JP6893644B2

JP6893644B2 - 糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子、ウイルスの捕捉、濃縮、精製と検出

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Publication number: JP6893644B2
Application number: JP2019146501A
Authority: JP
Inventors: 泰生隅田
Original assignee: Kagoshima University NUC; SUDx Biotec Corp
Current assignee: Kagoshima University NUC; SUDx Biotec Corp
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-06-23
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: JP2020025536A

Description

本発明は、粒子径が揃った糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子、並びに、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子によるウイルスの捕捉、及び捕捉したウイルスの濃縮、精製方法、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくはリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による高感度ウイルス検出方法に関する技術である。

糖鎖は、核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖で、核酸、タンパク質と同様に生物にとって重要な分子である。特にウイルスは、細胞表面の糖鎖を認識し、感染することが知られている。例えば、インフルエンザウイルスは、宿主となる標的細胞表層上の特定の結合様式を持つシアル酸構造を認識し、自らの遺伝情報を持つＲＮＡを宿主細胞に挿入して増殖を行うことが知られている。

一方、近年では、世界的パンデミックを引き起こす高病原性ウイルス、変異ウイルスなどの出現が危惧されているほか、鳥インフルエンザ、豚繁殖・呼吸障害症候群などのように、既に家畜、畜産物等の生産に影響を与えるウイルス性疾患も報告されている。そのため、ウイルス研究のためのウイルスの捕捉技術および治療のためのウイルス性疾患の早期診断技術などの開発が期待されている。

ナノ粒子は、ライフサイエンス・医療診断・バイオテクノロジーなどの様々な分野に応用されるマテリアルである。抗体などのタンパク質を固定化したナノ粒子は、抗原抗体反応による免疫染色、抗原の検出、分離・精製などに有用である。また、薬剤もしくは遺伝子を固定化したナノ粒子を用いたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）、標識化ナノ粒子を用いた分析用マーカー、トレーサーなどの分析用試薬も、広く利用されている。

磁性ナノ粒子は、磁性という性質から、適当な外部磁場によって粒子の状態を制御できるため、細胞の精製、バイオマーカー等に利用が可能である。さらに、磁性粒子は、医療分野において、核磁気共鳴画像法などの増感剤として使用すると、生体、細胞等の画像化を行うことができるなど、優れた特徴を有する実用性の高い素子である。加えて、銀は金などの金属と同様に硫黄原子と結合することが可能であり、生体分子や有機化合物と複合体化を行うことのできる汎用性の高い金属である。

例えば、特許文献１には、糖鎖固定化金ナノ粒子によって、糖鎖に特異的に結合するウイルス粒子表面の抗原タンパク質を分離し、当該抗原タンパク質を免疫抗原として使用して抗体を得る方法が記載されている。また、特許文献２には、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、所定の第二の磁性体とを用いたウイルスの濃縮方法が記載されている。

特開２０１３−１５９５６７号公報特開２０１１−４５３５８号公報

本発明は、糖鎖結合性タンパク質の検出、単離・精製等のためにこれまで開発されてきた糖鎖固定化金ナノ粒子および糖鎖固定化磁性金ナノ粒子における課題を解決するものである。

糖鎖固定化金ナノ粒子（例えば、特許文献１）は、金ナノ粒子と糖鎖とを固定化した粒子である。これは約５３０ｎｍに金特有の極大吸収波長を持ち、赤紫色を呈することから、レクチンなどの糖鎖結合性タンパク質との結合活性を、色の変化、凝集反応などを指標にすることによって目視下で解析する事ができる。

しかし、糖鎖固定化金ナノ粒子に結合した成分の単離および精製には、超遠心分離機等の大型機器を必要とする。

糖鎖固定化磁性金ナノ粒子（例えば、特許文献２）は、標的物と結合する場合、大掛かりな装置を必要とせず、磁気分離のみによってタンパク質またはウイルスなどの結合成分の単離・精製を行うことができる。この技術は、研究用以外に、ベッドサイド診療、農場、畜産場などでも、細菌・ウイルスなどの簡易検査・診断ツールとして応用されている。

糖鎖固定化磁性金ナノ粒子は、硫酸化多糖を固定化することによって、インフルエンザウイルスなどを効率よく濃縮できることが見出されており、現在、早期診断等の臨床応用へ展開されている。

しかしながら、従来の糖鎖固定化磁性金ナノ粒子は、固定化する糖鎖の種類に依存して、製造後の粒子径および分散安定性が変化すること等の課題がある。

これまでに金を構成原子とした「糖鎖固定化金ナノ粒子」、「糖鎖固定化磁性金ナノ粒子」はすでに製造法が確立し、研究機関、医療機関等での利用が展開されている。中でも、糖鎖固定化磁性金ナノ粒子は、汎用性が高い反面、固定化する糖鎖の種類、製造手技等に依存して、粒子径および分散安定性等が変化することなどの課題がある。つまり、粒径の制御に課題がある。

そこで、本明細書では、様々な糖鎖の固定化が可能で、糖鎖の種類に依存せずに高い分散安定性を有し、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子様の磁性を利用した、ウイルスを濃縮可能な新規糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子およびその調製法、新規糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を用いた結合成分の捕捉、濃縮、精製の方法ならびにウイルスの検出方法について記述する。

すなわち、本発明の一実施形態は、磁性ナノ粒子表面が、金および／または金同様のチオールを介した糖鎖固定化が可能な銀で被覆され、磁性を保持するために磁性を有する金属を内在した、金および／または銀を有する糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の調製法、検体中のウイルスを捕捉、分離する技術について行ったものである。

本発明は以下の態様を包含する。

＜１＞主鎖である炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の一端にアミノ基を備え、他端に硫黄原子を備えるリンカー化合物、糖鎖、および磁性ナノ粒子を有し、
上記アミノ基が上記糖鎖の還元末端と結合し、上記硫黄原子が上記磁性ナノ粒子と結合しており、
上記磁性ナノ粒子は、金および／または銀を含有し、さらに、
上記磁性ナノ粒子は、表面が、金および／または銀によって被覆されていることを特徴とする、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子。

＜２＞上記糖鎖がウイルス粒子表面のタンパク質に結合することによって、ウイルスを捕捉することを特徴とする＜１＞に記載の糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子。

＜３＞＜１＞または＜２＞に記載の糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、ウイルスを含有する検体とを混和して得られる混和物に磁力を加える工程を含むことを特徴とする、ウイルスの濃縮方法。

＜４＞上記混和物が、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を含有することを特徴とする、＜３＞に記載のウイルスの濃縮方法。

＜５＞上記第二の磁性体の表面が、シリカで被覆されていることを特徴とする、＜４＞に記載のウイルスの濃縮方法。

＜６＞＜３＞から＜５＞のいずれか１つに記載のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＲＮＡを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させること、または、＜３＞から＜５＞のいずれか１つに記載のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＤＮＡを、リアルタイム定量的ＰＣＲによって増幅させること、を特徴とするウイルス検出方法。

本発明に用いる糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、還元剤処理した糖鎖リガンド複合体と磁性ナノ粒子とを混和するだけで調製することができる。これにより種々のウイルスに対して結合性の高い糖鎖をそれぞれ固定化することできることから、多種多様なウイルスを捕捉可能な糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を提供することができる。

また、この糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を利用して、ウイルス粒子の捕捉および破砕を行うだけで、短時間かつ簡便に、ウイルス内のＲＮＡを精製して抽出することが可能であるため、低濃度のウイルス溶液であっても、容易に高濃度のウイルス溶液に調製することができる。

調製した高濃度ウイルス溶液は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ増幅、またはリアルタイム定量的ＰＣＲによるＤＮＡ増幅によって、従来の方法では検出の難しい唾液などの体液や希釈ウイルス液でも検出することが期待できる。

本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、固定化する糖鎖の種類に依存して粒子径および分散安定性が変化することがなく、ウイルスの検出や同定を迅速、簡便かつ高感度に行うことができるという効果を奏する。

α２−３結合したシアリルラクトース（２，３ＳＬ）、デキストラン硫酸２５００（ＤＳ２５）、β１−３結合したＮ−アセチルガラクトサミン−ガラクトース、もしくは、α１−６結合したマンノース−グルコースと、リンカー化合物とを含む糖鎖リガンド複合体の構造を示す図である。２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像と平均粒子径を示す図である。２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子の動的光散乱測定値、及び平均粒子径を示す図である。２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子の紫外可視吸収スペクトルを示す図である。２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子が捕捉したウイルス粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子によって捕捉したウイルスが有するＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す図である。ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真、及び平均粒径を示す図である。ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の動的光散乱測定値、及び平均粒径を示す図である。ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の紫外可視吸収スペクトルを示す図である。

本発明の実施の形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。以下、本発明の一実施形態に係る「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子」、「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子によるウイルスの濃縮法」および「リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイム定量的ＰＣＲによるウイルスの検出方法」について詳述する。

[１．糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子]
本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、主鎖である炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の一端にアミノ基を備え、他端に硫黄原子を備えるリンカー化合物、糖鎖、および磁性ナノ粒子を有し、上記アミノ基が上記糖鎖の還元末端と結合し、上記硫黄原子が上記磁性ナノ粒子と結合しており、上記磁性ナノ粒子は、金および／または銀を含有し、さらに、上記磁性ナノ粒子は、表面が、金および／または銀によって被覆されていることを特徴とする。

本明細書において、「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子」とは、以下に詳述する糖鎖リガンド複合体と磁性ナノ粒子とを結合させたものを意図する。「糖鎖リガンド複合体」とは、金および／または銀を含有する磁性ナノ粒子と結合することのできるリンカー化合物と、捕捉対象となるウイルスの表面タンパク質と特異的に相互作用することができる糖鎖とから構成されている化合物である。そのため、上記糖鎖リガンド複合体は、タンパク質等の物質と疎水性に基づく非特異的な相互作用を形成しないことが必要とされる。

本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、ナノ粒子表面に、還元剤処理した水溶性の糖鎖リガンド複合体を添加することによって製造され、水溶液中で高い分散性を示す。この糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、表面が糖鎖リガンド複合体で修飾されており、平均粒径が１〜２００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍから５０ｎｍ程度であることがより好ましい。

また、本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、上記糖鎖リガンド複合体、つまり炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えているリンカー化合物の一端に存在するアミノ基にて還元末端を有する糖鎖と結合し、当リンカー化合物の他端に存在する硫黄原子を含む炭化水素構造にて銀、金、またはその他の金属と結合している糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子である。

本発明の一実施形態に係る上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、上記糖鎖がウイルス粒子表面のタンパク質に結合することによって、ウイルスを捕捉することができる。

［２．リンカー化合物、糖鎖リガンド複合体］
本発明の一実施形態におけるリンカー化合物は、主鎖としての炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の一末端にアミノ基を備え、他端に硫黄原子を備える。

上記「炭化水素誘導鎖」とは、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、およびアミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）などに置き換わっていてもよいものを指す。

好ましくは、リンカー化合物は、炭化水素誘導鎖中に炭素−窒素結合を有する。

上記リンカー化合物は、炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の末端にアミノ基を有するため、糖鎖分子を簡便に導入することができる。上記アミノ基は、修飾されているアミノ基（例えばアセチル基、メチル基、ホルミル基などで修飾されたアミノ基）または芳香族アミノ基であってもよいし、未修飾のアミノ基であってもよい。

中でも、上記アミノ基は、芳香族アミノ基であることが好ましい。還元アミノ化反応の最適条件であるｐＨ３〜４の条件下においては、アミノ基がプロトン化されないことが必要である。そのため、芳香族との共役によって、ｐＨ３〜４の条件下でも非共有電子対が窒素原子上に存在しうる芳香族アミノ基であることが好ましい。

上記リンカー化合物と糖鎖との複合体である糖鎖リガンド複合体には、上記リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を持つ糖鎖が導入されている。すなわち、上記糖鎖リガンド複合体は、上記リンカー化合物と還元末端を持つ糖鎖がアミノ基を介して結合している構造を示す。

この糖鎖の導入は、上記リンカー化合物のアミノ基と糖鎖との還元アミノ化反応によって行うことができる。すなわち、平衡によって生じる糖鎖中のアルデヒド基（−ＣＨＯ基）またはケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が持つアミノ基が反応する。この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、アミノ基に容易に糖鎖を導入することが可能である。

なお、上記の「還元末端を持つ糖鎖」とは、分子末端に還元性をもつケトンまたはアルデヒドが形成しうる糖類である。つまり、還元末端を有する糖鎖とは、アノマー炭素原子が置換を受けていない単糖鎖、オリゴ糖鎖、または多糖鎖である。すなわち、上記還元末端を有する糖鎖とは、還元糖鎖である。還元末端を有する糖鎖としては、市販のものであっても天然のものであってもよく、合成して調製したものや、市販および天然の多糖鎖を分解して調製したものを用いることもできる。

還元末端を有する糖鎖として、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖、キトオリゴ等、ラミナリオリゴ糖、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコースなどが挙げられる。

より好ましくは、還元末端を有する糖鎖は、α２−３結合したシアリルラクトース（２，３ＳＬ）、分子量約２５００のデキストラン硫酸（ＤＳ２５）、β１−３結合したＮ−アセチルガラクトサミン−ガラクトース、α１−６結合したマンノース−グルコースである。

例えば、２，３ＳＬは鳥インフルエンザの感染に必要な糖鎖であり、ＤＳ２５は多数の硫酸基により高度に負電荷を帯びており、インフルエンザ、ヘルペス等のウイルス粒子表面に対して強い結合性を示す。また、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびフコースはノロウイルスとの結合性を示し、ラクトースはロタウイルスとの結合性を示す。これらのウイルスは、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子によって、糖鎖を介した捕捉が可能であると考えられる。

デキストラン硫酸は、主としてα１−６結合で結合したグルコース骨格からなるポリ陰イオン性のデキストラン誘導体であり、種々の高純度デキストラン分画から合成される。このデキストラン硫酸のうちＤＳ２５は、分子量を２５００程度に調整することで、ウイルスとの結合に必要な多数の硫酸基を保持するとともに、産物であるナノ粒子の粒径を１０ｎｍ前後に制御することを可能としている。「産物であるナノ粒子」とは、上記リガンド複合体が上記磁性ナノ粒子と結合した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子である。なお、上記ＤＳ２５は、市販もしくは天然の多糖鎖を分解して調製したものを用いることができる。

また、上記リンカー化合物は、炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の他端に備える硫黄原子により、金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合、銀−硫黄（Ａｇ−Ｓ）結合または他の金属との金属−硫黄（Ｍ−Ｓ）結合を形成することができる。より具体的には、上記リンカー化合物は、ジスルフィド結合（Ｓ―Ｓ結合）またはＳＨ基が含まれている炭化水素構造を主鎖の他端に備えている。

硫黄原子は、磁性ナノ粒子中の表面金属（金および／または銀）と金属−硫黄結合（例えば、Ａｕ−Ｓ結合、Ａｇ−Ｓ結合）を形成し、金属との結合を強固にすることができる。これにより、上記リンカー化合物において、アミノ基には糖鎖が結合し、硫黄原子は磁性ナノ粒子と結合するため、磁性ナノ粒子上に糖鎖分子を集合化して配列することができる。

上記リンカー化合物と糖鎖とを結合させた糖鎖リガンド複合体は、ＳＨ基の硫黄によって、磁性ナノ粒子と強固に、かつ簡便に結合させることができる。このため、糖鎖を磁性ナノ粒子表面に容易に固定化することができる。さらに、こうして磁性ナノ粒子上に結合した糖鎖の高い水和性によって、磁性ナノ粒子をコロイド状態で安定化することが可能となる。

リンカー化合物としては、従来公知のリンカー化合物、例えば、本発明者らがこれまでに開発したリンカー化合物、WO2005/077965号公報、米国特許公報7320867B2に記載のリンカー化合物等を用いることができるが、これに限定されない。

リンカー化合物としては、下記化学式（１）にて表される構造を有する化合物が好適に用いられ得る：

（化学式（１）中、ｐ，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、Ｘは、末端にアミノ基または芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖、２鎖または３鎖含んでなる構造であり、Ｙは、硫黄原子または硫黄原子を含む炭化水素構造であり、Ｚは、炭素−炭素結合または炭素−酸素結合をもつ直鎖または分岐を持つ構造である。）。

上記Ｘに含まれ得る芳香族アミノ基の芳香環は、炭化水素のみで構成されていてもよく、炭素以外の元素を含む複素環であってもよい。上記Ｘは、下記の化学式（２）、化学式（３）、化学式（４）、化学式（５）、化学式（６）または化学式（７）にて表される構造を備えることが好ましい：

（化学式（２）および化学式（３）中、ｍ^１〜ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数である。）

（化学式（６）中、ｎ^３は１以上１００以下の整数である。）

上記Ｚは、下記の化学式（８）または化学式（９）であってもよい：

（化学式（８）および化学式（９）中、ｎ^１およびｎ^２はそれぞれ１以上６以下の整数である。）。

上記リンカー化合物としては、下記の化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、化学式（１３）、化学式（１４）、化学式（１５）、化学式（１６）、または化学式（１７）にて表される構造を有する化合物がより好適に用いられ得る：

（化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、化学式（１３）、および化学式（１５）中、ｍ^１〜ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、ｎ^１およびｎ^２はそれぞれ独立して１以上６以下の整数であり、ｎ^３は１以上１００以下の整数であり、ｑは０以上６以下の整数である。）。

上記リンカー化合物は、例えば、チオクト酸と芳香族アミノ基末端との縮合反応を行うことによって製造される。このとき、チオクト酸と芳香族アミノ基との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシル基と芳香族アミノ基とが縮合し、アミド結合が形成されることによって、上記のリンカー化合物を得ることができる。上記糖鎖リガンド複合体は、このようにして作成されたリンカー化合物に、還元末端を持つ糖鎖が導入されたものである。

上記の化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、化学式（１３）または化学式（１４）にて表される構造を有する化合物は、例えば、チオクト酸（α−リポ酸とも称される）と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造され得る。

上記の化学式（１５）、化学式（１６）または化学式（１７）にて表される化合物は、例えば、チオクト酸とジアミノ化合物の一末端のアミノ基との縮合反応を行うことによって製造され得る。

具体的には、チオクト酸とジアミノ化合物との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシ基とジアミノ化合物の一末端のアミノ基とが縮合し、アミド結合が形成されることによって、上記の化学式（１５）、化学式（１６）または化学式（１７）にて表される化合物を得ることができる。チオクト酸とジアミノ化合物との縮合反応にジアミノ化合物を供する前に、ジアミノ化合物の一末端のアミノ基を、保護基によって保護してもよい。この場合、縮合反応後に、保護基によって保護されたアミノ基の保護基を脱保護することにより、上記の化学式（１５）、化学式（１６）または化学式（１７）にて表される化合物を得ることができる。

上記チオクト酸は、

にて表される構造を備えている。また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するものであれば特に限定されるものではない。

上記保護基とは、アミノ基（例えば芳香族アミノ基のアミノ基、またはジアミノ化合物の一末端のアミノ基）が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、特に限定されるものではないが、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３基；以下、Ｂｏｃ基とも称する。）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。

上述したようなリンカー化合物を用いて、糖鎖リガンド複合体を製造することができる。例えば、リンカー化合物に含まれる（例えば化学式（１）の上記Ｘに含まれる）アミノ基または芳香族アミノ基と、糖鎖との還元アミノ化反応により、糖鎖をリンカー化合物に導入することにより、糖鎖リガンド複合体を得ることができる。

図１は、α２−３結合したシアリルラクトース（２，３ＳＬ）、デキストラン硫酸２５００（ＤＳ２５）、β１−３結合したＮ−アセチルガラクトサミン−ガラクトース、もしくは、α１−６結合したマンノース−グルコースと、リンカー化合物とを含む糖鎖リガンド複合体の構造を示す図である。ただし、本発明の一実施形態に用いられる糖鎖リガンド複合体は、図１に示すものには限られない。

このようにして得られた糖鎖リガンド複合体は、リンカー化合物に含まれる（例えば化学式（１）の上記Ｙに含まれる）硫黄（Ｓ）と、磁性ナノ粒子に含まれる金および／または銀との間に形成される金属−硫黄結合を介して、強固にかつ簡便に磁性ナノ粒子に固定化され得る。このため、糖鎖リガンド複合体を磁性ナノ粒子の表面に容易に固定化することができる。

［３．磁性ナノ粒子］
本発明に使用する磁性ナノ粒子は、磁性を有するため、適当な外部磁場によって粒子の状態を制御できる。そのため、細胞の精製、バイオマーカーなどとしても利用が可能である。さらに、磁性ナノ粒子は、医療分野では核磁気共鳴画像法などの増感剤として使用される場合、生体または細胞などの画像化を行うことができるなど、優れた特徴を有する実用性の高い素子である。

上記磁性ナノ粒子とは、磁性を有する金属ナノ粒子であり、水溶液中で分散してコロイド溶液を形成するものが意図される。よって、磁性ナノ粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍの範囲内が好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。

上記磁性ナノ粒子の平均粒子径が１〜２００ｎｍの範囲内である場合、粒子の分散安定性が経時的に変化しにくいという利点がある。また、目標とするウイルス粒子よりもサイズの小さいナノ粒子を用いた場合に捕捉効率が飛躍的に大きくなるため、磁性ナノ粒子の平均粒子径は、１ｎｍから５０ｎｍであることがさらに好ましい。

本明細書において「粒子径」とは、粒子を透過型電子顕微鏡で観察した場合の、粒子の二次元形状に対する最大内接円の直径が意図される。例えば、粒子の二次元形状が実質的に円形状である場合はその円の直径が意図され、実質的に楕円形状である場合はその楕円の短径が意図され、実質的に正方形状である場合はその正方形の辺の長さが意図され、実質的に長方形状である場合はその長方形の短辺の長さが意図される。

「平均粒子径」とは、複数個の粒子の上記粒子径の平均値をいう。本明細書において、平均粒子径が所定の範囲の値を有するか否かは、２０個の粒子を透過型電子顕微鏡で観察して、各粒子の上記粒子径を測定し、２０個の粒子の上記粒子径の平均値を求めること、または、動的光散乱法によって確認した。さらに、動的光散乱法によって、磁性ナノ粒子に糖鎖が固定化された糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子では、糖鎖の分だけ粒子径が大きくなっていることを確認した。

上記磁性ナノ粒子に含有される磁性体（以下、「第一の磁性体」と称する）としては、特に限定されず、従来公知の磁性体を用いることができる。例えば、酸化鉄、マグネタイト、酸化クロム、コバルト、フェライト、ニッケル、ガドリニウムなどを上げることができる。

中でも、磁性が強いため、上記第一の磁性体は、酸化鉄およびコバルトであることが好ましい。なお、本明細書においては、酸化鉄とは三価の鉄の酸化物を指すものとする。マグネタイトとは二価および三価の鉄の酸化物（Ｆｅ^２＋Ｆｅ^３＋ _２Ｏ_４）である。

上記磁性ナノ粒子は、金および／または銀を含有する。銀は、金などの金属と同様に、硫黄原子と結合することが可能であり、生体分子または有機化合物などと複合体化を行うことのできる汎用性の高い金属である。

上記磁性ナノ粒子において、金および／または銀は、原子として含有されていてもよい。また、銀は酸化物として含有されていてもよい。

固定化した糖鎖の安定性と磁性の観点から、磁性ナノ粒子における金および／または銀の含有率は、磁性ナノ粒子の重量に対して、２０〜７０重量％が好ましく、３０〜６０重量％がより好ましい。

また、磁性ナノ粒子は、金および／または銀に加え、他の金属を含有していてもよい。他の金属としては、例えば、銅、アルミニウム、白金、酸化アルミニウム、ＳｒＴｉＯ_３、ＬａＡｌＯ_３、ＺｒＯ_２などが挙げられる。

上記磁性ナノ粒子は、表面が金および／または銀によって被覆されている。例えば、上記磁性ナノ粒子は、中心から金および／または銀、上記第一の磁性体、次いで金および／または銀となるような、コア−シェル−シェル構造を有している。

例えば、特開２０１６−１５３５１９号公報には、金等の金属コア、上記金属コアを被覆する磁性材料である第１シェル、上記第１シェルを被覆する金等の第２シェルを有する金属複合体粒子が記載されており、当該金属複合体粒子を、抗原、抗体等の選択的分離および捕集等に用い得ると考えられることが記載されている。また、Takahashi M. et al, ACS Omega, 2 (8): 4929-4937.等には、上記金属複合体粒子を用いたオートファゴソームの磁気分離について記載されている。

しかしながら、これらの文献には、上記金属複合体粒子を備えたリンカー化合物に糖鎖を結合させることは開示も示唆もされていない。また、上記金属複合体粒子と、上述した本願発明の課題との関連についても何ら示唆されていない。つまり、上記磁性ナノ粒子を用いることにより、固定化する糖鎖の種類、製造手技等に依存して、粒子径および分散安定性等が変化するという、従来の糖鎖固定化金ナノ粒子および糖鎖固定化磁性金ナノ粒子が有する課題を解決し得ることは、本発明者が見出した独自の知見である。

上記磁性ナノ粒子は、例えば、硝酸銀の溶液に、アセチルアセトン酸コバルト（ＩＩ）およびアセチルアセトン酸鉄（ＩＩＩ）の溶液を加えて加熱し、さらに、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物または硝酸銀の溶液を加えることによって、コア−シェル−シェル構造を有する磁性ナノ粒子として調製することができる。

［４．糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の調製法］
本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、上記磁性ナノ粒子を含む溶液と、還元剤処理によって糖鎖と結合したリンカー化合物（糖鎖リガンド複合体）との混和によって得ることができる。上記糖鎖リガンド複合体のＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、磁性ナノ粒子上の金、銀、または他の金属と金属−硫黄結合によって結合することにより、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が形成される。

糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、水溶液中で高い分散性を示す。糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍの範囲内が好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。

上記平均粒子径が１ｎｍ以上であることにより、低コストでの製造が可能となり、実用的である。また、上記平均粒子径が２００ｎｍ以下であることにより、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の分散安定性の経時的変化が抑制されやすくなるため好ましい。

また、上記平均粒子径が１ｎｍ〜５０ｎｍである場合、目標とするウイルス粒子よりもサイズの小さいナノ粒子を用いることになり、ウイルスの捕捉効率が飛躍的に大きくなるため好ましい。

リンカー化合物を糖鎖と結合させる方法としては、上記リンカー化合物と上記糖鎖とをモル比１：１〜５０：１で混和することが好ましい。

糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の調製法としては、具体的には、例えば、銀を含有する磁性ナノ粒子（以下、磁性銀ナノ粒子とも称する）の溶液に、糖鎖リガンド複合体を含む溶液を添加する方法を挙げることができる。上記糖鎖リガンド複合体としては、例えば、還元剤処理によって２，３−シアリルラクトースとリンカー化合物とを結合させた糖鎖リガンド複合体を挙げることができる。これによって、上記糖鎖リガンド複合体のＳ−Ｓ結合を、上記磁性ナノ粒子上の金属−硫黄結合に変換して、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を得ることができる。

なお、還元剤処理に用いられる還元剤としては、特に限定されるものではないが、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの塩類を挙げることができる。なお、例えば上記ナトリウムの代わりにカリウムを用いる場合のように、上記ナトリウムとは陽イオン成分が異なる塩類を用いてもよい。

磁性ナノ粒子を含む溶液及び糖鎖リガンド複合体を含む溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、超純水、メタノール、エタノール、プロパノールおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。

また、上記混和によって得られた糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を、限外濾過、遠心分離等による洗浄に供し、低分子の塩などの成分を除くことにより、溶液状態で安定な糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を得ることができる。

糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を調製するために用いる金、銀、上記糖鎖リガンド複合体、還元剤の混合比は、特に限定されるものではないが、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含有する溶液中の金および／または銀の最終濃度がそれぞれ０．１〜１ｍＭであることが好ましい。

また、上記糖鎖リガンド複合体の濃度は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含有する溶液中の最終濃度で０．１〜１０ｍＭであることが望ましい。また、用いられる還元剤の濃度は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含有する溶液中の最終濃度で１〜１０ｍＭであることが望ましい。

以上説明した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の調製法は、上述した磁性ナノ粒子の製造方法と、糖鎖リガンド複合体の製造方法とを利用している。この方法を基に製造された糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、水溶液中で分散するという特徴を有している。すなわち、この製造方法は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子のコロイド溶液を調製する方法でもある。

［５．糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子によるウイルスの捕捉と濃縮法］
本発明の一実施形態に係る、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子によるウイルスの捕捉と濃縮方法は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含有する溶液と、ウイルス粒子を含有する溶液とを相互作用させた後、その結合体と非結合体とを磁気によって分離する。

すなわち、本発明の一実施形態に係るウイルスの濃縮方法は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、ウイルスを含有する検体とを混和して得られる混和物に磁力を加える工程を含む。ウイルスを捕捉した本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を、磁気分離に供し、上清を除くことによって、高濃度のウイルス溶液を得ることができる。

検体としては、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と接触させることができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、唾液、鼻粘膜、植物、動物の体液等を挙げることができる。

上記唾液等は、それ自体を検体として用いてもよいし、例えばＭＥＭ培地や生理食塩水等に添加して調製した液体として用いることもできる。このような検体と、例えば糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を水、生理食塩水またはリン酸緩衝液等に添加して調製した溶液とを混和することにより、検体中のウイルスと糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子との接触を行うことができる。

上記「糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含有する溶液」とは、本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が液体中に分散したコロイド溶液が意図される。上記溶液は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を含んでいれば、他に塩などが含まれていても良い。上記液体としては、例えば超純水や緩衝液などを用いることができる。

また、上記「ウイルス粒子を含有する溶液」（ウイルスを含有する検体）とは、本発明においてウイルスが液体中に分散したコロイド溶液が意図される。また、ウイルスとは、本発明の一実施形態に係る糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖リガンド複合体に対して結合性を示すウイルスを意図する。このウイルス粒子の粒径としては１０−２００ｎｍであることが好ましい。

ウイルス粒子を分散させる溶液の液体としては、糖鎖リガンド複合体とウイルス粒子との結合を阻害する可能性のある物質を含まない限り、超純水、緩衝液などを用いることができる。また、溶液中のウイルス粒子の濃度は、赤血球凝集を誘導するウイルスの場合、１−１００００ＨＡＵ（赤血球凝集単位）であることが好ましい。

糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、ウイルスを含有する検体とを混和して得られる混和物中には、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子とウイルスとの相互作用により、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖と、ウイルスとが結合した成分である結合体と、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と結合しなかった成分である非結合体とが存在する。上記混和物に磁力を加えることにより、結合体を、非結合体と分離することができる。その結果、ウイルスを濃縮することができる。上記の工程で分離濃縮された成分を、ナノ粒子−ウイルス結合体とする。

また、上記混和物は、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を含有していてもよい。第二の磁性体は、第一の磁性体による磁気を補助する。

第二の磁性体としては、限定されるものではないが、マグネタイトまたはフェラエイト、または四酸化三鉄が好ましい。

上述したように、磁性ナノ粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍの範囲内が好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。磁性ナノ粒子に糖鎖を固定した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍの範囲内が好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。

また、上記第二の磁性体の平均粒子径の範囲は、平均粒子径の上限が１００μｍであり、かつ、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径より大きければ特に限定されるものではないが、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上５００００ｎｍ以下であることがより好ましく、１０００ｎｍ以上１００００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。

上記第二の磁性体を使用することで、第一の磁性体のみを用いる場合よりも、遠心分離を用いた場合に匹敵する濃縮効果をより効率的に得ることができる。そして、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の平均粒子径を上記範囲とし、第二の磁性体の平均粒子径を上記範囲のように調整することにより、両者の平均粒子径が最適化されると推測される。その結果、糖鎖固定化磁性ナノ粒子と、上記第二の磁性体と、ウイルスを含有する検体とを含有する混和物に磁力を加えることによって、検体中の微量のウイルスを、遠心分離を用いることなく、より効率よく、簡便かつ安全に濃縮することができる。

上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と上記第二の磁性体との重量比は、１：１×１０^３〜１：１×１０^１１であることが好ましい。平均粒子径が上述のような関係にある糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、第二の磁性体との使用量の比をかかる範囲に調整することによって、濃縮効率をより向上させることができる。

上記「磁力を加える」について、磁力の加え方は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の電磁石や棒磁石などの永久磁石を、上記混和物を入れた容器の外壁に当接させることなどによって、上記混和物に磁力を加えることができる。磁力の強さとしては、遠心分離を用いた場合と同等の濃縮効率を得るためには、１００〜５００ミリステラであることが好ましい。

また、第二の磁性体を使用する場合、上記混和物に磁力を加える工程の終了時期は、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が液中に分散していることによって呈する着色が、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が第二の磁性体に吸着されることで薄くなる現象を基準にして判断すればよい。

第二の磁性体を使用しない場合、上記混和物に磁力を加える工程の終了時期は、磁力によって、ウイルスが結合した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子が集積し、上記着色が薄くなる現象を基準として、目視によって判断すればよい。

磁力を加えることによって、ウイルスが結合した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子、または、ウイルスが結合した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、第二磁性体とが磁力により集積される。この集積物からウイルス遺伝子を回収する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法によることができる。例えば、上記集積物を滅菌水または蒸留水で水洗後、適宜ピペッティングを行い、上記集積物を含む滅菌水または蒸留水を１００℃で加熱することによって、上清にウイルス遺伝子を回収することができる。

濃縮対象のウイルスとしては、特に限定されるものではない。例えば、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、性病ヘルペスウイルス、エイズウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）、レンチウイルス、コイヘルペスウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス等を挙げることができる。

ウイルスは、ウイルスの表面タンパク質が分子内に有する糖結合部位（糖鎖認識部位）によって、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の糖鎖に結合する。上記結合としては、水素結合、イオン結合、静電気的相互作用による結合、ファンデルワールス力による結合等を挙げることができる。

また、本発明の一実施形態に係るウイルスの濃縮方法において、上記第二の磁性体の表面が、シリカで被覆されていてもよい。当該被覆の態様としては、例えば、酸化鉄を成分とする第二の磁性体の表面にシリカの膜が形成された態様を挙げることができる。当該構成によれば、核酸が第二の磁性体に吸着することを防ぐことができるため、ウイルス由来の核酸の回収率を大幅に改良することができる。

上記第二の磁性体の表面をシリカで被覆する方法としては、例えば、塩化第一鉄および塩化第二鉄にアンモニアを添加することによって調製する酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）粒子の表面を、エタノール中で、過剰量のオルトケイ酸テトラエチルおよびアンモニアで処理する方法を挙げることができる。また、上記第二の磁性体の表面がシリカで被覆されていることを確認する方法としては、組成分析（ＥＰＭＡ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察を挙げることができる。

［６．ナノ粒子−ウイルス結合体を利用したリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ、または、リアルタイム定量的ＰＣＲによる高感度ウイルス検出方法］
本発明の一実施形態に係るウイルス検出方法は、上述のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＲＮＡを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させること、または、上述のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＤＮＡを、リアルタイム定量的ＰＣＲによって増幅させることを特徴とする。

上記ナノ粒子−ウイルス結合体を利用したリアルタイムＰＣＲによる高感度ウイルス検出方法は、上記の工程によって分離濃縮したナノ粒子−ウイルス結合体を破砕しウイルスに内在するＲＮＡまたはＤＮＡをリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させる。

ウイルスを捕捉した糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子は、特にウイルス粒子表層のタンパク質に結合している。そのため、ウイルス粒子の破砕後の溶液には、核酸およびタンパク質などの、ウイルス由来の分子が多く存在していることが想定される。この糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と結合したウイルスのＲＮＡをリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲで増幅すること、または、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と結合したウイルスのＤＮＡをリアルタイム定量的ＰＣＲによって増幅することによって、特定のウイルスの有無、ウイルスのコピー数などを判定することができる。

リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲでは、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子を用いない場合のＣｔ（Threshold Cycle）値を求め、当該Ｃｔ値から、本発明の一実施形態に係る方法により濃縮した場合のＣｔ値を差し引いた差分を求めて、ウイルスの濃縮の程度を評価した。

また、本発明は、以下（１）〜（４）の態様も包含する。

（１）炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物の一端に存在するアミノ基にて還元末端を有する糖鎖と結合し、該リンカー化合物の他端に存在する硫黄原子が銀を表面構造として持つ磁性粒子と結合していることを特徴とする糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子。

（２）糖鎖がウイルス粒子表面のタンパク質に結合することによって、ウイルスを捕捉することを特徴とする（１）に記載の糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子。

（３）（２）に記載の捕捉されたウイルスが、磁気分離によって濃縮することを特徴とする（１）に記載の糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子。

（４）（１）に記載の糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子によって、捕捉、濃縮されたウイルスのＲＮＡをリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させることを特徴とするウイルスの捕捉、濃縮、精製および検出する方法。

本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例は、「糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子の調製」、「糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子の調製」、「糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子または糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子によるインフルエンザウイルスの捕捉と磁気分離による濃縮」、「糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子による豚唾液中の豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの捕捉と磁気分離による濃縮」、「糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子−ウイルス結合体の破砕とリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによるウイルス検出」、の６工程に分け説明する。

〔実施例１〕
［糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子の調製］
硝酸銀（１７．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、和光純薬工業）および１，２−ヘキサデカンジオール（２６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、東京化成工業）を、オレイン酸（２．３ｍｌ、８．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ）、オレイルアミン（３．２ｍｌ、１０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業）およびテトラエチレングリコール（１０ｍｌ、東京化成工業）に溶解させた。

得られた溶液を、アルゴン雰囲気下、マントルヒーターによって加熱しながら撹拌し、液温が１７０℃に達した後に、オレイルアミンとトルエンとの混合溶液（３．０ｍｌ、２：１）を加え、さらに２５０℃まで加熱した。上記混合溶液は、アセチルアセトン酸コバルト（ＩＩ）（７０．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）およびアセチルアセトン酸鉄（ＩＩＩ）（５３．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）を含有する。

次に、硝酸銀（１７．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）が溶解したオレイルアミンとトルエンとの混合溶液（２．０ｍｌ、１：１）を加えることによって、疎水性磁性銀ナノ粒子の合成を行った。

得られた疎水性磁性銀ナノ粒子は、残存する有機物成分を除去するため、過剰のアセトンを加えた後に遠心分離（３，７００ｇ、５ｍｉｎ）を２回行うことによって洗浄を行い、減圧濃縮によって有機溶媒を除去した。その後、得られた疎水性磁性銀ナノ粒子を、１７．０ｍｇ／ｍｌとなるようにヘキサン溶液（２００μｌ）に分散させた。

上記ヘキサン溶液に分散させた疎水性磁性銀ナノ粒子は、２，３−シアリルラクトースを固定した糖鎖リガンド複合体、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（それぞれ終濃度２．５ｍＭ、１．０ｍｌ）を１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調製した水溶液に加え、超音波を照射した。

３０分間超音波を照射しながら超純水を２．０ｍｌ加えた後、反応溶液を遠心分離（３，７００ｇ、５ｍｉｎ）し、水層を限外濾過（３ｋ、１３，０００ｇ、１５ｍｉｎ、３回）に供して未反応の試薬、塩類等を除くことにより、２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子（２，３ＳＬ−ＭＳＮＰ）を合成した。

なお、上記糖鎖リガンド複合体は、水・ジメチルアセトアミド・酢酸の混合溶媒中で、２、３−シアリルラクトースに対して、化学式（１４）に示すリンカー化合物を１．５当量、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムを１２当量添加し、４０℃、暗所下で３日間還元アミノ化反応を行うことによって調製した。

図２は、２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子（２，３ＳＬ−ＭＳＮＰ）の透過型電子顕微鏡画像と、２０個の粒子を透過型電子顕微鏡で観察して測定した平均粒子径（９．２４ｎｍ）とを示す図である。

また、図３は、動的光散乱法で測定した、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰの粒径分布と平均粒子径（１４．６１ｎｍ±２．６７ｎｍ）とを示す図である。

動的光散乱法で測定した２，３ＳＬ−ＭＳＮＰの平均粒子径の分散度は３０％未満である。当該分散度は、データは示さないが、特許文献１に記載されている糖鎖固定化金ナノ粒子および特許文献２に記載されている糖鎖固定化磁性金ナノ粒子よりも低い。つまり、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰは、従来の糖鎖固定化金ナノ粒子および糖鎖固定化磁性金ナノ粒子よりも粒子径が揃っており、製造後の粒子径および分散安定性が優れていると言える。

図４は、２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子の紫外可視吸収スペクトルを示す図である。縦軸は吸光度を表し、横軸は波長を表している。

［糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子によるインフルエンザウイルスの捕捉と磁気分離による濃縮］
糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子の中でも前述のように調製した２，３ＳＬ−ＭＳＮＰを用いてウイルス粒子の捕捉を行った。Ａ型鳥インフルエンザ（ＤＵＣＫＡ／ｓｐｏｔ−ｂｉｌｌｅｄｄｕｃｋ／ｋａｇｏｓｈｉｍａ／ＫＵ５７／２０１５（Ｈ１１Ｎ９））の培養上清をＰＢＳで希釈したインフルエンザウイルス希釈液（５００μｌ）に、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰ溶液（１０μｌ）を混合した。

混合溶液を、第二磁性体が約１０ｍｇ入っているエッペンドルフチューブへ移し、よく混合し、マグネットスタンド（ＴＡＫＡＲＡＭａｇｎｅｔｉｃＳｔａｎｄ（６ｔｕｂｅｓ））で１分間静置させ、磁気分離を行った。磁気分離後、混合溶液の上清を取り除き、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰとマグネットとによって磁気分離を行った沈殿物を回収した。上記第二磁性体としては、粒子径が２０〜１００μｍであるマグネタイトを用いた。

図５は、２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子が捕捉したウイルス粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。図５の右図は、図５の左図において枠囲みした部分の拡大図である。

［糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子−ウイルス結合体の破砕とリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲよるウイルス検出］
磁気分離によって得た沈殿物に、０．１％ＳＤＳ溶液２０μｌを加えてウイルス粒子の破砕を行い、沈殿画分とした。また、対照として、糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子を用いなかったウイルス溶液と、磁気分離後の上清画分からも各１０μｌを採取し、０．１％ＳＤＳ溶液１０ μｌを加えて、対照画分を調製した。

沈殿画分および対照画分について、得られた溶液の各２μｌを、ＰＣＲ用試薬２３μｌに添加し、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。試薬としては、ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲＫｉｔ II（タカラバイオ、製品コードＲＲ０８６Ａ）を使用した。

１反応あたりの試薬は、２×ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＲＴ−ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ４を１２．５μｌ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ１ｓｔｅｐＥｎｚｙｍｅＭｉｘ２を１μｌ、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水を５．５μｌ、および、６．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を２μｌ混合したものを使用した。

リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ装置としては、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ II（タカラバイオ製）を用いた。

プライマーとしては、インフルエンザのＴｙｐｅＡ／Ｍ遺伝子検出用プライマーであるＴｙｐｅＡ／ＭＰｇｅｎｅ（２１７−２３６）ＦｏｒｗａｒｄＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＧＣＴＴ（２０ｂｐ、配列番号１）およびＴｙｐｅＡ／ＭＰｇｅｎｅ（３８２−４０５）ＲｅｖｅｒｓｅＣＡＴＹＣＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴ（２４ｂｐ、配列番号２）を用い、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡのＭプロテイン領域１８８ｂｐを増幅させた。

ＲＴ−ＰＣＲの条件は、逆転写反応を４５℃５分、初期熱変性処理を９５℃１０秒、ＰＣＲサイクルは９５℃５秒、６０℃３０秒、を１サイクルとして設定し、４５サイクル行った。

図６は、２，３−シアリルラクトース固定化磁性銀ナノ粒子によって捕捉したウイルスが有するＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す図である。表１には、沈殿画分および対照画分のＣｔ値等を示す。図６および表１から、ウイルスを捕捉して磁気分離した沈殿画分のＣｔ値（２８．９５）は、糖鎖固定化磁性銀ナノ粒子を用いなかったサンプルのＣｔ値（３１．８）よりも２．８５サイクル早く、上清画分のＣｔ値（３３．４３）よりも４．４８サイクル早いことが確認された。

このことから、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰで磁気分離したウイルス溶液は、２，３ＳＬ−ＭＳＮＰを用いなかったサンプル溶液および上清画分よりも、それぞれ７．２１倍、２２．３１倍のウイルス濃度に調製できたことが示された。

〔実施例２〕
［糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子の調製］
硝酸銀（１７．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、和光純薬工業）および１，２−ヘキサデカンジオール（２６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、東京化成工業）を、オレイン酸（２．３ｍｌ、８．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ）、オレイルアミン（３．２ｍｌ、１０．０ｍｍｏｌ、東京化成工業）、テトラエチレングリコール（１０ｍｌ、東京化成工業）に溶解させた。

得られた溶液を、アルゴン雰囲気下、マントルヒーターによって加熱しながら撹拌し、液温が１７０℃に達した後に、オレイルアミンとトルエンとの混合溶液（３．０ｍｌ、２：１）を加え、さらに２５０℃まで加熱した。上記混合溶液は、アセチルアセトン酸コバルト（ＩＩ）（７０．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）、アセチルアセトン酸鉄（ＩＩＩ）（５３．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）を含有する。

次に、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（３９．７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、ナカライテスク）が溶解したオレイルアミンとトルエンとの混合溶液（２．０ｍｌ、１：１）を加えることによって、金原子を含む疎水性磁性金銀ナノ粒子の合成を行った。

得られた疎水性磁性金銀ナノ粒子は、残存する有機物成分を除去するため、過剰のアセトンを加えた後に遠心分離（３，７００ｇ、５ｍｉｎ）を２回行うことによって洗浄を行い、減圧濃縮によって有機溶媒を除去した。その後、得られた疎水性磁性金銀ナノ粒子を、２０．４ｍｇ／ｍｌとなるようにヘキサン溶液（２００μｌ）に分散させた。

上記ヘキサン溶液に分散させた、金原子を含む疎水性磁性金銀ナノ粒子は、ＤＳ２５を固定した糖鎖リガンド複合体、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（それぞれ終濃度２．５ｍＭ、１．０ｍｌ）を１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１に調製した水溶液に加え、超音波を照射した。

３０分間超音波を照射しながら超純水を２．０ｍｌ加えた後、反応溶液を遠心分離（３，７００ｇ、５ｍｉｎ）し、水層を限外濾過（３ｋ、１３，０００ｇ、１５ｍｉｎ、３回）に供して未反応の試薬、塩類等を除くことにより、ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子（ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰ）を合成した。

なお、上記糖鎖リガンド複合体は、水・メタノール・酢酸の混合溶媒中で、デキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤＳ２５・Ｎａ）に対して、化学式（１４）に示すリンカー化合物を１．２当量、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムを１０当量添加し、４０℃、暗所下で２日間還元アミノ化反応を行うことによって調製した。

図７は、ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像と、２０個の粒子を透過型電子顕微鏡で観察して測定した平均粒子径（１３．１１ｎｍ）とを示す図である。図７の中央の図は、図７の左図の拡大図である。

また図８は、動的光散乱法で測定した、ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の粒径分布と平均粒子径（２７．５６±７．６５ｎｍ）とを示す図である。

図９は、ＤＳ２５固定化磁性金銀ナノ粒子の紫外可視吸収スペクトルを示す。縦軸は吸光度を表し、横軸は波長を表している。

［糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子によるインフルエンザウイルスの捕捉と磁気分離による濃縮］
糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子の中でも前述のように調製したＤＳ２５−ＭＳＧＮＰを用いてウイルス粒子の捕捉を行った。Ａ型鳥インフルエンザ（ＤＵＣＫＡ／ｓｐｏｔ−ｂｉｌｌｅｄｄｕｃｋ／ｋａｇｏｓｈｉｍａ／ＫＵ５７／２０１５（Ｈ１１Ｎ９））の培養上清をＰＢＳで希釈したインフルエンザウイルス希釈液（５００μｌ）に、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰ溶液（１０μｌ）を混合した。

混合溶液をマグネットスタンド（ＴＡＫＡＲＡＭａｇｎｅｔｉｃＳｔａｎｄ（６ｔｕｂｅｓ））で２３時間静置させ、磁気分離を行った。磁気分離後、混合溶液の上清を取り除き、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰとマグネットとによって磁気分離を行った沈殿物を回収した。

［糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子−ウイルス結合体の破砕とリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲよるウイルス検出］
磁気分離によって得た沈殿物に、０．１％ＳＤＳ溶液１０μｌを加えてウイルス粒子の破砕を行い、沈殿画分とした。また、対照として、糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子を用いなかったウイルス溶液と、磁気分離後の上清画分からも各１０ μｌを採取し、０．１％ＳＤＳ溶液１０ μｌを加えて、対照画分を調製した。

１反応あたりの試薬は、２×ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＲＴ−ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ４を１２．５μｌ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ１ｓｔｅｐＥｎｚｙｍｅＭｉｘ２を１μｌ、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水を５．５μｌ、および、６．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を２ μｌ混合したものを使用した。

ＲＴ−ＰＣＲから得られたＲＮＡ増幅曲線から、ウイルスを捕捉して磁気分離した沈殿画分のＣｔ値とＴｍ値を表２に示す。その結果、糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子（ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰ）を用いた沈殿画分のＣｔ値（２６．１７）は、糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子（ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰ）を用いなかったサンプルのＣｔ値（３０．０５）よりも、３．８８サイクル早く、上清画分よりも４．５２サイクル早いことが確認された。なお、プラスミドは目的遺伝子の陽性対照である。

このことから、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰで磁気分離したウイルス溶液は、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰを用いなかったサンプル溶液および上清画分よりもそれぞれ１４．７２倍、２２．９４倍のウイルス濃度に調製できたことが示された。

〔実施例３〕
［糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子による口腔液中の豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の捕捉と磁気分離による濃縮］
実施例２で調製したＤＳ２５−ＭＳＧＮＰを用いてＰＲＲＳＶ粒子の捕捉を行った。臨床分離株のＰＲＲＳＶを、子豚から単離した肺胞マクロファージ細胞を用いて培養し、その培養上精をＰＢＳ（１％ＰＳ入り）で３００倍、１０００倍、１００００倍に希釈した。

約６０日齢の豚群（約８０頭）からロープ法で採取した口腔液（唾液）を、ＰＢＳ（１％ＰＳ入り）で倍に希釈し、さらに１０％ＤＴＴ（dithiothereitol）入りのＰＢＳ（１％ＰＳ入り）で倍に希釈した。

各々のウイルス希釈液と口腔液の希釈液とを３００μＬずつ混合し、遠心分離（１００００Ｇ、３０秒）して、固形物を省いた上清５００μＬを得た。これに、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰ溶液（１０μｌ）を混合し、さらに第二磁性体を約１０ｍｇ加えた後、数回のピペッティングによって混合し、混合溶液を得た。上記第二磁性体としては、シリカでコーティングした四酸化三鉄を用いた。上記第二磁性体の粒子径は１０〜４０μｍであった、
次に、混合溶液をマグネットスタンド（ＴＡＫＡＲＡＭａｇｎｅｔｉｃＳｔａｎｄ（６ｔｕｂｅｓ））で５秒間静置させ、磁気分離を行った。磁気分離後、混合溶液の上清を取り除き、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰとマグネットとによって磁気分離を行った沈殿物を回収した。

［糖鎖固定化磁性金銀ナノ粒子−ウイルス結合体の破砕とリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲよるウイルス検出］
磁気分離によって得た沈殿物に、０．１％ＳＤＳ溶液１０μｌを加えてウイルス粒子の破砕を行い、沈殿画分とした。得られた溶液の各２μｌを、ＰＣＲ用試薬２３μｌに添加し、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。試薬としては、ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲＫｉｔ II（タカラバイオ、製品コードＲＲ０８６Ａ）を使用した。

１反応あたりの試薬は、２×ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＲＴ−ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ４を１２．５μｌ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ１ｓｔｅｐＥｎｚｙｍｅＭｉｘ２を１μｌ、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１μｌ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水を５．５μｌ、６．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を２μｌ混合したものを使用した。

プライマーとしてはＦｏｒｗａｒｄＡＴＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡ（２０ｂｐ、配列番号３）およびＲｅｖｅｒｓｅＴＧＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣ（１８ｂｐ、配列番号４）を用い、ＰＲＳＳＶのＲＮＡのＭプロテインコード領域１５１ｂｐを増幅させた。

ＲＴ−ＰＣＲから得られたｃＤＮＡの増幅曲線から、ウイルスを捕捉して磁気分離した沈殿画分のＣｔ値とＴｍ値を表３に示す。３００倍希釈、１０００倍希釈、１００００倍希釈したＰＲＲＳＶと口腔液とから濃縮精製したウイルス量の差は、ＰＣＲのサイクル数の差として現れることから、３００倍希釈の溶液と１０００倍希釈の溶液とのＣｔ値の差は２．３であり、ウイルス量としては４．９倍の差となった。また、１０００倍希釈の溶液と１００００倍希釈の溶液とのＣｔ値の差は３．２２であり、ウイルス量としては９．３倍の差となった。

単純には、３００倍希釈の溶液と１０００倍希釈の溶液とのウイルス量の差は３．３倍であり、１０００倍希釈の溶液と１００００倍希釈の溶液とのウイルス量の差は１０倍である。よって、ＤＳ２５−ＭＳＧＮＰを用いた磁気分離によるウイルス濃縮は、口腔液を含んだ溶液からでも効率よくなされたことが示唆された。

医療機関や農場、畜産場では、想定外のウイルス性疾患の発生が起こりうるが、甚大な被害を防ぐためには微量なウイルスを検出し、未然に流行を防ぐことが求められている。一方で、全ての機関には微量ウイルスを濃縮するための大型機器である超遠心分離機があるわけではなく、従来の検出キットやＰＣＲ法では、体液から希薄なウイルスを検出することが困難である。

本発明は、糖鎖とウイルスとの結合性を利用し、第二磁性体を併用することで希薄なウイルス溶液からウイルス粒子を捕捉し、効率良く濃縮出来たことから、動植物のウイルス感染に対する高感度検査に利用可能で、畜産、バイオ、医薬品産業での経済的被害を未然に防ぐことが可能である。

Claims

主鎖である炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖の一端にアミノ基を備え、他端に硫黄原子を備えるリンカー化合物、糖鎖、および磁性ナノ粒子を有し、
上記アミノ基が上記糖鎖の還元末端と結合し、上記硫黄原子が上記磁性ナノ粒子と結合しており、
上記磁性ナノ粒子は、金および／または銀、並びに第一の磁性体を含有し、さらに、
上記磁性ナノ粒子は、表面が、金および／または銀によって被覆されており、
中心から金および／または銀、上記第一の磁性体、次いで金および／または銀となるコア−シェル−シェル構造を有し、
上記糖鎖は、捕捉対象となるウイルスの表面タンパク質と特異的に相互作用することができることを特徴とする、糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子。
請求項１に記載の糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子と、ウイルスを含有する検体とを混和して得られる混和物に磁力を加える工程を含むことを特徴とする、ウイルスの濃縮方法。
上記混和物が、上記糖鎖固定化磁性金属ナノ粒子よりも平均粒子径が大きい第二の磁性体を含有することを特徴とする、請求項２に記載のウイルスの濃縮方法。
上記第二の磁性体の表面が、シリカで被覆されていることを特徴とする、請求項３に記載のウイルスの濃縮方法。
請求項２から４のいずれか１項に記載のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＲＮＡを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させること、または、請求項２から４のいずれか１項に記載のウイルスの濃縮方法によって濃縮されたウイルスのＤＮＡを、リアルタイム定量的ＰＣＲによって増幅させることを特徴とするウイルス検出方法。