JP6866974B2

JP6866974B2 - 新規なエンドリシンポリペプチド

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Publication number: JP6866974B2
Application number: JP2018512273A
Authority: JP
Inventors: マーティンヨハネスロエスナー，; フリッツエイチェンセアー，
Original assignee: Micreos Human Health BV
Current assignee: Micreos Human Health BV
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2021-04-28
Anticipated expiration: 2036-09-12
Also published as: CA2997539C; KR102701505B1; KR20180049090A; US10829749B2; EP3350322B1; AU2016321832A1; NO3144387T3; IL258041A; JP2018527933A; EP3144387A1; US11339386B2; AU2016321832B2; PL3144387T3; HK1258877A1; CA2997539A1; EP3144387B1; EP3350322A1; ES2665821T3; IL258041B; BR112018005114A2

Description

本発明は医学の分野、具体的にはブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染に伴う病状の治療の分野に関する。本発明は特異的に細菌ブドウ球菌属細胞を標的とする新規なエンドリシンポリペプチドに関する。本発明はさらに、医学的用途のため、好ましくはブドウ球菌属感染に伴う病状を有する個体を治療するための上記エンドリシンポリペプチドに関する。

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）は、特にヒト及び乳牛等の哺乳類における主な動物病原体であり、いくつかの重篤な感染症及び食中毒に関係することが多い。その治療は抗生物質抵抗株の出現によってますます困難になっている。黄色ブドウ球菌に感染するファージからのエンドリシンはこれらの病原体を制御できる可能性があることが示され、またその特異的な検出に用いることができる。大部分の場合、ブドウ球菌属種を標的とするエンドリシンの適用における主な障害は、低い酵素活性、大量生産の困難性、及び／又はタンパク質の安定性である。したがって、たとえば抗微生物活性、安定性、及び／又は免疫原性の低減について特性が改善されたエンドリシンポリペプチドに対する必要性が存在する。

本発明はブドウ球菌属に特異的なエンドリシンポリペプチドに関し、上記ポリペプチドは、
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の１５６〜１９９番目のアミノ酸の領域において少なくとも５、１０、２０、３０、又は４０アミノ酸のトランケーションを有するポリペプチド
を含む。

本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドに関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。本発明はさらに、本発明による核酸構築物を含む発現ベクターに関する。本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物を含む宿主細胞に関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチドの産生のための方法に関し、上記方法は、
エンドリシンポリペプチドの産生を促す条件下において本発明による宿主細胞を培養するステップ、
任意選択で培養液中からエンドリシンポリペプチドを分離し、精製するステップ、及び
任意選択でエンドリシンポリペプチドを凍結乾燥するステップ
を含む。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシン、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチドの透析を含む、増大した活性を有する本発明によるエンドリシンポリペプチドを産生するための方法に関し、上記透析は、
ｉ）キレート化合物を含む緩衝液に対する透析、及び
ｉｉ）２価金属イオン、好ましくはＣｏ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋及びＺｎ^２＋からなる群から選択される２価金属イオンを含む緩衝液に対する透析
のステップを含む。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞を含む組成物に関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞を含む薬学的組成物に関し、上記薬学的組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

本発明はさらに、追加的な活性成分をさらに含む本発明による組成物に関する。

本発明はさらに、医薬としての使用のための本発明による組成物に関する。

本発明はさらに、ブドウ球菌感染に伴う病状の治療における医薬としての使用のための本発明による組成物に関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物の投与を含む、ブドウ球菌感染に伴う病状の治療の方法に関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物の、抗微生物剤、好ましくは食品添加物又は消毒剤としての使用に関する。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物の、好ましくは診断用途におけるブドウ球菌の検出のための使用に関する。

本発明によるエンドリシンポリペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）の代表的イメージである。本発明によるエンドリシンポリペプチドの熱安定性及び比活性である。ＳＡ．１００（上図及び中央図）とＸＺ．７００（下図）とを比較する濁度減少分析である。

驚くべきことに、増大した比活性及び低減した免疫原性を有する新規なエンドリシンポリペプチドが、本発明者らによって見出された。

したがって、第１の態様において、本発明はブドウ球菌属に特異的なエンドリシンポリペプチドを提供し、上記ポリペプチドは、
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の１５６〜１９９番目のアミノ酸の領域において少なくとも５、１０、２０、３０、又は４０アミノ酸のトランケーションを有するポリペプチド
を含む。

上記エンドリシンポリペプチドは本明細書において本発明によるエンドリシンポリペプチドと称される。本発明による上記エンドリシンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドよりも増大した比活性及び／又は低減した免疫原性を有することが好ましい。本発明による上記エンドリシンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドよりも増大した比活性及び低減した免疫原性を有することがより好ましい。本発明によるエンドリシンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことが好ましい。本発明によるエンドリシンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなることがより好ましい。

本発明によるエンドリシンポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の１５６〜１９９番目のアミノ酸の領域において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又はより好ましくは少なくとも４０アミノ酸のトランケーションを有するポリペプチドを含む。本明細書において、トランケーションという用語は、内部トランケーション又は欠失とも称される。

本発明によるより好ましいエンドリシンポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

本発明の文脈において、ブドウ球菌属に特異的なエンドリシンポリペプチドは、ブドウ球菌属に対する溶菌活性を有するポリペプチドと解釈され、上記溶菌活性はブドウ球菌属のペプチドグリカンに対するペプチドグリカンヒドロラーゼ活性であることが好ましい。上記ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）及びスタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）からなる群から選択されることが好ましい。溶菌活性は当業者には公知の任意の適当な方法によって評価することができる。本明細書の実施例に記載した分析法の１つを用いることが好ましい。

本発明によるエンドリシン又はその機能性部分を骨格として含み、さらなるポリペプチド又はその機能性部分をさらに含むエンドリシンポリペプチドは、本発明に包含される。上記さらなるポリペプチド又はその機能性部分は、これだけに限らないが、たとえば溶菌ドメイン又はアミダーゼドメインであってよい。これらのさらなるポリペプチド又はその機能性部分は、本発明によるエンドリシンポリペプチド本来のものでも、異種のものでもよい。

本発明によるエンドリシンポリペプチドは、本明細書における配列の１つから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ置換、挿入、欠失、又は付加することによって誘導することができる。本発明によるエンドリシンポリペプチドは、安定性、溶解性及び活性を増大させるために追加のＮ−若しくはＣ−末端アミノ酸又は化学部分を追加することによって、本明細書で特定した配列の１つから誘導することができる。

本発明によるエンドリシンポリペプチドは、少なくとも３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸、好ましくは４６２アミノ酸、及び／又は多くとも１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００又は４６２アミノ酸の長さを有する。上記ポリペプチドは少なくとも４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４６２、４７０、４８０、４９０、５００、５１０又は５２０アミノ酸及び／又は多くとも１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００アミノ酸の長さを有することが好ましい。本発明の実施形態には本発明によるエンドリシンポリペプチドの変異体が包含される。エンドリシンポリペプチドの変異体は、本発明によるエンドリシンポリペプチドの任意の非天然の形態であってよい。エンドリシンポリペプチドの変異体はいくつかの操作方法において配列番号２と異なる。本発明によるエンドリシンポリペプチドの変異体は、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列から出発する部位指向性変異誘発によって作製することができる。本発明によるエンドリシンポリペプチドの変異体は、コードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させない変異を含むことが好ましく、本発明によるエンドリシンポリペプチドの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドと比較して同一の又は増大したブドウ球菌属ペプチドグリカン細胞壁結合活性及び／又は溶菌活性を示すことが好ましい。

本発明によるエンドリシンポリペプチドは、たとえば精製を容易にするためのタグを含んでよい。上記タグは、これだけに限らないが、ＦＬＡＧタグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＨＡタグ及びＭｙｃタグからなる群から選択されることが好ましく、上記タグは６ｘＨｉｓタグであることがより好ましい。

第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるエンドリシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（請求項３）を提供する。本発明によるそのようなポリヌクレオチドは特定の宿主における効率的な発現のために最適化されたコーディングであることが好ましい。コドン及び／又はコドン対を最適化する方法は当業者には知られている。本発明によるポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡ分子であってよく、ＤＮＡ分子が好ましい。

本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。

本発明はさらに、本発明による核酸構築物又はポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。本発明による発現ベクターは組み換え発現ベクターであってよい。そのようなベクターは、本発明による核酸構築物又はポリヌクレオチドを導入することによって形質転換されるプラスミド、コスミド、バクテリオファージ若しくはウイルス、又はその一部を構成してもよい。形質転換される宿主生物に特異的な、そのような形質転換ベクターは当業者には周知であり、広く文献に記載されている。宿主において本発明によるポリヌクレオチド又はエンドリシンポリペプチドを産生させるために、宿主生物の形質転換、並びに本発明によるポリヌクレオチド、核酸構築物又は発現ベクターの一体化のためのプロセスが適している。そのような形質転換は、専門家用の文献に広く記載された、当業者には周知の任意の好適な既知の手段によって実施することができる。

第３の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物を含む宿主細胞に関する。本発明による宿主細胞は、本発明のポリペプチドの発現に適した任意の微生物細胞、原核細胞又は真核細胞であってよい。上記細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることが好ましい。さらに好ましい実施形態においては上記細胞は大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅＭＲＦである。

第４の態様において、本発明は、本発明によるエンドリシンポリペプチドの産生のための方法を提供し、上記方法は、
エンドリシンポリペプチドの産生を促す条件下において本発明による宿主細胞を培養するステップ、
任意選択で培養液中からエンドリシンポリペプチドを分離し、精製するステップ、及び
任意選択でエンドリシンポリペプチドを凍結乾燥するステップ
を含む。

本発明によるエンドリシンポリペプチドを産生するための方法において、大腸菌を用いることが好ましい。本発明によるエンドリシンポリペプチドを産生するためのステップｉ）において、大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅＭＲＦを用いることがさらに好ましい。本発明によるエンドリシンポリペプチドを精製するために、分離及び精製のステップにおいて、５ｍＬの低密度ニッケルキレートアガロースビーズ（ＡＢＴビーズ）を充填したＩＭＡＣ及びＥｃｏｎｏ−Ｐａｃクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を重力流と組み合わせて用いることが好ましい。溶出したポリペプチドは３×１ｌの凍結乾燥緩衝液に対して２、４、及び１２時間透析することができ、上記緩衝液は５０ｍＭのリン酸塩、５００ｍＭのスクロース、２００ｍＭのマンニトール、０．００５％のポリソルベート２０を含み、ｐＨが７．４であることが好ましい。

凍結乾燥及び再構成は凍結乾燥による脱水及びそれに続く水の添加による試料の再構成と解釈することが好ましい。凍結乾燥及び再構成は３００ｍｌの凍結乾燥用緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩又はＴｒｉｓ、５００ｍＭのスクロース、２００ｍＭのマンニトール、ｐＨ７．４）のアリコートの３回交換による透析及び液体窒素の気相中における凍結によって実施することが好ましい。凍結乾燥は標準的条件下で、好ましくは−４０℃、７５ｍＴｏｒｒの真空下で６０分行い、続いて５時間で−１０℃まで昇温し、同じ真空レベル、−１０℃でさらに６０分行うことが好ましい。最終ステップとして、１０時間で温度を２５℃まで上昇させることが好ましい。水の添加によって試料を再構成する。

本発明はまた、本発明の第１の態様によるエンドリシンポリペプチド、又は本明細書において上に示した方法によって得られるエンドリシンポリペプチドの透析を含む、増大した活性を有する本発明によるエンドリシンポリペプチドを産生するための方法（請求項８）を提供し、上記透析は、
ｉ）キレート化合物を含む緩衝液に対する透析、及び
ｉｉ）２価金属イオン、好ましくはＣｏ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋及びＺｎ^２＋からなる群から選択される２価金属イオンを含む緩衝液に対する透析
のステップを含む。

本明細書において「キレート化合物」は金属イオンと結合する化合物として定義される。周知のキレート化合物はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及びエチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）である。本発明の方法のステップｉ）においてはＥＤＴＡを用いることが好ましい。

ステップｉｉ）における２価金属イオンはＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋及びＣｕ^２＋からなる群から選択することが好ましく、上記２価金属イオンはＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋及びＣｏ^２＋からなる群から選択することがさらに好ましく、上記２価金属イオンはＭｇ^２＋又はＣａ^２＋であることがさらにより好ましい。

Ｃｏ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋及びＺｎ^２＋のいずれかによって２価金属イオンを置換することにより、本発明によるエンドリシンポリペプチドの溶菌活性を増大させることができることが好ましい。溶菌活性は本明細書の別の箇所で定義されるようにして評価される。本発明によるこの方法により、溶菌活性は対応する未処理のポリペプチドと比較して少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２倍に増大することが好ましい。本方法により、溶菌活性は少なくとも２．５倍に増大することがよりさらに好ましい。処理したポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する未処理のポリペプチドと比較して溶菌活性において０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９〜２倍の増大を示すことが好ましい。

第５の態様において、本発明は、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞を含む組成物を提供する。本発明によるそのような組成物はブドウ球菌属に対する溶菌活性を示すことが好ましく、上記溶菌活性はブドウ球菌属のペプチドグリカンに対するペプチドグリカンヒドロラーゼ活性であることが好ましい。上記ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シミュランス及びスタフィロコッカス・カルノーサスからなる群から選択することが好ましい。本発明による組成物は本発明による、又は本発明による方法によって得られる、異なったポリヌクレオチド、及び／又は核酸構築物、及び／又はエンドリシンポリペプチド、及び／又はベクター、及び／又は細胞の混合物を含んでよい。

本発明による組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。そのような組成物は本明細書において薬学的組成物と称し、薬物又は医薬として用いることが好ましい。医薬は感染症の治療において用いることが好ましい。

したがって、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞を含む薬学的組成物が提供され、上記薬学的組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

本発明による組成物は１つ又は複数の追加的な活性成分をさらに含んでよい。活性とは本明細書の他の箇所で定義する溶菌活性を示すものと定義することが好ましい。上記１つ又は複数の追加的な活性成分はバクテリオファージ又はファージからなる群から選択されることが好ましく、ファージエンドリシンはそのようなファージ及び抗生剤に由来している。本明細書に包含するファージは文献で知られた任意のファージであってよい。そのようなファージは、これだけに限らないが、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）及びポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）からなる科のリストからのものが好ましい。そのようなファージは、テクチウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ルジウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）及びシストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）からなる科のリストのファミリーからのものでもよい。

本発明の文脈において、本明細書に定義する活性成分の組合せは、連続的に又は同時に投与することができる。本発明による組成物は液体、固体又は半液体若しくは半固体の形態であってよい。

本発明による組成物は、ブドウ球菌属、好ましくは黄色ブドウ球菌に感染した、ヒトを含む動物を治療するために用いることができる。上記組成物を投与するために、これだけに限らないが、経口、エアロゾル若しくは肺への送達のためのその他のデバイス、経鼻スプレー、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、膣、直腸、局所、腰椎穿刺、髄腔内、並びに脳及び／又は髄膜への直接適用等の、任意の好適な投与経路を用いることができる。

本発明による、又は本発明による方法によって得られる、ポリヌクレオチド又は核酸構築物又はエンドリシンポリペプチド又はベクター又は細胞を含む本発明による組成物は、患者又は上記患者の細胞又は細胞株又は無細胞インビトロ系に存在するブドウ球菌属種の量がこれによって減少する場合、活性があり、機能性があり、治療活性があり、又は感染症を治療し、予防し、及び／若しくは遅延させる能力があると称されることが好ましく、またブドウ球菌属種の初期の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満が治療後も検出可能であることを意味されることが好ましい。ブドウ球菌属種は治療後に検出できないことが好ましい。本段落において「ブドウ球菌属種の量」という表現は、生きたブドウ球菌属を意味することが好ましい。ブドウ球菌属種は、ブドウ球菌属特異抗体、スタフィロコアグラーゼ若しくは「遊離のコアグラーゼ」を検出するチューブコアグラーゼ試験、クランピング因子（スライドコアグラーゼ試験）及び／又はプロテインＡ（市販のラテックス試験）等の表面タンパク質の検出を用いる免疫組織化学的手法等の、当業者には既知の標準的な手法を用いて検出することができる。生きたブドウ球菌属種は、微生物学的細菌培養手法及び／又は細菌のｍＲＮＡの分析のためのリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応等の、当業者には既知の標準的な手法を用いて検出することができる。上記の減少は、個体又は患者の組織中又は細胞中において、本発明による上記組成物又はポリペプチドを用いた治療の前の上記個体又は患者に存在する量との比較によって評価することが好ましい。或いは、治療が局所的な場合には、上記組成物又はポリペプチドによる治療を受けていない上記個体又は患者の組織又は細胞との比較をすることができる。

本発明による、又は本発明による方法によって得られる、ポリヌクレオチド又は核酸構築物又はポリペプチド又はベクター又は細胞を含む組成物は、それを必要とする対象に、又は上記患者の細胞、組織又は臓器に、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年又はそれ以上、投与することができる。

したがって、本発明は、それを必要とする対象の治療のための医薬としての使用のための、本発明による組成物を提供する。上記組成物は、ブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌種の細菌による対象の感染に伴う病状の治療における医薬としての使用のためであることが好ましい。

本発明はさらに、本発明によるエンドリシンポリペプチド又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド又は本発明によるポリヌクレオチド又は本発明による核酸構築物又は本発明による発現構築物又は本発明による宿主細胞又は本発明による組成物の投与を含む、ブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌種の細菌による対象の感染に伴う病状の治療、遅延及び／又は予防の方法を提供する。

本明細書に記載する医学的使用は、上述の疾患の治療のための医薬としての使用のための本発明による生成物として処方することができるが、本発明による生成物を用いる上述の疾患の治療の方法、上述の疾患を治療するための医薬の調製における使用のための本発明による生成物、及び上述の疾患の治療のための本発明による生成物の使用としても同様に処方することができる。そのような医学的使用は全て本発明によって予想されている。感染に伴う病状の治療、遅延及び／又は予防を必要とする対象は任意の動物対象であってよく、哺乳類が好ましく、畜牛、イヌ若しくはネコ等のペット、又はヒト対象者がより好ましい。

本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物は、国際公開第２０１５／００５７８７号で提供されているアトピー性皮膚炎の組合せ治療のための方法において便利に用いることができ、本方法においてはアトピー性皮膚炎又は湿疹を治療するために、抗炎症化合物と、細菌細胞、好ましくはグラム陽性細菌細胞を特異的に標的とする化合物が用いられる。

細菌細胞を特異的に標的とする化合物は、本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物であることが便利である。

本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物は、それを必要とする対象における細胞内細菌感染の治療の方法において便利に用いることができ、上記方法は、
宿主細胞の、及び／又は宿主細胞の細胞内区画の、細胞内ｐＨを増大させる有効量の薬剤の投与、及び
有効量の殺細菌剤の投与
を含む。上記方法は本明細書において本発明による方法と称され、
本方法においてはｐＨの増大によって非複製細胞内細菌が活性化され、活性化された細胞内細菌は殺細菌剤によって死滅させられることが好ましい。そのような治療方法は、欧州特許第１５１５８８８０．３号に記載されている。殺細菌剤は、本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物であることが便利である。本発明によるエンドリシンポリペプチドは、細胞内細菌が潜んでいる細胞の中にエンドリシンポリペプチドが進入することを可能にするタンパク質導入ドメインを含むことが好ましい。タンパク質導入ドメインは、欧州特許第１５１５８８８０．３号に広範に記載されている。

１つの態様において、本発明は本明細書の他の箇所に定義した溶菌活性を示す非医学的組成物に関する。この実施形態は抗微生物剤であることが好ましい。この実施形態は細菌、好ましくはブドウ球菌属の細菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌種の細菌を溶菌するための抗微生物剤に関することが好ましい。この実施形態は食品保存剤又は消毒剤としての抗微生物剤に関することが好ましい。

したがって、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物の、抗微生物剤、好ましくは食品添加物又は消毒剤としての使用が提供される。そのような使用の例としては、これだけに限らないが、乳牛から乳牛へのブドウ球菌属の伝染を防止するための搾乳の前の本発明による組成物による搾乳デバイスのカップの洗浄、食品生産（ｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ）における表面の清浄化、及び手術用具の清浄化が挙げられる。そのような使用は、当技術で公知の任意の滅菌法又は消毒剤、たとえば超音波清浄化、放射線又は熱滅菌、装置をエタノール、アンモニウム、ヨード、及び／又はアルデヒド消毒剤等の消毒剤溶液に浸漬すること、又はデバイスをホルマリンガス若しくはエチレンオキサイドガス等の閉鎖された雰囲気内に保つことによるガス滅菌による滅菌法又は消毒剤と組み合わせることができる。

本発明はさらに、好ましくは診断用途におけるブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌の検出のための、本発明によるエンドリシンポリペプチド、又は本発明による方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による核酸構築物、又は本発明による発現構築物、又は本発明による宿主細胞、又は本発明による組成物に関する。

［定義］
本明細書において「配列同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当技術において「同一性」は、場合によって配列の鎖間の一致によって決定されるアミノ酸又はヌクレオチド配列の間の配列の関連性の程度をも意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列又はその保存されたアミノ酸置換体を第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することによって決定される。好ましい実施形態においては、同一性又は類似性は、本明細書において特定された配列番号の全体にわたって計算される。「同一性」及び「類似性」は、これだけに限らないが、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｎｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．，Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編、ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。

同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列の間で最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムにコードされている。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、たとえばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他の供給源から一般に入手可能である（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ら、ＮＣＢＩＮＬＭＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。同一性を決定するために周知のＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いてもよい。

ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータには以下が含まれる。アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ１２；ギャップ長さペナルティ４。これらのパラメータとともに有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐの「Ｏｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。上記のパラメータはアミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（エンドギャップのためのペナルティを伴わない）。

核酸比較のための好ましいパラメータには以下が含まれる。アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ５０；ギャップ長さペナルティ３。Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐのギャッププログラムとして入手可能。上記のものは核酸比較のためのデフォルトパラメータである。

アミノ酸の類似性の程度の決定において、当業者は任意選択で当業者には明白ないわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の相互交換性を意味する。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示するアミノ酸配列の置換変異体は、開示した配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なった残基がその場所に挿入されたものである。アミノ酸の変化は保存的であることが好ましい。天然のアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は以下の通りである。Ａｌａからｓｅｒ、Ａｒｇからｌｙｓ、Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ、Ａｓｐからｇｌｕ、Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ、Ｇｌｎからａｓｎ、Ｇｌｕからａｓｐ、Ｇｌｙからｐｒｏ、Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ、Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ、Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ、Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ、Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ、Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ、Ｓｅｒからｔｈｒ、Ｔｈｒからｓｅｒ、Ｔｒｐからｔｙｒ、Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ、及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」（本明細書においてこれらの用語は相互交換可能に用いられる）は、ヌクレオチド配列によって表わされる。「ポリペプチド」はアミノ酸配列によって表わされる。「核酸構築物」は、天然に産生する遺伝子から分離された、又は天然には他に存在しない方法で組み合わされた若しくは並置された核酸のセグメントを含むように改変された核酸分子として定義される。核酸分子はヌクレオチド配列によって表わされる。任意選択で、核酸構築物中に存在するヌクレオチド配列は１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結され、この制御配列は細胞中又は対象中における上記ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を指令する。

本明細書において「作動可能に連結」は、制御配列が本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関連する位置に適切に配置され、それにより制御配列が細胞中又は対象中における本発明のペプチド又はポリペプチドの産生／発現を指令する構造として定義される。「作動可能に連結」はまた、配列が機能性ドメインをコードする別の配列に関連する位置に適切に配置され、それにより細胞中又は対象中においてキメラポリペプチドがコードされる構造を定義するためにも用いられる。

「発現」は、これだけに限らないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むペプチド又はポリペプチドの産生に関わる任意のステップを含むものと解釈される。

本明細書において「制御配列」は、ポリペプチドの発現に必要な又は有利な全ての成分を含むものと定義される。少なくとも、制御配列はプロモーター並びに転写及び翻訳の停止シグナルを含む。任意選択で、核酸構築物中に存在するヌクレオチド配列によって表わされるプロモーターは、本明細書において特定されたペプチド又はポリペプチドをコードする別のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

「形質転換」という用語は、新たなＤＮＡ（即ち、細胞にとって外来のＤＮＡ）の組み込みの後で細胞に誘導される永久的又は一時的な遺伝子の変化を意味する。本発明において意図しているように細胞が細菌細胞である場合には、この用語は、選択可能な抗生剤耐性を潜ませた染色体外の自己複製ベクターを意味する。

「発現ベクター」は、組み換えＤＮＡ手順に便利に供することができ、細胞中及び／又は対象中における本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる任意のベクターであってよい。本明細書で用いる「プロモーター」という用語は、１つ又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御する機能を有し、遺伝子の転写開始部位の転写の指示に関して上流に位置する核酸フラグメントを意味する。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位の存在によって特定される結合部位、転写開始部位、並びにこれだけに限らないが転写因子結合部位、抑制及び活性化タンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を直接に又は間接に制御する当業者には公知のヌクレオチドの他の任意の配列を含む他の任意のＤＮＡ配列に関連している。本発明の文脈においては、プロモーターは転写開始部位（ＴＳＳ）のヌクレオチド−１において終止していることが好ましい。

本明細書で用いる「ポリペプチド」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を意味する。ポリペプチドは連続的なアミノ酸を含む。「ポリペプチド」という用語は、天然に発生する、又は合成の分子を包含する。本明細書に提供する配列情報は、間違って特定された塩基を含むことを要求するほど狭く解釈すべきではない。当業者であればそのように間違って特定された塩基を特定することができ、そのようなエラーをどのようにして修正すべきかが分かっている。

本明細書及びその特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用形はその非制限的な意味で用いられ、この単語の後の項目は含まれるが、特に述べなかった項目は除外されないということを意味している。さらに「〜からなる」という動詞は「本質的に〜からなる」によって置き換えることができ、本明細書で定義する産生物又は組成物又は核酸分子又はペプチド又はポリペプチド又は核酸構築物又はベクター又は細胞は、具体的に特定されたもの以外の付加的な成分（複数可）を含んでもよく、上記付加的な成分（複数可）は本発明の特有の特徴を変化させるものではないことを意味している。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈によって明らかにただ１つのみの要素の存在が要求される場合以外には、２つ以上の要素の存在の可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常、「少なくとも１つの」を意味する。

本明細書に引用する全ての特許及び参考文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は説明の目的のみに提供され、いかなる様式においても本発明の範囲を限定することを意図していない。

材料及び方法
細菌株、培養条件、ファージ及びプラスミド
本発明によるポリペプチドの過剰発現のために、基本的には国際公開第２０１３／１６９１０２号に従って大腸菌ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ及び大腸菌Ｓｕｒｅを用いた。プラスミドの選択のための１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ−ＰＥ培地中、３０℃で両方の株を培養した。

ＤＮＡ手技及びクローニング手順
クローニングのため、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）による標準的手技を用いた。

組み換えエンドリシンポリペプチドの発現及び精製
タンパク質の過発現及び部分的精製は、基本的には他の研究者（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６、Ｓｃｈｍｅｌｃｈｅｒら、２０１０）によって既に記述されたように行った。簡単に述べると、プラスミドを有する大腸菌を、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．４〜０．６になるまで２５０ｍｌの修飾ＬＢ培地（１５ｇ／ｌのトリプトース、８ｇ／ｌのイースト抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を３０℃で４時間、又は２０℃で１８時間、さらにインキュベートして、４℃に冷却し、遠心分離によって回収した。細胞ペレットを５ｍｌの固定化緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、０．１％のポリソルベート２０、ｐＨ７．４）に懸濁した。可溶性組み換えタンパク質を含む細胞質大腸菌内容物を、１２００ｐｓｉで操作するＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓｕｒｅＣｅｌｌＰｒｅｓｓ（１２００ｐｓｉ、ＳＬＭＡｍｉｎｃｏ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ、Ｕ．Ｓ．）に２回通すことによって放出させた。その他の後処理ステップには、不溶性の細胞破片の遠心分離による除去、濾過滅菌（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び低密度Ｎｉ−ＮＴＡＳｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＣｈｅｍｉｅＢｒｕｎｓｃｈｗｉｇＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を充填したＭｉｃｒｏＢｉｏｓｐｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）カラムを用いる固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製が含まれていた。Ｎｉ−ＮＴＡ固定化タンパク質は、カラム体積の５〜１０倍の固定化緩衝液によるカラム上の重力流で洗浄した。次いでタンパク質画分を溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のポリソルベート２０、ｐＨ７．４）で溶出し、透析緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のポリソルベート２０、ｐＨ７．４）を２回交換して透析した。タンパク質濃度はＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計によって、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）による一次アミノ酸配列から計算した２８０ｎｍにおける比吸光度について補正して決定し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定した。アリコートを５０％のグリセロールと混合して−２０℃で保存した。

組み換えタンパク質の凍結乾燥
ＩＭＡＣで精製したタンパク質を、３００ｍｌの凍結乾燥用緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩又はＴｒｉｓ、５００ｍＭのスクロース、２００ｍＭのマンニトール、ｐＨ７．４）のアリコートの３回交換によって透析し、液体窒素の気相中で凍結した。凍結乾燥は−４０℃、７５ｍＴｏｒｒの真空下で６０分行い、続いて５時間で−１０℃まで昇温し、同じ真空レベル、−１０℃でさらに６０分行った。最終ステップとして、１０時間で温度を２５℃まで上昇させた。溶菌分析について試験する前に、水の添加によって試料を再構成した。

濁度溶菌分析
溶菌活性分析のための基質細胞を５９５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５９５）が０．４になるまで増殖させ、ＰＢＳＴｐＨ７．４で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４を含む１５％のグリセロールに再懸濁し、同時に１００倍に濃縮した。細胞は−２０℃に保存した。結合活性又は溶菌活性の分析においてさらに用いるため、細胞を融解し、ＰＢＳｐＨ７．４で洗浄し、ＯＤ５９５が１±０．０５になるまで希釈した。標準的な溶菌活性分析においては、タンパク質試料を等モル量まで希釈し、透明な９６ウェル組織培養試験プレート（ＳＰＬｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｃｈｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）に分注した。基質細胞を最終体積まで添加し、５９５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５９５）の低下を３７℃で約１時間、記録した。

５９５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５９５）の減少をＶｉｃｔｏｒ３１４２０ＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＣｏｕｎｔｅｒ装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１時間、測定した。各１回の測定の後、プレートを１秒間（二重軌道、直径０．１ｍｍ）、激しく振盪した。陽性対照としてＮ末端６ｘＨｉｓタグ付きのリゾスタフィン（ＨＬＳＴ）である市販のＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（組み換え、大腸菌由来、Ｓｉｇｍａ）を用いた。陰性対照としてＭｉｌｌｉＱ水を用いた。

最小阻止濃度（ＭＩＣ）分析
カゼインペプトン大豆粉ペプトン培地（ＣＡＳＯ培地（ＣａｒｌＲｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））中のエンドリシンの２倍連続希釈物（２０００ｎＭ〜４ｎＭ）を、滅菌した透明な９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで分注した。黄色ブドウ球菌ＮｅｗｂｏｌｄをＣＡＳＯ培地中で中間対数期（ＯＤ６００約０．５）まで増殖させ、新鮮なＣＡＳＯ培地で約１Ｅ＋６ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した。次いで細胞をエンドリシン含有ウェルに分注し、エンドリシン濃度１０００ｎＭ〜２ｎＭ、約１０Ｅ＋５ｃｆｕ／ウェルとした。９６ウェルプレートに蓋を被せ、３０℃で２０時間インキュベートした。ゲルスキャナーを用いて画像を取得した。陽性対照としてエンドリシンを含まないＣＡＳＯ培地を用いた。陰性対照として黄色ブドウ球菌細胞を含まないＣＡＳＯ培地を用いた。

結果
最小阻止濃度分析による本発明のエンドリシンポリペプチドの比活性の決定
配列番号２のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドであるＸＺ．７００の比活性を、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照エンドリシンポリペプチドであるＳＡ．１００の比活性と比較した。結果を図１に示す。２〜３Ｅ＋５ｃｆｕの黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｂｏｌｄを２００μｌのフォーマットでＳｔａｐｈｅｆｅｋｔの連続希釈に曝すことによってＭＩＣ値を得た。ＣＡＳＯ培地中で２０時間インキュベーションした後に画像を取得した。３つの独立した分析においてＳＡ．１００のＭＩＣ値は６２．５ｎＭであり、ＸＺ．７００のＭＩＣ値は１５．６ｎＭであった。即ち、ＸＺ．７００のＭＩＣ値はＳＡ．１００のＭＩＣ値の４分の１と小さく、ＸＺ．７００の比活性が４倍大きいことを示した。

濁度分析による本発明のエンドリシンポリペプチドの熱安定性及び比活性の決定
配列番号２のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドであるＸＺ．７００の熱安定性及び比活性を、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照エンドリシンポリペプチドであるＳＡ．１００の熱安定性及び比活性と比較した。簡単に述べると、２００ｍＭのＳＡ．１００及びＸＺ．７００を１０分間の熱曝露（Ｘ軸）に供し、続いて氷で冷却した。引き続いて濁度溶菌分析により、２０℃におけるＳＡ．１００に関する相対活性を決定した。図２より、約５５℃以上ではＸＺ．７００の活性がＳＡ．１００よりやや低い一方、約５５℃まではＸＺ．７００の活性がＳＡ．１００よりも顕著に高いことが明らかに観察できる。室温においては、ＺＸ．７００の活性はＳＡ．１００よりも約７０％高い。

比活性及び熱安定性を動力学的分析によっても決定した。勾配付き熱サイクラー中、ＰＢＳ緩衝液中で、濃度２００ｎＭのＸＺ．７００及びＳＡ．１００を４２℃〜７２℃の間で１０分間、熱に曝露した。続いて氷で冷却した後、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４の中の黄色ブドウ球菌ＳＡ．１１３に対して１００ｎＭのタンパク質濃度で標準的な動的濁度減少分析における溶菌動力学を記録した。図３に溶菌曲線を示し、時間（Ｘ軸、経過時間１時間）に対する光学密度の低減（Ｙ軸、初期ＯＤ６００ｎｍ約１）を示す。ＺＸ．７００は６０℃までＳＡ．１００よりも顕著に急な曲線を有し、より高い比活性を示すことが明らかに観察できる。

本発明によるエンドリシンポリペプチドの免疫原性の予測
ＸＺ．７００及びＳＡ．１００ポリペプチド配列（それぞれ配列番号１及び配列番号２）について、ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｂｃｅｌｌ／ウェブページを用い、パラメータをセンター位置４、ウィンドウサイズ７、閾値１．０として、免疫原性の予測を行った。結果を表１に示す。ＸＺ．７００には免疫原性ペプチド断片「ＶＫＥＬＫＨＩＹＳＮＨ」（ＳＡ．１００の１９７番〜２０７番）が存在しないことが明らかである。

まとめると、この非限定的な実施例において、本発明によるエンドリシンポリペプチドＸＺ．７００は、従来技術のエンドリシンポリペプチドＳＡ．１００よりも高い比活性及び低い免疫原性を有することが示された。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１
ＭＡＡＴＨＥＨＳＡＱＷＬＮＮＹＫＫＧＹＧＹＧＰＹＰＬＧＩＮＧＧＭＨＹＧＶＤＦＦＭＮＩＧＴＰＶＫＡＩＳＳＧＫＩＶＥＡＧＷＳＮＹＧＧＧＮＱＩＧＬＩＥＮＤＧＶＨＲＱＷＹＭＨＬＳＫＹＮＶＫＶＧＤＹＶＫＡＧＱＩＩＧＷＳＧＳＴＧＹＳＴＡＰＨＬＨＦＱＲＭＶＮＳＦＳＮＳＴＡＱＤＰＭＰＦＬＫＳＡＧＹＧＫＡＧＧＴＶＴＰＴＰＮＴＧＥＬＬＲＰＫＤＡＫＫＤＥＫＳＱＶＣＳＧＬＡＭＥＫＹＤＩＴＮＬＮＡＫＱＤＫＳＫＮＧＳＶＫＥＬＫＨＩＹＳＮＨＩＫＧＮＫＩＴＡＰＫＰＳＩＱＧＶＶＩＨＮＤＹＧＳＭＴＰＳＱＹＬＰＷＬＹＡＲＥＮＮＧＴＨＶＮＧＷＡＳＶＹＡＮＲＮＥＶＬＷＹＨＰＴＤＹＶＥＷＨＣＧＮＱＷＡＮＡＮＬＩＧＦＥＶＣＥＳＹＰＧＲＩＳＤＫＬＦＬＥＮＥＥＡＴＬＫＶＡＡＤＶＭＫＳＹＧＬＰＶＮＲＮＴＶＲＬＨＮＥＦＦＧＴＳＣＰＨＲＳＷＤＬＨＶＧＫＧＥＰＹＴＴＴＮＩＮＫＭＫＤＹＦＩＫＲＩＫＨＹＹＤＧＧＫＬＥＶＳＫＡＡＴＩＫＱＳＤＶＫＱＥＶＫＫＱＥＡＫＱＩＶＫＡＴＤＷＫＱＮＫＤＧＩＷＹＫＡＥＨＡＳＦＴＶＴＡＰＥＧＩＩＴＲＹＫＧＰＷＴＧＨＰＱＡＧＶＬＱＫＧＱＴＩＫＹＤＥＶＱＫＦＤＧＨＶＷＶＳＷＥＴＦＥＧＥＴＶＹＭＰＶＲＴＷＤＡＫＴＧＫＶＧＫＬＷＧＥＩＫ

ＳＥＱＩＤＮＯ：２
ＭＡＡＴＨＥＨＳＡＱＷＬＮＮＹＫＫＧＹＧＹＧＰＹＰＬＧＩＮＧＧＭＨＹＧＶＤＦＦＭＮＩＧＴＰＶＫＡＩＳＳＧＫＩＶＥＡＧＷＳＮＹＧＧＧＮＱＩＧＬＩＥＮＤＧＶＨＲＱＷＹＭＨＬＳＫＹＮＶＫＶＧＤＹＶＫＡＧＱＩＩＧＷＳＧＳＴＧＹＳＴＡＰＨＬＨＦＱＲＭＶＮＳＦＳＮＳＴＡＱＤＰＭＰＦＬＫＳＡＧＹＧＫＡＧＧＴＶＴＰＴＰＮＴＧＬＫＨＩＹＳＮＨＩＫＧＮＫＩＴＡＰＫＰＳＩＱＧＶＶＩＨＮＤＹＧＳＭＴＰＳＱＹＬＰＷＬＹＡＲＥＮＮＧＴＨＶＮＧＷＡＳＶＹＡＮＲＮＥＶＬＷＹＨＰＴＤＹＶＥＷＨＣＧＮＱＷＡＮＡＮＬＩＧＦＥＶＣＥＳＹＰＧＲＩＳＤＫＬＦＬＥＮＥＥＡＴＬＫＶＡＡＤＶＭＫＳＹＧＬＰＶＮＲＮＴＶＲＬＨＮＥＦＦＧＴＳＣＰＨＲＳＷＤＬＨＶＧＫＧＥＰＹＴＴＴＮＩＮＫＭＫＤＹＦＩＫＲＩＫＨＹＹＤＧＧＫＬＥＶＳＫＡＡＴＩＫＱＳＤＶＫＱＥＶＫＫＱＥＡＫＱＩＶＫＡＴＤＷＫＱＮＫＤＧＩＷＹＫＡＥＨＡＳＦＴＶＴＡＰＥＧＩＩＴＲＹＫＧＰＷＴＧＨＰＱＡＧＶＬＱＫＧＱＴＩＫＹＤＥＶＱＫＦＤＧＨＶＷＶＳＷＥＴＦＥＧＥＴＶＹＭＰＶＲＴＷＤＡＫＴＧＫＶＧＫＬＷＧＥＩＫ

Claims

ブドウ球菌属に特異的なエンドリシンポリペプチドであって、
配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の１５６〜１９９番目のアミノ酸の領域において少なくとも５、１０、２０、３０、又は４０アミノ酸のトランケーションを有するポリペプチド
を含み、
配列番号１のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドよりも増大した比活性及び／又は低減した免疫原性を有する、エンドリシンポリペプチド。
配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のエンドリシンポリペプチド。
請求項１又は２に記載のエンドリシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
請求項４に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
請求項１又は２に記載のエンドリシンポリペプチドの産生のための方法であって、
前記エンドリシンポリペプチドの産生を促す条件下において請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップ、
任意選択で培養液中から前記エンドリシンポリペプチドを分離し、精製するステップ、及び
任意選択で前記エンドリシンポリペプチドを凍結乾燥するステップ
を含む方法。
請求項１又は２に記載のエンドリシンポリペプチド、又は請求項７に記載の方法によって得られるエンドリシンポリペプチドの透析を含む、配列番号１のアミノ酸配列を有するエンドリシンポリペプチドよりも増大した活性を有する請求項１又は２に記載のエンドリシンポリペプチドを産生するための方法であって、前記透析が、
ｉ）キレート化合物を含む緩衝液に対する透析、及び
ｉｉ）２価金属イオンを含む緩衝液に対する透析
のステップを含む、方法。
前記２価金属イオンを含む緩衝液が、Ｃｏ ^２＋、Ｃｕ ^２＋、Ｍｇ ^２＋、Ｃａ ^２＋、Ｍｎ ^２＋及びＺｎ ^２＋からなる群から選択される２価金属イオンを含む、請求項８に記載の方法。
請求項１若しくは２に記載のエンドリシンポリペプチド、又は請求項７、８若しくは９に記載の方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４に記載の核酸構築物、又は請求項５に記載の発現ベクター、又は請求項６に記載の宿主細胞を含む組成物。
請求項１若しくは２に記載のエンドリシンポリペプチド、又は請求項７、８若しくは９に記載の方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４に記載の核酸構築物、又は請求項５に記載の発現ベクター、又は請求項６に記載の宿主細胞を含む薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、薬学的組成物。
追加的な活性成分をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の組成物。
医薬としての使用のための請求項１０、１１又は１２に記載の組成物。
ブドウ球菌感染に伴う病状の治療における医薬としての使用のための請求項１３に記載の組成物。
請求項１若しくは２に記載のエンドリシンポリペプチド、又は請求項７、８若しくは９に記載の方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４に記載の核酸構築物、又は請求項５に記載の発現ベクター、又は請求項６に記載の宿主細胞、又は請求項１０、１１若しくは１２に記載の組成物の、抗微生物剤としての使用（但し、ヒトへの使用を除く）。
食品添加物又は消毒剤としての、請求項１５に記載の使用。
請求項１若しくは２に記載のエンドリシンポリペプチド、又は請求項７、８若しくは９に記載の方法によって得られるエンドリシンポリペプチド、又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４に記載の核酸構築物、又は請求項５に記載の発現ベクター、又は請求項６に記載の宿主細胞、又は請求項１０、１１若しくは１２に記載の組成物の、ブドウ球菌の検出のための使用。