JP6901245B2

JP6901245B2 - ＩｇＭを含む組成物を用いて感染関連免疫状態を治療又は予防するための方法

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Description

本発明は、IgMを含む組成物を投与することによる、免疫症状又は免疫状態の治療又は予防に関する。

微生物種は、その個体が感染を除去することができない場合、感染した患者に非常に有害になることがある。また、感染は、感染した器官から血流に拡散し、敗血症になる可能性もある。これらの敗血症性感染は、患者にとって予後不良である。

血漿由来IgMが患者への内毒素媒介性の毒性に結合し防ぐことができることは十分に特徴付けられている。これは、グリカンに結合し、それによりその作用を防止する、IgMの固有の能力又は選好性に起因する。これらの内毒素の毒性作用は、典型的には抗生物質若しくは患者の免疫系により誘導される細菌の死又は溶菌に応答するものである。

加えて、IgM組成物又はIgMを多く含む組成物の使用は、自己免疫疾患又はアテローム性動脈硬化症の治療に提案されてきたが、これはIgMと前記疾患の特定の顕著な特徴(hallmark)、例えば自己抗体との相互作用に基づくものである(Hurez, V. et.al. “Pooled Normal Human Polyspecific IgM Contains Neutralizing Anti-Idioitypes to IgG Autoantibodies of Autoimmune Patients and Protects from Exaperimental Autoimmune Disease”, Blood, 1997, Vol. 90, No. 10, 4004-4013；及びCesena, HY. “Immune-modulation by polyclonal IgM treatment reduces atherosclerosis in hypercholesterolemic apoE -/- mice”, Atherosclerosis, 2012, Vol. 220, 59-65)。

米国特許第6,307,028号

Hurez, V. et.al. "Pooled Normal Human Polyspecific IgM Contains Neutralizing Anti-Idioitypes to IgG Autoantibodies of Autoimmune Patients and Protects from Exaperimental Autoimmune Disease", Blood, 1997, Vol. 90, No. 10, 4004-4013 Cesena, HY. "Immune-modulation by polyclonal IgM treatment reduces atherosclerosis in hypercholesterolemic apoE -/- mice", Atherosclerosis, 2012, Vol. 220, 59-65

敗血性疾患(septic condition)及び他の微生物感染の合併症は、免疫系の過剰刺激(over-stimulation)と関連付けられることが多く、過度に大きく、急激に進展するので、制御することが不可能であることが多い。したがって、免疫系の過剰刺激を低減させる、阻害する、又は予防するために有効な治療レジメンの必要性が依然として存在する。

本発明の一実施態様は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る組成物を提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、敗血症の治療において用いるための、IgMを含む組成物を提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、感染により生じる免疫性合併症(immune complication)の治療において用いるための、IgMを含む組成物を提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、IgMを含む組成物の投与を含むことを特徴とする、必要とする患者における感染により生じる免疫性合併症の治療のための方法を提供する。

また、さらなる実施態様において、本発明は、IgMを含む組成物の投与を含むことを特徴とする、必要とする患者における感染の免疫調節のための方法も提供する。

より良い理解のために、本発明は、付随する図を参照して以下により詳細に記述されるが、これらの図は、例として、及び本発明の限定ではない例示的な実施例に関連して、提示されるものである。

図1は、安定なNF-κBレポータープラスミドを保有するTHP-1細胞における、大腸菌LPS誘導性NF-κB活性化に対するIgMの効果の評価について得られた結果を示す。図1Aと図1Bの両方において、y軸はNF-κB SEAPレポーターにより測定されるNF-κB活性の増加倍数を示し、この増加はNF-κB活性の誘導に比例する。また、両方の図(1A及び1B)において、x軸に様々な処置群が示される。標準誤差を各バーに表示する。図2は、安定なNF-κBレポータープラスミドを保有するTHP-1細胞における、クロストリジウム・ディフィシルのトキソイドA又はトキソイドBによるNF-κBの誘導について得られた結果を示す。NF-κB SEAPレポーターにより測定されるNF-κB活性の増加倍数をy軸に表示し、これはNF-κB活性の誘導に比例する。トキソイドA又はトキソイドBの濃度(μg/mL)をx軸に示す。図3は、安定なNF-κBレポータープラスミドを保有するTHP-1細胞における、クロストリジウム・ディフィシルのトキソイドB誘導性NF-κB活性化の阻害について得られた結果を示す。NF-κB SEAPレポーターにより測定されるNF-κB活性の増加倍数をy軸に表示し、これはNF-κB活性の誘導に比例する。様々な処置群をx軸に示す。標準誤差を各バーに表示する。図4は、安定なNF-κBレポータープラスミドを保有するTHP-1細胞における、クレブシエラ・ニューモニエ及び緑膿菌誘導性NF-κB活性化並びにIL-8分泌の阻害についての結果を示す。図4Aにおいて、y軸はNF-κB SEAPレポーターにより測定されるNF-κB活性の増加倍数を示し、これはNF-κB活性の誘導に比例する；及びx軸は様々な処置群を示す。図4Bにおいて、y軸は培養上清に分泌されるIL-8の濃度を示し；及びx軸は様々な処置群を示す。図4Bにおいて、「UD」はIL-8が未処理対照群において検出不能であったことを表す。両方の図において、標準誤差を各バーに表示する。図5は、末梢血単核細胞(PBMC)、特にT細胞における、IgM媒介性のホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)/イオノマイシン誘導性細胞増殖の阻止に関する試験について得られた結果を示す。Cell Titer Glowにより測定される、対照群に対する相対増殖の増加倍数をy軸に表示し、これは細胞増殖の誘導に比例する。様々な処置群をx軸に示す。標準偏差を各バーに表示する。

本願発明者らは、網羅的かつ広範囲の試験及び調査の末に、IgM組成物が(例えばNF-κB活性誘導を減少させる及び/又は末梢血単核細胞の増殖を低減させることにより)免疫調節活性を阻害することを見出し、これにより、前記組成物は、免疫系の過剰刺激、例えば、敗血性疾患に関連する免疫系の過剰刺激に関連する状態の治療に適したものとなる。

本発明の一実施態様は、医薬担体中に、血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る組成物を提供する。特定の実施態様によれば、1種以上の賦形剤及び/又は医薬担体は合成である、すなわち非天然起源である。

本願明細書で用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、本発明の血漿由来IgMと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、若しくは他の合成溶媒等の、石油、動物、植物、又は合成由来のものを含む、水及び油等の無菌の液体であってもよい。また、生理食塩水溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体、特に注射溶液として使用することができる。特定の実施態様によれば、医薬的に許容される担体は合成である(すなわち、担体は天然起源でない)。

適切な賦形剤の非限定的な例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。また、賦形剤には、湿潤剤若しくは乳化剤、又は酢酸塩、クエン酸塩、若しくはリン酸塩等のpH緩衝化剤；ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；及び塩化ナトリウム若しくはデキストロース等の張性(tonicity)の調整のための剤を含んでもよい。特定の実施態様によれば、1種以上の賦形剤は合成である(すなわち、賦形剤は天然起源でない)。

また、本発明の実施態様は、内毒素(エンドトキシン)媒介性の免疫応答から独立している微生物感染への応答を免疫調節するための方法にも関する。

したがって、第一の実施態様において、本発明は、敗血症の治療における使用のための、IgMを含む組成物を提供する。

第二の実施態様において、本発明は、感染により生じる免疫性合併症の治療における使用のための、IgMを含む組成物を提供する。

またさらに、本発明は、IgMを含む組成物の投与を含むことを特徴とする、必要とする患者における感染の免疫調節のための方法を提供する。

本願明細書で使用される「高サイトカイン血症」及びその複数形は、サイトカインと、T細胞及びマクロファージを含む白血球細胞との間の正のフィードバックループの結果としての炎症性サイトカイン生産の過剰を特徴とする、免疫性合併症を意味する。

本願明細書で使用される「高凝固障害(hypercoagulopathy)」及びその複数形は、微生物及びその生産物による、血小板等の特定の血液細胞成分並びに外因性及び内因性の経路の血液凝固因子の極度の活性化から生じる免疫性合併症を意味する。

一実施態様において、本発明は、敗血症の治療において用いるための、IgMを含む組成物を提供する。特定の実施態様によれば、組成物は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る。

敗血症は、1種以上の細菌(グラム陽性又はグラム陰性)、1種以上の真菌(例えば、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus))、1種以上のウイルス、又はこれらの組み合わせにより生じ得る。好ましい実施態様において、敗血症は1種以上の細菌により生じ、より好ましくは、敗血症は大腸菌(Escherichia coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、又はこれらの組み合わせにより生じる。

敗血症又は敗血性疾患の治療は、炎症性応答又は免疫系の過剰活性化等の免疫性合併症の治療を通して行われ、そしてこれは免疫調節を通して行われる。免疫調節は、好ましくは内毒素媒介性の免疫応答から独立しており、様々な手段によりもたらされ得る。好ましい実施態様において、免疫調節は、NF-κB誘導の阻害を通して行われる。別の実施態様において、免疫調節は、末梢血単核細胞、好ましくはT細胞の増殖の阻害を通して行われる。最も好ましい実施態様において、免疫調節は、上述の両方の手段によりもたらされる。

組成物は、好ましくは少なくとも90% (w/v)のIgM純度、より好ましくは少なくとも95% (w/v)のIgM純度を有する。最も好ましい実施態様において、組成物は95% (w/v)のIgM純度を有する。

投与される組成物の用量は、好ましくは75 mg IgM/患者1kg〜1 g IgM/患者1kg、より好ましくは75 mg IgM/患者1kg〜600 mg IgM/患者1kg、及び最も好ましくは75 mg IgM/患者1kg〜300 mg IgM/患者1kgである。加えて、組成物は、好ましくは、少なくとも週1回若しくは隔日若しくは週3回、又は毎日、提供又は投与される。

加えて、前記IgMは、組換え、血漿由来、細胞培養由来、トランスジェニック、又は化学合成されたものであり得る。

IgMが組換えの場合、タンパク質の発現、生産、及び精製の分野における任意の手法に従って得ることができる。例えば、IgM核酸配列を、選択した宿主細胞、例えば、細菌(大腸菌、枯草菌(Bacilus subtilis)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、及びブドウ球菌属(Staphylococcus))、酵母(サッカロマイセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、又はクリベロマイセス属(Kluyveromyces))、昆虫細胞(カイコ(Bombyx mori)、ヨトウガ(Mamestra brassicae)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、又はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))、又は哺乳類細胞(HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS-1)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、ヒトアデノウイルス形質転換293細胞、マウスL-929細胞、HaKハムスター細胞株、Swiss、Balb-c、若しくはNIHマウス由来のマウス3T3細胞、CV-1細胞株、一次組織又は一次移植片のインビトロ培養由来の細胞株における発現に適した任意のベクターに挿入することができる。

細胞培養由来のIgMは、任意の最先端の周知の方法又は手順、例えばハイブリドーマ法により生産することができる。

トランスジェニックの又は化学合成されたIgMは、任意の最先端の周知の方法又は手順により生産することができる。

好ましい実施態様において、IgMは血漿由来IgMであり、血漿の適切な画分、例えば、米国特許第6,307,028号に記述される、IgGの回収後の2つのANXカラム手順の洗浄画分(wash)又はネガティブセレクションアフィニティークロマトグラフィー若しくはサイズ排除クロマトグラフィーによる前記画分のさらなる精製から単離される。

前記血漿由来IgMに関して、場合により、これを単離又は精製して所与の外毒素(エキソトキシン)、分泌型タンパク質、微生物種、又はこれらの組み合わせに対する特定の抗体の相対量を増加させることができる。

特定の実施態様によれば、IgMを含む組成物は単独で投与されることが予期される。

別の実施態様において、IgMを含む組成物は、1種以上の他の組成物又は分子と一緒に投与される。前記他の組成物又は分子は、好ましくは、抗炎症分子、抗生物質(例えば、小分子抗生物質、天然の抗菌性の分子、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、及び/又は抗菌特性を有するタンパク質)、他の免疫調節剤、又はこれらの組み合わせから選択される。好ましい実施態様において、前記他の組成物又は分子は、バンコマイシン、メロペネム、ラクトフェリン、又はこれらの組み合わせである。上述の、IgMを含む組成物の1種以上の他の組成物又は分子と一緒の投与には、全ての組成物若しくは分子を同時に投与すること、又は提供する組成物若しくは分子を順々に投与することが含まれる。

IgMを含む組成物は、上述のとおり敗血症の治療のため、及び前記疾患の予防のための両方に用いることができる。

さらなる実施態様において、本発明は、感染により生じる免疫性合併症の治療における使用のための、IgMを含む組成物を開示する。

感染は、1種以上の細菌(グラム陽性又はグラム陰性)、1種以上の真菌(例えば、アスペルギルス・フラバス)、1種以上のウイルス、又はこれらの組み合わせにより生じ得る。好ましい実施態様において、感染は1種以上の細菌により生じ、より好ましくは、感染は大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、クレブシエラ・ニューモニエ、肺炎レンサ球菌、クロストリジウム・ディフィシル、ボツリヌス菌、又はこれらの組み合わせにより生じる。

炎症性応答又は免疫系の過剰活性化等の免疫性合併症の治療は、免疫調節を通して行われる。前記免疫調節は、好ましくは内毒素媒介性の免疫応答から独立しており、様々な手段によりもたらされ得る。好ましい実施態様において、免疫調節は、NF-κB誘導の阻害を通して行われる。別の実施態様において、免疫調節は、末梢血単核細胞、好ましくはT細胞の増殖の阻害を通して行われる。最も好ましい実施態様において、免疫調節は、上述の両方の手段によりもたらされる。

組成物は、好ましくは少なくとも95% (w/v)のIgM純度、より好ましくは少なくとも95% (w/v)のIgM純度を有する。最も好ましい実施態様において、組成物は95% (w/v)のIgM純度を含む。

IgMが組換えの場合、タンパク質の発現、生産、及び精製の分野における任意の手法に従って得ることができる。例えば、IgM核酸配列を、選択した宿主細胞、例えば、細菌(大腸菌、枯草菌、サルモネラ・ティフィムリウム、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、及びブドウ球菌属)、酵母(サッカロマイセス属、ピキア属、又はクリベロマイセス属)、昆虫細胞(カイコ、ヨトウガ、ツマジロクサヨトウ、イラクサギンウワバ、又はショウジョウバエ)、又は哺乳類細胞(HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS-1)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、ヒトアデノウイルス形質転換293細胞、マウスL-929細胞、HaKハムスター細胞株、Swiss、Balb-c、若しくはNIHマウス由来のマウス3T3細胞、CV-1細胞株、一次組織又は一次移植片のインビトロ培養由来の細胞株における発現に適した任意のベクターに挿入することができる。

別の好ましい実施態様において、感染により生じる免疫性合併症は、高サイトカイン血症、高凝固障害、又は臓器不全である。

前記血漿由来IgMに関して、場合により、これを単離又は精製して所与の外毒素、分泌型タンパク質、微生物種、又はこれらの組み合わせに対する特定の抗体の相対量を増加させることができる。

IgMを含む組成物は、上述のとおり感染により生じる免疫性合併症の治療のため、及び前記免疫性合併症の予防のための両方に用いることができる。

追加的な実施態様において、本発明は、IgMを含む組成物の投与を含むことを特徴とする、必要とする患者における感染により生じる免疫性合併症を治療するための方法に言及する。

組成物は、好ましくは少なくとも90% (w/v)のIgM純度、より好ましくは少なくとも95% (w/v)のIgM純度を有する。最も好ましい実施態様において、組成物は95% (w/v)のIgM純度を含む。

本発明の方法は、上述のとおり感染により生じる免疫性合併症の治療のため、及び前記免疫性合併症の予防のための両方に用いることができる。

また、最後に、本発明は、IgMを含む組成物の投与を含むことを特徴とする、必要とする患者における感染の免疫調節のための方法も開示する。

前記免疫調節は、感染又は感染関連症状若しくは状態の治療又は予防のために用いることができる。

前記免疫調節により、炎症性応答又は免疫系の過剰活性化等の免疫性合併症の治療が可能になり、免疫調節は、好ましくは内毒素媒介性の免疫応答から独立しており、様々な手段によりもたらされ得る。好ましい実施態様において、免疫調節は、NF-κB誘導の阻害を通して行われる。別の実施態様において、免疫調節は、末梢血単核細胞、好ましくはT細胞の増殖の阻害を通して行われる。最も好ましい実施態様において、免疫調節は、上述の両方の手段によりもたらされる。

本願明細書に記述される実施態様は、本発明の例示的なものと意図され、その限定ではない。当業者は、本開示の範囲を逸脱することなく、本開示の実施態様及び実施例への改変を行うことができることを理解する。

本発明の実施態様は、用語「を含む」及びその変化形を用いて上に記述される。しかし、発明者の意図は、用語「を含む」が、本発明の範囲を逸脱することなく、本願明細書に記述される任意の実施態様において、「から成る」及び「から本質的に成る」と置換されてもよいということである。別段の特定がない限り、本願明細書において規定される全ての値は、与えられた始点及び終点に至るまでを含み、及びこれらを含む。

以下の実施例は、本願の実施態様をさらに例示し、これらは例示的なものとして解釈されるべきであり、その限定で解釈されるべきではない。

実施例1. 大腸菌のリポ多糖(LPS)内毒素によるNF-κB活性誘導におけるIgMの影響の解析
分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーターを駆動するNF-κB依存性プロモーターを含む安定なプラスミドを保有するヒトTHP-1単球細胞株(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)を、NF-κBシグナル伝達経路活性化をモニタリングする手段として用いて本試験を行った。

細胞をメーカーの推奨通りに増殖培地中で培養した。

大腸菌株O111:B4由来のLPS及び大腸菌株K12由来のLPSの両方を用いて、試験を行った。上述のTHP-1細胞を、100ng/mLのO111:B4株由来大腸菌LPS(図1A参照)、又は1ng/mLのK12株由来大腸菌LPS(図1B参照)で24時間処理した。

IgMを用いる場合は、細胞の処理の前に、LPSを精製IgM(95% (w/v)以上の純度)で予備インキュベートした。

NF-κB活性アッセイについては、1x10⁵細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種した。アッセイ培養培地は、ウシ胎児血清(FBS)由来タンパク質の非特異的作用を小さくするために低減された血清を含有する以外は、増殖培地と同一であった。終濃度2.5mg/mLのIgM(少なくとも95% (w/v)の純粋なIgM)を用いて、細胞を上述のとおり処理した。

NF-κB活性を、Quanti-Blueアッセイ(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)により測定され、メーカーの取り扱い説明書に従って行われる、上清中の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)のレベルを評価することにより決定した。NF-κBアッセイ時の相対細胞数は、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)により決定し、メーカーの取り扱い説明書に従って行った。図1に示す相対NF-κB活性は、NF-κBアッセイ値を、Cell Titer Glowアッセイにより決定される相対細胞数に正規化し、それから実験対照を1の値に標準化することにより計算した。

驚くべきことに、試験した、及び上述したどの場合においても、精製IgMはLPS媒介性のNF-κBシグナル伝達の活性化に有意な効果を有さないことが観察された(図1A及び図1B参照)。

実施例2. クロストリジウム・ディフィシルのトキソイドB(Toxoid B)によるNF-κB活性誘導におけるIgMの影響の解析

クロストリジウム・ディフィシルの毒素は、単球においてIL-8及びTNF-αを含むサイトカイン分泌を誘導することが知られている(Linevsky, JK., et.al., “IL-8 release and neutrophil activation by Clostridium difficile toxin-exposed human monocytes, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 1997, 273, G1333-G1340；及びSun, X., et.al. “Essential role of the glucosyltransferase activity in Clostridium difficile toxin-induced secretion of TNF-α by macrophages”, Microbial Pathogenesis, 2009, 16, 298-305)。また、これらのサイトカインの各々は、NF-κBの活性化の際に誘導されることが知られている。

したがって、上述の、安定にインテグレートされたNF-κBレポータープラスミドを保有するヒトTHP-1細胞(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)において、クロストリジウム・ディフィシルのトキソイドBがNF-κBシグナル伝達を誘導することができるか試験した。細胞をメーカーの推奨通りに増殖培地中で培養した。

毒素そのものが細胞毒性であるので、結果の複雑な解釈を避けるために不活性化されたトキソイドを用いた。NF-κB活性アッセイについては、2x10⁵細胞を、処理の前に、96ウェルプレートの各ウェルに24時間播種した。その後、細胞を複数の濃度のＣ．ディフィシルのトキソイドA(Toxoid A) (List Biological Labs, Inc、キャンベル、カリフォルニア州、米国)又はトキソイドB(List Biological Labs, Inc、キャンベル、カリフォルニア州、米国)で処理した。NF-κB活性を、Quanti-Blueアッセイ(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)により測定され、メーカーの取り扱い説明書に従って行われる、上清中の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)のレベルを評価することにより決定した。NF-κBアッセイ時の相対細胞数は、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)により決定し、メーカーの取り扱い説明書に従って行った。図2に示す相対NF-κB活性は、NF-κBアッセイ値を、Cell Titer Glowアッセイにより決定される相対細胞数に正規化し、それから実験対照を1の値に標準化することにより計算した。

トキソイドAはこれらの細胞においてNF-κBシグナル伝達を誘導しなかったが、トキソイドBはこれらの細胞においてNF-κBレポーターの誘導を示した(図2を参照)。

IgMの溶液(90%〜95%の純度のIgM)がNF-κB活性化を阻害する能力を、BSA(ウシ血清アルブミン)対照と比較して評価した。

細胞を9.25μg/mLのクロストリジウム・ディフィシルのトキソイドBで24時間処理した。処理がBSA又はIgM組成物も伴うものである場合は、細胞の処理の前に、トキソイドBを前記BSAと、又はIgMの溶液(90%〜95%の純度のIgM)と、インキュベートした。

アッセイ培養培地は、0.025μMのビタミンD3を含有する以外は、増殖培地と同一であった。NF-κB活性アッセイについては、2x10⁵細胞を、処理の前に、96ウェルプレートの各ウェルに24時間播種した。その後、細胞を終濃度3mg/mLのIgM(90%〜95%の純度のIgM)又はBSAを用いて、上述のとおり処理した。NF-κB活性を、Quanti-Blueアッセイ(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)により測定され、メーカーの取り扱い説明書に従って行われる、上清中の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)のレベルを評価することにより決定した。NF-κBアッセイ時の相対細胞数は、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)により決定し、メーカーの取り扱い説明書に従って行った。図3に示す相対NF-κB活性は、NF-κBアッセイ値を、Cell Titer Glowアッセイにより決定される相対細胞数に正規化し、それから実験対照を1の値に標準化することにより計算した。

BSAは、NF-κBのトキソイドB活性化に効果を有さなかったが、上述のIgMの溶液は、トキソイドB作用を減衰させた(図3参照)。

実施例3. クレブシエラ・ニューモニエ及び緑膿菌によるNF-κB活性誘導及びIL-8分泌におけるIgMの影響の解析
IgMは大腸菌の細胞壁内毒素LPSにより媒介されるNF-kBシグナル伝達を減衰させることができなかったので(実施例1参照)、精製IgMの(LPS等の細胞壁成分を保有する)インタクトな全細菌(whole bacteria)に対する効果を評価した。

生きた微生物の培養が哺乳類細胞培養アッセイ系を上回り、その結果を妨げた可能性がある。したがって、全細菌(クレブシエラ・ニューモニエ及び緑膿菌)をホルムアルデヒド固定し、細胞をインタクトに維持しながら殺菌した。

上述の安定なNF-κBレポータープラスミドを保有するTHP-1細胞を、ホルムアルデヒド殺菌したクレブシエラ・ニューモニエ及び緑膿菌で24時間処理した。

IgMを用いる場合は、上述の微生物を処理時に精製IgMで共処理した。

NF-κB活性アッセイについては、1x10⁵細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。アッセイ培養培地は、FBS由来タンパク質の非特異的作用を小さくするために低減された血清を含有する以外は、増殖培地と同一であった。終濃度2.5mg/mLのIgM(少なくとも95% (w/v)の純粋なIgM)を用いて、細胞を図の凡例に記述するとおりに処理した。NF-κB活性を、Quanti-Blueアッセイ(Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)により測定され、メーカーの取り扱い説明書に従って行われる、上清中の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)のレベルを評価することにより決定した。NF-κBアッセイ時の相対細胞数は、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)により決定し、メーカーの取り扱い説明書に従って行った。示される相対NF-κB活性は、NF-κBアッセイ値を、Cell Titer Glowアッセイにより決定される相対細胞数に正規化し、それから実験対照を1の値に標準化することにより計算した。

ホルムアルデヒド処理したどちらの種の細菌も、実施例1及び2で用いた細胞系又はモデル(すなわち、安定にインテグレートされたNF-κBレポータープラスミドを保有するヒトTHP-1細胞)において、NF-κB経路を効果的に誘導することができた(図4A参照)。

驚くべきことに、ホルムアルデヒド処理したクレブシエラ・ニューモニエ又は緑膿菌、及び精製IgMのいずれとの共処理によっても、NF-κBシグナル伝達の低減が示された。

先行技術において、NF-κBシグナル伝達の活性化により炎症性サイトカインの分泌が誘導されることは周知である。IL-8は、十分に特徴づけられた、ヒトにおけるNF-κB応答性の炎症性サイトカインである。したがって、上述の細胞培養の培養上清中のIL-8分泌を評価して、前記IL-8分泌が細菌(クレブシエラ・ニューモニエ又は緑膿菌)及びIgMにも応答性であるかを調べた(図4B参照)。上清中に分泌されたIL-8サイトカインは、AlphaLISA IL-8イムノアッセイキット(Perkin-Elmer、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)を用いて、メーカーのプロトコルに従い、AlphaLISAにより測定した。

NF-κB活性化と同様に、ホルムアルデヒド固定した細菌は単独でIL-8の分泌を誘導したが、一方で前記細菌とIgMとの共処理により、それのみで単独処理された培養と比較して、Il-8の分泌の減少が示された(図4B参照)。

実施例4. 末梢血単核細胞の増殖におけるIgMの影響の解析
IgMがNF-κB炎症性経路に対する明確な効果を示したので、精製IgMが免疫機能に対してより一般的な効果を有しているかを評価した。抗原により刺激された血液リンパ球、特にT細胞の増殖は、最も基本的な炎症性免疫応答の一つである。

ホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)及びイオノマイシンは、非常に一般的な増殖刺激剤であるが、これらを用いて末梢血単核細胞、より正確には血液Tリンパ球又はT細胞の増殖を誘導した。

ヒト末梢血単核細胞を、10%熱不活性化ヒト血清を含むRPMI中で培養した。増殖アッセイについては、培養培地を用いて、3x10⁵細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種した。

T細胞を10ng/mL PMA及び0.5μM イオノマイシンで3日間処理した。IgMを用いる場合は、場合に応じて、処理の時点で細胞を精製IgM(およそ5mg/mLの終濃度及び少なくとも95%の純度)で処理又は共処理した。

異なる群についての細胞力価を、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)を用いて、メーカーの取り扱い説明書に従って行い、ATP含有量の関数としての細胞増殖の誘導の測定に基づき、測定した。

3日間のPMA/イオノマイシン刺激の後、末梢血単核細胞において増殖の有意な増加が観察された(図5参照)。IgMを用いた細胞の処理により、PMA/イオノマイシンの存在下又は非存在下のいずれにおいても、対照の未処理細胞と比較して、及びPMA/イオノマイシン処理と比較して、末梢血単核細胞の増殖が低減された。PMA/イオノマイシンは非常に強力で、非常に非特異的な分裂促進因子であるので、この観察は非常に意外である。これは、IgMが免疫応答自体に対する調節効果を有していることを暗示している。

Claims

感染により生じる免疫性合併症の治療における使用のための、IgMを含む組成物であって、
前記組成物において用いられるIgMが少なくとも90% (w/v)のIgM純度を有し、
前記感染が、緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クロストリジウム・ディフィシル、又はこれらの組み合わせにより生じる、
組成物。
免疫合併症の治療が免疫調節を通して行われることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
免疫調節が、NF-κB誘導の阻害を通して、末梢血単核細胞の増殖の阻害を通して、又はこれらの組み合わせにより行われることを特徴とする、請求項２に記載の使用のための組成物。
前記組成物において用いられるIgMが95% (w/v)のIgM純度を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
投与される前記組成物の用量が75 mg IgM/患者1kg〜1 g IgM/患者1kgであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記組成物が少なくとも週1回投与されることを特徴とする、請求項５に記載の使用のための組成物。
IgMが組換え、血漿由来、細胞培養由来、トランスジェニック、又は化学合成されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
IgMが血漿の適切な画分から単離された血漿由来IgMであることを特徴とする、請求項７に記載の使用のための組成物。
IgMを含む前記組成物が単独で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
IgMを含む前記組成物が、抗炎症分子、小分子抗生物質、天然の抗菌性の分子、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、抗菌特性を有するタンパク質、他の免疫調節剤、又はこれらの組み合わせから選択される1種以上の他の組成物又は分子と一緒に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記他の組成物又は分子が、バンコマイシン、メロペネム、ラクトフェリン、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１０に記載の使用のための組成物。
感染の免疫調節のための使用のための、IgMを含む組成物であって、
前記組成物において用いられるIgMが少なくとも90% (w/v)のIgM純度を有し、
前記感染が、緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クロストリジウム・ディフィシル、又はこれらの組み合わせにより生じる、
組成物。
免疫調節が、感染又は感染関連症状若しくは状態の治療又は予防のために用いられることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
免疫調節が、NF-κB誘導の阻害を通して、末梢血単核細胞の増殖の阻害を通して、又はこれらの組み合わせにより行われることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
前記組成物において用いられるIgMが95% (w/v)のIgM純度を有することを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
投与される前記組成物の用量が75 mg IgM/患者1kg〜1 g IgM/患者1kgであることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
前記組成物が少なくとも週1回投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の使用のための組成物。
IgMが組換え、血漿由来、細胞培養由来、トランスジェニック、又は化学合成されたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
IgMが血漿の適切な画分から単離された血漿由来IgMであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用のための組成物。
IgMを含む前記組成物が単独で投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
IgMを含む前記組成物が、抗炎症分子、小分子抗生物質、天然の抗菌性の分子、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、抗菌特性を有するタンパク質、他の免疫調節剤、又はこれらの組み合わせから選択される1種以上の他の組成物又は分子と一緒に投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組成物。
前記他の組成物又は分子が、バンコマイシン、メロペネム、ラクトフェリン、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項２１に記載の使用のための組成物。
敗血症の治療における使用のための、IgMを含む組成物であって、
前記組成物において用いられるIgMが少なくとも90% (w/v)のIgM純度を有し、
前記敗血症が、緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クロストリジウム・ディフィシル、又はこれらの組み合わせにより生じる、
組成物。
敗血症の治療が免疫調節を通して行われることを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
免疫調節が、NF-κB誘導の阻害を通して、末梢血単核細胞の増殖の阻害を通して、又はこれらの組み合わせにより行われることを特徴とする、請求項２４に記載の使用のための組成物。
前記組成物において用いられるIgMが、95% (w/v)のIgM純度を有することを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
投与される前記組成物の用量が75 mg IgM/患者1kg〜1 g IgM/患者1kgであることを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
少なくとも週1回投与されることを特徴とする、請求項２７に記載の使用のための組成物。
IgMが組換え、血漿由来、細胞培養由来、トランスジェニック、又は化学合成されたものであることを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
IgMが血漿の適切な画分から単離された血漿由来IgMであることを特徴とする、請求項２９に記載の使用のための組成物。
単独で投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
抗炎症分子、小分子抗生物質、天然の抗菌性の分子、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、抗菌特性を有するタンパク質、他の免疫調節剤、又はこれらの組み合わせから選択される1種以上の他の組成物又は分子と一緒に投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の使用のための組成物。
前記他の組成物又は分子が、バンコマイシン、メロペネム、ラクトフェリン、又はこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項３２に記載の使用のための組成物。