JP6861438B2 - Ｅｔｓ転写因子を発現する改変内皮細胞 - Google Patents

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１９４，４６６号の優先権を主張し、該仮特許出願の内容は、参照によりその全体が本書に組み込まれる。

参照による組み込み
参照による組み込みが認められる管轄のためには、本開示で引用される参照文献は全て、それらの全体が参照により本書に組み込まれる。さらに、本書中で引用または言及する製品についての製造者の指示書またはカタログはいずれも、参照により本書に組み込まれる。参照により本書に組み込まれる文書、またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。米国特許第８，４６５，７３２号に示される一般的な教示の多くを、本発明に関連して用いることができるか、または本発明に用いるために適応させることができる。したがって、米国特許第８，４６５，７３２号の全内容が、参照により本出願に明らかに組み込まれる。

背景
ＥＴＶ２（Lee et al., Cell stem cell, 2: 497-507 (2008)、Sumanas et al., Blood, 111: 4500-4510 (2008)）、ＦＬＩ１（Liu et al., Current Bio. 18: 1234-1240 (2008)）およびＥＲＧ（McLaughlin et al., Blood, 98: 3332-3339 (2001)）を含む、Ｅ−２６ファミリーあるいは「ＥＴＳ」ファミリーの転写因子（ＴＦ）の成員は、血管発生および血管形成の調節に関連付けられている（De Val et al., Dev Cell, 16: 180-195 (2009)；Sato et al., Cell Struct Funct, 26: 19-24 (2001)）。これらのＴＦは、内皮細胞（ＥＣ）の発生および機能に関連する遺伝子の発現を直接的に調節する。成体ＥＣは、ＦＬＩ１、ＥＲＧ（アイソフォーム１および２）、ＥＴＳＪ、ＥＴＳ２、Ｅｌｆｌ、Ｅｌｋｌ、ＶＥＺＦおよびＥＴＶ６などの幾つかのＥＴＳ因子を構成的に発現するが、ＥＴＶ２は、胚発生中に一過的に発現され、成体ＥＣには存在しない（Kataoka et al., Blood, 118: 6975-6986 (2011)；Lelievre et al., The International Journal Of Biochemistry & Cell Biology, 33: 391-407 (2001)）。発生中の血管の特異化において重要な役割を果たす（Liu et al., Circ Res, 103: 1147-1154 (2008)；Pham et al., Dev Biol, 303: 772-783 (2007)）他に、これらのＴＦの幾つかの一過的な発現は、多能性幹細胞を内皮細胞へ再プログラミングすることができるか、または他の（非多能性）細胞型を内皮細胞へ再プログラミング／分化転換することができることも示されている（例えば、Choi et al., Stem Cells 27, 559-567 (2009)、James et al., Nat. Biotech. 28, 161-166 (2010)、Prasain et al., Nat. Biotech. 32, 1151-1157 (2014)、Morita et al., PNAS, 112, 160-165 (2015)、Kurian et al., Nat. Methods 10, 77-83 (2013)、およびGinsberg et al., Cell, 151: 559-575を参照）。しかしながら、本発明者らが知る限りでは、本発明より前には、ＥＴＳファミリーの転写因子、特にＥＴＶ２転写因子は、分化した内皮細胞、またはすでに内皮細胞系列への分化が方向付けられた内皮細胞に対して作用するとは考えられていなかった。同じく本発明より前には、本発明者らが知る限りでは、かかる因子を発現する内皮細胞が、幹細胞および前駆細胞などの他の細胞型の増殖を支持する能力に関して高められた性質を有し得るとの予測もなされていなかった。

アデノウイルス初期４（Ｅ４）領域は、少なくとも６つのオープンリーディングフレームを含有する（Ｅ４ＯＲＦ）。Ｅ４領域全体は、内皮細胞の血管形成を調節し生存を促進することが示されている（Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66を参照）。また、Ｅ４領域全体の中で、内皮細胞におけるこれら生物学的効果に関与するのは、Ｅ４ＯＲＦ１配列であることも示されている。例えば、米国特許第８，４６５，７３２号を参照されたい。また、Seandel et al. (2008), "Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene," PNAS, 105(49):19288-93を参照されたい。

発明の概要
本発明は、一つには、ＥＴＳ転写因子ＥＴＶ２は、内皮細胞において発現されると、特にアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドと同時発現されると、ある予測されなかった効果を示す、という発見に基づく。Ｅ４ＯＲＦ１発現内皮細胞は、血清の非存在下でさえ、培養中に長期間維持することができること、および造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）などの他の細胞型の培養の支持のために使用できることがすでに知られていたが（Kobayashi et al., Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010)；Butler et al., Blood 120, 1344-1347 (2012)を参照）、ここでは、Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２の両方を発現する改変内皮細胞（即ち、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞）もまた、ＨＳＰＣ増殖を支持できること、さらに、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮細胞と同時培養すると、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞またはＥＴＶ２＋内皮細胞のいずれかを使用する場合と比較して、より原始的なＨＳＰＣ集団の選択的増殖がもたらされ得ることが発見された。これらの発見に基づき、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞、該細胞を含む組成物、ならびに該細胞を生成および使用する様々な方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞の集団、即ちアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドおよびＥＴＳ転写因子ポリペプチドを発現する改変内皮細胞の集団を提供する。適切なＥＴＳ転写因子ポリペプチドとしては、ＦＬＩ１、ＥＲＧ（アイソフォーム１および２）、ＥＴＳＪ、ＥＴＳ２、Ｅｌｆｌ、Ｅｌｋｌ、ＶＥＺＦ、ＥＴＶ６およびＥＴＶ２が挙げられる。好ましい実施形態では、ＥＴＳ転写因子は、ＥＴＶ２である。したがって、１つの好ましい実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞の集団を提供する。幾つかのかかる実施形態では、改変内皮細胞は、挙げられた分子をコードする組換え核酸分子、例えば、ＥＴＳ転写因子ポリペプチド、またはＥＴＶ２ポリペプチド、またはＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む。幾つかのかかる実施形態では、組換え核酸分子は、プラスミドベクターの形態で存在する。幾つかのかかる実施形態では、組換え核酸分子は、改変内皮細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞の集団は、単離細胞集団である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞の集団は、実質的に純粋な細胞集団である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞の集団は、インビトロに、例えば細胞培養物中に存在する。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞の集団は、インビボに、例えば生存対象中に存在する。

本発明の幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、分化した内皮細胞に由来する。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、成体内皮細胞に由来する。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、胚内皮細胞ではないか、または胚内皮細胞に由来しない。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、ヒト内皮細胞に由来する。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、初代内皮細胞に由来する。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に由来する。

幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する様々な内皮細胞集団を含む組成物を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、本明細書中に記載されるような改変内皮細胞の集団を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、生理食塩水などの担体溶液を含んでもよい。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）を包含するがそれに限定されない幹細胞または前駆細胞などの他の細胞型を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ＨＳＰＣは、遺伝的に修飾されている。幾つかの実施形態では、本発明が提供する組成物は、処置用組成物であり、細胞、担体溶液および／または他の構成成分（ヒト対象などの生存対象への投与に適するもの）を含む。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、ＨＳＰＣ移植術などの細胞移植術において使用し得る。

組成物（例えば処置用組成物）がＨＳＰＣを含む実施形態では、ＨＳＰＣは、任意の適切な供給源から得るか、またはそれに由来し得る。例えば、一実施形態では、ＨＳＰＣは、骨髄から得るか、または骨髄に由来する。別の実施形態では、ＨＳＰＣは、末梢血から得るか、または末梢血に由来する。別の実施形態では、ＨＳＰＣは、羊水から得るか、または羊水に由来する。さらに別の実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血から得る。

幾つかの実施形態では、本発明は、培養において内皮細胞を維持するかまたは増殖させる方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、培養において内皮細胞を維持するかまたは増殖させる方法であって、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードする核酸分子およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を内皮細胞へ導入して、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞を作ること（ここで、該改変内皮細胞は、培養において維持するかまたは増殖させることができる）、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、上述の転写因子の導入は、持続的な効果を有し得、かつ、例えば誘導プラスミド、精製タンパク質またはペプチド模倣体による発現によって、一過的に必要とされるのみであり得る。好ましい実施形態では、ＥＴＳ転写因子はＥＴＶ２であり、作られる改変内皮細胞はＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞である。また、かかる方法はいずれも、続いて改変内皮細胞を培養することを含み得る。幾つかの実施形態では、かかる培養は、血清の非存在下で、または外因性増殖因子の非存在下で、または血清および外因性増殖因子の両方の非存在下で行い得る。幾つかの実施形態では、様々な核酸分子を「導入する」工程は、トランスフェクション、例えばリポソームによるトランスフェクション、ポリブレンによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、または微粒子銃によって行う。他の実施形態では、様々な核酸分子を「導入する」工程は、ウイルスによる形質導入、例えばレンチウイルスによる形質導入、アデノウイルスによる形質導入、レトロウイルスによる形質導入、アデノ随伴ウイルスによる形質導入、またはヘルペスウイルスによる形質導入によって行う。幾つかの実施形態では、様々な核酸分子を「導入する」工程は、１つまたは複数の遺伝子編集技術を使用して、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／または改変メガヌクレアーゼ再改変ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して行う。幾つかのかかる方法では、使用する内皮細胞は、初代内皮細胞である。幾つかのかかる方法では、使用する内皮細胞は、ＨＵＶＥＣなどのヒト内皮細胞である。

幾つかの実施形態では、本発明は、様々な同時培養方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、培養において「目的の細胞」の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞（例えば、好ましくはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞）の集団を得るかまたは作ること、および改変内皮細胞を、目的の細胞の集団と同じ培養容器中で培養すること、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、かかる同時培養方法は、血清の非存在下で、または外因性増殖因子の非存在下で、または血清および外因性増殖因子の両方の非存在下で行い得る。幾つかのかかる実施形態では、改変内皮細胞は、培養容器の表面上にフィーダー細胞層を形成する。「目的の細胞」は、内皮細胞との同時培養を行うことが望ましい任意の細胞であり得る。例えば、一実施形態では、目的の細胞は、がん細胞、幹細胞、前駆細胞またはハイブリドーマ細胞であり得る。１つの好ましい実施形態では、目的の細胞は、ＨＳＰＣである。重要なことに、本明細書中に記載する同時培養方法は、幾つかの他の方法と比較した場合にＨＳＰＣの増殖の改善をもたらすことができ、かつ、幾つかの他の方法と比較した場合に、より原始的なＨＳＰＣのより大きな増殖をもたらすことができることがわかった。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する同時培養方法は、ＣＤ４５ＲＡ−ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋ｈｉｇｈ，ＣＤ４５ＲＡ−ＨＳＰＣ、およびＣＤ３４＋ｈｉｇｈ，ＣＤ３８−ｌｏｗ，Ｌｉｎ−ＨＳＰＣなどの、より原始的なＨＳＰＣを増殖させるために使用し得る。

幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の改変内皮細胞から得た馴化培地を用いる培養方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、目的の細胞の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞（例えば、好ましくはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞）の集団の培養から馴化培地を得ること、および、目的の細胞を馴化培地と接触させること、を含む方法を提供する。同様に、一実施形態では、本発明は、目的の細胞の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞（例えば、好ましくはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞）の集団を得るかまたは作ること、培養容器中で改変内皮細胞を培養すること、培養容器から馴化培地を収集すること、および、目的の細胞を馴化培地と接触させること、を含む方法を提供する。かかる方法はそれぞれ、続いて目的の細胞を培養することを含んでもよい。

同様に、幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の改変内皮細胞の培養から得る馴化細胞培養培地を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＳ＋改変内皮細胞（例えば、好ましくはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞）の培養から得る馴化細胞培養培地を提供する。

幾つかの実施形態では、本発明はまた、核酸ベクター分子を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む核酸ベクターを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする核酸配列、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む核酸ベクターを提供する。幾つかのかかる実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。幾つかのかかる実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかのかかる実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。幾つかのかかる実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、別個のプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、両方のヌクレオチド配列が、同じプロモーターの制御下にある。

本明細書中に記載する細胞集団、組成物および方法は、様々な用途において有用であり得る（本特許開示の他のセクションにてさらに記載するように）。概して、本明細書において提供される改変内皮細胞ならびに関連する組成物および方法は、他の内皮細胞（例えば、ナイーブ内皮細胞、またはＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞）が現在使用されているかまたは使用され得る任意の適用のために使用することができ、そのような適用は、基礎科学研究適用、細胞培養方法（同時培養方法を包含する）、標的の発見、薬物の発見、ならびに薬物の有効性、毒性および／または安全性試験を包含するが、それに限定されない。例えば、幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、他の細胞型の培養を促進するために、例えばＨＳＣなどの様々な型の幹細胞または前駆細胞の増殖のために使用し得る。幾つかの実施形態では、本明細書において提供される改変内皮細胞は、インビボ細胞移植術を包含するがこれに限定されない処置用途において有用であり得る。例えば、幾つかの実施形態では、改変内皮細胞それ自体を、単独で、あるいは１つまたは複数のさらなる細胞型（ＨＳＣなどの幹細胞または前駆細胞を包含するが、これに限定されない）と一緒に、対象に投与し得る。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本特許開示の他のセクションにおいてさらに記載される。さらに、当業者には明らかであろうが、本明細書中に記載する様々な実施形態のある特定の修飾および組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。

図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｃは、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−（図１Ａ）、Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋（図１Ｂ）、およびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋（図１Ｃ）改変内皮細胞の、継代８（形質導入後に７回継代）における位相差顕微鏡画像を示す。 図２Ａ〜２Ｃは、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−（図２Ａ）、Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋（図２Ｂ）、およびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋（図２Ｃ）内皮細胞の、ＨＳＰＣとの同時培養における１０日後の位相差顕微鏡画像を示す。 図３は、Ｅ４ＯＲＦ１単独（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−）、ＥＴＶ２単独（Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋）、またはＥ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２の両方（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋）（ｘ軸上にバーの表示により示す）のいずれかを発現するように改変された内皮細胞が、同時培養したＨＳＰＣに及ぼす影響を示す。細胞は、１０日間同時培養した。ｙ軸は、ＣＤ４５＋細胞の数に対するパーセンテージとして表されるＣＤ３４＋ＨＳＰＣの数を示す。

詳細な説明
本特許開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」のセクションは、本発明の主な実施形態の幾つかについて説明するものである。本「詳細な説明」のセクションは、本発明の組成物および方法に関するある特定のさらなる説明を提供するものであり、本特許開示の全ての他のセクションと併せて読まれることが意図される。さらに、当業者に明らかであるように、本特許開示全体にわたって記載される種々の実施形態は、多様な方法で組み合わせることができるか、または組み合わせられることが意図される。本明細書中に記載する特定の実施形態のかかる組み合わせは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

定義
ある特定の定義を以下に提供する。他の用語は、本特許開示の他の箇所で定義されるか、それらが使用される文脈から明確な意味を有するか、または当該技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用される。

本明細書中で使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、数値に関して使用する場合、記載する値の＋または−２０％以内を意味する。

「培養すること」という用語は本明細書中で使用する場合、様々な種類の培地上または培地中での細胞の繁殖を指す。「同時培養すること」は、様々な種類の培地上もしくは培地中での２つまたはそれ以上の異なる型の細胞の繁殖を指し、例えば、幾つかの実施形態では、内皮細胞および造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）が同時培養され得る。

本明細書中で使用する場合、「有効量」という用語は、本明細書中に記載されるような特定の作用物質または細胞集団（例えば、ＥＴＶ２またはＥ４ＯＲＦ１ポリペプチド、ＥＴＶ２またはＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子、またはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞の集団）の量であって、本明細書中に記載する成果の１つまたは複数において検出可能な効果を達成するのに十分である量を指す。例えば、内皮細胞におけるＥＴＶ２およびＥ４ＯＲＦ１の発現の場合、内皮細胞へ導入／デリバリーされるべき核酸分子（例えば、ベクター中のもの）の有効量は、任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１⁻ＥＴＶ２⁻内皮細胞）の内皮細胞生存または増殖と比較した場合に、内皮細胞生存または増殖の検出可能な増加をもたらす量であり得る。同時培養方法におけるＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮細胞の使用の場合、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮細胞の有効量は、同時培養される細胞の検出可能な増殖をもたらす量であるか、または任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１⁻ＥＴＶ２⁻内皮細胞）を用いて得られる増殖と比較した場合に、同時培養される細胞の増殖の増加をもたらす量であり得る。内皮細胞におけるＥＴＶ２および／またはＥ４ＯＲＦ１をコードする核酸分子の導入の場合、核酸分子（例えば、ベクター中のもの）の有効量は、任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１⁻ＥＴＶ２⁻細胞）の内皮細胞生存または増殖と比較した場合に、内皮細胞生存または増殖の検出可能な増加をもたらす量であり得る。Ｅ４ＯＲＦ１^＋ＥＴＶ２^＋内皮細胞を対象へ投与することを含む方法の場合、有効量は、任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１⁻ＥＴＶ２⁻内皮細胞）を投与したときと比較した場合に、１つまたは複数の望ましい生物学的または治療的指標の検出可能な改善（例えば、内皮細胞生着の改善、内皮／血管再生の改善、血管新生の改善、ＨＳＰＣなどの同時投与される細胞型の生存または生着の改善など）をもたらす量であり得る。任意の個々の場合における適切な「有効量」は、経験的に、例えば用量漸増研究などの当該技術分野において公知の標準的な技法を使用して、決定してもよく、計画される使用、計画されるデリバリー／投与様式、所望のデリバリー／投与頻度等のような因子を考慮して決定してもよい。さらに、「有効量」は、内皮細胞または同時培養される細胞の効果を評価するための、本特許開示の実施例のセクションに記載されるアッセイなどのアッセイを使用して決定してもよい。

「改変」という用語は、本明細書中で細胞に関して使用される場合、そこで記載される表現型（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１^＋ＥＴＶ２^＋）を生じるように、またはそこで記載される核酸分子もしくはポリペプチドを発現するように、人間によって改変された細胞を指す。「改変細胞」という用語は、自然に存在する細胞を包含することを意図せず、その代わりに、例えば、組換え核酸分子を含む細胞、または別の方法で人工的に（例えば、遺伝的修飾によって）変更された細胞（この変更は、例えば、細胞が、変更されなければ発現しないポリペプチドを発現するように、または細胞が、未改変の内皮細胞で観察されるよりも実質的に高いレベルでポリペプチドを発現するように、なされる）を包含することが意図される。

「増殖」または「増殖すること」という用語は、本明細書中で使用する場合、細胞または細胞培養の文脈では、初期集団の細胞からのある特定の型の細胞（例えば、内皮細胞またはＨＳＣ）の数の増加を指し、ここで初期集団の細胞は、同一であってもよいし、または同一でなくてもよい。増殖に使用される初期細胞は、増殖により生じる細胞と同じである必要はない。例えば、増殖細胞は、初期集団の細胞の成長および分化によって産生され得る。

「遺伝子修飾（遺伝的修飾）」または「遺伝子修飾された」は、細胞の正常なヌクレオチド配列に対する、任意の付加、欠失または破壊を指す。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する内皮細胞は、ＥＴＳ転写因子ポリペプチド（ＥＴＶ２など）をコードする核酸分子およびアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含有することに加えて、望ましい場合には、１つまたは複数の他の遺伝的修飾を含んでもよい。「遺伝子修飾（遺伝的修飾）」という用語は、遺伝子デリバリービヒクルの使用を含み、形質導入（インビボまたはインビトロのいずれかでの、ウイルスによるレシピエントへの核酸導入）、トランスフェクション（単離核酸の細胞による取込み）、リポソームによる導入、および当該技術分野で周知の他の手段を含むが、これらに限定されない。

「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄系樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球細胞を含む造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能な、クローン原性の自己再生多能性細胞を指す。造血系の他の細胞と同様に、ＨＳＣは、通常、細胞マーカーの特徴的なセットの存在によって規定される。

「造血幹細胞または前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、本明細書中で使用する場合、上記で定義するようなＨＳＣ、ならびに造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能である多能性非自己再生前駆細胞、および造血系のある特定の細胞型へ分化することが可能な寡能性(oligopotent)および単能性前駆細胞を包含する。ＨＳＰＣは、本明細書中で定義するようなＣＭＰ、ＭＰ、ＭＥＰおよびＧＭＰを含む。

本明細書中で使用する場合、「単離された」という用語は、生成物、化合物または組成物が、天然におけるか合成的にもたらされるかに関わらずその自然に生じる状態において伴う少なくとも１つの他の生成物、化合物または組成物から分離されていることを指す。

本明細書中で使用する場合、「組換え」という用語は、分子生物学および遺伝子工学（分子クローニングなど）の方法を使用して人間によって（機械によることを包含する）生成され、そうでなければ自然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。したがって、組換え核酸分子は、自然に（例えば生物のゲノム中に）存在する核酸分子と区別されるべきである。したがって、対応するゲノムＤＮＡ配列中に見出されるような介在イントロン配列を伴わない、ｍＲＮＡ配列の相補的ＤＮＡ、即ち「ｃＤＮＡ」のコピーを含む核酸分子は、組換え核酸分子とみなされ得る。例として、組換えＥ４ＯＲＦ１核酸分子は、Ｅ４ＯＲＦ１コード配列が、自然に存在するアデノウイルスゲノムにおいては通常連結されないプロモーターおよび／または他の遺伝子要素に作動可能に連結されたものを含み得る。同様に、組換えＥＴＶ２核酸分子は、ＥＴＶ２ ｃＤＮＡ配列（即ち、生物のゲノム中に自然には存在しない配列）を含み得、および／またはＥＴＶ２コード配列が、自然に存在するアデノウイルスゲノムにおいては通常連結されないプロモーターおよび／または他の遺伝子要素に作動可能に連結されたものを含み得る。

「自己再生」という用語は、分裂して親細胞と同一の（例えば、自己再生）特性を有する少なくとも１つの娘細胞を生成する、細胞の能力を指す。別の娘細胞は、特定の分化経路に進むものであり得る。例えば、自己再生造血幹細胞は、分裂して、娘幹細胞、および骨髄系またはリンパ系経路の分化に向かう別の娘細胞を形成する。委任前駆細胞は通常、自己再生能力を失っており、細胞分裂により、より分化の進んだ（即ち、限定された）表現型を示す２つの娘細胞を生成する。

「対象」または「患者」という用語は本明細書中で互換的に使用され、特に示されている場合を除いて、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよび他の哺乳動物種などの哺乳動物を指す。

「実質的に純粋」という語句は、細胞集団に関して本明細書中で使用する場合、総細胞集団を構成する細胞のうち、ある特定の型（例えば、１つもしくは複数の特定の細胞マーカーの発現、形態学的特性、または機能的特性によって決定される）の細胞、または２つもしくはそれ以上の異なる細胞型が一緒に使用される実施形態において複数の特定の型の細胞の集団の占める割合が、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％であることを指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」は、細胞集団において、特定の型でない細胞の占める割合が、約５０％よりも少ない、好ましくは約２０〜２５％よりも少ない、より好ましくは約１０〜１５％よりも少ない、最も好ましくは約５％よりも少ないことを指す。

核酸分子およびポリペプチド
本明細書中に記載する本発明の実施形態の幾つかは、Ｅ４ＯＲＦ１＋、ＥＴＳ＋、および／またはＥＴＶ２＋である改変内皮細胞を含む。Ｅ４ＯＲＦ１＋細胞は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを発現する。ＥＴＳ＋細胞は、ＥＴＳ転写因子ポリペプチド（ＥＴＶ２転写因子ポリペプチドなど）を発現する。ＥＴＶ２＋細胞は、ＥＴＶ２転写因子ポリペプチドを発現する。これらのポリペプチドは、本明細書中ではまとめて「本発明のポリペプチド」と称される。

「本発明のポリペプチド」は、核酸分子によってコードされる。したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードする核酸分子、および／またはＥＴＶ２転写因子ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。かかる核酸分子は、本明細書中ではまとめて「本発明の核酸分子」と称される。

本発明のポリペプチドおよび本発明の核酸分子は、本明細書中に記載されるかまたは当該技術分野で公知であるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有してもよく、あるいはかかるアミノ酸またはヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体または断片であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有してもよいが、但し、かかる変異体、誘導体、突然変異体または断片は、本明細書中に記載する機能的特性［これには、（例えば無血清条件下に）培養において内皮細胞の維持または増殖を支持する能力、および／または培養において別の細胞型（例えばＨＳＰＣ）の増殖を支持する能力が包含されるが、それらに限定されない］の１つまたは複数を有するものであるか、またはそれを有するポリペプチドをコードするものである。

ＥＴＶ２ポリペプチドなどのＥＴＳ転写因子ポリペプチドを含む実施形態では、ポリペプチドは、ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、ヤギまたはブタポリペプチドなどの、任意の哺乳動物ＥＴＳ転写因子ポリペプチドであり得る。幾つかの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ヒトポリペプチドであり得る。かかるポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードする核酸配列は、当該技術分野において周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの周知の公的に利用可能なデータベースにおいて入手可能である。

アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを含む実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス２、３、５、７、９、１１、１２、１４、３４、３５、４６、５０または５２型などの任意の適切なアデノウイルス型または株に由来し得る。幾つかの好ましい実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス５型に由来する。かかるアデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードする核酸配列は、当該技術分野において周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの周知の公的に利用可能なデータベースにおいて入手可能である。例えば、適切な配列として、下記が挙げられる：ヒトアデノウイルス９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＩ０５９９１）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ８９９７７）、ヒトアデノウイルス４６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＸ７０９４６）、ヒトアデノウイルス５２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＫ３５０６５）、ヒトアデノウイルス３４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５０８）、ヒトアデノウイルス１４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３１４６）、ヒトアデノウイルス５０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５５４）、ヒトアデノウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１９６）、ヒトアデノウイルス１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１４１）、ヒトアデノウイルス３５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００６０７）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５７０）、ヒトアデノウイルス１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５３３）、ヒトアデノウイルス１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００４７４）、ヒトアデノウイルス３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＢ １７７９２）、およびヒトアデノウイルス５型（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ１２５８７）。

幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、本明細書中に記載されるかまたは当該技術分野において（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの、公的な配列データベースにおいて）公知であるのと同じアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する。幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、かかる配列の変異体、誘導体、突然変異体または断片、例えばかかる配列に対して８５％よりも大きい配列同一性を有する変異体、誘導体、突然変異体または断片であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有し得る。幾つかの実施形態では、変異体、誘導体、突然変異体または断片は、公知の配列に対して約８５％の同一性、または公知の配列に対して約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、公知のヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体または断片であって、公知のヌクレオチド配列に対して、長さが、ヌクレオチド約５０個分、またはヌクレオチド約４５個分、またはヌクレオチド約４０個分、またはヌクレオチド約３５個分、またはヌクレオチド約３０個分、またはヌクレオチド約２８個分、ヌクレオチド２６個分、ヌクレオチド２４個分、ヌクレオチド２２個分、ヌクレオチド２０個分、ヌクレオチド１８個分、ヌクレオチド１６個分、ヌクレオチド１４個分、ヌクレオチド１２個分、ヌクレオチド１０個分、ヌクレオチド９個分、ヌクレオチド８個分、ヌクレオチド７個分、ヌクレオチド６個分、ヌクレオチド５個分、ヌクレオチド４個分、ヌクレオチド３個分、ヌクレオチド２個分、またはヌクレオチド１個分異なるものが使用される。幾つかの実施形態では、公知のアミノ酸配列の変異体、誘導体、突然変異体または断片であって、公知のアミノ酸配列に対して、長さが、アミノ酸約５０個分、またはアミノ酸約４５個分、またはアミノ酸約４０個分、またはアミノ酸約３５個分、またはアミノ酸約３０個分、またはアミノ酸約２８個分、アミノ酸２６個分、アミノ酸２４個分、アミノ酸２２個分、アミノ酸２０個分、アミノ酸１８個分、アミノ酸１６個分、アミノ酸１４個分、アミノ酸１２個分、アミノ酸１０個分、アミノ酸９個分、アミノ酸８個分、アミノ酸７個分、アミノ酸６個分、アミノ酸５個分、アミノ酸４個分、アミノ酸３個分、アミノ酸２個分、またはアミノ酸１個分異なるものが使用される。

Ｅ４ＯＲＦ１核酸またはアミノ酸配列が使用される実施形態において、いくつかの態様では、かかる配列は、アデノウイルスＥ４領域由来の他の配列を伴わずに使用され、例えば、Ｅ４領域全体のヌクレオチド配列の状況では使用されないか、またはＥ４領域によってコードされる他のポリペプチドと一緒に使用されない。しかしながら、幾つかの他の態様では、かかる配列は、Ｅ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４またはＥ４ＯＲＦ５配列などのＥ４領域由来の１つまたは複数の他の核酸またはアミノ酸配列、あるいはそれらの変異体、突然変異体または断片と併用され得る。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１配列は、他の配列、遺伝子またはコード領域（プロモーター、マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等など）を含有するコンストラクト（ウイルスベクターなど）中に使用され得るが、ある特定の実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１配列は、Ｅ４領域全体を含有しないかまたはＥ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４および／またはＥ４ＯＲＦ５などのＥ４領域全体に由来する他のＯＲＦを含有しないコンストラクト中に使用される。

本発明の核酸分子は、所望の用途に応じた様々な他の核酸配列、遺伝子もしくはコード領域［例えば、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子または発現タグ（例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列など）］、または望ましい可能性がある任意の他のヌクレオチド配列もしくは遺伝子を含有するコンストラクト中に使用され得る。本発明のポリペプチドは、単独で、または融合タンパク質の一部として発現させることができる。

幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、発現を可能にする１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり得る。所望の細胞型において核酸配列の発現を駆動することが可能な任意のプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬｔｒおよびＭＭＬプロモーターがあるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、アデノウイルスゲノム由来のプロモーター、またはその変異体であり得る。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１が使用される場合、プロモーターは、アデノウイルスにおける対応する遺伝子の発現の駆動に用いられるプロモーターであり得る。

幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、核酸配列の発現を必要に応じてオンまたはオフにすることができるように、誘導プロモーターの制御下に置くことができる。例えばテトラサイクリン誘導発現系またはホルモン誘導発現系などの任意の適切な誘導発現系を使用し得る。例えば、本発明の核酸分子は、必要な時に発現させることができ、続いて所望の成果が達成されたら（例えば内皮細胞の十分な成長または増殖が達成されたら）、オフに切り替えることができる。発現をオンまたはオフにする能力は、インビボ適用のために特に有用であり得る。

本発明の核酸分子は、自然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、例えば細胞内で安定であり、細胞内で直接にタンパク質発現／産生を導くのに使用され得る合成修飾ＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、本発明の核酸分子は、ＤＮＡを含み得る。ＤＮＡが使用される実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内で発現を可能にする（および／または促進、増強もしくは調節する）１つまたは複数の適切なプロモーターおよび／または調節性要素に作動可能に連結されてもよく、また、１つまたは複数の適切なベクターまたはコンストラクト中に存在してもよい。本発明のそれぞれの核酸分子は、同じ核酸コンストラクトに含ませて内皮細胞へ導入することができるか、または別個の核酸コンストラクトに含ませて導入することができる。

本発明の核酸分子は、トランスフェクション技術およびウイルスによる形質導入技術を包含するがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の適切な系を使用して、内皮細胞へ導入することができる。本発明に従って使用し得るトランスフェクション方法には、リポソームによるトランスフェクション、ポリブレンによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃があるが、これらに限定されない。使用し得るウイルスによる形質導入方法には、レンチウイルスによる形質導入、アデノウイルスによる形質導入、レトロウイルスによる形質導入、アデノ随伴ウイルスによる形質導入およびヘルペスウイルスによる形質導入があるが、これらに限定されない。

本発明はまた、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターを包含するベクターを提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。幾つかのかかる実施形態では、ＥＴＳ転写因子は、ＥＴＶ２である。幾つかのかかる実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態では、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、別個のプロモーターの制御下にある。幾つかの実施形態では、ＥＴＳ転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターの制御下にある（例えば、ＥＴＳ配列とＥ４ＯＲＦ１配列との間の内部リボソーム進入部位配列（ＩＲＥＳ）による）。

幾つかの実施形態では、ペプチド模倣体を使用し得る。ペプチド模倣体は、ポリペプチドを模倣するように設計された小タンパク質様鎖である。かかる分子は、本発明のポリペプチド（例えば、ＥＴＶ２またはＥ４ＯＲＦ１ポリペプチド）のいずれかを模倣するように設計され得る。ペプチドを修飾してペプチド模倣体を創出するか、またはペプチド模倣体を設計する多種多様な方法が、当該技術分野において公知であり、本発明のポリペプチドの１つのペプチド模倣体を創出するのに使用することができる。

本発明のポリペプチドおよび核酸分子の取扱い、操作および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来の技法を用いて行い得る。かかる技法は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989、Methods of Enzymologyのシリーズ (Academic Press, Inc.)、あるいはヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の取扱い、操作および発現において用いる適当な技術に関するガイダンスの任意の他の標準的な教本の教示を参照し得る。Ｅ４ＯＲＦ１配列の取扱いまたは発現に関するさらなる側面が、米国特許第８，４６５，７３２号に記載されており、その内容を引用により本明細書の一部とする。

内皮細胞
幾つかの実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞などの「改変内皮細胞」を提供する。改変内皮細胞は、当該技術分野で公知の内皮細胞の任意の適切な供給源に由来し得る。例えば、幾つかの実施形態では、内皮細胞は、血管内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代内皮細胞である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、ヒトもしくは非ヒト霊長類細胞、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタもしくは他の哺乳動物細胞などの、哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代ヒト内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ）である。使用し得る他の適切な内皮細胞は、米国特許第８，４６５，７３２号（その内容を引用により本明細書の一部とする）に、Ｅ４ＯＲＦ１発現に適していると記載されているものを包含する。

幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、特に挙げられる分子（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２）の発現に加えて、またそれとは別に、１つまたは複数の遺伝的修飾を含むように遺伝子修飾されている。例えば、かかる細胞は、内皮細胞を冒す疾患もしくは障害に関与するかまたは関与する疑いのある遺伝子を修正したもの、あるいは内皮細胞に供給するかまたは改変内皮細胞の使用によって投与もしくは送達することが望ましい可能性のある任意の他の遺伝子（例えば処置に有用な遺伝子）を含み得る。

本発明の改変内皮細胞は、様々な形態で存在し得るか、または様々な形態で提供され得る。例えば、幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、単離された細胞集団などの、細胞の集団を含み得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、インビトロの細胞の集団を含み得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、実質的に純粋な細胞の集団を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、総細胞集団を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を、本発明の改変内皮細胞が占め得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、改変細胞および１つまたは複数のさらなる構成成分を含有する組成物の形態で提供され得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載されるような改変内皮細胞の集団を、生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地などの担体溶液と共に含む組成物を提供し得る。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、改変内皮細胞の集団、およびヒト対象などの対象への投与に適する担体溶液を含む処置用組成物であり得る。望ましい場合には、他の処置上許容される作用物質を含ませることができる。当業者は、目的の用途に応じて、処置用組成物中に含ませるのに適した作用物質を容易に選択することができる。

幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、本発明の改変内皮細胞および１つまたは複数のさらなる細胞型を含有する組成物（例えば、処置用組成物）の形態で提供され得る。かかるさらなる細胞型は、例えば、改変内皮細胞の存在下で（例えば、本発明の改変内皮細胞を「フィーダー」細胞として使用して）維持、培養または増殖することができる細胞型、または本発明の改変内皮細胞と一緒に使用することが望ましい可能性がある任意の他の細胞型（例えば、インビトロモデル系における使用のため、または対象への同時投与における使用のため）であり得る。かかるさらなる細胞型の例には、改変内皮細胞を「フィーダー」細胞として使用して増殖させ得る造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）などの幹細胞または前駆細胞があるが、これに限定されない。本発明の改変内皮細胞と一緒に供給または使用され得る細胞の他の例は、米国特許第８，４６５，７３２号（その内容を引用により本明細書の一部とする）に記載されている。

方法および用途
本発明の改変内皮細胞は、多種多様な用途に使用することができる。同様に、かかる改変内皮細胞を作製するための本発明が提供する方法は、多種多様な状況において使用することができる。概して、本発明が提供する改変内皮細胞は、未改変内皮細胞が現在使用されているかもしくは使用され得る任意の用途、またはＥ４ＯＲＦ１発現内皮細胞が現在使用されているかもしくは使用され得る任意の用途、例えば米国特許第８，４６５，７３２号（その内容を引用により本明細書の一部とする）に記載される用途に使用することができる。例えば、改変内皮細胞は、研究目的で、および／または処置目的で、例えば、内皮細胞の投与が望ましい可能性がある疾患、障害または状態（例えば心筋虚血などの虚血状態）、あるいは血管新生の増加が有益であり得るかまたはそれによって軽減され得る他の状態（例えば創傷治癒）の治療または予防のために使用し得る。心筋虚血の処置の場合、細胞を、心臓に直接、または心臓の近傍に投与し得る。創傷の処置の場合、細胞を、創傷の部位（例えば皮膚創傷の場合は、皮膚）へ直接、または創傷の部位の近傍に投与し得る。細胞は、単回用量または複数回用量で投与し得る。当業者は、所望の用途に応じて、適切な投与方法を選択することができる。

幾つかの実施形態では、本発明は、処置を必要とする対象を、該対象へ有効量の本発明の改変内皮細胞（またはかかる改変内皮細胞を含む組成物）を投与することによって処置する方法などの、様々な処置方法を提供する。かかる処置方法では、細胞を、当該技術分野において公知の任意の適切な手段を使用して、対象に投与することができる。例えば、細胞を、所望の位置にて、注射または注入によって血流または組織へ投与することができる。例えば、血管系の疾患、障害または状態の処置の場合、本発明による改変細胞を、血管系の罹患領域へ直接に、またはその近傍に投与し得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞を、１つまたは複数のさらなる細胞型と一緒に投与し得る。かかるさらなる細胞型は、例えば、幹細胞または前駆細胞、例えばＨＳＰＣおよび遺伝的に修飾されていてもよい細胞型（例えば、遺伝的に修飾されたＨＳＰＣ）であり得る。改変内皮細胞は、単回用量または複数回用量で投与することができる。当業者は、所望の用途に応じて、適切な投与方法および適切な投薬レジメンを選択することができる。

幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、インビボで、例えば研究目的で、または処置用に、作製し得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、かかる対象に、ＥＴＳ転写因子ポリペプチド（例えば、ＥＴＶ２）をコードする核酸分子およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、適切なベクター中あるもの、および／または適切なプロモーターの制御下にあるもの）の両方を有効量で投与して、対象の内皮細胞がインビボで、かかる核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入されて改変内皮細胞になるようにすることを含む方法、などの、様々な処置方法を提供する。かかる方法では、ヌクレオチド分子を、当該技術分野において公知の任意の適切な手段を使用して、対象に投与し得る。例えば、ヌクレオチド分子（例えば、適切なベクター中の）を、所望の位置で、注射または注入によって血流または組織へ投与することができる。核酸分子を、単回用量または複数回用量で投与することができる。当業者は、所望の用途に応じて、適切な投与方法および適切な投薬レジメンを選択することができる。

幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、使用（例えば、処置のための使用）に先立って、複製できないように有糸分裂が不活性化される。これは、例えば、マイトマイシンＣなどの化学物質を使用することによって、または改変内皮細胞を照射することによって達成することができる。

細胞培養方法
細胞を培養する方法は、当該技術分野において周知であり、任意の適切な細胞培養方法を使用することができる。例えば、本発明の改変内皮細胞は、他の内皮細胞を培養するのに有用であることが知られている方法、または例えば米国特許第８，４６５，７３２号（その内容を引用により本明細書の一部とする）に記載されるような、Ｅ４ＯＲＦ１発現内皮細胞の培養に有用であることが知られている方法を使用して培養することができる。幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、血清の非存在下で、または外因性増殖因子の非存在下で、または血清および外因性増殖因子の両方の非存在下で培養し得る。また、本発明の改変内皮細胞は、冷凍保存し得る。R. Ian FreshneyによるCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000)（「Freshney」）（その内容を引用により本明細書の一部とする）に記載される方法などの、細胞培養および細胞冷凍保存のための様々な方法が当業者に公知である。

幾つかの実施形態では、本発明は、フィーダー細胞、馴化培地および細胞産物であって、本発明の改変内皮細胞を含むかまたはそれから誘導され、他の細胞型の生存または成長を支持する（例えば同時培養方法において）のに有用であり得るものを提供する。例えば、一実施形態では、改変内皮細胞の集団を、ＨＳＰＣおよび遺伝的に修飾されたＨＳＰＣなどの幹細胞または前駆細胞の成長を支持するフィーダー細胞として使用し得る。同様に、他の実施形態では、本発明は、本発明の改変内皮細胞の培養から得る馴化細胞培養培地、または本発明の改変内皮細胞の培養から得る細胞産物（例えば、総細胞溶解物、細胞分画、または特定の細胞産物）を提供し得る。

幾つかの実施形態では、本発明は、目的の細胞の集団を培養するための同時培養方法を提供する。かかる「目的の細胞」には、がん細胞（初代がん細胞、がん幹細胞およびがん細胞株など）、ハイブリドーマ細胞、幹細胞または前駆細胞（胚幹細胞、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、および任意の胎児または成体組織に由来する幹細胞、例えば造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、精原幹細胞、腸幹細胞、およびがん幹細胞など）、および通常フィーダー細胞を使用して培養するかまたはフィーダー細胞培養系を使用することが望ましい他の細胞型が包含されるが、これらに限定されない。かかる同時培養方法は、目的の細胞の集団、および本発明の改変内皮細胞の集団を、同じ培養容器中で一緒に培養することを含み得る。幾つかのかかる実施形態では、改変内皮細胞は、培養容器の表面上にフィーダー細胞層を形成し得、目的の細胞は、フィーダー細胞層上に配置され得る。別の実施形態では、本発明は、目的の細胞を培養する方法であって、目的の細胞の集団を、本発明の改変内皮細胞の培養から得る馴化培地と接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明はまた、本発明の改変内皮細胞の培養から得る馴化細胞培養培地を提供する。

キット
本発明はまた、本明細書中に記載する様々な方法を実施するための、または本発明が提供する改変内皮細胞を製造するためのキットを提供する。かかるキットは、ヌクレオチド配列（例えば、ベクター中の）、内皮細胞、改変内皮細胞の集団、対照の非改変内皮細胞、試料／標準の改変内皮細胞、改変内皮細胞またはその中で発現されるタンパク質もしくは核酸分子の検出のための手段または組成物（例えば、核酸プローブ、抗体等）、改変内皮細胞を維持もしくは増殖するのに有用な培地または組成物、改変内皮細胞によって馴化した培地、改変内皮細胞を対象に投与するための手段または組成物、またはそれらの任意の組み合わせを包含するがそれらに限定されない、本明細書中に記載する構成成分のいずれかを含有し得る。かかるキットはいずれも、使用説明書、容器、培養容器等を含んでもよい。キットにラベルを付けることができ、ラベルは、キットの内容物の使用に関する説明または他の情報を提供する任意の文書または記録物［電子的またはコンピューターが読める形態（例えば、ディスク、光ディスク、メモリーチップまたはテープ）であり得る］を含み得る。

本発明のある特定の態様は、下記の非限定的な実施例においてさらに説明され得る。

実施例
Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮細胞の生成および使用
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、（ａ）Ｅ４ＯＲＦ１単独（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−）、（ｂ）ＥＴＶ２単独（Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋）、または（ｃ）Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２の両方（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋）のいずれかを発現するように改変した。Seandel et al., PNAS, 2008;105(49): pp.19288-93（その内容を引用により本明細書の一部とする）に記載されるようにして、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１をコードする核酸分子を、レンチウイルスベクターによりＨＵＶＥＣに導入した。ヒトＥＴＶ２をコードする核酸分子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４２９）を、同じレンチウイルス系を使用して導入した（１つはＥ４ＯＲＦ１用、１つはＥＴＶ２用の、２つの別個のレンチウイルスコンストラクトを使用した）。レンチウイルスを１〜５の感染多重度（ＭＯＩ）にてデリバリーした。ＥＴＶ２発現は、ＰＣＲによって確認した。Ｅ４ＯＲＦ１発現は、表現型で確認した（報告されているように、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞は無血清培地中で生存できるのに対して、Ｅ４ＯＲＦ１−内皮細胞は無血清条件で死滅する）。改変内皮細胞を、抗生物質、ＨＥＰＥＳ、ＦＧＦ２サイトカイン、ヘパリンおよびＧｌｕｔａｍａｘを伴う血清含有Ｍ１９９培地（１０％ＦＢＳ）中で培養し、２〜１５回の継代数で維持した。細胞が、少なくとも４８〜７２時間継代されず単一フラスコ中に存在した場合、培養培地を交換した。Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋内皮細胞（即ち、ＥＴＶ２を発現するが、Ｅ４ＯＲＦ１は発現しないもの）は、多回の継代において培養が維持され得ず、むしろ培養中に老化し始め内皮細胞表現型を失い始めたという点で、非形質導入（Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２−）内皮細胞と同様に挙動することがわかった。一方、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮細胞は、無血清条件下でさえ、老化することなく、より多くの継代数で培養することができ、内皮細胞表現型を失うことなく活発に増殖し続けた。図１は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−（図１Ａ）、Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋（図１Ｂ）、およびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋（図１Ｃ）改変内皮細胞の、継代数８（レンチウイルス形質導入後に７回継代）における顕微鏡写真を示す。Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋内皮細胞が老化しているように見えるのに対して、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−およびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋内皮は、健常で老化していないように見えることがわかる。Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋細胞は、ナイーブＥ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２−内皮細胞との比較において、増殖の差を示さなかった。Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋内皮細胞は、最初の２〜３回の継代においてＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−細胞とほぼ同じ速度で増殖し、その後、増殖が低下して、継代数およそ８〜１０において最終的な老化に至った。

ヒト造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）との同時培養に先立ち、様々な改変内皮細胞を、コンフルエントになるまで増殖させ、その後、サイトカイン補充なしの造血培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）培地）に一晩切り換えた。臍帯血のバフィーコートからＨＳＰＣを得た。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの磁気カラムを使用して、バフィーコート試料からＣＤ３４＋ＨＳＰＣを精製した。次いで、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、５０ｎｇ／ｍｌのサイトカインボーラス（ｔｐｏ／ｆｌｔ３ｌ／ｓｃｆ）とともに、内皮細胞培養液に添加した。ＨＳＰＣの「サイトカインｏ単独」対照群は、同じ様式で（同じサイトカイン処理を伴って）処理したが、内皮細胞と同時培養しなかったものである。

図２は、ＨＳＰＣとの同時培養における１０日後の、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−（図２Ａ）、Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋（図２Ｂ）、およびＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋（図２Ｃ）内皮細胞の顕微鏡写真を示す。ＥＴＶ２単独を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋）は、ＨＳＰＣ同時培養および増殖プロセス中に著しい細胞死を起こしたのに対して、Ｅ４ＯＲＦ１単独を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−）、またはＥＴＶ２およびＥ４ＯＲＦ１の両方を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋）は、無血清培地の存在下でさえ、同時培養および増殖プロセスの大部分において、生存を維持し、ほとんどコンフルエントのままであった。同時培養の１０日後に、総細胞数の測定を行い、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３８およびＣＤ４９Ｆマーカーを用いてフローサイトメトリーを行った。これにより、ＣＤ３４＋細胞の数を、総細胞数に対するパーセンテージとして、または総ＣＤ４５＋細胞数に対するパーセンテージとして計算することができた。

この実験のデータを、図３に示す。Ｅ４ＯＲＦ１単独を発現する内皮細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣの増殖を促進するが（これまでに実証されているように）、Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２の両方を発現する内皮細胞はより一層効果的であり、Ｅ４ＯＲＦ１単独を用いた場合に達成されるよりも一層大きなＣＤ３４＋ＨＳＣ増殖をもたらすことがわかった。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２−同時培養群とＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋同時培養群との間の、このＨＳＰＣ増殖における差は、統計学的に有意であった。さらに、Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２を一緒に組み合わせることにより、Ｅ４ＯＲＦ１またはＥＴＶ２のいずれかを単独で用いる場合に観察されるよりも、「より原始的な」ＨＳＰＣのより大きな増殖がもたらされることがわかった。ここで、「より原始的な」ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ｈｉｇｈ、ＣＤ４５ＲＡ−（そしてまた、ＣＤ３８−、ＣＤ４９Ｆ＋）であった。より少なく原始的なＨＳＰＣは、ＣＤ４５ＲＡ＋、かつ、ＣＤ３４＋ｈｉｇｈ（より少なく原始的）またはＣＤ３４＋（より一層少なく原始的）のいずれかであった。(ＨＳＰＣが原始的であるほど、ＣＤ３４発現は高くなる。）

ＥＴＶ２単独を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１−ＥＴＶ２＋）は、本明細書に記載する実験においてある程度までＣＤ３４＋ＨＳＰＣを増殖させる得ることがわかったが、観察される著しい老化および細胞死を考慮すると、かかる細胞は、臨床適用などの、より大規模な適用のためには、問題がある可能性が高い。一方、Ｅ４ＯＲＦ１およびＥＴＶ２の両方を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋）は、そのような不都合を伴わないので、大規模な内皮細胞培養または大規模な内皮細胞同時培養を必要とする適用（臨床適用を包含する）のための、類のない貴重な内皮細胞供給源を提供することができる。

本発明は、特許請求の範囲によってさらに記述される。

Claims (52)

1. Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞の単離された集団であって、該内皮細胞が分化した内皮細胞である、集団。
2. 細胞が、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項１に記載の改変内皮細胞の集団。
3. 細胞が、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む、請求項１に記載の改変内皮細胞の集団。
4. 核酸分子が、プラスミドベクターの形態で存在する、請求項２または３に記載の集団。
5. 核酸分子が、改変内皮細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない、請求項２または３に記載の集団。
6. 核酸分子が、改変内皮細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる、請求項２または３に記載の集団。
7. 内皮細胞が、分化した内皮細胞に由来する、請求項１に記載の集団。
8. 内皮細胞が、成体内皮細胞に由来する、請求項１に記載の集団。
9. 内皮細胞が、胚内皮細胞ではない、請求項１に記載の集団。
10. 内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項１に記載の改変内皮細胞の集団。
11. 内皮細胞が、初代内皮細胞に由来する、請求項１に記載の改変内皮細胞の集団。
12. 内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に由来する、請求項１に記載の改変内皮細胞の集団。
13. 請求項１に記載の改変内皮細胞の集団を含む組成物。
14. 担体溶液をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 担体溶液が、生理食塩水である、請求項１４に記載の組成物。
16. 幹細胞または前駆細胞をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
17. 幹細胞または前駆細胞が、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項１６に記載の組成物。
18. 請求項１に記載の改変内皮細胞の集団、および対象への投与に適する担体溶液、を含む処置用組成物。
19. 担体溶液が、生理食塩水である、請求項１８に記載の処置用組成物。
20. 幹細胞または前駆細胞をさらに含む、請求項１８に記載の処置用組成物。
21. 幹細胞または前駆細胞が、ＨＳＰＣである、請求項２０に記載の処置用組成物。
22. ＨＳＰＣが、骨髄から得られるかまたは骨髄に由来する、請求項１７に記載の組成物または請求項２１に記載の処置用組成物。
23. ＨＳＰＣが、末梢血から得られるかまたは末梢血に由来する、請求項１７に記載の組成物または請求項２１に記載の処置用組成物。
24. ＨＳＰＣが、羊水から得られるかまたは羊水に由来する、請求項１７に記載の組成物または請求項２１に記載の処置用組成物。
25. ＨＳＰＣが、臍帯血から得られる、請求項１７に記載の組成物または請求項２１に記載の処置用組成物。
26. 細胞移植術における使用のための、請求項１８に記載の処置用組成物。
27. ＨＳＰＣ移植術における使用のための、請求項１８に記載の処置用組成物。
28. 培養において内皮細胞を維持するかまたは増殖させる方法であって、ＥＴＶ２ポリペプチドをコードする核酸分子、およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を、内皮細胞へ導入して、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞を作ることを含み、ここで、該改変内皮細胞は、培養において維持するかまたは増殖させることができる、方法。
29. 改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 血清の非存在下で改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
31. 外因性増殖因子の非存在下で改変内皮細胞を培養することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
32. 導入を、トランスフェクションによって行う、請求項２８に記載の方法。
33. トランスフェクションを、リポソームによるトランスフェクション、ポリブレンによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃からなる群から選択される方法を使用して行う、請求項３２に記載の方法。
34. 導入を、ウイルスによる形質導入によって行う、請求項２８に記載の方法。
35. ウイルスによる形質導入を、レンチウイルスによる形質導入、アデノウイルスによる形質導入、レトロウイルスによる形質導入、アデノ随伴ウイルスによる形質導入、およびヘルペスウイルスによる形質導入からなる群から選択される方法を使用して行う、請求項２９に記載の方法。
36. 内皮細胞が、初代内皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
37. 内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
38. 内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項２８に記載の方法。
39. 培養において造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団を維持するかまたは増殖させる方法であって、（ａ）請求項１に記載のＥ４ＯＲＦ１＋ＥＴＶ２＋改変内皮細胞の集団を得るかまたは生成すること、および（ｂ）該改変内皮細胞を、ＨＳＰＣの集団とともに同じ培養容器中で培養すること、を含む方法。
40. 改変内皮細胞が、培養容器の表面上にフィーダー細胞層を形成する、請求項３９に記載の方法。
41. 培養が、ＣＤ４５ＲＡ−ＨＳＰＣの選択的増殖をもたらす、請求項３９に記載の方法。
42. 培養が、ＣＤ３４＋Ｈｉｇｈ，ＣＤ４５ＲＡ−ＨＳＰＣの選択的増殖をもたらす、請求項３９に記載の方法。
43. 培養が、ＣＤ４５ＲＡ−であるＨＳＰＣの割合の増加をもたらす、請求項３９に記載の方法。
44. 培養が、ＣＤ３４＋Ｈｉｇｈ，ＣＤ４５ＲＡ−であるＨＳＰＣの割合の増加をもたらす、請求項３９に記載の方法。
45. 工程（ｂ）の培養を、血清の非存在下で行う、請求項３９に記載の方法。
46. 工程（ｂ）の培養を、外因性増殖因子の非存在下で行う、請求項３９に記載の方法。
47. （ａ）ＥＴＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む核酸ベクター。
48. 発現ベクターである、請求項４７に記載の核酸ベクター。
49. ＥＴＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、別個のプロモーターの制御下にある、請求項４７に記載の核酸ベクター。
50. ＥＴＶ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、同じプロモーターの制御下にある、請求項４７に記載の核酸ベクター。
51. 内皮細胞が、アデノウイルスＥ４領域全体を含まない、請求項１に記載の集団。
52. 内皮細胞が、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４、および／またはＥ４ＯＲＦ５を含まない、請求項１に記載の集団。

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