JP6867952B2 - 性決定遺伝子及び育種におけるその使用 - Google Patents

Description

本発明は、植物の育種、特に、雌雄異株植物の、特に、アスパラガスの、育種の分野に関する。本発明は、古典的植物遺伝学及び分子学的植物遺伝学の両方の分野にまたがるものであり、新規ＤＵＦ２４７モチーフ含有遺伝子及びその変異体の配列、並びに、マーカー支援育種若しくは標的変異でのこれら配列の使用、又は、形質転換植物での（例えば、雌化又は脱雌化植物を作るための）これら配列の使用に関する。さらに、本発明は、シロイヌナズナのＴＤＦ１遺伝子（ＡＴ３Ｇ２８４７０）又はオリザ・サティバ（コメ）のｏｓＴＤＦ遺伝子（ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１８４８０）に相同なアスパラガスの遺伝子の配列、及び、マーカー支援育種でのこれら配列の使用、又は、形質転換植物での（例えば、雄化又は脱雄化植物を作るための）これら配列の使用に関する。

植物育種は人類の最古の偉業の一つである。植物育種は、植物を制御された条件下で育て、食料源に足る種を選抜することで、人類が植物を栽培品種化したときに始まった。植物育種者の技術又は科学により生み出されたもののなかで、世界の飼料源又は食料源の増加に与えた影響について、ハイブリッド品種に勝るものはない。ハイブリッド品種は、まず、トウモロコシで劇的な成功を収め、その使用は、他家受粉種及び自家受粉種の両方を含む他の作物に広がっていた。ハイブリッド品種では、商品作物としてＦ１集団が用いられる。Ｆ１の両親は、近交系、クローン品種、又はその他の集団であってもよい。ハイブリッド品種は、その開発に伴う追加費用及びその採種価格の追加費用よりもハイブリッドによる収穫高の増加が大きい場合に用いられる。近交系のハイブリッドの場合、付加価値として均一性がある。ハイブリッド品種の開発の方法は、『Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ』ＦＮ Ｂｒｉｇｇｓ及びＰＦ Ｋｎｏｗｌｅｓ著、１９６７年刊（２２３−２３９頁参照）に記載されている。

植物育種は、植物種の遺伝資源に内在する遺伝的多様性の開拓に基いて改良された作物品種を作ることを目的とする。遺伝的多様性は、伝統的には、遺伝的に隔離した２つの植物を交配させて雑種子孫を生み出すことにより得られる。ハイブリッド品種の開発の過程では、ハイブリダイゼーションは、純粋種集団を作出することではなく、むしろ、最終的な栽培品種としてＦ１ハイブリッド植物を作出することを目的としている。

異なる遺伝子型間での交配によるＦ１ハイブリッドは、しばしば、その両親よりもいっそう強勢である。この雑種強勢又はヘテローシスは、成長速度の増加、均一性の向上、開花の早期化、収穫量の増加をはじめとする、様々な形で表出し得る。この中でも、最後の収穫量の増加は、農業において最も重要である。

ハイブリッド品種の作出は、通常、３つの工程、［１］優れた植物の選抜［２］互いに異なるものの個別には純粋種であり高度に均一な一連の近交系を作るための数世代に渡る近親交配、［３］選抜した近交系の交配を含む。近親交配の過程では、こうした系の強勢は野外受粉品種の強勢に比べて急激に低下する。しかし、任意の２種の非近縁近交系を交配させると、強勢は復活し、場合によっては、近交系間のＦ１ハイブリッドは放任受粉品種よりも優れている。近交系がホモ接合性であることの重要な帰結として、任意の２つの近交種間のハイブリッドが常に同じものとなる。最良のハイブリッドをもたらす近交種をひとたび特定すれば、ハイブリッド種子を好きなだけ作ることができるようになる。

上記のように、ハイブリッド栽培品種を作る際に重要なのは近交系を得るための工程である。こうしたホモ接合植物を得るための一般的な方法として、非雌雄異株作物では、自家受粉又は自家受精（近親交配）を数世代にわたり適用することが挙げられる。また、数世代の自家受精による近親交配過程の代わりに、卵細胞（雌性発生の場合）又は花粉（雄性発生の場合）のいずれかの配偶子に排他的に由来する植物を作ることも可能である。配偶子に由来する植物の遺伝的内容が、化学的手段（コルヒチンの使用など）又は自然な染色体倍加により、倍加すると、完全にホモ接合性の植物が得られる。こうした植物は、倍加半数体と呼ばれる。非雌雄異株作物（コショウ、ナス、キュウリ、トウモロコシ、ナタネ、ブロッコリーなど）では、倍加半数体を、種子繁殖させたり、こうした植物を単に自家受精させたりすることで、倍加半数体を増やすことができる。これにより親系統を迅速に増殖することが可能となる。これは、親植物を大規模なハイブリッド種子生産に用いる場合、非常に望ましい。倍加半数体の種子繁殖の別の利点として、種子は比較的狭い場所に制御された気候条件下で比較的長期間にわたって保存できるので、利便的に保存できることが挙げられる。生きた植物の保存は、土地や温室の場所を必要とし、有害な環境条件、病原体の攻撃、及び体細胞変異に脆弱だが、これと比較して、種子保存は安価で比較的に安全である。さらに、種子繁殖は、ある種の（種子を介して伝染しない）病原体を取り除くために用いることもできる。その上、種子繁殖は、組織培養中に投与されたホルモンの長期的効果の結果として成長が次善となるかもしれない（Ｓｍｕｌｄｅｒｓ＆ｄｅ Ｋｌｅｒｋ，２０１１）試験管外に出した植物の成長を、組織培養の結果として低下したＤＮＡメチル化を回復する（Ｍａｃｈｃｚｙｎｓｋａ等，２０１４）などといったことにより（遺伝的なメチル化変化もあるかもしれないが（例えば、Ｓｔｅｌｐｌｕｇ等，２０１４を参照））、改善できるかもしれない。この意味で、種子繁殖は、外植片の生理状態をポジティブに変化させ得るだろう。明らかに、種子繁殖により倍加半数体を再生産する能力は様々な利点をもたらす。雌雄異株作物であるアスパラガスでの倍加半数体の作出には、葯培養（Ｑｉａｏ＆Ｆａｌａｖｉｇｎａ，１９９０）又は小胞子培養（Ｐｅｎｇ＆Ｗｏｌｙｎ，１９９９）が実用されており、アスパラガスではインビトロでの雌性発生の成功例は報告されていない。この結果、インビトロでの半数体の作出は機能的な葯をなす能力を有する雄性植物に限られている。自家受精及び／又はインビトロの雄性発生の実用が不可能であるため、販売用ハイブリッドの種子親の改良は、こうした種子親が早い世代でのハイブリッドの試験で良好な組合せ能力を示した場合でも、妨げられていた（初期試験について、Ｌｏｎｇｉｎ等，２００７参照）。これは、トウモロコシ、コショウ、ナス、アブラナなどの非雌雄異株作物での状況とは異なる。これらの作物では、ハイブリッド栽培品種の種子親を単一植物を起点として用いたさらなる近親交配又は半数体作出のいずれかにより直接改良することができる。要すれば、近親交配並びに／又は自家受粉及びインビトロ雄性発生による種子増殖は、雌性アスパラガス植物に関しては完全に行き詰まっていた。直接的なインビトロの雄性発生は、アスパラガスハイブリッドの種子親などの雌性植物には適用できない。

育種者は、エリートハイブリッド親系統を作るためのツールとして、近親交配や倍加半数体作出に加えて、他の技術を用いることもできる。こうした技術の一つとして、戻し交配育種又は連続戻し交配が挙げられる。戻し交配では、関心のある１つ以上の遺伝子を有するドナー親を、こうした関心のある１つ以上の遺伝子の追加により改善されるかもしれないエリート系統の反復親と交配させる。この交配の子孫を、関心のある形質で選抜した後、反復親と戻し交配させる。この過程は、関心のある遺伝子を（当然ながら）除いて反復親と遺伝的に類似の（同系の）系統を作るために必要な戻し交配の分だけ繰り返される。戻し交配の目的は、この育種過程を介して追加される関心のある遺伝子が追加され且つ反復親と可能な限り同一な系統を得ることである。連続戻し交配又は戻し交配育種は、ハイブリッドの両親としてうまく組み合わさる既知の親系統であるものの、これら系統をよりいっそう完璧な親系統とするための特定の形質をこれまで有していなかった系統の品質を改善する効率的な方法である。非雌雄異株作物では、ハイブリッドの雌親又は雄親として最終的に使われる育種系統のいずれに形質が導入されるべきかといったことは問題にならない。しかし、アスパラガスなどの雌雄異株作物では、雌株を雌株と交配させることはできないので、雌性ドナー植物でみられる形質をハイブリッドの種子親に導入するための第一交配は不可能である。同様に、多くの雄性植物（雄性両全性同株植物を除く）同士は、アスパラガスなどの雌雄異株作物では交雑受精できないので、雄性植物由来の形質を別の雄株に導入するための戻し交配計画を始めるための第一交配は不可能である。さらに以下で説明するように、ある形質を全雄ハイブリッドの雄親に導入するための戻し交配は、その形質のドナーがアスパラガスなどの雌雄異株作物の雌性植物であったとしても、厄介であった。

一般的に、［１］自家受精を適用する能力、［２］連続戻し交配を適用する能力、［３］倍加半数体又は近交系の種子繁殖及び／又は種子貯蔵を適用する能力、又は［４］インビトロの雄性発生による早い世代のハイブリッドの種子親をさらに改良する能力などの上記の育種ツールは、多くの非雌雄異株作物種（例えば、トウモロコシ、コショウ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、ヒマワリ、オオムギ、キュウリ、ナスなど）で使用できる。しかし、アスパラガス・オフィシナリスが両全株ではなく雌雄異株であることにより、アスパラガスの育種では、自家受精、戻し交配、並びにハイブリッド種子親の倍加半数体及びインビトロの雄性発生による種子繁殖は制限される。アスパラガスの育種及び種子繁殖での雌雄異株性により生じる制限を少なくとも部分的に克服する方法を提供することが必要である。このことを十分に理解するためには、アスパラガス・オフィシナリスの性の遺伝や全雄アスパラガスハイブリッドを作るためのいわゆる『超雄株』の使用における全ての側面を知っておく必要がある。このことを以下で詳述する。性的形質の遺伝について述べる前に、まず、読者が以下の文章をより良く理解するのを助けるために、いくつかの定義を行う。雌性アスパラガス植物は、着果を可能にする花柱と柱頭などの完全に発達した雌性器官を有し、白く退化した葯のみをなす花のみをつける植物である。雄性アスパラガス植物は、完全に発達した葯を有する花をつける能力を有する。雄性植物が漿果をつける能力を有する場合、それは雄性両全性同株又は両全株である。雄性両全性同株植物は、退化した雌性器官のみを有する雄花と両全性の「両性」花との両方をつけるが、両全性植物は、両性花のみをつける。高度に雄性両全性同株な植物及び少なくとも真性の両全性植物では、殆ど全ての花から漿果がなると期待されるだろう。しかし、以下でさらに議論するように、このことは両全株にタイプされた植物に常に当てはまるわけではないし（Ｔｈｅｖｅｎｉｎ，１９６７）、混乱することに、高度に雄性両全性同株な植物についても記録がない（Ｗｒｉｃｋｅ，１９６８，Ｗｒｉｃｋｅ，１９７３）。

アスパラガス・オフィシナリスは、雄花又は雌花をつける独立した単性の個体を含む雌雄異株種である。雄花及び雌花は発生の早い段階では心皮及び雄蕊の両方を備えており、雄花での心皮の発育停止及び雌花での雄蕊の発育停止が選択的に生じる結果として性分化が生じるようである。しかし、発育停止パターンは、両性で異なり、雌花では、雄蕊が発達を止め白く崩れ落ち、一方、雄花では、雄蕊が優勢となった後も子房は退化せず生長が阻害された状態に留る（Ｌａｚａｒｔｅ及びＰａｌｓｅｎ，１９７９；Ｃａｐｏｒａｌｉ等，１９９４）。

この植物での性分化の遺伝的制御は、両性に存在する雄蕊及び心皮の発生に関連する構造遺伝子の発現を調節遺伝子が制御するというモデルに基づいている。シレンにおいてＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８年）により提唱された『雄性活性因子』及び『雌性抑圧因子』の２種の調節遺伝子がアスパラガス・オフィシナリスで働いていることが示唆されている。アスパラガスにおける性分化のモデルとしてＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄのモデルを最初に提起した筆頭著者の１人がＷｒｉｃｋｅ（１９６８）である。彼の著作のイントロダクションで、筆者は、同型接合のＸＸである雌性アスパラガス植物と異型接合のＸＹである雄性アスパラガス植物について記載し、自家受精により同型接合のＹＹ植物を得る可能性についても注記している（これはＲｉｃｋ＆Ｈａｎｎａ、１９４８、及びＳｎｅｅｐ、１９５３でも提唱されている）。この自家受精は、極一部ではあるものの雄性植物が両性花をつけることができるため、可能である。ＹＹ雄性植物（『超雄株』とも呼ばれる）は、雌性植物との交配により、雌株を完全に含まない栽培品種、（『全雄ハイブリッド』とも呼ばれる）の作出を可能にする。全雄栽培品種は、当該栽培品種に属する植物が漿果を全くなさない場合、特に貴重であるが、葛藤をもたらす。両性花をつける植物の自家受精によりＹＹ雄を作出する能力が遺伝性であれば、この形質はハイブリッドにもおそらく導入されるので、望ましくない。両性花をつける相対量がどの程度まで遺伝性なのかという疑問は、Ｗｒｉｃｈｅより前に、Ｂｅｅｓｋｏｗ（Ｗｒｉｃｋｅ，１９６８中で引用）により提起されている。Ｂｅｅｓｋｏｗは、花（全て葯を持つ）を、花柱も柱頭も有しない花（Ｉ）から完全に発達した花柱及び柱頭を有する花（ＩＶ）までの段階を示すローマ数字のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶにより示される種類に分類した。Ｗｒｉｃｋｅ（１９６８）は、彼が研究した材料は、主にタイプＩＶの花をつける（タイプ１の花を全くつけない）グループと、主にタイプＩの花をつける（タイプ４の花を全くつけない）タイプのグループとの２つのグループに分類できると説明している。ある雌株と交配させた幾つか雄株がタイプＩＶの花を主につける子孫をなし、一方、当該雌株と交配させた別の雄株がタイプＩの花を主につける子孫をなす（Ｗｒｉｃｋｅの表１を参照）という事実に基づき、Ｗｒｉｃｋｅ（１９６８）は、Ｙ染色体上の主要因子が『雄性両全性同株の程度』をもたらすと結論づけた。この解釈は議論の的となっている。確かに彼のデータは雄性両全性同株性の水準が選ばれた特定の父系植物に依存するようにみえることを示しているものの、これが偶然によるものである（つまり、両親のいずれかではなく当該親に依存するというわけではない）可能性は、限られたセットの雌性植物のみ（２０種の異なる父系植物に対して６種の母系植物）が用いられているため、彼の結果から棄却されるわけではない。

Ｗｒｉｃｋｅは、（１９６８年の刊行物中の）彼の表１に示された結果の問題の解釈について、次の刊行物（Ｗｒｉｃｋｅ、１９７３）中での新しい表１で、前の家系で雄性両全性同株性の水準が高い又は低いことが示された家系にいずれかが属する雌株及び雄株の間の交配による第二世代家系の結果を提示することで、反論した。実際、Ｗｒｉｃｋｅのこの著作（１９７３）で提示されたこれらの家系から得られた結果は、雄性両全性同株性をもたらす因子がＹ染色体上にあるにちがいないことを示唆している。１９６８年の刊行物中で、Ｗｒｉｃｋｅは、雄性両全性同株性をもたらすＹ染色体上の主要因子について繰り返し言及し（このことは論文のサブタイトル『Ｅｉｎ Ｍａｊｏｒｆａｋｔｏｒ ｆｕｒ ｄｉｅ Ａｕｓｐｒａｇｕｎｇ ｄｅｓ Ａｄｒｏｍｏｎｏｏｚｉｅｇｒａｄｅｓ』にも現れている）、この仮説の根拠を高度に雄性両全性同株な植物である『１４３／４ａ／５』から得られた結果の詳細な議論に求めた。この植物（それ自身はタイプＩＩＩ及びＩＶの花を呈する）は３種の母植物と交配された。こうした交配では、雄性両全性同株植物（タイプＩＶ）と雌性植物が得られた。子孫の中で開花しなかった植物を（通常は遅れた開花を示す）雌株と解釈すると、これは、葯の有無で分離され、良く発達した花柱及び柱頭という形質を維持する植物と、１対１に対応している。植物１４３／４ａ／５は、さらに、雄性両全性同株の水準が低いと仮定される３種の父植物と交配された。結果として生じた子孫（４、５、６の番号を振られている）には、雌株が存在せず、雄株（クラスＩ）及び雄性両全性同株植物（クラスＩＶ）の両方が存在した。Ｗｒｉｃｋｅ（１９６８）は、この結果を、彼の論文で引用したＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８）によりシレン（以前の呼称はメランドリウム）について提唱された顕性雌性抑圧因子と一致する、『Ｙ_Ｉ染色体がＹ_ＩＶ染色体に対して顕性である』という遺伝子作用と解釈している。しかし、ＸＹ_ＩＶ×Ｙ_ＩＹ_Ｉと仮定される子孫５、６で得られたＷｒｉｃｋｅ（１９６８）の結果は、実際には、上述のモデルと一致しておらず、ホモ接合性父株（Ｙ_ＩＹ_Ｉ）の仮定上の顕性によれば理論的には存在しないはずの多数の雄性両全性同株植物が観察された。Ｗｒｉｃｋｅは彼の両刊行物中で漿果の着果やその後の種子繁殖の水準について記載していないので、彼の材料の自家受精性は不明なままである。Ｗｒｉｃｋｅ（１９７３）では、果実の着果が記録されなかったことが実に明示的に言及されている。Ｗｒｉｃｋｅ（１９７３）の研究の別の限界として、彼の表１では雄性両全性同株性の平均水準のみが記載されており、これらの家系内での雄性両全性同株性の分離比が提供されていない点が挙げられる。要するに、Ｗｒｉｃｋｅ（１９６８、１９７３）の研究は、雄性両全性同株性の遺伝の正確な方法について十分な教示を与えておらず、提示されたデータは彼の結論を（完全には）支持していない。

アスパラガスにおける性分化のモデルとしてＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄのモデルを次に提起した研究は、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）の研究である。この著者は３種の花のタイプを記載している。タイプ１は、良く発達した雌蕊、三裂柱頭、及び白く退化した葯を備える花を示す。タイプ２は、雌花のものに匹敵する雌蕊と、全ての点で雄花に匹敵する６つの雄蕊とを有する両性花を示す。タイプ３は、雄型の花、又は、中間的な表現型を有し、多かれ少なかれ退縮した雌蕊（サイズが小さくなった子房、退縮した花柱若しくはなくなった（ゼロ個の）花柱、裂片が１つか２つで乳頭突起の数が減少した又はゼロ個の柱頭）を有する花を指す。彼女は、さらに、雌花をつける植物は他のタイプをつけず、タイプ２の花をつける植物についてもそうであると述べている。要するに、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）は全ての花が両性であり得る植物を記載している。しかし、タイプ１の花を除いて、漿果や種子の生産は花の形態に完全に依存しているわけではないことに留意されたい。Ｔｈｅｖｅｎｉｎの研究では、通常、タイプ２の花をのみをつける植物は、ゼロから、１千、最大で数千まで変わり得る数の漿果（但し、後者の数は例外的である）をつけると説明している。重要な点として、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）の研究からは、各花から果実を着果する（開花から推測される）両性花を彼女が発見したのか否か不明であることに留意されたい。記載のある両性花は、１つの種子のみを通常は包含する小さな漿果をつける。Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）は、両性花が、雌性植物で普通みられる黒く完全な種皮とは異なり不完全な（白い）種皮を有する少なくとも幾つかの種子を通常つけることを指摘している。非制御下及び制御下の自家受精により、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）は、（当該植物で観察される花に基づいて）タイプ２又はタイプ３のいずれかに分類される植物について子孫を得た。これら子孫は、それぞれ、雌性植物、雄性植物、及び両性植物に分離された。雄性植物と両性植物の両方がこの子孫でみられたという事実は問題をもたらす。Ｗｒｉｃｋｅ（１９６８）と同様に、ＴｈｅｖｅｎｉｎもＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８）のモデルを採用している。彼女は、こうした両性植物は、連鎖遺伝子［Ｍ ｓｕ］の組（但し、『Ｍ』は、葯発生に関連する遺伝子を示し、『ｓｕ』は、Ｍと通常連鎖している顕性雌性抑圧因子Ｓｕの潜性アレルを示す）で生じた交差事象に由来すると仮説を立てている。このモデルによれば、［Ｍ ｓｕ／Ｍ ｓｕ］植物を自家受精させると、理論的には、子孫には［Ｍ ｓｕ／Ｍ ｓｕ］雄株は存在しないはずだが、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）の研究ではこうした雄株がみつかっている。これを説明するため、Ｔｈｅｖｅｎｉｎは、ホモ接合条件で顕性Ｍアレルを備える植物での柱頭発生にネガティブに干渉する一連の潜性遺伝子『ｒ』を導入している。

２種の連鎖遺伝子によるアスパラガスでの性決定の遺伝機構を記載している最後の人物は、Ｍａｒｋｓ（１９７３）である。この著者はＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８）に明示的には触れていないものの、潜性遺伝子『ｇ』が雌蕊群を制御し、これが、雄蕊群に関連する顕性遺伝子『Ａ』と密接に連鎖しているという等価なモデルを提示している。Ｍａｒｋｓ（１９７３）は、このモデルは、『両性花で得られる結果を説明するのに修正を全く又は殆ど必要としないため』、他のモデルと比べてより適切であると述べ、自説の主張のために、以前にＰｅｉｒｃｅ及びＣｕｒｒｅｎｃｅ（１９６２）で得られているデータを用いている。後者の著者等は、両性花を有する両全株栽培種アスパラガス植物について記載し、両全株の遺伝について明らかにするため交配実験を行った。Ｐｅｉｒｃｅ及びＣｕｒｒｅｎｃｅ（１９６２）の結果によれば、両全株性は３０から４０ｃＭの交差距離で隔てられている性染色体上の数種の顕性連鎖遺伝子により制御されていることになる。数種の顕性遺伝子を報告しているＰｅｉｒｃｅ及びＣｕｒｒｅｎｃｅ（１９６２）の解釈と比べると、雌蕊群発達のための連鎖潜性遺伝子と組み合わされた雄蕊群発達のための顕性遺伝子を報告しているＭａｒｋｓ（１９７３）のモデルは、まったく異なっている。Ｍａｒｋｓ（１９７３）のモデルは、２つの家系（『２−３』及び『３−４』）には適合するものの、彼のモデルは、他の２つの家系（『１−６』及び『４−１』）での雄株の存在については上手く説明できていない。こうした雄株は、Ｍａｒｋｓ（１９７３）によれば、『ｇＡ座位に関する限り遺伝的に両全性であるものの、ホモ接合時に雌蕊群を抑圧する潜性遺伝子ｓをさらに有するため、こうした植物は表現型としては雄性となる』と説明されている。こうした意味で、彼のモデルは、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ（１９６７）のモデルと同様に多遺伝子である。『２−１』家系に由来する第２世代Ｆ_２及びＢＣ_１の家系での理論比と観察との間の不整合は、Ｍａｒｋｓ（１９７３）では、異常分離の結果と説明されている。彼は、自身の考えによれば『両性花で得られる結果を説明するのに修正を全く又は殆ど必要としない』モデルを提案したと主張しているものの、このモデルも、他のモデルと同様に、さらなる検証を受けていない潜性修飾因子や異常分離といった説明仮説に依然として基づいている。Ｍａｒｋｓ（１９７３）は、彼の論文を彼の仮説の検証法に導くディスカッションセクション（１２９頁）で、Ｔｈｅｖｅｎｉｎの疑問について、より多くのデータが必要となるだろうと回答している。ニューハンプシャー大学のＬｉｎｃｏｌｎ Ｃ． Ｐｅｉｒｃｅ名誉教授との私信（２０１０年及び２０１５年のｅ−ｍａｉｌ）は、家系２−３で得られた、取り分けさらに世代を経て得られた実験的証拠が、Ｍａｒｋｓ（１９７３）により示唆されたモデルからの生じるだろう状況よりも混迷していることを示す未公表のデータが数多く得られたことを指している。名誉教授は、『元の研究を終え公表した後、遺伝システムについてもっとよく知りたいと願い、私は交配を続けた。交配又は自家受粉を重ねる毎に、つじつまが合わないことが見つかり、しかも、その全てが元の交配種又は戻し交配種に由来する材料から見つかるのだ。』と述懐されていた。さらに、彼は、『「２−３」はユニークで、後の交配や自家受粉ではこれに類似した植物を見つけることができなかった。それ故、他の因子が関連しているにちがいないとの結論には至ったものの、未だ追求することができずにいる。』とも書かれていた。

２−３の独自性について詳しくご教示いただきたいとの質問に、名誉教授は、『２−３同様の系統は見つからず』、ある意味、『全ての花が漿果をなすものの完全に発達した葯を有する２−３と同程度の強さで両全性である派生系統は二度と見つからなかった』と返答されている。

この未公表の結果は、後の子孫で２−３と同程度に両全性である植物が観察されるだろうと予測する（雄蕊群に関連する顕性遺伝子『Ａ』と密接に連鎖している、雌蕊群を制御する潜性遺伝子『ｇ』に基づく）Ｍａｒｋｓ（１９７３）のモデルとは対照的である。

要するに、雄性雌性抑圧因子に言及するＷｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８）のモデルがアスパラガスで働いているだろうと想定する各研究では（Ｌｏｐｅｚ−Ａｌｉｄｏ及びＣｏｉｎｔｒｙ、２００８）、その結果はこのモデルと完全には一致しておらず、或いは、より厳しい見方をすれば、その結果はこのモデルを棄却している。

Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄのモデルが公表される前の初期の研究はＳｎｅｅｐによる（Ｓｎｅｅｐ、１９５３ａ、１９５３ｂ）。この著者は、超雄株を得るためのハイブリッドの両親として雄性両全性同株植物の使用を強く支持し、販売用種子での雄性両全性同株性を防ぐことの重要性を認識しつつ、この問題を解決する可能性のある形質の遺伝分析を行った。彼が記載した子孫のうち、ある雄性両全性同株同胞は、３世代を経たものであるが、前述の形質を維持していたものの、別の雄性両全性同株同胞は、雄性両全性同株個体に加えて、純粋な雄株個体を生み出す能力を有していた。この結果を受け、Ｓｎｅｅｐ（１９５８ｂ）は、雄性両全性同株性は顕性因子により制御され、子孫の規模が極めて少ないため関連する因子の数を予測できないと結論している。雄性両全性同株性を防ぐ方法として、彼は、雄性両全性同株を制御する顕性遺伝子の潜性アレルを有する植物を選抜することを提案している。

Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９５８）のモデルと（部分的に重複するに過ぎないが）類似の別のモデルとして、Ｆｒａｎｋｅｎ（１９７０）により提唱されたモデルがある。この著者は、自家受精させた雄性両全性同株植物の子孫の数種を研究し、ある不完全顕性遺伝子（彼の命名によれば修飾因子『Ａ』）が、雌蕊の発生の抑圧に関与しており（下表参照）、この遺伝子がＸ染色体上に位置する雄性不稔アレルとは独立に遺伝すると結論づけた。

性の遺伝のモデルとしてＦｒａｎｋｅｎ（１９７０）により提唱された表現型（性別）及び遺伝子型
雌株 雄株 雄性両全性同株
ＸＸ ＡＡ ＸＹ ＡＡ ＸＹ Ａａ；弱
ＸＸ Ａａ ＸＹ ＡＡ ＸＹ ａａ；強
ＸＸ ａａ ＹＹ Ａａ ＹＹ ａａ；中

Ｆｒａｎｋｅｎ（１９７０）により提唱されたモデルは、幾つかの戻し交配種で雌蕊の長さを解析し、花柱の長さ及び柱頭の発生に影響を与える因子（修飾因子）は性染色体上に局在していないと結論づけたＧａｌｌｉ等（１９９３）の結果と一致している。Ｇａｌｌｉ等（１９９３）のモデルでは、花柱の長さの戻し交配種での分布は少なくとも２つの座位が関与するというモデルと合っていた。上述の表に示したＦｒａｎｋｅｎのモデルは、主に、Ｙ染色体が雄蕊のある（スタミネートな）花（葯あり雌蕊なし）を生じさせ、潜性『ａ』アレルが、Ｙ染色体の効果を弱め、ある程度の雌蕊の発生を可能とするという補足遺伝子作用の付加遺伝モデルである。雄蕊がある（スタミネートな）方向（葯あり雌蕊なし）に花を進めるＹ染色体の数と、ある程度の雌蕊の発生を可能とする潜性『ａ』アレルの数との間のバランスが、生み出され得る両性花の水準を決める。Ｆｒａｎｋｅｎ（１９７０）は、彼の交配結果の全てが単純な遺伝モデルで説明できるわけではなく、Ｆｒａｎｋｅｎの博士論文において表で示した結果（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９６９、第８章、５６−５８頁の表３７ａ及び表３７ｂを参照）の入念な検討から、雄性両全性同株性が、環境による影響を受け得る、定性的というよりむしろ定量的な形質であることが示唆されると認識していた。この定量的な観点を満たすため、特に、ときとしてより多くが雄性両全性同株となる傾向を有するＹＹＡａ植物を説明するために、Ｆｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）は、雄株での柱頭発生にポジティブに寄与するＧ因子を導入した。即ち、Ｓｎｅｅｐ（１９５３ｂ）同様に、Ｆｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）も、雄性両全性同株性に寄与し得る顕性遺伝子に言及している。

上述の研究の全てが、雄性両全性同株植物（時に、全ての花が両性である場合、両全株とも呼ばれる）についた花の自家受精により雄性植物を作出することができることを示していた。さらに、雄性両全性同株植物（ＸＹ）を自家受精させると、子孫の四分の一がＹＹ（アスパラガス育種では超雄株と呼ばれる）であることも説明されていた。雌親を受粉させるための父親として超雄株を用いる場合、全ての植物が、ＸＹ、即ち、葯をつけるようになる雄株である雑種子孫が得られる。しかし、これらの植物が漿果をなす能力を有するようになるか否かは、『Ｓｕ／ｓｕ』及び『ｒ』（Ｔｈｅｖｅｎｉｎ、１９６７）、『Ｙ』、『Ａ／ａ』、及び『Ｇ』（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９６９，１９７０）、『数種の顕性因子』（Ｓｎｅｅｐ、１９５３ａ、１９５３ｂ、Ｐｅｉｒｃｅ及びＣｕｒｒｅｎｃｅ、１９６１）、『Ｓｕ^Ｆ/ｓｕ^Ｆ』、『加えて、柱頭発生を中程度に又は強く制御する変更遺伝子』（Ｗｒｉｃｋｅ、１９６７、２０９頁）、『ホモ接合時に雌蕊群を抑圧する潜性遺伝子ｓ』又は異常分離による影響を受けているかもしれない表現型頻度などの複数の因子にかかることになるだろう。

これら変更遺伝子又は因子は、一部が同じ遺伝子又は因子を示しているかもしれないが、全て、未知である。Ｓｎｅｅｐにより既に指摘されているように、超雄株を作るために用いる雄性両全性同株性形質は販売用種子に残存するべきではない。これは以下のように葛藤をもたらす。遺伝的雄性両全性同株性を介した自家受精によりハイブリッド栽培品種の親系統を作ることができ、この遺伝形質が発現すればするほど、系統の作成を効率的に行うことができるようになる。しかし、こうした親系統の間の交配に由来するハイブリッドはこの遺伝形質を発現してはならない。この遺伝形質が複雑で未知な場合、育種者は、ハイブリッドの近交親系統を作るためには、その発現を利用しつつ、この親系統を販売用種子を作るために用いるときには、その発現を回避するといったことをできない。

その結果、育種者は、雄性両全性同株植物の自殖によりＹＹ植物を得ることをなるべく避け、代わりに、雄性植物の葯培養によりこうした植物を得ることを好む。しかし、親植物として倍加半数体を用いる場合であっても、Ｙ染色体の仮説上の雄化効果（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９７０による仮説）を克服するのに十分な数の修飾因子が母系又は父系側のいずれかの親植物で積み重なれば、雄性両全性同株のハイブリッドができる可能性がある。育種者が雄性両全性同株植物を用いて近親交配を適用しようとする場合、この作業は、雄性両全性同株性又は両全株性は育種材料の約０．１から２％までしか生じないため雄性両全性同株性が遺伝子プール又は遺伝資源の僅かな部分集合に限定されているという事実により、制限を受けることに留意されたい。要するに、育種者は修飾因子がハイブリッドに残存することを避けねばならず、さらに、遺伝子プール全体で十分な雄性両全性同株性が滅多に利用できないことから、育種者は制限を受ける。

超雄株が雄性両全性同株性を用いた自家受精又は葯培養により得られたものであるか否かによらず、作られた超雄株は、共通の自家受粉種（トマト、コショウ、ナス、ナタネ、ブロッコリーなど）に属する作物のハイブリッドによる雄親と比べて、欠点がある。まず、表現型を雄性両全性同株性に向けて好適に修正する遺伝子は避けねばならない（さもなくば望まぬ漿果が作られてしまう）ため、超雄株は大規模な種子繁殖に掛けることが全くできない。次に、重要な点だが、第一交配で得られるＦ１植物が、新しい形質を導入すべき超雄株に直接に戻し交配することができない雄株となるため、超雄株は連続戻し交配により改良することができない。

育種者が自家受精を行える両性花の使用を望む場合、両全性形質の遺伝が少なくとも単純であることが望ましく、一世代又は僅か二三世代で簡単に取り除けるので、一遺伝子性遺伝形質が好ましいだろう。好ましくは、こうした一遺伝子性形質は遺伝子マーカーにより選抜することができる。

要するに、アスパラガス育種の分野では、遺伝が単純なため、予測が容易であり、また、育種の特定段階で、好ましくは、遺伝子マーカーにより、それがあるものやないものを簡単に選抜できる両全株性を利用できることで、大きな利益が得られると考えられる。さらに、アスパラガス育種の分野では、育種者が、自家受精による近親交配を可能とし、近交系を種子繁殖させたり倍加半数体を種子繁殖させたりすることを可能にする方法を用いることができれば、大きな利益が得られると考えられる。最後に、アスパラガス育種者は反復親としての超雄株植物に直接的な連続戻し交配を適用できるようになればと望んでいると考えられる。育種者は、雄性両全性同株性に有利に働く性染色体に連鎖していない未知の修飾因子の導入に悩まされたり、十分な天然の雄性両全性同株性を示す植物の数が限られていることに悩まされたりせずに、上述の全てを実行できるようになればと望んでいると考えられる。上述の全ての問題を解決するために、雄性植物から両全株へ変えること、又は、より遺伝学的には、育種スキームにおいて植物の性に影響を与える方法が、標的を取り一時的に働くものであることが理想的である。

仮説には上がっているものの、その存在が完全には証明されておらず、また、少なくとも一遺伝子的に働くことが証明されていない雌性抑圧因子又は雌蕊群抑圧因子が同定され、『オン・オフをスイッチする』という意味で、操作できることが、よりいっそう理想的な状況である。

育種者が雌蕊群発達を可能としたり不可能としたりといったことに興味を抱く場合、種子及び花粉親の一方又は両方としての植物の用途に依存するが、この育種者は雄蕊群発達を可能とすることにも興味を抱くだろう。雌性植物で雄蕊群発達を可能にすると実質的にその性が変わるが、これにより、本来は雌性の植物から他家受粉なしで（即ち、自家受精により）種子を得ることが可能となり、また、こうした植物からインビトロ雄性発生により倍加半数体を得る能力が提供されると考えられる。これにより、自家受粉を可能化された本来は雌性の植物と比べてより優れている育種系統の導出に繋がるかもしれない近親交配が可能となるだろう。雌性育種系統の種子保存も可能となるだろう。雌性植物（本来は機能的な葯を持たない）及び雄性植物（本来は雌蕊群発達が完全又は部分的に生じない）の性を調節し変更する能力は、雌雄異株性により現在は妨げられている交配スキームに自由度を与えるだろう。また、雌性植物及び雄性植物の性を調節し変更する能力は、ハイブリッド交配において優れた汎用組合せ株であるようにみえる雄性植物を雌性植物に変更し、適当な雄性植物と交配させたり、ハイブリッド交配において優れた汎用組合せ株であるようにみえる雌性植物を雄性植物に変更し、適当な雌性植物と交配させたりできる場合、ハイブリッドを作る際の遺伝子プールを拡張するかもしれない。

本分野では、こうした性変化が生じるだろうことは示唆されていたものの（Ｍａｅｄａ等、２００５）、証拠が極めて弱いため、本当に起きるのか定かではなく、ましてや、どのようにそれがなされ得るのか理解もできなかった。

Ｍａｅｄａ等（２００５）が発表した研究では、インビトロ胚発生の結果として雄性のビトロクローンの栽培品種Ｆｅｓｔｏから雌性アスパラガスが得られるとの仮説が立てられている。性転換が『確認』され、『今回の研究での性転換は、染色体再配置の一種である体細胞乗換などの体細胞変異の結果かもしれない』とも書かれている。この性転換仮説は、調査場所でみつかったたった一つの雌性植物を五つの雄性植物と比較した遺伝分析に基づいている。Ｍａｅｄａ等（２００５）は、以前にＯｚａｋｉ等（２０００ａ）で用いられたアロザイムを用いている。Ｏｚａｋｉは、両論文の責任著者である。Ｏｚａｋｉ等（２０００ａ）は、アロザイムの使用について汚染の検出の観点から繰り返し議論を行っていた。しかし、Ｍａｅｄａ等（２００５）は、植物汚染を試験せずに、複数の体細胞組換事象の観点のみから彼らの結果を議論し、ヘテロ接合の喪失を、特に、Ｍ座位に緩く連鎖しているＭｄｈ１アロザイム座位の変化を、性転換理論に結び付けている。試験した座位のほとんど半分について、観察された雌性遺伝子型は、それの由来であると期待された雄株と比べて、異なっていたことが判明している。著者らは、８箇所のアロザイム座位を試験し、雌性植物が雄性植物と５箇所の座位、ＡａｔＩの『ｂｂ』、Ａａｔ２の『ａａ』、Ａａｔ−３の『ｂｂ』、Ｐｇｍ−１の『ｂｃ』、及びＳｋｄｈ−１の『ａｂ』で、類似していることを発見した。これは、座位の数が少なく、類似する２つの座位、ＡａｔＩとＡａｔ２の弁別力が限定的であったように思われる。Ｏｚａｋｉ等（２０００ａ）は、試験した９種の栽培品種のうち、わずか２つのアレルでＡａｔＩが観察され、『ｂｂ』ホモ接合遺伝子型はこれらのうち８種で観察されたことを示している。さらに、Ａａｔ２は多様性が全く無いように思われる。さらに、他の２つの座位、Ｐｄｍ−１及びＳｋｄｈ−１は緊密に連鎖しており（４−６ｃＭ、Ｏｚａｋｉ等、２０００ａ及びその参考文献を参照）、これらの座位マーカーが実質的に同じ座位を標的としているため、弁別力が制限されることに留意されたい。他の３つの座位では、雄性対照植物と雌性植物との間で、差が観察された。雄性対照植物対雌性植物の形式で列記すると、ＭｄｈＩでは『ａｎ』対『ｎｎ』、Ｍｄｈ２では『ａｎ』対『ｕｎ』、ｉｄｈＩでは、『ａｎ』対『ａａ』である。

著者等は、性転換は性決定座位において遺伝子型が『Ｍｍ』から『ｍｍ』に変化した結果であるかもしれず、『Ｍｄｈ−１及びＩｄｈ−１が変異によりヘテロ接合性からホモ接合性に変化した』と理由付けをしている。これは、推論が過ぎるだけでなく、理論も事実誤認の仮定に基づいているように思われる。著者等は、ＭｄｈＩがＭ座位に連鎖していることを示すＭａｅｓｔｒｉ等（１９９１）の研究を引用している。この研究では、実際に、当該連鎖について記載されている。著者等は、『Ａａｔ−１／Ｍｄｈ−１、Ａａｔ−１／Ｉｄｈ−１、及びＰｇｍ−１／Ｓｋｄｈ−１の３つの連鎖対が従来認識されていた（Ｏｚａｋｉ等、２０００ｂ）』とも述べているが、これは正しくなく、Ｏｚａｋｉ等（２０００ｂ）はＩｄｈ１がＡａｔ１ではなくＡａｔ３に連鎖していることを発見している。

従って、単一の同じ染色体の（一部）に影響する明白な事象であるかのように両方の座位が『変異によって変わった』というシナリオは支持されない。Ｍｄｈ１のヘテロ接合性の喪失が仮説上の性転換に関連しているかもしれない変異に繋がっているという何らかの証拠を得るためには、少なくとも、前述の雌株で観察された問題の喪失アレルが元の栽培品種で雄の表現型を付与する顕性Ｍアレルと相引相又は『インシス（ｉｎ ｃｉｓ）』で連鎖していることを確定させねばならない。こうした仮説の試験は、Ｍａｅｓｔｒｉ等（１９９１）が栽培品種ＦｅｓｔｏとはＭｄｈＩ座位が異なっており好ましくはホモ接合性である雌株を用いて行ったような検定交配で容易に実行できる。こうした実験はＭａｅｄａ等（２００５）によって行われておらず、このため、問題の喪失ＭｄｈＩアレルと問題の性転換との関係は、因果関係という意味で、未解決のままである。

第３の変数である座位Ｍｄｈ２はＭｄｈ１に連鎖していないことが分かっている（Ｏｚａｋｉ等、２０００ｂ参照）。

Ｍｄｈ遺伝子を標的とするＬｉｍｇｒｏｕｐの独占マーカー、
ＣＡＧＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＡＴＴＴＡＣ［Ｃ／Ｔ］ＧＧＧＴＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＡ
がＡｓｐ２７６の
ＧＴＡＧＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧ［Ｃ／Ｔ］ＧＴＴＣＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣＧＧＧＣＴ
に連鎖していることが発見された。これは、性染色体ではなく、適切にマップされた集団で染色体８の番号が付された染色体にマップされていた。

このことから、Ｍ座位に連鎖していることが判明したＭｄｈ１がＭｄｈ２と連鎖していないことが再確認された。Ｍａｅｄａ等（２００５）は、この点について、例えば、観察された遺伝的多様性からもたらされ得る汚染が調査場所で頻繁に生じる事象であるか否かを明らかにするために、より決定的なデータを提供できたはずである。こうした第２世代の植物を試験しなかった理由は説明されていない。

要するに、Ｍａｅｄａ等（２００５）により確認された性転換の報告は、当業者の議論の的となり、当業者にとって答えのない疑問を数多くまねくはずなので、性転換アスパラガス植物をインビトロ胚発生により得ることができるか否かについて十分な教示をもたらさない。

従って、雌雄同株植物の、特に、アスパラガス植物の育種者は、依然として、遺伝が単純なため、予測が容易であり、また、育種の特定段階でそれがあるものやないものを簡単に選抜できる両全株性を利用できることを必要としている。さらに、熟練の育種者は雄蕊群発達を可能とすることにも興味を抱くだろう。雌性植物で雄蕊群発達を可能にすると実質的にその性が変わるが、これにより、本来は雌性の植物から他家受粉なしで（即ち、自家受精により）種子を得ることが可能となり、また、こうした植物からインビトロ雄性発生により倍加半数体を得る能力が提供されると考えられる。

本発明は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下されている植物を準備する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法に関する。さらなる実施形態では、本発明は、親植物の一方又は両方が、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下させられている植物である、雌雄異株植物を自家受精又は交雑受精させる方法に関する。別のさらなる実施形態では、本発明は、ＧＤＳタンパク質の発現を阻害することにより、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログの発現を減少させることにより、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下させられている植物を作る方法に関する。より具体的には、本発明の上述の方法では、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現の破壊又は低下が、ＧＤＳ遺伝子（好ましくは、配列番号１の配列、又はそのオルソログ、機能的ホモログ、若しくは機能的断片を含むＧＤＳ遺伝子）の発現を阻害することにより生じている。好ましくは、本発明の方法は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現を破壊又は低下させるためにＧＤＳ遺伝子に変異を導入する工程を備える。従って、上述の方法は、変異ＧＤＳ遺伝子を含む植物を用いることが好ましく、当該変異はＤＮＡ置換により生じたものであることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、クサスギカズラ属の一種の植物、好ましくは、アスパラガス・オフィシナリスで行われることが好ましい。

また、本発明の一態様は、雌蕊群発達タンパク質の顕性抑圧因子の発現が破壊又は低下させられている雌雄異株植物、好ましくは、クサスギカズラ属の一種の植物、より好ましくは、アスパラガス・オフィシナリス種の植物である。好ましくは、当該植物では、ＧＤＳ遺伝子の発現が破壊又は低下させられている。さらなる好ましい実施形態では、当該植物は変異処理を受けており、好ましくは、当該処理は放射性元素による放射を含む。当該植物についてさらに好ましいのは、それが、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現を破壊又は低下させる能力を有するヌクレオチド配列を形質転換又はトランスフェクションにより導入されており、好ましくは、当該ヌクレオチド配列はＧＤＳ遺伝子の配列に相同又は部分的に相同であり、特に、当該発現の破壊又は低下が可逆的であることである。

また、本発明は、顕性雄性刺激因子の機能的発現が回復させられている植物を準備する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統育種技術に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより補われている植物を準備する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統技術に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法を包含する。好ましくは、当該方法では、顕性雄性刺激因子の導入が非相同顕性雄性刺激因子の発現を雌雄異株植物で誘導することにより行われ、好ましくは、顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質であり、好ましくは、ＴＤＦ１タンパク質は、配列番号５のアスパラガス・オフィシナリスＴＤＦ１遺伝子、又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログ若しくは機能的断片であり、好ましくは、当該機能的断片は、ＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログのＲ２及びＲ３ドメインを少なくとも含んでいる。さらに好ましい実施形態では、顕性雄性刺激因子をコードする遺伝子は、配列番号４のアスパラガス・オフィシナリスＴＤＦ１遺伝子、又は、そのオルソログ若しくは機能的ホモログ、若しくは上で規定するＴＤＦタンパク質の断片をコードする当該遺伝子の断片である。

さらに、本発明の一態様は、親植物の一方又は両方が、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が回復又は前記顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより補われている植物であり、好ましくは、顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログである、雌雄異株植物を自家受精又は交雑受精させる方法である。

また、本発明の一態様は、葯を提供するために用いられる植物が、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が回復又は前記顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより補われている植物であり、好ましくは、顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログである、インビトロ雄性発生を行う方法である。

また、本発明の一態様は、配列番号２のアミノ酸配列又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログを含むクサスギカズラ属植物における雌蕊群発達を抑圧する能力を有するタンパク質である。さらに、本発明は、配列番号１のｃＤＮＡ配列又は配列番号３から派生し得るゲノム配列である、上述のタンパク質をコードする核酸配列も包含する。

また、本発明の一態様は、雌雄異株種由来の植物での雄性化をもたらす能力を有するタンパク質であって、配列番号５のアミノ酸配列、又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログ、若しくは請求項１７内で規定する当該アミノ酸配列の断片を含む、タンパク質である。さらに、本発明は、配列番号４のｃＤＮＡ配列又は請求項１７内で規定する断片をコードする能力を有する当該ｃＤＮＡ配列の断片である、請求項２３に記載のタンパク質をコードする核酸配列も包含する。

また、本発明の一態様は、ある育種スキームにより得られた雌雄異株種のハイブリッド植物、好ましくは、本発明に係る育種方法の一つを介して作られた近交系植物に由来するハイブリッド植物である。

さらに、本発明の一態様は、雌化植物を提供する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法である。

さらに、本発明は、脱雌化植物を提供する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法も含む。

さらに、本発明は、雄化植物を提供する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法も含む。

また、本発明は、脱雄化植物を提供する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法も含む。

ＤＨ００／０９４（“ＸＸ Ｆｅｍａｌｅ Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ”トラックとして図示）のリードのリードカバレッジが１０４，６８８位で突然（３０倍から０へと）低下するものの、雄のＨＤ００／０８６（“ＹＹ Ｍａｌｅ ｍａｐｐｉｎｇ”として図示）のリードカバレッジが高値を維持すること示すｓｃａｆｆｏｌｄ９０５の例。これは当該領域が性染色体の常染色体部分と雄特異的部分（ＭＳＹ；Ｍａｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｒｔ）との間の境界となっていることを示唆する。 公知のマーカーであるＡｓｐ１−Ｔ７とＡｓｐ２−ＳＰ６が位置するｓｃａｆｆｏｌｄ９０５の位置の例。Ａｓｐ２−Ｔ６は予測遺伝子Ａｏｆ３１５２７．１に極めて近い位置にある点に注意。リシークエンスした雌株（ＸＸ Ｆｅｍａｌｅ Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅトラック参照）ではシークエンスリードが欠けているが、リシークエンスした雄株（“ＹＹ Ｍａｌｅ ｍａｐｐｉｎｇ”トラックとして図示）ではリードが豊富である。３１２５００位でのリードの欠損はメイトペアリードにある不明配列ＮＮＮＮの結果である。 公知のマーカーであるＡｓｐ１−Ｔ７とＡｓｐ２−ＳＰ６が位置するＭ−ｌｏｃｕｓ ｓｃａｆｆｏｌｄ４の位置の例。Ａｓｐ２−Ｔ６は予測遺伝子Ａｏｆ００６５．２に極めて近い位置にある点に注意。リシークエンスした雌株（ＸＸ Ｆｅｍａｌｅ Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅトラック参照）ではシークエンスリードが欠けているが、リシークエンスした雄株（“ＹＹ Ｍａｌｅ ｍａｐｐｉｎｇ”トラックとして図示）ではリードが豊富である。図中の表示はｓｃａｆｆｏｌｄ９０５について示した表示（図１Ｃ）と似ているものの、遺伝子の向きは反転している。さらに、ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５では第２エクソンが２つの部分に分かれているものの、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４では第２エクソンが単一のエクソンとなっている点に注意。サンガーシークエンシングにより、第２エクソンについては、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４の表示が、正確であり、軽微なアセンブリエラーを明白に含むｓｃａｆｆｏｌｄ９０５に比べて妥当な表示であることが分かった。 イントロン２のドナースプライス部位。ＭＬ４ＤＵＦ２４７はＣＤＳ２／イントロン２境界に位置する。ＥＶＭ１の予測をプラス鎖配列の直上に示すが、これから黒の縦線で図示する推定５’−スプライス部位（ＴＧ／ＧＣ）が予測される。遺伝子型ＤＨ００／０８６の花芽から単離したＲＮＡに由来する２つのｃＤＮＡ配列を、マイナス鎖配列の下に、ＣＰ３５ＣＲ５５＿５７及びＣＲ５５ＣＲ５７＿５７として図示する。実際のスプライス部位をｃＤＮＡ５’−スプライス部位（ＧＣ／ＧＴ）として図示する。２７９５位のシトシンは植物のドナースプライス部位ではこれまで報告されていなかった。２８３５位のチミジンは１００％保存されている。 アスパラガス・オフィシナリスのゲノムＤＮＡの別の解析に基づくＤＵＦ２４７遺伝子の別のｃＤＮＡ配列。 Ｙ連鎖Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４に対して行ったＧ０３３（ＬＩＭ＿Ｇ０３３＿Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓとして図示する）及びＫ３２３（ＬＩＭ＿Ｋ３２３＿Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓとして図示する）のショートリードアライメント。ＢＧＩ遺伝子アノテーションのトラックは、予測イントロンを示す細い線で隔てられた太いバーとしてＦＧＥＮＥＳＨ予測エクソンを示す。ＥＶＭは証拠に基づく遺伝子モデルを示した（詳細は実施例１の本文を参照）。破線はＧ０３３にマッピングされたリードが存在しない領域を囲っており、これはＤＵＦ２４７の当該部分がもともと欠失していることを示している。矢印はインサートの境界を示すクリップリード（本文参照）を示す。 ＣＮ７８／ＣＮ８３のプライマーペアを用いた両性花Ｇ０３３のシークエンシングにより得られた２種のサンガーリード、及び、参照としてのＣＮ５９／ＣＮ７０のプライマーペアを用いた野生型ハイブリッドのサンガーリードの例。プライマーペアについては表３プライマーを参照のこと。 Ｇ０３３の配列が他種のリードと比べて異なってみえるイントロン部位を示す、シークエンスした雄株、両全株５３７５、及び両全株Ｇ０３３のアライメント。 雌株１８００×選抜Ｆ１（５３７５×１７７０）の疑似検定交配（ｐｓｅｕｄｏ ｔｅｓｔ ｃｒｏｓｓ）の３Ｅの家計の最初の植物が開花してから開花した植物の累計数。実線の曲線は雄性植物由来の花の累計数を示し、破線は両全性植物の花の累計数を示す。 シロイヌナズナ系統の１０の発生段階に渡るシロイヌナズナの１０のＤＵＦ２４７様遺伝子の全ての利用可能な遺伝子発現を用いたＧＥＮＥＶＥＳＴＩＣＡＴＯＲ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｏｒｇ、ＮＥＢＩＯＮ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）での実験。ＡＴ２Ｇ３８５４０は無関係シロイヌナズナＴＤＦ１遺伝子である。発現ポテンシャル百分率（Ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を、遺伝子と段階の組み合わせ毎に６グループの色を付けて表示している。 シロイヌナズナ系統の１０の発生段階に渡るシロイヌナズナの９つの色を付けたＤＵＦ２４７様遺伝子の全ての利用可能な遺伝子発現を用いたＧＥＮＥＶＥＳＴＩＣＡＴＯＲ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｏｒｇ、ＮＥＢＩＯＮ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）での実験。ＡＴ２Ｇ３８５４０は無関係シロイヌナズナＴＤＦ１遺伝子である。発現の水準（シロイヌナズナＡＴＨ１ゲノムアレイの信号強度）を、遺伝子と段階の組み合わせ毎にＬＯＷ、ＭＥＤＩＵＭ、又はＨＩＧＨとして表示している。 シロイヌナズナ系統の１２７の解剖部位に渡るシロイヌナズナの１０のＤＵＦ２４７様遺伝子の全ての利用可能な遺伝子発現を用いたＧＥＮＥＶＥＳＴＩＣＡＴＯＲ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｏｒｇ、ＮＥＢＩＯＮ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）での実験。発現ポテンシャル百分率を、遺伝子と解剖部位の組み合わせ毎に６グループの色を付けて表示しているシロイヌナズナの開花データを、花器官について詳細に示すが、雌蕊データでの遺伝子発現が比較的に低い値であることが目立つ。 ＦＧｅｎｅｓｈ（ＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＦＧ）及びＥＶＭ（ＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＥＶＭ）の２種の遺伝子の予測（暗部）並びにそれぞれのコード配列（ＦＧ予測についてはＣＤＳ１、ＣＤＳ２、ＥＶＭ予測についてはＣＤＳ１−ＣＤＳ３）。中央のバーは、ＤＨ雄株ＤＨ００／０８６の花芽由来のｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列で検出されたジェネリック配列及び対応するコード配列を示す。イントロン２の５’−スプライス部位はＥＶＭ予測と比べて４２ｂｐ上流にずれている。 シロイヌナズナ野生型実験の選択解剖部位に渡るシロイヌナズナ１０のＤＵＦ２４７ドメイン含有遺伝子の全ての利用可能な遺伝子発現を用いたＧＥＮＥＶＥＳＴＩＣＡＴＯＲ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｏｒｇ、ＮＥＢＩＯＮ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）での実験。選択には、未成熟及び成熟花の発現データを４組含む。ＡＴ２Ｇ３８５４０は無関係シロイヌナズナＴＤＦ１遺伝子である。発現ポテンシャル百分率を、遺伝子と解剖部位の組み合わせ毎に６グループの色を付けて表示しているシロイヌナズナの開花データを、花器官について詳細に示すが、８つの遺伝子での遺伝子発現が比較的に低い値であることが目立つ。 図９Ａでの個別の花の実験についての遺伝子発現データの詳細図。 図９Ａに示した解剖部位の階層的クラスタリング（ピアソン相関指標）及び発現ポテンシャル百分率。３つの遺伝子クラスターで高い相関値が得られたことがそれぞれの相関ツリーでの線の長さにより示されている。 予測コード配列ＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＥＶＭ（ＥＶＭと図示）及び全ＲＮＡ由来のＤＨ００／０８６花芽のｃＤＮＡ配列で見つかったアイソフォームＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＤＨ（ＤＨと図示）のコード配列の配列アライメント。コード配列の詳細は表６を参照。 ＤＨ００／０８６（参照ゲノム配列の超雄株）、両全性変異体Ｇ０３３、及び超雄株Ｋ３２３といった遺伝子型並びにＣＮ７８／ＣＮ８４から（プライマー対ＣＮ７８／８３を用いて）得られたＰＣＲ産物。１００ｂｐサイズのラダーを挟んで左がＣＮ７８、右がＣＮ８４であり、これらのプライマー対は、欠失・挿入事象を検査するためのもの、即ち、両全性変異体Ｇ０３３のＤＵＦ２４７遺伝子に固有の配列である。Ｇ０３３では固有かつ突出したＰＣＲ産物がみられたが、他の（雄性）サンプルは非特異的なフィンガープリント様のパターンを示す点に注意。 完全着果を示す両全株Ｇ３３。 ３つのＧ０３３の花の隣に並べて示した３つの野生型Ｋ３２３植物の花（左側）。両全株Ｇ０３３の花は、野生型Ｋ３２３雄性植物と比べて、より長い花柱、より発達した柱頭、及びより大きな果実を示した点に注意。 サイズ差を評価できるよう定規の隣に並べて示したＧ０３３の花（左）及び全雄ハイブリッドＫ３２３の２つの花（右の２つ）。 本出願で言及しているスキャフォールド、ｌｃｌ｜Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４、Ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５、Ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８、ｓｃａｆｆｏｌｄ１０５１５の配列、並びに、ＤＨ００／０８６、９Ｍ、８８Ｍ、Ｋ３２３、両全株５３７５、及び両全株Ｇ０３３といった遺伝子型を鋳型ＤＮＡとして用いたＰＣＲ断片のシーケンシングから得られたサンガーリード。 花の表現型の例。検定交配で雌株として用いた育種系統の雌花と、８６１ＢＣ１ｄで分離している２つの表現型を代表する２つの典型的な花との例。 Ｋ１０３６対ＤＨ００／０８６及び系統９のＳｃａｆｆｏｌｄ＿９０５でのＣＨＧメチル化及びリードカバレッジ。Ｓｃａｆｆｏｌｄ＿９０５の４９．８１５から５１．２４９位（ｇｅｎｏｍｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に関して、Ｋ１０３６（上のグラフ）並びにＤＨ００／０８６及び系統９（下のグラフ）について、位置毎にＣＨＧメチル化レベルを線グラフとしてプロットしている。位置毎に参考となるリードカバレッジを、Ｋ１０３６はバツ、ＤＨ００８６は三角、系統９は円で、プロットしている。参考となるリードは、ＣＨＧ位置がある鎖に応じて、ワトソン鎖又はクリック鎖のいずれか一方のみに由来する。Ｋ１０３６では、多数のＣＨＧ位置が（数多くのバーで示すように）メチル化されており、一方、ＤＨ００／０８６及び系統９のＣＨＧメチル化位置が限られている点に注意。ＤＨ００／０８６及び系統９についてメチル化を示すバーの数が少ないが、これは他の多数のＣＨＧ位置でメチル化レベルが０％に等しい（バーがない）ことを意味する点に注意。 アスパラガス・オフィシナリスの雄株ＤＨ００／０８６の４．６ＸカバレッジのＰａｃＢｉｏロングシーケンシングリードのサイズ分布。 Ｍ座位領域でのＢｉｏＮａｎｏコンティグＢＮＧ２８及び整列させたそのＡＧＳ Ｖ２．０ スキャフォールド。矢印とプライマーコードは、コバルト６０γ線照射により生じた欠失のサイズを検査するためのものであるヘミ結合の喪失又はヘテロ接合の喪失を解析するためのＰＣＲによる試験で用いられたプライマーの位置を示す。 アスパラガス・オフィシナリスのＴＤＦ様ＣＤＳ。エキソンは大文字のフォントで影をつけている。 シロイヌナズナのＡＴ３Ｇ２８４７０又はオリザ・サティバ（コメ）のｏｓＴＤＦ１（ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１８４８０）に相同な、Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｔａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ １遺伝子の、ＭＹＢ３４様アスパラガスオルソログの２７６アミノ酸の翻訳。 ＡＳＧ Ｖ２．０ ａｓｓｅｍｂｌｙのデータベース上でＡＴＨ ＴＤＦ１をクエリとして用いて行ったｔＢＬＡＳＴＮ結果。ＡＧＨＳ ２．０ ｓｃａｆｏｌｌｄ ４３６及び１２２０が最も高い相同性を示した。ただ、ＡＧＳ Ｖ２．０ ｓｃａｆｆｏｌｄ １２２０は最初のＳＡＮＴドメインでは低い相同性を示した。 ＡＳＧ Ｖ２．０ ａｓｓｅｍｂｌｙのデータベース上でＡＴＨ ＴＤＦ１をクエリとして用いて行ったｔＢＬＡＳＴＮ結果。ＡＧＨＳ ２．０ ｓｃａｆｏｌｌｄ ４３６及び１２２０が最も高い相同性を示した。ただ、ＡＧＳ Ｖ２．０ ｓｃａｆｆｏｌｄ １２２０は最初のＳＡＮＴドメインでは低い相同性を示した。 特定のハイブリッドでみつかった変異の信頼性を確認するためのマイクロサテライトマーカー（ｓａｔ）及びＨＲＭマーカーを用いたフィンガープリンティング。変異遺伝子型を、これらの変異が属する対照ハイブリッドとともに示す。これらのマーカーで一般的に観察される多様性を例示するために数種の対照植物を示す。これらのハイブリッドの親アレルも（既知であれば）示す。 コバルト６０照射により得られたハイブリッドＫ１１５０、Ｋ１１２９、及びＫ３２３の変異体の花並びに基準対照の花の写真。説明については、実施例６及び実施例７を参照。 スキャフォールド部のリードデプスを示す例。あるものはＡｓ−ＴＤＦ１を包含し、また、あるものはＤＵＦ２４７ドメインを有するＧＤＳ遺伝子を包含する。雄株から雌株への変異体で観察されたリードデプスが低い、及び／又は、当該リードがないことは、欠失がＹ染色体特異的領域及び偽常染色体領域の両方にまたがっていることを示す点に注意。 スキャフォールド部のリードデプスを示す例。あるものはＡｓ−ＴＤＦ１を包含し、また、あるものはＤＵＦ２４７ドメインを有するＧＤＳ遺伝子を包含する。雄株から雌株への変異体で観察されたリードデプスが低い、及び／又は、当該リードがないことは、欠失がＹ染色体特異的領域及び偽常染色体領域の両方にまたがっていることを示す点に注意。 配列番号１から６の配列を示す。

（定義）
本明細書では、特記のない限り、そこで用いられる用語及び定義は、（メンデル）遺伝学で用いられるものである。遺伝学については、Ｍ．Ｗ．Ｓｔｒｉｃｋｂｅｒｇｅｒ著、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（１９７６）、特に、１１３−１２２頁及び１６４−１７７頁を参照されたい。当該箇所で言及されているように、『遺伝子』は、広く、生物（例えば、植物）の生物学的特徴を決定する遺伝因子を意味し、『アレル』は、二倍体（アスパラガス）植物などの多倍体生物に存在する遺伝子対における個々の遺伝子である。

『天然スタミノース植物』は、機能的な花粉を生産する１以上の機能的な葯を天然に有する植物と定義される。『スタミノース（ｓｔａｍｉｎｏｓｅ）』という用語は、機能的な花粉を生産する１以上の機能的な葯を備える花を持つこととして定義され、雌性植物は除外される。『スタミノース』という用語は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ、第１１版、５６０頁で用いられる『スタミノース』という用語と似ているかもしれないが、同書で雄蕊を持つものの心皮を持たない花と記載されている『スタミネート（ｓｔａｍｉｎａｔｅ）』とは似ていないこともある。

『同系』は、遺伝的に同一であることを明確にするために用いられる。

『雌蕊群』は、胚珠を生産し最終的に果実及び種子へと成長する花の一部の総称である。雌蕊群は、１以上の独立した雌蕊から構成されていてもよい。雌蕊は、典型的には、子房と呼ばれる膨らんだ基部と、花柱と呼ばれる細長い部分と、柱頭と呼ばれる花粉を受け取る先端構造とから構成される。

『雌蕊群発達』は、胚珠を生産し最終的に果実及び種子へと成長する雌蕊群の発達を指す。

『天然雌性植物』は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子を天然に持たず、雄蕊群発達をもたらす顕性遺伝子を天然に持たないため、自然界でみられるように、着果を可能とする花柱、柱頭、及び子房などの完全に発育した雌性器官を有する花のみをつけ、退化した非機能的な葯のみをつける植物である。

『雌化』は、人為的介入の結果、本明細書で定義されるような、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現を破壊又は減少させることにより植物の雌蕊群発達を回復又は増進させることと定義される。

雌化植物での回復又は増進させた雌蕊群発達は、当業者であれば、当該植物をそれと同一の生育条件（但し、雌化植物が基準植物と比べてあまり機能的ではない花粉を生産する場合、受粉自体が着果を制限しないようなやり方で雌化植物を受粉させる）に置いた適切な基準植物と比較することで確認できる。当該基準植物は、雌化植物と同じ倍数性レベルを有するはずであり、雌株ではなく、当該基準植物では、本明細書に開示の、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現が破壊も減少もされていない。基準植物は評価する雌化植物と同系であることが最も好ましい。好ましい基準植物の例として、雌化対象の植物を、そのＧＤＳ遺伝子を標的とした人為的介入を行う前に、栄養繁殖させることにより、好ましくは、両植物を適切な比較ができるほど十分に同系ではなくしてしまうかもしれない体細胞多様性を避けるための短期繁殖工程により、得られた同系植物が挙げられる。適切な基準の別の好ましい例としては、２つの倍加半数体親の間の交配、又は、何世代にも渡って同じ特徴を示す（従って高度に近交の）両親であって、評価対象の雌化植物の由来であるハイブリッドの両親と同じものの間の交配、から得られた多数の完全同胞（の平均又は一員）（但し、当該完全同胞もそれらのいずれの親も、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログを標的とした人為的介入の対象となったことがない）が挙げられる。上述の好ましい基準植物が利用できない場合、例えば、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子を標的とした人為的介入が配偶子に行われていた場合、当業者は、雌化植物への基準として、雌性植物ではない十分に多数の同胞（但し、当該同胞もそれらのいずれの親も前述の人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした同胞が利用できない又はその数が少ない場合、当業者は、基準植物として、雌化植物の直接の雄性祖先株（但し、当該雄性祖先株は、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログを標的とした人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした雄性祖先株を利用可能とするために、当業者は祖先株を栄養繁殖することができる。基準植物が遺伝的に多様な場合、これにより高度に同系な基準植物との比較は妨げられるが、当業者は、雌化植物の回復又は増進された雌蕊群発達の形質が適当な検定交配集団において標的のＧＤＳ遺伝子及び／又はそのホモログ若しくはオルソログとは独立に分離するという帰無仮説が受諾されるべきか棄却されるべきかを検定することができる。その後、精密なマッピング及び表現型検査により、雌化におけるＧＤＳ遺伝子の役割をさらに明確にすることができる。

雌化の定義で用いた『雌蕊群発達を回復又は増進させる』とは、雌蕊群発達が増進又は回復されている植物が、適当な基準植物と比べて、生存種子を含む漿果をつける能力が優れていることを意味する。増進又は回復された雌蕊群発達は、花柱の長さの増加、及び、より顕著な柱頭を含み得る。これらはＦｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）及びＢｅｅｓｋｏｖ（１９６７）が適用したようなスケールに基づき測定又は推測することができる。前述のスケールに基づく雌蕊群発達の増進又は回復は、雌化植物の花が当該スケール上で基準植物のスコアと比べて高いスコアをつけることを意味する。

『脱雌化』は、人為的介入の結果、本明細書で定義されるような、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現を回復又は増加させることにより雌蕊群発達を破壊又は減少させることと定義される。

脱雌化植物での破壊又は減少させた雌蕊群発達は、当業者であれば、当該植物をそれと同一の生育条件（但し、基準植物が脱雌化植物と比べてあまり機能的ではない花粉を生産する場合、受粉自体が着果を制限しないようなやり方で雌化植物を受粉させる）に置いた適切な基準植物と比較することで確認できる。当該基準植物は、脱雌化植物と同じ倍数性レベルを有するはずであり、スタミノースな植物であり、当該基準植物では、本明細書に開示の、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現が回復も増加もされていない。基準植物は評価する雌化植物と同系であることが最も好ましい。好ましい基準植物の例として、脱雌化対象の植物を、そのＧＤＳ遺伝子の機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入を行う前に、栄養繁殖させることにより、好ましくは、両植物を適切な比較ができるほど十分に同系ではなくしてしまうかもしれない体細胞多様性を避けるための短期繁殖工程により、得られた同系植物が挙げられる。適切な基準の別の好ましい例としては、２つの倍加半数体親の間の交配、又は、何世代にも渡って同じ特徴を示す（従って高度に近交の）両親であって、評価対象の脱雌化植物の由来であるハイブリッドの両親と同じものの間の交配、から得られた多数の完全同胞（の平均又は一員）（但し、当該完全同胞もそれらのいずれの親も、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入の対象となったことがない）が挙げられる。上述の好ましい基準植物が利用できない場合、例えば、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子の機能的発現を回復又は増加させる人為的介入が配偶子に行われていた場合、当業者は、雌化植物への基準として、スタミノースな植物である十分に多数の同胞（但し、当該同胞もそれらのいずれの親も前述の人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした同胞が利用できない又はその数が少ない場合、当業者は、基準植物として、脱雌化植物のスタミノースな祖先株（但し、当該雄性祖先株は、雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした雄性祖先株を利用可能とするために、当業者は祖先株を栄養繁殖することができる。基準植物が遺伝的に多様な場合、これにより高度に同系な基準植物との比較は妨げられるが、当業者は、脱雌化植物の破壊又は減少された雌蕊群発達の形質が適当な検定交配集団においてＧＤＳ遺伝子及び／又はそのホモログ若しくはオルソログの回復又は増加された機能的発現とは独立に分離するという帰無仮説が受諾されるべきか棄却されるべきかを検定することができる。その後、精密なマッピング及び表現型検査により、脱雌化におけるＧＤＳ遺伝子の役割をさらに明確にすることができる。

脱雌化の定義で用いた『雌蕊群発達を破壊又は減少させる』とは、こうした破壊又は減少された雌蕊群発達を有する植物が、適当な基準植物と比べて、生存種子を含む漿果をつける能力が劣っていることを意味する。

脱雌化の定義で用いたような、破壊又は減少された雌蕊群発達は、花柱の長さの減少、及び、比較的に顕著でない柱頭を含み得る。これらはＦｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）及びＢｅｅｓｋｏｖ（１９６７）が適用したようなスケールに基づき測定又は推測することができる。前述のスケールに基づく雌蕊群発達の減少又は破壊は、脱雌化植物の花が当該スケール上で基準植物のスコアと比べて低いスコアをつけることを意味する。

雌化又は脱雌化の本定義で呼ぶところ人為的介入は、任意の形態の誘導変異誘発（例えば、放射線、化学処理、又は任意の他の変異誘発手段によるもの）を含む。また、人為的介入は、遺伝子の、若しくは当該遺伝子の転写及び翻訳の干渉の、任意の形態の破壊（雌化）又は回復（脱雌化）も含む。この例としては、コード配列の遺伝子改変、スプライスバリアントの誘導、メチル化によるエピジェネティックな変化、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、アンチセンス発現による発現阻害、遺伝子のシス調節エレメント内の部位の改変などが挙げられる。人為的介入は、変異遺伝子を有する植物を未改変植物と交配させ、変異ＧＤＳ遺伝子が存在するオフスプリングをマーカー支援選抜の指示に従い選抜することも含む。

『雄化』は、人為的介入の結果、本明細書で定義されるような、顕性雄性刺激因子（例えば、ＡｓＯｓＴＤＦ１）、そのホモログ又はオルソログの機能的発現を回復又は増加させることにより雄蕊群発達を回復又は増進させることと定義される。

雄化植物で雄蕊群発達を回復又は増進させたことは、当業者であれば、当該植物をそれと同一の生育条件に置いた適切な基準植物と比較することで確認できる。当該基準植物は、雄化植物と同じ倍数性レベルを有するはずであり、天然スタミノース植物ではなく、当該基準植物では、本明細書に開示の、雄性刺激因子遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現が回復も増加もされていない。基準植物は評価する雄化植物と同系であることが最も好ましい。好ましい基準植物の例として、雄化対象の植物を、雄性刺激因子遺伝子の機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入を行う前に、栄養繁殖させることにより、好ましくは、両植物を適切な比較ができるほど十分に同系ではなくしてしまうかもしれない体細胞多様性を避けるための短期繁殖工程により、得られた同系植物が挙げられる。上述の好ましい基準植物が利用できない場合、例えば、雄性刺激因子遺伝子の機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入が配偶子に行われていた場合、当業者は、雄化植物への基準として、スタミノースな植物でない十分に多数の同胞（但し、当該同胞もそれらのいずれの親も前述の人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした同胞が利用できない又はその数が少ない場合、当業者は、基準植物として、雄化植物の直接の雌性祖先株（但し、当該雌性祖先株は、その雄性刺激因子遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現の回復又は増加をもたらす人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした雌性祖先株を利用可能とするために、当業者は祖先株を栄養繁殖することができる。基準植物が遺伝的に多様な場合、これにより高度に同系な基準植物との比較は妨げられるが、当業者は、雄化植物の回復又は増進された雄蕊群発達の形質が適当な検定交配集団において雄性刺激因子及び／又はそのホモログ若しくはオルソログの回復又は増加された機能的発現とは独立に分離するという帰無仮説が受諾されるべきか棄却されるべきかを検定することができる。その後、精密なマッピング及び表現型検査により、雄化における標的雄性刺激因子遺伝子の役割をさらに明確にすることができる。

雄化の定義で用いた『雄蕊群発達を回復又は増進させる』とは、増進又は回復させた雄蕊群発達を獲得した植物が、適当な基準植物と比べて、機能的な花粉を含む機能的な葯をつける能力が優れていることを意味する。

雄蕊群発達を増進又は回復させることは、天然スタミノース植物に匹敵するじゅうたん組織の発達を有しつつも、花糸の長さの増加、より大きな葯（即ち、サイズの増加）を示すことを含み得る。天然スタミノースアスパラガス植物に匹敵するじゅうたん組織の発達は、じゅうたん組織の退化がみられない又は少なくとも天然の雌株で典型的に観察されるものと比べて少ないじゅうたん組織の退化を示すはずであることを意味する。

『脱雄化』は、人為的介入の結果、本明細書で定義されるような、顕性雄性刺激因子（例えば、ＡｓＯｓＴＤＦ１）、そのホモログ又はオルソログの機能的発現を破壊又は減少させることにより植物の雄蕊群発達を破壊又は減少させることと定義される。

脱雄化植物で雄蕊群発達を破壊又は減少させたことは、当業者であれば、当該植物をそれと同一の生育条件に置いた適切な基準植物と比較することで確認できる。当該基準植物は、脱雄化植物と同じ倍数性レベルを有するはずであり、天然スタミノース植物であり、当該基準植物では、本明細書に開示の、雄性刺激因子遺伝子、そのホモログ又はオルソログの機能的発現が破壊も減少もされていない。基準植物は評価する脱雄化植物と全く同系であることが最も好ましい。好ましい基準植物の例として、脱雄化対象の植物を、雄性刺激因子遺伝子を標的とした人為的介入を行う前に、栄養繁殖させることにより、好ましくは、両植物を適切な比較ができるほど十分に同系ではなくしてしまうかもしれない体細胞多様性を避けるための短期繁殖工程により、得られた同系植物が挙げられる。適切な基準の別の好ましい例としては、２つの倍加半数体親の間の交配、又は、何世代にも渡って同じ特徴を示す（従って高度に近交の）両親であって、評価対象の脱雄化植物の由来であるハイブリッドの両親と同じものの間の交配、から得られた多数の完全同胞（の平均又は一員）（但し、当該完全同胞もそれらのいずれの親も、雄性刺激因子遺伝子、そのホモログ又はオルソログを標的とした人為的介入の対象となったことがない）が挙げられる。上述の好ましい基準植物が利用できない場合、例えば、雄性刺激因子遺伝子を標的とした人為的介入が配偶子に行われていた場合、当業者は、脱雄化植物への基準として、スタミノースな植物である十分に多数の同胞（但し、当該同胞もそれらのいずれの親も前述の人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうした同胞が利用できない又はその数が少ない場合、当業者は、基準植物として、脱雄化植物の直接の雌性又はスタミノース祖先株（但し、当該スタミノース祖先株は、その雄性刺激因子遺伝子、そのホモログ又はオルソログを標的とした人為的介入の対象となったことがない）を採用できる。こうしたスタミノース祖先株を利用可能とするために、当業者は祖先株を栄養繁殖することができる。基準植物が遺伝的に多様な場合、これにより高度に同系な基準植物との比較は妨げられるが、当業者は、脱雄化植物の破壊又は減少された雄蕊群発達の形質が適当な検定交配集団において標的の雄性刺激因子遺伝子及び／又はそのホモログ若しくはオルソログとは独立に分離するという帰無仮説が受諾されるべきか棄却されるべきかを検定することができる。その後、精密なマッピング及び表現型検査により、脱雄化における標的の雄性刺激因子遺伝子の役割をさらに明確にすることができる。

脱雄化の定義で用いた『雄蕊群発達を減少又は破壊させる』とは、破壊又は減少させた雄蕊群発達を獲得した植物が、適当な基準植物と比べて、機能的な花粉を含む機能的な葯をつける能力が劣っていることを意味する。

雄蕊群発達を減少又は破壊させることは、天然スタミノース植物に匹敵するじゅうたん組織の発達を有しつつも、花糸の長さの減少、より小さな葯（即ち、サイズの減少）を示すことを含み得る。天然スタミノースアスパラガス植物に匹敵するじゅうたん組織の発達は、雌性植物で典型的に観察されるのと同様なじゅうたん組織の発達の欠如又は少なくともスタミノースな植物で典型的に観察されるものと比べて少ないじゅうたん組織の発達を示すはずであることを意味する。

雄化又は脱雄化の本定義で呼ぶところ人為的介入は、任意の形態の誘導変異誘発（例えば、放射線、化学処理、又は任意の他の変異誘発手段によるもの）を含む。また、人為的介入は、遺伝子の、若しくは当該遺伝子の転写及び翻訳の干渉の、任意の形態の回復（雄化）又は破壊（脱雄化）も含む。この例としては、コード配列の遺伝子改変、スプライスバリアントの誘導、メチル化によるエピジェネティックな変化、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、アンチセンス発現による発現阻害、遺伝子のシス調節エレメント内の部位の改変などが挙げられる。人為的介入は、変異遺伝子を有する植物を未改変植物と交配させ、変異雄性刺激因子遺伝子が存在するオフスプリングをマーカー支援選抜の指示に従い選抜することも含む。

『雄性祖先株』は、後代の植物の派生元となる植物の家系に属する、機能的な葯をつける能力を有するスタミノースな植物として定義され、植物の派生元となる、当該祖先株、その体細胞、又は体細胞組織の栄養生殖も包含し得る。

『家系』は、ある植物の出自となる祖先株の系譜である。

『雌蕊群発達の抑圧』又は『雌蕊群発達の阻害』は、雄性植物及び雄性両全性同株植物（即ち、両全性植物とは異なる）又は無性植物で典型的に観察される、顕性抑圧因子遺伝子が雌蕊群発達を妨げるという現象と定義される。一般的に、雌蕊群発達の抑圧は、最適条件下で生育され、生存花粉により受精可能であり、着果に影響する適応度の現象を招きかねない近交弱勢や変異による悪影響を受けていないという条件のもと、生存種子を含む多くの漿果をつけ、また、その花の全てから漿果をつけるはずである天然の雌株でも天然の両全株でも観察されない。雌蕊群発達の抑圧を示すと仮定される植物は、最適条件下で生育され、生存花粉により受精可能であり、着果に影響する適応度の現象を招きかねない近交弱勢や変異による悪影響を受けていない場合であってさえも、その花から実をつけることもないし、その全ての花から実をつけることもない。生存種子を含む漿果をつける能力が低下していることの他に、雌蕊群発達の抑圧を示す植物は、花柱の長さの著しい減少、及び／又は、比較的に顕著でない柱頭を示すと期待される。これらはＦｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）及びＢｅｅｓｋｏｖ（１９６７）が適用したようなスケールに基づき測定又は推測することができる。Ｂｅｅｓｋｏｖ（１９６７）のスケールによれば、雌蕊群発達の抑圧を示す植物は、ＩＶ未満の、好ましくは、ＩＩＩ未満の、好ましくは、ＩＩ未満の、好ましくは、Ｉのスコアに分類されるはずの花を有すると考えられる。Ｆｒａｎｋｅｎ（１９６９、１９７０）のスケールによれば、雌蕊群発達の抑圧を示す植物は、５未満の、好ましくは、４未満の、好ましくは、３未満の、好ましくは、２未満の、好ましくは１のスコアに分類されるはずの花を有すると考えられる。雌蕊群発達の抑圧は、本明細書で提示した配列と相同な雌蕊群発達抑圧因子ＧＤＳ遺伝子の機能的発現の結果と考えられる。顕性抑圧因子遺伝子がある植物で活性化されていることは、ある植物の検定交配子孫の表現型検査を行い、破壊雌蕊群発達表現型と、本分野で記述されているものなどのＭ座位に連鎖したマーカーとが、独立に分離するという仮説を棄却することで、検定することができる。

『雄蕊群』は、花の雄蕊の総称であり、雄蕊は、典型的には、花糸と呼ばれる柄と、小胞子嚢を含む葯とから構成され、小胞子嚢中で花粉粒が小胞子から発達する。

『ＴＤＦ１マーカー支援選抜』は、雄化又は脱雄化を誘導する任意の変異を、又は、本明細書で開示の、ＴＤＦ１遺伝子、そのホモログ又はオルソログの配列情報を明らかにするために設計されたアッセイ（これらに限定されるわけではないものの、サンガーシークエンシング、ＣＡＰＳマーカー解析、高解像度融点曲線マーカー解析、Ｔａｑｍａｎアッセイ、Ｋａｓｐアッセイなど）に基づく情報から導かれた任意の変異を、ある植物家系に導入することを目的としたマーカー支援選抜として定義される。また、ＴＤＦ１マーカー支援選抜は、所望のＴＤＦ１遺伝子アレルを家系に導入した後に、親植物の、ＴＤＦ１遺伝子、そのホモログ又はオルソログの配列情報を明らかにするために設計された情報を用いることも含み得る。この場合、所望のＴＤＦ１遺伝子アレルと、十分に、好ましくは、２０ｃＭ以内、より好ましくは、１０ｃＭ以内、より好ましくは、５ｃＭ以内、より好ましくは、１ｃＭ以内で連鎖している、ＴＤＦ１遺伝子を標的とするマーカーを除く他のマーカーが用いられる。

『ＧＤＳマーカー支援選抜』は、雌化又は脱雌化を誘導する任意の変異を、又は、本明細書で開示の、ＧＤＳ遺伝子、そのホモログ又はオルソログの配列情報を明らかにするために設計されたシークエンシング又はアッセイ（これらに限定されるわけではないものの、ＣＡＰＳマーカー解析、高解像度融点曲線マーカー解析、Ｔａｑｍａｎアッセイ、Ｋａｓｐアッセイなど）に基づく情報から導かれた任意の変異を、ある植物家系に導入することを目的としたマーカー支援選抜として定義される。また、ＧＤＳマーカー支援選抜は、所望のＧＤＳ遺伝子アレルを家系に導入した後に、親植物の、ＧＤＳ遺伝子、そのホモログ又はオルソログの配列情報を明らかにするために設計された情報を用いることも含み得る。この場合、所望のＧＤＳ遺伝子アレルと、十分に、好ましくは、２０ｃＭ以内、より好ましくは、１０ｃＭ以内、より好ましくは、５ｃＭ以内、より好ましくは、１ｃＭ以内で連鎖している、ＧＤＳ遺伝子を標的とするマーカーを除く他のマーカーが用いられる。

『変異誘発』又は『変異処理』は、放射線照射を自然界ではみられぬ放射線量で適用したり、変異誘発剤に自然ではないやり方で暴露させたりして、生物の遺伝情報を安定的に変化させ、自然界で自然に生ずる変異とは異なる、実験的に実現された変異をもたらす過程を、可能にし、好ましくは、増進させることと定義される。

『顕性雄性刺激因子（遺伝子）』は、スタミノースな植物での発育をもたらす、Ｍ座位に連鎖している若しくはＭ座位に存在する遺伝子、又はこの遺伝子に由来する遺伝子産物である。この顕性雄性刺激因子（雄蕊群発達刺激因子又は葯発達刺激因子とも呼ぶ）は、シロイヌナズナ（ＡＴ３Ｇ２８４７０）及びコメ（ｏｓＴＤＦ１、ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１８４８０）で見つかったＴＤＦ１（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｔａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）遺伝子と同じ遺伝子、又は、ＴＤＦ１遺伝子のホモログ又はオルソログである遺伝子によりコードされているタンパク質である。アスパラガス・オフィシナリスでのオルソログ遺伝子ＡｓＯｓＴＤＦ１の配列を、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６にて提示する。

幾つかの理由で、Ｍａｅｄａ等（２００５）の『プロトプラスト培養』の項に記載の体細胞胚発生の手順（Ｋｕｎｉｔａｋｅ及びＭｉｉ（１９９０）の方法への参照を含み、当該体細胞胚発生で得られた植物をフィールドに移植する）は、雌蕊群の物理的特性を増進する人為的介入の実施形態として包含されない。本明細書で当該文献を評して議論したように、Ｍａｅｄａ（２００５）の研究は、性転換植物が体細胞胚発生により得られ、これが実行可能な方法を提供するだろうという十分な教示を当業者に与えない。十分に実証された性転換植物がＭａｅｄａ等（２００５）が適用したような移植後の胚培養により生産され得ることは完全に排除できるわけではないものの、本発明の著者等は、本明細書で雌化を定義するために用いた人為的介入として、Ｍａｅｄａ等（２００５）が記載した方法を除外することに全く異存はない。当業者であれば、人為的介入の任意の方法が、Ｍａｅｄａ等（２００５）に記載の体細胞胚発生及び移植まで広がり、ひいては、追加の工程を含むことを理解できるだろう。好ましくは、当該工程は、体細胞胚発生の前後のいずれかに、変異誘発又はＧＤＳマーカー支援選抜の適用を含むが、唯一の追加の人為的介入として生存オフスプリングを生成する従来の交配を含まないと考えられる。このように雌化植物を得ることが可能かもしれず、ひいては、これは異なる方法になると考えられる。

『天然雄性アスパラガス植物』は、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔａｐｅｔｕｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １（ＴＤＦ１）に相同な顕性アスパラガス遺伝子の天然の機能的コピーを少なくとも１つ有するため、自然界でみつけることができるような完全に発達した葯を有する花をつける能力を有する植物として定義される。

ある植物が、ある遺伝子について、当該遺伝子と同じアレルを含む場合、その植物は『ホモ接合性』と呼ばれ、ある遺伝子について、当該遺伝子と異なるアレルを含む場合、その植物は『ヘテロ接合性』と呼ばれる。大文字を用いて、顕性（型の）遺伝子を示し、小文字を用いて、潜性遺伝子を示す。従って、『ＸＸ』は、遺伝子又は性質Ｘについてのホモ接合体顕性遺伝子型を示し、『Ｘｘ』又は『ｘＸ』は、ヘテロ接合体遺伝子型を示し、『ｘｘ』は、ホモ接合体潜性遺伝子型を示す。一般的に知られているように、複アレル、抑圧因子、共顕性などの遺伝子及び／又は因子が表現型の決定で（同様に）役割を果たさない限り、ホモ接合体潜性遺伝子型のみが対応する潜性表現型を通常もたらす（即ち、性質又は形質『ｘ』を示す植物に繋がる）はずであり、一方、ヘテロ接合体及びホモ接合体の顕性遺伝子型は対応する顕性表現型を通常もたらす（即ち、性質又は形質『Ｘ』を示す植物に繋がる）はずである。ある植物が通常は２つであるところの染色体対又は染色体部分を１つのみ有する場合、その植物は『ヘミ接合性』と呼ばれる。より具体的には、本明細書では、『ヘミ接合性』という用語は、特定のＹ連鎖遺伝子が、畢竟、雄性染色体上にあり、雄性植物が雌株にはない染色体部分を有するようになっていることを指す。

本明細書では、『植物』という用語は、植物全体、その任意の部分若しくは派生物（植物細胞、植物プロトプラスト、植物（例えば、アスパラガス・オフィシナリス植物）の再生元とできる植物細胞組織培養、植物カルス、植物細胞集塊、及び植物中の無傷の植物細胞など）、又は植物の一部（胚、花粉、胚珠、果実（例えば、収穫したトマト）、花、葉、種子、根、根冠など）を包含する。

本発明によれば、『オルソログ』又は『オルソログ遺伝子』は、種間、さらには、品種間で、分岐進化した遺伝子と考えられる。これは、ここで定義するＧＤＳ遺伝子のオルソログが、本出願のＧＤＳ配列の由来である種又は品種とは異なる種の遺伝子であって、共通祖先配列から進化した任意の遺伝子を意味するだろうことを意味する。オルソログ遺伝子の全てではないが多くの場合について、当該遺伝子の機能が維持されていることを認識できるはずである。この意味で、自動的に、ここで特定するＧＤＳ遺伝子のオルソログは、アスパラガス・オフィシナリスのＧＤＳ遺伝子について本出願で記載したのと同じ機能を有する。オルソログ同士は、かなりの相同性を共有するかもしれないが、かならずしもそうである必要はない。異種のオルソログ遺伝子は、しばしば、類似の遺伝子環境で、即ち、クラスターに存在する遺伝子の多くがオルソロガスであるといえるような遺伝子クラスター内にクラスターされてみつかる。

本発明によれば、『ホモログ』又は『相同配列』は、ホモログであるといわれる基準の配列と高いレベルの配列相同性を有する配列である。この点で、高い配列相同性又は高いホモロジーは、ある核酸配列について、２つの相同配列が選択的ハイブリダイゼーション条件下で互いに選択的にハイブリダイズするだろうことを意味する。相同核酸は、それが相同であるといわれる基準の遺伝子によりコードされているタンパク質の機能と類似する生物学的機能を有するアミノ酸配列を当該核酸がコードすると考えられる場合、機能的ホモログ又は機能的相同配列といわれる。

この意味で、本願発明では、高い配列相同性の定義は、それが相同であるといわれる基準の遺伝子との相同性の割合が６５％から９５％であるヌクレオチド配列を含む。そして、例えば、相同性の割合は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であってもよい。ヌクレオチド配列に基づく配列相同性は、ＢＬＡＳＴＮコンピュータープログラム（例えば、国立生物工学情報センター（インターネットを経由して、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／よりアクセスできる）を介して、公的に入手可能）を、Ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）を１１、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）を１０、一致した残基の組のＲｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ（Ｍ）を５、ミスマッチのＰｅｎａｌｔｙ ｓｃｏｒｅを−４、ｃｕｔｏｆｆを１００としたデフォルトの設定で用い、計算できる。この代わりに、ホモロジーを、当該ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算することもできる。アミノ酸については、配列相同性は、ＢＬＡＳＴＰコンピュータープログラム（同様に、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介して入手可能）を用いて計算できる。アミノ酸レベルでは、機能的ホモログは、前述のタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも５５％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列として定義される。タンパク質の機能的ホモログ又はオルソログは、当該タンパク質が相同又はオルソロガスであるといわれる基準のタンパク質と類似の生物学的機能を有することと定義される。アミノ酸配列をコードする核酸配列は多くの多様体を有し得る。遺伝暗号の性質により、一つの同じアミノ酸に翻訳される異なるヌクレオチドのトリプレットが存在する。あるタンパク質をコードする核酸が、異なるアミノ酸配列をもたらすことなく、かなり変わることもあり得ることを理解されたい。こうした遺伝暗号のゆらぎは、相同又はオルソロガスなタンパク質をコードする２つの核酸配列のホモロジーレベルに影響を与えないかもしれず、コードされているタンパク質が、ここで用いた定義に従って、高度に相同又はオルソロガスであると判断される場合、それをコードする核酸も高度に相同であるとみなされるはずである。

（発明を実施するための形態）
本発明の第１の目的は、雌性抑圧因子遺伝子の発現を変化させることにより、及び／又は、雄蕊群発達を可能とする遺伝子の発現を変化させることにより、植物の性を変化させる方法を提供することである。さらなる目的は、雌性抑圧因子遺伝子の機能欠損を用いることにより、及び／又は、雄蕊群発達を可能とする遺伝子を提供することにより、雌雄異株植物、好ましくは、アスパラガス植物を、自家受精又は交雑受精させる代替的方法である。

第２の目的は、両全株、又は部分的に両全性若しくは雄性両全性同株である植物、又は雌性植物といった『雌化植物』を、好ましくは、クサスギカズラ属から、本分野で周知のやり方とは異なるやり方で、疑う余地なく獲得できる方法に関する技術的教示を提供することである。

第３の目的は、雌性植物を雄化させて機能的雄蕊群を有する雄性植物とし得る方法に関する技術的教示を提供することである。本発明では、慎重に設計した検定交配により、雌化植物の、特に、両全性表現型の、一遺伝子性潜性伴性遺伝の存在が確認された。さらに、この雌蕊群発達の伴性顕性抑制因子が同定された。この遺伝子の特性解析により、それがＤＵＦ２４７ドメイン含有遺伝子であることが明らかとなった。両全性表現型又は雌性表現型のいずれかを有する１０の変異体が発見され、これらの全てが前述の遺伝子（本願発明ではＧＤＳ遺伝子と呼称する）の発現に関連する異なる変異を含んでいた。幾つかの変異体は、機能的ＴＤＦ１遺伝子（シロイヌナズナのＡＴ３Ｇ２８４７０又はオリザ・サティバ（コメ）のｏｓＴＤＦ１（ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１８４８０））の発現に欠けており、これにより、それらの表現型が雄性から雌性に変化していることが分かった。３つの独立した変異体の家系でその分離が検定済みの、この一遺伝子性潜性遺伝伴性両全性表現型の存在は、雌雄異株種では進化生物学者（Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ、１９５８、Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ及びＣｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ、１９７８）により一般的に予測されているものの、アスパラガスでは納得のいく証明がなされてこなかった、雌化をもたらす遺伝子が雄性雌性抑圧因子であることを示唆している。本発明は、こうした雌性抑圧因子が実際にアスパラガスに存在し、その雌性抑圧能力を失わせ、本来は厳格に雄性である植物を、自家受精及び／又は他の雄性植物との交配ができる両性花を有する植物へと転換させるように、当該雌性抑圧因子を操作できること、又は、当該雌性抑圧因子の操作が雄性刺激因子とともに喪失した場合、本来は雄性である植物が雌性植物に転換され得ることを教示する。さらに、本発明は、新しい両全性植物を作るために、雌性抑圧能力を失った雌性抑圧因子のアレルが、遺伝的に関連する雄性（花粉）稔性とともに、他の植物に遺伝子導入／移入され得ることも開示する。本発明は、本発明で開発された単純な一遺伝子性潜性遺伝とは異なる遺伝学的モデルで記述されてきた（あるいは、少なくとも、遺伝学的により複雑であった）雄性両全性同株植物又は両全性植物を用いたものなどの自家受精又は他の雄性植物との交配の既存の手段とは異なる方法について記述する。

さらに、本発明は、この表現型を一時的にのみ発現する植物を提供する方法も包含する。

さらに、本発明は、ＴＤＦ１遺伝子の機能的コピー又はその遺伝子産物を導入することにより達成されるはずの、雌性植物を雄性植物に変える方法を開示する。

当業者であれば、雌性抑圧因子をオンやオフにスイッチすること、より微妙には、雌蕊群発達の抑圧を増進又は低下させることが、最も広義な解釈で用いられていることを理解できるだろう。雌蕊群発達の抑圧の可能化又は増進は、雌蕊群発達の抑圧をもたらす遺伝子の機能的コピーを提供した結果として起こり得る。『スイッチオフ』、雌蕊群発達の抑圧の不可能化又は低下は、雌蕊群発達の抑圧をもたらす遺伝子の発現又は機能性を低下させる任意の方法を含むだろう。また、当業者であれば、雌蕊群発達の抑圧をもたらす遺伝子をオンやオフにスイッチすることの適用、又は、当該遺伝子の抑圧の低下又は増進は、機能的葯を持つ植物を提供することのみに限られるわけではないことを理解できるだろう。雄性植物の雌蕊群発達の抑圧をもたらす遺伝子が（部分的に）スイッチオフされた場合（例えば、その機能的発現が低下された場合）、実際に（より多くの）雄性両全性同株植物又は両全性植物がもたらされるかもしれない。しかし、雌蕊群の抑圧の低下は、葯の機能性の欠如又は低下、例えば、これらに限定されるわけではないが、雌蕊群発達の抑圧及び葯発達の刺激の両方が単一の欠失により共に破壊されるという事象など、と同時に起きるかもしれない。こうした場合、雄性又は雄性両全性同株植物は、雌性植物へと変わるが、こうした事象（両方の雌蕊群発達の顕性抑圧因子を変えることが雄蕊群発達の刺激因子の破壊と同時に生じる事象）も雌蕊群発達の抑圧因子の機能性を制御する方法として本発明に包含される。

この文脈において、本明細書で用いられる『雌蕊群発達抑圧因子遺伝子（ＧＤＳ遺伝子）』又は『雌蕊群発達抑圧因子アレル』という用語は、配列番号１に記載の配列を有するアレル、又はその機能的ホモログ若しくはオルソログを指す。こうした遺伝子又はアレルの好ましい例として、ｃＤＮＡが配列番号１で与えられる特定のアスパラガスＤＵＦ２４７ドメイン含有遺伝子が挙げられる。従って、本発明の一態様は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列のオルソログであるタンパク質又は当該アミノ酸配列と機能的に相同なタンパク質をコードし得る全ての核酸配列である。本明細書で示すように、この遺伝子の機能欠損は雌蕊群発達の阻害を引き起こす。ＧＤＳ遺伝子の機能欠損又は低下機能は、植物がつける漿果及び種子の数が、同じ家計世代又は当該植物が属する家計の前の世代の植物に対して、増えていることを調べることで定量的に確認される。こうした機能欠損は、一般的に、当該家計の以前の世代では見られなかった変異により生じているはずである。

そこで、本明細書で用いられる『変異ＧＤＳ遺伝子』又は『変異ＧＤＳアレル』は、本発明の表現型をなすこと又は当該表現型に寄与することにつながるＧＤＳ遺伝子の任意の機能欠損を指し得る。一つの変異体として、本明細書に記載の、γ線照射処理の結果として得られた、配列番頭１のヌクレオチドの５６７位以降のコード情報の欠如をまねくと推測されるＳｃａｆｆｏｌｄＭｌｏｃｕｓ４（Ｇｅｎｏｍｅ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｖ１．１）の１８２０位のヌクレオチドで始まる欠失挿入事象を有するＧＤＳ欠失挿入アレルが挙げられる。

本明細書に記載の別の変異体として、リーディングフレームシフトにつながるはずの配列番号１の５２７位での欠失に対応する、ＧＤＳ遺伝子の第１エクソンの３’末端でのチミンの（１塩基対）欠失を有するＧＤＳ欠失アレルが挙げられる。

本明細書に記載の別の変異として、ＧＤＳ遺伝子の、第１予測エクソン、第１予測イントロンにまたがり、且つ、第２予測エクソンと部分的に重なる高メチル化により生じるＧＤＳエピアレルが挙げられる。前述のメチル化は、（厳格ではないものの）顕著には、ＣＨＧメチル化（ｓｃａｆｆｏｌｄ ９０５（Ｇｅｎｏｍｅ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｖ１．１）の３０９７６２−３０８３２３位又はＳｃａｆｆｏｌｄＭｌｏｃｕｓ４（Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）１０５３−２４９２位の核酸にわたるもの）である。エピアレルで観察された示差的ＣＨＧメチル化は、配列番号１と、５位から８５９位のヌクレオチドの範囲内のヌクレオチドで、重なっているはずである。本明細書に記載のさらに別の変異体であるＫ５７５６は、プロリンからトレオニンへのアミノ酸変化（Ｐｒｏ→Ｔｈｒ）をもたらす配列番号１の６８４位でのシトシンからアデニンへの変化を特徴とするＧＤＳ遺伝子アレルである。

本明細書に記載の別の変異として、配列番号１の１６６位でのシトシンからアデニンへの変化を特徴とするＧＤＳアレルであるＫ４３８１が挙げられる。

本明細書に記載の別の変異として、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸変化をもたらす配列番号１の１１９３位に対応する位置でのアデニンからグアニンへの変異を特徴とする、γ線照射処理により生じたＧＤＳアレルＫ１１５０が挙げられる。

本明細書に記載の別の変異として、配列番号３の１１６０ヌクレオチド位と一致するアデニンからチミンへの変化であるＧＤＳアレルＫ１１２９−３００−８が挙げられる。このアデニンからチミンへの変化は、ＧＤＳ遺伝子の第１予測開始コドンのアデニンから、６６５ヌクレオチドだけ離れている。

本明細書に記載の３つの類似の変異として、遺伝子マーカーアレルと配列ｎの喪失から推測してＧＤＳ遺伝子が（今回の場合、γ線照射処理の結果として）完全に欠失している３つの非天然ＧＤＳヌルアレルが挙げられる。

本明細書では、ＧＤＳ遺伝子とは、雌雄異株アスパラガス種で雌蕊発達及び結実を抑制するタンパク質の一群に属するだろうＤｏｍａｉｎ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ２４７をそのタンパク質配列中に含む遺伝子と理解されたい。当該ＧＤＳ遺伝子の好ましい例としては、本明細書に記載したようなアスパラガスＤＵＦ２４７ドメイン含有遺伝子が挙げられる。しかし、本発明は、このＧＤＳ遺伝子の機能的ホモログ及び／又はオルソログも包含する。

また、本明細書では、『雌蕊群発達の顕性抑圧因子』という用語も用いる。この用語は、雌性抑圧因子ＧＤＳ遺伝子の機能が残余を除いて当該用語と同一であるとみなされるべきことをいっそう明白に説明している。雌蕊群発達を抑圧する雌性抑圧因子は、例えば、着果が好ましくない場合に雌性不妊をもたらすために、別の植物に導入されてもよい。

本発明の雌雄異株植物は、好ましくは、クサスギカズラ属植物であり、より好ましくは、アスパラガス・オフィシナリス種の植物である。しかし、本発明は、他の雌雄異株植物（アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、ディオスコレオフィルム・ヴォルケンシー、カラハナソウ属（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、及びカイノコソウ属（Ｖａｌｅｒｉａｎａ）といった作物など）についても考えられる。

アスパラガスは、キジカクシ科クサスギカズラ亜科の属の一つである。この属は３００にものぼる種を包含する。多くは、常緑性で長命な多年生植物で、リアナ、ブッシュ、又はつる植物として下層植生から成長する。最もよく知られている種は、広く単にアスパラガスと呼ばれる食用のアスパラガス・オフィシナリスである。本発明の目的は、通常は雌雄異株である種（例えば、これらに限定されるわけではないものの、Ａ．ａｐｈｙｌｌｕｓ、Ａ．ｓｔｉｐｕｌａｒｉｓ、Ａ．ｆｉｌｉｃｉｎｕｓ、Ａ．ｓｃｈｏｂｅｒｏｉｄｅｓ、Ａ．ｋｉｕｓｉａｎｕｓ、Ａ．ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｏｓ、Ａ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ、Ａ．ｉｎｄｅｒｉｅｎｓｉｓ、Ａ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（アスパラガス・オフィシナリス））又は通常は雌性両全性異株である種（例えば、これらに限定されるわけではないものの、Ａ．ｐｌｏｃａｍｏｉｄｅｓ、Ａ．ａｌｔｉｓｓｉｍｕｓ、Ａ．ｎｅｓｉｏｔｅｓ、及びＡ．ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）について、アスパラガス亜属（Ｎｏｒｕｐ等、２０１５、及び、その図３でのアスパラガス亜属クレードを参照）に属する、アスパラガス植物を交配選抜すること、又は、アスパラガス植物の性を変えることである。文中で『アスパラガス』又は『アスパラガス植物』に言及する場合、少なくとも上述のアスパラガス種の全て又は育種で用いられる対象であるクサスギカズラ属に属する任意のアスパラガス植物が包含される。

雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子及びアレルを含む核酸配列又は断片並びにＧＤＳ遺伝子及びアレルを含む核酸配列又は断片は、上述したようなＧＤＳと、特に、配列番号１若しくは配列番号３又は当該遺伝子のスプライスバリアントで提供される配列と、好ましくは、モデレートなハイブリダイゼーション条件下で、又は、より好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、『ハイブリダイズ』する能力により定義してもよい。『ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件』は、少なくとも約２５ヌクレオチドの、好ましくは、約５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、又は１００ヌクレオチドの、最も好ましくは、約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約６５℃の温度で、約１Ｍの塩を含む溶液中で、好ましくは、６ｘＳＳＣ又は相応のイオン強度を有する他の任意の溶液中で、ハイブリダイズさせ、約６５℃の温度で、約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液中で、好ましくは、０．２ｘＳＳＣ又は相応のイオン強度を有する他の任意の溶液中で、洗浄する条件として本明細書では定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、オーバーナイトで、即ち、少なくとも１０時間行われ、好ましくは、洗浄は少なくとも２回洗浄液を交換して少なくとも１時間行われる。こうした条件は、通常、約９０％以上の配列相同性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能とするはずである。『モデレートなハイブリダイゼーション条件』は、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは、約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約４５℃の温度で、約１Ｍの塩を含む溶液中で、好ましくは、６ｘＳＳＣ又は相応のイオン強度を有する他の任意の溶液中で、ハイブリダイズさせ、室温で、約１Ｍ以下の塩を含む溶液中で、好ましくは、６ｘＳＳＣ又は相応のイオン強度を有する他の任意の溶液中で、洗浄する条件として本明細書では定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、オーバーナイトで、即ち、少なくとも１０時間行われ、好ましくは、洗浄は少なくとも２回洗浄液を交換して少なくとも１時間行われる。こうした条件は、通常、５０％までの配列相同性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能とするはずである。当業者であれば、５０％から９０％の間の相同性を有する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を調節することができるはずである。

本発明の重要な実施形態は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下されている植物を準備する工程と、当該植物を、［１］近親交配、［２］戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は［３］半数体倍加系統育種技術に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法である。背景技術で示したように、雌雄異株植物の育種は、自家受精、戻し交配、及び種子繁殖の使用が制限されていたために、妨げられていた。ＧＤＳ遺伝子の発現が破壊又は妨害されている本発明の植物の提供によりこの問題は解決される。なぜならば、これにより、何世代にもわたって同じ特徴を示す（ｔｒｕｅ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ）親系統を生み出すために用いることができる両全株性の植物又は部分的に両全株性の植物の発育が可能となるからである。

本発明の特定の実施形態では、本発明に記載の『両全性形質』は、雌雄異株植物の、より好ましくは、アスパラガス植物の育種で、近交系を作るために用いられる。

原則的に、本発明に基づいた１種以上の近交系の作出は、以下の工程を含む。

［１］機能的雌蕊群と機能的雄蕊群の両方を持つ植物（以降、『両全性形質』を有する植物とも呼称する）をもたらす雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下された新規の両全性植物を作出する工程。こうした雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下された新規の両全性植物をどのように作出できるかについては、以下でさらに説明する。

［２］『両全性形質』を有する第１植物をを第２植物と交配させる少なくとも１回の交配により、『両全性形質』を有するハイブリッド植物を調製することにより、新規の両全性植物を調製する工程。

［３］工程［１］又は工程［２］で得られた植物の自家受精を促進し、その子孫から１つ以上の好ましい植物を選抜する工程。

［４］任意で、工程［３］で得られた植物を自家受精させる工程を１回以上繰り返し、その子孫から１つ以上の好ましい植物を選抜する工程。

［５］任意で、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能又は発現を十分に回復させることで、工程［３］又は［４］で得られた『両全性形質』を有する植物の性を変える工程。

本発明の特定の実施形態の一つでは、工程［２］の前述の新規の両全性植物は、『両全性形質』を有する第１植物を雌性の第２の植物と交配させ、その子孫から『両全性形質』を有する植物を選抜することにより、作出される。

本発明の別の実施形態では、工程［２］の前述の新規の両全性植物は、『両全性形質』を有する第１植物を『両全性形質』を有する第２の植物と交配させ、その子孫から『両全性形質』を有する植物を選抜することにより、作出される。

本発明のさらに別の実施形態では、工程［２］の前述の新規の両全性植物は、『両全性形質』を有する第１植物を雌蕊群発達の顕性抑圧因子がホモ接合していない雄性の第２の植物と交配させ、その子孫から『両全性形質』を有する植物を選抜することにより、作出される。

本発明の別の実施形態では、工程［２］の前述の新規の両全性植物は、『両全性形質』を有する第１植物を雌性発達の顕性抑圧因子がホモ接合又はヘテロ接合している雄性の第２植物と交配させ、その子孫から次の世代に『両全性形質』を導入する能力を有するだろう雄性植物を選抜する工程（ａ）と、工程（ａ）で得られた雄性植物を第１植物として雌蕊群発達の顕性抑圧因子がホモ接合していない第２植物と交配させ、『両全性形質』を有する植物を選抜する工程（ｂ）とにより作出される。

この第１の実施形態には、ＧＤＳ遺伝子及びＴＤＦ１遺伝子の両方の発現が共に破壊又は妨害されている本発明の雌性植物の提供が関連している。こうした植物は、この特定の雌性植物をピスティレートな（ｐｉｓｔｉｌａｔｅ、雌蕊だけある）親として、ＧＤＳ遺伝子及びＴＤＦ１遺伝子の両方を依然として含有する当該雌性植物の由来となった植物と交配させることを可能とするため、前述の問題を解決する助けとなり得る。こうした交配は、原則的に、何世代にもわたって同じ特徴を示す親系統を生み出すために用いることができる交配である。上記の実施形態に関するこの可能性は、ＧＤＳ遺伝子が破壊又は妨害されている植物が両全株性の植物又は部分的に両全株性の植物の発育を可能とするかもしれないことを明確にするために言及されているが、特定の場合では、雌性植物の発育まで拡張される。

本発明のさらに別の実施形態では、両全性形質は戻し交配育種で開発される。特に、本発明は、同一遺伝子型の超雄植物を提供するために、ある『遺伝形質』を超雄植物の遺伝的背景に取り込む方法を提供する。ここで、超雄株は、雌性植物を受精させてもその直接のオフスプリングとして雌性植物をなすことができない植物と定義される。本発明によれば、超雄植物の第１度近親株と超雄植物との間の直接交配を行うことができるため、高度に同一遺伝子型の超雄植物を得ることができる。

従って、本発明は、第１度近親株及びその超雄親を直接交配させ、当該交配によるオフスプリングを得ることを可能とする方法を提供する。これは、以下の工程を含む方法を提供することにより実現される。

［１］ある『遺伝形質』（即ち、関心のある形質）を超雄植物の遺伝的背景に導入するための第１工程として、当該『遺伝形質』を有する第１植物を超雄株である第２植物と交配させ、その子孫から次の世代に当該『遺伝形質』を導入する能力を有する植物を選抜する事により、Ｆ１ハイブリッド子孫を調整する工程。

当業者であれば、工程［１］で、超雄植物の遺伝的背景に『遺伝形質』を導入する能力を有する植物の性が任意のものでよいことを理解できるだろう。しかし、第１植物が雄性である場合、第１植物及び第２植物の一方又は両方、即ち、工程［１］の交配で用いられる少なくとも一の植物が、種子繁殖の能力を有するものでなければならない。こうした種子繁殖の能力を有する植物は雌化されねばならない。こうした雌化植物は、『雄株から両全株への性転換株』又は『雄株から雄性両全性同株への性転換株』のいずれかである。そこで、こうした植物は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能の破壊又は雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現の低下の結果によるものでもよいし、あるいは、雄蕊群発達の刺激因子もその発現が破壊又は低下されている植物での雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能の破壊又は雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現の低下の結果による雄株から雌株への性転換株である。

当業者であれば、工程［１］で用いられる第１植物及び第２植物の一方又は両方が、本発明による雌化とは異なり、天然の両全株性又は雄性両全性同株性を示すため、これまで本分野では不可能とされていた、超雄植物へある『遺伝形質』を直接に導入する能力を有する雄性植物を交配させることによりＦ１ハイブリッドを作る方法を本発明が提供することを認識できるだろう。当業者であれば、第１工程で『子孫』が『次の世代に当該「遺伝形質」を導入する能力を主として有する植物』から得ねばならないと記載されていることから、工程［１］で植物が雌化されているか否かは特別に記載する必要がないことを認識できるだろう。しかし、当業者であれば、工程［１］で第１植物として『遺伝形質』を導入する能力を有する雄性植物を用いる能力、即ち、柔軟性の価値を十分に理解できるだろう。

［２］第２工程（ＢＣ１又はバッククロス１）は、工程［１］で得られたハイブリッドを工程［１］で用いた超雄株と同一又は類似の遺伝子型の第２植物と交配させ（但し、第１植物及び第２植物の両方又は一方、即ち、工程［２］のこの交配の少なくとも一の植物は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能の破壊又は雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現の低下の結果により、好ましくは一時的に、雌化されている）、そのＢＣ１子孫から、次の世代に『遺伝形質』を導入する能力を主として有し、且つ、機能的な雄蕊群を有する植物を選抜する工程である。

［３］任意に、工程［２］で得られたハイブリッドが工程［１］で最初に用いた超雄植物と十分に同一遺伝子型であることを保証するために、工程［２］を１回又は『ｎ』回繰り返し、その子孫から、次の世代に『遺伝形質』を導入する能力を主として有し、且つ、機能的な雄蕊群を有するＢＣ２又はＢＣｎ植物を選抜する工程。

［４］任意に、工程［１］、工程［２］、又は工程［３］で得られた植物ＢＣ１、ＢＣ２、又はＢＣｎ（但し、ＢＣｎはｎ世代を経た後の高次世代の戻し交配を表す）において、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能を、好ましくは一時的に、破壊させ、又は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現を低下させ、自家受精促進し、その子孫から、『遺伝形質』がホモ接合性であり、且つ、超雄性を示す植物を選抜する工程。

［５］任意に、『遺伝形質』がホモ接合性であり、且つ、超雄性を示す植物を選抜するために、工程［１］、工程［２］、又は工程［３］で得られた植物の倍加半数体を得る工程。

［６］任意に、工程［２］、工程［３］、又は工程［４］で得られた植物の雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能又は発現を、当該植物の『両全性形質』がもはや次の世代に導入されず、超雄株となるように、好ましくは、『遺伝形質』がホモ接合である超雄株となるように、回復させる工程。

当業者であれば、［２］、［３］、又は［４］、さらには、［５］で得られた植物の家系において、次の世代への『両全性形質』の望まぬ導入をまねくかもしれず、そして、回復されて（即ち、非両全株又は非雄性両全性同株でみられるような雌蕊群発達の抑圧因子の少なくとも十分なレベルと共通するほど回復されて）雄性形質となってしまう、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の、一時的ではなく恒久的な機能欠損、又は、一時的ではなく恒久的な低下発現が導入された場合、この工程［６］が必須となるはずであることを理解できるだろう。

当業者であれば、第１度近親株及びその超雄親を直接交配させ、当該交配によるオフスプリングを得ることを適用するこの方法が、これまで不可能であったことを理解できるだろう。遺伝形質を超雄株に導入する従来の方法では、『遺伝形質』を有する第１植物と第２の『超雄』植物との交配により、『遺伝形質』を有する植物の間でハイブリッドを作ることができた。しかし、結果として生じるハイブリッドは、雄性となり、以降の世代で超雄反復親と直接的に交配することは決してできなかった。代わりに、当該ハイブリッドと雌性植物を先ず追加で交配させ、その後、この交配から生じた、『遺伝形質』を維持している次のハイブリッドを、雌親として、超雄反復親と再び交配できるようにすることが行われていた。本発明により提供される方法では、超雄株と第１度近親であるハイブリッドは、当該超雄株及び当該ハイブリッドの一方又は両方が、『雄株からの性転換両全株』、『雄株からの性転換雄性両全性同株』、又は雌化形質を有する『雄株又は雄性両全性同株からの性転換雌株』となるはずなので、以降の世代で超雄株と常に直接的に交配できる。

第１度近親株及びその超雄親を直接交配させ、当該交配によるオフスプリングを得ることが不可能なはずであるという原則の例外として、第１度近親株又は超雄株のいずれかが『天然の両全株性又は雄性両全性同株性』を有する場合が挙げられよう。こうした『天然の両全株性又は雄性両全性同株性』は、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の破壊又は低下発現の結果ではなく、天然に生じた、未知の、雌蕊群発達抑圧因子ＧＤＳではない『変更遺伝子』の結果によるものである。こうした変更遺伝子については、これまでの段落の数々で概説した文献で示されているように、本分野でその存在が推測されてきたものであり、本発明により提供された同一遺伝子型の超雄株を作出するためのツールとしての『両全性形質』とは異なるものである。

雌性抑圧因子、即ち、雌蕊群発達の抑圧因子の発現に関与するＧＤＳ遺伝子の操作は、様々な方法で実現できる。ＧＤＳ遺伝子は、遺伝子の仮説のｃＤＮＡ（配列番号１）により表される。

ＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＧＡＴＴＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＡＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＴＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＡＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＧＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＡＴＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＴＡＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＴＡＡＴＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＴＣＧＧＧＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＧＡＴＡＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＧＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＧＧＴＴＴＧＡＧＴＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ

このｃＤＮＡは以下のタンパク質に翻訳される。

ＭＳＥＡＷＶＳＲＬＴＳＤＩＧＷＬＮＳＴＮＡＬＭＡＥＡＷＳＲＨＳＩＹＤＶＰＤＴＦＫＲＩＳＰＱＩＨＫＰＳＴＣＳＩＧＰＲＹＮＧＤＬＮＬＬＲＭＥＲＨＫＨＲＡＬＬＮＦＬＩＲＣＱＶＳＩＨＤＩＩＲＡＬＲＫＮＬＨＤＦＲＡＣＹＱＤＬＤＴＦＷＭＫＮＤＤＥＦＬＫＩＭＩＹＤＧＡＦＭＩＥＩＭＩＡＴＶＥＰＹＥＲＴＰＳＳＹＨＡＫＤＰＩＦＫＫＰＹＬＶＥＤＬＲＶＤＭＬＲＬＤＮＱＩＰＭＫＶＬＥＩＬＳＫＦＣＫＮＫＩＱＳＩＨＱＬＩＲＨＦＦＦＲＫＹＥＥＧＲＹＤＩＳＱＴＳＴＩＦＨＬＰＥＩＴＧＨＨＬＬＤＶＹＫＫＴＬＩＱＨＧＧＹＨＨＴＳＳＲＱＰＬＳＡＶＥＬＱＥＡＧＶＩＦＱＣＳＥＴＬＳＬＴＤＩＣＦＴＫＧＶＬＣＬＰＡＶＤＶＤＥＡＦＥＶＶＭＲＮＬＩＡＹＥＱＡＨＧＥＧＱＥＶＴＳＹＶＦＦＭＤＧＩＶＮＮＤＫＤＩＡＬＬＲＥＫＧＩＩＲＳＧＶＳＳＤＫＲＩＡＤＬＦＮＧＬＴＫＧＩＶＡＫＶＶＤＮＶＤＶＤＶＴＫＤＩＮＥＹＣＮＲＲＷＮＲＷＱＡＮＦＫＱＲＹＦＡＮＰＷＡＦＰＧＩＨＫＣ

代わりに、ゲノム配列の解析法に依存して、本遺伝子のｃＤＮＡは、図３に列記した５つの別の遺伝子配列によっても表される。また、これらの配列は、配列番号１の、『スプライスバリアント』又は『スプライシングバリアント』又は相同アスパラガス配列（Ｍ４及び３０９８など、実施例１参照）として、本出願において、同定された。さらに、これらの配列が図１３に列記したゲノム配列に由来することも記すべきであろう。

本出願で用いられる『ＧＤＳ遺伝子』という用語は、図１３のゲノム配列に由来し得る、機能的雌性抑圧因子をコードする又はホモロガス／オルソロガス遺伝子をコードする全てのスプライスバリアント（配列番号１を含む）及び全てのゲノム配列（イントロンを含む）を包含すると思料される。この遺伝子又はそこから転写されるｍＲＮＡを標的とした任意の遺伝子構築物は、好ましくは、エクソン１、エクソン２（若しくはエクソン３）、又はＤＵＦ２４７ドメインを標的としている。ＤＵＦドメインについては、正確なコンセンサスは得ることができない。ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＤＵＦ２４７の定義によれば、このドメインは、ファミリーの定義を構築するためのシードとして用いられた以下のデータベース配列により特徴づけられている。

#=GS Q9SJR2_ARATH/47-434 AC Q9SJR2.1
#=GS Y3720_ARATH/48-447 AC Q9SD53.1
#=GS Q8L703_ARATH/63-464 AC Q8L703.1
#=GS Q9FK84_ARATH/46-474 AC Q9FK84.1
#=GS Q9FK85_ARATH/33-422 AC Q9FK85.1
#=GS Q01J11_ORYSA/116-543 AC Q01J11.1
#=GS Q9SNE9_ARATH/180-572 AC Q9SNE9.1
#=GS Q5XVA4_ARATH/115-523 AC Q5XVA4.1
#=GS Q9SN03_ARATH/92-493 AC Q9SN03.1
#=GS A0MF17_ARATH/106-485 AC A0MF17.1
#=GS A0MF16_ARATH/141-548 AC A0MF16.1
#=GS Q6ZC88_ORYSJ/184-584 AC Q6ZC88.1
#=GS Q0ISB3_ORYSJ/59-439 AC Q0ISB3.1
#=GS Q2QQW6_ORYSJ/36-452 AC Q2QQW6.1
#=GS Q2QQW3_ORYSJ/44-442 AC Q2QQW3.1
#=GS Q2R303_ORYSJ/44-473 AC Q2R303.1
#=GS Q1RU73_MEDTR/31-462 AC Q1RU73.1
#=GS Q6YPE9_ORYSJ/42-450 AC Q6YPE9.1
#=GS Q6YRM8_ORYSJ/34-376 AC Q6YRM8.1
#=GS O22159_ARATH/86-487 AC O22159.2
#=GS Q5S4X4_ARATH/111-507 AC Q5S4X4.1
#=GS Q6E287_ARATH/8-398 AC Q6E287.1
#=GS Q8VYN0_ARATH/16-440 AC Q8VYN0.1
#=GS Q1ZY19_BETVU/30-415 AC Q1ZY19.1
#=GS O49393_ARATH/295-669 AC O49393.2
#=GS Q9LFM8_ARATH/35-411 AC Q9LFM8.1
#=GS Q65XU3_ORYSJ/66-531 AC Q65XU3.1
#=GS Q65XU0_ORYSJ/49-551 AC Q65XU0.1
#=GS Q65XT8_ORYSJ/62-514 AC Q65XT8.1
#=GS Q9FP37_ORYSJ/53-496 AC Q9FP37.1
#=GS Q6ZKD8_ORYSJ/79-483 AC Q6ZKD8.1
#=GS Q69TN1_ORYSJ/150-572 AC Q69TN1.1
#=GS Q7XDW8_ORYSJ/117-510 AC Q7XDW8.1
#=GS Q0J689_ORYSJ/12-411 AC Q0J689.2
#=GS Q0J2S9_ORYSJ/46-452 AC Q0J2S9.1
#=GS Q0J2T1_ORYSJ/42-479 AC Q0J2T1.1
#=GS Q651E4_ORYSJ/52-471 AC Q651E4.1
#=GS Q2QPY1_ORYSJ/9-413 AC Q2QPY1.1
#=GS Q2QPX9_ORYSJ/148-562 AC Q2QPX9.1
#=GS Q656Q9_ORYSJ/57-451 AC Q656Q9.1
#=GS Q94D69_ORYSJ/72-478 AC Q94D69.1
#=GS Q94D66_ORYSJ/18-428 AC Q94D66.1
#=GS Q6ET10_ORYSJ/21-420 AC Q6ET10.1
#=GS Q8LJD1_ORYSJ/36-407 AC Q8LJD1.1
#=GS Q60E19_ORYSJ/30-431 AC Q60E19.1
#=GS Q10RD5_ORYSJ/49-462 AC Q10RD5.1
#=GS Q6H4T3_ORYSJ/102-533 AC Q6H4T3.1
#=GS Q6K301_ORYSJ/128-542 AC Q6K301.1

既に上述したように、ＧＤＳ遺伝子のコード配列又は発現の変化を介して雌蕊群発達の抑圧をもたらす様々な変異体が作出されている。第１の実施形態では、雌性抑圧因子標的遺伝子の干渉はその転写を防ぐことからなる。これは、例えば、標的遺伝子プロモーターに向けたＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉ分子により実現できる。

上述の遺伝子発現の阻害は、好ましくは、阻害化合物を発現する能力を有する構築物を持つ植物を提供することにより達成される。遺伝子発現の阻害は、雌性抑圧因子標的遺伝子由来のタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物のレベルでの欠如（又は観察可能な減少）を指す。阻害の特異性は、細胞の他の遺伝子への顕在効果なく、雌性抑圧因子標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞又は生物の外的形質（本発明の具体的な例では、性表現型）の調査、又は、生化学的技術（ＲＮＡソルーションハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）など）により、確認することができる。基本的に、現時点で、４種の阻害法、アンチセンス発現、センスコサプレッション、ＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ介在遺伝子サイレンシングが知られており、本出願にもこれらは包含される。しかし、本発明はこれらの方法に限定されるわけではなく、内因性の雌性抑圧因子のサイレンシングを引き起こす任意の他の方法も包含される。

アンチセンス発現の場合、雌性抑圧因子遺伝子のヌクレオチド配列、又は、少なくとも１９ヌクレオチドからなるその一部、通常は、少なくとも２１ヌクレオチド以上からなる一部、より好ましくは、ＧＤＳ領域が、アンチセンス方向で構成的又は性的器官特異的プロモーターの下流に置かれる。このヌクレオチド配列の転写後、内因性雌性抑圧因子遺伝子の転写により形成されるｍＲＮＡと相補的なｍＲＮＡが作られる。こうしたアンチセンスｍＲＮＡの産生が、それが相補的な遺伝子の内因性発現を阻害することができることは、今やよく実証されている。さらに、この効果を得るために、１００％未満の相同性の配列であってすらも有用であることが実証されている。また、阻害すべき内因性ｍＲＮＡよりも短いアンチセンスｍＲＮＡも用いることができる。一般的に、７０％以上の相同性を有する２３ヌクレオチド以上のｍＲＮＡ配列が阻害効果を生じる能力を有するはずであることが認められている。主な特許文献としては、Ｃａｌｇｅｎｅ社の欧州特許第２４０２０８号明細書が挙げられる。アンチセンス技術の実効性は疑う余地がない。この方法は、良く確立されており、世界中の研究室で日常的に用いられており、それが用いられた製品が市場に登っている。

第２のアプローとはセンスコサプレッションと広く呼ばれている。この減少は、雌性抑圧因子遺伝子又は当該遺伝子の一部がそのセンス方向に発現するときに生じる。この種の発現は全長遺伝子が用いられるときにその遺伝子の過剰発現を殆どの場合もたらすものの、幾つかの場合、特に、全長よりも短い配列が用いられる場合、この遺伝子又は断片の発現が内因性遺伝子の阻害を引き起こすことが発見されている。センスコサプレッションに関する主な特許文献としては、ＤＮＡ Ｐａｌｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社名義の欧州特許４６５５７２号明細書が挙げられる。

センス及びアンチセンス遺伝子調節はＢｉｒｄ及びＲａｙによってレビューされている（Ｇｅｎ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：２０７−２２１、１９９１）。遺伝子サイレンシングは、全体若しくは一部を含み又はトランケート型配列であってもよく、センス方向でもアンチセンス方向でもよい標的雌性抑圧因子遺伝子コード配列の余分なコピーを標的生物のゲノムに挿入することにより得ることができる。付加的に、ゲノム遺伝子配列から得ることができるイントロン配列をサプレッションベクターの構築に用いることもできる。配列が同じなのがプロモーター領域のみである導入遺伝子及び内因性遺伝子の両方を持つ生物内でも遺伝子サイレンシングが実現されたという報告もある。

遺伝子をサイレンスする３つ目の方法は、いわゆるＲＮＡｉ技術を用いたものであり、これは、内因性遺伝子のサイレンシングを実現するために二重鎖ＲＮＡが用いられる全ての用途をカバーする。Ｆｉｒｅ等（Ｎａｔｕｒｅ、３９１： ８０６−８１１、１９９８）により示されたように、一本の鎖が内因的に作られたｍＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であるｄｓＲＮＡは、細胞内で産生させるか細胞外から添加してやると、そのｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する能力を有すること甚だしい。この現象は、ｄｓＲＮＡの短いストレッチ（２３ヌクレオチド長）が中間的に作られることを介して機能すると考えられている。ｄｓＲＮＡの産生を実現するために、サイレンスする必要がある内因性遺伝子と一方が相補的な、少なくとも１９ヌクレオチド、通常は、２３ヌクレオチド以上の、センス及びアンチセンスの両方であるヌクレオチド配列（まとめて逆向き反復配列とも呼ばれる）を宿す構築物が作られる。センス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、センス及びアンチセンス配列により二重鎖ＲＮＡが形成されるように形成後のＲＮＡの折り畳みを許容する任意の長さのスペーサーヌクレオチド配列を介して接続され得る。そして、このスペーサーは、センス及びアンチセンス配列の両方を接続するヘアピンループを形成する役割を果たす。センス及びアンチセンス配列の順番は重要ではない。単一の同じ構築物中に１つ以上のセンス・アンチセンスの組を組み合わせることも可能である。単純な形を示せば、ｐｒｏｍ−Ｓ−ｓｐａｃ−ＡＳ−ｔｅｒｍとなるが、ｐｒｏｍ−Ｓ１−ｓｐａｃ−ＡＳ１−ｓｐａｃ−Ｓ２−ｓｐａｃ−ＡＳ２−ｔｅｒｍやｐｒｏｍ−Ｓ２−ｓｐａｃ−Ｓ１−ｓｐａｃ−ＡＳ１−ｓｐａｃ−ＡＳ２−ｔｅｒｍといった構築物も可能である。構築物の転写産物が１つ以上のｄｓＲＮＡをもたらす限り、構築物のビルドアップとしては様々なものが可能である。この代わりに、細胞中でＲＮＡ二本鎖形成が生じる相補的なＲＮＡ鎖をコードする２つの別々の構築物により二重鎖構造を形成することもできる。これらの構築物は、略記法によれば、ｐｒｏｍ１−Ｓ１−ｔｅｒｍ１及びｐｒｏｍ２−ＡＳ１−ｔｅｒｍ２というようになる。ｐｒｏｍ１及びｐｒｏｍ２は、同じでも異なってもよいが、両者は、構成的又は果実特異的プロモーターであるべきであり、ｔｅｒｍ１及びｔｅｒｍ２は同じでも異なってもよい。両方の構築物は、細胞内に同じベクターに載せて導入できるが、２つの異なるベクターを用いて導入することもできる。

標的雌性抑圧因子遺伝子の一部に一致するヌクレオチド配列を有するＲＮＡは阻害に好ましい。標的遺伝子に対して、挿入、欠失、及び単一点変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に効果的であることが分かっている。そこで、１００％未満の配列相同性を有する配列を用いてもよい。配列相同性は、配列比較と本分野で周知のアライメントアルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９１、及び当該文献中の参考文献を参照）により、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムをデフォルトのパラメーターで用いることより（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）、計算できる。そこで、ＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部にハイブリダイズする能力を有する（二本鎖）ヌクレオチド配列として機能的に定義することもできる（例えば、ハイブリダイゼーションの条件としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃から６５℃、１２−１６時間のハイブリダイゼーション、及びその後の洗浄などが挙げられる）。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも２３ヌクレオチドであるべきだが、好ましくは、４０、５０、１００、２００、３００、又は４００塩基より長い。

本明細書で開示したように、阻害構築物と標的内因性遺伝子との間の１００％の配列相同性は、本発明を実施するにあたって、必要ではない。そこで、本発明は、遺伝子変異、系統多型、又は進化的分岐により考えられ得る配列多様性を許容することができるという利点を有する。

そこで、本発明は、性的器官特異的プロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列（但し、当該配列は、配列番号１の配列の、又は、当該配列と７０％を超える、好ましくは、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、又は９８％を超える同一性を有する配列の、１９ヌクレオチド以上の一部を、センス方向で、アンチセンス方向で、又は逆向き反復配列の形態で含む）を有する構築物を包含する。

本発明に係る方法で使用するための組換えＤＮＡ構築物は、当業者にとって周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築できる。組換え遺伝子構築物は、植物への形質転換に適しており、且つ、形質転換細胞での遺伝子産物の発現に適しているベクター（市販のものでもよい）に挿入されてもよい。好ましくは、アグロバクテリウムを用いた植物形質転換に役立つバイナリーベクターが用いられる。

この代わりに、標的遺伝子プロモーターで働くネガティブに働く転写因子の発現により転写を防ぐことも挙げられる。こうしたネガティブに働く転写因子は天然のものでも人工的なものでもよい。ネガティブに働く人工的な転写因子は、一般的な転写抑制因子に結合された改変ポリダクチルジンクフィンガー転写因子の過剰発現により、採用できる。さらなる実施形態によれば、標的遺伝子との干渉は、標的遺伝子ｍＲＮＡの不安定化、特に、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分子、コサプレッサー分子、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群より選択される標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的な核酸分子による不安定化からなる。別の実施形態では、標的遺伝子との干渉は、標的遺伝子発現産物の阻害からなる。これは、１つ以上の顕性ネガティブ核酸構築物の発現産物、標的遺伝子産物と干渉する１つ以上の抑圧因子の過剰発現により、又は、１つ以上の化学化合物により、実現できる。部位特的変化を（真核生物の）遺伝子の転写に導入する新しい方法としては、最近記述されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子改変相同組換システムの変法によるものが挙げられる。この変法は、エンドヌクレアーゼ活性を失っているものの、ｇＲＮＡと共発現されるときに、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合、又は転写因子結合に特異的に干渉する能力を維持しているＣａｓ酵素の使用を必然的に伴う。このシステムは、ＣＲＩＳＰＲｉとしても示されている（Ｑｉ ＬＳ等、Ｃｅｌｌ ２０１３；１５２：１１７３−１１８３；Ｌａｒｓｏｎ、ＭＨ等、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、８：２１８０−２１９６；Ａｍｅｌｉｏ，Ｉ．及びＭｅｌｉｎｏ Ｇ．、２０１５、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２２：３−５）。

上述のシステムは、全て、発現に対して働くシステムであり、発現の基となる遺伝子の遺伝子配列を変化させはしない。この点で、これらのシステムは、発現の抑圧が必要なとき又は発現の抑圧がもはや必要ではなくなったときに、折々、スイッチをオンにしたりオフにしたりすることが比較的容易である。こうしたスイッチは、例えば、サイレンシングシステムの構成要素の一つ又は全ての発現を特定の時間又は位置拘束プロモーターの制御下に置くことにより好適な影響を受け得る。こうしたプロモーターは、植物の発育の特定の段階の間に、又は、植物の特定の器官内でのみ発現するプロモーターであってもよい。こうした例としては、例えば、着花の間に、又は、植物の生殖器官内で特異的に発現する遺伝子のプロモーターが挙げられる。別の実施形態では、誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性発現を植物に導入するシステムは広く知られている（例えば、Ｂｏｒｇｈｉ Ｌ、２０１０、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、６５５：６５−７５）。これらのシステムでは、外因性因子、例えば、アルコールやデキサメタゾンなどの化学化合物の添加により、発現の開始又は破壊を誘発させることができる。

遺伝子の発現の変化に加えて、遺伝子自体を機能的タンパク質がもはや発現しないように変更することもできる。これは遺伝子を変異させることにより実現できる。１つ以上の変異が、１つ以上の化学化合物及び／又は物理的手段及び／又は遺伝要素の挿入により無作為に導入できる。適切な化学化合物としては、エチルメタンスルホネート、ニトロソメチルウレア、ヒドロキシルアミン、プロフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎニトロ’’ニトロソグアニジン、ジエチルサルフェート、エチレンイミン、アジ化ナトリウム、ホルマリン、ウレタン、フェノール、エチレンオキサイドが挙げられる。使用可能な物理的手段としては、ＵＶ照射、高速中性子曝露、Ｘ線、及びγ線照射が挙げられる。遺伝要素としては、トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ、又はレトロウィルスエレメントなどが挙げられる。

より効率的な標的技術は、いわゆる部位特異的変異誘発技術によるものである。部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）のための多くのシステムが当業者にとって周知であり、最も有名なのは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）及びＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｃｕｒｔｉｎ Ｓ．Ｊ．等、２０１２、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ５：４２−５０）などのヌクレアーゼ系ＳＤＭシステムである。

ＳＤＭの別の技術は、標的遺伝子との相同組換えに基づいている。最も古い方法として、広範に記述されてきたＣｒｅ−Ｌｏｘシステムが挙げられる。既に、少し前に、Ｂｕｎｄｏｃｋ等（国際特許出願公開第０２／０５２０２６号明細書）及びＰｒｏｋｏｐｉｓｈｙｎ等（国際特許出願公開第０３／０６２４２５号明細書）により、モデルが提起されている。ごく最近、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、植物の相同組換えに基づくＳＤＭで極めて有効であることが実証された（国際特許出願公開第２０１４／１４４１５５号明細書）。

導入部で述べたように、熟練の育種者（特に、雌雄異株植物の、より具体的には、アスパラガスの育種者）は、植物での雄蕊群発達を可能とすることにも興味を抱くだろう。雌性植物で雄蕊群発達を可能にすると実質的にその性が変わるが、これにより、本来は雌性の植物から他家受粉なしで（即ち、自家受精により）種子を得ることが可能となり、また、こうした植物からインビトロ雄性発生により倍加半数体を得る能力が提供されると考えられる。雄蕊群発達又は雄蕊群発達抑制は、顕性雄性刺激因子を産生する遺伝子の発現を調節することにより誘導することができる。

この顕性雄性刺激因子（雄蕊群発達刺激因子又は葯発達刺激因子とも呼ぶ）は、シロイヌナズナ（ＡＴ３Ｇ２８４７０）及びコメ（ｏｓＴＤＦ１、ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１８４８０）で見つかったＴＤＦ１（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｔａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）遺伝子と同じ遺伝子、又は、ＴＤＦ１遺伝子のホモログ又はオルソログである遺伝子によりコードされているタンパク質である。好ましくは、この機能を持つタンパク質は、配列番号５に記載のアスパラガス・オフィシナリス由来のＴＤＦ１オルソログによりコードされる。

核酸配列の機能的ホモログは、本明細書では、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする配列と高い相同性を有する、好ましくは、配列番号４の核酸配列と高い配列相同性を有し、葯をつけない雌雄異株植物で発現されたとき、葯形成を誘導する能力を有すると予期される核酸配列として定義される。

これらの配列とシロイヌナズナ及びコメの配列との配列比較から、タンパク質のいわゆるＲ２及びＲ３ドメインが本発明に必要な機能性をもたらすドメインであることが明らかとなった。そこで、雌雄異株植物で発現させたときに機能的であると考えられる、ＴＤＦ１遺伝子のＲ２及びＲ３ドメインを含む任意のタンパク質配列、及び／又は、こうしたタンパク質配列をコードする任意のヌクレオチド配列が、本発明に包含される。特に好ましいのは、タンパク質の最初の１２５アミノ酸に存在する配列番号５に記載したアスパラガス・オフィシナリスＴＤＦ１遺伝子のＲ２及びＲ３ドメインを含む配列である。好ましくは、当該Ｒ２及びＲ３ドメインは、ａａ１４のあたりからａａ５７（Ｒ２）及びａａ７０のあたりからａａ１１２のあたり（Ｒ３）で見つかるはずである。

これらのヌクレオチド配列及び／又は核酸配列を、雌雄異株植物、好ましくは、アスパラガスの育種で用いる方法については、上述している。

本発明のさらなる実施形態は、処理により予期される性質を植物が有することを検出する方法である。処理が顕性雌蕊群発達抑圧遺伝子の発現を減少させることからなる場合、植物が（より）雌化されたか否かを調べるべきである。これは、表現型を評価することにより、即ち、植物が成熟するのを待ち、雌化の表現型特徴が現れるか否かを確認することにより、行うことができる。しかし、より迅速でより信頼性の高い方法として、ＧＤＳマーカー支援選抜が挙げられる。ＧＤＳマーカー支援選抜でＧＤＳ遺伝子の機能欠損をまねくかもしれない変異が同定された場合、当該変異の導入は、以降の世代でＧＤＳマーカー支援選抜により導かれてもよいし、Ｍ座位を間接的に確認できるようにＧＤＳ遺伝子の変異と十分に遺伝的に連鎖したマーカー（好ましくは、ＧＤＳ遺伝子との遺伝的距離が５０ｃＭ未満の、より好ましくは、４０ｃＭ未満の、より好ましくは、３０ｃＭ未満の、より好ましくは、２０ｃＭ未満の、より好ましくは、１０ｃＭ未満の、より好ましくは、５ｃＭ未満の、より好ましくは、２ｃＭ未満の、より好ましくは、１ｃＭ未満の）を用いるなどして、分子生物学的に確認することにより導かれてもよい。実施例で確立されたように、ＡＯ０２２、Ａｓｐ１−Ｔ７、Ａｓｐ２−Ｓｐ６、Ａｓｐ４−Ｓｐ６、Ｔ３５Ｒ５４−１６００ｓｅｑ、Ａｓｐ８０、Ａｓｐ４３２／４４８、Ａｓｐ４４６、１０Ａ３＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒ及び１０Ｂ６＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒ、又はＣＥ６４／ＣＥ６６−ＨＲＭなどの１つ以上のマーカーの存在により、どの遺伝子型が存在するか、ひいては、そこからどの表現型が生じるかが判別できる。本発明の実験部で用いたマーカーに加えて、任意のマーカーの由来とするために、又は、植物の遺伝子構造を決定するための分子系アッセイを開発するために、配列番号１又は配列番号３の遺伝情報を用いることもできる。さらに、代わりに、マーカーは、図１３で示した、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４配列又はＳｃａｆｆｏｌｄ９０５に由来するものであってもよい。

一般的に、本発明に係る方法での植物の選抜と交配について、少なくとも１つの選抜工程での選抜を支援するためにマーカーが用いられる。本分野では周知であるが、ある形質又は状態を示すマーカーは、インビボ及びインビトロで異なる生物学的レベルで発見され得る。例えば、マーカーは、ペプチドレベル又は遺伝子レベルで発見され得る。遺伝子レベルでは、マーカーは、ＲＮＡレベル又はＤＮＡレベルで検出され得る。好ましくは、本発明では、こうしたマーカーの存在は、上述のマーカーを用いて、ＤＮＡレベルで検出される。代わりに、ＧＤＳ遺伝子の発現の変化が、当該遺伝子と特異的に結合するによるイムノアッセイを行うことにより、植物部分で評価され得る。また、以下の表３で記載のものなどのプライマーも、ＧＤＳ遺伝子の増幅のために用いられ得る。当該遺伝子の存在は、この遺伝子の配列、例えば、配列番号１由来の配列と結合するプローブにより試験できる。さらに、本出願の実験部で用いられたマーカーなどの、コード配列の近傍でみつかるはずの特異的マーカーを使用することもできる。形質転換アプローチの場合、導入植物の選抜は、下記の選抜可能なマーカー又はレポーター遺伝子を用いることにより達成できる。

幾つかの場合、本発明の方法を一時的な発現を介して行うことが推奨され得るだろう。一時的な遺伝子発現、例えば、アグロ浸潤を介して実現されるものなどは、有用なタンパク質の高レベル発現への、迅速で、柔軟性があり、再現性のあるアプローチである。植物では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の組換え系統が、細菌ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に導入されている遺伝子の一時的発現のために用いられ得る。細菌培養を葉に浸潤させ、Ｔ−ＤＮＡが導入されると、植物細胞で関心のある遺伝子の異所的な発現がみられる。しかし、このシステムの有用性は、異所的なＲＮＡ発現が２−３日後には止まってしまうため、限られている。転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）がこの効率性の欠如の主な要因であることが示されている。ウイルスにコードされる遺伝子サイレンシングの抑圧因子であるトマトブッシースタントウィルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質の共発現に基づくシステムは、浸潤組織でのＰＴＧＳの開始を防ぎ、高レベルの一時的発現を可能とする。ある範囲のタンパク質の発現は、ｐ１９の存在で５０倍以上に増進されたので、ほんの１００ｍｇの浸潤葉材料からタンパク質精製を行うことができた。ｐ１９の使用が有利であることは明らかなものの、例えば、ＲＮＡｉ構築物及び／又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物で用いられる断片及びホモログなどの候補断片及び機能的ホモログの機能性を試験するために、ｐ１９を用いないアグロ浸潤法を用いることもできる。

本発明のある特定の実施形態では、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の破壊又は減少された発現が回復されることが好ましい。植物に関して示されているように（Ｊｉａｎｇ等、２０１３、破壊されているＧＦＰタンパク質がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓにより回復できたことが示されている）、こうした方法はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによりもたらされ得るだろう。

さらに、本発明は、顕性雄性刺激因子の機能的発現が回復させられている植物を準備する工程と、当該植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統育種技術に取り入れる工程と、を備える、雌雄異株植物における育種を改良する方法を包含する。こうした機能的発現の回復は、当該顕性雄性刺激因子の機能的コピーによる補填により達成できる。

代替的実施形態では、本発明は、親植物の一方又は両方が、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が当該顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより補填されている植物である、雌雄異株植物を自家受精させる方法を包含する。雌性植物が雄性顕性刺激因子の機能的コピーを付与されると、当該植物は、より雄らしくなり、そして、葯をつけるはずであり、そして、当該植物は、両全株になると思料され得る。上で議論したように、こうした両全性植物は本発明の方法で数種のやり方で用いることができる。

機能的顕性雄性刺激因子を付与された植物は葯をつけるので、本発明は、こうした機能的タンパク質を産生する能力を有する遺伝子を植物に付与する工程を含むインビトロ雄性発生を行う方法も指向する。こうした植物を作出するために、タンパク質をコードする核酸構築物又は当該タンパク質自身のいずれかを植物又は植物細胞に付与する全ての方法を用いることができる。こうした方法について上で簡単に記載したが、これらは当業者にとって周知である。

植物細胞に（組換え）核酸を導入できるやり方は複数あり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換などがある。しかし、本発明を実施しようと思う場合、アグロバクテリウム感染に加えて、レシピエント植物へのＤＮＡの効率的な送達のための他の手段もある。植物細胞へＤＮＡを送達する適切な方法には、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９：１８３−１８８、１９８５）、エレクトロポレーション（米国特許第５３８４２５３号明細書）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒ等、１９９０；米国特許第５３０２５２３号明細書；及び米国特許第５４６４７６５号明細書）、及びＤＮＡ被覆粒子の加速（米国特許第５５５０３１８号明細書；米国特許第５５３８８７７号明細書；及び米国特許第５５３８８８０号明細書）などによるＤＮＡの直接送達などによる、細胞にＤＮＡを導入できる事実上任意の方法が包含されると考えられる。こうした技術の適用により、事実上任意の植物種由来の細胞が安定して形質転換され得、これらの細胞はさらに開発されて形質転換植物となり得る。

アグロバクテリウム媒介形質転換が用いられる場合、Ａ２８１株又はその派生株又は本分野で利用可能な別の毒性株といった、アグロバクテリウム・ツメファシエンシスなどの実質的に有毒なアグロバクテリウム宿主細胞を用いることが好ましい。これらのアグロバクテリウム株は、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、及びｖｉｒＧ遺伝子を含有するＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２の毒性領域を起源とするＤＮＡ領域を含んでいる。アグロバクテリウム・ツメファシエンシスの毒性（ｖｉｒ）遺伝子産物はＴ−ＤＮＡのプロセシングとその植物細胞への転移を調整する。ｖｉｒ遺伝子発現は、ｖｉｒＡ及びｖｉｒＧにより制御され、一方、誘導シグナルを認識すると、ｖｉｒＡはリン酸化によりｖｉｒＧを活性化する。同様に、ｖｉｒＧは、ｖｉｒＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅの発現を誘導する。これらの遺伝子はＤＮＡの転移に関連するタンパク質をコードする。ｐＴｉＢｏ５４２の増進された毒性は、このＴｉプラスミド上の超毒性ｖｉｒＧ遺伝子により引き起こされると考えられる（Ｃｈｅｎ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２３０：３０２−３０９、１９９１）。

植物又は植物細胞への核酸の転移の後、当該核酸が付与されたのがどの植物又は植物細胞であるかを決定せねばならない。これは、分子マーカーとの配列アライメント又はＰＣＲ系技術などの分子アッセイ技術を用いて行うことができるが、例えば、選択可能なマーカー又はリポーター遺伝子を用いて達成してもよい。選択マーカー又は選択遺伝子の中で、植物形質転換で最も広範に使われているのは、欧州特許第１３１６２３号明細書で提案された、選択剤であるカナマイシンへの抵抗性を与える細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩ、ｎｐｔＩＩ、及びｎｐｔＩＩＩ遺伝子）、及び、欧州特許第１８６４２５で提案された、ハイグロマイシンへの抵抗性を与える細菌性ａｐｈＩＶである。欧州特許第２７５９５７号明細書は、除草剤であるホスフィノトリシンへの抵抗性を与えるストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の使用を開示する。除草剤であるグリホサートへの相対的な抵抗性を与える植物遺伝子が欧州特許第２１８５７１号明細書で提案されている。この抵抗性は、Ｎ−ホスホメチルグリシンに対して比較的に耐性を有する５−エノールシキマート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子の発現に基づいている。リシン、トレオニン、又はリシン誘導体であるアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）及び５−メチルトリプトファンといったトリプトファンアナログなどの幾つかのアミノ酸も、選択剤として用いることができる。この選択システムでは、選択可能なマーカー遺伝子の発現は、形質転換細胞による、選択下での当該形質転換細胞の増殖を許すアミノ酸の過剰発現をもたらす。レポーター遺伝子の適切な例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。しかし、好ましくは、抵抗性遺伝子の存在が核酸系アッセイにより検査される、国際公開第０３／０１０３１９号明細書に開示のものなどの、マーカーフリーアプローチが用いられる。

顕性雄性刺激因子（をコードする遺伝子）を導入する方法に加えて、このタンパク質の発現は上記のように阻害されてもよい。遺伝子発現の阻害又は遺伝子の破壊は、上で分類したような、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の阻害のための技術を用いて達成できる。上記のように、雌性抑圧因子の不活化に加えて、顕性雄性刺激因子の阻害は、雄性又は雄性両全性同株植物に由来する雌性植物をもたらすはずであるので、これも所望の雌化植物の例に含まれる。加えて、顕性雄性刺激因子の阻害は、除雄が必要な交配で除雄の代替法を提供するのに役立つかもしれない。

本発明はさらに以下の非限定的な実施例に例示される。

（実施例１）
（両全性変異体５３７５の遺伝分析）
ヘテロ接合雄株（ＸＹ）の葯培養の後に、Ｒｉｃｃａｒｄｉ等（２０１０）は、雄株（ＹＹ）、雌株（ＸＸ）、及び、完全に両全性のクローンからなる希少例である『５３７５』遺伝子型を得た。全ての花が両性花であるこの遺伝子型は、雄花と両性花の割合が変動する雄性両全性同株遺伝子型とは別個のものである。完全に両全性のクローンは、成熟植物として、３季節連続で盛んな成長をみせ、この間に、その全ての花から漿果をつける能力を示したが、これは、イタリアのロジのＣＲＡ−ＯＲＬ研究所でこれまで評価された全雄育種素材の着果と比べて類を見ないほど高度な着果であった。両全株５３７５を得るために使用する原材料としての役割を果たしたハイブリッド植物は、漿果をつける能力を有していない雄性植物であり、育種に用いた、葯培養のための元の植物は、好ましくは、極めて限られた着果を示すため、漿果が見過ごされた季節がある場合でも、その数はほんの僅かと考えられた。

アスパラガスでは、２つの連鎖遺伝子（Ａ、Ｆ）での２つの顕性アレルが雄蕊群発達と雌蕊群発達の抑制とをそれぞれ制御するとの仮説が立てられていた（Ｂｒａｃａｌｅ等、１９９０、Ｓｅｘ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ．、３：２３−３０； Ｂｒａｃａｌｅ等、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、８０：６７−７７）。

Ｒｉｃｃａｒｄｉ等（２０１０）が引用するこのモデルでは、雌株は『ａａｆｆ』遺伝子型を有し、ヘテロ接合雄株は『ＡａＦｆ』遺伝子型を有し、超雄株は『ＡＡＦＦ』遺伝子型を有する。Ｒｉｃｃａｒｄｉ等（２０１０）は、『５３７５』のＭ座位内の組換え事象が、倍加半数体及びＡＡｆｆ遺伝子型を備える完全に両全性の植物を生み出したと推測した。この仮説を検証するために、数種の交配が計画され、開花について（雄花、雌花、又は両性花のいずれに分類されるか）の表現型検査及び伴性マーカーの分析の両方が行われた。高度に多様な単一座位マイクロサテライトマーカーのセットを用いることにより、特定の両全株『５３７５』が倍加半数体ではなく、実際は、高度にヘテロ接合性であることが後に示された。両全株『５３７５』は、稀な組換えが生じた花粉配偶子を起源とする倍加半数体ではなく、組織培養に用いた葯を提供したハイブリッドの体細胞クローンに相当するとの仮説が立てられた。結果として、遺伝子型『Ａａｆｆ』がより適切と考えられた。このモデルの元で、この遺伝子型は、顕性雄蕊群発達遺伝子については通常の雄株で観察されるのと同様に『Ａａ』のヘテロ接合を維持し、さらに、特定の葯を提供したヘテロ接合雄株に元から存在する雌蕊群発達抑圧因子遺伝子が機能欠損変異により破壊されたため、顕性雌蕊群発達抑制因子遺伝子の２つの潜性アレル『ｆｆ』を備えている。図式で示せば、ＡｆＦｆ（変異）→Ａａｆｆ、となる。

性染色体又は『Ｍ座位』と両全性形質との共分離を検証するために、伴性マーカーが用いられた。第１マーカーは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＶ２８７８６０に由来する独占マイクロサテライトマーカー（ＡＯ０２２と示す）であり、以下の配列を有する。

ＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＴＴＡＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＧＡＴＴＣＣＧＧＴＡＧＡＡＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＡ

このマーカーは、育種集団及び研究集団でこれまで試験済みであり、Ｍ座位から０から５センチモーガンの間で変動する遺伝的距離に常にマップされてきた。第２マーカーは、Ｊａｍｓａｒｉ等（２００４）が発表したＡｓｐ１−Ｔ７であり、以下の配列を有する。

ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＧＣＴＧＮＧＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣＧＡＧＴＡＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＴＴＣＴＡＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＧＡＡＡＧＧＧＡＴＡＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴ

仮説の『Ａａｆｆ』遺伝子型の証拠を見つけるために、数回の検定交配が行われた。第１家系（家系１Ｅと示す）では、両全株５３７５（Ａａｆｆ）は自家受精するよう放任された。結果生じた家系１Ｅの子孫、いわゆる、『Ｓ１』又は『Ｆ２』は、両全株と雌株の両方を含むものの、雄性植物を含まなかった。この家系の花を分析し、着果（無昆虫条件の着果）を記録した。観察された両全株及び雌株の数は、それぞれ、１６６及び５６であり、両全株性をもたらす一遺伝子性顕性遺伝子の場合に予期されるとおり、３：１の比率に従っていた。この家系の両全株の全てが、無昆虫条件下で、漿果をつけた。５３７５に由来する成熟両全性植物の茎の全ての花が、果実をつけ、そして、漿果をなしたこと、及び、全ての漿果が黒色の完全に発達した種子を含んでいたことは重要なので留意されたい。こうしたよく発達した種子は、雌性植物で通常観察されるものに匹敵する。両全株親植物５３７５のマーカー分析は、マーカーＡＯ０２２について１６１／１６９遺伝子型（但し、１６１及び１６９はキャピラリー電気泳動システムでの推定断片サイズを指す）を示した。推定断片長さはキャピラリーシステム毎に変わるかもしれないが、当業者であれば、当該推定断片長さを相互に明確に区別できる。さらに、両全株５３７５はＰＣＲマーカーＡｓｐ１−Ｔ７の存在を示した。観察された両全性形質はＡＯ０２２マイクロサテライトマーカーと固く連鎖しているようにみえる。ＡＯ０２２−１６９アレルは、１６６の両全性植物のうち１６３からみつかり、５８の雌性植物のうち５３では欠如していた。この集団の全ての植物がＡｓｐ１−Ｔ７雄性マーカーで検査された。検査した１６６の両全株の全てがＡｓｐ１−Ｔ７雄性アレルを有していたが、検査した６５の雌株の全てがＡｓｐ１−Ｔ７雄性マーカーアレルを欠如していた。家系１Ｅ植物の一部の結果を表１ａにまとめる。

表１ａ：家系１Ｅ両全株５３７５（マーカーＡＯ０２２について１６１／１６９遺伝子型を有し、鋳型ＤＮＡとして用いられた場合にＡｓｐ１−Ｔ７雄性検査用断片を示す）の自家受精から生じた家系の、花の表現型及びマーカーの分離について得られた結果。

組換え事象により生じたに違いないマイクロサテライトマーカーでの僅かな例外はあるものの、ＡＯ０２２−１６９アレル（１６１／１６１遺伝子型）及び顕性Ａｓｐ１−Ｔ７雄性マーカーアレルを欠如している植物は、葯も欠如しており、そして、雌株であると結論できる。結果として、雌蕊群抑圧因子は両全株５３７５では失われており（そして、これにより、柱頭発達及び着果が可能となり）、一方、葯をつける能力は、交配で分離し且つ準備した遺伝子マーカーと連鎖しているヘテロ接合の状態に維持されたと推測できる。第２世代では、Ａａｆｆを示すマーカーＡＯ０２２について１６１／１６９遺伝子型を有する２６のＦ２植物の自家受精から得られた２６のＦ３ファミリーがさらに表現型検査された。これらのファミリーの子孫は、各ファミリー毎に４から８９個体の間で個体数に開きがあった。これらのＦ３ファミリーのうち３つを除く全体で、両全株及び雌株についてそれらの総数で５８９対１９３の分離が再び観察された。これは、再び、雌蕊群発達抑圧因子が欠如しているに違いない遺伝的背景で雄蕊群発達の顕性遺伝子が分離する両全株性をもたらす顕性遺伝子の場合に予期される３：１の比率であった。他の３つの（１６１／１６９−Ｆ２植物由来）Ｆ３ファミリーは、それぞれ１８、２０、及び１１個体からなるが、両全株のみがみつかり、雌株はみられなかった。この特定の植物については、マイクロサテライトマーカーと性決定遺伝子との間で組換え事象が生じ、この特定の自家受精植物は、１６１／１６９遺伝子型を有するにもかかわらず、ＡＡｆｆ遺伝子型をおそらく有するだろう。最大のファミリーのうち、１０の植物がＡｓｐ１−Ｔ７断片の存在を検査されたが、実際に、これらの植物のいずれもが雄性Ａｓｐ１−Ｔ７アレルを欠如していた。別の１４のＦ３ファミリーは、子孫の個体数が８から８８の間で開きがあり、ＡＡｆｆを示すマーカーＡＯ０２２について１６９／１６９遺伝子型を有するＦ２植物の自家受精に由来するものであるが、総計で３２４の両全株同胞が生じ、雌性植物はみられなかった。家系１Ｅ Ｆ３交配の結果を表２に示す。

表２：Ｆ２ファミリーのＡＯ０２２マイクロサテライトアレル及びＡｓｐ１＿Ｔ７マーカーの結果及び植物表現型、並びに、これらの個別のＦ２植物から得られたＦ３での、雌株（Ｆ）及び／又は両全株（Ｈ）としたときの花（及び自然発生的な漿果の着果数）の表現型を示す。マーカーＡｓｐ１−Ｔ７について付されている『Ｍ』は、雄性特異的領域の検査用のＰＣＲ断片の存在を指す。交配１（５３７５自家受精＝Ｆ２植物）。

第２家系（家系２Ｅと示す）では、雌性半数体倍加系統『５４５９』が両全株『５３７５』と交配された。上で提起した遺伝子モデルによれば、これは、５４９５×５３７５＝ａａｆｆ×Ａａｆｆ、となる。マイクロサテライトマーカーＡＯ０２２について、植物５４９５及び５３７５は、それぞれ、１６６／１６６及び１６１／１６９遺伝子型を示した。この検定交配の子孫２Ｅは、６４の両全株、８３の雌性植物を示し、雄性植物はみられなかった。これは、葯発達のための顕性遺伝子の分離と一致する、１：１の分離比と顕著な違いはない。さらに、この集団は、その子孫で分離しない雌蕊群発達抑圧の完全な欠如を示しており、これは、５３７５が雌蕊群抑制因子遺伝子の機能欠損について事実上ホモ接合性であることを示唆しており、そうでなくとも、少なくとも棄却するものではない。表現型分類及びマーカーの分離を表１ｂに示す。マーカーの結果は、交配１Ｅで既に観察されているように、ＡＯ０２２−１６９アレルが両性花形質に密接に連鎖していることを示す。ＡＯ０２２−１６９アレルは、６４の両全株のうち６０に存在し、８３の雌性植物のうち８２で存在しなかった。Ａｓｐ１−Ｔ７について検査した植物の一部（１１の両全株及び１０の雌株）は、雄性アレルと両全性形質の完全な連鎖を示している。

表１ｂ：家系２Ｅ雌株５４５９×両全株５３７５（ＡＯ０２２遺伝子型がそれぞれ１６６／１６６及び１６１／１６９であり、５３７５のみで、雌親には存在しない検査用雄性Ａｓｐ１−Ｔ７断片を示す）の交配の子孫の花表現型及びマーカーの分離について得られた結果。

第３家系（家系３Ｅと示す）では、両全性植物『５３７５』は、除雄され、半数体倍加系統超雄株『１７７０』と交配された。この交配では、１２のＦ１植物が得られた。異なる２つの遺伝子型『ＡａＦｆ』及び『ＡＡＦｆ』が予期される１２の植物の全てが、雄株であり、そのため、果実や種子をつけることができない。これは、雄性形質、雌蕊群発達の抑制因子が両全性形質に対して顕性であることを指し示している。そして、両全性形質、即ち、機能的な葯を有する植物が雄蕊群と種子を持つ果実とをつける能力が潜性であることが立証された。少数の植物が遺伝子型『ＡａＦｆ』及び『ＡＡＦｆ』の両方を含み、実際に、『ａｆ』配偶子（共通雌株及びヘテロ接合性雄株から獲得できる）のみならず『Ａｆ配偶子』（両全株で典型的）がこの子孫の世代に寄与していることの証拠は、マーカー解析から得られる。倍加半数体１７７０は、マーカーＡＯ０２２について１６６／１６６マーカー遺伝子型を有していた。表現型の結果及びマイクロサテライトマーカーの結果を表１ｃの示す。７のＦ１植物が、ＡＯ０２２マイクロサテライトマーカー１６１／１６６遺伝子型を示した。マイクロサテライトＡＯ０２２アレル『１６１』と雌性表現型（家系１Ｅ及び２Ｅで確認）との間の遺伝的連鎖から、これらの植物又は少なくともこれらの植物の大部分は、雌性染色体遺伝子型『ａｆ』を有する両全株５３７５の母系配偶子及び『ＡＦ』を有する倍加半数体超雄株１７７０の父系配偶子から生じたに違いない。結果として、これらの植物は『ＡａＦｆ』遺伝子型をおそらく有するだろう。残りの５つの植物は、ＡＯ０２２マイクロサテライトマーカー遺伝子型１６９／１６６を有しており、マイクロサテライトＡＯ０２２アレル『１６９』と両全性表現型との間の連鎖から、これらの植物又は少なくともその大部分は、『Ａｆ』のアレルで両全性形質を引き起こす雄性染色体を持つ両全株５３７５の母系配偶子及び倍加半数体超雄株１７７０の父系『ＡＦ』配偶子から生じたに違いない。結果として、これらの植物は『ＡＡＦｆ』遺伝子型をおそらく有するだろう。そして、両全性形質、即ち、機能的な葯を有する植物が雄蕊群と種子を持つ果実とをつける能力が潜性であることが立証された。植物は、マーカーＡｓｐ１−Ｔ７について検査され、全ての植物が、この雄性特異的マーカーの雄性アレルを示した。

表１ｃ：家系３ＥＦ１交配５３７５×（５３７５×１７７０）（遺伝子型１６９／１６６を有するＦ１植物が除雄された５３７５を受粉するために用いられた）において花表現型及びマーカーの分離について得られた結果。

表１ｄ：家系３Ｅ疑似検定交配１８００×選抜Ｆ１（５３７１×１７７０）（マーカーは１８００（１６６／１６６）×選抜Ｆ１（１６９／１６６）と対応している）の花表現型及びマーカーの分離について得られた結果。

表１ｅ：家系３Ｅ疑似検定交配１８００×選抜Ｆ１（５３７１×１７７０）（マーカーは１８００（ＨＲＭ曲線『Ｔ欠失』）×選抜Ｆ１（ＨＲＭ融解曲線ＷＴ）と対応している）の花表現型及びマーカーの分離について得られた結果。

家系３Ｅの次の世代で、疑似検定交配が行われた。交配５３７５×１７７０由来の単一の雄性植物が、そのＡＯ０２２マーカー遺伝子型１６９／１６６のため選抜された。当該マーカー及び性決定遺伝子との間の連鎖から、これは遺伝子型ＡＡＦｆを殆ど確実に有するはずである。この選抜植物は、マーカーＡＯ０２２について１６６／１６６遺伝子型を有する倍加半数体雌性植物『１８００』と交配された。式で表せば、１８００×選抜Ｆ１（５３７５×１７７０）＝１６６／１６６×１６９／１６６＝ａａｆｆ×ＡＡＦｆ、となる。このファミリーは、１２１の雄株対１１８の両全株に分離し、これは、顕性雌蕊群発達抑圧因子Ｆｆ対ｆｆの分離から予期される１：１の比率と一致していた。また、これは、全ての同胞が、雄蕊群発達遺伝子についてヘテロ接合性『Ａａ』のはずであり、そのため、全てが葯を有すると予測する遺伝子モデルとも一致する。この疑似検定交配の２４の植物の一部について、ＡＯ０２２マイクロサテライト遺伝子型が決定された。結果を表１ｄに示す。２４の両全株のうち１１が１６６／１６９遺伝子型を有していた。両全株の一つは、１６６アレルと雌蕊群発達抑制因子遺伝子との間の組換えによる可能性があるが、１６６／１６６遺伝子型を有していた。１２の雄性植物の全てが１６６／１６６遺伝子型を有していた。これは、ＡＯ０２２マイクロサテライト父系マーカーアレル『１６６』（雄性祖父株１７７０起源）と雌蕊群発達抑制因子との連鎖を裏付ける。さらに、両全性祖父株のＡＯ０２２１６９父系アレルに連鎖する雌蕊群発達抑制因子の欠如が雌蕊群発達を可能とすることが指し示される。

上述の交配の全てから、観察された分離が、共通雌株と同様に雄蕊群発達遺伝子がヘテロ接合性であり、雌蕊群発達抑制因子遺伝子の機能的アレルが欠失している両全性クローン５３７５の『Ａａｆｆ』遺伝子型と一致していることが教示される。顕性遺伝性両全性がアスパラガスの性染色体と連鎖しており、ここで提示した遺伝分析は、性染色体上での当該形質とマーカーとの間の遺伝的連鎖が検査又は検証できる方法を提供する。当業者にとって、両全性形質と性染色体との連鎖を検査するために同様に用いいることができる他のマーカーは自明であろう。

さらに、これらの交配の結果から、両全株が、自家受精する能力を有しており、以降の世代で近親交配をもたらすオフスプリングを提供することが教示される。この実施例での近親交配は、ＡＯ０２２遺伝子型の分析から推測できる。例えば、家系１Ｅで、ＡＯ０２２座位でのヘテロ接合は５０％減少している。遺伝学者又は育種者であれば、この種の近親交配が任意の他の座位でヘテロ接合を減少させ得ることを想定できるだろう。さらに、当業者にとって、完全同胞交配と比べて、ここで提示した自家受精による近親交配がより効率的に生じることは、明白だろう。完全同胞交配では、後の姉妹兄弟の交配と同様に、自家受精と比べて同程度のヘテロ接合性を実現するために３世代も余分にかかる（Ｂｏｓ、１９８５、Ｔｈｅｖｅｎｉｎ、１９６７；ｐ１０８）。さらに、両全性形質が（例えば、販売用Ｆ１ハイブリッドなどで）もはや望ましくない場合に、両全性形質を次の世代に移さないはずの近交系雌性植物を最終的に得るために、雄蕊群発達遺伝子がないように（例えば、連鎖マーカーを用いて）選抜することにより、特定の近親交配世代において両全性形質を容易に除去することができることも想定できるだろう。従って、自家受精を可能とする常染色体性修飾因子（これらの修飾因子についてはＦｒａｎｋｅｎ、１９６９、１９７０を参照）に依存せず、自家受精により近交系を得るための方法が提供される。代わりに、本発明の近親交配は、雄蕊群発達を可能とする顕性遺伝子『Ａｆ』に連鎖する雌蕊群発達を可能とする劣性アレルがあるように選抜を行い、その後、２つの連鎖遺伝子の『Ａｆ』のアレルの組み合わせがないように選抜を行うことで、共通雌性近交系を得ることに依拠している。

両全性形質と雄性植物に固有の染色体セグメントを示すマーカーＡｓｐ１−Ｔ７との共分離があるため、Ｒｉｃｃａｒｄｉ等（２０１０）により以前提案された、組換え事象が、雄性特異的染色体セグメント上に位置する雌蕊群抑制因子を、雌蕊群抑制因子を天然には有していない雌性染色体セグメントに『乗り換えさせた』という理論は、棄却された。代わりに、両全性植物に依然として存在し、組換えで失われていない雄性染色体セグメント上の雌蕊群抑制因子で変異が生じたという仮説が立てられた。この変異は、次の世代に伝えることができ、メンデル性の単一座位分離を示す。

結果として、変異が生じた遺伝子をみつけることに精力が向けられた。

Ｊａｍｅｓ Ｈ Ｌｅｅｂｅｎｓ−Ｍａｃｋ博士の研究室（ジョージア大学、米国、アセンズ）では、中国の深川にある北京ゲノム研究所（ＢＧＩ）との共同で、倍加半数体超雄株ＤＨ００／０８６のドラフトゲノム配列（ｖｅｒｓｏｎ １．０）に取り組んできた。

このため、ＤＨ００／０８６の幼芽又はシダ組織から単離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンシングのために、単離及びプールされた。要約すると、プールされたｇＤＮＡは、ショットガンライブラリー調製のため、厳重な断片化とｇＤＮＡの末端修復、アダプターライゲーション、サイズ選抜、ＰＣＲ増幅、ライブラリー精製、及び品質管理により、調製された。９つのショートインサートペアドエンドライブラリーと６つのロングインサートペアドエンドライブラリー（メイトペア）が、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）に用いられた。２１のフローチャネルが準備され、ライブラリーはＨｉｓｅｑ２５００ ２ｘ１００ｎｔ ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｍｏｄｅでシーケンスされた。イルミナパイプライン１．８でのＱｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓに従ってデータは収集及びフィルターされた。合計で１６３ギガ塩基の配列が、アスパラガス・オフィシナリスの半数体ゲノムのおよそ１２３Ｘカバレッジに対応する品質基準を合格した。デノボアセンブリを、複数ｋ−ｍｅｒ戦略によりＳＯＡＰｄｅｎｏｖ２パイプラインで実施した（Ｌｕｏ等、２０１２、Ｐｅｎｇ等、２０１２）。ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ２は、ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏと同様に、リードエラー校正、ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ｇｒａｐｈ（ＤＢＧ）構築、コンティグアセンブリ、ペアエンドリードマッピング、スキャフォールド構築、及びギャップ封鎖を取り扱う６つのモジュールから構成されている。デノボアセンブリは、ＳｃａｆＳｅｑ−のプリフィックスを有する２４１１３スキャフォールドを有し、このスキャフォールドのうち１１５は、Ｍ座位及び周辺領域にマップされる可能性が高いゲノム配列のアライメントから構成される疑似スキャフォールドであった。疑似スキャフォールドは、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ−のプリフィックスを有する。アライメントに用いたゲノム配列は、遺伝子型ＤＨ００／０８６（超雄株）及びＤＨ００／９４（雌株）の高分子量ゲノムＤＮＡから構築された２つのＢＡＣライブラリーに由来する細菌人工染色体（ＢＡＣ）コンティグ配列を含んでいた（Ｌｅｅｂｅｎｓ−Ｍａｃｋ、ＪＨ、ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２０１０）。ライブラリーは、Ｍ座位表現型と遺伝的に連結している分子マーカーによりスクリーニングされ、候補クローンのＢＡＣ ＤＮＡは、その後、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ ｓｙｓｔｅｍ用のＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｃｌｕｓｔｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてシーケンスされた。アスパラガス・オフィシナリスの２４１１３ものスキャフォールドを含有するアセンブリなどのデノボアセンブリで有用な統計量の一つとして、Ｎ５０値が挙げられる。要約すると、コンティグ又はスキャフォールドＮ５０は、アセンブリ全体の５０％がこの値以上のコンティグ又はスキャフォールドに含まれるというメジアン統計量である。アスパラガス・オフィシナリスのデータのアセンブリの結果は、コンティグＮ５０が２１１７９、スキャフォールドＮ５０が３０１０４０を示し、これは半数体ゲノムの８０％にものぼる。スキャフォールドのコンセンサス配列が、推定反復因子やアブイニショ遺伝子予測などのアノテーション目的で用いられ、アスパラガス・オフィシナリスの数種の遺伝子型の、ｃＤＮＡリードマッピング実験（ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験と呼ぶ）及びゲノムリシーケンシング実験の両方で参照ゲノムとしての役割を果たした。用いた参照ゲノムは、Ａｓｐａｒａｇｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｖ１．１０（ＡＧＳ Ｖ１．１０）と呼称され、アノテーションのメタデータは、ＡＧＳ Ｖ１．１０に基づく関係型データベース中の個別のファイルに保存された。

反復因子の既知の種類の全て、及び、植物トランスポゾン配列をはじめとする反復因子の新規の予測について、ＡＧＳ Ｖ１．１０をスクリーニングするために、多数の方法が用いられた。ＬＴＲｈａｒｖｅｓｔは、ゲノム配列中で長い末端反復を有するレトロトランスポゾンの境界位置を計算するソフトウエアパッケージである（Ｅｌｌｉｎｇｈａｕｓ等、２００８）。ＬＴＲｈａｒｖｅｓｔは、デフォルト及び手動で設定した類似指数で用いられ、出力ファイルはＦＡＳＴＡ形式及びＧＦＦ３形式の予測を含んでいた。Ｒｅｐｅａｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒは、ＮＧＳデータでの反復配列及び転移因子コード配列の解析のためのユーティリティを含むパイソンスクリプトのソフトウエアスートである （Ｎｏｖａｋ等、２０１０）。ＲｅｐｅａｔＥｘｐｌｏｒｅｒは、市販のものに加えて、Ｇａｌａｘｙに基づくウェブサーバー（ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｏｒｇ）からもアクセスできる（Ｎｏｖａｋ等、２０１３）。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、分散型反復配列及び低複雑性配列についてＤＮＡ配列をスクリーニングするプログラムである。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ワシントン、シアトル、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）は、入力クエリ配列を反復配列の精選されたデータベースとアラインし、出力ファイルとして、予測反復配列のヌクレオチドが記号Ｎで置換されたマスクされたクエリ配列を含むものを出力するＢＬＡＳＴに基づくプログラムのセットである。クエリＡＧＳ Ｖ１．１０は、ＲＭＢｌａｓｔをデフォルトの感度で用いてマスクされた。マスクされた出力ファイル（ｒｍＡＧＳ Ｖ１．１０）がアブイニショ遺伝子予測に用いられた。基本的に、プログラムは、遺伝子証拠の所与のソースで示唆される、プロモーター、転写開始点、停止、スプライスドナー、スプライスブランチ、及びスプライスアクセプター部位などの候補シグナル部位を同定することにより、遺伝子について証拠を収集するアルゴリズムの訓練されたセットを用いる。アブイニショ遺伝子予測は、ＢＧＩパイプライン（Ｆｇｅｎｅｓｈ及びＧｌｉｍｍｅｒＨＭＭ）をデフォルトの設定で用いて行われ、遺伝子証拠についての組み合わせＧＬＥＡＮファイル（Ｅｌｓｉｋ、２００７）が得られた。セットは、２８２８８の予測タンパク質コード遺伝子（平均ＣＤＳ長が１００６ｂｐ、予測転写物毎の平均エクソン数が４．７５）を含んでいた。さらに、ＳＮＡＰ（Ｓｅｍｉ−ＨＭＭ−ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐａｒｓｅｒ、Ｋｏｒｆ、２００４）ソフトウエアパッケージを緑色植物亜界の設定で用い、遺伝子モデルを予測した。合計で２４１１６の遺伝子がＳＮＡＰアルゴリズムにより予測された。

（ＲＮＡｓｅｑ）
２つのＲＮＡ−ｓｅｑ実験が行われた。第１の実験は、雌株、雄株、超雄株のアスパラガス遺伝子型の間で示差的に発現される転写物を同定し、これらの転写物をＡＧＳ Ｖ１．１０ゲノムアセンブリにマップするために設計された。合計で、１３のＬｉｍｇｒｏｕｐアスパラガス系統、具体的には、９Ｆｅｍａｌｅ（９Ｆ）、９Ｍａｌｅ（９Ｍ）、８８Ｆ、８８Ｍ、８８ｓｕｐｅｒＭａｌｅ（８８ｓｕｐＭ）、８９Ｆ、８９Ｍ、８９ｓｕｐＭ、１０３Ｆ、１０３Ｍ、１０３ｓｕｐＭ、並びに、雄性ＤＨ系統のＤＨ００／８６及びＤＮ３３８９が処理された（Ｌｉｍｇｒｏｕｐ ＢＶ、ホルスト、オランダ）。要約すると、全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）のプロトコルを用いて花芽から単離され、ＲＮＡ量がＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア州）のプロトコルを用いて定量された。このＲＮＡは、二重鎖ｃＤＮＡに変換され、ショットガンライブラリー調製のため、アダプターライゲーション、サイズ選抜、ＰＣＲ増幅、ライブラリー精製、及び品質管理により、調製された。１３のショートインサートペアドエンドライブラリーが、ＮＧＳに用いられた。３つのフローチャネルが準備され、ライブラリーはＨｉｓｅｑ２５００ ２ｘ１００ｎｔ ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｍｏｄｅでシーケンスされた。イルミナパイプライン１．８でのＱｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓに従ってデータは収集及びフィルターされた。合計で５億リードが品質基準を合格した。デノボトランクリプトームアセンブリがＴｒｉｎｉｔｙソフトウエアパッケージで行われた（Ｇｒａｂｈｅｒ等、２０１３）。Ｔｒｉｎｉｔｙは、３つの独立したソフトウエアモジュール（Ｉｎｃｈｗｏｒｍ、Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ、及びＢｕｔｔｅｒｆｌｙ）を組み合わせており、大量のＲＮＡ−ｓｅｑリードを処理するためにこれらを順次適用する。Ｔｒｉｎｉｔｙは、配列データを、所与の遺伝子又は座位での転写複雑度にそれぞれ対応する多数の個別のＤｅ Ｂｒｕｉｊｎ Ｇｒａｐｈｓに分割し、その後、各グラフを、全長スプライシングアイソフォームを抽出し、パラログな遺伝子由来の転写物を分離するために、独立して処理する。ペアドエンドリードの標準化の後、２７６５５６個の配列がアセンブリされ、全長が３７８ＭｂでＮ５０が２３８６となった。１３のペアドエンドリードデータがデノボアセンブリに再びマップされ、遺伝子型についてのデータが、性特異的に発現している一塩基変異多型（ｅＳＮＰ）及び短い挿入／欠失（ｉｎｄｅｌ）を探して、ソフトウエアパッケージであるｖｃｆｔｏｏｌｓ（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ ｆｏｒｍａｔ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ、ケンブリッジ、イギリス）を用いて比較された。多数のストリンジェンシー設定を実施し評価した。さらなる検証が必要となるｅＳＮＰ及びｉｎｄｅｌはみつけられなかったと結論付けられた。また、ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウエアパッケージｖｅｒｓｉｏｎ Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ ２．２（Ｔｒａｐｎｅｌｌ等、２０１０）を用いて、上述の１１のＬｉｍＧｒｏｕｐサンプルでの遺伝子の示差的発現を明らかにするためにも用いられた。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓは、転写物をアセンブリし、そのアバンダンスを評価し、ＲＮＡ−ｓｅｑサンプルでの示差的発現及び調節を検定する。このソフトは、アラインされたＲＮＡ−ｓｅｑを受け入れ、こうしたアラインメントを転写物のセットへとアセンブリする。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓは、その後、いくつのリードが互いにサポートし合うのかに基づいてこれらの転写物の相対的なアバンダンスを評価する。要約すると、ＲＮＡ−ｓｅｑデータが、ＴｏｐＨａｔ２．０．１３（Ｋｉｍ等、２０１３）をデフォルトのストリンジェンシー設定で用いて参照ＡＧＳ Ｖ１．１０とアラインされた。ＴｏｐＨａｔは、ＲＮＡ−ｓｅｑリードをｒｍＡＧＳ Ｖ１．１０参照とアラインし、マッピング結果を分析して、エクソン間のスプライス部位を同定する。データは、ＣｕｆｆｌｉｎｋｓでＣｕｆｆｄｉｆ２アルゴリズム（Ｔｒａｐｎｅｌｌ等、２０１２）を用いて処理され、示差的に発現した転写物の同定及び定量が行われる。発現の比較により、一般的な系統及び性の両方の間でのパターンが明らかとなった。発現パターンのクラスター解析は、８８及び８９遺伝子型にそれぞれ関連するクラスターと、９及び１０３遺伝子型の発現パターンを有する第３のクラスターとの３つのクラスターがみられることを示した。全ての遺伝子型についての雄株対雌株の発現の比較は、雄株サンプルで、２６９の遺伝子が顕著に上方調節され、２つが下方調節されていることを示した。全ての遺伝子型についての超雄株対雌株の発現の比較は、４３４の遺伝子が上方調節され、４９が下方調節されていることを示した。シロイヌナズナでアノテートされるＡＢＯＲＴＥＤ ＭＩＣＲＯＳＰＯＲＥＳ ＡＭＳ及びＭＡＬＥ ＳＴＥＲＩＬＩＴＹ ＭＳ２の遺伝子とオルソログな遺伝子をはじめとする葯発達に関連する多数の遺伝子が、超雄株対雌株で示唆的に発現していることがわかった。一連の少なくとも４０の遺伝子が雌株サンプルでは発現を示さなかった。

第２のＲＮＡ−ｓｅｑ実験は、特定の発達段階のアスパラガスの異なる遺伝子型から得られた花芽での全ゲノム遺伝子発現を研究するために設計された。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために選ばれた遺伝子型及びそれに関連するサンプルは、以下のとおりである。
ＤＨ雄株１７７０＝サンプル１
ＤＮ雌株１８００＝サンプル２
両全株５３７５＝サンプル３
家系１ＥのＡＡｆｆ両全株の５つの植物＝バルク１
家系３ＥのＡｓＦｆ雄株の４つの植物＝バルク２
各植物から、３つのフラワーボタンステージ（ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｔｔｏｎ ｓｔａｇｅｓ）を採取した。
Ａ）減数分裂前（両全株及び雄株では１．０−１．２ｍｍ、雌株では０．８−１．０ｍｍ）、
Ｂ）単核小胞子（１．６−１．８ｍｍ）又は発達したばかりの子房（１．２−１．４ｍｍ）、
Ｃ）完全に発達した心皮（萼片が開く直前）
要約すると、全ＲＮＡがＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、デューレン、ドイツ）を用いて花芽から単離され、ＲＮＡ量がＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア州）のプロトコルを用いて定量された。このＲＮＡは、二重鎖ｃＤＮＡに変換され、ショットガンライブラリー調製のため、アダプターライゲーション、サイズ選抜、ＰＣＲ増幅、ライブラリー精製、及び品質管理により、調製された。１３のショートインサートペアドエンドライブラリーが、ＮＧＳに用いられた。２つのフローチャネルが準備され、ライブラリーはＨｉｓｅｑ１０００ ２ｘ１００ｎｔ ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｍｏｄｅでシーケンスされた。イルミナパイプライン１．７でのＱｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓに従ってデータは収集及びフィルターされた。要約すると、ＲＮＡ−ｓｅｑデータが、ＴｏｐＨａｔ２．０（Ｋｉｍ等、２０１３）を感度の良いストリンジェンシー設定（−ｂ２−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）及び大きな最大イントロンサイズ（４０ｋｂ）で用いて参照ＡＧＳ Ｖ１．１０とアラインされた。ＴｏｐＨａｔのアノテーションデータが、ＡＧＳ Ｖ１．１０へのメタデータとして保存され、個別のトラックとしてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、２０１１に読み込まれた。ＩＧＶでは、ＡＧＳ Ｖ１．１０のゲノムスキャフォールドが個別に検査できる。

Ｌｅｅｂｅｎｓ−Ｍａｃｋ博士の研究室では、複数のソースからの遺伝子モデル予測をまとめるために、ＡＵＧＵＳＴＵＳ Ｇｅｎｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｈｏｆｆ等、２０１３）及びＥＶＭ（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｍｏｄｅｌｅｒ、Ｈａａｓ等、２００８）を実用していた。ＡＵＧＵＳＴＵＳ ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎは、以下の２つの工程、アスパラガスについてトレーニングセットを作る工程、及び実際の遺伝子予測を行う工程を伴う。トレーニングソフトウエアは、ゲノム配列及びＴｒｉｎｉｔｙアセンブリのセットから遺伝子セットを自動的に生成、その後、新しい種のためのＡＵＧＵＳＴＵＳパラメーターをトレーニングする。こうした新しいパラメーター及び供給された外部証拠が遺伝子予測モジュールに適用される。ＥＶＭは利用可能な全てのｇＤＮＡ及びＲＮＡ−ｓｅｑデータを統合するために用いられた。このソフトウエアは、アブイニショ遺伝子予測及び転写物アラインメントを組み合わせて、重み付けコンセンサス遺伝子構造を作る。アスパラガスでは、これは、ＧＬＥＡＮ、ＳＮＰＡ、Ｔｒｉｎｉｔｙ、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ、及びＡＵＧＵＳＴＵＳのデータセットを含む。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓデータに最も高い重みが与えられ、ＧＬＥＡＮデータに最も低い重みが与えられた。合計で２４ｋの遺伝子モデルがアノテートされた。遺伝子予測メタデータは、ＡＧＳ Ｖ１．１０に基づく関係型データベース中の個別のファイルに保存された。

リシークエンシングは、参照へのリードのマッピング及びアラインメント、並びに、エラー校正を含む。このため、アスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０９４のショートインサートペアドエンド Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンシングデータ（ＢＧＩ、深川、中国）が得られた。ＤＨ００／０９４は、ＤＨ００／０８６も起源とする同じハイブリッドからの組織培養により得られた雌性倍加半数体である。当該データは、およそ４０Ｘゲノムカバレッジを表す１００ｎｔペアドエンドエンドリードを含む。ＤＨ００／０８６及びＤＨ００／０９４の両方のリードが、ソフトウエアパッケージｂｗａ−ＭＥＭ（Ｌｉ及びＤｕｒｂａｎ、２００９）のＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（設定はデフォルト）、及び、ソフトウエアパッケージＢｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ等、２０１２）のごく最近に開発された超高速ショートリードアライナーを用いて、参照ゲノムとアラインされた。ＤＨ００／０９４マッピングが、ＳＮＰ及びｉｎｄｅｌを探して、ソフトウエアパッケージであるｖｃｆｔｏｏｌｓ（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ ｆｏｒｍａｔ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ、ケンブリッジ、イギリス）を用いて比較された。多数のストリンジェンシー設定を実施し評価した。最初に、ＳＮＰが少なくとも３１９５の遺伝子モデルでみつかった。リシーケンシングメタデータは、ＡＧＳ Ｖ１．１０に基づく関係型データベース中の個別のファイルに保存された。上述の、ＬＴＲ−ｈａｒｖｅｓｔデータ、遺伝子予測、Ｔｒｉｎｉｔｙ ＲＮＡ−ｓｅｑアセンブリ、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓアノテーション、及びリシーケンシングデータを含む全てのＡＧＳ Ｖ１．１０へのメタデータが、ゲノムブラウザーＪＢｒｏｗｓｅ１．１１．４（Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ ＧＭＯＤ、２０１３）内に個別のトラックとして保存された。トラックは、ＡＧＳ Ｖ１．１０のゲノムスキャフォールドの全てについて可視化できる。

（マーカー）
アスパラガス・オフィシナリスでＭ座位に関連することが知られているゲノム配列の全ての利用可能な遺伝的及び分子的データが、参照ゲノムスキャフォールドＡＧＳ Ｖ１．１０のｂｌａｓｔデータベース内のローカルアラインメントサーチ（ＢＬＡＴ、ＢＬＡＳＴ、Ａｌｔｈｓｃｈｕｌ等、１９９０）でのクエリ配列として用いられた。サーチはデフォルト設定で行われた。これらの分子配列は、Ｍ座位に密接に連鎖している公表済みの遺伝子マーカー（Ａｓｐ１−Ｔ７、Ａｓｐ２−Ｓｐ６、Ａｓｐ４−Ｓｐ６ （Ｊａｍｓａｒｉ等、２００４）、Ｔ３５Ｒ５４−１６００ｓｅｑ（Ｋａｎｎｏ等、２０１３）の名称が付されたもの）及びＬｉｍｇｒｏｕｐにより開発された遺伝子マーカー（Ａｓｐ８０、Ａｓｐ４３２／４４８、Ａｓｐ４４６、１０Ａ３＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒ及び１０Ｂ６＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒの名称が付されたもの）を含んでいた。Ａｓｐ１−Ｔ７（５１０ｎｔ）は、ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５の３０５２０６−３０４７１７位と９８．３７％の相同性を有し、ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４ （ＭＬ４）の５４７０−５９５９位と関連している。Ａｓｐ２−Ｓｐ６（６３４ｎｔ）は、ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５の３０７４０５−３０６８８３位及びＭＬ４の３２７１−３７９３位と９８．８５％の相同性を有し、ｓｃａｆｆｏｌｄ１９９の４６４８７８−４６４３５９位と９６％の相同性を有する。Ａｓｐ４−Ｓｐ６（４４３ｎｔ）は、ｓｃａｆｆｏｌｄ９９７の２２４０２７−２２４４６９位と９６．６２％の相同性を有し、別の３０３のゲノムスキャフォールドと高い（＞８０％）相同性を示す。Ａｓｐ−Ｓｐ６の配列は、ＬＴＲ−ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，ｓｕｂｃｌａｓｓ Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ ｒｅｌａｔｅｄとしてアノテートされた。Ｔ３５Ｒ５４（１５８６ｎｔ）の配列は、アスパラガスのゲノムの高度反復領域の一部であり、２５のゲノムスキャフォールド（例えば、ＭＬ４の２２１７３−２１０３９位）と１００％の相同性を有する。Ａｓｐ８０は、ｓｃａｆｆｏｌｄ１１９４と、Ａｓｐ４３２／４４８は、ｓｃａｆｆｏｌｄ２０６と、Ａｓｐ４４６は、ｓｃａｆｆｏｌｄ１５３９と、アラインする。１０Ａ３＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒ及び１０Ｂ６＿ｆｏｒｗａｒｄ ｍａｒｋｅｒの配列は、ｓｃａｆｆｏｌｄ９９７及びｒｅｌａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ２と１００％の相同性で、アラインする。密接に連鎖する配列の３つがｓｃａｆｆｏｌｄ９０５及びＭＬ４内の小領域とアラインするので、これらのスキャフォールドが以降の研究の優先対象とした。ＥＶＭデータは、ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５（３５１８４７ｂｐ）内の１５の遺伝子モデル及びＭＬ４（９４４０５ｂｐ）内の３つの遺伝子モデルを示す。２つのＥＶＭアノテーション、ｅｖｍ＿１．ＴＵ．Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４．１（種別：ｍＲＮＡ、１８９ ｂｐ）及びＥＶＭ＿１ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４．２（種別：Ｇｅｎｅ、２６４０ ｂｐ）が、マーカー配列Ａｓｐ１−Ｔ７、Ａｓｐ２−Ｓｐ６、及びＴ３５Ｒ５４８の位置に近接している。

両方のＥＶＭアノテーションが、翻訳され、アライメントソフトウエアＢＬＡＳＴＰでのクエリとして用いられた。このとき、データベースは、Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓの非冗長タンパク質配列（ｎｒ）並びにＰＤＢ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＰＩＲ、及びＰＲＦといったデータベースでのタンパク質配列（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｏｒｇ ｕｐｄａｔｅｄ ２０１５．１．５，５４１８３０４２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いた。配列は、低複雑性用フィルターを含むＶｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ［ＯＲＧＮ］に限られた。他の全ての設定はデフォルトであった。ｅｖｍ＿１．ＴＵ．Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４．１の翻訳は、データベースで目立ったヒットがなかった。ＥＶＭ＿１ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４．２は、ヴィテス・ヴィニヘラのｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＩＴＩＳＶ＿０３１３３９（Ｈｉｔ：ＣＡＮ８２１１４、Ｉｄ：１４７８４４２９９）及びヴィテス・ヴィニヘラのｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ＵＰＦ０４８１ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＴ３Ｇ４７２００−ｌｉｋｅ （Ｈｉｔ：ＸＰ＿０１０６５７６６２、Ｉｄ：７３１３７７４８９）の両方と高度に顕著な相同性（３８．５４％）を有する。両方のエントリーが、ＮＣＢＩの保存ドメインアライメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）に用いられ、ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｐｆａｍ０３１４０， Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ （Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＤＵＦ２４７）と高い類似性を有する。Ｐｆａｍデータベースは、タンパク質ファミリーの大規模なコレクションであり、それぞれが、複数の配列アライメント及び隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）により表示される。現在のバージョンはＰｆａｍ２７．０（２０１３年３月、１４８３１ファミリー）。Ｐｆａｍ０３１４０（ＰＦ３１４０）は、４８のメンバーから構成され、ＤＵＦ２４７サブファミリーｃＩ０３９１１に属している。このスーパーファミリーを構成する植物タンパク質の機能は未知である。ＤＵＦ２４７様遺伝子配列（一時的に『ＤＵＦ２４７様』と呼ぶ）が、参照ゲノムスキャフォールドＡＧＳ Ｖ１．１０のデータベースでのクエリとして用いられた。ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５及びｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ＭＬ４に加えて、２つの関連しないスキャフォールド由来の２つのＤＵＦ２４７様配列、ｒｅｇｉｏｎ ＤＵＦ２４７−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ３０９８（１９６５ｂｐ）及びｒｅｇｉｏｎ ＤＵＦ２４７−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ１０５１５（１４２２ｂｐ）が返り値として得られた。標準設定のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａでアライメントを作成した（Ｓｉｅｖｅｒｓ等、２０１１）。ＤＵＦ２４７−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ１０５１５は、ＣＤＳ２の６９から１１８６位と９１％の相同性でアラインし、ＤＵＦ−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８は、第２イントロンの１から１９７０位と９２％の相同性でアラインした。アライメントを図２に示す。ＤＵＦ−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８遺伝子が、ＥＶＭ及びＡＵＧＵＳＴＵＳアノテーション（ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８ ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８：９５４１１．．９７１３４ （＋ ｓｔｒａｎｄ） ｃｌａｓｓ＝ｇｅｎｅ ｌｅｎｇｔｈ＝１７２４）で予測されたが、これは、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓアノテーション（ＴＣＯＮＳ＿００１４９１６３）に裏付けられる。上述のスキャフォールドの配列は図１３でみつけられるだろう。

シロイヌナズナの情報源（ＴＡＩＲ１０）では、クエリタームＡＴ３Ｇ４７２００が用いられ、５つの隔たった遺伝子モデルで、２座位でのマッチ結果、ＡＴ３Ｇ４７２００及びＡＴ３Ｇ４７２１０ が得られた。ＥＶＭ＿１ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４．２の翻訳をクエリとして用いて、ＴＡＩＲ Ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）配列でのＢｌａｓｔＰによりみつかる全てのシロイヌナズナ遺伝子モデルの関係を詳しく調べることとした。最も高いスコアのものは、ＡＴ３Ｇ５０１５０．１（Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＤＵＦ２４７）、ｃｈｒ３：１８５９５８０９−１８５９７５５１ ＲＥＶＥＲＳＥ ＬＥＮＧＴＨ＝５０９（Ｓｃｏｒｅ＝２０１ ｂｉｔｓ（５１１）、Ｅｘｐｅｃｔ＝８ｅ−５２、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１３３／４２５ （３１％）、Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ＝２１６／４２５ （５０％）、Ｇａｐｓ＝３４／４２５ （８％））及びＡＴ３Ｇ５０１６０．１（Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ （ＤＵＦ２４７）、ｃｈｒ３：１８５９８８２６−１８６００９０３ ＲＥＶＥＲＳＥ ＬＥＮＧＴＨ＝５０３（１９７ｂｉｔｓ （５０２）、Ｅｘｐｅｃｔ＝８ｅ−５１、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１３２／４１３（３１％）、Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ＝２０７／４１３（５０％）、Ｇａｐｓ＝２９／４１３（７％）））であった。特に、ＡＴ３Ｇ４７２００．１遺伝子モデルは、より低い相同性を示す（（ＤＵＦ２４７）、ｃｈｒ３：１７３７７６５８−１７３７９０８８ ＲＥＶＥＲＳＥ ＬＥＮＧＴＨ＝４７６（Ｓｃｏｒｅ＝１３０ ｂｉｔｓ（３２６）、Ｅｘｐｅｃｔ＝２ｅ−３０、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１０４／４１７（２４％）、Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ＝１９５／４１７（４６％）、Ｇａｐｓ＝５２／４１７ （１２％）））。顕著な相同性を有するシロイヌナズナ遺伝子は表ＸのＡＧＩ Ｃｏｄｅの欄に列記する。ＤＵＦ−ｌｉｋｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ３０９８のパラロガス配列の翻訳からは、ＡＴ３Ｇ５０１５０．１、Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ （ＤＵＦ２４７）について、あまり高い割合ではない１８１／４５４アミノ酸がアラインするという、最も高いスコアが返り値として得られた。ＡＴ３Ｇ５０１５０及びＡＴＧ３Ｇ５０１６０のＴＡＩＲの記載は、Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ （ＤＵＦ２４７）；ＩＮＶＯＬＶＥＤ ＩＮ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｓｓ ｕｎｋｎｏｗｎ；ＬＯＣＡＴＥＤ ＩＮ： ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ；ＥＸＰＲＥＳＳＥＤ ＩＮ：ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｒｉｓｔｅｍ，ｐｅｔａｌ，ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ，ｒｏｏｔ； ＥＸＰＲＥＳＳＥＤ ＤＵＲＩＮＧ：４ ａｎｔｈｅｓｉｓとなっている。

外部リンクからより多くの情報にアクセスできる。Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＰＤＢ）から、シロイヌナズナについて別の４つの遺伝子モデルと、オリザ・サティバでの１０の遺伝子モデルが返り値として得られた。ＳｕｂＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＵＢＡ３）は、シロイヌナズナの細胞内コンパートメント由来の大規模なプロテオーム及びＧＦＰ局在セットを収蔵している。また、これは、タンパク質の細胞内局在についてのコンパイル前のバイオインフォマティクス予測も含んでいる。タンパク質−タンパク質相互作用の新しいデータセットが最近追加されている。両方のアノテーションからのＡＴ３Ｇ４７２００タンパク質（ヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＫ２２１２２５．１から取得可能）の予測細胞内局在及びＭｓ／Ｍｓ実験は、原形質膜、ペルオキシソーム、及び色素体を指していた。他のデータベースはこのタンパク質に関連する情報を有していない（但し、例外的に、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅｓ（ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ）は、緑藻類を含む緑色植物亜界のクレードを代表する４０のゲノム配列にまたがる９２２のメンバーの３８６９４３００のクラスターを表示する）。ＰＦ０３１４０（ＤＵＦ２４７）及びＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｓｓ ＧＯ：０００８１５０を含むこのファミリーと関連するオントロジー：この用語がアノテーションで用いられる場合、それは、アノテートされたその遺伝子産物の生物学的処理に関して情報が得られないことを指す。これを示すために、証拠コードＮＤ（データなし）が用いられる。オントロジーの少数がＰＦ０００４３（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｃ末端領域のＰｆａｍＡアノテーション）を含む。この領域は、真核生物での解毒機能に加えて、植物でのオーキシン調節タンパク質などを包含するストレス関連因子であるＨＳＰ２６ファミリーなどの、こうした活性を持たないタンパク質でもみつかっている。シロイヌナズナのＰＦ０３１４０のファミリーメンバーの発現プロファイルを詳しく調べるため、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲを探索した（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｏｒｇ、ＮＥＢＩＯＮ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）。ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲは、遺伝子発現分析の高性能サーチエンジンである。数千にのぼる、手動で精選した、良く記述された、公表済みのマイクロアレイ及びＲＮＡｓｅｑ実験を統合し、異なる生物学的文脈（組織又は遺伝子型）にまたがる遺伝子発現を可視化する。Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｄａｔａｂａｓｅでは、１０種が、１０７７３サンプルを含むと記載されており、これらのサンプルは、シロイヌナズナマイクロアレイ実験の６００の研究を表す。これらの研究では、ＧｅｎｅＣｈｉｐＲ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡＴＨ１ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア州）の実験が精選されている。ＡＴＨ１は、旧ＴＩＧＲ研究所（元グレイグ・ベンター研究所、ロックビル、マサチューセッツ州）との共同で設計され、およそ２４０００の遺伝子を表す２２５００を超えるプローブセットを含んでいる。ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲのＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ環境では、表Ｘの遺伝子の遺伝子発現を探索するために、全てのＡＴＨ研究が選択された（対象として、ＤＥＦＥＣＴＩＶＥ ｉｎ ＴＡＰＥＴＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ８についてのＡＴＨ ＴＤＦ１遺伝子モデル、Ａｔ２Ｇ３８５４０を含む）。ＡＴ３Ｇ４７２００は、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ ＡＴＨ１ ｄａｔａにはみつからない。シロイヌナズナの１０の発生段階での全てのＡＴＨ実験を用いた発現レベルのオーバービューでは、ＡＴ３Ｇ４７２５及びＡＴ２Ｇ３８５４０を除き全ての遺伝子について遺伝子発現の相対的に低いレベルが表示され、一方、ＡＴ３Ｇ４７２５及びＡＴ２Ｇ３８５４０では、発現ポテンシャル百分率からみられるようにステージ２−９で高い遺伝子発現が表示される（図７Ａ及び図７Ｂ）。シロイヌナズナの１２７の解剖部位での全てのＡＴＨ実験のオーバービューでは、根でＡＴ３Ｇ４７２５０の発現が検出されず、離層帯でＡＴ３Ｇ４７２５０を除く全ての遺伝子の発現が極めて低い点を除けば 全ての解剖部位でリストアップした複数のＰＦ３１４０遺伝子について中程度の遺伝子発現が表示された。次の実験では、未成熟花及び成熟花での遺伝子発現を記述する４つの利用可能なデータセットを含め、実験での外乱を有するサンプルを除外し、引用文献及び／又は用いたデータベースでの情報を用いて野生型シロイヌナズナサンプルを精選した。選択した解剖部位では、ＡＴ３Ｇ４７２１０、ＡＴ３Ｇ４７２５０、及びＡＴＨ ＴＤＦ１対照を除くリストアップしたＰＦ３１４０遺伝子について、花での極めて低い発現ポテンシャル百分率が表示された（図９Ａ）。早期及び後期の花での遺伝子発現の詳細画面では、実験データの数が未だ顕著に制限されていることを勘定にいれても、５つの遺伝子モデルについて遺伝子発現が表示されない（図９Ａ）。雄蕊及び雌蕊のサンプルの両方での絶対発現レベルを再計算して表示しても結果は同じであった（データは図示せず）。解剖部位の階層的クラスタリング（ピアソン相関指標）及び発現ポテンシャル百分率の両方が、クラスター（ＡＴ３Ｇ５０１３０、ＡＴ３Ｇ５０１４０、ＡＴ３Ｇ５０１９０）、クラスター（ＡＴ３Ｇ５０１５０、ＡＴ３Ｇ５０１６０、ＡＴ３Ｇ５０１２０、ＡＴ３Ｇ５０１８０）、及び無関係クラスター（ＡＴ３Ｇ２５０、ＡＴ２Ｇ３８５４０）について、高い相関値を有する（図９Ｃ）。要するに、選択されたＤＵＦ２４７様遺伝子に関して、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲインターフェースにおいて、１０の発達段階及び１２７の解剖部位で、相関を探して、精選されたシロイヌナズナ遺伝子発現データを慎重にマイニングすることにより、２つのクラスターについての他の器官と比較して、相関性の高い３つのクラスターが花で実質的に遺伝子発現をみせないことが表示された。さらに、ＡＴＨ ＴＤＦ１遺伝子が、全ての発達段階にわたって、全身的に、高いレベルで発現している。顕性雌性抑圧因子遺伝子であるＤＵＦ２４７が、実際に、両全性のシロイヌナズナの花では実質的に不活性化されており、一方、ＡＴＨ ＴＤＦ１などの潜性雄性促進因子遺伝子が、早期及び後期の花の発達で活性化されているはずと推測できる。ＡＴ３Ｇ５０１５０遺伝子での変異及びそのようなものが非変異表現型と比べて明確な表現型の差を与えるかどうかを詳しく調べ、アスパラガス・オフィシナリスの花序発達におけるＤＵＦ２４７の機能を推測することとした。

このため、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ（ＮＡＳＣ、ノッティンガム大学、ラフバラ、イギリス）で、リストアップしたＤＵＦ２４７遺伝子モデルの配列インデックス化変異系列が利用可能かが調査された。全ての遺伝子モデルについて、変異系列の生殖質がＮＡＳＣにより利用可能となり得た。アレル型、即ち、上述のアレルの表現型及び遺伝子型に基づくアレルの分類が知られているかが調査された。リストアップした系列のいずれについてもＴＡＩＲ及び関連データベース（ＮＡＳＣ及びＡｔＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ／ＡｔＧＤＢ／）など）で信頼できるアレル型及び表現型の記載がなされていないという結果が得られた。これはＳＡＬＫ研究所でプリフィックスＳＡＬＫ＿で示される挿入系列について検証され、実際に、利用可能なアレル型がなかった（Ｊ．Ｅｃｋｅｒ、サルク生物学研究所、ラ・ジョラ、カリフォルニア州、米国）。『調査』と示された６つの系列が、一般的な生長、開花時間、花序構造、及び小穂形成について、視覚的に検査された。このため、典型的な実験では、Ｃｏｌ−０遺伝子型（種多様体：９０）を含む前記系列の約５０の種子が、簡単に滅菌され、個体ＭＳ１培地上にまかれ、暗所、４℃に、２４時間置かれ、発芽のために、滅菌条件下で、連続明期、２３℃で、生長室中に、１０−１５日置かれた。実生が土壌に移植され、１０日後に、その生長が観測された。示した遺伝子型について、Ｃｏｌ−０バックグラウンドと区別される明確な表現型は観察できなかった。ＳＡＬＫ＿１０９３４８．５５．５０．Ｘ（ＡＴ３Ｇ５０１５０）、ＳＡＬＫ＿１２２０６０（ＡＴ３Ｇ５０１６０）、及びＳＡＬＫ＿００９８３９（ＡＴ３Ｇ４７２００）一部について、花構造が顕微鏡下で調べられた。ステージ８−１３での花芽の調製物では、Ｃｏｌ−０バックグラウンドと比べて花解剖部位の関連する差は観察されないという結果が得られた（ワニンゲン大学生化学部（ワニンゲン、オランダ）との共同）。ＤＵＦ２４７シロイヌナズナ遺伝子の６つの系列の視覚検査では、Ｃｏｌ−０バックグラウンドと比べて明白な表現型の差が観察できなかったので、アスパラガス・オフィシナリスの花序発達でのＤＵＦ２４７の生物学的機能を推測できないと結論された。示された全てのホモ接合性変異系列のさらなる調査が、ＫｅｙＢｏｘ（ＫｅｙＧｅｎｅ、ワニンゲン、オランダ）でのＤｉｇｉｔａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇを用いて、行われるはずである。

表Ｘ：アスパラガス・オフィシナリスＤＵＦ２４７様遺伝子と顕著な相同性を有するシロイヌナズナ遺伝子遺伝子毎に、遺伝子ＩＤ（ＡＧＩ Ｃｏｄｅ）、予測細胞内局在（ＳＵＢＡ）、及びＮＡＳＣ ＩＤ、並びに、変異系列の情報を示す。詳細は本文参照。

シロイヌナズナで明白な表現型が観察されない限り、シロイヌナズナ遺伝子を含むこれらのＤＵＦドメインが配列番号１のＧＤＳ ＤＵＦ２４７遺伝子と相同であると考えることができる。

ＭＬ４ ＤＵＦ２４７様遺伝子が数種のアスパラガス遺伝子型でさらに調査されることとなった。Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ、２００７）を用いて設計されたプライマー対を用いて、予測ＤＵＦ２４７様遺伝子を含む領域で、ジデオキシシーケンシング（サンガーシークエンシング）が行われた。これらのプライマーは、ＣＮ５９／ＣＮ６０、ＣＮ６７／ＣＮ６８、ＣＮ６９／ＣＮ７０、ＣＮ７１／ＣＮ７２、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６７／ＣＮ８２、ＣＮ６９／ＣＮ８１と呼ばれ、表３に列記される。我々は、４つの非近縁雄性植物ＤＨ００／０８６、９Ｍ、８８Ｍ、Ｋ３２３、１２＿２５、及び両全株Ｈｅｒｍａ５３７５の配列を得ている。この実施例の予測は、ＥＶＭモデルで予測される開始コドンから始まる（表６参照）。ＣＤＳ１のヌクレオチド位５２７で、全ての雄性植物は、チミン塩基を示し、一方、両全株は、この位置で、一塩基対欠失を示す。この欠失は、リーディングフレームでのフレームシフト、アミノ酸の変化をまねくはずであり、スプライス後、時期尚早な停止コドンをまねく可能性がある。両全株（黒背景に対して白文字で示す）及びＣＤＳ２のアミノ酸、予測される時期尚早な停止コドンを示す。両性株５３７５に固有のエクソンでの構造的差異に加えて、２つのＳＮＰが９Ｍのイントロンで、１つのＳＮＰがＣＤＳ２でみつかり、これは同義的置換（アミノ酸の変化をもたらさないサイレント変異）である。１２＿２５Ｍ、Ｋ３２３、及びＨｅｒｍａ５３７５は、他のシーケンス済みの雄株と比べて、予測イントロン内に一塩基対のＩＮＤＥＬを示す。ＣＤＳ３では、配列データが利用可能なサンプル（ＤＨ００／０８６、Ｋ３２３、及びＨｅｒｍａ５３７５）では差異がみつからなかった。さらに、上述の第２ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験の結果が、ＭＬ４ ＤＵＦ２４の調査に含められた。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために選ばれた遺伝子型及びそれに関連するサンプルは、以下のとおりである。
ＤＨ雄株１７７０＝サンプル１
ＤＮ雌株１８００＝サンプル２
両全株５３７５＝サンプル３
家系１ＥのＡＡｆｆ両全株の５つの植物＝バルク１
家系３ＥのＡｓＦｆ雄株の４つの植物＝バルク２
各植物から、３つのフラワーボタンステージ（ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｔｔｏｎ ｓｔａｇｅｓ）を採取した。
Ａ）減数分裂前（両全株及び雄株では１．０−１．２ｍｍ、雌株では０．８−１．０ｍｍ）、
Ｂ）単核小胞子（１．６−１．８ｍｍ）又は発達したばかりの子房（１．２−１．４ｍｍ）、
Ｃ）完全に発達した心皮（萼片が開く直前）
結果として生じたＲＮＡ−ｓｅｑデータが、ＴｏｐＨａｔ２．０．１３（Ｋｉｍ等、２０１４）を用いて参照ＡＧＳ Ｖ１．１０とアラインされた。ＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＥＶＭ１アノテーションが視覚的に検査された。まず、遺伝子発現は、検出可能であるが、平均で、２ＦＰＫＭ未満である（ＦＰＫＭ；Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｏｆ Ｅｘｏｎ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｍａｐｐｅｄ、マップされた百万フラグメント毎のエクソン１キロベース毎の断片数）。雄性バルク２及び雄株１７７０ステージＣ由来のアラインしたリードの少数は、ＣＤＳ１において、４つの非近縁雄性植物ＤＨ００／０８６、９Ｍ、８８Ｍ、Ｋ３２３、１２＿２５由来のＲＮＡ−Ｓｅｑから得られたものと同じ配列を示し、ＣＤＳ１の５２７位のチミジン塩基を含む。両全性バルク１由来の２つのアラインされたリードは、Ｈｅｒｍａ５３７３由来のＲＮＡ−Ｓｅｑから得られたものと同じ、ＣＤＳ１での５２７位の単一チミジン欠失を示した。要するに、花器官由来の雄性及び両全性アスパラガスサンプルを用いて行われた２つの個別のＲＮＡ−Ｓｅｑ実験では、全ての場合について、ＭＬ４ ＤＵＦ２４７のｍＲＮＡ時期尚早な停止コドンをもたらすＭＬ４ ＤＵＦ２４７ ＣＤＳ１の５２７位の一塩基ｉｎｄｅｌが検出された。

ＤＵＦ２４７様遺伝子のＥＶＭアノテーションを確認するために、ＤＨ００／０８６（アスパラガス参照配列の植物）及び別の２つの非近縁植物の花芽由来の全ＲＮＡを単離することにより、発現が調べられた。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉハンドブック（Ｑｉａｇｅｎ）に従いＲＮｅａｓｙＲ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、液体窒素に沈めた１５ｍｇのアスパラガス由来の若い花芽及び完全に開き切った老いた花を用いて単離した。ＲＮＡの分解を避けるために、ＲＮａｓｅフリーの使い捨て０．１％ＤＥＰＣ処理済みペッスル及びガラス製品が用いられた。ｃＤＮＡ合成の前に、生産者のプロトコルに従いＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でＲＮＡは処理された。その後、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、２μｌの全ＲＮＡ、１μｌ（２００Ｕ）のＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、１００ｐｍｏｌのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ、０．５ ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ（各１０ｍＭ）、５ｘＲＴ ｂｕｆｆｅｒ、及び最終容量が４０μｌになるまでのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの水を用いて、ｃＤＮＡが合成された。この混合物は、５０℃で３０分間インキュベートされ、その後、８５℃で５分間インキュベートされた。

生産者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）に従ったＤＮＡｓｅＩ処理の後、アガロース電気泳動及びＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア州）でＲＮＡ量が定量された。その後、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）を用い、２μｌの全ＲＮＡ、１μｌ（２００Ｕ）のＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、及び１００ｐｍｏｌのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒを用いて、ｃＤＮＡが合成された。Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、カリフォルニア州）を用いたＰＣＲで、準備したファーストストランドｃＤＮＡを鋳型として用い、予測エクソン（表３）を標的としたプライマーを用いて、特定のＰＣＲ産物が増幅された。対照サンプルとして、ゲノムＤＮＡが個別のＰＣＲ鋳型として含められた。プライマー対、ＣＲ５５／ＣＲ５７、ＣＰ３５／ＣＲ５７、ＣＰ４５／ＣＲ５７、ＣＰ６１／ＣＰ４０、ＣＰ６１／ＣＲ５６、ＣＰ３３／ＣＰ３８、ＣＰ３３／ＣＰ４０は、全て、単一のＰＣＲ産物をもたらし、これらは、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １００ｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、カリフォルニア州）と比べたときの１．５％アガロースゲルでの移動から推測して、遺伝子予測とよく対応したサイズを有していた。ｃＤＮＡ鋳型と比べて、ゲノム対照鋳型は、常に予想サイズのより長い断片をもたらした。プライマー対、ＣＰ６１／ＣＰ６２、ＣＰ３３／ＣＰ６２ は、ｃＤＮＡ鋳型では増幅産物がなかったが、一方、ゲノムＤＮＡ鋳型は予想サイズの断片をもたらした。ＤＨ００／０８６の数種の発達段階での花芽由来のバッチ全ＲＮＡのファーストストランドｃＤＮＡでのＣＲ５５／ＣＲ５７及びＣＰ３５／ＣＲ５７のＰＣＲ産物について、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（レイデン、オランダ）でのダイレクトシーケンシングにより、フォワード配列リード及びリバース配列リードの両方が得られた。これら４つの配列のアライメントは、ＣＤＳ２／イントロン２の境界についてのＡＵＧＵＳＴＵＳ及びＥＶＭ１アノテーションでの５’−スプライス部位が正しくないことを示した。実際、ＭＬ４のジェネリック配列の２７９５位のシトシンはシロイヌナズナスプライスデータでは全く観察されなかった（Ｓｚｃｚｅｎｉａｋ等、２０１３）。新しいスプライス部位は、１００％保存されているＭＬ４のゲノム配列での２８３４−２８３５位でのグアニン−チミジンジヌクレオチドを有している。結果として、新しい停止コドン（ＴＧＡ）がジェネリック配列の３６１６−３６１８位に導入され、そのため、ＣＤＳ３は僅か２７ｂｐである。ＤＵＦ２４７ ＥＶＭ１及びＤＵＦ２４７＿ＤＨについて、最終的なスプライス配列及び対応する翻訳を、図１０に示す。

ＭＬ４ ＤＵＦ２４７様転写物の３’−未翻訳配列を求めるため、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（３’−ＲＡＣＥ）が設計された。このため、ＤＨ００／０８６の数種の発達段階での花芽由来のバッチ全ＲＮＡが用いられた。その後、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）を用い、２μｌの全ＲＮＡ、１μｌ（２００Ｕ）のＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、及び１００ｐｍｏｌのａｄａｐｔｏｒ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ）を用いて、ｃＤＮＡが合成された。ファーストストランドｃＤＮＡが、フォワードプライマーＣＰ３９及びＣＰ３５を用いたリニアＰＣＲのために用いられた。これらのリニアＰＣＲの産物は、希釈後、ＣＰ４１（ＣＰ３９の下流、ＣＰ３９（ＣＰ３５の下流））及びａｄａｐｔｏｒ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒの尾部に相補的なユニバースプライマーを用いたネストＰＣＲの鋳型として用いられた。電気泳動後、２つのＰＣＲ産物がアガロースから切り出され、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ（レイデン、オランダ）でのシーケンシングに送られた。

表３：実施例１で用いたプライマー

これらの結果から、ＤＵＦ２４７様遺伝子が花芽で発現しており、両全株の発現遺伝子配列が（少なくとも）雄性植物の遺伝子配列と一ヌクレオチド欠失分異なることが示された。既に述べたが、前記遺伝子は公表されている伴性マーカーに密接に近接していることがわかった。変異自身と両性花形質との間の連鎖を示すために、我々は家系交配３Ｅの数種の植物を分析した。我々は、Ｗｉｔｔｗｅｒ等（２００３）に記載の方法に実質的に従った高解像度融解曲線分析にプライマー対ＣＲ３９／ＣＲ４０（表３）を用いた。結果を表１ｅに示す。この結果は、マーカーと両全性形質との完全な共分離を示す。１２の両全株の全てがチミン欠失検査用マーカーアレルを有し、一方、１２の雄性植物の全てが野生型遺伝子アレルを有する。このことから、上では予期されぬ１６６／１６６のＡＯ０２２マイクロサテライトマーカー遺伝子型を有すると記載した単一両全性形質が、実際は、１６６アレル及び雌蕊群発達抑制因子遺伝子との間の組換え事象から生じたことが、及び、この植物が一塩基対欠失を示すＣＲ３９／ＣＲ４０マーカー遺伝子型を示し、『Ａａｆｆ』遺伝子型を有していたに違いないことが、確認された。この結果は、ｄＣＡＰｓマーカーを用い、プライマー組ＣＲ３７／ＣＲ３８及び制限酵素Ｈｐｙ１８８ＩＩＩを用いて、確認された。これらのマーカーは、そこで、これらの特異的欠失変異の検出に適しており、それ自体が本出願に記載の診断及び育種法に使用できる。上でもたらされた証拠に基づいて、ＤＵＦ２４７様遺伝子が雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子であることが結論付けられた。

一般的に、本出願で言及したマーカーの多くが、ＧＤＳ遺伝子内又はＧＤＳ遺伝子近傍の変異の存在を示すのに適している可能性があり、及び／又は、これらはＧＤＳ遺伝子のアレルの存在を示すのに適している。好ましくは、こうしたマーカーは、ＧＤＳ遺伝子、その変異、又はアレル、又は５’ＵＴＲ、又は３’ＵＴＲ、又はそのシス調節エレメントを標的とする。しかし、他のマーカーが、ＧＤＳ遺伝子に遺伝的に連鎖しており、ＧＤＳ遺伝子の減少された機能的発現をまねくはずのＧＤＳ遺伝子内又は近傍の変異を有することが示された植物での多型を開示し得る場合、これら他のマーカーも、ＧＤＳ遺伝子内又はＧＤＳ遺伝子近傍の変異の存在を適切に示すために用いることができ、及び／又は、ＧＤＳ遺伝子のアレルの存在を示すのに適している。それ故、こうしたマーカーの全てが有利にはマーカー支援育種で用いられ得る。変異の欠失のために用いることができるプライマー対は、ＣＮ６７／ＣＮ６８、ＣＮ６９／ＣＮ７０、ＣＮ７１／ＣＮ７２、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６７／ＣＮ８２、ＣＮ６９／ＣＮ８１、ＣＰ３１／ＣＰ３２、ＣＰ３３／ＣＰ３４、ＣＰ３５／ＣＰ３６、ＣＰ３７／ＣＰ３８、ＣＰ３９／Ｃ４０、ＣＰ４１／ＣＮ７２、ＣＲ６１／ＣＲ５７、ＣＰ３５／ＣＲ５７からなる群より選択できるが、これらのプライマー及び／又は表３で言及した他のプライマーの他の組合せも可能だろう。

さらに、ＧＤＳ遺伝子座位の近傍に位置し、マーカー支援育種で用いることができるマーカーは、ＡＯ０２２及びＡｓｐ１−Ｔ７などの既に上述したものに加えて、表５に列記されている。

表５：ＧＤＳ遺伝子についてマーカー支援育種に有利に用いることができるマーカー

その既知の雄性祖先株のいずれよりも漿果をつける能力が高く、公表された遺伝子マーカーにより標的とされたヘミ接合性領域上に位置する、雌蕊群発達抑圧因子遺伝子と今や呼ぶ遺伝子での、一ヌクレオチド欠失を有する、例外的な両全性植物が組織培養により得られたことが示された。さらに、この一ヌクレオチド欠失を有するＧＤＳ遺伝子が、前記植物と共分離し、これにより、両全性表現型が維持されることが示された。適用された組織培養法はＱｉａｏ及びＦａｌａｖｉｇｎａ（１９９０）により発表された方法に実質的に従う。要約すると、葯が２，４Ｄを含有する胚誘導培地に移植され、胚様構造（直径１ｍｍの玉）が得られ、これが、新芽が生えるカルスを生成するよう設計された次の培地に移され、これらの新芽が腋芽分裂組織からの新たな新芽の形成が可能となるようにばらばらにされ、最後に、最終的に温室に移植できる根付いたｍｉｎｉ−ｃｒｏｗを得るために新芽が根誘導培地に置かれる。前世紀の１９８０年台から、植物の組織培養が体細胞多様性の危険性をもたらすことが認識されていた（Ｅｖａｎｓ等、１９８４）。体細胞多様性は、点変異（Ｊｉａｎｇ等、２０１１）を含み得る。体細胞多様性は、新規表現型の回復の可能性と認識されている（Ｅｖａｎｓ＆Ｂｒａｖｏ、１９８６）。体細胞多様性は、花の形態学における差を示す植物を含むアスパラガスの表現型多様性をもたらすと記載されている。Ｐｏｎｔａｒｏｌｉ及びＣａｍａｄｒｏ（２００５）は、対応するドナークローン及びその再生体の、植物の高さ、葉状茎の高さ及び形態、群葉の色を比較した。これらの著者は、再生体の１つが青緑（淡い青緑）であり、ドナー及び他の再生体が緑である再生体を得た。本実施例ではより重要だが、Ｐｏｎｔａｒｏｌｉ及びＣａｍａｄｒｏ（２００５）は、通常より雄蕊の数が多く、雄蕊の幾つかが花被片にくっついており、幾つかの花被片も末端の葉状茎と融合している異常花を有する再生体を得た。

５３７５で観察された特定の変異は、培養を始めるために組織を採取した植物は両全性表現型を示さなかったことから、Ｑｉａｏ及びＦａｌａｖｉｇｎａ（１９９０）の方法の後の葯培養で潜在的に生じ得る体細胞多様性から生じた可能性がある。

実施例６及び実施例２で指摘するように、ＧＤＳ遺伝子は、雌株には存在しない雄株でヘミ接合性の染色体領域に位置している。この結果は、ＧＤＳ遺伝子の単一機能欠損アレルが、ヘテロ接合雄株でインビボに生じた場合、ＧＤＳ遺伝子の別の野生型アレルによりマスクされるはずはなく、見過ごされる可能性も低い。

表６：予測エクソンＤＵＦ２４７ＦＧ（ＦＧｅｎｅｓｈ予測）及びＤＵＦ２４７ＥＶＭ（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｍｏｄｅｌｅｒ予測）のコード配列（ＣＤＳ）及び検出されたｃＤＮＡ配列（ＤＵＦ２４７ＤＨ）以下は、ＣＤＳ構造の想像上の翻訳である。

（実施例２）
（両全性変異体Ｋ３２３−Ｇ３３の遺伝分析）
全雄ハイブリッドＫ３２３は、栽培品種Ｇｌａｄｉｏの葯培養から得られた雌性倍加半数体ＬＩＭ４２５と、栽培品種Ｇｉｊｎｌｉｍの葯培養から得られた雄性倍加半数体ＬＩＭ４２８との間の交配である。

ＬＩＭ４２８は、他の基準に加え、漿果をつける能力を有しないため、父系植物として選抜された。雄性ハイブリッドＫ３２３は、雌蕊群に退化した花柱を有し、その祖父株Ｇｉｊｎｌｉｍがときに雄性両全性同株植物を含むにもかかわらず、雄性ハイブリッドＫ３２３は、１９９８−２００７の期間に評価された様々なハイブリッドトレイルの１５１５９を超える植物で１つの漿果もつけなかった。放射線変異誘発を介した変化ＧＤＳの結果として両全性形質を獲得したＫ３２３の変異版を作ることとした。ＧＤＳでの変異が伴性両全性形質を有する植物をもたらす別の実施例を提供するという決定は、このハイブリッドが変異誘発の優れた初期材料をもたらすからである。第１の理由は、このハイブリッドが、短日冷温（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９７０）や植物齢（３年目に雄性両全性同株性のピークとなる傾向がある）（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９７０）などの雄性両全性同株性が好まれるだろう条件下でさえも、漿果をつける傾向を全くみせないことである。こうした条件は、どの場合でもＫ３２３の長い評価期間中に起きたはずである。第２の理由は、このハイブリッドの全ての植物が、倍加半数体両親の間の交配から生じているため、遺伝的に同一であることである。従って、ハイブリッドＫ３２３に属する植物での表現型の変化はいずれも変異によるもののはずである。

変異を作成するために、隔離した温室内で、蜂の受粉により得られた３４０００の種子が、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈｅａｌｔｈ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｄｅ Ｂ．Ｖ． Ｍｏｒｓｅｓｔｒａａｔ ３． Ｅｄｅ、オランダ）で彼らの『試験装置』を用いて４５０グレイの線量でコバルト６０γ線照射に晒された。この装置では、コバルト６０線源は、サンプルを載せることができる円筒状の容器に同心円状に配置された鉛筆型のロッドから構成されている。種子は、この容器内に積まれたペトリ皿に載せられ、４５０グレイの指示線量に晒された。与える線量は、当該線量により生じる比色変化を測定するためのＰｅｒｓｐｅｘの使用を伴う典型的な線量測定システムにより測定された。

Ｋ３２３の照射済みの種子は、オランダのホーストの屋外に２０１２年の３月に蒔かれ、最初の花は、翌年の２０１３年４月から７月までに観察・検査された。種子のおよそ半分が最終的に成熟した植物をもたらし、これは、約１７０００の花をつけた植物が評価されたことを意味する。各花から発達したようにみえる、枝になる漿果を示す植物が１つみつかった。さらに、この植物は、両性花をつける第２の茎を有していた。従前の観察と一致して、他の全てのＫ３２３植物は全く漿果をつけなかった。この一つの両性株Ｋ３２３植物（『Ｋ３２３−Ｇ０３３』又は縮めて『Ｇ０３３』と呼ぶ）が、無昆虫温室に移され、さらに、芝を敷き詰めたポットで育てられた。このポット内で、当該植物は、新しい茎をつけ、その全てが両性花及びその後の完全な着果を示した。着果の実施例は図１２Ａに示される。同様の温室条件下での、野生型（ＷＴ）Ｋ３２３植物の花と比べたときのＫ３２３−Ｇ０３３の典型的な花が、図１２Ｂに示される。Ｇ０３３の花は、ＷＴ型Ｋ３２３花と比べて、より長い花柱、より発達した（より長くより曲がった）柱頭裂片を有する。季節の後半は、他のハイブリッドでは雄性両全性同株性が好まれる（Ｆｒａｎｋｅｎ、１９７０）短日であったが、最も両性花に見えるＷＴ型Ｋ３２３植物の花が集められ、その最も発達した花柱及び柱頭が変異体で観察されたレベルまでとどき得るかを見つけ出すため、Ｇ０３３と再び比較された（図１２Ｃ）。変異Ｇ０３３の平均花柱長は、２ミリメートルであり、一方、ＷＴ型Ｋ３２３は、最大でも、１ミリメートルの花柱をつけた。明白に、ハイブリッドのＷＴ版と比べてより両性の花を示し、ＷＴハイブリッド及びその父株の植物では決してなかった完全な漿果の着果を示す完全な変異体が作られた。

分析された変異体は、その予測信頼性を確認するための独占マイクロサテライトマーカーにより検証された。これにより、両全性形質を得る元となったこのハイブリッドについて高度に特異的且つ特徴的な固有のマイクロサテライトプロファイルが示された。野生型Ｋ３２３及びそこから派生した両全性植物Ｋ３２３−Ｇ０３３の両方を、これらの配列を比較しどの遺伝子変異が両全性形質をまねくかを見つけ出すために、シーケンスすることとなった。配列は、Ｊａｍｅｓ Ｈ Ｌｅｅｂｅｎｓ−Ｍａｃｋ博士の研究室が北京ゲノム研究所（ＢＧＩ）との共同で倍加半数体超雄株ＤＨ００／０８６（ｖｅｒｓｉｏｎ １．０）のドラフトゲノム配列で研究して構成したゲノム参照配列とアラインされた。この研究では、配列リードは、ＢＧＩから得られた１００−９０ｂｐのペアドエンド及びメイトペアのＩｌｌｕｍｉｎａ配列のアセンブリ（配列は合計１６３ギガベース、およそのカバレッジは１２３Ｘ）にマップされた。北京ゲノム研究所でＳＯＡＰアセンブラーを用いてバイオインフォマティクスにより構築された結果として生じたアセンブリは、コンティグＮ５０が２１１７９ｂｐ、スキャフォールドＮ５０が３０１０４０ｂｐであった。換言すれば、ゲノムの半分が少なくとも３０１０４０ｂｐの長さの１１９６のシーケンススキャフォールドでアセンブリされる。

北京ゲノム研究所（ＢＧＩ）は、さらに、ＤＨ００／０９４雌性倍加半数体について１００ｎｔのペアドエンドイルミナショートリードのおよそ４０Ｘゲノムカバレッジを生成した。ＤＨ００／０９４雌性倍加半数体は、ゲノムアセンブリ及びアノテーションのために用いられたＤＨ００／０８６雄性倍加半数体個体の同胞である。

Ｇ０３３及びＷＴ型Ｋ３２３の両方から得られたショートリードが、ｂｗａ−ｍｅｍ（Ｌｉ及びＤｕｒｂａｎ、２００９）をデフォルトの設定で用いて参照ゲノム配列とアラインされた。Ｂｏｗｔｉｅ２によりコンカレントアライメントを作成した（エンドツーエンドリードアライメントを要し、ソフトクリッピングやスプリットリードアライメントは許されない）。

Ｇ０３３及び野生が対Ｋ３２３植物から得られた葉組織が、Ｌｅｅｂｅｎｓ−Ｍａｃｋの研究室で同様にシーケンスされ、各ライブラリについておよそ７Ｘのホールゲノムショットガンカバレッジ（Ｉｌｌｕｍｉｎａペアドエンド１００ｎｔリード）が生成された。両方のライブラリーからのリードがｂｗａ−ｍｅｍを用いてゲノムとアラインされた。ＧＬＥＡＮ（例えば、全遺伝子、ｍＲＮＡ、各エクソン、ＣＤＳ、ＵＴＲ）で作られた最初のＢＧＩアノテーションからの非トランスポゾンゲノム特徴毎のリードカバレッジが、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｃｏｖｅｒａｇｅＢｅｄを用いて、両方のライブラリーについて計数された。γ線照射がＧ０３３での欠失を誘導したという仮説の下、データをソートした結果、Ｇ０３３植物で０リードサポート及びＫ３２３植物での５つのリードを有する遺伝子特徴が同定され、さらにソートした結果、２つの個体の間で最大のリードカバレッジの差を有する遺伝子特徴が同定された。

この方法を用いることにより、潜在的に２キロ塩基対を超え、Ｇ０３３のゲノム配列に固有のバリアント配列が同定された。伴性ＢＡＣアセンブリ（Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４）上の２２０１：２９２６位に位置するＣＤＳエクソンは、１８のアラインＫ３２３リード及び０個のアラインＧ０３３リードを有していた。リードカバレッジはＪｂｒｏｗｓｅゲノムブラウザ内で可視化された。５つのリードで単一の位置でｂｗａ−ｍｅｍソフトクリップリードにより示されたこの多様体の境界について強いサポートがあり、これは、図４でリードの右側で矢印により示される。多様体の正確なサイズは、他の境界を同定するためのリードサポートがないため、未知である（以下のさらなる説明を参照）。周辺ゲノム配列の２００ｋｂ超が、ＤＨ００／０８６リードカバレッジの存在及びＤＨ００／０９４リードカバレッジの欠如から、ヘミ接合性（Ｙ特異的）であると考えられた。

Ｊｂｒｏｗｓｅの画像（図４）から、ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ ４で表されるゲノム領域（及び同様にｇｅｎｏｍｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ９０５）において、変異両全株Ｇ０３３で、ＤＵＦ２４７含有遺伝子の、予測イントロン、予測第２エクソンの大部分と、さらに、潜在的な第３エクソンを含むかもしれない転写配列（ＥＶＭにより予測される）の大部分と重複する領域において、リードの欠失をもたらした事象が起きたと推測できる。２つの隔たった遺伝子予測を図４に画像として示す。これらの遺伝子予測の配列は図４及び１３でみつけられるだろう。

リードがＧ０３３について欠如しているアライメントから左の境界で、いわゆる『クリップリード』がみつかった（図４で矢印で示す）。これらのリードがライブラリー配列データから取り出され、これらの全遺伝子配列からそれらを『スプリットリード』とした。これらのスプリットリードでは、ある区域（ＧＯ０３３でリードがある又は欠けている部分に対して左側）は、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４（図１３に示す配列）との相同性を示し、右側の別の区域は、リードの間では同一であるものの、一貫して、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４とは異なっている。これらのスプリットリードに基づいて、コンセンサス配列を作成することができたが、これは、Ｍ−ｌｏｃｕｓ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ４の位置で元の配列を置き換える挿入が生じたことを開示又は示唆していた。

イントロンのエクソン１側に近いイントロンでの挿入のスプリットリードコンセンサスは、
ＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡＧＣＧＧＡＴＣ
である（但し、下線部は挿入特異的部分を示す）。

この下線部をＧ０３３ライブラリーの配列データをマイニングするためのクエリとして用い、挿入部側にさらに広がるコンセンサス配列を提供するメイトペア配列が同定された。このコンセンサス配列は、
ＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣ
（但し、Ｎは未知塩基を示す）であった。

問題の挿入の配列にアニールし、第１エクソンの方を向いた２つのリバースプライマー（ＣＮ８３及びＣＮ８４と示す）（表３のプライマーを参照）が設計された。Ｇ０３３についてこれまで集めた短い配列の全てが実際にインサートの境界を正確に表していることを確認するために、これらのプライマーとエクソン１特異的プライマーＣＮ７８とを組み合わせてＰＣＲで検査した。用いた鋳型配列は、Ｋ３２３−ＷＴ、両全株Ｇ０３３、及びＤＨ００／０８６であった（但し、最後のものは参照ゲノムに対応するサンプルを表す）。Ｋ３２３−ＷＴ植物及び参照ゲノムサンプルでは欠如しており、遺伝子マーカーとして用いることができる（図１１参照）、固有の断片が変異Ｇ０３３で得られた。この断片のシーケンシングにより得られたサンガー配列を以下に示す。
ＣＣＴＴＣＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＡＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴ

この配列の予測イントロン中でのアライメントを図５に示す。サンガーシーケンシングから、当該断片が、『キメラ』であり、そして、予測イントロンで生じることが知られている配列と、その後に続く、挿入様事象（おそらく殆どの場合、『置換挿入』と呼ばれる）から生じたはずである固有の『下流』部分とを含むことが証明された。正確な事象がなんで合ったかはさておき、Ｇ０３３変異植物は、明白に、ＧＤＳ遺伝子（実施例１に記載）の、予測イントロン、予測エクソン２及びエクソン３でのリードを欠如しており、破壊されたＧＤＳ遺伝子を有する。Ｊ−ｂｒｏｗｓｅでのリードマッピングの研究から、Ｇ０３３のリードがＧＤＳ遺伝子のさらに下流の配列も欠如していることが教示される。この下流領域は、一連の反復ＤＮＡを含んでおり、コピー数が少ない又は一つの領域により隔てられている。このことは、雌性参照ＤＨ００／０９４（実施例１に記載）のリードマッピングで幾つかのリードが特定のサブ領域にマップされること（コピー数が多いＤＮＡを含むこと）が示されたことから推測できる。この下流領域は、上記の真に固有で雄性特異的なＤＮＡのサブ領域にマップできる雌性リードが存在しないことから、リードカバレッジでのギャップにより破壊されている。予測通り、リードのこの『パッチ状分布』は、同じ参照にマップされたＤＨ００／０８６のリードでは観察されない。ゲノムブラウザーＪ−ｂｒｏｗｓｅでのリードマッピングの研究から明らかなように、Ｇ０３３から得られたリードはパッチ状リード分布を示し、雌性ＤＨ００／０９４の分布とはＭｌｏｃｕｓ−Ｓｃａｆｆｏｌｄ ４の１７５００位までは比較可能であるものの、Ｋ３２３−ＷＴのリードマッピングは、典型的な連続リードマッピングを示し、ＤＨ００／０８６参照雄株のものと比較可能であることが示された。

要するに、リードマッピングの展望を概観すると、Ｇ０３３での『挿入置換事象』により生じた消失部の末端は、ＧＤＳ遺伝子のイントロンから、スキャフォールド開始点から大雑把に１．８ｋｂ前の位置までに位置していることが示唆される。後者の位置のさらに下流では、Ｇ０３３及びＫ３２３−ＷＴ対照植物の両方で比較可能な深度のリードマッピングが観察される。破壊されたＧＤＳ遺伝子から『挿入置換事象』の仮説上の待ったまでにまたがる猟奇では、３つのコード配列がＦＧＥＮＥＳＨによる同定でみつられる。３つのコード配列の全てが、非冗長タンパク質に対してＢＬＡＳＴｘ（Ａｌｔｓｈｕｌ等、１９９０）を用いたとき、Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ， ＣＣＨＣ−ｔｙｐｅ（ＡＢＤ３２５８２．１）、Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ［Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ］ ＡＢＤ６３１４２．１、及びＲｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ［Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ］ ＡＢＤ６３１３５．１．などのヒットを示す。これらのアノテーションは植物遺伝子ではなくトランスポゾンに関連していたので、実施例１で記載の変異と同様に、ＧＤＳ遺伝子の変異により両全性植物が作出されたと結論付けられた。

Ｇ０３３の両全性形質の分離をさらに調査するために、数種の交配が行われた。挿入置換事象を示すＣＮ７８／ＣＮ８３マーカーの共分離についての後の研究のために、オフスプリングから、性が記録され、ＤＮＡが単離された。表現型検査は、花の視覚的検査（花を両性花、雌花、雄花に分類する）及び無昆虫条件下での完全漿果着果の検査の両方により行った。得られた結果は表４に提示する。

表４：変異Ｇ０３３を親植物として用いて作出された３つの家系（Ｇ０３３の自家受精、雄性ＤＨと交配させたＧ０３３、Ｇ０３３と交配させた雌株）について、当該家系のマーカーの結果も用いて得られた表現型分離の結果『マーカー存在』は、図１１に示したような研究した特定の植物について鋳型ＤＮＡを用いて、欠失／挿入事象検査用のプライマー対ＣＮ７８／ＣＮ８３又はＣＮ７８／ＣＮ８４で生じるＰＣＲ断片が、増幅されたこと、即ち、存在することを意味する。

Ｇ０３３の自家受精から得られた家系（予測遺伝子型Ａａｆｆを有すると考えられる）は、予期された３：１の比率とは顕著に異なる（ｐ＜０．０２）、４６の両全株及び８つの雌株ともたらした。この逸脱の説明仮説として、雌性植物は通常雄性植物よりも遅く開花し（Ｌｏｐｅｚ＿Ａｎｉｄｏ＆Ｃｏｉｎｔｒｙ、２００８、ｐ９９）、また、両性株よりも遅く開花する可能性もあることから、雌株であるかもしれない数多くの植物が成長期の間に表現型検査を受けなかったことが挙げられる。開花しなかった植物の１５のうち１つを除いた全てが、ＧＤＳ遺伝子変異の検査マーカーを欠如しており、これは、ＧＤＳ遺伝子と両全性形質との連鎖及び雌性植物で見込まれる遅延開花と一致している。さらに、全ての両全株がＣＮ７８／ＣＮ８３マーカーを有し、一方、８つの雌株ではこれは欠如していた。

第２交配では、両全株Ｇ０３３は、除雄され、母植物として、雄性倍加半数体と交配された。これは、遺伝子型Ａａｆｆ×ＡＡＦＦの交配型と表現できる。ＧＤＳ遺伝子での変異の検査用マーカーが１：１の比率（１０：１４）で分離する２４の雄性植物の家系が得られた。これは、実施例１で提示した結果と一致しており、雄性植物由来の雌蕊群発達の抑制因子の顕性アレルが、既に観察された両全株の雌蕊群発達を遮ることをやはり示す。そのため、両全性形質は潜性形質であると結論できる。

第３交配では、雌株が両性株により受粉され、５３の両全株と３３の雌株を含む９３の植物の家系ができた。この比率は、３：１の比率から顕著に逸脱しており、上述のように、まだ開花していない７つの植物が雌性植物であると仮定すると、この逸脱はよりいっそう大きくなる。しかし、ＧＤＳ遺伝子での『挿入欠失事象』検査用マーカーは両全性形質と完全に共分離し、雌蕊群発達を抑圧する顕性遺伝子を持たない家系での葯発達を可能とする顕性遺伝子という遺伝モデルが確認された。

上記の交配の全てにおいて、両全株の花が、その全てから漿果が発達する両性花であったことに留意されたい。

要するに、雄性特異的領域でのＧＤＳ遺伝子の破壊が放射線変異誘発を用いてなされたことが示された。この変異遺伝子は、次の世代に転移可能であり、両全性形質のメンデル性遺伝をもたらす。

（実施例３）
（雌性抑圧遺伝子を含むＤＵＦ２４７ドメインのエピアレル）
繁殖系統Ｋ１０３６を、受粉のためのハチが配置された、隔離された温室内で種子繁殖させると、通常、植物の半分は漿果を産生しない雄株であると予想されるが、全ての植物が漿果を産生したことが認められた。数年後、両全性形質の遺伝を解明するため、Ｋ１０３６を再び播種した。１６の植物の開花及び着果を評価した。植物は、いずれもよく発達した葯を有しているため、無昆虫条件下で着果することができた。これらの植物及び／又はその枝の間では、着果が幾分異なることが認められた。着果のいくつかの失敗はあったものの、植物の漿果の数は９５％の高さに達することができ、これは異例の高さである。繁殖記録では、繁殖系統Ｋ１０３６が繁殖した世代数の情報が不十分であるため、５つのＫ１０３６植物につき、繁殖ストックの信頼性及び近親交配のレベルの双方をモニターするために常用されている３０の独占マイクロサテライトマーカーのセットを用いて遺伝子型同定を行った。５つの両全株は、３０の（高頻度可変性の）座位において完全にホモ接合型で現れ、事実上同一であった（結果は示さない）。４つの植物は完全に同一であり、１つの植物は、３０個の座位のうち２つのみが他の３つの植物と異なり、対立アレルのホモ接合となっていた。Ｋ１０３６について観察されたレベルのホモ接合性は、通常、葯培養によって得られた倍加半数体についてのみ見出される。結論として、両全性Ｋ１０３６は、完全同型接合（同系）近交系の材料を表す。いくつかの植物の着果が９５％という高さである事実にもかかわらず、すべての植物が完全に結実したわけではなく、いくつかの植物は、数十の花が漿果を欠いた。これらの植物は事実上同系であることが判明したため、着果の違いは、当初、テーブル上の他の植物を覆っている植物、植え替え後の生育が不十分な植物、灌水の不足、温暖な気候条件下での受粉などの不均一な生育条件に起因すると考えられた。着果が不完全となる現象をさらに分析するため、いくつかのＫ１０３６両全株を、２つ（８８系統及び１０５系統）の雌性検定株と交配した。これらの検定交配によって得られたＦ１植物はすべて葯を生成し、すべての植物は無昆虫条件下で漿果を産生することができた。着果は等級１−５へと評価しており、これらはそれぞれ、０〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜１００％の着果に概ね対応する。ほとんどのＦ１は、あたかもすべてのＦ１ハイブリッドが本質的に完全に浸透性の形質を継承したかのように高度に両全性（等級５）であることが観察された。しかしながら、Ｆ１家系内の植物の中には着果の劣ったいくつかの植物が再びみられ、また、１つの植物のＦ１子孫（８６７Ｆ１ｂ。父株はＩＤ２１５２９２）は、はるかに低い着果で際立っており、あたかもこの特定のＦ１子孫については異なる遺伝要因が存在しているかと思われるようであった。Ｆ１ハイブリッドの着果を表３１に示す。別の実験では、自己受精した個々のＫ１０３６両全株から得た家系の着果を記録した。これらの結果を表３２に示す。これらの結果は、着果に関してファミリーが分離しているとみられること、及び、平均着果が家系によって異なることを再び示している。しかし、特定のＫ１０３６父株のＩＤの着果を自己受精の結果としてみて、この着果を、これら特定のＫ１０３６父株のＩＤによって生み出された雌性の検定交配種の家系の着果と比較すると、両者間には明らかな相関がないとみられる（同じ２１５２９ＩＤにつき、表３１及び表３２参照）。

表３１：雌性検定株（８８番または１０５番のいずれか）を受粉するＫ１０３６父株から得られたＦ１検定交配種の着果。着果は等級１−５へと評価しており、これらはそれぞれ、０〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜１００％の着果（漿果）に概ね対応する。

表３２：株ＩＤにより示される特定のＫ１０３６の自家受粉から得られたＦ１検定交配種の着果。着果は等級１−５へと評価しており、これらはそれぞれ、０〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜１００％の着果（漿果）に概ね対応する。

したがって、観察された変異が遺伝性のものであるか、または環境に大きく制御されているのかは、疑問の余地があった。遺伝的性質をさらに解析するため、除雄した両全性Ｋ１０３６植物（ＩＤ２１５４９７）を超雄株（８８番の倍加半数体、ＤＨ０２／５０４と命名）と交配させた。この交配により、３つのＦ１ハイブリッド（８６１Ｆ１−１２４Ｍ、８６１Ｆ１−１２６Ｍ及び８６１Ｆ１−１２８Ｍと命名）が得られ、これらの植物はすべて完全に雄性、すなわち、すべて稔性の葯を有し、果実の産生をしなかった。このことは、Ｋ１０３６に由来する両全性形質が、超雄株ＤＨ０２／５０４の雄性形質に対して潜性であることを示す。Ｋ１０３６と雌株の検定交配により両全株が得られた一方、超雄株との交配では雄株のみが得られたという事実は、Ｋ１０３６が、実施例１及び実施例２の両全株については見出されたような雌性抑圧因子を欠いている可能性があることを示唆する。これをさらに調べるために、両性株×超雄性Ｆ１ハイブリッドを８８番の雌株へと戻し交配した。雌性の個体８８−１００５９９と個体８６１Ｆ１−１２４Ｍとの間の交配である家系８６１ＢＣ１ｄにつき、着果及び花の形態について表現型を決定し、性関連マーカーを用いて遺伝子型を決定した。遺伝的には、これは、近交系８８番雌株×（両全株Ｋ１０３６ｘ近交系８８番超雄株）種の疑似検定交配である。合計９１の植物が性別を区別でき、うち５３が雄株で３８が両全株であって、１：１の比からの有意な乖離はなかった（ｐ＞０．１１）。マーカーＡＯ０２２は、試験した９１個の試料において３回の組換え事象を示し、マーカーＡｓｐ＿８０（プライマーは実施例１の表３参照）は、試験した８５個体のうち２つの組換え事象しか示さなかった。このことは、潜性の両全性形質が、実施例１及び実施例２の両全株について見出されたように、Ｍ座位に関連していることを示す。着果に若干の変動がみられたＫ１０３６由来の他の家系とは対照的に、この特定の家系８６１ＢＣ１ｄの両全株の間には著しい変動がなく、すべての両全株がほぼ完全な着果を示し、最大の着果スコア「５」を示した。家系８６１ＢＣ１ｄのすべての両全株は、Ｆｒａｎｋｅｎ、１９６９ ｐ３７の分類を用いて４または５のスコアを得られる、十分に発達した花柱を示した。家系８６１ＢＣ１ｄのすべての雄株においてはこの花柱は欠けており、これらの雄株はいずれも漿果を産生しなかったので、少しも雄性両全同株性さえ有していなかった。８６１ＢＣ１ｄに分離され、この集団における分離表現型を代表する２個の花の表現型の例を図１４に示す。結論として、Ｋ１０３６に由来し、家系８６ＩＦＩｄに分離された両全株は、明確な単一遺伝性潜性形質であり、Ｍ座位に連鎖している。

実施例１及び実施例２の両全株は、Ｍ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子において、それぞれ、単一ヌクレオチド欠失及び大きな挿入欠失を示したので、Ｋ１０３６両全株Ｍ座位ＧＤＳアレルについても変異が予想された。テンプレートＤＮＡとしてＫ１０３６を使用し、プライマー対ＣＮ６７／６８、ＣＮ６７／ＣＮ８２、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６９／ＣＮ８１、ＣＮ５９／ＣＮ６０（表３、実施例１参照）を使用する両方向へのＰＣＲ断片の配列決定を行ったが、特有の配列の変異は見出されなかった。Ｋ１０３６は、第２予測エキソンの５８番目のアミノ酸におけるセリンアミノ酸（ＡＧＣ〜ＡＧＴ）の第３コドン位置のＳＮＰを特徴とするＧＤＳ遺伝子ハプロタイプを示し、これは、（両全性ではなく）雄性の繁殖系統９Ｍ（９Ｍの配列については図１３を参照）にも見出され得る同義の置換であり（したがって、セリンアミノ酸を保持するサイレント変異であり）、この特定のＳＮＰが性別決定に影響を及ぼさないことを示す。この特定のＳＮＰは、後に遺伝子マーカー標的として利用された（下記参照）。両全性Ｋ１０３６及び雄性９Ｍの、Ｍ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子の配列は完全に同一であることが判明した。Ｋ１０３６を９Ｍ半数体から区別することができる突然変異のためにＭ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子の上流の配列情報を得る試みは失敗しているが（結果は示していない）、この配列の性質に依存している可能性がある。さらに上流のスキャフォールド９０５に位置する遺伝子を含むＤＵＦ４２８３に向かうＧＤＳ遺伝子の上流の未知の領域と重複する３個のＰＡＣ Ｂｉｏリードが得られている（結果は示していない）。これらのＰＡＣ ＢＩＯのリードによって得られた情報は、ＧＤＳ遺伝子の上流の領域が高度に反復性であり、Ｋ１０３６及び９Ｍの両方についてＧＤＳ遺伝子の上流（遺伝子プロモーターまたは他のシス調節エレメントを含み得る）のサンガー配列決定を行えるプライマーを設計することを不可能とするような、大きなＡＴ反復配列、または、ＧＣに富む短い反復配列が散在した、ＡＴに富む大きな反復配列を有することを示唆している（結果は示されていない）。「配列ギャップ」に隣接するプライマーを用いた長距離増幅により、最初に対として使用された２個のプライマーのうちの一方を欠く、ＰＣＲで増幅されたものであるために真正ではない指紋様の模様または断片が得られた。結果は示されていない。結論として、Ｍ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子の上流の配列情報を得ることは不可能であった。

ＧＤＳ近くの配列変異を検出するための新たな試みを行う価値があるか否かを調べるためには、Ｍ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子（領域）において、Ｋ１０３６家系の突然変異を実際に探すべきであり、Ｋ１０３６の両全性形質のさらに詳細なマッピングが試みられた。この目的のため、近交系８８系統雌性ｘ（両全株Ｋ１０３６×近交系８８系統超雄株）の型の『８６１ ＢＣｌ交配』をさらに作製した。温室での最適な使用のためには、Ｍ座位に連鎖したＧＤＳ遺伝子に５センチモルガン未満の遺伝的距離で両側で隣接するマイクロサテライトマーカーＡＯ０２２及びＡｓｐ−８０（マーカーの詳細については実施例１参照）の間の組換え事象を経た若い植物のみを選択して維持することにより、集団のサイズを減少させることを要した。その後、これらの「マーカー組換え植物」の開花及び着果につき表現型を調べた。マーカーＡＯ０２２及びＡｓｐ−８０に加えて、Ｍｅｌｔｉｎｇ ＣｕｒｖｅマーカーＣＰ８０／ＣＰ８１（プライマーについては表３参照）によって、ＧＤＳアレルについて、植物の遺伝子型を決定した。このマーカーは、８８番の超雄株の他の祖父母ＤＨ０２／５０４のアレルとは異なる、両全株の祖父母Ｋ１０３６のＧＤＳ遺伝子の第２予測エキソンのＳＮＰを標的とする。

集団８６１ＢＣｌａ、８６１ＢＣｌｂ、８６１ＢＣｌｃ、８６１ＢＣｌｅ及び８６１ＢＣｌｆについては、それぞれ、２２個、３２７個、１３５個、８６個及び３３個の個体を増殖させ、これらからは、さらなる表現型決定のためにマーカーＡＯ０２２とＧＤＳ座位との間の１８の組換え体及びＧＤＳ座位とＡｓｐ＿８０との間の８つの組換え体を得た。それらの組換え体は、いくつかの「対照株」（ＡＯ０２２、ＧＤＳ、及びＡｓｐ＿８０との組換えをしていない）とともに４４の植物の集団をなし、これを次季においてさらに表現型決定した。この集団のうち２５の植物は、ＤＨ０２／５０４雄株の祖父母に由来するＧＤＳアレルを有していたが、漿果を産生する能力がなかった。これら２５の植物はすべて、Ｆｒａｎｋｅｎ，１９６９；ｐ３７の尺度によれば、１（花柱がまったくない）に分類される花柱の長さを有していた。結論として、ＢＣ１植物がＤＨ０２／５０４雄性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを受け取った場合、これは雄性植物となっていた。集団中の１９の植物は、Ｋ１０３６両全性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを有していた。これら１９の植物のうちには、変異がみられた：１２の植物は５００個を超える漿果を産生し、これらの植物は、「５」（ｎ＝９）またはあるいは「４」（ｎ＝３）に分類される花柱を有していた。２つの植物は約２００の漿果を産生し、「５」または「４」に分類される花柱を有していた。他の２つの植物はおよそ１００の漿果を産生し、「３」及び「２」に分類される花柱を有していた。残りの３つの植物は、「１」に分類されるにすぎない花柱を有し、５つの漿果しか産生せず（ｎ＝１）、またはまったく果実を産生しなかった（ｎ＝２）。着果できなかった１つの植物は、Ｋ１０３６両全性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを保有しており、「マーカー組換え」よりむしろ「対照区」の両全株であり、このことは、着果の変動という現象がそれ自体ではＭ座位領域組換えには関連しておらず、この集団において一般的に起こっていた現象であったことを示す。

結論として、付加的な８６１ＢＣ１家系では、（ちょうど８６１ＢＣ１ｄ家系のように）いずれも雄性であるＤＨ０２／５０４雄性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを保有する植物の間では着果が観察されなかったが、一方で、Ｋ１０３６両全性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを保有する株の間では、２つの植物以外のすべてが着果した。しかしながら、着果したこれらの植物の間では着果のレベルの変動がみられた。この着果は、花柱がどの程度発達していたか関連するものとみられる。付加的な８６１ＢＣ１家系（８６１ＢＣ１ｄ以外の８６１ＢＣ１ａ−ｆ）についてみられたこの状況は、８６１ＢＣ１ｄ家系で得られた結果と比較して異なっており、後者の集団では、Ｋ１０３６両全性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルを保有するすべての植物において（すなわち、例外なく）、変動なく高レベルの両全性がみられた。

実施例１及び実施例２では、潜性アレルが、通常は顕性雌性抑圧因子ＧＤＳの喪失を引き起こしたことが示されている。本実施例の８６１ＢＣ１ｄ家系で得られた結果は、機能欠損の原因は明らかではないものの、このモデルとは整合する。他の８６１ＢＣ１家系については、「不完全に喪失した」または「不完全に抑圧された」雌性抑圧ＧＤＳ遺伝子と解釈されなければならない可能性のあるＫ１０３６両全性祖父母Ｍ座位ＧＤＳアレルの不完全な浸透を示唆する表現型が見出された。

先の家系の表現型決定の期間と重複する後の期間において、８６１ＢＣｌｊと命名した別の８６１ＢＣ１家系を、２つのマーカーについて遺伝子型決定した。第１のＨＲＭマーカーは、Ａ２０／ＡＮ１様ジンクフィンガーファミリータンパク質遺伝子、略称「Ａ２０／ＡＮ１様」（プライマーＣＭ４５／ＣＭ４６、表３３参照）に位置して、マーカーＡＯ０２２を置き換え、第２のマーカーはＡｓｐ＿８０（ＣＫ６３／ＣＫ６４、実施例１の表３）である。８６１ＢＣｌｊの子孫を着果について評価した時点では、いくつかの家系について、着果が環境的に制御されるよりはむしろ遺伝的に決定されるということが大部分不明であったので、これらの株についての様々な数の着果及び着果を、定量的にではなく着果できたか否かで大まかにスコアリングしていた。ＧＤＳ座位に隣接するマーカー「Ａ２０／ＡＮ１様」Ａｓｐ＿８０についてＫ１０３６両全性祖父母アレルにつき「非組換え」であった株は１４２の植物であった。これら１４２の植物のうち、１１８の植物は漿果を産生し、２４の植物は着果しなかった。ＧＤＳ座位に隣接するマーカー「Ａ２０／ＡＮ１様」及びＡｓｐ＿８０についてＤＨ０２／５０４雄性祖父母アレルを有し「非組換え」であった植物は１３５であり、いずれも雄性であり着果しなかった。６個のマーカー組換え体は、それらの型のＧＤＳアレルに基づいて予想された表現型を示した。

Ｋ１０３６の両全性祖父母由来のアレルにもかかわらず漿果を産生しなかった２４の植物は、８つの両全性「対照植物」及び１１の雄性の「対照植物」とともに（これらの対照株は、両全性Ｋ１０３６及び雄性ＤＨ０２／５０４祖父母にそれぞれ由来するこれらのマーカーアレルＡ２０／ＡＮ１様及びＡｓｐ＿８０と一致する表現型を示した）、以前に表現型決定が行われていなかった３つの植物、Ａ２０／ＡＮ１様とＧＤＳ遺伝子との間の組換え事象を経た１つの植物及びＧＤＳ遺伝子とＡｓｐ＿８０との間の組換え事象を示した４つの植物とともに、表現型決定のため次季に保存した。次の評価では、漿果の数及び花の形態をより注意深く決定した。１１の雄性対照植物は、また漿果をまったく産生せず、発達の悪い花柱（スコア１）を有していた。ＧＤＳ座位に連鎖したマーカーの祖父母アレルに基づいて両全性であることが予想された植物は、着果及び花の形態につき多様性を示した。Ｋ１０３６両全性祖父母ＧＤＳアレルを有していた３６の植物のうち、６つの植物は１００個の漿果を産生し、６つの植物は２５―６５個の漿果を産生し、７つの植物は１−１８個の漿果を産生し、残りは漿果をまったく産生しなかった。

これは、この家系において、Ｋ１０３６祖父母ＧＤＳアレルの雌性抑圧の喪失が不完全であったことを再び示した。

Ｋ１０３６に由来するＧＤＳアレルが、メロンにおける性別決定について見出された（Ｍａｒｔｉｎ等、２００９）ようにエピアレルであり得るか否かを調べるために、両全株Ｋ１０３６について、両全株Ｋ１０３６の亜硫酸塩配列決定データ、雄性ＤＨ００／０８６の、及び９系統についてはＫ１０３６と同じＧＤＳハプロタイプを有する雄性の（ＳＮＰを共有するため）、基準ゲノムを得ることとした。以下に、データを得るために使用された材料及び方法を記す。

（ライブラリー）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを、亜硫酸塩変換ＤＮＡから調製した。亜硫酸塩変換後、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換したが、５−メチル−シトシンは損傷しないままであった。ＰＣＲ増幅の後、変換されたヌクレオチドはチミンを生じたが、非変換のヌクレオチドはシトシンのままであった。各ライブラリーについて、２μｇの全ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ−Ｓ２を用いて約５５０ｎｔで超音波処理した。Ｅｎｄ−Ｉｔ−Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造元の指示に従って使用し、末端修復を行った。反応物を、０．８Ｘ ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて洗浄した。Ｋｌｅｎｏｗ（３’−５’エキソマイナス、ＮＥＢ）を用いてＡテーリングを行い、３７℃で３０分間インキュベートした。反応物を、０．８Ｘ ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて再び洗浄した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、Ａテールされた各断片にＮｅｘｔＦｌｅｘ配列決定アダプターをリガンド結合し、１６℃で一晩インキュベートした。リガンド結合反応物を、ＩＸ ＡｍｐｕｒｅＸＰを用いて２回洗浄した。ＭｅｔｈｙＣｏｄｅキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従って使用し、亜硫酸塩変換を行った。亜硫酸塩処理したＤＮＡを、Ｋａｐａ Ｕａｒｃｉｌ＋２ｘＲｅａｄｙｍｉｘを用い、以下のプロトコルに従って増幅した。：９５℃で２分、９８℃で３０秒、次いで［９８℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で４分］を４サイクル、最後は７２℃で１０分。

増幅された亜硫酸塩ライブラリーを、ＩＸ ＡｍｐｕｒｅＸＰを用いて再び清浄し、イルミナＮｅｘＳｅｑ５００で、ペアードエンド１５０ｎｔリードにより配列決定した。

（バイオインフォマティクス）
ペアードエンドＩｌｌｕｍｉｎａリードは、ＢＷＡ−ｍｅｔｈ（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，２０１４）をｂｗａ−ｍｅｍ（Ｌｉ，２０１３）バージョン０．１０とで用いて、以下のコマンドライン（／ｕｓｒ／ｌｏｃａｌ／ｂｉｎ／ｂｗａｍｅｔｈ．ｐｙ −−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．． ／Ｇｅｎｏｍｅ／０２． ａｓｓｅｍｂｌｙ ＿ｒｅｓｕｌｔ／Ｖ２．０／Ａｓｐａｒａｇｕｓ．Ｖ２．０． ｇｅｎｏｍｅ． ｆａ −ｔ １０ −−ｃａｌｍｄ −ｐ ＤＨ００８６ ＤＨ００８６＿ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ＿ｌ．ｆｑ．ｇｚ ＤＨ００８６＿ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ＿２．ｆｑ．ｇｚ）を用いて、Ａｓｐａｒａｇｕｓ ２．０基準ゲノム（ソース）にマッピングした。ｂｗａ−ｍｅｔｈは、計算上変換された２個の基準配列を生成する。１個は、すべてのシトシンがチミンに変換される順鎖すなわちワトソン鎖であり、１個は、すべてのグアニンがアデニンに変換されるクリック鎖すなわち逆鎖である。読み取られたペアは、計算上変換された双方のゲノムにマッピングし、４０より高いマッピングスコアでペアがワトソン鎖またはクリック鎖にマッピングされた場合、ペアを保持した。ペアがワトソン鎖とクリック鎖の両方に一致する場合は、最も高い得点のペアのみを保持した。得られたＢＡＭアライメント・ファイル「ＹＤ：Ｚ：ｆ」内のカスタムリードグループタグで、ワトソン鎖にマッピングされたリードペアを識別し、一方、「ＹＤ：Ｚ：ｒ」で、クリック鎖にマッピングされたリードを識別した。これらのタグに基づき、以下のｂａｓｈコマンドを用いて、リードをワトソンマッピングとクリックマッピングペアに分離した：「ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ −ｈ ａｌｌ．ｂａｍ ｜ｔｅｅ ＞（ｇｒｅｐ”＾＠＼｜ＹＤ：Ｚ： ｆ”｜ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ

マッピングの後、ゲノムのすべてのヌクレオチドを反復するカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを作成した。このような（Ｐｙｔｈｏｎ）スクリプトの作成は、この技術に精通したバイオインフォマティシャンであれば行うことができる。ワトソン及びクリック鎖の両方の全てのシトシンについて、正しい文脈で、ＣＧ、ＣＨＧまたはＣＨＨ（ＨはＣ、ＡまたはＴ）を特定した。ヌクレオチドは、このジヌクレオチド対に続く塩基がまたＧであっても、ワトソン鎖上のＣＧ文脈にあると考えられるので、配列「ＣＧＧ」の最初のヌクレオチドはＣＧ文脈にあると考えられる。第２の位置のＧとは反対の、クリック鎖上に存在するシトシンは、同じ鎖上の３’下流のヌクレオチドがＧであるので、これもＣＧ文脈にあると考えられる。同様に、第３のＧとは反対のシトシンは、クリック鎖上の最初の３’下流のヌクレオチドがＣである一方、この鎖の２番目の３’下流のヌクレオチドがＧであるので、ＣＨＧ文脈にあると考えられる。ワトソン鎖及びクリック鎖について、全ヌクレオチドに対する変換されていないものの数を数えることにより、メチル化レベルを個別に特定した。ワトソン鎖では、変換されたヌクレオチドは。基準ヌクレオチドのＣではチミン（Ｔ）で表され、一方、クリック鎖では、変換されたヌクレオチドは、基準ヌクレオチドのＧではアデニン（Ａ）として表される。ｓａｍｔｏｏｏｌｓ（バージョン１．２）パイルアップを用いて、ワトソン鎖及びクリック鎖双方のシトシンについて、位置当たりの変換率を同時に計算した。メチル化は、ヌクレオチド多型が明らかでない位置についてのみ必要とされた。メチル化多型とヌクレオチド多型（ＳＮＰ）とは、後者の場合、ワトソン及びクリック鎖の両方が多型の証拠を示す一方、メチル化多型はワトソン鎖またはクリック鎖のいずれかにのみ存在するため、区別できる。これは、亜硫酸塩変換がシトシンにのみ影響を与え、反対側の鎖上のグアニンを損傷しないまま残すという事実に起因する。両方の鎖で十分な範囲のリードがあれば、メチル化多型は、このようにしてヌクレオチド多型から確実に区別される。

（結果）
Ｍ座位に連鎖した、配列番号１のコード領域（実施例１参照）によって示される、ＤＵＦ２４７ドメインを有するＳｃａｆｆｏｌｄ＿９０５ Ａｓｐａｒａｇｕｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０の参照ゲノム上に位置する名称「Ａｏｆ０３０５７５．３」の遺伝子は、Ｋ１０３６とＤＨ００／０８６との間で、４９８１５から５１．２４９位置の１４３４塩基対領域におけるＣＨＧメチル化に顕著な差異を示した。この領域には、ＣＨＧ文脈に合計１１３個のヌクレオチドが存在する。Ｋ１０３６については、平均メチル化レベルは０．７３であったが、一方でＤＨ００／０８６では、平均メチル化レベルは０．０３であった。Ｋ１０３６とＤＨ００／０８６との間で平均メチル化レベルの間に差がないという帰無仮説を用いて不等分散を仮定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌバージョン５．１３．１（１５０８０７）で実施されたスチューデントのＴ検定では、Ｐ（Ｔ＜＝ｔ）＝９．０３Ｅ−６１に基づいてこれが棄却された。Ｋ１０３６とＤＨ００／０８６との間では、塩基の間のＳｃａｆｆｏｌｄ＿９０５ゲノムバージョン２．０の塩基４９．８１５から５１．２４９（図１３のＳｃａｆｆｏｌｄ＿９０５の位置３０９７５７−３０８３２３に相当する）について、ＣＨＧメチル化の差は極めて有意であった。解析の結果を図１５に示す。

亜硫酸塩データにより、Ｋ１０３６ ＧＤＳアレルにおける顕著に高いＣＨＧメチル化が明らかになったため、４つの８６１ＢＣ１同胞より亜硫酸塩配列決定データを得ることとした。これら４つの同胞は、すべて祖父母Ｋ１０３６からのＧＤＳアレルを有していた。しかし、２つは高度に両全性（ｎ＞１００の漿果）であった一方、他の２個の同胞は事実上漿果を産生できなかった。この仮説は、もしメチル化が雌性抑圧遺伝子を抑圧する役割を果たすならば、両全性祖父母Ｋ１０３６のＧＤＳアレルを有し高度にメチル化されたままの植物は両全性であり、一方で、何らかの理由で（部分的に）このメチル化を喪失した株は「脱抑制」され、かくして活性化された雌性抑圧遺伝子を有し、厳密に雄性ではないにしても、より両全性でなくなる、というものであった。メチル化の損失のために、高度に両全性であるところから、より両全性でないか、あるいは雄性へさえ表現型を変えると仮定された株を、「復帰変異株」と命名した。

亜硫酸塩処理されたゲノムＤＮＡから、亜硫酸塩処理されたテンプレートの増幅を可能にするプライマーを用いたＰＣＲによって、サンガー法のリードを得た。この目的に向けて、配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ変換を生成するため、ＧＤＳ遺伝子配列をＢｉｓｕｒｌｆｉｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｅｋｅｒ １２Ｓにインポートした。続いて、この配列をＰｒｉｍｅｒ３（Ｕｎｔｅｒｇｒａｓｓｅｒ、２０１２）にインポートし、プライマーを設計及び選択した。亜硫酸塩で処理されたＤＨ００／０８６及びＫ１０３６テンプレートのワトソン及びクリックの配列リードのＪ−Ｂｒｏｗｓｅにおける視覚的表現により、差次的メチル化（または単一メチル化多型；ＳＭＰ）を含む比較的小さな標的（１００−３００ｎｔ）を注意深く選択することができた。差次的メチル化されたＤＮＡ標的においてミスマッチが生じるので、プライマーはこれらがＳＭＰにアニーリングしないように選択された。設計されたプライマーは、亜硫酸塩処理したテンプレートＤＮＡを用いて２５６ｎｔ断片の増幅を可能にするＣＳ７７及びＣＳ７８（表３３参照）である。ＰＣＲは、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（商標）キット（Ｚｙｍｏｇｎ Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ９２６１４、米国）を用いて亜硫酸塩処理されたＣＴＡＢ単離ＤＮＡ（Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｄｏｙｌｅ、１９９０）に適用される製造者のプロトコルに従ってポリメラーゼとしてＫａｐａ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ（オランダ、オフテンのＳｏｐａｃｈｅｍから購入）を用いて行った。ＰＣＲ断片は、オランダ、ライデンのＢａｓｅＣｌｅａｒによって、サンガー法による配列決定を受けた。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ、オークランド、ニュージーランド）の配列アラインメントが、以下の「高品質配列部分」を提供した：
ＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡ
この高品質配列部分において、「二重ピークＣ／Ｔ ＳＮＰ」として際立っているＳＭＰが、それぞれ、７９、８８、１０３、１１９、１２７、１４２、１７６、１９６、２０７、２２０及び２２７の１１の位置にみられ、一方、他の多くの位置（ｎ＝２６）では、亜硫酸塩のＣからＴへの変換が完了しており、したがって、４個の試料についてチミン以外の二重ピークはみられず、分析されたすべての試料について亜硫酸塩処理が成功したことを示した。

これらのＳＭＰの混合Ｃ対Ｔピークプロット内の相対ピークプロット高としてシトシンの相対量を定量するために、プログラムＭｕｔａｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ５．０（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃｓ、州立大学、パサデナ、米国）を使用した。ａｂｉファイルは「Ｓａｍｐｌｅ Ｆｉｌｅｓ」としてインポートし、高品質配列ＦＡＳＴＡファイルは、Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＳｕｒｖｅｙｏｒのＯｐｅｎ Ｆｉｌｅメニューに必要な「Ｇｅｎｂａｎｋ配列ファイル」としてインポートした。設定は、ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎオプションがチェックされているＰｒｏｃｅｓｓ−＞Ｓｅｔｔｉｎｇ−＞Ｏｔｈｅｒｓメニューで調整した。Ｓｅｔ ｂｙ Ｕｓｅｒメニューでは、ＣＧ−＞ＴＧオプションのみがチェックされていなかったので、Ｐｒｏｃｅｓｓドロップダウンメニューで「Ｒｕｎ」を押し、ツールバーのＭｕｔａｔｉｏｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒボタンを押した。定量された突然変異（ＳＭＰ）は、その後、プレッドシートに現われ、それに基づいて特定のＳＭＰにおけるシトシンの百分率を取って表３４に要約した。明らかに、二重のＣ対Ｔピークにより単一のメチル化多型または「ＳＭＰ」が明らかになり、シトシンのピーク高は、復帰変異株について観察されたシトシンのピーク高さと比較すると、２個の両全株サンプルにおいてより高かった。これは、メチル化が、「オールオアナッシング」な差異ではなく定量的であった「復帰変異体」と比較して、高度に両全性である２個の試料においてより顕著であったことを意味する。

亜硫酸塩配列決定は、標的ＤＮＡを分解するものであり技術的に困難であるため、ＧＤＳ遺伝子の差次的メチル化を定量するために他の手法を適用した。この目的のため、メチル化感受性／障害性制限酵素の認識部位と重複するＳＭＰについて配列を検査した。

この手順により、２種のアッセイを設計した。第１のアッセイでは、メチル化感受性制限酵素ＥｃｏＲＩＩ（ＣＣＷＧＧ：ｍＣを標的ＳＭＰとして、プラス鎖上のＣｍＣＴＧＧ及びマイナス鎖上のＣｍＣＡＧＧを標的とする）の、ＣＮ６７の５’プライム末端に対する位置８２−８６及び１４８−１５２における２個の認識部位を含む３５３ｎｔゲノム領域をカバーするために、プライマーＣＮ６７及びＣＰ３２（表３の実施例１）を用いて断片を増幅する。

第２のアッセイでは、酵素ＧｓｕＩ（ｍＣを標的ＳＭＰとして、プラス鎖及びマイナス鎖上のＣＴＣｍＣＡＧ及びｍＣＴＧＧＡＧを標的とする）の、ＣＮ３５の５’プライム末端に対する位置１８４−１８９における１個の認識部位を含む３５３ｎｔゲノム領域をカバーするために、プライマーＣＮ３５及びＣＰ８２（表３の実施例１）を用いて断片を増幅する。

ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６機器（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ブレダ、オランダ）上でｓｂｅａｄｅｘ（登録商標）ミニプラントキット（ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）を用いて単離した４０ナノグラムのゲノムテンプレートＤＮＡを、ＥｃｏＲＩＩ及びＧｓｕＩ（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２個のユニットを用い、１５μｌの容量で１ｘ標準緩衝液中で４時間個別に消化した。対照ＤＮＡは、酵素をＭＱ水で置き換えた点を除き、同様のインキュベーションからなるものとした。続いて、この酵素処理及び非酵素処理されたテンプレートＤＮＡを２μｌ、ＰｈｉｒｅＩＩ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＬＣ ｇｒｅｅｎ Ｂｉｏｆｉｒｅ ｄｅｆｅｎｓｅ、ソルトレークシティ、米国）を用いて９８℃で１分、［９８℃：１０秒、６２℃：５秒及び７２℃：１０秒］を４０サイクルにプログラムされたＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヴィーネンダール、オランダ）によってカバーされたＣ１０００ＴｏｕｃｈＴｈｅｒｍａｌサイクラーでの１０μｌのＰＣＲで個別に用いた。

表３４：亜硫酸塩処理したゲノムＤＮＡテンプレートから得られた２５８ｎｔのＰＣＲ断片からのサンガー法による配列リード中の１１個のＳＭＰにおけるシトシン（Ｃ＋Ｔ＝１００％）の百分率。テンプレートは、２つの強い両全株（植物あたり１００を超える漿果を産生する）から得られた３０３及び５８０、及び、２個の「復帰変異株」から得たものであって、Ｋ１０３６祖父母ＤＵＦ２４７アレルにもかかわらずひとつは１個の漿果しか産生せずひとつはまったく漿果を産生しない６００及び６０６である。順方向のリードについては、（信頼性のある）情報が不足しているため、一部のＳＭＰを得ることができなかった。それを「ｎｄ」と表示する。他の２６の位置で、すべての試料につきＣからＴへの変換は完了した（結果は示していない）。両方のリードに保持された、すなわちメチル化を示すシトシンの百分率は、復帰突然変異体と比較して両全株の方がはるかに高いことに留意されたい。これは、メチル化の明らかな喪失が雌性抑圧遺伝子を再活性化させ、復帰変異株の着果を低下させることを示唆している。

亜硫酸塩処理したゲノムＤＮＡテンプレートから得られた２５８ｎｔのＰＣＲ断片からのサンガー法による配列リード中の１１個のＳＭＰにおけるシトシン（Ｃ＋Ｔ＝１００％）の百分率。テンプレートは、２つの強い両全株（植物あたり１００を超える漿果を産生する）から得られた３０３及び５８０、及び、２個の「復帰変異株」から得たものであって、Ｋ１０３６祖父母ＤＵＦ２４７アレルにもかかわらずひとつは１個の漿果しか産生せずひとつはまったく漿果を産生しない６００及び６０６である。順方向のリードについては、（信頼性のある）情報が不足しているため、一部のＳＭＰを得ることができなかった。それを「ｎｄ」と表示する。他の２６の位置で、すべての試料につきＣからＴへの変換は完了した（結果は示していない）。両方のリードに保持された、すなわちメチル化を示すシトシンの百分率は、復帰突然変異体と比較して両全株の方がはるかに高いことに留意されたい。これは、メチル化の明らかな喪失が雌性抑圧遺伝子を再活性化させ、復帰変異株の着果を低下させることを示唆している。

表３５：性別で型付けしたいくつかの戻し交配個体にＣＱ値を与えている。両全株（雄性両全性同株）と雄性表現型とを分離している。８６１ＢＣ１ｄ集団の個体（表の下部）では、Ｋ１０３６から祖父母アレルを受けた株についてはＣＱ値が低く、これらの植物は両全性であり、ＤＨ０２／５０４アレルを受けた株では反対の関係がみられ、ＣＱ値が高く雄性の表現型であることに留意されたい。他の集団８６１ＢＣ１ａ、ｂ、ｃ、ｅからの株（表３５の上部）については、ＣＱ値は、Ｋ１０３６アレルを有する株、特に、両全性ではなく雄性であることが判明している植物についてははるかに低くなり得るものであり、これらは復帰変異株と型付けされる。

ＣＱ値の差（デルタＣＱ）は、消化されたテンプレートＤＮＡから消化されていないテンプレートＤＮＡのＣＱ値を差し引いて得られたＣＱ値であり、ＤＮＡメチル化の尺度として用いた。

この試験の結果を表３５に示す。結果は、両全株が約０のｄｅｌｔａＣＱ値を有しており高いメチル化を示し（ＰＣＲに提供されるテンプレートを酵素が切断できないため）、一方、復帰変異株のｄｅｌｔａＣＱ値はゼロより大きく１．９−７．１の範囲であり、この手法による標的とされたＧＤＳ遺伝子領域のメチル化が不十分であることを示す。集団８６１ＢＣ１ｄについては、ＤＨ０２／５０４祖父母ＧＤＳアレルを有する雄株は０より大きいｄｅｌｔａＣＱ値を有し、一方、Ｋ１０３６祖父母ＧＤＳアレルを有する両全株は、０に近いｄｅｌｔａＣＱ値を有することが示された。

これは、この手法が、雄株の両全性傾向、すなわち漿果を産生する能力をモニターするために使用できることを示す。当業者であれば、メチル化感受性制限酵素による消化とその後のＱ−ＰＣＲという手法は粗い方法であり完全ではないことを認識するであろう。例えば、表３５に示す結果は、１つの両全株（ＩＤ：４０９４５５）が、ＥｃｏＲＩＩ複製１についてのｄｅｌｔａＣＱが１．２（約０ではなく）であることを示す。当業者であれば、この手法を最適に用いるためには、いくつかの複製及びより多くの標的の使用、好ましくは、いくつかのメチル化感受性制限酵素の使用が好ましいことを理解するであろう。

結論として、亜硫酸塩配列決定実験で観察されたのと同様に、Ｑ−ＰＣＲ実験では、メチル化障害制限酵素処理されたテンプレートＤＮＡの、ＰＣＲに用いられる未処理のテンプレートＤＮＡに対するＣＱの差から推測されるように、差次的メチル化が検出された。復帰変異株及び雄株についても、ＰＣＲに使用する未処理のテンプレートＤＮＡに対する、メチル化障害制限酵素で処理されたテンプレートＤＮＡから得られたＣＱ値の相対的に大きい差として、低メチル化が顕著であった。この差次的メチル化は、戻し交配の集団８６１ＢＣ１ｄにおいて明確かつ安定的に分離された。Ｋ１０３６のＧＤＳ祖父母アレルのメチル化は、同じく不安定であった両全性の表現型と一致する他の系統において不安定であることが示された。５個以上の超可変座位を用いたＭｉｒｃｒｏ−ｓａｔｌｌｉｔｅマーカー分析は、これらの不安定な株または復帰変異株が、真にそれらの系統に属する株であることを示した（結果は示していない）。

遺伝子やゲノムのメチル化、エピアレルの遺伝を報告する科学論文がますます増えている（例えば、Ｊｉ他、２０１５；Ｇｒｅａｖｅｓ他、２０１４、Ｚｈａｎｇ他、２０１３）。株において、ＤＮＡのメチル化は３つの異なる文脈で分離されている。ＣＧ、ＣＨＧ及びＣＨＨ（Ｈ＝Ａ、ＴまたはＣ）である。３個の文脈すべてにおいて、メチル化されたゲノムの領域はしばしば、標的領域、及び、場合によっては隣接領域において、サイレンシングをもたらす（Ｊｉ他、２０１５の引用文献参照）。サイレンシングされた遺伝子の多くは、プロモーターのメチル化が、配列の反復（または重複）から遺伝子（ｃｍＷＩＰ１、ブースター１、ＢＳＮ、ＦＯＬＴ１；Ｊｉ他２０１５参照）へと伝搬するため、発現がより低い。プロモーターではなくエキソンのメチル化がより低い発現をもたらすいくつかの例が存在する。最も初期の例の１つは、シロイヌナズナのいわゆるスーパーマン遺伝子のクラークケント（ｃｌｋ）アレルにみられる。スーパーマンは、同じ表現型を提供するアレル型が見いだされたが野生型との核酸差異が明らかでない遺伝子の突然変異によってノックアウトされると、より多くの葯をもたらす遺伝子である。しかし、亜硫酸塩配列決定により、野生形またはｓｕｐの「ナンセンス」アレル（ｓｕｐ−１）にシトシンのメチル化が存在しない一方、転写の開始及び転写された領域のほとんどをカバーするｃｌｋのアレルにおいてすべての文脈に広範なメチル化がみられるこれら（ｃｌｋ）の表現型が明らかになった。興味深いことに、復帰変異株と、ＤＮＡのメチル化に関連する、より強くより弱いｃｌｋアレルも観察された。表現型の復帰は、野生型ＲＮＡの発現による回復とスーパーマン遺伝子ＤＮＡのシトシンのメチル化の減少の両方に相関する。当業者は、アスパラガスＧＤＳ座位について観察されたメチル化、及び本明細書に示したメチル化の減少に関連する復帰変異株の現象が、スーパーマン遺伝子についてみられた状況を反映することを理解するであろう。ＧＤＳ遺伝子の野生型発現の低さに関係する技術的理由から、ＧＤＳ遺伝子のメチル化がより低い発現または別の配列決定を帰結するか否かを明白に決定することは不可能と思われた。当業者は、そのような関係が非常にあり得ることと、ＲＮＡｓｅｑ研究、特定の組織または発生段階の標本化へと続く遺伝子捕捉技術により、両全性の表現型とＧＤＳ遺伝子のメチル化との関係、及び発現レベルまたは組み換えの低下が確認される見込みが高いことを理解するであろう。

本実施例は、ロットＫ１０３６及びこれから派生する子孫における両全性のエピジェネティックな制御について報告する。これは、ＧＤＳ遺伝子のメチル化が、両全株を得る方法を提供することを開示する。本実施例はまた、ＧＤＳ遺伝子（部分）の亜硫酸塩配列決定またはこのＧＤＳ遺伝子を標的とするメチル化によって損なわれた制限酵素の使用などであるがこれらには限られない、メチル化の検出を可能にする方法を、植物が両全性になりあるいはなり続ける傾向があるか否かを予測する診断に使用できることを示す。

当業者は、Ｓｈｅｎ及びＷａｔｅｒｌａｎｄ；２００７によって概説された方法のような、しかしこれに限られない、ＤＮＡメチル化の検出を可能にする多くの方法があり、このような方法のいずれも本発明で使用できることを認識するであろう。

当業者はまた、ＧＤＳのＤＮＡメチル化を増大または減少させることによって影響を及ぼすことにより、雌性の抑制を減少または増加させる遺伝子の発現及び／または組み換えへの変化がもたらされることを認識するであろう。本実施例におけるメチル化は転写領域に限定されているものの、当業者であればまた、遺伝子の近くのプロモーターまたは他のシス作用要素のメチル化が、発現または選択的組み換えの減少をもたらしてもよく、したがって雌性抑制の減少をもたらしてもよいことを理解するであろう。あらゆる文脈でのメチル化は、ウイルス誘発遺伝子サイレンシングによって形成され得るし、このメチル化の一部は、ウイルスが除去された後に持続してもよい（例えば、Ｄａｌａｋｏｕｒａｓ他、２０１２参照）。

遺伝子メチル化を形成するための他の方法は、Ｚｈａｎｇ及びＨｓｉｅｈ（２０１３）が提案しており、これは、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集技術により、座位特異的エピジェネティック操作を通じた作物の改良がますます実現可能になった旨を述べている。最近、多くの形態のヒト癌（Ｎｕｎｎａ他、２０１４）の形で発現される遺伝子の発現を減少させるための、標的化されたメチル化が、そのプロモーターの遺伝子の標的メチル化によって達成されている。これらの著者は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインに融合された遺伝子プロモーターに特異的に結合する、設計されたジンクフィンガーを使用した。当業者であれば、標的部分とともにサイレンシング信号を伝達する触媒部分を提供する任意の技術が、定義されたゲノム標的への触媒部分の特異的結合を確実にし、標的化メチル化を可能にしてもよいことを理解するであろう。このような技術は近い将来に開発される可能性がある。Ｎｕｎｎａ他によって使用されているようなＤｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼではなく、ＤＵＦ２４７遺伝子のコード領域のＣＨＧメチル化を増強するメチルトランスフェラーゼが好ましい。標的化されたヒストン修飾によって同様の高メチル化効果を達成することができる。非ＣＧメチル化に関与する遺伝子の例は、Ｓｔｒｏｕｄ他（２０１４）に概説されている。本実施例は、すべての文脈におけるメチル化、特にＤＵＦ２４７遺伝子のエクソン及びイントロンのＣＨＧメチル化が雌性化をもたらすことを教示する。

（実施例４）
（ＧＤＳ遺伝子の第２予測エキソンにおけるヒスチジンからグルタミンへの変異）
品種Ｋ５７５６は、クローン雌株である１６９Ｆ１−８５Ｖと倍加半数体雄株であるＤＨ０５／１２８と間の交ハイブリッドである全雄ハイブリッド品種である。後者の倍加半数体は親株として選択された。これは、とりわけ、漿果を産生する能力がなかったという理由による。

このハイブリッドの初年度の株は、株圃で最初に生育され、その後、クラウンがハイブリッド評価圃場に移植された。移植に先立ってクラウンを袋に入れたとき、クラウンを２つのクラウンに分けることができるわずかな可能性があった。

ハイブリッドＫ５７５６は、それぞれ２０個の株からなる４つの再現プロットで試験した。評価すると、同じプロットの２つの異なる株は漿果が充実した一方、このハイブリッドの他のすべての個体については、この４つのプロットのいずれにおいても漿果をまったく結実せず、漿果は、生育可能な種子を含んでいた。季節の後期の検査の際、漿果を産生した２つの植物に、吹き飛ばされた花がまだ残っており、葯や大きな花弁の残渣が認められ、雌しべと雄しべが明らかにあり、真に両全性の性質があることが確認された。２つの植物から収穫された漿果は合計で１０１６の種子をもたらした。２つの両全株及び同じハイブリッドの対照植物からシダが採取された。２つの両全株から得られたテンプレートＤＮＡを、プライマーの組み合わせＣＮ８２／ＣＮ６７、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６９／ＣＮ８１を用いて、順方向及び逆方向の両方でサンガー法で配列決定した。プライマーの対ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６９／ＣＮ８１の両方から得られた配列読み取りの結果、シトシンからアルギニンへの同様な塩基転換が明らかになった。この塩基転換は、ＣＮ６９／ＣＮ７０ ＰＣＲ断片中に存在する合計３つのＨｐｈＩ制限部位（この場合は５−＾（Ｎ）_７ＴＣＡＣＣ−３）の第２番目を破壊したもので、その断片を診断に使用できる。このタイプの診断を、圃場から採取した２つの両全株及び雄性対照試料につき行った。一般にＣＡＰＳマーカー分析と呼ばれるこの分析により、特定の塩基転換が２つの両全株に独特であることが確認された。

７個の独占的な超可変座位を用いたマイクロサテライト解析では、２つの両全株が、対照試料とは異なる同一の遺伝子型を有することが示された。しかし、両全株及び雄株で観察されたアレルの両方が、同じハイブリッドに属することが確認された。結論として、全雄ハイブリッド５７５６において、２つの両全性のクローンコピーのＭ連鎖ＧＤＳ遺伝子に突然変異が見出された。このクローンは、このハイブリッド中に見いだされた両全株の標本のみを提供した。特定の突然変異は、ヒスチジン（Ｈ）の第３コドン位置のシトシン（配列番号１の位置６８４）をアデニンに変え、グルタミン（Ｑ）のコドンを提供する。従ってＣＡＣ＞ＣＡＡである。

（実施例５）
（雌性抑制遺伝子を含むＧＤＳドメインの第２予測エキソン中のプロリンをスレオニンに変化させる突然変異が両全株を生成する）
品種Ｋ４３８１は、それぞれ葯培養によって得られた雌性の倍加半数体ＤＨ３６６／１と雄性倍加半数体ＤＨ０２／０４７との交配であり、全雄ハイブリッド品種である。ＤＨ０２／０４７は、他の基準の中で、漿果を産まなかったという理由から、このハイブリッドの親株として選択された。テストされたＤＨ０２／０４７によって作られた１９０を超える遺伝的に異なるハイブリッドについて、我々の育種データベースに着果の報告はなかった。Ｋ４３８１のような、倍加半数体×倍加半数体ハイブリッドの個体は。遺伝的に同一である。品種Ｋ４３８１は、２０の植物を４回（したがってｎ＝８０）の野外試験で栽培された。これらの８０の植物の中から、１つの完全な両全株が同定された。この１つの植物は、生育可能な種子を含んだ数百の漿果を産生したが、他のすべての個体は、漿果を全く産生しなかった。この両全性のオフ型株をマイクロサテライトマーカーについて分析したところ、この特定のＫ４３８１品種の参照個体と完全に同一であることを示した（結果は示していない）。結論として、この両全性個体は、この試験内の遺伝的不純物の結果ではなかった。ＧＤＳ遺伝子の突然変異がＫ４３８１両全株を生成したか否かを調べるため、このＫ４３８１両全株について、プライマー対ＣＮ８２／ＣＮ６７、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６９／ＣＮ８１を用いて配列を得た。これらのプライマーは、ＧＤＳ遺伝子の第１予測エキソン、予測イントロン１及びＧＤＳ遺伝子の第２予測エキソンに及ぶ。

参照ゲノムと比較して、すでに同定された多型が見出された。この多型は、６個でなく７個のチミンの区間を含み、スキャフォールド９０５（ゲノムバージョン２．０）の位置５０，９４１−５０，９４６に見いだされる予測イントロン１アクセプター部位に近く、例えば、超雄株１２＿２５、両全株５３７５、全雄ハイブリッドＫ３２３及び両全性変異体Ｋ３２３−Ｇ０３３のような同様のハプロタイプにも見出される。より重要なことに、一塩基多型（ＳＮＰ）が見出され、この点で両全性の個体Ｋ４３８１は、これまでに知られる配列決定されたすべてのハプロタイプと比較してユニークである。このＳＮＰは、配列番号１の位置１６６に対応する、第１予測エキソンにおけるシトシンからアデニンへの変化であり、これは、配列番号２の位置５６でのプロリンからスレオニンへのアミノ酸変化を導く。

この特定の突然変異は、非極性アミノ酸が極性アミノ酸に変化するものであるため、非保存的置換である。本実施例は、ＧＤＳ遺伝子におけるこの特定のアミノ酸変化が、雄株を、その雄性の祖先よりはるかに多くの漿果を産生する両全株へと変えるに十分であることを明らかに示す。

（実施例６）
（Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｔａｐｅｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ １のアスパラガスホモログは雄性アクチベーター遺伝子である）
雄性プロモーター遺伝子を単離するために、ＢｉｏＮａｎｏゲノムマッピング（ＢｉｏＮａｎｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）を適用することにより、Ｍ座位領域について更に調査を行った。この手法により、ＤＮＡ配列ゲノムスキャフォールド（伴性マーカーによりタグ付けされたスキャフォールドを含む）は、ＢｉｏＮａｎｏコンティグに配列され、１つのコンティグは、Ｍ座位に及ぶ可能性がある。新しいゲノム配列スキャフォールドが同定され、雌性リードが優性参照ゲノムにマップされないゲノムの一部にあるそれらのスキャフォールドのうち１つの上に、Ａｓ−ＴＤＦ１と相同である候補遺伝子が同定された。

雄株でのＴＤＦ１のヘミ接合の存在、その欠失変異体の表現型、及びＡＳ−ＴＤＦの下流の経路で働くことが予想されるメンバー遺伝子と相同なアスパラガス遺伝子の発現及びゲノムリードマッピングに関する研究は、ＡＳ−ＴＤＦ１が雄性刺激遺伝子であることを示している。

アスパラガス・オフィシナリスの遺伝子型ＤＨ００／０８６及びＤＨ００／０９４の高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。ＤＨ００／０８６は、（米国ジョージア州）アセンズのジョージア大学の、レーベンスマック研究所において、アスパラガスの参照ゲノムの作製に使用されている超雄株である。ＤＨ００／０９４は、二重ハイブリッド雄株であるＤＨ００／０８６の起源である同一のハイブリッドより、組織培養により得られる雌性倍加半数体である（Ｌｉｍｇｒｏｕｐ社、オランダ、ホルスト）。このために、新鮮な葉を、１０ｍＬのＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後、新たに調製したＴＥＮ／２％ホルムアルデヒド溶液で固定した。葉を非常に細かい断片に細断し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１５ｍＬのＩｓｏｌａｔｉｏｎ緩衝液（ＩＢ：１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１３０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、８％（ｍ／Ｖ）ＰＶＰ１０、ｐＨ９．４）中でインキュベートし、核を放出させた。２０ｍＬのパーコールの７５％ＩＢ／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液内で、２０００ＲＰＭで２０分間、密度勾配遠心分離を行うことにより、核を精製した。得られた安定化されたホモジネートを、ＩＢ／１．５％低融点アガロースと６０℃で穏やかに混合し、混合物を予め冷却したアガロースプラグ用モールド鋳型（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国カリフォルニア州、ハーキュレス）に流し込み、氷水上で１０分間かけて、アガロースマトリックスに包埋した。２２０μＬのプラグをリシスバッファー（１％サルコシル、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）に回収し、１度リシスバッファーを交換し、５０℃で１日放置した。ＴＥバッファー中でよく洗浄した後、６０℃で穏やかに溶かし、プラグあたり３単位のＧｅｌａｓｅ（商品名）を用いた１０〜２０分間のＧｅｌａｓｅ（商品名：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、米国ウィスコンシン州マディソン）処理により、ＨＭＷ ＤＮＡを回収した。ＣＨＥＦ電気泳動（ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国カリフォルニア州、ハーキュレス）による定量の前に、ドロップダイアリシス（ｄｒｏｐ ｄｉａｌｙｓｉｓ）により高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを洗浄した。平均して、１プラグあたり３〜４μｇの高分子量ＤＮＡが得られた。

ＨＭＷ ＤＮＡは、ＢｉｏＮａｎｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｉｏｎａｎｏ Ｇａｎｏｍｉｃｓ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）内で、同社保有のＩｒｙｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製パイプラインを用いて処理され、アスパラガス雄性及び雌性遺伝子のゲノムマップ（広域物理マップ、Ｂｒｏｗｎ著、２００２年の総説参照）が作製された。Ｉｒｙｓ法は、蛍光色素（ＩｒｙｓＰｒｅｐ（登録商標））によるＨＭＷ ＤＮＡ標識、ナノチャネル（ＩｒｙｓＣｈｉｐ（登録商標））内への単一分子の移動、ＣＣＤカメラによる色素分子の位置のスキャニング及びゲノムマップコンティグのデノボアセンブル及び可視化（Ｉｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）、Ｓｈｅｌｔｏｎ他著、２０１５年参照）技術を含んでいる。

概説すると、ＩｒｙｓＰｒｅｐ（登録商標）法のプロトコールにより、８μｇのＨＭＷ ＤＮＡを標識した。ＨＭＷ ＤＮＡは、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｐＱＩを用いて、ＧＣＴＣＴＴＣＮ／Ｎの位置にニックが導入された（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ＮＥＢ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）。ニックが導入されたＤＮＡは、Ａｌｅｘａ５４６−ｄＵＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）及びＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ社）を用いて標識された。標識後、ｄＮＴＰ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を加えることにより、ＤＮＡを連結した。標識したＤＮＡサンプルを、両方のフローセル内のそれぞれのＩｒｙｓＣｈｉｐ（登録商標）上にピペッティングした。Ｉｒｙｓ社の装置は、フローセル内のＤＮＡの動きを電気泳動的に制御している。直鎖化された分子は、Ａｌｅｘａ５４６の場合、緑色レーザーを用いてイメージングされた。自社のオートフォーカス機構を備えたＣＣＤカメラと制御ソフトウェアにより、高速でチップのスキャンを行った。次いで、個々の分子上の標識（Ａｌｅｘａ５４６）の位置を検出し、Ｉｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）パッケージを用いて解析した。標識された長鎖ＤＮＡ分子の画像生データは、モチーフ特異的な標識パターンのデジタル表現に変換される。まず、標識された長鎖ＤＮＡ分子の原画像データが、モチーフ特異的な標識パターンのデジタル表現に変換された。次に、相互の類似性について全分子マップをスコアし、ＲパッケージＦａｓｔｃｌｕｓｔｅｒ（Ｄａｎｉｅｌ Ｍｉｌｌｉｎｅｒ著、２０１３年参照）でクラスター化することにより、単分子Ｎｔ．ＢｓｐＱＩデータをクラスター化した。クラスターから、標識の位置をプロットした。最後に、Ｉｒｙｓｖｉｅｗ（登録商標）データ解析ソフトウェアを用いて、データをデノボアセンブルさせ、アスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０８６及びＤＨ００／０９４のオリジナル遺伝子の全ゲノムコンセンサスマップを再構築した。アスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０８６（雄性）に関し、８８Ｇｂ（７９Ｘ）のデータ（分子量＞１５０ｋｂ）が収集された。得られたＢｉｏＮａｎｏゲノムコンセンサス配列のサイズは１．２０５Ｇｂであり、１３６４のコンティグ配列を含んでいる。データのコンティグ配列は、コンティグのＮ５０が１．２４Ｍｂであることを示した。コンティグデータベースを、ＢＮＧ ＶＩ．０と呼び、個々のコンティグには、プリフィクス＜ＢＮＧ＞番号を付する。

Ｉｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）パッケージを用いて、ＮＧＳ（ＡＧＳ ＶＩ．１０）により得られたアスパラガスのスキャフォールド参照ゲノムを、ＢＮＧ ＶＩ．０コンティグとリンクさせた。まず、ＰＢＪｅｌｌｙ（Ｅｎｇｌｉｓｈ他著、２０１２年参照）というアルゴリズム及び関連するソフトウェアを用いて、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州）により得られたロングシーケンシングリードを配列させることにより、ＡＧＳ ＶＩ．１０を、ＡＧＳ ＶＩ．１０スキャフォールドにアップグレードした。ＰＢＪｅｌｌｙは、ロングシーケンシングリードをｆａｓｔａフォーマットで配列させ、ドラフトアセンブルを得るための高度に自動化されたパイプラインである。ＰＢＪｅｌｌｙは、捕捉されたギャップ（ＡＧＳ ＶＩ．１０中のＮ−ストレッチ）を補充又は低減し、アップグレードされたドラフトゲノムを生成する。概説すると、アスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０８６及びＤＨ００／０９４の高分子量（ＨＭＷ）ゲノムＤＮＡを前述の通り単離し、メーカー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州）の取扱説明書にしたがい、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリー作製のためのインプットとして使用した。ＨＭＷ ＤＮＡの標的サイズセレクション用のＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎシステム（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国マサチューセッツ州）を用いて、作製したライブラリーについて、２０Ｋｂを超える断片のサイズセレクションを行った。フロリダ州立大学バイオテクノロジー学際研究センター（ＩＣＢＲ、米国）所有のＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩシーケンサー上の２つのＳＭＲＴｃｅｌｌ内で、回収したフラクションのシーケンシングを行った。アスパラガス・オフィシナリスのゲノムの４．６Ｘカバレージに相当する約６．０７Ｇｂのロングリードシーケンスが生成された。図１６は、ＰａｃＢｉｏ実験において観測された長さの分布を示す。ＰＢＪｅｌｌｙは、北京ゲノム研究所（中華人民共和国、深川市）で動作させた。得られた参照ゲノムを、アスパラガスゲノムスキャフォールドＶ２．０（ＡＧＳ Ｖ２．０）と呼び、個々のスキャフォールドには、プリフィクス＜ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド＞番号を付する。アノテーションメタデータは、ＡＧＳ Ｖ２．０に基づくリレーショナルデータベース内に個別のファイルとして保存された。

２０Ｋｂよりも大きいＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールド（１，１１３Ｍｂを示す５１９８ ＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールド）を、インシリコでの、ＧＣＴＣＴＴＣＮ Ｎ位におけるニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｐＱＩの認識配列の検出による、ＢＮＧ ＶＩ．０コンティグへのマッピングに用いた。得られたＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドの物理マップ（Ｑｕｅｒｙ＿ｉｄ）は、ストリンジェンシーを標準に設定したＩｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）パッケージを用いて、ＢＮＧ ＶＩ．０物理マップ（Ａｎｃｈｏｒ＿ｉｄ）に配列させた。このソフトウェアは、Ａｎｃｈｏｒ＿ｉｄとＱｕｅｒｙ＿ｉｄとのマッチ（Ｍａｔｃｈ＿ｉｄ）を生成する。合計すると、２７２５のＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールド（５２％）が、８７５Ｍｂ（７９％）を示すＢＮＧ ＶＩ．０コンティグに配列された。得られた比較マップ（ｃｍａｐ）は、「Ａｓｐａｒａｇｕｓ．Ｖ２．０．ｇｅｎｏｍｅ．ｓｔａｂｌｅ＿ＢｓｐＱＩ＿ｒｅｓ２９＿ｔｏ＿２０１５０５０５＿ａｓｐａｒａｇｕｓ＿ＵＧＡ＿Ａｓｓｅｍｂｌｅ＿Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ｘｍａｐ」という名称で保存され、Ｉｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）パッケージを用い、比較マップモードでデータをハイライトさせることにより見ることができる。この環境下では、ｃｍａｐを様々な形態で可視化することができ、個々のＭａｔｃｈ＿ｉｄについて、Ａｎｃｈｏｒに関し、対応するＡｎｃｈｏｒ＿ｉｄ、ＡｎｃｈｏｒＳｔａｒｔ、ＡｎｃｈｏｒＥｎｄ、Ａｎｃｈｏｒ ｓｉｚｅ、Ｑｕｅｒｙ＿ｉｄ、ＱｕｅｒｙＳｔａｒｔ、ＱｕｅｒｙＥｎｄ及びＱｕｅｒｙ＿ｉｄの配向を列挙した表が含まれる。

表６１は、表３のＨＲＭマーカー等の遺伝マーカーに関する情報及び物理情報（ＢＡＣクローン、結果は示さない。）より検出されたアスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０８６（雄性）Ｖ２．０スキャフォールドに関する比較マップの結果をまとめたものである。第１列は、第３列の（伴性）遺伝マーカー情報及び対応するＢｉｏＮａｎｏ ＶＩ．０コンティグに基づく比較に使用したＡＳＧ Ｖ２．０スキャフォールドを示す。合計８つの対応するＢｉｏＮａｎｏコンティグ（ＢＮＧ７、ＢＮＧ２２、ＢＮＧ２８、ＢＮＧ５５、ＢＮＧ４３８、ＢＮＧ８３３、ＢＮＧ１０３０及びＢＮＧ１１３８）が検出され、これらのコンティグの間に物理的なオーバーラップがない列挙されたＢＮＧコンティグのニッキングデータの検査により確認された。これらのデータ（表６１）は、８つのコンティグは全てアスパラガス・オフィシナリスの染色体のＭ座位をカバーする領域にクラスター化することを強く示唆している。全ての８つのコンティグを、整列したＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドの配列内容及びＢＮＧ ＶＩ．０とＡＧＳ Ｖ２．０ ｃｍａｐの間の共線性について検査した。

ＢＮＧ２８は、塩基長３．４５Ｍｂであり、ｃｍａｐは、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５を含むＤＧＳと共に、伴性ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ２０６、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９４５、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ１９４、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ２０４、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９０５５３９及びＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ２３１２を含むＧＤＳと直線性を示す（図１７、表３）。これらのスキャフォールドの性別との関連性は、性別毎に分離した集団において、分子マーカーを用いて以前に実証されている（結果は示さない。）。それらのスキャフォールドの伴性を検査するために用いたマーカーを表３に示す。更に、４つのスキャフォールドＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド４３６、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド２５１０、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド３２９４及びＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド３７７９がＢＮＧ２８にマッチしたが、これらは以前に同定されなかった（表６１の第３列に「新規」と表示している。）。ＢＮＧ２８と１１の表示されたＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドとのｃｍａｐは、ＢＮＧ２８上でのスキャフォールドの線形順序、スキャフォールドの配向及び５つのスキャフォールドのキメラ性を明らかにした。キメラ性は、次世代シークエンシング及びゲノムアセンブリで使用される元のゲノムＤＮＡ配列を反映していない、アスパラガス・オフィシナリスＶＩ．１０及びＶ２．０のスキャフォールドにおける１つ以上の配列アセンブリの接合として定義される。結果として、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ２０６、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ４３６、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９４５、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ１２０４及びＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ２３１２がキメラ性であることが判明した。これは、ＪＢｒｏｗｓｅ環境（ＪＢｒｏｗｓｅ １．１．１６、Ｓｋｉｎｎｅｒ他著、２００９年参照）におけるＤＨ００／０９４リシークエンシングデータの雌性リードの存在（ＭＳＹではない）又は非存在（ＭＳＹ）によって確認された。ＭＳＹは、Ｙ染色体の雄性特異的領域ゲノムセグメントを意味し、ゲノムセグメントが雄性特異的であることを明確にするために、ヒト遺伝学から借用した用語であり（しかし、パパイヤ等の雌雄異株植物にも適用される。Ｙｕ他著、２００９年参照）、シーケンシングされた雌性から得られたリードは、雄性参照ゲノムのそのような領域にマッピングされたリードを示さず、したがって欠損していることを意味する。

ＢＮＧ２８以外のｃｍａｐとマッチし、伴性であることが知られている、表６１内の残りの７つのＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドについても、それらのスキャフォールド内のキメラ性及び遺伝的マーカー配列の位置について検査した。７つのスキャフォールドのうち、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９９７及びＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ１１６６がキメラ性であることが判明した。これらのスキャフォールドの非マッチング配列を抽出し、１，１１３Ｍｂを表すＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドについて述べたのと本質的に同様に、ＢＮＧ ＶＩ．０コンティグへの新規マッピングにおいて使用した。その結果、ＢＮＧ２２２とマッチせず、伴性マーカー（データは示さず）を含むＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ９９７の領域＝１．．１４０，０２２は、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ４３６の非共線性領域とオーバーラップする１，０９３，８０１．．１，１６９，９１３位で、ＢＮＧ２８にマッピングされた。ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿Ｓｃａｆｆｏｌｄ１１６６の非マッチング配列は、ＢＮＧ３７に配列される。

ＢＮＧ２８と厳密に共線性を示す全てのＡＧＳ Ｖ２．０ ｃｍａｐ領域を抽出し、ＡＵＧＵＳＴＵＳ Ｇｅｎｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｈｏｆｆ他著、２０１３年参照）に使用するか、又はＪＢｒｏｗｓｅ環境下、手動で検査した。翻訳されたアノテーションは、Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＤＳの翻訳結果の非重複タンパク質配列（ｎｒ）のデータベース及びデータベースＰＤＢ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＰＩＲ及びＰＲＦ内の環境サンプルを除くタンパク質配列を用いた、ＷＧＳプロジェクト提供の配列ソフトウェアＢＬＡＳＴＰプログラムＢｌａｓｔ２．３．０（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｏｒｇ、２０１５年１０月アップデート、バージョン２１０）のクエリーとして使用された。配列は、複雑性の低い配列がフィルタリングされたＶｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ［ＯＲＧＮ］のものに限定した。他の設定は全てデフォルトのままとした。得られたＢＬＡＳＴスコアをフィルタリングし（ｅ値＜１Ｅ−４０）、Ｊ−Ｂｒｏｗｓｅ内で、ミスアノテーション及び雌性ＤＨ００／０９４ｅのリードのカバー率を手動で選別した。雌性の抑制に関与していることが証明されたＤＵＦ２４７遺伝子モデルに次いで、今回ＧＤＳ遺伝子と命名された、雄株、雌株及び両全株の花の発達の運命に関与している可能性のある他の２つの遺伝子モデル（予測：シロイヌナズナ由来脂質輸送タンパク質（ＬＴＰ１）、遺伝子モデルＡｔ２Ｇ３８５４０がＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド９０５上に、予測：転写因子ＭＹＢ３４［ナツメヤシ］が、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド４３６上の、ＢＮＧ２８の領域＝３８０，０００．．４９６，１６７と共線性を示す部分）に見つかった。ＬＴＰ１遺伝地図は、ＤＵＦ２４７遺伝子モデルの遠位側のＢＮＧ２８〜２８０Ｋｂに線形順序でマッピングされ、現在はＧＤＳ遺伝子と命名されており、これらの２つの遺伝子モデルの間の情報マーカーを用いた遺伝子マッピング実験は、ＬＴＰ１が完全に伴性でないことを示す（Ｌｉｍｓｅｅｄｓ社、オランダ、ホルスト）。ＭＹＢ３４関連遺伝子モデルは、現在ＧＤＳ遺伝子と呼ばれるＤＵＦ２４７遺伝子モデルの近位側の約６００Ｋｂである。いくつかの研究は、ＭＹＢクラスの転写因子が、発達過程及び一般的なストレス応答に関与する経路の重要な調節因子であることを示しているので、ＭＹＢ３４関連遺伝子モデルについて更に検討した。ＭＹＢ３３、ＭＹＢ３５、ＭＹＢ６５及びＭＹＢ１０３は、胚の発達の後期段階、より正確には、早期微小胞子発生におけるタペートの発生と記載される段階に関与する遺伝子調節ネットワークにおいて作用する転写因子である（Ｊｕｎ Ｚｈｕ他著、２００８年、Ｈａｒｋｅｓｓ他著、２０１５年、Ｃｉ−Ｆｅｎｇ Ｃａｉ他著、２０１５年参照）。ＭＹＢ３４関連遺伝子モデルを、数種類の遺伝子特異的プライマーを用いたサンガー配列決定によって検査し、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用したギャップのデノボアセンブリを用いて、１つのＮ−ストレッチを充填することができた。１つの反転反復配列をアセンブリから削除した。再構成されたＭＹＢ３４関連遺伝子モデルは３つのイントロンを有し（図１８参照）、３１Ｋｄａｌの２７６ＡＡタンパク質をコードする（図１９参照）。全ての非冗長ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ変換のデータベースを使用して、ＢＬＡＳＴＰでクエリーとして再使用する際には、ＳｍａｒｔＢｌａｓｔオプションが使用された。ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ環境のＳｍａｒｔＢｌａｓｔオプションは、複数の配列アラインメントと保存されたタンパク質ドメインに基づく系統関係を示す、よく研究された参照種からの２つの最良のマッチと共に、配列データベースにおける最良のマッチの簡潔な要約を返す。ＳｍａｒｔＢｌａｓｔを通常の設定で用いた場合、出力は、タンパク質ＤＥＦＥＣＴＩＶＥ ＩＮ ＭＥＲＩＳＴＥＭ ＤＥ ＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ １（シロイヌナズナ）、予測：ｍｙｈ−関連タンパク質３０８（ヒヨコマメ）、予測：転写因子ＭＹＢ３５様タンパク質（ダイズ）、予測：転写因子ＭＹＢ７６（ハス）、予測：転写因子ＭＹＢ３４（ナツメヤシ）であった。シロイヌナズナＤＥＦＥＣＴＩＶＥ ＩＮ ＭＥＲＩＳＴＥＭ ＤＥ ＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ １は、ＭＹＢ含有遺伝子ファミリーのＭＹＢ３５サブクラスに属し、２つのＤＮＡ結合性ＳＡＮＴスーパーファミリードメイン（Ｒ２Ｒ３サブクラスとも呼ばれる）によって特徴付けられる。結合は、Ｇ／Ｃリッチなモチーフ［Ｃ２−３Ａ（ＣＡ）１−６］を含む反復配列に依存する。このドメインは、植物界でのみ、ＤＮＡを結合する、転写抑制因子の一部として見出される（Ｊｕｎ及びＭａｒｔｉｎ著、１９９９年の総説参照）。シロイヌナズナＤＥＦＥＣＴＩＶＥ ＩＮ ＭＥＲＩＳＴＥＭ ＤＥ ＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ １遺伝子の欠損は、単一突然変異株及びそれから誘導されたマッピング集団（Ｊｕｎ Ｚｈｕ著、２００８年参照）を用いてマッピングベースでクローニングされ、シロイヌナズナにおける小胞子成熟のための葯の発達及びタペートの機能におけるその重要な役割を示すＤｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｔａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １（ＡＴＨ ＴＤＦ１）と再命名された。また、クエリーとして使用されるアスパラガス・オフィシナリスＭＹＢ３４様遺伝子は、転写因子のＭＹＢ３５クラスに属し、ＡＴＨ ＴＤＦ１とのＳＡＮＴスーパーファミリードメインにおける高い配列同一性を共有する。したがって、ＭＢＹ３４様遺伝子モデルは、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様と再命名された。ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様において、ＳＡＮＴスーパーファミリードメインは、１６（Ｈ）から６０（Ｙ）及び７６（Ｆ）からＫ（１５１）の２箇所に見出される。ＭＹＢ３５関連タンパク質のメンバーは、３００〜３５０アミノ酸からなり、一方、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様は２７６アミノ酸からなり、これらのタンパク質は、Ｎ末端のＳＡＮＴスーパーファミリードメイン構成において高い同一性を有し、配列相同性は、タンパク質のＣ末端に向かって低くなる。ＡＴＨ ＴＤＦ１タンパク質をＡＧＳ Ｖ２．０においてクエリーとして用いた場合、ｔＢＬＡＳＴＮの出力は、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド４３６、次にＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド１２２０の２つの顕著なヒットを有しており、後者は、高度に保存された第１のＳＡＮＴスーパーファミリードメインにおいて相同性がより低い（７８％に対し５２％、図２０参照）。

このようにして、機能的ＴＤＦ１遺伝子を欠く雄性不稔植物を得ることができるか否かを調べるために、新たな照射実験を行った。

倍加半数体間の交配に由来するため、種子ロットごとに遺伝的に類似した個体を産生すると思われるＫ１１５０、Ｋ３２３及びＫ１１２９と命名された３つの異なる全雄性ハイブリッドの種子ロットへの、３００グレイ（ｎ＝１，１００個の種子）及び６００グレイ（ｎ＝１３，０００個の種子）のコバルト６０源からの照射を、実施例２で説明したような手順で行った。

これらのハイブリッドの花粉親植物は、他の基準以上に、実質的に果実を産生することができなかったという理由で選択された。Ｋ１１２９は、かつて、合計６株のうちの１つが、１年間に数本の果実を散発的に産生したが、これらの植物は、それ以上調査されていない。Ｋ３２３及びＫ１１５０は、複数回の実験において、果実を産生しなかった。

これらの種子から栽培された植物は、苗木トレイで栽培され、そこから植物は最終的にトルジョ（ペルー）付近の評価圃場に移植された。特定のハイブリッドは、過去の評価の間に確認されたように、数年にわたって種子を自発的に産生する傾向がないため選択された。したがって、植物上で生産された任意の果実は、果実を産生するこの能力を引き起こす突然変異を示すものである。照射処理後生存した２４，０００の種子から得られた６，６８０株の植物について、１０ヶ月の植物の生育後に、果実のセットについて検査し、その４ヶ月後に、６〜８週間後（２０１５年１１月〜１２月）に見られる新たな開花及び／又は果実を得るために、現地のアシスタントにより３回にわたってファーンの切断が行われた。これらの植物の多くは３００グレイの線量に由来するもので、６００グレイの線量については、照射された１３，０００個の種子のうち、処理後も生存したものは１４９２株のみであった。１６株の植物が、少なくとも１つの分岐から果実が産生できることが見出された。形成された果実の数は、１株あたり１〜１７４個にわたっていた。しかし、果実に損傷を与え、果実の発育不全を引き起こすＣｉｔｒｕｓ ｇａｌｌ ｍｉｄｇｅ（Ｐｒｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｌｏｎｇｉｆｉｌａ Ｇａｇｎｅ）に植物がひどく感染し、果実の発育停止を引き起こしたため、植物に見いだされた果実の数は、雌花の受精能の定量的尺度として解釈することができなかった。結論として、複数の果実の存在は、雌花の受精能の定性的な指標であった。１６株のうち、果実を産生能を有する１株（Ｋ１ １５０−６００−１）は２つの雌花を有していた。２番目の茎において、Ｋ１ １５−６００−１及びＫ３２３−６００Ａ６の両者の写真を撮影することができたが、ファーンの切断後に、その成長を保持しなかった欠失（Ｋ１ １５０−３００−１２）を示す第３の植物の撮影はできなかった。しかし、これらに由来するＦ１植物は、さらなる分析のために現在温室内で栽培中である。

果実産生能を有する植物の鋳型ＤＮＡ及びいくつかの果実産生能を有しない雄性参照植物のＤＮＡを、プライマーペアＣＰ３１／ＣＰ３２、ＣＰ３３／ＣＰ３４、ＣＰ３５／ＣＰ３６、ＣＰ３７／ＣＰ３８、ＣＰ３９／ＣＰ４０、ＣＰ４１／ＣＮ７２を用い、雌性抑制遺伝子又はＧＤＳ遺伝子に関連するＤＵＦ２４７を含むＭ座位をターゲットとする高分解能融解曲線分析（基本的に、Ｇａｄｙらによって２００９年に記載されたガイドラインにしたがって実行した。）に用いた。これらのプライマーを表３に示す。断片は、Ｍ座位に関連する雌蕊発達抑制因子（ＧＤＳ）遺伝子の変異の指標である、融解曲線の相違について解析された。分析された１６の植物のうち３つについて、断片を増幅することができないか、又は野生株の融解曲線に対し大きく異なるように見える融解曲線の形状を示したと思われる。このことは、これらの３つの植物において、Ｍ座位に連鎖する雌蕊発達抑制因子（ＧＤＳ）遺伝子を含む真正のＤＵＦ２４７の増幅に必要な鋳型ＤＮＡが欠失していることを示唆した。この仮説の検証のために、Ｋ１ １５０−６００−１、Ｋ３２３−６００Ａ６及びＫ１ １５０−３００−１１についての、実施例２に記載の方法による、大規模並列シーケンシングを用いてゲノムＤＮＡの配列決定を行った。Ｊ−Ｂｒｏｗｓｅを用いて検査したリードのマッピングは、特にヘミ接合Ｍ座位領域において、天然型の雌性と同様、雌性のリードが欠失していることを示した。ヘミ接合Ｍ座位に隣接する領域では、欠失が染色体のヘテロ接合部分と重複する場合に、ヘテロ接合性の喪失が見られる。作成された欠失部位の正しい境界の決定は継続中である。

雌株についても、Ｍ座位連鎖雌蕊発生抑制遺伝子ＧＤＳの自然な欠損が、種子ロットで非常に小さい（しかし無視できない）確率で、自発的に起こりうると予想されたので、植物の遺伝的純度を分析した。これらの個々の植物から得られた鋳型ＤＮＡについて、１４個の独自のマイクロサテライトマーカー（Ｃａｒｕｓｏ他著、２００８年に概説されたものと同様の設計、使用及び識別力を有し、事実、ＡＯ１１０はマーカーＣＶ２９１８９０である）及び７つの独自の高分解能融解曲線ＳＮＰマーカーを用いるマイクロサテライト分析を行い、果実を着けることが可能な１６株の植物のうち１４株が、確かにこれらのハイブリッドが属する真正な代表であることを示した。２株の他の植物は、偏ったマイクロサテライト遺伝子型を示した。これらの植物の１株は、１４の全てのマイクロサテライト座位及び５つのＳＮＰマーカー座位において異なる対立遺伝子を示し、このため、確実にハイブリッドの真正のメンバーではなかった。別の植物は、Ｍ座位領域に連鎖することが知られているＡＯ０２２マイクロサテライトマーカーの父性対立遺伝子の欠失という注目すべき例外を除いて、属している特定のハイブリッドに対して期待される全てのマイクロサテライト対立遺伝子を示した。伴性座位ＡＯ０２２の父性対立遺伝子の典型的な単一の欠失は、コバルト６０照射の結果として失われるべき染色体部分の欠失を示すと予想される。このセグメントは、少なくともその特定の植物にとっては、上昇するＭ座位連鎖雌蕊発達抑制因子（ＧＤＳ）遺伝子とマイクロサテライトマーカー座位ＡＯ０２２との間の領域に及ぶ必要がある。

突然変異体及びそれらの対照ハイブリッドの真正性を確認するために用いたマイクロサテライト解析の概要を図２１に示す。

ＧＤＳ遺伝子断片が欠失した全ての植物を、Ｍ座位に遺伝的に近接しているか、又はＭ座位領域に位置していることが知られているゲノムスキャフォールドを標的とするマーカー処理に供した。

これらのプライマーは、ＣＫ６３／６４、ＣＭ４５／４６、ＣＮ９６／９７、ＣＭ９８／９９、ＣＱ３１／３２、ＣＴ１３／１４、ＣＥ４０／４１及びＣＥ６４／ＣＥ６６（表３参照）であった。図１７は、Ｍ座位領域にマッピングすることができるスキャフォールド（又はスキャフォールドの一部）の概略を示す。マーカーが有益であるかどうかによって、欠失していることが既に分かっている雌蕊発生抑制因子遺伝子とは別に、染色体断片のどの部分が、果実を産生することができる照射植物においてさらに欠失しているのかが示される。

突然変異事象により果実の産生が可能となる３つの植物は、ＧＤＳ遺伝子の発達及びタペータム発達及び機能遺伝子（ＴＤＦ１）の欠失が位置する染色体セグメントを欠いていると思われる。前に指摘したように、これらの３つの植物のうち２つの花は検査され、完全に発達した雌蕊を有し、更に葯を有しない花を有する雌性植物であることが証明された。これは、雄性植物が、そのＧＤＳ遺伝子及び雄性刺激因子の両方の切除又はタペータム発達遺伝子（ＡＳ−ＴＤＦ１）欠損性アスパラガスによって雌性植物に変換され得るという証拠を提供する。当業者は、これらの遺伝子の両方の雌性植物への導入を含む逆の効果が、雄性植物への変換になりうることを理解するであろう。また、当業者は、タペータム発達及び機能遺伝子（ＴＤＦ１）に欠陥を導入するだけでなく、雌性植物にＭ座位連鎖雌蕊発達抑制因子遺伝子を含むＤＵＦ２４７ドメインを含ませないことによっても、雌雄植物が雌雄同株植物に変換されることを理解するであろう。雄性刺激因子としてのＴＤＦ１遺伝子を支持する別の独立した強力な証拠は、伴性を示す全ての遺伝子における遺伝子発現の分析である。倍加半数体マッピング集団の７２個の個体を用いて構築された約３２０万個のＳＮＰ遺伝地図により、３７０個のアノテーション付き遺伝子モデルを含むＹ染色体上の抑制された組換え領域の範囲を定めた。この抑制組換え領域（Ｍ座位領域）内の全３７０遺伝子の正規化された遺伝子発現値を計算することにより、我々は、４つのＸＸ雌性ライブラリーの少なくとも３つにおいて、１ＦＰＫＭ未満の発現値を有する１１遺伝子と、遺伝子を非発現であると判定するために適切なカットオフを最初に同定した。これらの１１遺伝子のうち、我々は、ガンマ線照射されたＤＵＦ２４７雌性抑制遺伝子及び１０の推定上の雄性促進候補遺伝子を同定する。候補遺伝子について、まず、１）雌性ライブラリーでの発現、２）常染色体上の重複遺伝子の存在、３）遺伝子アノテーションの欠如（誤ったアノテーション付きレトロトランスポゾン）、４）モデル系における遺伝子発現及びノックアウト表現型に基づき、客観的に刈り込みを行った。Ｈａｒｋｅｓｓら（２０１５年）の研究より、雄性及び超雄性ライブラリー（雄性８９株、雄性９株、超雄性８９株、雄性１０３株）のうち４株のみは、繁殖系統間の生殖発生の変動の結果として、雄性生殖遺伝子の発現が増大していた。これらの４つのライブラリーにおいて、１０の推定候補遺伝子の３つ、脂質移動タンパク質ＤＩＲ１、タペータム機能不全１ ＴＤＦ１及びエキソポリガラクツロナーゼタンパク質が一貫してアップレギュレーションされていることを示している。ＬＴＰ１遺伝子は、繁殖集団（ＣＮ９４／ＣＮ９５−ＨＲＭ、プライマーは表３参照）において組換えられたことが見出された。エキソポリガラクツロナーゼは、葯活性にのみ緩やかに関連しており、アスパラガスのマルチ遺伝子ファミリーの一員であり、遺伝子コピー間の高い類似性のためにＲＮＡ−ｓｅｑリードが誤って整列される可能性を生じる。一方、ＴＤＦ１遺伝子は、アスパラガスゲノムにおいて単一コピーであり、Ｙ染色体上のこの組換え抑制領域にのみ存在する。

ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様が雄性アスパラガス・オフィシナリスにのみ存在し、したがって雌性アスパラガス・オフィシナリスには存在せず、単一コピーの遺伝子モデルであり、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド９０５からＤＵＦ２４７と呼ばれる雌性抑制因子遺伝子のすぐ近傍にあり、いくつかのＤＮＡマーカー（例えば、ＣＥ６４／ＣＥ６６−ＨＲＭ、表３）に遺伝的に隣接し、雄株及び超雄株においてより高いレベルで発現するという事実は、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様が性染色体の起源に関する２遺伝子モデルによって予測される雄性促進遺伝子であることの強力な証拠となる（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ及びＣｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ、１９７９年参照）。

この遺伝子を、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１と呼ぶ。

タペータムの発達ための遺伝的経路は、シロイヌナズナとイネの間の類似性を考慮すると、一般に保存されている（Ｃａｉ他著、２０１５年及び参考文献参照）。

これは、胞子体壁の分化、タペータムの特殊化、減数分裂及び花粉の成熟並びにこれらの過程の重要な調節因子等、葯の発達の重要な事象の両方の場合についてあてはまる。シロイヌナズナ及びイネでは、タペータムの発達及び機能に不可欠な転写因子（ＴＦ）が同定されている。シロイヌナズナの場合、これらには、ｂＨＬＨファミリーのメンバーであるＤＹＳＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＴＡＰＥＴＵＭ（ＤＹＴ１）及びＡＢＯＲＴＥＤ ＭＩＣＲＯＳＰＯＲＥＳ（ＡＭＳ）、Ｒ２Ｒ３ ＭＹＢ ＴＦ、ＤＥＦＥＣＴＩＶＥ ｉｎ ＴＡＰＥＴＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ａｎｄ ＦＵＮＣＴＩＯＮ（ＴＤＦ１）及びＭＳ１８８／ＭＹＢ０及びＰＨＤ−フィンガータンパク質ＭＡＬＥ ＳＴＥＲＩＬＩＴＹ（ＭＳＩ）が含まれる。これらの転写因子のイネホモログには、ＵＮＤＥＶＥＬＯＰＥＤ ＴＡＰＥＴＵＭ（ＵＤＴ１）、ＴＡＰＥＴＵＭ ＤＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＲＥＴＡＲＤＡＴＩＯＮ（ＴＤＲ１）、ＯｓＴＤＦ１、ＯＳＭＹＢ１０３／ＯｓＭＹＢ８０及びＰＥＲＳＩＳＴＥＮＴ ＴＡＰＥＴＵＭ ＣＥＬＬ１（ＰＴＣ１）が含まれる。これらの制御因子は、ＤＹＴ１ ＵＤＴ１→ＴＤＦｌ／ＯｓＴＤＦｌ→ＡＭＳ／ＴＤＲ→ＭＳ１８８／ＯｓＭＳ１８８→ＭＳ １ ＰＴＣ１という遺伝経路を形成しており、ＴＤＲは、ｂＨＬＨファミリーの他の２つのメンバーと相互作用している（ｂＨＬＨ １４２及びＥＡＴ１、Ｃａｉ他著、２０１５年参照）。シロイヌナズナ及びイネの両者において、ＤＴＹ１ ＵＤＴは、花粉壁の発達に関する全ての下流遺伝子の発現を、主にＴＤＦ１／ＯｓＴＤＦ１を介して制御している。ＡｓＯｆ ＴＤＦ１が、アスパラガス中の雄性プロモーターであることを支持するための遺伝子発現データを用いた２つの検証として、伴性を示す全ての遺伝子を分析する前進遺伝的アプローチ及びシロイヌナズナ及びイネの主要な調節因子のアスパラガスホモログの発現を分析するために、上記の保存された遺伝子経路を用いた逆遺伝学的アプローチを実施した。

最初のアプローチ（Ｈａｒｋｅｓｓ他著、２０１５年に記載されている）では、アスパラガス・オフィシナリスＤＨマッピング集団（Ｌｉｍｇｒｏｕｐ社、オランダ、ホルスト）の７２個の個体を用いて構築された約３２００万の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝地図が、３７０個のアノテーション付き遺伝子モデルを含む性染色体のＹ染色体特異的領域上で抑制組換領域の境界を定める。この抑制組換領域内の全３７０遺伝子の正規化された遺伝子発現値を計算することにより、ＤＨ雌性系統において、ＤＵＦ２４７雌性抑制遺伝子（ＳＧＤ遺伝子（配列番号１及び配列番号３と同一））及び１０個の推定雄性促進候補遺伝子の１１遺伝子が発現されなかった。候補遺伝子は、まず、常染色体上の重複遺伝子、遺伝子アノテーション（すなわち、ミスアノテーションされたレトロトランスポゾン）の欠如、及びシロイヌナズナ及びイネにおける遺伝子発現及びノックアウト表現型についての重複遺伝子の存在に基づいて客観的に刈り込まれた。Ｈａｒｋｅｓｓら（２０１５年）は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験（雄性８９株、雄性９株、超雄性８９株、雄性１０３株）で使用される雄性及び超雄性サンプルのうち４つのみが、繁殖系統間の生殖発生の変異の結果であると思われる、異なる雄性生殖遺伝子発現を示すと説明している。結果は、ＬＩＰＩＤ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＩＲ１ ＬＴＰ１、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１（配列番号４）及びエクスポリガラクツロナーゼタンパク質のアスパラガスホモログである１０の推定上の候補遺伝子の３つが一貫してアップレギュレーションされていることを示す。エキソポリガラクツロナーゼは、葯の活性に緩やかに関連しており、アスパラガスのマルチ遺伝子ファミリーに属し、遺伝子コピー間の高い類似性に起因するＲＮＡ−ｓｅｑリードの誤整列の可能性を生じさせる。これらの結果は、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１が雄性特異的な遺伝子発現に関与していることを示している。

第２のアプローチにおいて、アスパラガスゲノムスキャフォールドＶ２．０（ＡＧＳ Ｖ２．０）及びアノテーションメタデータにおける候補同族遺伝子モデルを分析するために、タペータム発達のための保存された遺伝子経路における主要調節因子のシロイヌナズナ及びイネ配列を使用した。このために、ｔＢＬＡＳＴＮを、ＡＧＳ Ｖ２．０のＢＬＡＳＴデータベース及びＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｔｒｉｎｉｔｙ デノボアセンブリのクエリーとしての主要調節因子のタンパク質配列を用いて使用した。有意な類似性スコアを有する戻された配列を、シロイヌナズナ及びイネのＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースにおけるクエリーとしての候補の翻訳を用いて、標準設定でＢＬＡＳＴＰによって検査及び評価した。

ＤＹＴ１ ＵＤＴ１については、ＡＧＳ Ｖ２．０では有意なｔＢＬＡＳＴＮヒットは検出されず、Ｔｒｉｎｉｔｙアセンブリでは１つの関連するヒットであるｃｏｍｐ６４６１９＿ｃ４＿ｓｅｑ３ ｏｆ ８４７ｎｔ、配列番号１０が検出された。

（配列番号１０：ｃｏｍｐ６４６１９＿ｃ４＿ｓｅｑ３ ｏｆ ８４７ｎｔ）
ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＧＣＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＴＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＡＣＴＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＡＡＧＣＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡＣＡＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡＡ

ＢＬＡＳＴＰにおいてクエリーとして使用される場合、最上位のスコアリング配列は、シロイヌナズナのＡＭＳ／ＴＤＲ１及びＴＦ ＳＣＲＥＡＭ２のｂＨＬＨドメインを含む。ＤＹＴ１／ＵＤＴ１は、使用された雄性データベースにおいて有意な相同配列を有しないと結論された。

ＴＤＦ１／ＯｓＴＤＦ１については、相同なゲノム配列は以前に記載されており、配列番号に見出すことができる。雌性配列は存在せず、発現は雄性においてのみアップレギュレートされている（Ｈａｒｋｅｓｓら、２０１５年及び個人観察、Ｌｉｍｇｒｏｕｐ社、オランダ、ホルスト）。

ＡＭＳ／ＴＤＲ１では、ＡＧＳＶ２．０：ＡｓＯｆ Ｖ２．０スキャフォールド２８００の位置１２１０５５．．１２１７３５に、同一性７３／２２７（３３％）及び陽性９８／２２７（４４％）で、１つのｔＢＬＡＳＴＮ配列が見出された。ＡＭＳ／ＴＤＲ１予測ｃＤＮＡは、配列番号７に示されている。

（配列番号７）
ＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＡＣＧＣＡＣＡＡＧＴＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＡＧＧＧＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＡＧＴＴＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＡＴＧＣＡＡＣＧＧＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＡＣＧＣＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＣＧＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＣＣＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＴＡＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＴＴＴＡＧＴＡＣＴＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＡＴＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＣＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＡ

アライメントの検査は、スコアが、保存されたｂＨＬＨファミリードメインにおけるアライメントの結果であることを示した。この配列は、Ｈａｒｋｅｓｓらによって記載されたＡＭＳ関連配列とは異なっていた（Ｈａｒｋｅｓｓ他著、２０１５年）。この研究では、ＡＭＳ候補ＲＮＡは、ＡＭＳ／ＴＤＲ１様配列に対して予測されるように、雄株においてのみダウンレギュレーションされていた。

ＡｓＯｆ Ｖ２．０スキャフォールド２８００雌性リードの検査では、参照雌株ＤＨ００／０９４及び４株の倍加半数体の雌株のリードのカバー率は、ＡＭＳ遺伝子が雌株において欠失していないことの指標であるリードカバレッジ（結果は示さず）の有意な減少を示さなかった。

ＭＳ１８８／ＯｓＭＳ１８８については、ＡＧＳ Ｖ２．０：ＡｓＯｆ Ｖ２．０＿スキャフォールド３３２０の位置１０７５９８．．１０６４４４ ｒｅｖにおいて、ｔＢＬＡＳＴＮを用いて、１つの非常に重要な配列が見出された。配列ＭＳ１８８／ＯｓＭＳ１８８の予想されるｃＤＮＡを配列番号８に示す。

（配列番号８）
ＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＣＡＣＡＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＧＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＡＡＣＧＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＣＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＴＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＴＡＣＧＡＧＧＧＡＣＣＡＴＣＧＴＡＴＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＴＧＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＧＴＡＴＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＧＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＧ

検査の結果、ＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースにおいてＢＬＡＳＴＰを用いたアスパラガスホモログ遺伝子モデルに対する両方のタンパク質配列のほぼ完全なアラインメントは、シロイヌナズナＭＳ１８８及びＯｓＭＳ１８８が最高スコアのヒットとして返すことが示された。さらに、ＡｓＯｆ Ｖ２，０＿スキャフォールド３３２０は、雌株特異的なリードマッピングによって十分にカバーされており、この非伴性連鎖遺伝子モデルのために、雄株及び雌株の両者について遺伝子発現を分析することを可能にする。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、遺伝子モデルについての厳密な雄株に偏向した発現を示し、すなわち、リードマッピングは雌株発現データには存在しない。上述のＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて、異なるアスパラガスの遺伝子型及び特定の発達段階から得られた花芽における全ゲノム遺伝子発現が研究されたものを含む。これらのデータから、アスパラガスＭＳ１８８／ＯｓＭＳ１８８様遺伝子モデルは、減数分裂前段階で制限された雄性表現型においてのみ発現されると結論された。減数分裂前段階における遺伝子モデル及び時空間発現は、ＭＳ １８８及びＯｓＭＳＩＳＳデータによく一致する（Ｇｕ他著、２０１４年、Ｃａｉ他著、２０１５年参照）。したがって、この遺伝子モデルはＭＳ１８８／ＯｓＭＳ１８８のアスパラガスホモログであると結論付けられた。遺伝子を、ＡｓＯｆ ＭＳ １８８と呼ぶ。

ＭＳ１／ＰＴＣ１について、データはＡｓＯｆ ＭＹＢ１８８のデータと同様である。ＡＧＳ Ｖ２．０：ＡｓＯｆ Ｖ２．０ スキャフォールド２４２１の１３３６０１．．１３４３４１位において、ｔＢＬＡＳＴＮを用いて有意なヒットが返された。予測されるｃＤＮＡ配列ＭＳ１／ＰＴＣ１は、配列番号９に示されている。

（配列番号９）
ＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＴＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＣＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＡＣＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＴＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＡＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＣＣＡＴＡＧＣＣＧＡＣＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＡＴＴＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＧＧＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＧＡＣＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＧＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧＴＧＡＴＴＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＣＣＴＡＴＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＧ

検査の結果、ＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースにおいてＢＬＡＳＴＰを用いたアスパラガスホモログ遺伝子モデルに対する両方のタンパク質配列のほぼ完全なアラインメントは、最高スコアのヒットとして、シロイヌナズナＭＳＩ及びＰＴＣ１（Ｏｓ０９ｇ０４４９０００）を返すことが示された。さらに、ＡｓＯｆ Ｖ２，０＿スキャフォールド２４２１は、雌株特異的なリードマッピングによって十分にカバーされており、この非伴性連鎖遺伝子モデルのために、雄株及び雌株の両者について遺伝子発現を分析することを可能にする。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、遺伝子モデルの４つのエキソンの全てについて厳密な雄株に偏向した発現を示し、すなわち、リードマッピングは雌株発現データには存在しない。いくつかの特異的なリードマッピングは、雄株と雌株の両方で起こる。上述のＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて、異なるアスパラガスの遺伝子型及び特定の発達段階から得られた花芽における全ゲノム遺伝子発現が研究されたものを含む。これらのデータから、アスパラガスＭＳ １ ＴＣＰ １様遺伝子モデルは、減数分裂前段階で制限された雄性表現型においてのみ発現されると結論された。減数分裂前段階における遺伝子モデル及び時空間発現は、ＭＳＩ及びＰＣＴデータによく一致する（Ｇｕ他著、２０１４年、Ｃａｉ他著、２０１５年参照）。したがって、この遺伝子モデルはＭＳ１／ＰＣＴ１のアスパラガスホモログであると結論付けられた。遺伝子を、ＡｓＯｆ ＭＳＩと呼ぶ。注目すべきことに、ＡｓＯｆ ＭＳ １の雄株に偏向したＲＮＡ−ｓｅｑリードマッピングは、９Ｍ系列には存在しない（Ｌｉｍｇｒｏｕｐ社、オランダ、ホルスト）。これは、特定の段階でサンプリングされた花芽の量が少ないためであった。結論として、制御ネットワークが下記のとおり明らかになった。

ＤＹＴ１／ＵＤＴ（信頼性のある予測は存在しない）→ＴＤＦ １／ＯｓＴＤＦ １／ＡｓＯｆ ＴＤＦ １→ＡＭＳ／ＴＤＲ１（？）→ＭＳ １８８／ＯｓＭＳ １８８／ＡｓＯｆ ＭＳ １８８→ＭＳ １ ＰＴＣ １／ＡｓＯｆ ＭＳ １

ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様が雄性アスパラガス・オフィシナリスにのみ存在し、したがって雌性アスパラガス・オフィシナリスには存在せず、単一コピーの遺伝子モデルであり、ＡｓＯｆ＿Ｖ２．０＿スキャフォールド９０５から、雌蕊発達抑制因子（ＧＤＳ遺伝子）と呼ばれる雌性抑制因子遺伝子又はＤＵＦ２４７ドメインを含む遺伝子のすぐ近傍にあり、いくつかのＤＮＡマーカーに遺伝的に隣接し、雄株及び超雄株においてより高いレベルで発現し、アスパラガスホモログが、予想される時空発現パターンを示す、タペータムの発達のための十分に研究された遺伝的経路の一部である事実は、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１様が性染色体の起源に関する２遺伝子モデルによって予測される雄性促進遺伝子であることの強力な証拠となる（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ及びＣｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ、１９７９年参照）。さらに、アスパラガスの雌株にＡｓＯｆ ＴＤＦ１を補充することにより、機能的な雄蕊の発達が回復すると、安全に結論づけることができる。

Ｃａｉら（２０１５年）は、シロイヌナズナにおけるＯｓＴＤＦ１の発現が、その受精能を回復させ、このホモログが、シロイヌナズナにおけるＴＤＦ１の正常な機能を果たし得ることを実証している。イネＯｓＴＤＦ１遺伝子及びシロイヌナズナＴＤＦ１遺伝子は、Ｒ２Ｒ３ ＭＹＢモチーフにおいて全く異なるが保存されていることが示されている。この知見は、本明細書に開示された知見と併せて、ＡｓＯｆ ＴＤＦ１のホモログ又はオルソログを補充したアスパラガス雌株が、機能的な雄蕊の発達を回復し得ることを示す。

表６１：Ｉｒｙｓｖｉｅｗ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）パッケージを用いるアスパラガス・オフィシナリス遺伝子型ＤＨ００／０８６（雄性）及びＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールドのＢｉｏＮａｎｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコンティグの配列。遺伝子マーカーの情報に基づき、１６のＡＧＳ Ｖ２．０スキャフォールド（伴性）をクエリーとして選抜し、８つの異なるＢｉｏＮａｎｏコンティグ（７、２２、２８、５５、４３８、８３３、１０３０及び１１３８）が得られ、或いはコンティグが得られなかった（０）。表は、７つの伴性スキャフォールドがＢＮＧ ＶＩ．０コンティグ２８にマッチし、遺伝子マーカースクリーニングにより検出されなかった（新規）４つのスキャフォールドも、同様にコンティグ２８にマッチした。マッチ情報に基づき、少なくとも７つのＭ座位スキャフォールドがキメラ性のアセンブリであることが結論づけられた。

（実施例７）
（ガンマ線照射によって作出された雌化植物（雌株を含む）、それらの果実セット、その花、その実証された突然変異）
本実施例７では、実施例６において説明されたガンマ線照射により得られた変異植物についてより詳細に述べる。

本明細書の作成時において、研究は継続中である。以下の文書は、最新の知見の記録を提供するものである。１回目及び２回目の評価のいずれにおいても、植物がＰｒｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｌｏｎｇｉｆｉｌａに感染しており、そのため、実止まり（ｆｒｕｉｔ ｓｅｔ）は、これらの植物について報告されているよりも高くなる可能性があることには注意が必要である。２回目の評価は、実止まりに悪影響を与えるかもしれない温暖期である２０１５年１２月に実施した。

全ての突然変異体に対し、実施例６に記載されているように、それらのＤＮＡについてのＨＲＭ分析を行ったが、雄性から雌性へのトランスジェンダーを除いて、実際に突然変異を有するＫ１１５０＿３００＿１１の融解曲線の差を示すのみであった（下記参照）。ＨＲＭによるいくつかの突然変異（例えば、Ａ→Ｔ型４ ＳＮＰ）が見落とされていないことを確認するために、遺伝子領域を、Ｋ１ １５０−６００−２（大規模並列シーケンシングのために送付）以外のすべての変異株について、プライマーＣＮ８７、ＣＮ８８／ＣＮ８９、ＣＰ４１／ＣＮ６０、ＣＮ５９／ＣＮ７０、ＣＮ６７／ＣＮ８２、ＣＮ６９／ＣＮ８１（表３）を用いて配列決定した。１つの変異株のみが、翻訳領域外のＨＲＭマーカーが標的とする領域外のＣＮ８６／ＣＮ８７によって得られた配列中のＳＮＰを示した。これは、翻訳された領域の外側に配列を伸ばすことが、より多くの変異体の検出を可能にすることを示している。しかしながら、以前に述べたように、ＰＡＢ ＢＩＯリードは、遺伝子の上流の領域に、ＧＣリッチなアイランドに隣接するＡＴリッチな反復ＤＮＡを示した（結果は示さず）。リピートを含む領域は、シロイヌナズナＦｗａ遺伝子について示されているようなシス調節エレメントを含んでいてもよい（Ｓｏｐｐｅ他著、２０００年）。すべての突然変異体の真正性は、マーカーＡＯ００８、ＡＯ０２２、ＡＯ０５８、ＡＯ０６９、ＡＯ０９７、ＡＯ１１０、ＡＯ１４５によって少なくとも証明されており、Ｋ３２３−＿６００Ａ３以外には不純物を示さなかった。この座位の数は、不純物と呼ぶのに十分である（非公表の結果）。しかし、特に高価なゲノム配列決定を受けた（雌性）変異株については、図２１に示すより多くのマーカーが適用されている。

Ｋ１ １５０−６００−１は、実施例６に記載された雌株であり、ＧＤＳ及びＡＳ−ＴＤＦ１遺伝子を含む欠失を示した。最初の検査では、その雌の開花は記録されたが、殆ど写真撮影されなかった。数週間後、植物は再び複数の雌花を着け、そのうちの１つが図２２に示す写真が撮影された。果実は３本の茎に見られ、うち２本には５個、１本は４個の果実を着けており、９個の成熟果実から１１個の生存可能な種子が得られた。４カ月後、ファーンの切断後、この植物は現在１５２個の新しい果実を産生しており、現在熟成中である。

Ｋ１ １５０−６００−２は、５つの茎（それぞれ、４個、２個、１４個、５７個、４個の果実を有する）を生産し、そのうち４つが、５個の生存可能な種子を提供する成熟果実であり、数週間後に図２２に示す花の撮影を行った。花は、この交配種にとって例外的でない花柱及び柱頭の発達を示した。最近、Ｋ１ １５０−６００−２は熟成中の２０の新しい果実を産生した。ゲノム再シークエンシングの結果は、１４４９〜２０２３位から開始する小さな欠失候補を示唆するが、プライマーＣＮ８８／ＣＮ８９、ＣＮ８６／ＣＮ８７及びＣＮ６２／ＣＮ６８（表３）を用いたＰＣＲ不全のために、このような欠失の決定的な証拠は今日まで得られなかった。この変異体のＧＤＳ領域の配列決定は保留中である。

Ｋ３２３−６００Ａ−３は、１回目の評価時には若い花を着けておらず、４つの茎を産生した（それぞれ２１個、約１００個、１個、１１個の果実を着けた）。この変異株は、種子汚染と思われたため、後に偽変異体に分類された（図２１）。

Ｋ３２３ ６００Ａ−４は、開花を終え、３本の茎を産生し、それぞれ、２個、１個、４個の熟成した果実を着け、８種の生存可能な種子が得られた。Ｋ３２３ ６００Ａ−４については、新たなシュートにおいて新たな果実が得られなかった。

Ｋ１ １２９−３００−５は、２つの生存可能な種子が得られた２個の成熟果実を産生する１本の茎を有していた。新しいフラッシングにおいて植物の花が得られた（図２２）。画像は、交配種の参照花では観察されなかった非常によく発達した三葉の柱頭を示した。最近、この植物は２６の新しい果実を生産したと報告された。

Ｋ１ １２９−３００−７は、４つの生存可能な種子が得られた３つの熟した果実が着いた１本の茎を産生しており、その写真はいくつかの柱頭が発育した花柱を示す（ただし、Ｋ１ １２９−３００−５と比較して少ない傾向にある）。最近の植物の新しいシュートの検査では、新しい実止まりが認められなかった。

Ｋ１ １２９−３００−８は、１個の成熟した果実を産生し、次のフラッシュにおいて１個の生存可能な種子が得られることが判明した。この植物の花を図２２に示す。この花は、非常によく発達した柱頭を有することにも注目された。プライマー対ＣＮ８６／ＣＮ８７を用いたＫ１１２９−３００−８のサンガー配列決定は、配列番号３のヌクレオチド位置１１６０と同じ位置でアデニンからチミンへの置換を明らかにした。このアデニンからチミンへの置換は、ＧＤＳ遺伝子の最初に予測される開始コドンのアデニンから６６５ヌクレオチド離れている。このアデニンからチミンへの置換に関する結論は、Ｋ１１２９参照交配種及びＫ１０３６（実施例６の遺伝子型）育種系統９Ｍ及びハイブリッドＫ１１５０参照ゲノム倍加半数体ＤＨ００／０８６等の他の植物で得られた比較配列情報から推測される。この領域でこのような突然変異を偶然のみで検出する可能性はきわめて小さいはずであり、したがってこのような突然変異がＫ１ １２９−３００−８に少なくとも１つの果実を産生することを可能にしたと予想される。さらなる調査が継続中である。これまでのところ、茎の２回目のフラッシュでは、新たな果実は得られなかった。

Ｋ１ １２９−３００−９は、１つの生存可能な種子を含む１つの成熟した果実を産生した。撮影された写真は、顕著な花柱の発育を示さなかった（図２２）。これまでのところ、新しい果実の産生は報告されていない。

Ｋ１ １５０−３００−１０は、３つの熟した果実が発見された１本の茎を有し、そこから２つの生存可能な種子が得られた。それは比較的大きな果実を示した。この植物について、現在のところ新たな果実の産生は報告されていない。

Ｋ１ １２９−３００−１１は３本の茎を有し、その上に（１個、２個及び３個）の果実が着いており、それらから、生存可能な種子はただ１つしか得られなかった。２番目のシュートのフラッシュに由来する花の写真が撮影され（図２２）、これは例外的に長い花柱を示し、その葯をほぼ覆っていた。今日まで、新しいシュートには新しい果実が着いていない。プライマー対ＣＰ４１／ＣＮ７２を用いた高解像度融解分析は、植物Ｋ１１５０＿３００＿１１について、品種Ｋ１１５０に属する他の個体と比較して、オフ型の融解曲線を生成した。プライマー対ＣＮ６９／ＣＮ８１（表３、実施例１）を用いたサンガー配列決定は、配列番号１の１１６０の１１９３位と同等のアデニンからグアニンへの置換を示し、これはアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸変化をもたらす。このＳＮＰは、Ｋ１１５０＿３００参照交配種及びＤＨ００／０８６、ハイブリッドＫ３２３及び８８Ｍ、５３７５、９Ｍなどの多くの参照配列について得られた配列にはなく、ユニークなものであると考えられている。この果実産生能を有する変異株は、雌蕊発生抑制因子に変化するアミノ酸を有するため、果実産生能を有しない元のＫ１１５０と区別される。したがって、この特定の突然変異が雌性化株を提供すると結論づけられる。

Ｋ１ １５０−３００−１２は、２００個を上回る生存可能な種子が収集された１７４個及び６個の果実を含む２本の枝を有していた。植物は検査時には開花が完了しており、新たなシュートを得るためにファーンを刈り取った後も、植物は回復していない。さらなる調査は、これらの果実から得られた温室で現在成長している１２本の実生について行われる。幸いにも、ファーンの切除前に、ＤＮＡ単離のために組織を採取したところ、実施例６に開示されているように、ＧＤＳを含む欠失が存在し、雄性刺激因子遺伝子が存在することが証明された。これまでのところ、新しい花が開花しないため、期待される雌性の表現型の確認ができない。この植物の系統から新たな花を得ることを目的とし、欠失と雌の花の表現型との間の関連を確認できる可能性のある更なる研究が継続中である。

Ｋ１ １５０−３００−１３は、３つの成熟した果実が発見された茎を有しており、そこから１１の生育可能な種子が得られた。その花の１つの画像（図２２）は、非常に長い花柱を示していた。最近形成された新しいシュートについて、１８個の新しい果実が報告されている。

Ｋ１ １５０−３００−１４は２つの茎を産生し、その上に、６つの生存可能な種子を産生した３個及び４個の熟した果実が見出された。花（子房の一部を切り取ったもの）が示されている（図２２）。これまでのところ、新たなシュートから果実は得られていない。写真撮影の対象となる花は得られていない。

Ｋ１ １５０−３００−１５は、生存可能な種子を有さない単一の成熟した果実が発見された茎を有していた。

Ｋ１ １５０−３００−１６は、２つの生存可能な種子を含む単一の成熟した果実が見出された茎を有していた。最近、茎の２番目のフラッシュで、３つの新しい果実が産生されたことがわかった。

最近、交配種Ｋ１１２９の参照株のためにより多くの花が集められた。これらの植物は花柱が発達しておらず、あるいは非常に小さいことが指摘された。

これは、Ｋ１ １２９−５及びＫ１ １２９−８について示されたような花柱の発達が、かなり例外的であることを示唆している。

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［付記１］
雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下されている植物を準備する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記２］
親植物の一方又は両方が、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下させられている植物である、
雌雄異株植物を自家受精又は交雑受精させる方法。

［付記３］
ＧＤＳタンパク質の発現を阻害することにより、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログの発現を減少させることにより、雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下させられている植物を作る方法。

［付記４］
雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現の破壊又は低下が、ＧＤＳ遺伝子（好ましくは、配列番号１の配列、又はそのオルソログ、機能的ホモログ、若しくは機能的断片を含むＧＤＳ遺伝子）の発現を阻害することにより生じている、付記１から３のいずれか１つに記載の方法。

［付記５］
雌蕊群発達の顕性抑圧因子の機能的発現が破壊又は低下されており、前記植物は変異ＧＤＳ遺伝子を含み、前記方法はＧＤＳ遺伝子に変異を導入する工程を備える、付記１から３のいずれか１つに記載の方法。

［付記６］
前記変異はＤＮＡ置換により生じたものである、付記５に記載の方法。

［付記７］
前記雌雄異株植物は、クサスギカズラ属の一種、好ましくは、アスパラガス・オフィシナリスである、付記１から６のいずれか１つに記載の方法。

［付記８］
雌蕊群発達タンパク質の顕性抑圧因子の発現が破壊又は低下させられている雌雄異株植物、好ましくは、クサスギカズラ属の一種の植物、より好ましくは、アスパラガス・オフィシナリス種の植物。

［付記９］
ＧＤＳ遺伝子の発現が破壊又は低下させられている、付記８に記載の雌雄異株植物。

［付記１０］
前記植物は変異処理を受けており、好ましくは、前記処理は放射性元素による放射を含む、付記８又は９に記載の雌雄異株植物。

［付記１１］
前記植物は前記雌蕊群発達の顕性抑圧因子の発現を破壊又は低下させる能力を有する核酸配列を形質転換又はトランスフェクションにより導入されており、好ましくは、前記核酸配列はＧＤＳ遺伝子の配列に相同又は部分的に相同である、付記８から１０のいずれか１つに記載の雌雄異株植物。

［付記１２］
発現の前記破壊又は低下は可逆的である、付記１１に記載の雌雄異株植物。

［付記１３］
顕性雄性刺激因子の機能的発現が回復させられている植物を準備する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統育種技術に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記１４］
顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより補われている植物を準備する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統技術に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記１５］
前記顕性雄性刺激因子の導入が非相同顕性雄性刺激因子の発現を雌雄異株植物で誘導することにより行われ、好ましくは、前記顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質である、付記１３又は１４に記載の方法。

［付記１６］
前記ＴＤＦ１タンパク質は、配列番号５のアスパラガス・オフィシナリスＴＤＦ１遺伝子、又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログ若しくは機能的断片である、付記１５に記載の方法。

［付記１７］
前記機能的断片は、前記ＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログのＲ２及びＲ３ドメインを少なくとも含んでいる、付記１６に記載の方法。

［付記１８］
親植物の一方又は両方が、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が前記顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより回復又は補填されている植物であり、好ましくは、前記顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログである、
雌雄異株植物を自家受精又は交雑受精させる方法。

［付記１９］
葯を提供するために用いられる植物が、顕性雄性刺激因子の機能的発現の欠失が前記顕性雄性刺激因子の機能的コピーにより回復又は補填されている植物であり、好ましくは、前記顕性雄性刺激因子はＴＤＦ１タンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログである、
インビトロ雄性発生を行う方法。

［付記２０］
前記顕性雄性刺激因子をコードする遺伝子は、配列番号４のアスパラガス・オフィシナリスＴＤＦ１遺伝子、又は、そのオルソログ若しくは機能的ホモログ、若しくは付記１７内で規定するＴＤＦタンパク質の断片をコードする当該遺伝子の断片である、付記１３から１９のいずれか１つに記載の方法。

［付記２１］
配列番号２のアミノ酸配列又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログを含むクサスギカズラ属植物における雌蕊群発達を抑圧する能力を有するタンパク質。

［付記２２］
配列番号１のｃＤＮＡ配列又は配列番号３から派生し得るゲノム配列である、付記２１に記載のタンパク質をコードする核酸配列。

［付記２３］
雌雄異株種由来の植物での雄性化をもたらす能力を有するタンパク質であって、配列番号５のアミノ酸配列、又はそのオルソログ若しくは機能的ホモログ、若しくは付記１７内で規定する当該アミノ酸配列の断片を含む、タンパク質。

［付記２４］
配列番号４のｃＤＮＡ配列又は付記１７内で規定する断片をコードする能力を有する当該ｃＤＮＡ配列の断片である、付記２３に記載のタンパク質をコードする核酸配列。

［付記２５］
ある育種スキームにより得られた雌雄異株種のハイブリッド植物、好ましくは、付記１から７及び１３から２０のいずれか１つに記載の方法で育種することを介して作られた近交系植物に由来するハイブリッド植物。

［付記２６］
雌化植物を提供する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記２７］
脱雌化植物を提供する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記２８］
雄化植物を提供する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

［付記２９］
脱雄化植物を提供する工程と、
前記植物を、近親交配、戻し交配育種、連続戻し交配育種、又は半数体倍加系統種子繁殖に取り入れる工程と、
を備える、
雌雄異株植物における育種を改良する方法。

Claims (19)

1. 顕性雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子又はその機能的ホモログ遺伝子によりコードされる配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含むＤＵＦ２４７ドメインの機能的発現を変化させることにより、
   配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、雄蕊群発達を可能とするＴａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １（ＴＤＦ１）遺伝子又はその機能的ホモログ遺伝子の機能的発現を変化させることにより、又は、
   その両方により、
   アスパラガス植物の性を変化させる方法。
2. 顕性雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＤＳタンパク質又はそのスプライスバリアントタンパク質又は前記ＧＤＳ遺伝子の機能的ホモログ遺伝子によりコードされる配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する機能的ホモログタンパク質の機能的発現を減少させることにより、雌化アスパラガス植物を作る方法。
3. 前記スプライスバリアントタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１９又は配列番号１２１で表される、又は、前記機能的ホモログタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２３、配列番号１２６、又は配列番号１２８で表される、請求項２に記載の方法。
4. 前記顕性ＧＤＳ遺伝子又は前記顕性ＧＤＳ遺伝子の前記機能的ホモログ遺伝子の機能的発現の低下が、配列番号３で表される前記ＧＤＳ遺伝子又は配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する前記機能的ホモログ遺伝子の機能的発現を阻害することにより生じている、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記機能的ホモログ遺伝子は配列番号１４２又は配列番号１４５の配列を有する、請求項４に記載の方法。
6. 前記顕性ＧＤＳ遺伝子又は前記顕性ＧＤＳ遺伝子の前記機能的ホモログ遺伝子の機能的発現の低下が、前記顕性ＧＤＳ遺伝子又は前記顕性ＧＤＳ遺伝子の前記機能的ホモログ遺伝子の破壊により生じている、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記植物が変異ＧＤＳ遺伝子を含むこととなるような前記顕性ＧＤＳ遺伝子又は前記顕性ＧＤＳ遺伝子の前記機能的ホモログ遺伝子における変異の導入により、前記顕性ＧＤＳ遺伝子又は前記顕性ＧＤＳ遺伝子の前記機能的ホモログ遺伝子の機能的発現が低下されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記変異はＤＮＡ置換により生じたものである、請求項７に記載の方法。
9. 前記アスパラガス植物は、アスパラガス・オフィシナリス植物である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 配列番号２のアミノ酸配列を有する雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）タンパク質又はそのスプライスバリアントタンパク質又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する機能的ホモログタンパク質の機能的発現が低下させられている雌化アスパラガス植物。
11. 前記スプライスバリアントタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１９又は配列番号１２１で表される、又は、前記機能的ホモログタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２３、配列番号１２６、又は配列番号１２８で表される、請求項１０に記載の雌化アスパラガス植物。
12. 前記植物は変異処理により得られたものである、請求項１０又は１１に記載の雌化アスパラガス植物。
13. 前記植物は前記ＧＤＳタンパク質又は前記スプライスバリアントタンパク質又は前記機能的ホモログタンパク質の機能的発現を低下させる能力を有する核酸配列で形質転換されている、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の雌化アスパラガス植物。
14. 前記発現の前記低下は可逆的である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の雌化アスパラガス植物。
15. アスパラガス・オフィシナリス植物である、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の雌化アスパラガス植物。
16. 配列番号５で表されるＴａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １（ＴＤＦ１）タンパク質又は配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する機能的ホモログタンパク質を含む顕性雄性刺激因子をアスパラガス植物において機能的に発現させることを含む、雄化アスパラガス植物を作る方法。
17. 配列番号６に表されるようなＴａｐｅｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １（ＴＤＦ１）遺伝子又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する機能的ホモログ遺伝子の機能的発現をアスパラガス植物において阻害することを含む、脱雄化アスパラガス植物を作る方法。
18. 配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を発現する顕性雌蕊群発達抑圧因子（ＧＤＳ）遺伝子又はその機能的ホモログ遺伝子をアスパラガス植物において機能的に発現させることを含む、脱雌化アスパラガス植物を作る方法。
19. 前記アスパラガス植物は、アスパラガス・オフィシナリス植物である、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。

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