JP6894086B2 - 新規抗ｃｃｒ８抗体 - Google Patents

Description

本発明は、新規抗ＣＣＲ８抗体及び該抗体を含有する医薬組成物に関する。

腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が媒介する免疫抑制をはじめとする強力な負の調節機構は、腫瘍の治療にとって大きな障害である（非特許文献１）。
例えば、腫瘍に浸潤するＣＤ４陽性Ｔｒｅｇ細胞は、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害している可能性があり、効果的な癌治療の大きな障害となりうる。
ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞が媒介する腫瘍免疫抑制は、動物腫瘍モデルで十分に立証されており、腫瘍内も含めた全身性のＴｒｅｇ細胞除去により抗腫瘍効果が得られるが、一方で５０％程度の腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去では効果が認められないことが報告されている（非特許文献２）。

ヒトにおいて全ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団中のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞比（Ｔｒｅｇ細胞を含む細胞集団）の増大が、肺、乳房及び卵巣腫瘍をはじめとする、種々の癌患者の腫瘍内で検出され、存在比と患者生存率に負の相関があることが報告されている（非特許文献３〜８）。

抗ＣＤ２５抗体によってＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞を腫瘍内より除去することで、抗腫瘍効果を確認している。しかしＣＤ２５は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞及び新たに活性化されたエフェクターＴ細胞の細胞表面にも発現するため、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に除去しているとは言えない。またマウスにおいて抗ＣＤ２５抗体投与による抗腫瘍効果は限定的であり、腫瘍移植前の抗体投与でのみ治療効果を示し、腫瘍をマウスに生着させた後に抗体を投与する場合は治療効果がほとんどないことが種々の腫瘍モデルで証明されている。移植後１日目に抗ＣＤ２５抗体投与開始の場合、抗腫瘍効果は減弱し、移植後２日目以降の投与開始の場合、ほとんど抗腫瘍効果は認められていない（非特許文献９）。

現在までＴｒｅｇ細胞除去を目的として抗ＣＤ２５抗体をマウスに投与する薬効試験が実施されているが、抗腫瘍効果を示す報告はほとんどなく、移植後の抗体投与によるＴｒｅｇ細胞除去による抗腫瘍治療効果の確認は非常に困難である（非特許文献１０）。

ＣＣＲ８はＣＹ６、ＣＫＲ―Ｌ１又はＴＥＲ１とも呼ばれていた胸腺や脾臓等で発現しているＧ蛋白共役型７回膜貫通型のＣＣケモカイン受容体タンパク質であり、その遺伝子はヒトクロモゾームでは３ｐ２１に存在する。ヒトＣＣＲ８は３５５アミノ酸からなる（非特許文献１１）。ＣＣＲ８に対する内因性リガンドとしてはＣＣＬ１が知られている（非特許文献１２）。ヒトＣＣＲ８ ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ ＡＣＣ Ｎｏ． ＮＭ＿００５２０１．３に示される塩基配列で構成され、マウスＣＣＲ８ ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ ＡＣＣ Ｎｏ．ＮＭ＿００７７２０．２に示される塩基配列で構成される。

ＣＣＲ８は、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞にも特異的に発現しており、ＣＣＲ８欠損マウスと野生型マウスに乳癌細胞を移植したところ、ＣＣＲ８欠損マウスにおける乳癌の増殖と転移が野生型マウスと比較して抑制されていたことが示されている（特許文献１及び非特許文献１３）。さらに、抗ＣＣＲ８抗体を癌モデル動物に投与することにより抗腫瘍効果を示したことが開示されている（特許文献２及び３）。

特許文献４には、アレルギー性疾患及びＨＩＶ感染の治療に有用な抗ＣＣＲ８抗体が開示されている。本文献においては、４１４Ｂ、４１４Ｃ、４１４Ｅ、４３３Ｈ、４５９Ｍ、４６４Ａ、４６４Ｂ、４３３Ｂ及び４５５ＡＬで示される抗ＣＣＲ８抗体が開示されている。これらのうち、４３３Ｈの抗ＣＣＲ８抗体については、ＢＤバイオサイエンス社から販売されている。しかし、該抗体のＣＤＲ配列は開示されていない。また、抗ＣＣＲ８抗体が抗腫瘍活性を有し、癌治療に有用であることは示されていない。
非特許文献１４には、３Ｂ１０、２Ｄ１０及び５Ｂ１１で示される抗ＣＣＲ８抗体が開示されている。また、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から、品番Ｌ２６３Ｇ８の抗ＣＣＲ８抗体が販売されている。Ｒ＆Ｄ社から、品番１９１７０４の抗ＣＣＲ８抗体が販売されている。しかし、該抗体のＣＤＲ配列は開示されていない。また、抗ＣＣＲ８抗体が抗腫瘍活性を有し、癌治療に有用であることは示されていない。
特許文献５及び非特許文献１５〜１９には、ＣＣＲ８が癌の病態に関与していることが記載されている。

米国特許第１００８７２５９号明細書 国際公開第２０１８／１８１４２５号 国際公開第２０１８／１１２０３２号 国際公開第２００７／０４４７５６号 国際公開第２０１７／１９８６３１号

Nat. Rev. Immunol.、２００６年、第６巻、第４号、p.295-307 Eur. J. Immunol.、２０１０年、第４０巻、p.3325-3335 J. Clin. Oncol.、２００６年、第２４巻、p.5373-5380 Nat. Med.、２００４年、第１０巻、p.942-949 J. Clin. Oncol.、２００７年、第２５巻、p.2586-2593 Cancer、２００６年、第１０７巻、p.2866-2872 Eur. J. Cancer、２００８年、第４４巻、p.1875-1882 Cell. Mol. Immunol. ２０１１年、第８巻、p.59-66 Cancer Res.、１９９９年、第５９巻、第１３号、p.3128-33 Cancer Res.、 ２０１０年、第７０巻、第７号、p.2665-74 J. Immunol.、 １９９６年、第１５７巻、第７号、p.2759-63 J. Biol. Chem.、１９９７年、第２７２巻、第２８号、p.17251-4 Cancer Res.、２０１６年、第７６巻、第４号、Supp.1, P4-04-11 J. Exp. Med.、２００４年、第２００巻、第１０号、p1231-1241 Immunity、２０１６年、第４５巻、p1122-1134 Immunity、２０１６年、第４５巻、p1135-1147 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１８年、第１１５巻、第４５号、p10672-10681 Targeting of CCR8 induces antitumor activity as a monotherapy that is further enhanced in combination with a Listeria-based immunotherapy, ASCO 2018, Daniel O Villarreal, et al. https://www.advaxis.com/wp-content/uploads/2018/04/KeystonePosterCCR8-combo-posterFINAL.pdf Cancer Res.、２０１８年、第７８巻、第１８号、p5340-5348

本発明の目的は、新規抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片を提供することである。さらには、癌の治療薬として利用可能な新規抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片を提供することである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＣＣＲ８に特異的に結合し、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの結合を阻害するモノクローナル抗体を見出した。また、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片を、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの結合を阻害するために用いることができることを見出した。さらに、本発明のモノクローナル抗体が、抗腫瘍活性を有し、癌の治療に有用であることを見出した。また、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片が、抗腫瘍活性を有し、癌を治療するために用いることができることを見出した。すなわち、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの結合を阻害するために用いることができる。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、中和抗体として用いることができる。

本発明は、以下に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識する、ＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２）中和抗体である、（１）記載の抗体又はその抗体断片。
（３）さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の９４位から１０７位の中の１以上のアミノ酸を認識する、（１）又は（２）記載の抗体又はその抗体断片。
（４）さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７２位から２０２位の中の１以上のアミノ酸を認識する、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０位のイソロイシン、２２位のセリン、３５位のリジン、１８１位のロイシン、１８３位のシステイン及び１８８位のアスパラギンのうち、１以上のアミノ酸を認識する、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
（６）ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
（７）１）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号４のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号５のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号４のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１０のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１１のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ここで、以下のいずれかの置換を１以上有していても良い、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の２番目のセリンがトレオニンに置換、
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の３番目のセリンがトレオニンに置換、
Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の５番目のセリンがトレオニンに置換、
Ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列の２番目のグルタミンがアスパラギンに置換、
Ｅ）配列番号８のアミノ酸配列の１番目のトレオニンがセリンに置換、
Ｆ）配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のアラニンがバリンに置換、
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１８番目のリジンがアルギニンに置換、
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
Ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列の５番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号１１のアミノ酸配列の１２番目のチロシンがフェニルアラニンに置換）；
４）配列番号２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１０のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１３のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
５）配列番号１４のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１５のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１６のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１７のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１８のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１９のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；若しくは
６）配列番号２０のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２１のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２２のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号２３のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２４のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２５のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよいアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、ＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（８）１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
（ここで、以下のいずれかの置換を１以上有していても良い、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換
Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換
Ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の５番目のロイシンがイソロイシンに置換
Ｅ）配列番号４のアミノ酸配列の４番目のロイシンがイソロイシンに置換
Ｆ）配列番号４のアミノ酸配列の６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１６番目のセリンがトレオニンに置換
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換）；
２）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
４）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
５）配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；若しくは
６）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、（７）記載の抗体又はその抗体断片。
（９）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有する、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換；
Ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の５番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｅ）配列番号４のアミノ酸配列の４番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｆ）配列番号４のアミノ酸配列の６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１６番目のセリンがトレオニンに置換
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
（８）記載の抗体又はその抗体断片。
（１０）以下のいずれかの置換を１以上有する、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
（９）記載の抗体又はその抗体断片。
（１１）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
（９）又は（１０）記載の抗体又はその抗体断片。
（１２）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、さらに、配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがアルギニンに置換されている、（１１）記載の抗体又はその抗体断片。
（１３）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有する、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の２番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の３番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列の２番目のグルタミンがアスパラギンに置換；
Ｅ）配列番号８のアミノ酸配列の１番目のトレオニンがセリンに置換；
Ｆ）配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のアラニンがバリンに置換；
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１８番目のリジンがアルギニンに置換；
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換；
Ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列の５番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号１１のアミノ酸配列の１２番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
（８）記載の抗体又はその抗体断片。
（１４）ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、（７）〜（１３）のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
（１５）配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列又は
配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列又は
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
を含む、（１４）記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（１６）１）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
６）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
７）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
８）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
９）配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
１０）配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
１１）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；若しくは
１２）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有していても良い、
Ａ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換；
Ｄ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｅ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｆ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換；
Ｇ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｈ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
（１４）又は（１５）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（１７）以下のいずれかの置換を１以上有する、
Ａ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換；
Ｄ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｅ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｆ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換；
Ｇ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｈ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
（１６）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（１８）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有する、
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換；
Ｄ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｅ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換；
Ｆ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換；
Ｇ）配列番号４１のアミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｈ）配列番号４１のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換、
（１７）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（１９）以下のいずれかの置換を１以上有する、
配列番号４０又は４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換；
Ｃ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
（１７）又は（１８）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２０）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い、
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換、
（１７）〜（１９）のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２１）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されている、
（２０）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２２）配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、（２０）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２３）配列番号５４、５５若しくは５６のアミノ酸配列又は
配列番号５４、５５若しくは５６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号５７若しくは５８のアミノ酸配列又は
配列番号５７若しくは５８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
を含む、（１４）記載のヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２４）１）配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
６）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい、
Ａ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｂ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２６番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｃ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２８番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｄ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の９５番目のグルタミンがアスパラギンに置換；
Ｅ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の３１番目のトレオニンがセリンに置換；
Ｆ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６３番目のアラニンがバリンに置換；
Ｇ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６７番目のリジンがアルギニンに置換；
Ｈ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換；
Ｉ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の９９番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の１０５番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
（１４）又は（２３）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２５）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい、
Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列の２５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列の２６番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列の２８番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列の９５番目のグルタミンがアスパラギンに置換；
Ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列の３１番目のトレオニンがセリンに置換；
Ｆ）配列番号５７のアミノ酸配列の６３番目のアラニンがバリンに置換；
Ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列の６７番目のリジンがアルギニンに置換；
Ｈ）配列番号５７のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換；
Ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列の９９番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号５７のアミノ酸配列の１０５番目のチロシンがフェニルアラニンに置換、
（２４）記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２６）さらに、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域、及び、
配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有し、
配列番号５３のＣ末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい、（１４）〜（２５）のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
（２７）（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
（２８）ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
（２９）中和抗体として用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
（３０）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するために用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載のＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
（３１）ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、（３０）記載の医薬組成物。
（３２）抗体がＡＤＣＣ活性を有するものである、（２７）〜（３１）のいずれかに記載の医薬組成物。
（３３）抗体がＩｇＧ抗体である、（２７）〜（３１）のいずれかに記載の医薬組成物。
（３４）癌を治療するために用いる、（２７）〜（３３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（３５）（７）〜（１８）のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
（３６）（３５）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

（５１）（７）〜（１９）のいずれかに記載の抗体が認識する抗原上の部位を認識する、ＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５２）中和抗体である、（５１）記載の抗体又はその抗体断片。
（５３）ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、（５１）又は（５２）記載の抗体又は抗体断片。

（５４）ヒトＣＣＲ８に対し中和活性を有し、ヒトＣＣＲ８への結合に関して、（７）〜（２６）のいずれかに記載の抗体と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５５）ヒトＣＣＲ８に対し中和活性を有し、ヒトＣＣＲ８への結合に関して、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５６）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体のエピトープと完全に又は部分的に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５７）ヒトＣＣＲ８に対し中和活性を有し、ヒトＣＣＲ８への結合に関して、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５８）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体のエピトープと完全に又は部分的に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
（５９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識する抗体又はその抗体断片である、（５４）〜（５８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
（６０）さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の９４位から１０７位の中の１以上のアミノ酸を認識する、（５９）記載の抗体又はその抗体断片。
（６１）さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７２位から２０２位の中の１以上のアミノ酸を認識する、（５９）又は（６０）記載の抗体又はその抗体断片。
（６２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０位のイソロイシン、２２位のセリン、３５位のリジン、１８１位のロイシン、１８３位のシステイン及び１８８位のアスパラギンのうち、１以上のアミノ酸を認識する、（５９）〜（６１）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
（６３）ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、（５４）〜（６２）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
（６４）上記（５４）〜（６３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。

（７１）ヒトＣＣＲ８遺伝子を抗原として作製した抗体産生ハイブリドーマが産生する、（１）〜（５）又は（７）〜（１３）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。

（８１）ヒトＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片（以下の抗体を除く）であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片。
ａ）ＷＯ２００７／０４４７５６に記載された、４１４Ｂ、４１４Ｃ、４１４Ｅ、４３３Ｈ、４５９Ｍ、４６４Ａ、４６４Ｂ、４３３Ｂ及び４５５ＡＬで示される抗ＣＣＲ８抗体。
ｂ）Quらの論文（J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241）に記載された、３Ｂ１０、２Ｄ１０及び５Ｂ１１で示される抗ＣＣＲ８抗体。
ｃ）ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社の品番Ｌ２６３Ｇ８の抗ＣＣＲ８抗体。
ｄ）Ｒ＆Ｄ社の品番１９１７０４の抗ＣＣＲ８抗体。

（９１）（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を用いることを特徴とする、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害する方法。
（９２）（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
（９３）（７）〜（２６）のいずれかに記載のＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識する方法。
（９４）ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害する薬剤を製造するための、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片の使用。
（９５）癌の治療剤を製造するための、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片の使用。
（９６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識する薬剤を製造するための、（１）〜（２６）のいずれかに記載のＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片の使用。
（９７）ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
（９８）癌を治療するために用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片。
（９９）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するために用いる、（１）〜（２６）のいずれかに記載のＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＣＣＲ８に特異的に結合するので、生体試料においてヒトＣＣＲ８を検出するために使用することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＣＣＲ８を選択的に阻害する活性を有するので、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物は、医薬品、特に、ヒトＣＣＲ８関連疾患の治療又は予防のための医薬として非常に有用である。

ヒトＣＣＲ８、ヒトＣＣＲ４及びヒトＣＣＲ８の細胞外ドメインに相当するＮ末領域、ｌｏｏｐ１領域、ｌｏｏｐ２領域又はｌｏｏｐ３領域を、それぞれ対応するヒトＣＣＲ４のＮ末領域、ｌｏｏｐ１領域、ｌｏｏｐ２領域又はｌｏｏｐ３領域に置換した各キメラ体のアミノ酸配列比較。 １０Ａ１１、２７Ｇ１、１Ｈ４、１９Ｄ７、８Ｆ７及び２Ｃ７の軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 １０Ａ１１、２７Ｇ１、１Ｈ４、１９Ｄ７、８Ｆ７及び２Ｃ７の重鎖可変領域のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 １０Ａ１１の軽鎖可変領域、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２−２８及びＩＧＫＶ１−１６のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 １０Ａ１１の重鎖可変領域、ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ及びＩＧＨＶ３−７３のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 １９Ｄ７の軽鎖可変領域、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ２−１８及びＩＧＫＶ３−２０のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 １９Ｄ７の重鎖可変領域、ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ及びＩＧＨＶ３−７３のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びアライメント結果。 大腸癌由来ＣＴ２６細胞を移植したヒトＣＣＲ８ノックインマウスにおいて、抗ヒトＣＣＲ８抗体の抗腫瘍活性を移植後の腫瘍体積を測定することにより評価した。有意水準＊＊はＷｅｌｃｈ‘ｓ ｔ ｔｅｓｔによりｐ<０.０１、＊＊＊はｐ<０.００１を示す。

本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。

本発明においては、当該分野で公知の抗体作製手法が利用可能である。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載された方法等が挙げられる。
また、当該分野で公知の遺伝子操作的手法が利用可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｆｏｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２）に記載された方法等が挙げられる。

ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５に示されている（配列番号１）。ヒトＣＣＲ８の膜外ドメインは、１〜３５位アミノ酸からなるＮ末領域、９４〜１０７位アミノ酸からなるｌｏｏｐ１領域、１７２〜２０２位アミノ酸からなるｌｏｏｐ２領域、２６４〜２８０位アミノ酸からなるｌｏｏｐ３領域が該当する。ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における１７位はチロシンであり、マウスＣＣＲ８のアミノ酸配列においては、１７位は欠損している。本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、実施例３の表２に示すように、マウスＣＣＲ８には結合活性を有さない。

マウスＣＣＲ８に対するモノクローナル抗体として、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から、抗体ＳＡ２１４Ｇ２が販売されている。当該抗体はマウスＣＣＲ８の中和活性を有している。本発明者らは、当該抗体がヒトＣＣＲ８には結合活性を示さず、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における１７位のチロシンを認識しないことを確認した。また、当該抗体は、マウスＣＣＲ８のアミノ酸配列における２７位のフェニルアラニンを認識しており、当該アミノ酸が、マウスＣＣＲ８に対する中和活性の発現に関する重要なアミノ酸であることを確認した。マウスＣＣＲ８のアミノ酸配列における２７位のアミノ酸は、アライメント上、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における２９位のアミノ酸に相当する。ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における２９位のアミノ酸はロイシンである。この違いにより、マウスＣＣＲ８に対する中和活性を有するモノクローナル抗体は、ヒトＣＣＲ８には結合活性を示さないと考えられる。

本発明の抗ＣＣＲ８抗体を産生するハイブリドーマは、ヒトＣＣＲ８タンパク質、ヒトＣＣＲ８の全長をコードする遺伝子、ヒトＣＣＲ８発現細胞等を免疫原として作製することができる。ヒトＣＣＲ８の全長をコードする遺伝子を免疫原とする場合は、例えば、該遺伝子を抗原としてＤＮＡ免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合させることにより、抗ＣＣＲ８抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の一つの態様としては、本明細書記載のＣＤＲ又は重鎖可変領域／軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体又は該抗体の断片が挙げられる。該抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ。好ましくは、ＩｇＧ。）又はサブクラス由来であり得、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から取得されてもよい。該抗体又は抗体断片として、好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体の抗体断片である。

本明細書中、エピトープは、その抗原を標的とする抗体によって結合される抗原の領域を意味し、抗原がタンパク質である場合、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。本発明には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と完全に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片のみならず、部分的に同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片も包含される。

本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における１７位のチロシンを認識する、ヒトＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片である。
さらに、上記のモノクローナル抗体又はその抗体断片のうち、以下のモノクローナル抗体又はその抗体断片が好ましい。
ヒトＣＣＲ８のｌｏｏｐ１に該当する、該アミノ酸配列の９４位から１０７位の中の一以上のアミノ酸を認識するヒトＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ヒトＣＣＲ８のｌｏｏｐ２に該当する、該アミノ酸配列の１７２位から２０２位の中の一以上のアミノ酸を認識するヒトＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の２０位のイソロイシン、２２位のセリン、３５位のリジン、１８１位のロイシン、１８３位のシステイン及び１８８位のアスパラギンのうち、１以上のアミノ酸を認識するヒトＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
ここで、上記の好ましい場合において、上記に示したエピトープのうち、任意に選択される複数のエピトープを認識していてもよい。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における上記アミノ酸以外のアミノ酸をさらに認識していてもよい。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における１７位のチロシンを認識するものであれば、特に限定されないが、一つの態様として、本発明のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列は、好ましくは、以下の配列を有している。
（１）軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２、１４又は２０。
（２）軽鎖ＣＤＲ２：配列番号３、９、１５又は２１。
（３）軽鎖ＣＤＲ３：配列番号４、１０、１６又は２２。
（４）重鎖ＣＤＲ１：配列番号５、８、１２、１７又は２３。
（５）重鎖ＣＤＲ２：配列番号６、１８又は２４。
（６）重鎖ＣＤＲ３：配列番号７、１１、１３、１９又は２５。
さらに好ましくは、以下の配列を有している。
（１）軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２。
（２）軽鎖ＣＤＲ２：配列番号３又は９。
（３）軽鎖ＣＤＲ３：配列番号４又は１０。
（４）重鎖ＣＤＲ１：配列番号５、８又は１２。
（５）重鎖ＣＤＲ２：配列番号６。
（６）重鎖ＣＤＲ３：配列番号７、１１又は１３。
最も好ましくは、以下の配列を有している。
（１）軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２。
（２）軽鎖ＣＤＲ２：配列番号３。
（３）軽鎖ＣＤＲ３：配列番号４。
（４）重鎖ＣＤＲ１：配列番号５。
（５）重鎖ＣＤＲ２：配列番号６。
（６）重鎖ＣＤＲ３：配列番号７。
また、上記の各アミノ酸配列（配列番号２〜２５）において、１又は２のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されていてもよい。
ここで、本発明のモノクローナル抗体におけるＣＤＲ配列中のアスパラギンはグルタミン又はリジンに、アスパラギン酸はグルタミン酸に、ロイシはンイソロイシンに、チロシンはフェニルアラニンに、セリンはトレオニンに、及び、グリシンはグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換されていてもよい。
好ましくは、以下のいずれかの置換を１以上有していても良い、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
Ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の５番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｅ）配列番号４のアミノ酸配列の４番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｆ）配列番号４のアミノ酸配列の６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１６番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
より好ましくは、以下のいずれかの置換を１以上有していても良い。
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
さらに好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い。
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の１０番目のアスパラギンがリジンに置換；
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
また、本発明のモノクローナル抗体が以下の配列を有している場合、
（１）軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２。
（２）軽鎖ＣＤＲ２：配列番号９。
（３）軽鎖ＣＤＲ３：配列番号１０。
（４）重鎖ＣＤＲ１：配列番号８。
（５）重鎖ＣＤＲ２：配列番号６。
（６）重鎖ＣＤＲ３：配列番号１１。
以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい、
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列の２番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の３番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の５番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列の２番目のグルタミンがアスパラギンに置換。
Ｅ）配列番号８のアミノ酸配列の１番目のトレオニンがセリンに置換。
Ｆ）配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のアラニンがバリンに置換。
Ｇ）配列番号６のアミノ酸配列の１８番目のリジンがアルギニンに置換。
Ｈ）配列番号６のアミノ酸配列の１９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
Ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列の５番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
Ｊ）配列番号１１のアミノ酸配列の１２番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。

本発明において「モノクローナル抗体の抗体断片」とは、本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にヒトＣＣＲ８に特異的に結合し、ヒトＣＣＲ８を選択的に阻害する断片を意味する。本発明のモノクローナル抗体の抗体断片は、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列における１７位のチロシンを認識する。

具体的には、ヒトＣＣＲ８に対して特異的に結合するＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ；以下、ｓｃＦｖと表記する）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ； 以下、ｄｓＦｖと表記する）、２量化体Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。

Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られる、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成される、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂを製造することができる。

Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ間のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂ’は、本発明のモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂ’を製造することができる。

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のＳ−Ｓ結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られる、２つのＦａｂ’領域がヒンジ部分で結合して構成される、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦ（ａｂ’）_２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦ（ａｂ’）_２を製造することができる。

ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨ及びＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることによって製造することができる。

ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨ又はＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、適当な発現ベクターに挿入してｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該発現ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入し、発現させることによって製造することができる。

Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性が同じ又は異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性又は異なる抗原に対する２種類の特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、本発明のモノクローナル抗体に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、３〜１０残基のペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させることによって製造することができる。

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＣＣＲ８に結合することが特徴である。特に、特異的に結合するものが好ましい。

特異的結合は、少なくとも約１×１０^−６Ｍ又はそれ未満の平衡解離定数（例えば、Ｋｄが小さいほど、より緊密な結合を表す）を特徴とすることができる。Ｋｄ値は、好ましくは１×１０^−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０^−９Ｍ以下である。２つの分子が特異的に結合するかどうかを測定する方法は、当該技術分野で周知であり、競合ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴及び同様のものが挙げられる。

本発明は、ヒトＣＣＲ８への結合に関して、本明細書中に記載されているモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む。
「競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片」は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片（好ましくは、本願明細書の実施例記載の抗体。特に好ましくは、10A11。例えば、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換され、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されている抗体。）のヒトＣＣＲ８への特異的結合を阻害する抗体又はその抗体断片を意味する。あるモノクローナル抗体又はその抗体断片が本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合するかどうかを決定する。Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体の共存下、抗原（ヒトＣＣＲ８）との結合が確認できた抗体のうち、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の共存下では結合シグナルが顕著に低下する抗体を、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体として同定することができる。該結合シグナルの低下は、好ましくは５０％、より好ましくは７０％である。また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体の、該本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と抗原との結合に対するＫｉ値は、好ましくは１×１０^−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０^−９Ｍ以下である。
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗体のヒトＣＣＲ８の中和活性は、好ましくはＩＣ５０値が１０ｎＭ以下である。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害することが特徴である。「ＣＣＲ８リガンド」とは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１８など、ＣＣＲ８に結合する物質であれば特に限られないが、好ましくは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１８であり、特に好ましくはＣＣＬ１である。
ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの結合阻害能については、例えば、ヒトＣＣＬ１の場合、ヒトＣＣＲ８発現２９３細胞を用い、ヒトＣＣＬ１添加によるＣａ^２＋流入を測定し、ヒトＣＣＬ１非添加時のシグナルを阻害率１００％、ヒトＣＣＬ１添加及び抗体非添加時のシグナルを阻害率０％として、ＩＣ５０値を計算することにより決定することができる。他のＣＣＲ８リガンドの結合阻害能についても、上記ヒトＣＣＬ１の場合と同様に、決定することができる。

ヒトＣＣＬ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ２２３６２などに示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＣＣＬ８は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＩ２６２４３．１などに示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＣＣＬ１８は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＥＡＷ８０１０２．１などに示されるアミノ酸配列を有する。

本発明のモノクローナル抗体は、本明細書記載のＣＤＲ又は重鎖可変領域／軽鎖可変領域を用いて当該技術分野の定法によって作製することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、抗体低分子複合体（ＡＤＣ）及び二重特異的抗体も含む。
ヒト化モノクローナル抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的等でヒトに投与する場合に有用である。ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ； ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ； ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）へ移植したものである。従って、ヒト化モノクローナル抗体のＦＲは、ヒト由来のものである。適当なＦＲは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。この場合のＦＲとしては、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成することができるものが選択される。必要に応じ、再構成したヒト化モノクローナル抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ、Ｋ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９３年、第５３巻、８５１ページ）。置換されるＦＲのアミノ酸の割合は、全ＦＲ領域の０〜１５％、好ましくは０〜５％である。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は、好ましくは、
配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列又は
配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列又は
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
１）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
６）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
７）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
８）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
９）配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
１０）配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
１１）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；若しくは
１２）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有していても良い。
Ａ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
Ｃ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
Ｄ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｅ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｆ）配列番号４０、４２、４３、４４、４５又は４７のアミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
Ｇ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｈ）配列番号４１又は４６のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
さらに好ましくは、
１）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；若しくは
２）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい。
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミン、トレオニン、アラニン、リジン、ロイシン又はアルギニンに置換。
Ｃ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
Ｄ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｅ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｆ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
Ｇ）配列番号４１のアミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｈ）配列番号４１のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。
特に好ましくは、
１）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；若しくは
２）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい。
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
Ｃ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
最も好ましくは、
１）配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；若しくは
２）配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、
配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、
さらに、以下のいずれか一つの置換を有していても良い。
Ａ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがロイシン又はアルギニンに置換。
配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されているヒト化モノクローナル抗体が最も好ましい。

本発明のヒト化モノクローナル抗体における軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列としては、例えば、表１の組合せが挙げられる。

ここで、上記表１の「置換の種類」における各記号は、それぞれ以下の置換を意味する。
（１）配列番号４０又は４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
Ａ）アミノ酸配列の３３番目のアスパラギンがリジンに置換。
Ｂ１）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがグルタミンに置換。
Ｂ２）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがトレオニンに置換。
Ｂ３）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがアラニンに置換。
Ｂ４）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがリジンに置換。
Ｂ５）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがロイシンに置換。
Ｂ６）アミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換。
Ｃ）アミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換。
Ｄ）アミノ酸配列の５９番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｅ）アミノ酸配列の９７番目のロイシンがイソロイシンに置換。
Ｆ）アミノ酸配列の９９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
（２）配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
Ｇ）アミノ酸配列の６５番目のセリンがトレオニンに置換。
Ｈ）アミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換。

本発明のヒト化モノクローナル抗体の別の態様としては、
配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列又は
配列番号４０、４２、４３、４４、４５若しくは４７のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の２６番目はセリン、２７番目はリジン、３０番目はロイシン及び９８番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列又は
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の３３番目はアラニン、３５番目はチロシン、５２番目はアルギニン、５６番目はアスパラギン、６２番目はチロシン、１０２番目はアルギニン、１０３番目はフェニルアラニン、１０４番目はチロシン、１０９番目はグリシン及び１１３番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
配列番号４０若しくは４２のアミノ酸配列又は
配列番号４０若しくは４２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の２６番目はセリン、２７番目はリジン、３０番目はロイシン及び９８番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列又は
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の３３番目はアラニン、３５番目はチロシン、５２番目はアルギニン、５６番目はアスパラギン、６２番目はチロシン、１０２番目はアルギニン、１０３番目はフェニルアラニン、１０４番目はチロシン、１０９番目はグリシン及び１１３番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。
さらに好ましくは、
配列番号４２のアミノ酸配列若しくは
配列番号４２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の２６番目はセリン、２７番目はリジン、３０番目はロイシン及び９８番目はグルタミン酸である軽鎖可変領域並びに
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列若しくは
配列番号４１若しくは４６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の３３番目はアラニン、３５番目はチロシン、５２番目はアルギニン、５６番目はアスパラギン、６２番目はチロシン、１０２番目はアルギニン、１０３番目はフェニルアラニン、１０４番目はチロシン、１０９番目はグリシン及び１１３番目はアスパラギン酸である重鎖可変領域を含む。

本発明のヒト化モノクローナル抗体はまた、好ましくは、
配列番号５４、５５若しくは５６のアミノ酸配列又は
配列番号５４、５５若しくは５６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域並びに
配列番号５７若しくは５８のアミノ酸配列又は
配列番号５７若しくは５８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。
より好ましくは、
１）配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
６）配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含み、以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい、
Ａ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｂ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２６番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｃ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の２８番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｄ）配列番号５４、５５又は５６のアミノ酸配列の９５番目のグルタミンがアスパラギンに置換；
Ｅ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の３１番目のトレオニンがセリンに置換；
Ｆ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６３番目のアラニンがバリンに置換；
Ｇ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６７番目のリジンがアルギニンに置換；
Ｈ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換；
Ｉ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の９９番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号５７又は５８のアミノ酸配列の１０５番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。
さらに好ましくは、
配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、以下のいずれかの置換を１以上有していてもよい、
Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列の２５番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列の２６番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列の２８番目のセリンがトレオニンに置換；
Ｄ）配列番号５６のアミノ酸配列の９５番目のグルタミンがアスパラギンに置換；
Ｅ）配列番号５７のアミノ酸配列の３１番目のトレオニンがセリンに置換；
Ｆ）配列番号５７のアミノ酸配列の６３番目のアラニンがバリンに置換；
Ｇ）配列番号５７のアミノ酸配列の６７番目のリジンがアルギニンに置換；
Ｈ）配列番号５７のアミノ酸配列の６８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換；
Ｉ）配列番号５７のアミノ酸配列の９９番目のアスパラギンがグルタミンに置換、
Ｊ）配列番号５７のアミノ酸配列の１０５番目のチロシンがフェニルアラニンに置換。

なお、本発明のヒト化モノクローナル抗体には、ヒト抗体の定常領域が使用される。好ましいヒト抗体の定常領域としては、重鎖としてはＣγが挙げられ、例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を、軽鎖としてはＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体のＣ領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等いかなるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはＩｇＧを用いることが好ましく、さらにＩｇＧ１又はＩｇＧ４が好ましい。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は、重鎖定常領域のＣ末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい。好ましくは、配列番号５２のアミノ酸配列の軽鎖定常領域及び配列番号５３のアミノ酸配列の重鎖定常領域を有し、配列番号５３のＣ末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい。

ヒト化モノクローナル抗体は一般的な製造方法により作製することができる（例えば、ＷＯ９５／１４０４１号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報等参照）。具体的には、まずマウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のＦＲを連結するように設計した可変領域をコードするＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報参照）。得られたＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込む。又は、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体の定常領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

上記の形質転換体の宿主細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の脊椎動物細胞、原核細胞、酵母等が挙げられる。形質転換体は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養により、形質転換体細胞内又は細胞外に本発明のモノクローナル抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、ＣＯＳ細胞の場合、ＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。該形質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタンパク質合成能を著しく低下せしめない温度であればいずれでもよいが、好適には３２〜４２℃、最も好適には３７℃で培養することが好ましい。また必要に応じて、１〜１０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養することができる。

上記により形質転換体の細胞内又は細胞外に生産される本発明のモノクローナル抗体を含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知の分離操作法により、分離・精製することができる。かかる方法としては、具体的には例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、及びこれらの組み合わせ等を採用できる。該方法により、容易に高収率、高純度で本発明のモノクローナル抗体を製造できる。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子により修飾されていてもよい。抗体の修飾方法はこの分野で公知の方法を利用することができる。

また本発明のモノクローナル抗体は、そのＮ末端あるいはＣ末端に他のタンパク質を融合してもよい（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １０， １２７４−１２８１）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。

本発明のモノクローナル抗体には、抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合している抗体が含まれる。なお、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していなくてもよい。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いて作製される抗体が挙げられる。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有する。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、Ｔｒｅｇ細胞又はマクロファージ細胞を除去させる観点から、ＣＣＲ８を発現する細胞に対してＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；抗体依存性細胞介在性細胞傷害）活性を有する抗体又はその抗体断片が好ましい。ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、標的細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、標的細胞等を傷害する活性を意味する。エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。なお、本発明においては、生体内で、Ｔｒｅｇ細胞又はマクロファージ細胞等の細胞表面抗原（ＣＣＲ８）に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、Ｔｒｅｇ細胞又はマクロファージ細胞等を傷害し、結果として腫瘍細胞等を傷害する場合も含む。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＣＣＲ８の中和抗体や中和抗体断片が好ましい。ＣＣＲ８の中和抗体又は中和抗体断片とは、ＣＣＲ８に対する中和活性を有する抗体又は抗体断片を意味する。ＣＣＲ８に対する中和活性を有するか否かは、例えば、ＣＣＲ８リガンドのいずれか（例えば、ＣＣＬ１）のＣＣＲ８に対する生理作用を抑制するか否かを測定することにより判別できる。例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＣＬ１のＣＣＲ８への結合、あるいはＣＣＬ１によるＣＣＲ８発現細胞の遊走又は細胞内Ｃａ^２＋増加又はＣＣＬ１刺激に感受性のある遺伝子の発現変動などを測定することが挙げられる。また、後述の実施例記載の方法にて測定することもできる。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の、ＣＣＲ８とＣＣＬ１の結合に対する中和活性は、あらかじめＣａ^２＋指示薬を取り込ませたヒトＣＣＲ８発現２９３細胞に対し、培地で希釈した抗体希釈液を添加して測定することができる。ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの親和性は、ＣＣＬ１が最も強く、ＣＣＬ１に対して高い阻害活性を有する抗体が有用である。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の中和活性は、ＩＣ５０値が１０ｎＭ以下であることが好ましい。中和活性は、より好ましくは、ＩＣ５０値が５ｎＭ以下、さらに好ましくは２ｎＭ以下、特に好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは０．５ｎＭ以下である。

ヒトＣＣＲ８を認識する抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片においては、ヒトＣＣＲ８を強く認識する抗体又はその抗体断片が好ましい。ヒトＣＣＲ８を強く認識する抗体又はその抗体断片を選択する際に、中和活性の強度を指標にして、抗体又はその抗体断片を選択することで、より強くヒトＣＣＲ８を認識する抗体又はその抗体断片を選択することができる。

ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識する抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片は、ＣＣＲ８とＣＣＬ１の結合を阻害し、中和活性を有する抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片として有用である。また、ヒトＣＣＲ８をより強く認識する抗体又はその抗体断片を選択するという点では、中和活性の高い抗体又はその抗体断片が好ましい。たとえば、以下のような抗体又はその抗体断片が好ましい。
ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンに加え、さらに、ヒトＣＣＲ８のｌｏｏｐ１に該当する、該アミノ酸配列の９４位から１０７位の中の一以上のアミノ酸及び／又はヒトＣＣＲ８のｌｏｏｐ２に該当する、該アミノ酸配列の１７２位から２０２位の中の一以上のアミノ酸を認識する抗体又はその抗体断片がより好ましい。
また、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンに加え、さらに、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の２０位のイソロイシン、２２位のセリン、３５位のリジン、１８１位のロイシン、１８３位のシステイン及び１８８位のアスパラギンのうち、１以上のアミノ酸を認識する抗ＣＣＲ８抗体又はその抗体断片がより好ましい。

ヒトＣＣＲ８を認識する抗体として、以下の抗体が知られている。
ａ）ＷＯ２００７／０４４７５６に記載された、４１４Ｂ、４１４Ｃ、４１４Ｅ、４３３Ｈ、４５９Ｍ、４６４Ａ、４６４Ｂ、４３３Ｂ及び４５５ＡＬで示される抗ＣＣＲ８抗体。
ｂ）Quらの論文（J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241）に記載された、３Ｂ１０、２Ｄ１０及び５Ｂ１１で示される抗ＣＣＲ８抗体。
ｃ）ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社の品番Ｌ２６３Ｇ８の抗ＣＣＲ８抗体。
ｄ）Ｒ＆Ｄ社の品番１９１７０４の抗ＣＣＲ８抗体。
ａ）の抗ＣＣＲ８抗体については、ＷＯ２００７／０４４７５６において、エピトープ解析によりヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１位から３９位と結合することが開示されている。しかし、詳細なエピトープ部位については全く解析も開示もされていない。
ｂ）〜d）の抗ＣＣＲ８抗体については、エピトープ部位については全く開示されていない。すなわち、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片を、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンド（例えば、ＣＣＬ１）の結合を阻害するために用いることができることは、いずれの文献にも開示も示唆もされていない。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有するものが好ましい。本発明のモノクローナル抗体が腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有しているか否かは、例えば、特許文献２の実施例記載の方法にて測定することができる。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有するものが好ましい。本発明の抗体又はその抗体断片が腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有しているか否かは、例えば、特許文献２の実施例記載の方法にて測定することができる。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、医薬組成物として有用である。特に、ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するモノクローナル抗体又はその抗体断片は、医薬組成物として非常に有用である。したがって本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物は、経口的又は非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができる。

本発明の医薬組成物は、ＣＣＲ８関連疾患の治療及び／又は予防のための医薬として非常に有用である。特に、ＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞の腫瘍内浸潤が生じている癌を治療及び／又は予防するための医薬として非常に有用である。例えば、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、血球癌（白血病、リンパ腫等）、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌等の癌、好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎癌及び肉腫、より好ましくは乳癌、大腸癌、腎癌及び肉腫を治療及び／又は予防するための医薬として非常に有用である。

本発明の「癌治療用医薬組成物」における「癌」には、すべての固形癌及び血液癌が含まれる。具体的には、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、血球癌（白血病、リンパ腫等）、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌等が挙げられる。好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎癌、肉腫が挙げられ、より好ましくは乳癌、肺癌、大腸癌、腎癌、肉腫が挙げられる。
また、本発明の「癌治療用医薬組成物」における「癌」は、腫瘍特異抗原を発現する癌が好ましい。

なお、本明細書記載の「癌」は、卵巣癌、胃癌等の上皮性の悪性腫瘍のみならず、慢性リンパ性白血病やホジキンリンパ腫等の造血器がんを含む非上皮性の悪性腫瘍も意味するものとし、本明細書において、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」、「癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」等の用語は互いに区別されず、相互に交換可能である。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、
（１）本発明の医薬組成物の治療効果の補完及び／又は増強、
（２）本発明の医薬組成物の動態、吸収改善、投与量の低減及び／又は、
（３）本発明の医薬組成物の副作用の軽減、
のために他の薬剤と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と他の薬剤の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与及び時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を先に投与し、他の薬剤を後に投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を後に投与してもかまわず、それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と併用してもよい他の薬剤としては、例えば抗ＰＤ―１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が好ましく、抗ＰＤ―１抗体がより好ましい。

本発明において、抗ＰＤ―１抗体としては、例えば、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）が挙げられる。

本発明において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）が挙げられる。

本発明において、抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、例えば、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）が挙げられる。

本発明の医薬組成物の対象患者は癌患者であるか又はその疑いがあることが想定される。本発明の医薬組成物の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり５〜５０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明は、さらに、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを包含する。

該ポリヌクレオチドは、本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等のヌクレオチドからなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により製造するために使用することができる。また本発明のモノクローナル抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングするために、プローブとして用いることもできる。即ち本発明のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、又はその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のモノクローナル抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。

ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， ９．４７−９．５８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ， １９８９）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度等複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明のモノクローナル抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のモノクローナル抗体には、本発明のモノクローナル抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも７５％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ． Ｊ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）記載のアルゴリズムに従えばよい。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＣＣＲ８に特異的に結合するため、生体試料においてＣＣＲ８を検出するために使用することができる。生体試料としては、血液、血漿、血清、尿、臓器、組織、骨髄、リンパ節等が挙げられる。そのため、本発明のモノクローナル抗体を含有するキットはＣＣＲ８検出用キットとして利用可能である。該キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含み、さらに、標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのＣＣＲ８タンパク質、使用説明書等を含んでいてもよい。

本発明には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が認識する抗原上の部位を認識する、ＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片も含まれる。すなわち、ＣＣＲ８への結合において、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に競合するモノクローナル抗体又はその抗体断片も本発明に含まれる。たとえば、実施例３のclone No. 10A11などの抗体や、本願明細書記載のＣＤＲ配列を軽鎖及び長鎖可変領域に有する抗体を用いて、競合実験を行うことにより、上記抗体を選択することができる。

以下に本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

実施例１：抗ヒトＣＣＲ８抗体産生マウスハイブリドーマの作製
ヒトＣＣＲ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５）の全長をコードする遺伝子を抗原とし、Ａ／Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ雌性マウスにＤＮＡ免疫した。ＤＮＡ免疫は、２週間隔で２回又は３回繰り返し、最終免疫１週間後にヒトＣＣＲ８発現Ｅｘｐｉ２９３細胞を腹腔内投与することでブーストした。その３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３６３−Ａｇ８．、東京腫瘤研究所）をＰＥＧ法を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地で選択した。抗ヒトＣＣＲ８抗体及び抗ヒトＣＣＲ８中和抗体はこの培養上清を用い、下記の方法により選抜した。
抗ヒトＣＣＲ８抗体は、培養上清をヒトＣＣＲ８発現Ｅｘｐｉ２９３細胞及びヒトＣＣＲ４発現Ｅｘｐｉ２９３細胞とそれぞれ反応させ、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で検出することにより、ヒトＣＣＲ８に対してのみ特異的に結合するクローンを選抜した。
抗ヒトＣＣＲ８中和抗体は、あらかじめＣａ^２＋指示薬を取り込ませたヒトＣＣＲ８発現２９３細胞に対して培養上清を十分に反応させたのちに、ＦＬＩＰＲにより２００ｎＭ ｈＣＣＬ１（バイオレジェンド社製）添加によるＣａ^２＋流入を測定し、ｈＣＣＬ１刺激によるＣａ^２＋流入を阻害するクローンを選抜した。
特に強い中和活性を示すクローン（％ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＞８０％）と、中和活性をもたないクローンをそれぞれクローニングし、ハイブリドーマを樹立した。

実施例２：抗ヒトＣＣＲ８抗体産生ラットハイブリドーマの作製
免疫原であるヒトＣＣＲ８発現Ｒａｔ−１細胞は、ｐＱＣＸＩＰ（クロンテック社）に
ヒトＣＣＲ８遺伝子をクローニングした発現ベクターをＲａｔ−１細胞にトランスフェクションしたのちに、ピューロマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）で一ヶ月間薬剤選択することにより作製した。
ヒトＣＣＲ８発現Ｒａｔ−１細胞をラットに一回免疫し、約２週間後にリンパ節を回収して常法によりハイブリドーマを作製した。
抗ヒトＣＣＲ８抗体は、ハイブリドーマ培養上清をヒトＣＣＲ８発現２９３細胞と２９３細胞にそれぞれ反応させ、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ラットＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で検出することで、ヒトＣＣＲ８に特異的に結合可能なクローンを選抜した。

実施例３：抗ヒトＣＣＲ８中和抗体及び非中和抗体のエピトープ解析
実施例１で樹立した抗ヒトＣＣＲ８抗体産生ハイブリドーマについて、無血清培地培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＧ精製及び、ゲル濾過精製により、４０種類のクローンの精製抗体を得た。得られた４０種類のクローンのうち、２７種類の中和抗体及び１３種類の非中和抗体の精製抗体を用い、下記の方法で抗原結合試験を実施することにより、中和活性に重要なエピトープを同定した。各クローンの中和活性は実施例１記載の方法で１００ｎＭ ｈＣＣＬ１（バイオレジェンド社製）添加によるＣａ^２＋流入に対する阻害活性をＦＬＩＰＲにより測定した。各中和抗体は、１００ｎＭ ｈＣＣＬ１刺激によるＣａ^２＋流入阻害活性のＩＣ５０値が２ｎＭ以下であった。
ヒトＣＣＲ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５ 配列番号１）の全長をコードする遺伝子及びヒトＣＣＲ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６７９ 配列番号４８）の全長をコードする遺伝子、マウスＣＣＲ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５６４８４ 配列番号３９）の全長をコードする遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングした。これをトランスフェクションすることで一過性にヒトＣＣＲ８、ヒトＣＣＲ４、マウスＣＣＲ８を発現させたＥｘｐｉ２９３細胞を作製した。この細胞に各クローンの精製抗体の希釈系列を反応させ、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で検出することにより、その結合性を評価した。その結果、いずれの抗体もヒトＣＣＲ８には結合するが、ヒトＣＣＲ４、マウスＣＣＲ８には全く結合しなかった。
そこで、ヒトＣＣＲ８の細胞外ドメインに相当するＮ末領域（配列番号１の１−３５位アミノ酸）、ｌｏｏｐ１領域（配列番号１の９４−１０７位アミノ酸）、ｌｏｏｐ２領域（配列番号１の１７２−２０２位アミノ酸）、ｌｏｏｐ３領域（配列番号１の２６４−２８０位アミノ酸）をそれに対応するヒトＣＣＲ４のＮ末領域（配列番号４８の１−３９位アミノ酸）、ｌｏｏｐ１領域（配列番号４８の９８−１１１位アミノ酸）、ｌｏｏｐ２領域（配列番号４８の１７６−２０６位アミノ酸）、ｌｏｏｐ３領域（配列番号４８の２６８−２８４位アミノ酸）に置換したキメラ体（図１）を作製し、上述の方法と同様の方法により、各抗体の結合性を評価した。
５ｕｇ／ｍＬ、０．５ｕｇ／ｍＬ、０．０５ｕｇ／ｍＬでの結合を評価し、野生型のヒトＣＣＲ８（ｈＣＣＲ８）と比較して、結合活性が顕著に低下しているものを△、結合が検出限界以下まで低下しているものを×で示した。空欄は、野生型のヒトＣＣＲ８（ｈＣＣＲ８）と同程度の結合活性を示すことを意味する。
その結果、表２に示すとおり、中和活性を有する抗体はいずれもＮ末領域をヒトＣＣＲ４（Ｎ−ｔｅｒ ｈＣＣＲ４−ｈＣＣＲ８）に置換することでその結合活性は検出限界以下となり、Ｎ末領域が中和活性発揮に重要なエピトープであることが明らかになった。さらに、ｌｏｏｐ１ヒトＣＣＲ４置換ヒトＣＣＲ８、及びｌｏｏｐ２ヒトＣＣＲ４置換ヒトＣＣＲ８に対しても結合活性が低下した。以上のことから、強い中和活性を有する抗ＣＣＲ８抗体はＮ末領域を強く認識し、かつｌｏｏｐ１及びｌｏｏｐ２にも結合するような立体構造認識をしていると考えられる。
なお、ヒトＣＣＲ８、ヒトＣＣＲ４及びマウスＣＣＲ８のいずれも認識しない抗体をコントロールとして使用したが、コントロール抗体は各抗原とは結合しなかった。また、各抗原のＮ末にタグを付与し、抗タグ抗体により検出することで、変異によりｈＣＣＲ８の発現が低下しないことを確認した。
さらに、強い中和を有するすべてのクローンについて共通するエピトープ領域であるＮ末領域についてより詳細に解析すべく、表２に示すヒトＣＣＲ８点変異体を作製した。上述の方法と同様の方法で、この変異体に対する各クローンの結合活性を評価した結果、上記の２７種類の中和抗体は、いずれもヒトＣＣＲ８の１７位のＹをＡに置換した変異体（ｈＣＣＲ８（Ｙ１７Ａ））に対する結合活性が著しく低下し検出限界以下となったことから、１７位のＹを認識していると考えられる。また、表２にはclone No. 8F7しか示していないが、ヒトＣＣＲ８の２０位のIをＡに置換した変異体（ｈＣＣＲ８（I２０Ａ））に対する結合活性が低下している中和抗体も複数存在し、２０位のイソロイシンにも結合するようなような立体構造認識をしている中和抗体も存在すると考えられる。
一方、上記の１３種類の非中和抗体は、ｈＣＣＲ８（Ｙ１７Ａ）に対する結合活性が低下しなかったことから、同じＮ末領域を認識しているが、１７位のＹは認識していないと考えられる。このことから、１７位のＹが中和活性発揮に極めて重要なアミノ酸であると考えられる。代表的な中和抗体（clone No. 10A11, 27G1, 1H4, 8F7, 2C7）及び非中和抗体（clone No. 5B5）についての結果を表２に示す。

実施例４：抗体配列の決定
樹立したクローンのうち、表３に示すマウス抗体及び表４に示すラット抗体について、ハイブリドーマ細胞より、常法に従って抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定した。

実施例５：抗体配列のアライメント
実施例４に記載したマウスハイブリドーマ由来、抗ヒトＣＣＲ８中和抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列について抗体配列解析ソフトウェアａｂＹｓｉｓを用いたＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇと、アライメントを実施した（図２、図３）。その結果、１０Ａ１１、２７Ｇ１、１Ｈ４、１９Ｄ７，８Ｆ７のアミノ酸配列は以下に述べるとおりＣＤＲに類似した配列を含むものであった。
軽鎖のＣＤＲ１は、配列番号２の１６アミノ酸から構成されていた。
軽鎖のＣＤＲ２は、Ｒ−Ｘａａ１−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ｓ（ここで、Ｘａａ１は、Ｍ又はＶである：配列番号４９）の７アミノ酸から構成されていた（配列番号３又は９）。
軽鎖のＣＤＲ３は、Ｍ−Ｑ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｐ−Ｘａａ１−Ｔ（ここで、Ｘａａ１は、Ｌ又はＦである：配列番号５０）の９アミノ酸から構成されていた（配列番号４又は１０）。
重鎖のＣＤＲ１は、Ｘａａ１−Ｙ−Ａ−Ｘａａ２−Ｙ（ここで、Ｘａａ１は、Ｔ又はＰであり、Ｘａａ２はＬ又はＭである：配列番号５１）の５アミノ酸から構成されていた（配列番号５、８又は１２）。
重鎖のＣＤＲ２は、配列番号６の１９アミノ酸から構成されていた。
重鎖のＣＤＲ３は１０Ａ１１、２７Ｇ１、１Ｈ４が共通した配列を有し、配列番号７の１４アミノ酸から構成されていた。

実施例６：中和活性評価
樹立したハイブリドーマを無血清培地で培養し、その培養上清をＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティー精製及びゲル濾過精製を行うことで、精製抗体を得た。この精製抗体について下記の方法で中和活性を測定した。
あらかじめＣａ^２＋指示薬を取り込ませたヒトＣＣＲ８発現２９３細胞に対して培地で希釈した抗体希釈液を添加し、ＦＬＩＰＲにより２００ｎＭ ｈＣＣＬ１（バイオレジェンド社製）添加によるＣａ^２＋流入を測定した。ｈＣＣＬ１非添加時のシグナルを阻害率１００％、ｈＣＣＬ１添加及び抗体非添加時のシグナルを阻害率０％として阻害率を計算し、５０％の阻害率を示す抗体濃度をＩＣ５０とした。少なくとも３回評価を行い、ＩＣ５０をＡｖｅｒａｇｅ±ＳＤとして表記した。（表５）

実施例７：抗体のヒト化（１０Ａ１１、２Ｃ７）
１０Ａ１１、２Ｃ７について、下記の方法でヒト化を実施した。
抗体配列解析ソフトａｂＹｓｉｓを用いてＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇ及びＣＤＲの定義を実施した。マウス抗体アミノ酸配列の重鎖及び軽鎖のＶ遺伝子領域配列に類似したヒト生殖系アクセプター配列を配列解析ソフトＡｂｓｉｓで検索し、選択した。またＪ鎖領域については、マウス抗体ＤＮＡ配列と相同性の高い配列をＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）で検索しヒトフレームワーク配列とした。このヒトフレームワーク配列に対し、Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ａｕｇ１；１３２（２）：２１１−５０．（１９７０））によって定義されたマウス抗体重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及びマウス抗体軽鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３を移植することでヒト化モノクローナル抗体配列を設計した（軽鎖；図４、重鎖；図５）。実施例６に示す方法により中和活性を測定した結果、表６に示すヒト化モノクローナル抗体が、マウス抗体と同等以上の親和性を示した。

実施例７−２：抗体のヒト化（１９Ｄ７）
１９Ｄ７について、実施例７と同様の方法でヒト化を実施した（軽鎖；図６、重鎖；図７）。実施例６に示す方法により中和活性を測定した結果、表７に示すヒト化モノクローナル抗体が、マウス抗体と同等以上の親和性を示した。

実施例８：ヒト化１０Ａ１１の活性に重要なアミノ酸の特定
図４及び図５に示すヒト化１０Ａ１１について、ＣＤＲに相当するアミノ酸に点変異を導入した変異体を作製し、実施例６に示した方法により、各変異体の中和活性を算出した。各変異体について複数回中和活性評価を行い、そのＩＣ５０値をＷＴのＩＣ５０値との比として、ＩＣ５０ ｒａｔｉｏ （ＷＴ ＩＣ５０／ 変異体ＩＣ５０）で表記した。
結果を表８及び表９に示す。ｎ．ｄ．（＝ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）は、変異体のＩＣ５０値が測定系の限界値である１０ｎＭ以上であり、検出限界以下まで活性が低下していることを示す。中和活性評価の結果、軽鎖については、ＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＬ２６、Ｌ２７、Ｌ２７ｃ、Ｌ９３アミノ酸部位において変異を有するＳ２６Ｔ、Ｋ２７Ｒ、Ｌ２７ｃＩ、Ｅ９３Ｄの各変異体は１０倍以上活性が低下した（表８）。また重鎖については、ＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＨ３３、Ｈ３５、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５９、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ１００ｃ、Ｈ１０１アミノ酸部位において変異を有するＡ３３Ｖ、Ｙ３５Ｆ、Ｒ５２Ｋ、Ｎ５３Ｑ、Ｙ５９Ｆ、Ｒ９６Ｋ、Ｆ９７Ｌ、Ｙ９８Ｆ、Ｇ１００ｃＡ、Ｄ１０１Ｅの各変異体で１０倍以上活性が低下した（表９）。これらのアミノ酸は活性に極めて重要なアミノ酸である。

※アミノ酸部位はＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる部位。

※アミノ酸部位はＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる部位。

実施例８−２：ヒト化１９Ｄ７の活性に重要なアミノ酸の特定
図６及び図７に示すヒト化１９Ｄ７について、ＣＤＲに相当するアミノ酸に点変異を導入した変異体を作製し、実施例６に示した方法により、各変異体の中和活性を算出した。各変異体について複数回中和活性評価を行い、そのＩＣ５０値をＷＴのＩＣ５０値との比として、ＩＣ５０ ｒａｔｉｏ （ＷＴ ＩＣ５０／ 変異体ＩＣ５０）で表記した。
結果を表１０及び表１１に示す。ｎ．ｄ．（＝ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）は、変異体のＩＣ５０値が測定系の限界値である１０ｎＭ以上であり、検出限界以下まで活性が低下していることを示す。

※アミノ酸部位はＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる部位。

※アミノ酸部位はＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる部位。

実施例９：ヒト化１０Ａ１１の活性向上
実施例７により見出されたヒト化フレームワークに、実施例８により見出された活性向上変異と、脱アミド化リスク配列に相当する、ＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＬ２８アミノ酸部位のＮとＬ２９アミノ酸部位のＧに対する変異を組み合わせることで、ヒト化１０Ａ１１の最適化を行った。その結果、表１２に示すヒト化１０Ａ１１変異体を見出した。

※アミノ酸部位はＫａｂａｔのｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる部位。

実施例９−２：ヒト化１９Ｄ７の活性向上
実施例７−２により見出されたヒト化フレームワークに点変異を導入し、ヒト化１９Ｄ７の最適化を行った。その結果、表１３に示すヒト化１９Ｄ７変異体を見出した。

実施例１０：腫瘍移植ヒトＣＣＲ８ノックインマウス（以下、ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ）マウス）における抗ヒトＣＣＲ８抗体の抗腫瘍活性
（１）ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ)マウスの作製
マウスＣＣＲ８遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２７７６）及びヒトＣＣＲ８遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２３７）は、いずれも２つのエクソンから構成されており、第２番目のエクソン内にＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）全長が含まれている。マウスＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦ（ＣＣＤＳ ＩＤ：２３６２１．１）全長を取り除くと同時にヒトＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦ（ＣＣＤＳ ＩＤ：２６８４．１）全長を挿入することで、発現するＣＣＲ８タンパク質を完全にヒト化したｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ）マウスを作製した。
相同組換えアームとして使用するＤＮＡ断片は、マウスＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦの上流下流それぞれ約２ｋｂ（キロベース）のマウスゲノム配列をＰＣＲ増幅することにより取得し、マウス由来のゲノム配列はＯＲＦのみが取り除かれるように設計した。先のヒトＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦ全長配列の前後に相同組換えアームをそれぞれ継ぎ目なく接続することでターゲティングベクターを作製し、相同組換えに供し、ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/+）Ｂａｌｂ／ｃマウスを作製した。作製したｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/+）Ｂａｌｂ／ｃマウスについては、マウスＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦ全長とヒトＣＣＲ８遺伝子のＯＲＦ全長が正しく置き換わっており、かつ、余計な配列の挿入や欠失がないことをＰＣＲ及びＤＮＡ塩基配列解析により確認した。ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/+）Ｂａｌｂ／ｃマウスを通常交配で掛け合わせることでｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ）マウスを作製した。

（２）ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ）マウスにおける大腸癌ＣＴ２６細胞株腫瘍内浸潤細胞のヒトＣＣＲ８発現確認
ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ）マウス（６週齢、メス）の背部皮内に３．５ｘ１０^５個(５０μＬ)のＣＴ２６細胞を移植し、移植１７日目に、５例の個体より腫瘍を回収した(Ｎ=５)。ＣＴ２６細胞の腫瘍塊を、ハサミで細かく切断し、市販キット（Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ, ｍｏｕｓｅ, Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社及びＴｈｅ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ＴＭ） Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ, Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社)を用いて添付キットプロトコルに従い、腫瘍浸潤細胞を調製した。
調製された細胞は７０ｕｍのセルストレイナーに通した後、２回１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ／２%ＦＢＳで洗浄した。その後、赤血球溶解液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で５分間処理し、赤血球を除去し、さらに２％ＦＢＳ/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳバッファーで２回洗浄した。腫瘍浸潤細胞は以下の方法及び抗体により染色した。
浸潤細胞をＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）試薬を用いて、３０分間氷中で染色した。２%ＦＢＳ/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで１回洗浄後、Ｂｖ５１０標識抗マウスＣＤ４５（３０-Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、 ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４（ＲＭ４-４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ８（５３−６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗マウスＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ２５（ＰＣ６１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１標識抗ヒトＣＣＲ８抗体（４３３Ｈ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（又はＢＶ４２１標識アイソタイプコントロール抗体）で染色した。染色は３０分間氷中で実施した。２%ＦＢＳ／ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳで２回洗浄後、フローサイトメーターを用いて細胞を解析した。
ＣＤ４５＋ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞中のヒトＣＣＲ８発現を解析した。アイソタイプコントロール抗体での染色により陰性細胞領域を決定し、抗ヒトＣＣＲ８抗体で陽性となる細胞をヒトＣＣＲ８＋細胞として移植１７日後に存在頻度を算出した。その結果、マウス腫瘍内のＣＤ４５+ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞中の約４７％にヒトＣＣＲ８が検出された。

（３）大腸癌由来ＣＴ２６細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
ｈＣＣＲ８−ＫＩ（ＫＩ/ＫＩ)マウス（８週齢、メス）の背部皮内に４ｘ１０^５個の大腸癌由来ＣＴ２６細胞(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植４日目及び１１日目にヒト化１０Ａ１１抗体（軽鎖可変領域：ＩＧＫＶ４−１ Ｎ５３Ｑ＋Ｇ２９Ｒ（配列番号５９）／重鎖可変領域：ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ（配列番号４１））を静脈内に１００μｇ（１００μＬ）又は２００μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。コントロールは媒体（りん酸緩衝生理食塩水）１００μＬを投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植４、７、１０、１１、１４、１６、１８、２１、２４日後に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（ｍｍ^３）は長径（ｍｍ）ｘ短径（ｍｍ）ｘ短径（ｍｍ）／２で計量した。
その結果、移植１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目、２４日目においていずれの用量の抗ヒトＣＣＲ８抗体投与群の腫瘍体積が有意に小さかった（図８、有意水準はＷｅｌｃｈ‘ｓ ｔ ｔｅｓｔを用い、いずれの用量においても１０日目が＊＊；ｐ<０.０１、１１日目以降が、＊＊＊；ｐ<０.００１）。また抗ヒトＣＣＲ８抗体投与群では、完全退縮を示す個体が出現し、２４日目には１００μｇ抗ヒトＣＣＲ８抗体投与群で１０匹中５匹、２００μｇ抗ヒトＣＣＲ８抗体投与群で１０匹中６匹のマウスの腫瘍がほぼ完全に消失した。

実施例１１：１０Ａ１１と競合する抗ヒトＣＣＲ８抗体のスクリーニング
ヒト化１０Ａ１１抗体（軽鎖可変領域：ＩＧＫＶ４−１／重鎖可変領域：ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ）を用い、ｈＣＣＲ８との結合において、これと競合する抗体のスクリーニングを実施した。
実施例１に記載の方法と同様の方法で、ヒトＣＣＲ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５）の全長をコードする遺伝子を抗原とし、Ａ／Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ雌性マウスにＤＮＡ免疫してハイブリドーマを作製した。作製したハイブリドーマを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、９日間培養後得られた培養上清のうち１７６ｗｅｌｌについて、ヒト化１０Ａ１１抗体との競合結合試験を実施した。競合試験は、実施例１の方法で作製したヒトＣＣＲ８発現Ｅｘｐｉ２９３細胞に対し、培養上清を１０ｎＭのヒト化１０Ａ１１抗体もしくは、ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌと混合して、室温で３時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄したのちにＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で検出することにより行った。Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌの共存下、ハイブリドーマ由来抗体の結合が確認できたものを通常のヒトＣＣＲ８結合抗体であると定義した。またヒトＣＣＲ８結合抗体のうち、ヒト化１０Ａ１１抗体の共存下では結合シグナルが顕著に低下する抗体をヒト化１０Ａ１１抗体と競合する抗体として同定した。その結果、１７０ｗｅｌｌ中５６ｗｅｌｌがヒトＣＣＲ８結合抗体であった。一方この５６ｗｅｌｌ中、７ｗｅｌｌがヒト化１０Ａ１１抗体と競合する抗体であった。
さらに、競合する抗体として同定したもののうち、代表して３クローンをクローン化し、クローン化後のハイブリドーマ培養上清より精製抗体を得た。この精製抗体についてヒトＣＣＬ１−ヒトＣＣＲ８に対する中和活性を実施例１の方法により測定した。その結果いずれの抗体も中和活性を有しており（表１４）、ヒト化１０Ａ１１抗体と競合する抗体が強い中和抗体であることが示された。

実施例１２ ヒト化モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例３に記載の内容と同様、ヒト化１０Ａ１１抗体、ヒト化１９Ｄ７抗体について、エピトープ検証を実施した。実施例３で作製した、ヒトＣＣＲ４のキメラ体、ヒトＣＣＲ８Ｎ末領域の点変異体に加え、ヒトＣＣＲ８ ｌｏｏｐ１、ｌｏｏｐ２領域の点変異体についても結合評価を実施した。結合評価は各変異体をＥｘｐｉ２９３細胞に一過性発現させ、ヒト化１０Ａ１１抗体（軽鎖可変領域：ＩＧＫＶ４−１／重鎖可変領域：ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ）又はヒト化１９Ｄ７抗体（軽鎖可変領域：ＩＧＫＶ３−２０／重鎖可変領域：ＩＧＨＶ３−１５ Ｔ９４Ｒ）を２０μｇ／ｍＬから３倍ずつ８段階希釈調製した抗体溶液を反応させることにより実施した。室温で３時間反応させたのちにＡｌｅｘａ４８８標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と反応させ、フローサイトメトリー解析を実施した。また各変異体の発現量は各変異体のＮ末にタグを付与し、同様の方法で抗タグ抗体により検出することで、補正した。
結果を表１５および１６に示す。ヒトＣＣＲ８と比較して、その結合活性が７０％以下になる変異体を△、２０％以下になる変異体を×と示した。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、生体試料においてＣＣＲ８を検出するために使用することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物は、ＣＣＲ８関連疾患の治療又は予防のための医薬として非常に有用である。

Claims (15)

1. 配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
   配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
   配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
   配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
   配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
   配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
   を含み、
   配列番号３のアミノ酸配列の４番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、さらに、配列番号２のアミノ酸配列の１１番目のグリシンがアルギニンに置換されている、
   ＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片。
2. ヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項１記載の抗体又は抗体断片。
3. 配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
   配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、
   配列番号４２のアミノ酸配列の５８番目のアスパラギンがグルタミンに置換されており、配列番号４２のアミノ酸配列の３４番目のグリシンがアルギニンに置換されている、
   請求項２記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
4. 配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、請求項２記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
5. さらに、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域、及び、
   配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有し、
   配列番号５３のＣ末端にリジンが付加していてもしていなくてもよい、請求項２〜４のいずれかに記載の抗体であるヒト化モノクローナル抗体又はその抗体断片。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
7. ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
8. 中和抗体として用いる、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
9. 配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７位のチロシンを認識するために用いる、請求項１〜５のいずれかに記載のＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を含有する医薬組成物。
10. ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害するために用いる、請求項９記載の医薬組成物。
11. 抗体がＡＤＣＣ活性を有するものである、請求項６〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
12. 抗体がＩｇＧ抗体である、請求項６〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
13. 癌を治療するために用いる、請求項６〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
14. 請求項１〜４のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
15. 請求項１４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

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