の血管新生剤。
（１４）上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１０）から（１３）の何れか一に記載の血管新生剤。
（１５） 間葉系幹細胞を免疫隔離膜で内包する工程を含む、（１）から（１４）の何れか一に記載の血管新生剤の製造方法。

さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１６）（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスを、血管新生を必要とする対象者に移植する工程を含む、血管新生方法。
（１７） 血管新生のための処置において使用するための細胞移植用デバイスであって、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイス。
（１８） 血管新生剤の製造のための、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスの使用。

本発明の血管新生剤は、免疫拒絶反応を生じる他家または異種の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を移植して、血管新生の促進を行う際に有用である。本発明によれば、ＭＳＣを宿主細胞から保護しながら、ＭＳＣによる血管新生効果を十分に発揮することができる。本発明によればさらに、血管新生剤の周囲に局所的かつ高効率で血管を新生させることができる。

図１は、条件Ａに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図２は、条件Ｂに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図３は、条件Ｃに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図４は、参考例８の多孔質膜の膜断面のＳＥＭ撮影写真を示す。 図５は、参考例８の多孔質膜の厚さ方向の孔径分布を示す。 図６は、細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）の作製方法を示す。 図７は、参考例１０の多孔質膜の膜断面のＳＥＭ撮影写真を示す。 図８は、参考例１０の多孔質膜の厚さ方向の孔径分布を示す。 図９は、参考例１２の多孔質膜の膜断面のＳＥＭ撮影写真を示す。 図１０は、参考例１２の多孔質膜の厚さ方向の孔径分布を示す。 図１１は、細胞構造体を含む細胞移植用デバイスを移植した組織標本を示す。 図１２は、細胞構造体のみを移植した組織標本を示す。 図１３は、細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）を移植した組織標本を示す。 図１４は、視野当たりの血管総面積の測定結果を示す。 図１５は、視野当たりの血管本数の測定結果を示す。 図１６は、視野当たりの血管総面積の測定結果を示す。 図１７は、視野当たりの血管本数の測定結果を示す。 図１８は、細胞構造体を含む細胞移植用デバイス、または細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの組織標本を示す。 図１９は、細胞移植用デバイスのみを移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの組織標本を示す。 図２０は、視野当たりの血管総面積の測定結果を示す。 図２１は、視野当たりの血管本数の測定結果を示す。

以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
本発明の血管新生剤は、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む。

本発明の血管新生剤は、血管新生剤の周囲に局所的に血管を新生させることができ、移植細胞による長期の治療効果を発揮することができる。なお、本発明の血管新生剤それ自体には、微小血管は含まれておらず、この点において特許文献６に記載されているデバイスとは相違する。なお、産業利用を考えた場合には、他人の細胞または組織を移植するのが現実的であるが、特許文献６のような構成品においては、微小血管自体が宿主の免疫反応による拒絶の対象となってしまう。これは微小血管が細胞を含む場合には特に顕著であり、特許文献６でもそのことを考慮して、同種同系を用いることが記載されている。しかし、同種同系とは実験動物として遺伝学的に制御された動物間でのみ成立するものであり、実用上、例えば人間を対象とした際には同系は存在せず、使うことが出来ない。一方、本発明の血管新生剤は、外部由来の微小血管を含まず、あくまでも新たな血管を宿主の細胞により作成させるため、そのような制約を受けずに使用することが出来る点で大きく異なる。

＜細胞＞
本発明で使用する細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。間葉系幹細胞の由来は特に限定されないが、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞がより好ましい。なお、間葉系幹細胞とは間葉系組織に存在する体性幹細胞をいい、間葉系組織に属する細胞への分化能を有する。間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓等の組織をいう。

＜細胞構造体＞
本発明において使用する細胞は、そのまま使用してもよいが、細胞構造体として使用してもよい。本明細書で言う細胞構造体とは、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。

（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。

リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）が好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。

化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記するリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。

生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」,vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ₄）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。

生体親和性高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。

生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server forin-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。

生体親和性高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。

（１−２）架橋
生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。

酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼまたはラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、並びにヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。

架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、特に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、最も好ましくは１２０℃〜２００℃である。

（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。

リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。

リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。

リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。

一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。

一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。

リコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５〜６０の間で均一でないことがより好ましい。
この最少アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中に好ましくは３〜５０個であり、さらに好ましくは４〜３０個であり、特に好ましくは５〜２０個であり、最も好ましくは１２個である。

リコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、リコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。リコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、好ましくは少なくとも４つのＲＧＤモチーフを含み、より好ましくは少なくとも６つのＲＧＤモチーフを含み、さらに好ましくは少なくとも８つのＲＧＤモチーフを含み、特に好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。

リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。

好ましくは、リコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_n］_m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。

より好ましくは、リコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）₆₃］₃−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。

繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型コラーゲンである。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。

リコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。

好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。

リコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである。

本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。

「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。

リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。

（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明においては、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用することができる。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。

本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ³以上５００ｍｇ／ｃｍ³以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ³以上４００ｍｇ／ｃｍ³以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ³以上２２０ｍｇ／ｃｍ³以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ³以上１５０ｍｇ／ｃｍ³以下である。

タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、および生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。

本明細書でいうタップ密度は、特に限定されないが、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ³）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。

本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。

生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、生体親和性高分子がＣＢＥ３の場合には、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ₃水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ₃水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５ｎｍ）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。

（式２） （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）

（式３） １−（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。

本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは６００％以上、最も好ましくは７００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、または２０００％以下である。

生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。

（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）

本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、より好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。

ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。

（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。

上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。

生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法としては、特に限定されないが、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥させることによっても得ることができる。例えば、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕し、生体親和性高分子ブロックを製造する場合には、粉砕前の多孔質体の空孔が、得られる生体親和性高分子ブロックの形状に影響を与えるため、上記の通り、凍結乾燥の条件を調整することにより、得られる生体親和性高分子ブロックの形状を調整することができる。

生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。

生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。これにより、製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。

工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。

好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。

好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。

工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。

工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。

本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。

（２）細胞構造体
細胞構造体は、上記した複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成され、物質透過能を有することとなる。

細胞構造体は、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。

また、高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。

なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではない。

細胞構造体の厚さまたは直径は、所望の大きさとすることができるが、下限としては、１００μｍ以上であることが好ましく、２１５μｍ以上であることがより好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さまたは直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さまたは直径の範囲として、好ましくは１００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下、より一層好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。

細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さまたは直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さまたは直径」とする。

細胞構造体においては、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの高分子ブロックの質量が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、さらに好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とすることにより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後記する培地に含まれる成分が挙げられる。

（３）細胞構造体の製造方法
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。なお、交互とは、完全な交互を意味するものではなく、例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞とが混合された状態を意味する。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。

用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。

上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、（ａ）別々に調製したモザイク細胞塊同士を融合させる、または（ｂ）分化培地または増殖培地下でボリュームアップさせる、などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。

例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地または増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。

上記別々に調製したモザイク細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。

＜免疫隔離膜＞
本明細書において、免疫隔離膜は免疫隔離のために用いられる膜を意味する。
免疫隔離は免疫拒絶反応の防止方法である。一般的には、免疫隔離は移植の際のレシピエントの免疫拒絶反応を防止する方法の一つである。ここで、免疫拒絶反応は、移植される細胞構造体に対するレシピエントの拒絶反応である。免疫隔離により、レシピエントの免疫拒絶反応から細胞構造体が隔離される。免疫拒絶反応としては、細胞性免疫応答によるものおよび液性免疫応答によるものが挙げられる。

免疫隔離膜は酸素、水、グルコース等の栄養分は透過させ、免疫拒絶反応に関与する免疫細胞等の透過を阻止する選択透過性の膜である。免疫細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、各種Ｔ細胞、Ｂ細胞、その他リンパ球が挙げられる。
免疫隔離膜は、用途に応じ、免疫グロブリン（ＩｇＭまたはＩｇＧ等）および補体のような高分子量タンパク質の透過を阻止することが好ましく、インスリンなどの比較的低分子量の生理活性物質を透過させることが好ましい。

免疫隔離膜の選択透過性は用途に応じて調整すればよい。免疫隔離膜は、例えば、分子量５００ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、または５０ｋＤａ以上などの物質を遮断する選択透過性の膜であればよい。例えば、免疫隔離膜は、抗体の中で最も小さいＩｇＧ（分子量約１６０ｋＤａ）の透過を阻止できることが好ましい。また、免疫隔離膜は、球体としてのサイズとして直径５００ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、または１０ｎｍ以上などの物質を遮断する選択透過性の膜であればよい。

免疫隔離膜は、好ましくは、ポリマーを含む多孔質膜を含む。免疫隔離膜は、ポリマーを含む多孔質膜のみからなっていてもよく、または他の層を含んでいてもよい。他の層としては、ハイドロゲル膜が挙げられる。免疫隔離膜は、輸送等のために表面に容易に剥離可能な保護フィルムを有していてもよい。

免疫隔離膜の厚みは、特に限定されないが、１０μｍ〜５００μｍであればよく、２０μｍ〜３００μｍであることが好ましく、３０μｍ〜２５０μｍであることがより好ましい。

［多孔質膜］
（多孔質膜の構造）
多孔質膜は複数の孔を有する膜をいう。孔は例えば膜断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）撮影画像または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）撮影画像で確認することができる。
多孔質膜の厚みは、特に限定されないが、１０μｍ〜５００μｍであることが好ましく、１０μｍ〜３００μｍであることがより好ましく、１０μｍ〜２５０μｍであることがさらに好ましい。

好ましくは、多孔質膜は、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、この緻密部位から多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している。孔径は、後述する区分の平均孔径で判断するものとする。
膜の表面とは主表面（膜の面積を示すおもて面または裏面）を意味し、膜の端の厚み方向の面を意味するものではない。多孔質膜の表面は他の層との界面であってもよい。なお、免疫隔離膜において、多孔質膜は孔径または孔径分布（厚み方向での孔径の差異）などについて全面積において一様の構造を有していることが好ましい。

多孔質膜が孔径分布を有することにより、免疫隔離膜は、寿命を向上させることができる。実質的に異なる孔径の膜を用いて多段階の濾過を行なったような効果が得られ、膜の劣化を防止することができるからである。

孔径は電子顕微鏡によって得られた膜断面の写真から測定すればよい。多孔質膜はミクロトーム等により切断し、断面が観察できる薄膜の切片として、多孔質膜断面の写真を得ることができる。

本明細書において、膜の厚み方向の孔径の比較は、膜断面のＳＥＭ撮影写真を膜の厚み方向に分割して行なうものとする。分割数は膜の厚みから適宜選択できる。分割数は少なくとも５以上とし、例えば２００μｍ厚の膜では後述する表面Ｘから２０分割して行う。なお、分割幅の大きさは、膜における厚み方向の幅の大きさを意味し、写真での幅の大きさを意味するものではない。膜の厚み方向の孔径の比較において、孔径は、各区分の平均孔径として比較される。各区分の平均孔径は、例えば、膜断面図の各区分の５０個の孔の平均値であればよい。この場合の膜断面図は例えば８０μｍ幅（表面と平行な方向において８０μｍの距離）で得てもよい。このとき、孔が大きく、５０個測定できない区分については、その区分でとれる数だけ測定したものであればよい。また、このとき、孔が大きくその区分に収まるものでない場合は、ほかの区分にわたってその孔の大きさを計測する。

孔径が最小となる層状の緻密部位は、上記膜断面の区分のうちで平均孔径が最小となる区分に相当する多孔質膜の層状の部位をいう。緻密部位は１つの区分に相当する部位からなっていても、２つ、３つなどの、平均孔径が最小となる区分の１．１倍以内の平均孔径を有する複数の区分に相当する部位からなっていてもよい。緻密部位の厚みは、０.５μｍ〜５０μｍであればよく、０.５μｍ〜３０μｍであることが好ましい。本明細書において、緻密部位の平均孔径を多孔質膜の最小孔径とする。多孔質膜の最小孔径は、０．０２μｍ〜１．５μｍであることが好ましく、０．０２μｍ〜１．３μｍであることがより好ましい。このような多孔質膜の最小孔径で少なくとも通常の細胞の透過を阻止することができるからである。ここで、緻密部位の平均孔径はＡＳＴＭ Ｆ３１６−８０により測定したものとする。

多孔質膜は、緻密部位を内部に有する。内部とは膜の表面に接していないことを意味し、「緻密部位を内部に有する」とは、緻密部位が、膜のいずれかの表面にもっとも近い区分ではないことを意味する。免疫隔離膜においては、緻密部位を内部に有する構造の多孔質膜を用いることにより、同じ緻密部位を表面に接して有する多孔質膜を用いた場合よりも、透過させることが意図された物質の透過性が低下しにくい。いかなる理論にも拘泥するものではないが、緻密部位が内部にあることによりタンパク質の吸着が起こりにくくなっているためと考えられる。

緻密部位は、多孔質膜の厚みの中央部位よりもいずれか一方の表面側に偏っていることが好ましい。具体的には、緻密部位が多孔質膜のいずれか一方の表面から多孔質膜の厚みの５分の２以内の距離にあることが好ましく、３分の１以内の距離にあることがより好ましく、４分の１以内の距離にあることがさらに好ましい。この距離は上述の膜断面写真において判断すればよい。本明細書において、緻密部位がより近い側の多孔質膜の表面を「表面Ｘ」という。

多孔質膜においては緻密部位から少なくともいずれか一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している。多孔質膜において、緻密部位から表面Ｘに向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していてもよく、緻密部位から表面Ｘと反対側の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していてもよく、緻密部位から多孔質膜のいずれの表面に厚み方向で向かうときも孔径が連続的に増加していてもよい。これらのうち、少なくとも緻密部位から表面Ｘと反対側の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していることが好ましく、緻密部位から多孔質膜のいずれの表面に厚み方向で向かうときも孔径が連続的に増加していることがより好ましい。「厚み方向で孔径が連続的に増加」とは、厚み方向に隣り合う区分の間の平均孔径の差異が、最大平均孔径（最大孔径）と最小平均孔径（最小孔径）の差異の５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下となるように増加していることをいう。「連続的に増加」は、本質的には、減少がなく一律に増加することを意味するものであるが、減少している部位が偶発的に生じていてもよい。例えば、区分を表面から２つずつ組み合わせたときに、組み合わせの平均値が、一律に増加（表面から緻密部位に向かう場合は一律に減少）している場合は、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。
厚み方向で孔径が連続的に増加する多孔質膜の構造は、例えば後述する製造方法により実現することができる。

多孔質膜の最大孔径は１．５μｍ超２５μｍ以下であることが好ましく、１．８μｍ〜２３μｍであることがより好ましく、２．０μｍ〜２１μｍであることがさらに好ましい。本明細書において、上記膜断面の区分のうちで平均孔径が最大となる区分のその平均孔径を多孔質膜の最大孔径とする。

緻密部の平均孔径と多孔質膜の最大孔径との比（多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比であって、最大孔径を最小孔径で割った値、本明細書において「異方性比」ということもある。）は、３以上が好ましく、４以上がより好ましく、５以上がさらに好ましい。緻密部位以外の平均孔径を大きくし、多孔質膜の物質透過性を高くするためである。また、異方性比は、２５以下であることが好ましく、２０以下であることがより好ましい。多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比は、例えば、３．０〜２０．０とすることができる。

平均孔径が最大となる区分は膜のいずれかの表面にもっとも近い区分またはその区分に接する区分であることが好ましい。
膜のいずれかの表面にもっとも近い区分においては、平均孔径が０．０５μｍ超２５μｍ以下であることが好ましく、０．０８μｍ超２３μｍ以下であることがより好ましく、０．５μｍ超２１μｍ以下であることがさらに好ましい。また、膜のいずれかの表面にもっとも近い区分の平均孔径の緻密部の平均孔径との比は、１．２以上２０以下であることが好ましく、１．５以上１５以下であることがより好ましく、２以上１３以下であることがさらに好ましい。

（多孔質膜の元素分布）
多孔質膜は、少なくとも一方の表面において、式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たすことが好ましい。
Ｂ／Ａ ≦ ０．７ （Ｉ）
Ａ ≧ ０．０１５ （ＩＩ）
式中、Ａは膜の表面におけるＣ元素（炭素原子）に対するＮ元素（窒素原子）の比率を示し、Ｂは同じ表面から３０ｎｍの深さにおけるＣ元素に対するＮ元素の比率を示す。
式（ＩＩ）は多孔質膜の少なくとも一方の表面に一定量以上のＮ元素が存在することを示すものであり、式（Ｉ）は多孔質膜中のＮ元素が表面３０ｎｍ未満に偏在していることを示しているものである。Ｎ元素は窒素含有ポリマーに由来することが好ましい。さらに、窒素含有ポリマーはポリビニルピロリドンであることが好ましい。

表面が式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たすことにより、多孔質膜の生体親和性、特に、式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たす表面側の生体親和性が高くなる。
多孔質膜は、いずれか一方のみの表面が、式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たしていてもよく、または両表面が式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たしていてもよいが、両表面が式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たしていることが好ましい。いずれか一方のみの表面が式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たす場合、その表面は、後述の移植用チャンバーにおいて、内側であっても、または外側であってもよいが、内側であることが好ましい。また、いずれか一方のみの表面が式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たす場合、式（Ｉ）および式（ＩＩ）を満たす表面は表面Ｘであることが好ましい。

本明細書において、膜表面のＣ元素に対するＮ元素の比率（Ａ値）および表面から３０ｎｍの深さにおけるＣ元素に対するＮ元素の比率（Ｂ値）は、ＸＰＳ測定結果を用いて算出したものとする。ＸＰＳ測定はＸ線光電子分光法であり、膜表面にＸ線を照射し、膜表面から放出される光電子の運動エネルギーを計測することで、膜表面を構成する元素の組成を分析する方法である。実施例に記載する単色化Ａｌ−Ｋα線を用いた条件で、スパッタ開始時の結果からＡ値を計算し、スパッタレートから測定した膜の表面から３０ｎｍであると計算される時間の結果からＢ値を計算するものとする。

Ｂ／Ａは０．０２以上であればよく、０．０３以上であることが好ましく、０，０５以上であることがより好ましい。
Ａは０．０５０以上であることが好ましく、０．０８０以上であることがより好ましい。また、Ａは０．２０以下であればよく、０．１５以下であることが好ましく、０．１０以下であることがより好ましい。
Ｂは０．００１〜０．１０であればよく、０．００２〜０．０８であることが好ましく、０．００３〜０．０７であることがより好ましい。

多孔質膜の元素分布、特にＮ元素の分布は、後述する多孔質膜の製造方法において、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間、凝固液の温度、浸漬時間、洗浄のためのジエチレングリコール浴の温度、洗浄のためのジエチレングリコール浴への浸漬時間、多孔質膜製造ラインの速度等によって制御することができる。なお、Ｎ元素の分布は、製膜原液中の含有水分量によっても制御することができる。

（多孔質膜の組成）
多孔質膜はポリマーを含む。多孔質膜は本質的にポリマーから構成されていることが好ましい。
多孔質膜を形成するポリマーは生体適合性であることが好ましい。ここで、「生体適合性」とは、無毒性、非アレルギー誘発性を含む意味であるが、ポリマーが生体内において被包化される性質を含むものではない。
ポリマーは数平均分子量（Ｍｎ）が１，０００〜１０，０００，０００であるものが好ましく、５，０００〜１，０００，０００であるものがより好ましい。

ポリマーの例としては、熱可塑性または熱硬化性のポリマーが挙げられる。ポリマーの具体的な例としては、ポリスルホン、セルロースアシレート、ニトロセルロース、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、スチレン−アクリロニトリルコポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー、エチレン−酢酸ビニルコポリマーのケン化物、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、オルガノシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリエステルカーボネート、オルガノポリシロキサン、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンズイミダゾール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）等を挙げることができる。これらは、溶解性、光学的物性、電気的物性、強度、弾性等の観点から、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーやポリマーブレンド、ポリマーアロイとしてもよい。
これらのうち、ポリスルホン、セルロースアシレートが好ましく、ポリスルホンがより好ましい。

多孔質膜はポリマー以外の他の成分を添加剤として含んでいてもよい。
上記添加剤としては、食塩、塩化リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、塩化亜鉛等の無機酸の金属塩、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム等の有機酸の金属塩、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の高分子、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド等の高分子電解質、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルメチルタウリン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤等を挙げることができる。添加剤は多孔質構造のための膨潤剤として作用していてもよい。

多孔質膜は単一の層として1つの組成物から形成された膜であることが好ましく、複数層の積層構造ではないことが好ましい。

（多孔質膜の製造方法）
多孔質膜の製造方法は、上述の構造の多孔質膜が形成できる限り、特に限定されず、通常のポリマー膜形成方法をいずれも用いることができる。ポリマー膜形成方法としては延伸法および流延法などが挙げられる。
例えば、流延法においては、製膜原液に用いる溶媒の種類および量や流延後の乾燥方法を調節することにより上述の構造を有する多孔質膜を作製することができる。

流延法による多孔質膜の製造は、例えば以下（１）〜（４）をこの順で含む方法で行なうことができる。
（１）ポリマー、必要に応じて添加剤、および必要に応じて溶媒を含む製膜原液を溶解状態で支持体上に流延する。
（２）流延された液膜の表面に調温湿風を当てる。
（３）調温湿風を当てた後に得られる膜を凝固液に浸漬する。
（４）必要に応じて支持体を剥離する。

調温湿風の温度は、４℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４０℃であればよい。調温湿風の相対湿度は、３０％〜７０％、好ましくは４０％〜５０％であればよい。調温湿風の絶対湿度は、１．２〜６０５ｇ／ｋｇ空気であることが好ましく、２．４〜３００ｇ／ｋｇ空気であることがより好ましい。調温湿風は、０.１ｍ／秒〜１０ｍ／秒の風速で０.１秒間〜３０秒間、好ましくは１秒間〜１０秒間、当てていればよい。
緻密部位の平均孔径および位置は、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間によって制御することができる。なお、緻密部位の平均孔径は、製膜原液中の含有水分量によっても制御することができる。

上記のように液膜の表面に調温湿風を当てることによって、溶媒の蒸発の制御を行い、液膜の表面から内部に向かってコアセルベーションを起こすことができる。この状態でポリマーの溶解性が低いがポリマーの溶媒に相溶性を有する溶媒を収容する凝固液に浸漬することによって、上記のコアセルベーション相を微細孔として固定させ微細孔以外の細孔も形成することができる。

上記の凝固液に浸漬する過程において凝固液の温度は−１０℃〜８０℃であればよい。この間で温度を変化させることによって、緻密部位より支持体面側におけるコアセルベーション相の形成から凝固に至るまでの時間を調節し、支持体面側に至るまでの孔径の大きさを制御することが可能である。凝固液の温度を高くすると、コアセルベーション相の形成が早くなり凝固に至るまでの時間が長くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりやすい。一方、凝固液の温度を低くすると、コアセルベーション相の形成が遅くなり凝固に至るまでの時間が短くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりにくい。

支持体としては、プラスチックフィルムまたはガラス板を用いればよい。プラスチックフィルムの材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などのポリエステル、ポリカーボネート、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、ポリアミド、ポリオレフィン、セルロース誘導体、シリコーンなどが挙げられる。支持体としてはガラス板またはＰＥＴが好ましく、ＰＥＴがより好ましい。

製膜原液は溶媒を含んでいてもよい。溶媒は使用するポリマーに応じて、使用するポリマーの溶解性が高い溶媒（以下、「良溶媒」ということがある）を用いればよい。良溶媒は、凝固液に浸漬した場合速やかに凝固液と置換されるものが好ましい。溶媒の例としては、ポリマーがポリスルホン等の場合、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがポリアクリロニトリル等の場合、ジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがポリアミド等の場合にはジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがセルロースアセテート等の場合はアセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンあるいはこれらの混合溶媒が挙げられる。

製膜原液は良溶媒のほか、ポリマーの溶解性が低いがポリマーの溶媒に相溶性を有する溶媒（以下、「非溶媒」ということがある）を用いることが好ましい。非溶媒としては、水、セルソルブ類、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。

製膜原液としてのポリマー濃度は、５質量％以上３５質量％以下、好ましくは１０質量％以上３０質量％以下であればよい。３５質量％以下であることにより、得られる多孔質膜に十分な透過性（例えば水の透過性）を与えることができ、５質量％以上とすることにより選択的に物質を透過する多孔質膜の形成を担保することができる。添加剤の添加量は添加によって製膜原液の均一性が失われることが無い限り特に制限は無いが、通常溶媒に対して０．５質量％以上１０質量％以下である。製膜原液が非溶媒と良溶媒とを含む場合、非溶媒の良溶媒に対する割合は、混合液が均一状態を保てる範囲であれば特に制限はないが、１．０質量％〜５０質量％が好ましく、２．０質量％〜３０質量％がより好ましく、３．０質量％〜１０質量％がさらに好ましい。

凝固液としては、用いられるポリマーの溶解度が低い溶媒を用いることが好ましい。このような溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのグリコール類；エーテル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；グリセリン等のグリセロール類などが挙げられる。好ましい凝固液の例としては、水、アルコール類またはこれらの２種以上の混合物が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。

凝固液への浸漬の後、使用した凝固液とは異なる溶媒で洗浄を行なうことも好ましい。洗浄は、溶媒に浸漬することにより行なうことができる。洗浄溶媒としてはジエチレングリコールが好ましい。洗浄溶媒としてジエチレングリコールを用い、フィルムを浸漬するジエチレングリコールの温度および浸漬時間のいずれか一方または双方を調節することにより、多孔質膜中のＮ元素の分布を調節できる。特に、多孔質膜の製膜原液にポリビニルピロリドンを用いる場合において、ポリビニルピロリドンの膜への残量を制御することができる。ジエチレングリコールでの洗浄後さらに、水で洗浄してもよい。

多孔質膜の製膜原液としては、ポリスルホンおよびポリビニルピロリドンをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解して水を加えてなる製膜原液が好ましい。
多孔質膜の製造方法については、特開平４−３４９９２７号公報、特公平４−６８９６６号公報、特開平０４−３５１６４５号公報、特開２０１０−２３５８０８号公報等を参照することができる。

［他の層］
免疫隔離膜は多孔質膜以外の他の層を含んでいてもよい。他の層としては、ハイドロゲル膜が挙げられる。ハイドロゲル膜は、生体適合性であるものが好ましく、例としては、アルギン酸ゲル膜、アガロースゲル膜、ポリイソプロピルアクリルアミド膜、セルロースを含む膜、セルロース誘導体（例えばメチルセルロース）を含む膜、ポリビニルアルコール膜などが挙げられる。ハイドロゲル膜としては、アルギン酸ゲル膜が好ましい。アルギン酸ゲル膜の具体例としては、アルギン酸-ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸のポリイオンコンプレックス膜を挙げることができる。

＜血管新生剤の製造方法＞
本発明の血管新生剤は、間葉系幹細胞を免疫隔離膜で内包する工程を含む方法によって製造することができる。

本発明においては、免疫隔離膜は、間葉系幹細胞を内包するための移植用チャンバーの構成部材として用いられる。移植用チャンバーは、間葉系幹細胞をレシピエントに移植する際に、間葉系幹細胞を内包するための容器として用いられる。免疫隔離膜は移植用チャンバーの内部と外部とを形成する面の少なくとも一部に配置することができる。このように配置することにより、移植用チャンバーに内包される間葉系幹細胞を外部に存在する免疫細胞等から保護しつつ、水、酸素、グルコース等の栄養分を移植用チャンバーの外部から内部に取り込むことができる。

免疫隔離膜は移植用チャンバーの内部と外部とを形成する面の全面に配置されていてもよく、全面に対し、例えば、１〜９９％、５〜９０％、１０〜８０％、２０〜７０％、３０〜６０％、４０〜５０％等の面積に相当する一部に配置されていてもよい。免疫隔離膜が配置される面は１つの連続した部分であってもよく、２つ以上の部分に分かれていてもよい。

移植用チャンバーの形態は限定されず、袋状、バッグ状、チューブ状、マイクロカプセル状、太鼓状であればよい。例えば、太鼓状の移植用チャンバーはシリコーンリングの上下に免疫隔離膜を接着させて形成することができる。移植用チャンバーの形状は、血管新生剤としての使用の際に、レシピエント内における移動を防止できる形状であることが好ましい。移植用チャンバーの形状の具体例としては、円筒状、円盤状、矩形、卵型、星形、円形などが挙げられる。移植用チャンバーは、シート状、ストランド状、らせん状などであってもよい。移植用チャンバーは、細胞または細胞構造体を内包し、血管新生剤とした際に初めて上記の形状となるものであってもよい。

移植用チャンバーは、容器としての形状や強度を維持するための生体適合性プラスチック等を含んでいてもよい。例えば、移植用チャンバーの内部と外部とを形成する面が免疫隔離膜および免疫隔離膜に該当しない生体適合性プラスチックからなっていてもよい。または実質的に内部と外部とを形成する面の全面に免疫隔離膜が配置されている移植用チャンバーは、強度の観点からさらに内部と外部とを形成する面の外側に網状構造の生体適合性プラスチックが配置されていてもよい。

移植用チャンバーにおいては、多孔質膜の表面Ｘが内部側にあることが好ましい。すなわち、免疫隔離膜中の多孔質膜の緻密部位がより移植用チャンバーの内部に近くなるように、免疫隔離膜が配置されていることが好ましい。表面Ｘを移植用チャンバーの内部側にすることにより、生理活性物質の透過性をより高くすることができる。

＜血管新生剤＞
本発明の血管新生剤は、間葉系幹細胞および免疫隔離膜を含む。血管新生剤においては、免疫隔離膜に間葉系幹細胞が内包されている。

血管新生剤において、免疫隔離膜には、間葉系幹細胞（または間葉系幹細胞の細胞構造体）のみが内包されていてもよく、または、間葉系幹細胞（または間葉系幹細胞の細胞構造体）に加えて、それ以外の他の構成物または成分が内包されていてもよい。例えば、間葉系幹細胞（または間葉系幹細胞の細胞構造体）は、ハイドロゲルとともに、好ましくはハイドロゲルに内包された状態で、免疫隔離膜に内包されていてもよい。血管新生剤は、pH緩衝剤、無機塩、有機溶媒、アルブミンなどのタンパク質、ペプチドを含んでいてもよい。
血管新生剤において、間葉系幹細胞（または間葉系幹細胞の細胞構造体）は１種のみ含まれていてもよく、２種以上含まれていてもよい。

血管新生剤は、例えば、レシピエントの腹腔内または皮下などに移植されるものであればよい。本明細書において、レシピエントは移植を受ける生体を意味する。レシピエントは哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
血管新生剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。

＜各種の用途＞
本発明によれば、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスを、血管新生を必要とする対象者に移植する工程を含む、血管新生方法が提供される。
本発明によれば、血管新生のための処置において使用するための細胞移植用デバイスであって、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスが提供される。
本発明によれば、血管新生剤の製造のための、（Ａ）間葉系幹細胞、および（Ｂ）上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスの使用が提供される。
上記した各種用途において、好ましい態様は、前述と同様である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［参考例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造： ＧＡＰ［（ＧＸＹ）₆₃］₃Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G

［参考例２］ リコンビナントペプチド多孔質体の作製
［ＰＴＦＥ厚・円筒形容器］
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをＰＴＦＥ厚・円筒形容器と呼称する。

［アルミ硝子板・円筒形容器］
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。

［温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程］
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。

条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０⁵Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

条件Ｂ：
アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。
棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０⁵Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０⁵Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

［各凍結工程での温度測定］
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。

図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。

以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。

条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃

条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃

条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃

［参考例３］生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
参考例２で得られた条件Ａおよび条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。

以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。ＥおよびＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本実施例の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、ＥおよびＦでは性能に差が見られなかった。以下の参考例、実施例および比較例では、条件Ａ、サイズ５３〜１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。

［参考例４］生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ³）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ／ｃｍ³であった。

［参考例５］ 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
参考例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ₃水溶液（１ｍＬ）および１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。

＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ₃水溶液（１ｍＬ）および１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度（３４５ｎｍ）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。

（式２） （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）

（式３） １−（サンプル（式２）／未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。

その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。

［参考例６］ 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
参考例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。

（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）

その結果、参考例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。

[参考例７] 細胞構造体の作製
マウス脂肪由来間葉系幹細胞（ｍＡＤＳＣ）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有のＤ−ＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、最終的にｍＡＤＳＣ（１．２×１０⁸ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２５ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）ディッシュＴｙｐｅ９０３（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数〜約１，２００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。上記ディッシュをＣＯ₂インキュベーターで３７℃で４８時間静置することで、約１，２００個の均一な細胞構造体を取得した。

[参考例８]免疫隔離膜の作製と孔径評価
＜多孔質膜の作製＞
ポリスルホン（ソルベイ社製Ｐ３５００）１５質量部、ポリビニルピロリドン（日本触媒社製Ｋ−３０）１５質量部、塩化リチウム１質量部、および水２質量部をＮ-メチル-２-ピロリドン６７質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルム表面に乾燥厚み５０μｍとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に３０℃、相対湿度８０％ＲＨに調節した空気を２ｍ／秒で５秒間当てた。その後直ちに水を満たした６５℃の凝固液槽に浸漬した。ＰＥＴフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、８０℃のジエチレングリコール浴に１２０秒間つけ、その後純水で洗浄し、乾燥厚み５０μｍの多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。

＜バブルポイント評価＞
バブルポイントは、パームポロメータ（西華産業製 ＣＦＥ−１２００ＡＥＸ）を用いた細孔径分布測定試験において、ＧＡＬＷＩＣＫ（Ｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ社製）に完全に濡らした膜のサンプルに対して空気圧を５ｃｍ³／分で増大させて評価した。
参考例８の多孔質膜のバブルポイントは０．５８ｋｇ／ｃｍ²であった。

＜厚みおよび孔径評価＞
多孔質膜の厚みを膜断面のＳＥＭ撮影写真を用いて測定した。
多孔質膜の厚み方向の孔径の比較を、膜断面のＳＥＭ撮影写真を膜の厚み方向に２０分割したときの１９本の分割線における孔径の比較により行なった。分割線と交差するまたは接する孔を連続して５０個以上選択し、それぞれの孔径を測定し、平均値を算出して平均孔径とする。ここで、孔径は、選択された孔が分割線と交差する部分の長さではなく、膜断面のＳＥＭ撮影写真からデジタイザーで孔をなぞり面積を算出し、得られた面積を真円の面積として算出される直径を用いる。このとき、孔が大きく、５０個以上選択できない分割線については、膜断面を得るＳＥＭ撮影写真の視野を広げて５０個測定するものとする。得られた平均孔径を分割線ごとで比較することにより膜の厚み方向の孔径の比較を行なった。そのとき最も小さな平均孔径を緻密部位の平均孔径とした。

多孔質膜の緻密部位の厚みは以下の式から算出した。
（式）膜厚×[（最小孔径×１．３倍以内の孔径となる分割線の数）÷１９]

膜断面のＳＥＭ撮影写真を図４、厚さ方向の孔径分布を図５に示す。参考例８の多孔質膜の厚みおよび孔径評価の結果は以下であった。
多孔質膜の厚み：５５μｍ
緻密部位の平均孔径（多孔質膜の最小孔径の平均値）：０．８μｍ
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比：７．５
緻密部位の厚み：１０．５μｍ
図５より、参考例８の多孔質膜は、分割線No.5〜8が緻密部位であり、本明細書の段落番号００９７の定義から、分割線No.1〜5および分割線No.8〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。

[参考例９]細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）の作製
参考例８で作製したポリスルホン多孔質膜を３ｃｍ×５ｃｍに切り出した。製造時に空気を当てた側の面を内側にして２つ折りにした。
その後、富士インパルス社製茶袋シーラー（Ｔ−２３０Ｋ）を用い、３ｃｍ×２．５ｃｍの長方形の長辺２辺および短辺１辺の３辺を、２６０℃に加熱した。なお温度は熱電対で測定した。その後Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃポリエチレンチューブ（ＰＥ２００）の内側に金属棒を挿した状態で残った１辺に挿入し、その状態で同じシーラーを用いてそれぞれ、同じ温度で加熱した。その後、端部封止部の幅が１ｍｍになるように周囲部をナイフで切断し、１ｃｍ×２ｃｍとなるような細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）を作製した。作製方法を図６に示す。

[参考例１０]免疫隔離膜の作製と孔径評価
ポリスルホン（ソルベイ社製Ｐ３５００）１５質量部、ポリビニルピロリドン（日本触媒社製Ｋ−３０）１５質量部、塩化リチウム１質量部、および水２質量部をＮ-メチル-２-ピロリドン６７質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をＰＥＴフィルム表面に乾燥厚み８３μｍとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に３０℃、相対湿度５７％ＲＨに調節した空気を２ｍ／秒で５秒間当てた。その後直ちに水を満たした７０℃の凝固液槽に浸漬した。ＰＥＴフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、８０℃のジエチレングリコール浴に１２０秒間つけ、その後純水で洗浄し、多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。
参考例１０の多孔質膜のバブルポイントは0.66kg/cm²であった。

参考例８と同様に、厚みおよび孔径を評価した。膜断面のＳＥＭ撮影写真を図７、厚さ方向の孔径分布を図８に示す。参考例１０の多孔質膜の厚みおよび孔径評価の結果は以下であった。
多孔質膜の厚み：８５μｍ
緻密部位の平均孔径（多孔質膜の最小孔径の平均値）：０．７３μｍ
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比：１１．１
緻密部位の厚み：２１．８μｍ
図８より、参考例１０の多孔質膜は、分割線No.4〜8が緻密部位であり、本明細書の段落番号００９７の定義から、分割線No.1〜4および分割線No.8〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。

[参考例１１]細胞移植用デバイスの作製
多孔質膜として参考例８で作製したポリスルホン多孔質膜の代わりに参考例１０で作製したポリスルホン多孔質膜を用いて、参考例９と同様に細胞移植用デバイスを作製した。

［参考例１２］免疫隔離膜の作製と孔径評価
ポリスルホン（ソルベイ社製 Ｐ３５００）１８質量部、ポリビニルピロリドン（Ｋ−３０）１２質量部、塩化リチウム０．５質量部、水１質量部をＮ−メチル−２−ピロリドン６８．５質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をＰＥＴフィルム表面に乾燥厚み１３０μｍとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に３０℃、相対湿度５０％ＲＨに調節した空気を２ｍ／秒で５秒間当てた。その後直ちに水を満たした５０℃の凝固液槽に浸漬した。ＰＥＴフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、８０℃のジエチレングリコール浴に１２０秒間つけ、その後純水で洗浄し、多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。
参考例１２の多孔質膜のバブルポイントは１．３ｋｇ／ｃｍ²であった。

参考例８と同様に、厚みおよび孔径を評価した。膜断面のＳＥＭ撮影写真を図９、厚さ方向の孔径分布を図１０に示す。参考例１２の多孔質膜の厚みおよび孔径評価の結果は以下であった。
多孔質膜の厚み：１４２μｍ
緻密部位の平均孔径（多孔質膜の最小孔径の平均値）：０．４５μｍ
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比：１２．２
緻密部位の厚み：２７．４μｍ
図１０より、参考例１２の多孔質膜は、分割線No.2〜5が緻密部位であり、本明細書の段落番号００９７の定義から、分割線No.1〜2および分割線No.5〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。

[参考例１３]細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）の作製
多孔質膜として参考例８で作製したポリスルホン多孔質膜の代わりに参考例１２で作製したポリスルホン多孔質膜を用いて、参考例９と同様に細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）を作製した。

[実施例１]生体内でのデバイス周囲への血管誘導能評価
参考例９、１１および１３で作製した細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）に参考例７で作製したｍＡＤＳＣの細胞構造体を１，６００個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイス（血管新生剤）を完成させた。それらを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背部皮下に埋植し、２週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。２個体に移植した代表的な組織標本を図１１に示した。その結果、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞構造体を含む細胞移植用デバイスでは、デバイス近傍に局所的に多数の新生血管が誘導されていることが分かった。

[比較例１]生体内でのデバイス周囲への血管誘導能評価
参考例７で作製したｍＡＤＳＣの細胞構造体のみをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背部皮下に埋植し、２週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。２個体に移植した代表的な組織標本を図１２に示した。その結果、間葉系幹細胞（ｍＡＤＳＣ）の細胞構造体のみでは、新生血管はランダムな部位に誘導された。

[比較例２]生体内でのデバイス周囲への血管誘導能評価
参考例９、１１、１３で作製した細胞移植用デバイスをNOD/SCIDマウスの背部皮下に埋植し、２週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。２個体に移植した代表的な組織標本を図１３に示した。その結果、間葉系幹細胞（ｍＡＤＳＣ）の細胞構造体を含まない細胞移植用デバイスでは、新生血管の誘導は非常に少ないことが分かった。

［実施例２］
実施例１および比較例１、２の結果について、視野当りの血管の総面積、および視野当りの血管本数で定量評価を行った。評価に当たっては４個体のデータを解析し、平均値と標準偏差を算出した。結果、「細胞構造体＋細胞移植用デバイス」（実施例１）の移植結果では、デバイスの周囲において、視野当りの血管総面積が１３，３９１±４，３２９μｍ²で、視野当りの血管本数が２８．５±７．０本となった。一方で「細胞構造体のみ」（比較例１）の移植結果では、視野当りの血管総面積が１，５７１±１，２６４μｍ²で、視野当りの血管本数が８．０±３．２本となった。「細胞移植用デバイスのみ」（比較例２）の移植結果では、視野当りの血管総面積が３，５１９±３，８２６μｍ²で、視野当りの血管本数が８．５±７．１本となった。このことから、「細胞構造体＋細胞移植用デバイス」では、「細胞構造体のみ」または「細胞移植用デバイスのみ」に比べて、デバイス周囲において顕著に多くの新生血管を誘導していることが定量的にも明らかとなった。図１４〜１７を参照。尚、統計学的解析についてもｔ検定により、血管総面積の評価結果、血管本数の評価結果いずれとも、「細胞構造体のみ」または「細胞移植用デバイスのみ」と「細胞構造体＋細胞移植用デバイス」では有意な差のあることが分かった。（ｐ＜０．０５）

［実施例３］生体内でのデバイス周囲への血管誘導能評価（レシピエント動物違い）
参考例９で作製した細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）に参考例７で作製したｍＡＤＳＣの細胞構造体を１，６００個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイスを完成させた。それらを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に埋植し、２週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。尚、参考例９で作製した細胞移植用デバイスのみを移植した場合と比較した組織標本を図１８に示した。その結果、細胞構造体を含む細胞移植用デバイスでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した場合でも、細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）を移植した場合と比べて、デバイス近傍に多数の新生血管が誘導されることが分かった。

[参考例１４] スフェロイドの作製
マウス脂肪由来間葉系幹細胞（ｍＡＤＳＣ）１．２×１０⁸ｃｅｌｌｓを１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有のＤ−ＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に４ｍLに懸濁された状態で、細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）ディッシュＴｙｐｅ９０３（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数〜約１，２００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。上記ディッシュをＣＯ₂インキュベーターで３７℃で４８時間静置することで、約１，２００個の均一なスフェロイドを取得した。

［実施例４］生体内でのデバイス周囲への血管誘導能評価
参考例９で作製した細胞移植用デバイス（免疫隔離膜のみ）に参考例１４で作製したｍＡＤＳＣのスフェロイドを１，６００個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイス（血管新生剤）を完成させた。それらを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に埋植し、２週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。２個体に移植した代表的な組織標本を図１９に示した。その結果、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞移植用デバイスでは、デバイス近傍に新生血管が誘導されることが分かった。

［実施例５］
実施例４の結果について、視野当りの血管の総面積、および視野当りの血管本数で定量評価を行った。評価に当たっては４個体のデータを解析し、平均値と標準偏差を算出した。結果、「細胞＋細胞移植用デバイス」（実施例４）の移植結果では、視野当りの血管総面積が５８７１±１０５３μｍ²で、視野当りの血管本数が１６±５．６本となった。実施例２および実施例４の結果から、「細胞＋細胞移植用デバイス」では「細胞移植用デバイスのみ」に比べて、多くの新生血管を誘導していることが明らかとなった（図２０および図２１を参照）。

Claims (15)

1. （Ａ）細胞構造体、および（Ｂ）前記細胞構造体を内包する免疫隔離膜、を含む血管新生剤であって、細胞構造体が、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の前記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも１個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体として、含まれている、血管新生剤。
2. 前記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の血管新生剤。
3. 前記免疫隔離膜が、ポリマーを含む多孔質膜である、請求項１または２に記載の血管新生剤。
4. 前記多孔質膜の最小孔径が０．０２μｍ〜１．５μｍである、請求項３に記載の血管新生剤。
5. 前記多孔質膜の厚みが１０μｍ〜２５０μｍである、請求項３または４に記載の血管新生剤。
6. 前記多孔質膜が、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、前記緻密部位から前記多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している、請求項３から５の何れか一項に記載の血管新生剤。
7. 前記緻密部位の厚みが０．５μｍ〜３０μｍである、請求項６に記載の血管新生剤。
8. 前記多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比が３．０〜２０．０である、請求項３から７の何れか一項に記載の血管新生剤。
9. 前記多孔質膜が少なくとも一種のポリスルホンおよびポリビニルピロリドンを含む、請求項３から８の何れか一項に記載の血管新生剤。
10. 多孔質膜が熱可塑性または熱硬化性のポリマーを含む、請求項３から９の何れか一項に記載の血管新生剤。
11. 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、請求項１から１０の何れか一項に記載の血管新生剤。
12. 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項１から１１の何れか一項に記載の血管新生剤。
13. 前記生体親和性高分子ブロックが不定形である、請求項１から１２の何れか一項に記載の血管新生剤。
14. 前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の血管新生剤。
15. 細胞構造体を免疫隔離膜で内包する工程を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の血管新生剤の製造方法。

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