JP6904030B2

JP6904030B2 - Useful substance ratio production rate accelerator

Info

Publication number: JP6904030B2
Application number: JP2017078773A
Authority: JP
Inventors: 加奈本石; 優英城戸; 西川　孝治; 孝治西川
Original assignee: Osaka Soda Co Ltd
Current assignee: Osaka Soda Co Ltd
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: JP2018174790A

Description

本発明は、特定の微生物の培養抽出物を含む細胞における有用物質の比生産速度促進剤；当該促進剤を含む有用物質生産に用いる細胞培養用培地；当該促進剤を含む細胞培養用培地を用いて細胞を培養する工程を含む有用物質の製造方法等を提供する。 The present invention uses a specific production rate accelerator for a useful substance in a cell containing a culture extract of a specific microorganism; a cell culture medium used for producing a useful substance containing the accelerator; a cell culture medium containing the accelerator. Provided is a method for producing a useful substance including a step of culturing cells.

遺伝子組換え技術を利用して、タンパク質、ペプチドが人為的に生産されている。とりわけ医薬分野においては、医薬に有用なタンパク質（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体等）が培養細胞を利用して製造されている。
有用物質の生産量の向上を目的として様々な試みが行われており、例えば、特許文献１では、細胞の培養に用いられる培地に、米糠抽出物を細胞増殖促進剤として添加し、細胞数を増大させることにより、産生されるタンパク質量を増大できることが開示されている。 Proteins and peptides are artificially produced using gene recombination technology. Particularly in the pharmaceutical field, proteins useful for pharmaceuticals (for example, humanized antibody, human antibody, etc.) are produced using cultured cells.
Various attempts have been made for the purpose of improving the production of useful substances. For example, in Patent Document 1, rice bran extract is added as a cell proliferation promoter to a medium used for cell culture to increase the number of cells. It is disclosed that the amount of protein produced can be increased by increasing the amount.

特開２０１３−２４７９２７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2013-247927

抗体等の有用物質の生産量の向上には、特許文献１に記載の方法等の細胞密度を高くする手法が広く知られている。しかしながら、本願発明者が鋭意検討した結果、過度に細胞密度を高くすると、不純物、変性物が増加し、更には細胞断片等も増加するため、精製工程の負荷が増大することとなる場合があることが判明した。また、細胞密度が高くなると培地に用いる栄養源もその分多く必要であることも判明した。このように、細胞密度を高くする手法では有用物質の生産に関するトータルコストの低減には繋がらないことが判明した。
そこで、本願発明者は、細胞増殖性と細胞あたりの有用物質の生産性（比生産速度）がトレードオフとなる傾向があることに着目し、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低くする一方、１細胞あたりの有効物質の生産性を向上させることにより、１細胞当たりの有用物質の生産性(すなわち、比生産速度)を向上させるという、特許文献１に記載の細胞密度を高くするとの思想とは全く反対の思想に想到した。
本発明は、特定の微生物の培養抽出物を含む細胞における有用物質の比生産速度促進剤；当該促進剤を含む有用物質生産に用いる細胞培養用培地；当該促進剤を含む細胞培養用培地を用いて細胞を培養する工程を含む有用物質の製造方法等を提供する。 In order to improve the production amount of useful substances such as antibodies, a method for increasing the cell density such as the method described in Patent Document 1 is widely known. However, as a result of diligent studies by the inventor of the present application, if the cell density is excessively increased, impurities and denatured substances increase, and further, cell fragments and the like also increase, which may increase the load of the purification process. It has been found. It was also found that as the cell density increases, more nutrient sources are required for the medium. As described above, it was found that the method of increasing the cell density does not lead to the reduction of the total cost related to the production of useful substances.
Therefore, the inventor of the present application pays attention to the fact that cell proliferation tends to be a trade-off between cell proliferation and productivity of useful substances per cell (specific production rate), and suppresses cell proliferation to reduce cell density. 1. The idea of increasing the cell density described in Patent Document 1, which is to improve the productivity of useful substances per cell (that is, the specific production rate) by improving the productivity of active substances per cell. I came up with the opposite idea.
The present invention uses a specific production rate accelerator for a useful substance in a cell containing a culture extract of a specific microorganism; a cell culture medium used for producing a useful substance containing the accelerator; a cell culture medium containing the accelerator. Provided is a method for producing a useful substance including a step of culturing cells.

本願発明者は、上記思想に基づいて鋭意検討した結果、特定の微生物の培養抽出物が、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低減できると共に、細胞においてタンパク質等の有用物質の生産性を向上し、１細胞あたりの比生産速度を増大させることができることを見出し、これに基づき本発明を完成させた。
本発明は、細菌、放線菌、糸状菌、酵母および担子菌からなる群より選択される少なくとも１種の微生物の培養抽出物を含む、細胞における有用物質比生産速度促進剤を提供する。
本発明は、一つの側面として、細菌、放線菌、糸状菌、酵母および担子菌からなる群より選択される少なくとも１種の微生物の培養抽出物を含む、有用物質産生に用いる細胞培養用培地を提供する。
本発明は、一つの側面として、上記培養抽出物を含む促進剤を含有する細胞培養用培地を用いて細胞を培養する工程を含む、有用物質の製造方法を提供する。 As a result of diligent studies based on the above idea, the inventor of the present application can suppress cell proliferation and reduce cell density, and improve the productivity of useful substances such as proteins in cells. However, they have found that the specific production rate per cell can be increased, and based on this, the present invention has been completed.
The present invention provides a useful substance ratio production rate accelerator in cells, which comprises a culture extract of at least one microorganism selected from the group consisting of bacteria, actinomycetes, filamentous fungi, yeasts and basidiomycetes.
One aspect of the present invention is a cell culture medium used for producing useful substances, which comprises a culture extract of at least one microorganism selected from the group consisting of bacteria, actinomycetes, filamentous fungi, yeast and basidiomycetes. provide.
The present invention provides, as one aspect, a method for producing a useful substance, which comprises a step of culturing cells using a cell culture medium containing an accelerator containing the culture extract.

本発明によれば、上記培養抽出物を有効成分とする、細胞においてタンパク質等の有用物質の比生産速度を増大させることが可能な動物細胞用培地を提供することができる。本発明の上記培養抽出物を含む細胞培養用培地は、細胞の形態や種類、形質転換の有無等に限定されず有用物質の比生産速度を増大させる。即ち、本発明が提供する有用物質比生産速度促進剤、当該促進剤を含んだ細胞培養用培地、および当該培地を用いた有用物質の製造方法は、細胞における有用物質の比生産速度を増大させることができ、抗体を利用した臨床診断薬製造、抗体医薬生産、再生医療、細胞治療等の分野での応用が可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a medium for animal cells containing the above-mentioned culture extract as an active ingredient and capable of increasing the specific production rate of useful substances such as proteins in cells. The cell culture medium containing the above-mentioned culture extract of the present invention is not limited to the morphology and type of cells, the presence or absence of transformation, etc., and increases the specific production rate of useful substances. That is, the useful substance specific production rate accelerator provided by the present invention, the cell culture medium containing the accelerator, and the method for producing a useful substance using the medium increase the specific production rate of the useful substance in cells. It can be applied in the fields of clinical diagnostic drug production using antibodies, antibody drug production, regenerative medicine, cell therapy, and the like.

実施例１における各培養抽出物の培地における培養８日目の１細胞当たりの抗体比生産速度を示す図である。It is a figure which shows the antibody ratio production rate per cell on the 8th day of culture in the culture medium of each culture extract in Example 1. FIG. 実施例１における各培養抽出物の培地におけるＣＨＯ細胞培養終了の生細胞数を示す図である。It is a figure which shows the number of viable cells at the end of CHO cell culture in the culture medium of each culture extract in Example 1. FIG. 実施例２〜４、及び比較例１の培養８日目のＣＨＯ細胞の生細胞数を示す図である。It is a figure which shows the viable cell number of the CHO cell of Example 2-4 and Comparative Example 1 on the 8th day of culture. 実施例２〜４、及び比較例１の培養８日目の１細胞当たりの抗体比生産速度を示す図である。It is a figure which shows the antibody ratio production rate per cell on the 8th day of culture of Examples 2-4 and Comparative Example 1. 実施例２〜４、及び比較例１の培養８日目の抗体量当たりの不純物量（ＨＣＰ濃度）を示す図である。It is a figure which shows the amount of impurities (HCP concentration) per antibody amount on the 8th day of culture of Examples 2-4 and Comparative Example 1.

本発明では、特定の微生物の培養抽出物により、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低減できると共に、細胞においてタンパク質等の有用物質の生産性を向上させ、１細胞当たりの比生産速度を増大（促進）させることができる。これにより、培養バッチあたりの有用物質生産量を維持（または増加）したまま、その有用物質生産量を得るために要する細胞数を低減できる。そのため、細胞密度を高めた場合に培養液中に増加する、不純物、変性物、細胞断片等を低減でき、有用物質の精製工程の負荷を低減できると共に、培地に用いる栄養源量も低減でき、有用物質の生産に関するトータルコストの低減を図ることが可能である。 In the present invention, a culture extract of a specific microorganism can suppress cell proliferation and reduce cell density, improve the productivity of useful substances such as proteins in cells, and increase the specific production rate per cell. Can be (promoted). As a result, the number of cells required to obtain the useful substance production amount can be reduced while maintaining (or increasing) the useful substance production amount per culture batch. Therefore, impurities, denatured substances, cell fragments, etc., which increase in the culture medium when the cell density is increased, can be reduced, the load on the purification process of useful substances can be reduced, and the amount of nutrient source used for the medium can be reduced. It is possible to reduce the total cost of producing useful substances.

本発明では、細菌、放線菌、糸状菌、酵母および担子菌からなる群より選択される少なくとも１種の微生物の培養抽出物が使用される。
培養抽出物の調製方法としては、例えば、上記微生物を培養して得られる培養物から抽出する方法が挙げられる。具体的には、上記微生物を培地で培養する培養工程、および培養工程により得られた培養物から培養抽出物を調製する抽出工程を含む方法により培養抽出物を製造できる。 In the present invention, a culture extract of at least one microorganism selected from the group consisting of bacteria, actinomycetes, filamentous fungi, yeast and basidiomycetes is used.
Examples of the method for preparing the culture extract include a method of extracting from a culture obtained by culturing the above-mentioned microorganism. Specifically, the culture extract can be produced by a method including a culture step of culturing the above-mentioned microorganism in a medium and an extraction step of preparing a culture extract from the culture obtained by the culture step.

＜微生物について＞
本発明の用いることのできる微生物としては、特に限定されず、例えば、細菌、放線菌、子嚢菌網に属する糸状菌、酵母、担子菌等を例示することができる。 <About microorganisms>
The microorganism that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include bacteria, actinomycetes, filamentous fungi belonging to the ascomycete network, yeast, and basidiomycetes.

細菌としては特に限定されず、例えば、アセトバクター（Acetobacter）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アーセロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、シトバクター（Citobacter）属、クロストリヂウム（Clostridium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、エーウイニア（Erwinia）属、エッシェリキア（Escherichia）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ハロバクテリウム（Halobacterium）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、リューコノストク（Leuconostoc）属、ペヂオコッカス（Pediococcus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、プロタミノバクター（Protaminobacter）属、プロビデンシア（Providencia）属、シュードモナス（Psudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ストレプトバクテリウム（Streptobacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ジモモナス（Zymomonas）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ペヂオコッカス（Pediococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属等が挙げられる。 The bacteria are not particularly limited, and are, for example, the genus Acetobacter, the genus Achromobacter, the genus Arthrobacter, the genus Bacillus, the genus Bifidobacterium, and the genus Brevibacterium. Brevibacterium, Cellulomonas, Chromobacterium, Citobacter, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Erwinia Genus, Escherichia, Flavobacterium, Gluconobacter, Halobacterium, Klebsiella, Leuconostoc, Pediococcus Genus, Propionibacterium, Protaminobacter, Providencia, Psudomonas, Serratia, Streptobacterium, Streptococcus Examples include the genus Xanthomonas, Zymomonas, Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus and the like.

放線菌としては特に限定されず、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、アクチノプラネス（Actinoplanes）属、ミクロモノスポラ（Micromonospora）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、ルブロバクター（Rubrobacter）属、アクチノバチュラム（Actinobaculum）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、ゴルドニア（Gordonia）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ミクロスファエラ（Microsphaera）属、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）属、アグロマイセス（Agromyces）属、クリオバクテリウム（Cryobacterium）属、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、アクチノビスポラ（Actinobispora）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）属、アクチノシネマ（Actinosynnema）属、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）属、キタサトスポラ（Kitasatospora）属、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）属、ミクロビスポラ（Microbispora）属、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）属、ノノムラエ（Nonomuraea）属、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属、アクチノマデュラ（Actinomadura）属、キネオコッカス（Kineococcus）属、キネオスポリア（Kineosporia）属、サーモビスポラ（Thermobispora）属等が挙げられる。なかでも、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、ミクロモノスポラ（Micromonospora）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、アクチノバチュラム（Actinobaculum）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ミクロスファエラ（Microsphaera）属、アグロマイセス（Agromyces）属、クリオバクテリウム（Cryobacterium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、アクチノシネマ（Actinosynnema）属、ミクロビスポラ（Microbispora）属、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属、キネオコッカス（Kineococcus）属、キネオスポリア（Kineosporia）属、サーモビスポラ（Thermobispora）が好ましく、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、クリオバクテリウム（Cryobacterium）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、アクチノシネマ（Actinosynnema）属、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属、キネオコッカス（Kineococcus）属がより好ましい。 The actinomycetes are not particularly limited, and are, for example, the genus Streptomyces, the genus Micrococcus, the genus Actinoplanes, the genus Micromonospora, the genus Cryptobacterium, and the genus Lubrobactor. (Rubrobacter), Actinobaculum, Actinomyces, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Microspha Genus Microsphaera, Genus Cryptosporangium, Genus Agromyces, Genus Cryobacterium, Genus Dactylosporangium, Genus Nocardioides, Pseudonocardia (Pseudonocardia), Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Kitasatosato , Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinomadura, Kineococcus , The genus Kineosporia, the genus Thermobispora, and the like. Among them, the genus Streptomyces, the genus Micrococcus, the genus Micromonospora, the genus Cryptobacterium, the genus Actinobaculum, the genus Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Agromyces, Cryobacterium, Nocardioides , Pseudonocardia, Actinosynnema, Microbispora, Nocardiopsis, Kineococcus, Kineosporia, Thermobispora, preferred The genus Streptomyces, the genus Micrococcus, the genus Cryptobacterium, the genus Actinomyces, the genus Mycobacterium, the genus Nocardia, the genus Rhodococcus. , Cryobacterium, Nocardioides, Pseudonocardia, Actinosynnema, Nocardiopsis, Kineococcus are more preferred.

糸状菌としては特に限定されず、例えば、アクレモニウム（Acremonium）属、アクチノムコール（Actinomucor）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アウレオバシヂウム（Aureobasidium）属、バクーセラ（Backusella）属、ボトリチス（Botrytis）属、チャララ（Chalara）属、クラビセプス（Claviceps）属、コルチシウム（Corticium）属、クリフォネクトリア（Cryphonectria）属、ユウロチウム（Eurotium）属、フサリウム（Fusarium）属、ゲオトリチュム（Geotrichum）属、モナスカス（Monascus）属、モルチエレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ミロテシウム（Myrothecium）属、ニューロスポーラ（Neurospora）属、パエシロマイセス（Paecilomyces）属、ペニシリウム（Penicilium）属、ペスタロチオプス（Pestalotiopsis）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、スクレロチニア（Sclerotinia）属、シンセファラストルム（Syncephalastrum）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、アルテルナリア（Alternaria）属、ボーベリア（Beauveria）属、セルコスポラ（Cercospora）属、セファロスフォリウム（Cephalosporium）属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、コクシジオイデス（Coccidioides）属、クルブラリア（Curvularia）属、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）属、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ドレクスレラ（Drechslera）属、エピコッカム（Epicoccum）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、グリオクラディウム（Gliocladium）属、グラフィウム（Graphium）属、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）属、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）属、イサリア（Isaria）属、メタルヒジウム（Metarhizium）属、モニリア（Monilia）属、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）属、ピリキュラリア（Pyricularia）属、フィアロマイセス（Phialomyces）属、リゾクトニア（Rhizoctonia）属、スポロスリクス（Sporopthrix）属、トリコヒートン（Trichophyton）属、トリコセシウム（Trichothecium）属等が挙げられる。なかでも、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アウレオバシヂウム（Aureobasidium）属、バクーセラ（Backusella）属、ボトリチス（Botrytis）属、コルチシウム（Corticium）属、フサリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属、モルチエレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポーラ（Neurospora）属、パエシロマイセス（Paecilomyces）属、ペニシリウム（Penicilium）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、シンセファラストルム（Syncephalastrum）属、アルテルナリア（Alternaria）属、セルコスポラ（Cercospora）属、セファロスフォリウム（Cephalosporium）属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、エピコッカム（Epicoccum）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、グリオクラディウム（Gliocladium）属、グラフィウム（Graphium）属、ピリキュラリア（Pyricularia）属、フィアロマイセス（Phialomyces）属、リゾクトニア（Rhizoctonia）属、スポロスリクス（Sporopthrix）属が好ましく、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アウレオバシヂウム（Aureobasidium）属、ボトリチス（Botrytis）属、フサリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属、モルチエレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、パエシロマイセス（Paecilomyces）属、ペニシリウム（Penicilium）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、セファロスフォリウム（Cephalosporium）属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、エピコッカム（Epicoccum）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、グリオクラディウム（Gliocladium）属、グラフィウム（Graphium）属、リゾクトニア（Rhizoctonia）属、スポロスリクス（Sporopthrix）属がより好ましい。 The filamentous fungus is not particularly limited, and for example, the genus Acremonium, the genus Actinomucor, the genus Aspergillus, the genus Aureobasidium, the genus Backusella, and the genus Botrytis. Genus, Charara, Claviceps, Corticium, Cryphonectria, Eurotium, Fusarium, Geotrichum, Monascus ), Mortierella, Mucor, Myrothecium, Neurospora, Paecilomyces, Penicilium, Pestalotiopsis, Rizomu ), Rhizopus, Sclerotinia, Syncephalastrum, Trichoderma, Alternaria, Beauveria, Cercospora, Cephalos Cephalosporium, Chrysosporium, Coccidioides, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella Genus, Drechslera, Epicoccum, Eupenicillium, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyalodendron ), Isaria, Metalhizium, Monilia ), Nodulisporium, Pyricularia, Philomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichothecium Genus etc. can be mentioned. Among them, the genus Acremonium, the genus Aspergillus, the genus Aureobasidium, the genus Backusella, the genus Botrytis, the genus Corticium, the genus Fusarium, and the genus Monascus. (Monascus), Mortierella, Mucor, Neurospora, Paecilomyces, Penicylium, Rhizomucor, Rhizopus, Synth The genus Syncephalastrum, Alternaria, Cercospora, Cephalosporium, Chrysosporium, Epicoccum, Eupenicillium, The genus Gliocladium, the genus Graphium, the genus Pyricularia, the genus Phialomyces, the genus Rhizoctonia, the genus Sporopthrix are preferred, and the genus Acremonium , Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Fusarium, Monascus, Mortierella, Mucor, Paecilomyces Genus, Penicilium, Rhizomucor, Rhizopus, Cephalosporium, Chrysosporium, Epicoccum, Eupenicillium, Genus Gliocladium, Genus Graphium, Genus Rhizoctonia, Sporosli The genus Sporopthrix is more preferred.

酵母としては特に限定されず、例えば、デバリョマイセス（Debaryomyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピチア（Pichiak）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トルラスポラ（Torulaspora）属、キャンヂダ（Candida）属、シュビア（Ashbya）属、ブレッタノマイセス（Brettanomyces）属、エレモテリウム（Eremothecium）属、イッサチェンキア（Issatchenkia）属、クロッケラ（Klockera）属、リポマイセス（Lipomyces）属、メトシュニコウイア（Metschnikowia）属、ロードトルア（Rhodotorula）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属等が挙げられる。なかでも、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピチア（Pichiak）属、トルラスポラ（Torulaspora）属、キャンヂダ（Candida）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属が好ましい。 The yeast is not particularly limited, and for example, the genus Debaryomyces, the genus Saccharomyces, the genus Pichiak, the genus Kluyveromyces, the genus Torulaspora, the genus Candida, and Shubia. (Ashbya), Brettanomyces, Eremothecium, Issatchenkia, Klockera, Lipomyces, Metschnikowia, Lord Torua Examples include the genus Rhodotorula, the genus Shizosaccharomyces, and the genus Zygosaccharomyces. Of these, the genera Saccharomyces, Pichiak, Torulaspora, Candida, Shizosaccharomyces, and Zygosaccharomyces are preferred.

担子菌としては特に限定されず、例えば、マンネンタケ属、カワラタケ属、スエヒロタケ属、シイタケ属、エノキタケ属、シメジ属、ヒラタケ属、タモギタケ属、アガリクス属、アンズタケ属、シロソウメンタケ属、ホウキタケ属、ハナビラタケ属、サンゴハリタケ属、フサハリタケ属、カノシタ属、ブナハリタケ属、マイタケ属、オオチリメンタケ属、ヒイロハリタケ属、オリーブウロコタケ属、カンゾウタケ属、ラシャタケ属、カラスタケ属、ニンギョウタケ属、ヌメリアイタケ属、コウタケ属、クロカワ属、チョレイマイタケ属、アイカワタケ属、シュタケ属、ヒメシロアミタケ属、ミヤマシロアミタケ属、シカタケ属、クロサルノコシカケ属、アナタケ属、カワタケ属、シトネタケ属等が挙げられる。
より具体的には、霊芝（マンネンタケ）（Ganoderma lucidum）、カワラタケ（Trametes versicolor）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、シイタケ（Lentinula edodes）、エノキタケ（Flammulina velutipes）、シメジタケ（Lyophyllum decastes）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus）、メシマコブ（Fomes yucatensis）、アガリクス（Agaricus subrufescens）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、アンズタケ（Cantharellus cibarius）、シロソウメンタケ（Clavaria vermicularis）、ホウキタケ(Ramaria botrytis)、ハナビラタケ（Sparassis crispa）、サンゴハリタケ(Hericium ramosun)、フサハリタケ(Creoloplus cirrbatus)、カノシタ（Hydnum repandum）、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitcbisonii）、マイタケ（Grifola frondosa）、オオチリメンタケ（Trametes gibbosa）、ヒイロハリタケ（Phanerochaete chrysorbiza）、オリーブウロコタケ（Lopharia cinerascens）、カンゾウタケ（Fistulina hepatica）、イボラシャタケ（Tomentella crinalis）、カラスタケ（Polyzellus multiplex）、ニンギョウタケ（Albatrellus confluens）、アオロウジ（Albatrellus caeruleoporus）、ヌメリアイタケ（Albatrellus yasudai）、コウタケ（Sarcodon aspratus）、クロカワ（Boletopsis leucomelas）、センニンタケ（Albatrellus pascaprae）、チョレイマイタケ（Polyporus umbellatus）、マスタケ（Laetiporus sulphureus）、ヒイロタケ（Pycnoporus coccineus）、ヒメシロアミタケ(Antrodia albida)、ミヤマシロアミタケ（Antrodia beteromorpha）、ベニクスノキタケ（Antrodia camphorata）、Antrodia salmonea（和名なし）、クロサルノコシカケ（Melanoporia castanea）、アナタケ（Schizopora flavipora）、ツガノマンネンタケ（Ganoderma mastporum）、カバノアナタケ（Inonotus oblicuus）、カワタケ（Peniophora quercina）、シトネタケ（Peroneutypa scoparia）等が挙げられる。なかでも、霊芝（マンネンタケ）（Ganoderma lucidum）、カワラタケ（Trametes versicolor）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、シイタケ（Lentinula edodes）、エノキタケ（Flammulina velutipes）、シメジタケ（Lyophyllum decastes）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus）、メシマコブ（Fomes yucatensis）、アガリクス（Agaricus subrufescens）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、アンズタケ（Cantharellus cibarius）、シロソウメンタケ（Clavaria vermicularis）、ホウキタケ(Ramaria botrytis)、ハナビラタケ（Sparassis crispa）、マイタケ（Grifola frondosa）、チョレイマイタケ（Polyporus umbellatus）、マスタケ（Laetiporus sulphureus）、ベニクスノキタケ（Antrodia camphorata）、Antrodia salmonea（和名なし）、クロサルノコシカケ（Melanoporia castanea）、アナタケ（Schizopora flavipora）、ツガノマンネンタケ（Ganoderma mastporum）、カバノアナタケ（Inonotus oblicuus）、カワタケ（Peniophora quercina）、シトネタケ（Peroneutypa scoparia）が好ましく、霊芝（マンネンタケ）（Ganoderma lucidum）、カワラタケ（Trametes versicolor）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、シイタケ（Lentinula edodes）、エノキタケ（Flammulina velutipes）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、メシマコブ（Fomes yucatensis）、アガリクス（Agaricus subrufescens）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、ハナビラタケ（Sparassis crispa）、マイタケ（Grifola frondosa）、チョレイマイタケ（Polyporus umbellatus）、カワタケ（Peniophora quercina）、シトネタケ（Peroneutypa scoparia）がより好ましい。 The carrier is not particularly limited, and for example, Mannentake, Kawaratake, Suehirotake, Shiitake, Enokitake, Shimeji, Hiratake, Tamogitake, Agarix, Anzutake, Shirosomentake, Hokitake, Hanabiratake. Genus, Coral Bamboo, Fusaharitake, Kanoshita, Bunaharitake, Maitake, Ochirimentake, Hiiroharitake, Olive Urokotake, Kanzotake, Rashatake, Karatake, Ningyotake, Numerikatake , Choreimaitake, Aikawatake, Stake, Himeshiroamitake, Miyamashiroamitake, Shikatatake, Kurosarnokoshikake, Anatake, Kawatake, Shitonetake and the like.
More specifically, Albatrellus (Ganoderma lucidum), Kawaratake (Trametes versicolor), Suehirotake (Schizophyllum commune), Shiitake (Lentinula edodes), Enokitake (Flammulina velutipes), Shimejitake (Lyophy) ), Yamabushitake (Hericium erinaceum), Tamogitake (Pleurotus cornucopiae var. Citrinopileatus), Meshimakobu (Fomes yucatensis), Agaricus (Agaricus subrufescens), Eringi (Pleurotus eryngii), Eringi (Pleurotus eryngii), Anzutake (Pleurotus eryngii) (Ramaria botrytis), Sparassis crispa, Coralium ramosun, Creoloplus cirrbatus, Hydnum repandum, Beefsteak fungus (Mycoleptodonoides aitcbisonii) (Phanerochaete chrysorbiza), Olive Urokotake (Lopharia cinerascens), Kanzotake (Fistulina hepatica), Ibora Shatake (Tomentella crinalis), Karastake (Polyzellus multiplex), Albatrellus confluence (Albatrellus confluens), Aoruji (Albatrellus confluens) (Sarcodon aspratus), Kurokawa (Boletopsis leucomelas), Sennintake (Albatrellus pascaprae), Choreimaitake (Polyporus umbellatus), Mastertake (Laetiporus) sulphureus), Hiirotake (Pycnoporus coccineus), Himeshiroamitake (Antrodia albida), Miyamashiroamitake (Antrodia beteromorpha), Benix nokitake (Antrodia camphorata), Antrodia salmonea (no Japanese name), Antrodia salmonea (no Japanese name) Schizopora flavipora), Tsuganomannentake (Ganoderma mastporum), Chaga mushroom (Inonotus oblicuus), Kawatake (Peniophora quercina), Antrodia (Peroneutypa scoparia) and the like. Among them, Reishi (Ganoderma lucidum), Kawaratake (Trametes versicolor), Suehirotake (Schizophyllum commune), Shiitake (Lentinula edodes), Enokitake (Flammulina velutipes), Enokitake (Flammulina velutipes), Shimejitake (Lyophy) (Hericium erinaceum), Tamogitake (Pleurotus cornucopiae var. Citrinopileatus), Meshimakobu (Fomes yucatensis), Agaricus subrufescens, Eringi (Pleurotus eryngii), Anzutake (Cantharellus cibarius) ), Hanabiratake (Sparassis crispa), Maitake (Grifola frondosa), Choreimaitake (Polyporus umbellatus), Mastertake (Laetiporus sulphureus), Benix nokitake (Antrodia camphorata), Antrodia salmonea (no Japanese name), Kurosaru no Koshika , Anatake (Schizopora flavipora), Tsuganomannentake (Ganoderma mastporum), Kabanoanatake (Inonotus oblicuus), Kawatake (Peniophora quercina), Sitonetake (Peroneutypa scoparia), Reishi (Mannentake) (Ganoderma) Suehirotake (Schizophyllum commune), Shiitake (Lentinula edodes), Enokitake (Flammulina velutipes), Hiratake (Pleurotus ostreatus), Yamabushitake (Hericium erinaceum), Meshimakobu (Fomes yucatensis) s subrufescens), King trumpet (Pleurotus eryngii), Sparassis crispa (Sparassis crispa), Maitake (Grifola frondosa), Choreimaitake (Polyporus umbellatus), Kawatake (Peniophora quercina), Shitonetake (Peroneutypa scoparia).

上記微生物のなかでも放線菌、担子菌が好ましく、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シトネタケ属がより好ましい。 Among the above-mentioned microorganisms, actinomycetes and basidiomycetes are preferable, and Streptomyces and Sitonetake are more preferable.

ストレプトマイセス（Streptomyces）属としては特に限定されず、例えば、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・ライジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・サブルティラス（Streptomyces subrutilus）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・アヌラトス（Streptomyces anulatus）、ストレプトマイセス・スカビエイ（Streptomyces scabiei）、ストレプトマイセス・スカビエス（Streptomyces scabies）、ストレプトマイセス・アシディスカビエス（Streptomyces acidiscabies）、ストレプトマイセス・タージディスカビエス（Streptomyces turgidiscabies）、ストレプトマイセス・ビンチャンエンシス(Streptomyces bingchengensis) 、ストレプトマイセスロゼオスポラス（Strepromyces roseosporus）、ストレプトマイセスアルブス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセスピウセチウス（Streptomyces peucetius）、ストレプトマイセスオーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセスハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）等が挙げられる。なかでも、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Streptomyces sp.）が好ましい。 The genus Streptomyces is not particularly limited, and for example, Streptomyces sp., Streptomyces violaceoruber, Streptomyces avermitilis. ), Streptomyces coelicolor, Streptomyces thermoviolaceus, Streptomyces lividans, Streptomyces griseus, Streptomyces griseus Streptomyces lydicus, Streptomyces subrutilus, Streptomyces lavendulae, Streptomyces anulatus, Streptomyces scabiei, Streptomyces scabiei Streptomyces scabies), Streptomyces acidiscabies, Streptomyces turgidiscabies, Streptomyces bingchengensis, Streptomyces roseosporus Examples include Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces hygroscopicus and the like. Of these, Streptomyces sp. Is preferred.

シトネタケ属としては特に限定されず、例えば、Peroneutypa aequlinearis、Peroneutypa sp．、Peroneutypa vitis、Peroneutypa canker、Peroneutypa parasitica、Peroneutypa scoparia等が挙げられる。 The genus Shitonetake is not particularly limited, and for example, Peroneutypa aequlinearis, Peroneutypa sp. , Peroneutypa vitis, Peroneutypa canker, Peroneutypa parasitica, Peroneutypa scoparia and the like.

＜培養方法について＞
上記微生物を培養する方法としては、上記微生物を培養できる限り特に限定されず、また、使用する微生物に応じて公知の培養方法を適宜調整すればよい。 <About culture method>
The method for culturing the above-mentioned microorganism is not particularly limited as long as the above-mentioned microorganism can be cultivated, and a known culturing method may be appropriately adjusted according to the microorganism to be used.

具体的には、上記微生物を適当な培地で培養すればよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。また、固体培地、液体培地のいずれであってもよいが、液体培地が好ましい。 Specifically, the above-mentioned microorganism may be cultured in an appropriate medium. The medium for this purpose is not particularly limited as long as the microorganism can grow, and may be a normal medium containing a normal carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and if necessary, an organic nutrient source. Further, it may be either a solid medium or a liquid medium, but a liquid medium is preferable.

例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びこれらの塩類、パラフィン等の炭水化物類あるいはこれらの混合物等を使用することができる。 For example, any of the above microorganisms can be used as the carbon source, specifically, sugars such as glucose, fructose, maltose and amylose, alcohols such as sorbitol, ethanol and glycerol, fumaric acid and citric acid. , Acetic acid, organic acids such as propionic acid, salts thereof, carbohydrates such as paraffin, or mixtures thereof.

窒素源としては特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー等の有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。 The nitrogen source is not particularly limited, and for example, ammonium salts of inorganic salts such as ammonium sulfate and ammonium chloride, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, peptone, and yeast extracts. , Meat extract, organic nitrogen compounds such as corn steep liquor, or mixtures thereof can be used.

他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類、ホルモン等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。 In addition, nutrient sources used in ordinary media such as inorganic salts, trace metal salts, vitamins, and hormones can be appropriately mixed and used.

また、培地として、市販の培地を使用してもよい。 Moreover, you may use a commercially available medium as a medium.

培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ１〜１０（好ましくは３〜８）、温度１５〜６０℃（好ましくは２５〜３５℃）の範囲でｐＨおよび温度を適当に制御しつつ１２〜４８０時間程度培養を行えばよい。また、静置培養、振盪培養のいずれであってもよいが、振盪培養が好ましい。 There are no particular restrictions on the culture conditions, for example, the pH and temperature can be adjusted in the range of pH 1 to 10 (preferably 3 to 8) and temperature 15 to 60 ° C (preferably 25 to 35 ° C) under aerobic conditions. The culture may be carried out for about 12 to 480 hours while being appropriately controlled. Further, either static culture or shaking culture may be used, but shaking culture is preferable.

＜抽出を行う方法について＞
上述の培養条件にて上記微生物を培養することにより、培養物が得られる。ここで、培養物とは、例えば、上述の培養条件にて上記微生物を培養した培養液や、該培養液から微生物をろ過や遠心分離等により分離した培養ろ液（培養上澄液）等が挙げられる。なかでも、有効成分の大部分が培養液中に分泌されているため、培養ろ液を含有する培養物または培養ろ液から抽出することが好ましく、より多くの有効成分が得られるという理由から、培養液から抽出することがより好ましい。もちろん、上記培養液からろ過や遠心分離等により分離された微生物体のみから抽出してもよい。また、培養液や分離された微生物体をホモジナイズした破砕物、超音波処理した破砕物等から抽出してもよい。 <How to extract>
A culture can be obtained by culturing the above-mentioned microorganism under the above-mentioned culture conditions. Here, the culture includes, for example, a culture solution in which the above-mentioned microorganisms are cultured under the above-mentioned culture conditions, a culture filtrate (culture supernatant) in which microorganisms are separated from the culture solution by filtration, centrifugation, or the like. Can be mentioned. Among them, since most of the active ingredient is secreted into the culture medium, it is preferable to extract from the culture or the culture filtrate containing the culture filtrate, and more active ingredients can be obtained. More preferably, it is extracted from the culture broth. Of course, it may be extracted only from the microorganisms separated from the culture solution by filtration, centrifugation or the like. Further, it may be extracted from a culture solution, a crushed product obtained by homogenizing the separated microorganisms, a crushed product obtained by ultrasonic treatment, or the like.

培養物から抽出を行う方法としては特に限定されず、公知の方法により抽出を行えばよい。なかでも、有機溶媒による抽出が好ましく、有機溶媒による溶媒抽出が好ましい。 The method for extracting from the culture is not particularly limited, and extraction may be performed by a known method. Of these, extraction with an organic solvent is preferable, and solvent extraction with an organic solvent is preferable.

有機溶媒による抽出方法としては特に限定されず、公知の方法により抽出を行えばよい。例えば、培養物と有機溶媒を混合し混合液を得、一定時間後に有機溶媒相を分離すればよい。 The extraction method using an organic solvent is not particularly limited, and extraction may be performed by a known method. For example, the culture and the organic solvent may be mixed to obtain a mixed solution, and the organic solvent phase may be separated after a certain period of time.

有機溶媒としては特に限定されず、例えば、アセトン、アセチルアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、３−メチル−１，５−ペンタンジオール、１，２−オクタンジオール、１，８−オクタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール等のジオール類；グリセロール；炭素数１〜１０（好ましくは炭素数４〜８）の直鎖又は分岐鎖のアルコール、シクロヘキサノール、３−メトキシ−３−メチル−１−ブタノール、３−メトキシ−１−ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、酪酸エチル、蟻酸エチル等の脂肪酸エステル類；ポリエチレングリコール、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、テトラエチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテルエーテル等のグリコール又はグリコールエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ジメチルスルホキシド；テルピネオール等のテルペン類；アセトニトリル；γ-ブチロラクトン；２-ピロリドン；Ｎ-メチルピロリドン；Ｎ-(２-アミノエチル)ピペラジン等の極性溶媒；トルエン、ベンゼン、キシレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、オクタン等の無極性溶媒等が挙げられる。なお、上記溶媒を混合して使用してもよい。なかでも、極性溶媒が好ましく、脂肪酸エステル類、直鎖又は分岐鎖のアルコールがより好ましく、酢酸エステル類が特に好ましい。
酢酸エステル類としては、上述の酢酸エチル、酢酸ブチルの他、酢酸プロピル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシル、酢酸イソブチル、酢酸イソアミル等が挙げられる。 The organic solvent is not particularly limited, and for example, ketones such as acetone, acetylacetone and methyl ethyl ketone; ethers such as diethyl ether, dipropyl ether, dibutyl ether, tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; 1,2-propanediol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, 1,2-hexanediol, 1,6-hexanediol, 1,2-pentanediol, 1 , 5-Pentanediol, 2-Methyl-2,4-Pentanediol, 3-Methyl-1,5-Pentanediol, 1,2-octanediol, 1,8-Octanediol, 2-Ethyl-1,3- Diores such as hexanediol; glycerol; linear or branched alcohols with 1 to 10 carbon atoms (preferably 4 to 8 carbon atoms), cyclohexanol, 3-methoxy-3-methyl-1-butanol, 3-methoxy. Alcohols such as -1-butanol; fatty acid esters such as ethyl acetate, butyl acetate, ethyl butyrate, ethyl formate; polyethylene glycol, triethylene glycol monomethyl ether, tetraethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycol monoethyl Glycols or glycol ethers such as ether, diethylene glycol dimethyl ether, triethylene glycol dimethyl ether ether; N, N-dimethylformamide; dimethylsulfoxide; terpenes such as terpineol; acetonitrile; γ-butyrolactone; 2-pyrrolidone; N-methylpyrrolidone; N Polar solvents such as-(2-aminoethyl) piperazine; non-polar solvents such as toluene, benzene, xylene, chlorobenzene, dichlorobenzene, hexane, octane and the like can be mentioned. The above solvents may be mixed and used. Of these, polar solvents are preferred, fatty acid esters, straight-chain or branched-chain alcohols are more preferred, and acetate esters are particularly preferred.
Examples of acetic acid esters include propyl acetate, pentyl acetate, hexyl acetate, isobutyl acetate, isoamyl acetate and the like, in addition to the above-mentioned ethyl acetate and butyl acetate.

培養物に対する有機溶媒の割合は、特に限定されず、例えば、体積比で１０：１〜１：１０（培養物：有機溶媒）、好ましくは４：１〜１：４、より好ましくは２：１〜１：２である。
抽出温度も特に限定されず、例えば、２５〜６０℃で抽出を行えばよい。 The ratio of the organic solvent to the culture is not particularly limited, and for example, the volume ratio is 10: 1 to 1:10 (culture: organic solvent), preferably 4: 1 to 1: 4, and more preferably 2: 1. ~ 1: 2.
The extraction temperature is also not particularly limited, and for example, extraction may be performed at 25 to 60 ° C.

混合液から有機溶媒相を分離する方法としては特に限定されず、例えば、遠心分離法、ろ過法、減圧膜ろ過法、加圧膜ろ過法、静置デカント法等が挙げられる。 The method for separating the organic solvent phase from the mixed solution is not particularly limited, and examples thereof include a centrifugation method, a filtration method, a reduced pressure membrane filtration method, a pressurized membrane filtration method, and a static decanting method.

得られた有機溶媒相は、そのまま培養抽出物として使用してもよいし、公知の方法で有機溶媒相を濃縮した濃縮液、有機溶媒相を希釈した希釈液、または有機溶媒相を凍結乾燥した粉末を培養抽出物として使用してもよい。もちろん、上記粉末を任意の溶媒に溶解および／又は懸濁させてから培養抽出物として使用してもよい。 The obtained organic solvent phase may be used as it is as a culture extract, or a concentrated solution obtained by concentrating the organic solvent phase by a known method, a diluted solution obtained by diluting the organic solvent phase, or the organic solvent phase is freeze-dried. The powder may be used as a culture extract. Of course, the powder may be dissolved and / or suspended in any solvent and then used as a culture extract.

また、有効成分が含有（残留）される限り、必要に応じて、得られた有機溶媒相に対して、酸沈殿、アルコール沈殿、塩析、膜分離、クロマト分離等の公知の精製操作を更に行ってもよい。 Further, as long as the active ingredient is contained (residual), known purification operations such as acid precipitation, alcohol precipitation, salting out, membrane separation, and chromatographic separation are further performed on the obtained organic solvent phase, if necessary. You may go.

このようにして得られた特定の微生物の培養抽出物は、細胞での有用物質の比生産速度の増大に使用することができる。好ましくは、in vitroで細胞を用いた有用物質生産をする際の比生産速度の増大のため、特定の微生物の培養抽出物の使用が提供される。比生産速度の増大は、そのメカニズムに関係なく、有用物質の１細胞当たりの比生産速度が増大すればよく、例えば、細胞増殖を抑制することにより比生産速度を増大させてもよく、個々の細胞における有用物質の発現量を増大させることにより有用物質の産生を増大させて比生産速度を増大させてもよく、その両方であってもよい。 The culture extract of a particular microorganism thus obtained can be used to increase the specific production rate of useful substances in cells. Preferably, the use of a culture extract of a particular microorganism is provided for increased specific production rates during the production of useful substances using cells in vitro. The increase in the specific production rate may be made as long as the specific production rate per cell of the useful substance is increased regardless of the mechanism. For example, the specific production rate may be increased by suppressing cell proliferation, and the specific production rate may be increased individually. By increasing the expression level of the useful substance in the cell, the production of the useful substance may be increased to increase the specific production rate, or both may be used.

本発明では、培養抽出物として、由来する微生物が異なる複数の培養抽出物を組み合わせて使用してもよく、抽出方法が異なる複数の培養抽出物を組み合わせて使用してもよい。この場合、後述する、特定の微生物の培養抽出物の最終濃度、特定の微生物の培養抽出物の含有量は、それぞれ、特定の微生物の培養抽出物の最終合計濃度、特定の微生物の培養抽出物の合計含有量を意味する。 In the present invention, as the culture extract, a plurality of culture extracts having different origins may be used in combination, or a plurality of culture extracts having different extraction methods may be used in combination. In this case, the final concentration of the culture extract of the specific microorganism and the content of the culture extract of the specific microorganism, which will be described later, are the final total concentration of the culture extract of the specific microorganism and the culture extract of the specific microorganism, respectively. Means the total content of.

特定の微生物の培養抽出物は、細胞培養用培地に添加することにより有用物質の比生産速度促進に使用することができる。また、好ましい実施態様において、特定の微生物の培養抽出物を細胞培養用培地に添加することにより、有用物質の比生産速度を向上させる。よって、特定の微生物の培養抽出物は、単独で培地添加因子である有用物質比生産速度促進剤として使用できる。また、他の有用物質の産生促進に寄与する物質（例えば、トランスフェリン、インスリン等のタンパク質）および／または低分子化合物（例えば、グルコース、リン酸塩、亜セレン酸）とともに使用することもできる。すなわち、有用物質比生産速度促進剤は、特定の微生物の培養抽出物を含む限り、特に限定されず、他の物質を含んでもよいし、含まなくてもよい。 A culture extract of a specific microorganism can be used to promote the specific production rate of useful substances by adding it to a cell culture medium. In a preferred embodiment, the specific production rate of useful substances is improved by adding a culture extract of a specific microorganism to a cell culture medium. Therefore, the culture extract of a specific microorganism can be used alone as a medium-adding factor, which is a useful substance ratio production rate accelerator. It can also be used with substances that contribute to the promotion of production of other useful substances (eg, proteins such as transferrin, insulin) and / or low molecular weight compounds (eg, glucose, phosphate, selenite). That is, the useful substance ratio production rate accelerator is not particularly limited as long as it contains a culture extract of a specific microorganism, and may or may not contain other substances.

本発明が提供する促進剤（例えば、有用物質の比生産速度促進剤）は、培地容量に対する特定の微生物の培養抽出物の添加量（培養抽出物の添加量（ｖ）／培養抽出物添加前の培地容量（ｖ））が、０．００１〜１％（ｖ/ｖ）の範囲で使用すればよく、０．０１〜１％（ｖ/ｖ）の範囲で使用することが好ましく、０．０１〜０．５％（ｖ/ｖ）の範囲で使用することがより好ましい。また、培地への培養抽出物の添加量として、培養後の生細胞数が培養抽出物無添加をコントロールとした場合の生細胞数を５％以上生育阻害する添加量であればよく、１０％以上生育阻害する添加量が好ましく、１５％以上生育阻害する添加量がより好ましい。促進剤は室温で液体でも固体でもよい。例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等の緩衝液やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に特定の微生物の培養抽出物を溶解および／又は懸濁させて、本発明が提供する促進剤として、培地中での培養抽出物濃度を上記範囲内で調整することができる。 The accelerator provided by the present invention (for example, a specific production rate accelerator for useful substances) is an amount of a culture extract of a specific microorganism added to a medium volume (amount of culture extract added (v) / before addition of culture extract). The medium volume (v) of the above may be in the range of 0.001 to 1% (v / v), preferably in the range of 0.01 to 1% (v / v), and 0. It is more preferable to use it in the range of 01 to 0.5% (v / v). The amount of the cultured extract added to the medium may be 10% as long as the number of viable cells after culturing is 5% or more that inhibits the growth of the number of viable cells when no addition of the cultured extract is controlled. The amount of addition that inhibits growth is preferable, and the amount of addition that inhibits growth by 15% or more is more preferable. The accelerator may be liquid or solid at room temperature. For example, it is specific to a buffer solution such as phosphate buffer physiological saline, phosphate buffer, acetate buffer, citric acid buffer, Tris buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, or a solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO). By dissolving and / or suspending the culture extract of the microorganism, the concentration of the culture extract in the medium can be adjusted within the above range as the accelerator provided by the present invention.

特定の微生物の培養抽出物を添加する培地は、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ１２、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓｍｅｄｉｕｍまたはそれらの混合物であってもよい。これらの基礎培地に上記で説明した特定の微生物の培養抽出物を添加することにより、有用物質の製造に有用な培地（無血清培地）を調製できる。また、増殖因子や血清代替物質を添加することにより血清非含有で使用することを前提とした無血清培地、無タンパク培地またはケミカリー・ディファインド培地に添加して用いることもできる。これらの培地の例としてはＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＥＸ−ＣＥＬＬ３０２, ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５−ＰＦ、ＥＸ−ＣＥＬＬＣＤＣＨＯ等、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＳＦＭＩＩ、ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ、ＣＤＣＨＯ等、また、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＩＳ−ＣＨＯＣＤ、ＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍ等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、このような無血清培地、無タンパク培地、またはケミカリーディファインド培地を任意の比率で２種以上を混合した混合培地に対しても同様に用いることができる。培地中の特定の微生物の培養抽出物の含有量は、特に限定されないが、培養後の生細胞数が培養抽出物無添加をコントロールとした場合の生細胞数を５％以上生育阻害する含有量であればよく、１０％以上生育阻害する含有量が好ましく、１５％以上生育阻害する含有量がより好ましい。 The medium to which the culture extract of a specific microorganism is added may be, for example, MEM, DMEM, HamF12, RPMI1640, Fisher's medium or a mixture thereof. By adding the culture extract of the specific microorganism described above to these basal media, a medium (serum-free medium) useful for producing a useful substance can be prepared. It can also be used by adding it to a serum-free medium, a protein-free medium, or a chemicery-defined medium, which is premised on being used without serum by adding a growth factor or a serum substitute substance. Examples of these media include EX-CELL 302, EX-CELL 325-PF, EX-CELL CD CHO manufactured by SAFC Biosciences, SFM II, CHO-III-PFM, CD CHO manufactured by Life Technologies, and the like. , IS-CHO CD manufactured by Irvine Scientific, BalanCD Growth A Medium, and the like, but are not limited thereto. Further, it can be similarly used for a mixed medium in which two or more kinds of such serum-free medium, protein-free medium, or chemicary-defined medium are mixed at an arbitrary ratio. The content of the culture extract of a specific microorganism in the medium is not particularly limited, but the content that inhibits the growth of the number of viable cells after culturing by 5% or more when the addition of no culture extract is controlled. Anything is preferable, and a content that inhibits growth by 10% or more is preferable, and a content that inhibits growth by 15% or more is more preferable.

特定の微生物の培養抽出物を含む培地は、前記培養抽出物に加えて、例えば、無機塩類（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、炭水化物（例えば、グルコース等の糖）、アミノ酸（例えば、グルタミンやイソロイシン）、ビタミン（例えば、リボフラビン、チアミン）、脂肪酸・脂質（例えば、コレステロール等のステロイド）、タンパク質・ペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン等のジペプチド）、微量元素（例えば、マグネシウム、銅、鉄）およびそれらの組み合わせから選択される物質を含んでもよい。一つの実施態様において、特定の微生物の培養抽出物を含む液体培地は、前記培養抽出物に加え、０．１〜４．５ｇ／Ｌのグルコース、０．１〜０．５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、１〜１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−アルギニン・ＨＣｌ、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−システイン・２ＨＣｌ、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−ロイシン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−リジン・ＨＣｌ、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−メチオニン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−トレオニン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ_２Ｏ、および０．００１〜０．３ｇ／ＬのＬ−バリンを含む。また、一つの実施態様として、水に溶解したときに上記の組成になるような粉末状態の培地であってもよい。このような上記で説明した特定の微生物の培養抽出物を含有する培地は、有用物質の製造に使用することができる。
具体的には、有用物質を産生する細胞を、特定の微生物の培養抽出物を含む培地で培養する培養工程、および細胞から産生された有用物質を単離する単離工程を含む方法により有用物質を製造できる。例えば、有用物質として抗体を製造する場合には、抗体産生細胞を、特定の微生物の培養抽出物を含む培地で培養し、抗体を精製する工程を含む方法により抗体を製造できる。抗体の精製工程は、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いた方法等が含まれる。なお、上記培養工程においては、培養中に培地成分を追加する、いわゆるＦｅｅｄ培養を行ってもよい。この場合、追加される培地は、特定の微生物の培養抽出物を含むことが好ましい。 In addition to the culture extract, the medium containing the culture extract of a specific microorganism may contain, for example, inorganic salts (eg, sodium salt, potassium salt, calcium salt), carbohydrates (eg, sugars such as glucose), amino acids (eg, sugars such as glucose). , Glutamine and isoleucine), vitamins (eg, riboflavin, thiamine), fatty acids / lipids (eg, steroids such as cholesterol), proteins / peptides (eg, dipeptides such as albumin, transferase, L-alanyl-L-glutamine), trace amounts It may contain a substance selected from elements (eg, magnesium, copper, iron) and combinations thereof. In one embodiment, the liquid medium containing the culture extract of a particular microorganism is, in addition to the culture extract, 0.1 to 4.5 g / L glucose, 0.1 to 0.5 g / L CaCl _2. 1, 10 g / L NaCl, 0.001 to 0.3 g / L L-arginine HCl, 0.001 to 0.3 g / L L-cysteine 2HCl, 0.001 to 0.3 g / L Roh L- histidine _· HCl _· H 2 O, L- isoleucine 0.001~0.3g / L, of 0.001~0.3g / L L- leucine, the 0.001~0.3g / L L -Lydin HCl, 0.001-0.3 g / L L-methionine, 0.001-0.3 g / L L-phenylalanine, 0.001-0.3 g / L L-threonine, 0.001 L- tryptophan ~0.3g / L, 0.001~0.3g / L of L- tyrosine · 2Na · _2H 2 O, and a L- valine 0.001~0.3g / L. Further, as one embodiment, the medium may be in a powder state so as to have the above composition when dissolved in water. Such a medium containing a culture extract of a specific microorganism described above can be used for the production of a useful substance.
Specifically, a useful substance is produced by a method including a culture step of culturing cells producing a useful substance in a medium containing a culture extract of a specific microorganism, and an isolation step of isolating the useful substance produced from the cells. Can be manufactured. For example, when producing an antibody as a useful substance, the antibody can be produced by a method including a step of culturing an antibody-producing cell in a medium containing a culture extract of a specific microorganism and purifying the antibody. The antibody purification step includes, for example, a method using affinity column chromatography and the like. In the above culture step, so-called Feed culture, in which a medium component is added during the culture, may be performed. In this case, the medium to be added preferably contains a culture extract of a particular microorganism.

本発明では、培養抽出物の培地への添加時期は特に限定されず、培養開始前に培養抽出物を予め培地に添加しておいてもよく、培養途中に培養抽出物を培地に添加してもよい。なかでも、本発明では、特定の微生物の培養抽出物により、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低減できると共に、細胞においてタンパク質等の有用物質の比生産速度を増大させることができるため、上記培養工程において、細胞の増殖が盛んな対数増殖期に培養抽出物を培地へ添加することが好ましい。これにより、本発明の効果がより好適に得られる。 In the present invention, the timing of addition of the culture extract to the medium is not particularly limited, and the culture extract may be added to the medium in advance before the start of the culture, or the culture extract is added to the medium during the culture. May be good. Among them, in the present invention, the culture extract of a specific microorganism can suppress cell proliferation, reduce cell density, and increase the specific production rate of useful substances such as proteins in cells. In the culturing step, it is preferable to add the culture extract to the medium during the logarithmic growth phase in which cell proliferation is active. Thereby, the effect of the present invention can be obtained more preferably.

本明細書において、有用物質とは、医薬、農薬、食品、その他化学工業に有用な物質であれば特に制限はない。好ましくは、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インスリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）等の生理活性タンパク質、ペプチド等が例として挙げられる。抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）である。有用物質は、外来遺伝子の発現産物である組み換えタンパク質であり得る。 In the present specification, the useful substance is not particularly limited as long as it is a substance useful for pharmaceuticals, pesticides, foods, and other chemical industries. Preferably, physiologically active proteins such as antibodies, enzymes (urokinase, etc.), hormones (insulin, etc.), cytokines (interferon, interleukin, erythropoietin, G-CSF, GM-CSF, etc.), peptides and the like can be mentioned as examples. The antibody is, for example, a mouse monoclonal antibody, a humanized monoclonal antibody or a human monoclonal antibody. The class of immunoglobulin is not particularly limited, but is, for example, IgG (for example, IgG1, IgG2). The useful substance can be a recombinant protein that is an expression product of a foreign gene.

本明細書において、細胞については組換えタンパク等の有用物質生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞（例えば、ＳＰ２/Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞）等の哺乳類動物細胞、カイコ細胞、ショウジョウバエ細胞等の昆虫細胞等の動物細胞；シロイヌナズナ細胞等の植物細胞；およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が例として挙げられる。有用物質として抗体を産生させる場合は、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２/Ｏ細胞またはＮＳＯ細胞等の動物細胞（好ましくは哺乳類動物細胞）を細胞融合することによって得られるハイブリドーマ等を抗体産生細胞として採用することができる。なかでも、動物細胞が好ましく、哺乳類動物細胞がより好ましく、ＣＨＯ細胞が更に好ましい。 In the present specification, the cells are not particularly limited as long as they can be used for producing useful substances such as recombinant proteins, and are CHO cells, BHK cells, HepG2 cells, rodent myeloma cells (for example, SP2 / O cells, NSO). Mammalian animal cells such as mouse myeloma cells such as cells), animal cells such as insect cells such as silkworm cells and Drosophila cells; plant cells such as white-spotted nazuna cells; and transformed cells into which foreign genes have been introduced into these cells. Is listed as. When producing an antibody as a useful substance, a hybridoma or the like obtained by fusing animal cells (preferably mammalian animal cells) such as CHO cells, SP2 / O cells or NSO cells can be adopted as antibody-producing cells. it can. Among them, animal cells are preferable, mammalian cells are more preferable, and CHO cells are further preferable.

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

（培養抽出物の調製１−ａ（Ａ２０４））
培養抽出物（１−ａ）はオーピーバイオファクトリー株式会社より購入した。培養抽出物は下記の調製方法で調製した。
−８０℃の凍結保存液からＩＳＰ２寒天平板培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％グルコース、２％寒天となるように海水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．３に調整）にStreptomyces sp.ＯＰＭＡ４０６９１（Ａ２０４）を植菌し、２８℃で７日間培養した。寒天平板培地上に生育した菌株をＳＰＹ培地（１％可溶性スターチ、０．５％ペプトン、０．２５％酵母エキスとなるように海水１Ｌに溶解し、生育培地として用い、φ２２ｍｍ試験管１本当たり、１５ｍｌ分注したもの１０本を用いた）に植菌し、２８℃、２００ｒｐｍ、５日間振盪培養を行った。培養終了後、培養液１５ｍｌに等量の酢酸エチルを添加し、２５℃で１時間撹拌抽出をおこなった。撹拌抽出後、抽出液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して、液相を分離し、分離上層（酢酸エチル層）から、１２ｍｌの酢酸エチルを分取、回収（試験官１０本分の培養液から、１２０ｍｌの酢酸エチル抽出液）した。回収した酢酸エチル抽出液をエバポレータで濃縮して、溶媒を除去、乾燥した後、１２ｍｌのＤＭＳＯを添加して培養抽出物（１−ａ）を溶解した。培養抽出物（１−ａ）を実施例１に用いた。 (Preparation of culture extract 1-a (A204))
The culture extract (1-a) was purchased from OP Bio Factory Co., Ltd. The culture extract was prepared by the following preparation method.
ISP2 agar plate medium from cryopreservation solution at -80 ° C (dissolve in 1 L of seawater to make 0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% glucose, 2% agar, and adjust to pH 7.3) Was inoculated with Streptomyces sp. OPMA40691 (A204) and cultured at 28 ° C. for 7 days. The strain grown on the agar plate medium was dissolved in 1 L of seawater so as to become SPY medium (1% soluble starch, 0.5% peptone, 0.25% yeast extract) and used as a growth medium, per φ22 mm test tube. , 15 ml of the medium was dispensed), and the cells were cultured at 28 ° C., 200 rpm, and shaken for 5 days. After completion of the culture, an equal amount of ethyl acetate was added to 15 ml of the culture solution, and the mixture was stirred and extracted at 25 ° C. for 1 hour. After stirring and extracting, the extract is centrifuged (3,000 rpm, 5 min) to separate the liquid phase, and 12 ml of ethyl acetate is separated and recovered from the separation upper layer (ethyl acetate layer) (for 10 examiners). From the culture broth, 120 ml of ethyl acetate extract) was added. The recovered ethyl acetate extract was concentrated with an evaporator to remove the solvent, dried, and then 12 ml of DMSO was added to dissolve the culture extract (1-a). The culture extract (1-a) was used in Example 1.

さらに、培養抽出物（１−ａ）を３ｇのＯＤＳ樹脂（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５Ｃ１８−ＯＰＮ）を１０ｍｌ容ＰＰ注射筒に充填した分離カラムを用いて、培養抽出物の分画を行った。溶出溶媒は、水／アセトニトリルを用いて、アセトニトリル２０％（画分１）、４０％（画分２）、６０％（画分３）、８０％（画分４）、１００％（画分５）のステップワイズ溶出で分画を実施し、５分画とした。各分画（液量１５ｍｌ）を遠心濃縮し、乾燥した。乾燥した各培養抽出画分（１−ａ：画分１〜５）を１１．８ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。 Further, the culture extract was fractionated using a separation column in which 3 g of the culture extract (1-a) was filled with 3 g of ODS resin (Cosmosil 75C18-OPN) in a 10 ml PP injection tube. Water / acetonitrile was used as the elution solvent, and acetonitrile was 20% (fraction 1), 40% (fraction 2), 60% (fraction 3), 80% (fraction 4), 100% (fraction 5). ) Stepwise elution was used for fractionation to obtain 5 fractions. Each fraction (15 ml liquid volume) was centrifuged and dried. Each dried culture extract fraction (1-a: fractions 1-5) was dissolved in 11.8 ml DMSO.

（培養抽出物の調製２−ａ（Ａ２７８））
培養抽出物（２−ａ）はオーピーバイオファクトリー株式会社より購入した。培養抽出物は下記の調製方法で調製した。
−８０℃の凍結保存液からＩＳＰ２寒天平板培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％グルコース、２％寒天となるように海水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．３に調整）にStreptomyces sp. ＯＰＭＡ４０７６０（Ａ２７８）を植菌し、２８℃で７日間培養した。寒天平板培地上に生育した菌株をＳＰＹ培地（１％可溶性スターチ、０．５％ペプトン、０．２５％酵母エキスとなるように海水１Ｌに溶解し、生育培地として用い、φ２２ｍｍ試験管１本当たり、１５ｍｌ分注したもの１０本を用いた）に植菌し、２８℃、２００ｒｐｍ、５日間振盪培養を行った。培養終了後、培養液１５ｍｌに等量の酢酸エチルを添加し、２５℃で１時間撹拌抽出をおこなった。撹拌抽出後、抽出液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して、液相を分離し、分離上層（酢酸エチル層）から、１２ｍｌの酢酸エチルを分取、回収（試験官１０本分の培養液から、１２０ｍｌの酢酸エチル抽出液）した。回収した酢酸エチル抽出液をエバポレータで濃縮して、溶媒を除去、乾燥した後、１２ｍｌのＤＭＳＯを添加して培養抽出物（２−ａ）を溶解した。培養抽出物（２−ａ）を実施例１に用いた。 (Preparation of culture extract 2-a (A278))
The culture extract (2-a) was purchased from OP Bio Factory Co., Ltd. The culture extract was prepared by the following preparation method.
ISP2 agar plate medium from cryopreservation solution at -80 ° C (dissolve in 1 L of seawater to make 0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% glucose, 2% agar, and adjust to pH 7.3) Streptomyces sp. OPMA40760 (A278) was inoculated into the agar and cultured at 28 ° C. for 7 days. The strain grown on the agar plate medium was dissolved in 1 L of seawater so as to become SPY medium (1% soluble starch, 0.5% peptone, 0.25% yeast extract) and used as a growth medium, per φ22 mm test tube. , 15 ml of the medium was dispensed), and the cells were cultured at 28 ° C., 200 rpm, and shaken for 5 days. After completion of the culture, an equal amount of ethyl acetate was added to 15 ml of the culture solution, and the mixture was stirred and extracted at 25 ° C. for 1 hour. After stirring and extracting, the extract is centrifuged (3,000 rpm, 5 min) to separate the liquid phase, and 12 ml of ethyl acetate is separated and recovered from the separation upper layer (ethyl acetate layer) (for 10 examiners). From the culture broth, 120 ml of ethyl acetate extract) was added. The recovered ethyl acetate extract was concentrated with an evaporator to remove the solvent, dried, and then 12 ml of DMSO was added to dissolve the culture extract (2-a). The culture extract (2-a) was used in Example 1.

さらに、培養抽出物（２−ａ）を３ｇのＯＤＳ樹脂（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５Ｃ１８−ＯＰＮ）を１０ｍｌ容ＰＰ注射筒に充填した分離カラムを用いて、培養抽出物の分画を行った。溶出溶媒は、水／アセトニトリルを用いて、アセトニトリル２０％（画分６）、４０％（画分７）、６０％（画分８）、８０％（画分９）、１００％（画分１０）のステップワイズ溶出で分画を実施し、５分画とした。各分画（液量１５ｍｌ）を遠心濃縮し、乾燥した。乾燥した各培養抽出画分（２−ａ：画分６〜１０）を１１．８ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。 Further, the culture extract was fractionated using a separation column in which 3 g of the culture extract (2-a) was filled with 3 g of ODS resin (Cosmosil 75C18-OPN) in a 10 ml PP injection tube. Water / acetonitrile was used as the elution solvent, and acetonitrile was 20% (fraction 6), 40% (fraction 7), 60% (fraction 8), 80% (fraction 9), 100% (fraction 10). ) Stepwise elution was used for fractionation to obtain 5 fractions. Each fraction (15 ml liquid volume) was centrifuged and dried. Each dried culture extract fraction (2-a: fractions 6-10) was dissolved in 11.8 ml DMSO.

（培養抽出物の調製３（Ｆ６７））
培養抽出物（３−ａ）はオーピーバイオファクトリー株式会社より購入した。培養抽出物は下記の調製方法で調製した。
−８０℃の凍結保存液からＬＣ寒天平板培地（０．１％グルコース、０．１％リン酸二水素カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０２％塩化カリウム、０．２％硝酸ナトリウム、０．２酵母エキス、２％寒天となるように海水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．０に調整）にPeroneutypa scoparia ＯＰＭＦ００７９４（Ｆ６７）を植菌し、２８℃で７日間培養した。寒天平板培地上に生育した菌株をＰＤＢ培地（２．４％ポテトデキストリンブロース、０．４％硝酸カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物となるように海水１Ｌに溶解し、生育培地として用い、φ２２ｍｍ試験管１本当たり、１５ｍｌ分注したもの１０本を用いた）に植菌し、２８℃、２００ｒｐｍ、７日間振盪培養を行った。培養終了後、培養液１５ｍｌに等量の酢酸エチルを添加し、２５℃で１時間撹拌抽出をおこなった。撹拌抽出後、抽出液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して、液相を分離し、分離上層（酢酸エチル層）から、１２ｍｌの酢酸エチルを分取、回収（試験官１０本分の培養液から、１２０ｍｌの酢酸エチル抽出液）した。回収した酢酸エチル抽出液をエバポレータで濃縮して、溶媒を除去、乾燥した後、１２ｍｌのＤＭＳＯを添加して培養抽出物（３−ａ）を溶解した。培養抽出物（３−ａ）を実施例１に用いた。 (Preparation of culture extract 3 (F67))
The culture extract (3-a) was purchased from OP Bio Factory Co., Ltd. The culture extract was prepared by the following preparation method.
LC agar plate medium (0.1% glucose, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.02% potassium chloride, 0. Peroneutypa scoparia OPMF00794 (F67) was inoculated into 1 L of seawater so as to have 2% sodium nitrate, 0.2 yeast extract and 2% agar, and adjusted to pH 7.0, and cultured at 28 ° C. for 7 days. Strains grown on agar plates should be converted to PDB medium (2.4% potato dextrin broth, 0.4% potassium nitrate, 0.15% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate). Was dissolved in 1 L of seawater, used as a growth medium, and inoculated into 10 tubes in which 15 ml was dispensed per φ22 mm test tube), and cultured with shaking at 28 ° C., 200 rpm for 7 days. After completion of the culture, an equal amount of ethyl acetate was added to 15 ml of the culture solution, and the mixture was stirred and extracted at 25 ° C. for 1 hour. After stirring and extracting, the extract is centrifuged (3,000 rpm, 5 min) to separate the liquid phase, and 12 ml of ethyl acetate is separated and recovered from the separation upper layer (ethyl acetate layer) (for 10 examiners). From the culture broth, 120 ml of ethyl acetate extract) was added. The recovered ethyl acetate extract was concentrated with an evaporator to remove the solvent, dried, and then 12 ml of DMSO was added to dissolve the culture extract (3-a). The culture extract (3-a) was used in Example 1.

さらに、培養抽出物（３−ａ）を、３ｇのＯＤＳ樹脂（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５Ｃ１８−ＯＰＮ）を１０ｍｌ容ＰＰ注射筒に充填した分離カラムを用いて、培養抽出物の分画を行った。溶出溶媒は、水／アセトニトリルを用いて、アセトニトリル２０％（画分１１）、４０％（画分１２）、６０％（画分１３）、８０％（画分１４）、１００％（画分１５）のステップワイズ溶出で分画を実施し、５分画とした。各分画（液量１５ｍｌ）を遠心濃縮し、乾燥した。乾燥した各培養抽出画分（３−ａ：画分１１〜１５）を１１．８ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。 Further, the culture extract (3-a) was fractionated using a separation column filled with 3 g of ODS resin (Cosmosil 75C18-OPN) in a 10 ml PP injection tube. Water / acetonitrile was used as the elution solvent, and acetonitrile was 20% (fraction 11), 40% (fraction 12), 60% (fraction 13), 80% (fraction 14), 100% (fraction 15). ) Stepwise elution was used for fractionation to obtain 5 fractions. Each fraction (15 ml liquid volume) was centrifuged and dried. Each dried culture extract fraction (3-a: fractions 11-15) was dissolved in 11.8 ml DMSO.

（培養抽出物の効果の確認（実施例１））
ＩｇＧ遺伝子が導入されＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−１２４４５）を用い、ＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に馴化、および浮遊化させた細胞を実験に用いた。１２５ｍｌの三角フラスコにＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍを３０ｍｌ添加し、上記浮遊化細胞を２.０×１０^５ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下、１００ｒｐｍで振盪をしながら８日間培養した。
各培養抽出物（１−ａ、２−ａ、３−ａ）を培養４日目に培地容量に対して各々０．１％添加し、コントロール（培養抽出物無添加）としてＤＭＳＯを添加した。８日目の培養液をサンプリングし、培養液中の生細胞数とＩｇＧ抗体濃度を測定し、抗体比生産速度を求めた。結果を図１に示す。また、培養８日目の生細胞数を図２に示す。 (Confirmation of effect of culture extract (Example 1))
Using a CHO cell line (ATCC CRL-12445) into which an IgG gene was introduced and secreted and produced an IgG antibody, cells acclimatized to BalanCD Growth A Medium (manufactured by Irvine Scientific) and suspended were used in the experiment. 30 ml of Balan CD Growth A Medium was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, and the above-mentioned suspended cells were ^{seeded at 2.0 × 10 5} cells / ml, and shaken at 37 ° C. and 5% CO ₂ environment at 100 rpm. While culturing for 8 days.
Each culture extract (1-a, 2-a, 3-a) was added at 0.1% to the medium volume on the 4th day of culture, and DMSO was added as a control (no culture extract was added). The culture broth on the 8th day was sampled, the number of living cells in the culture broth and the IgG antibody concentration were measured, and the antibody ratio production rate was determined. The results are shown in FIG. The number of viable cells on the 8th day of culture is shown in FIG.

（ＩｇＧ濃度の測定方法）
ＰａｌｌＦｏｒｔｅＢｉｏ社製のＢＬＩｔｚを用い、添付の取扱説明書記載の方法で細胞培養液中のＩｇＧ濃度を測定した。 (Measuring method of IgG concentration)
Using Blitz manufactured by Pall ForteBio, the IgG concentration in the cell culture medium was measured by the method described in the attached instruction manual.

（生細胞数の測定方法）
Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣｏｕｎｔｅｓｓＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒを用いて、添付の取扱説明書記載の方法で生細胞数を測定した。 (Measuring method of viable cell number)
The number of viable cells was measured by the method described in the attached instruction manual using a Countess Automated Cell Counter manufactured by Life technologies.

（ＨＣＰの測定方法）
Ｃｙｇｎｕｓ社製のＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎ３ｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ＃５５０を用い、添付の取扱説明書記載の方法で細胞培養液中のＨＣＰ濃度を測定した。 (HCP measurement method)
Using CHO Host Cell Protein 3rd Generation # 550 manufactured by Cygnus, the HCP concentration in the cell culture medium was measured by the method described in the attached instruction manual.

図１、２より、特定の微生物の培養抽出物を培地に添加することにより、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低減できると共に、細胞においてタンパク質等の有用物質の比生産速度を増大させることができることがわかった。 From FIGS. 1 and 2, by adding a culture extract of a specific microorganism to the medium, cell proliferation can be suppressed, cell density can be reduced, and the specific production rate of useful substances such as proteins can be increased in cells. I found that I could do it.

（培養抽出物の培地への添加量の検討）
ＩｇＧ遺伝子が導入されＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−１２４４５）を用い、ＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に馴化、および浮遊化させた細胞を実験に用いた。１２５ｍｌの三角フラスコにＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍを３０ｍｌ添加し、上記浮遊化細胞を２.０×１０^５ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下、１００ｒｐｍで振盪をしながら８日間培養した。培養抽出画分（１−ａ：画分１〜５、２−ａ：画分６〜１０、３−ａ：画分１１〜１５）を培養４日目に各々０.００６％、０．０１６％、０．０２４％、０．０４％、０.０８％添加し、コントロール（培養抽出物無添加）としてＤＭＳＯを０．０８％添加した。なお、各画分の培地へのＤＭＳＯの添加量が０．０８％になるように不足分を各々添加した。８日目の培養液をサンプリングし、培養液中の生細胞数を測定した。各培養抽出各分の生育数の結果を表１に示す。８日目の生細胞数がコントロールと比べ、２０％以上抑制（コントロールの生細胞数を１００とした場合）されている画分を〇で示す。 (Examination of the amount of culture extract added to the medium)
Using a CHO cell line (ATCC CRL-12445) into which an IgG gene was introduced and secreted and produced an IgG antibody, cells acclimatized to BalanCD Growth A Medium (manufactured by Irvine Scientific) and suspended were used in the experiment. 30 ml of Balan CD Growth A Medium was added to a 125 ml Erlenmeyer flask, and the above-mentioned suspended cells were ^{seeded at 2.0 × 10 5} cells / ml, and shaken at 37 ° C. and 5% CO ₂ environment at 100 rpm. While culturing for 8 days. Culture-extracted fractions (1-a: fractions 1-5, 2-a: fractions 6-10, 3-a: fractions 11-15) were 0.006% and 0.016, respectively, on the 4th day of culture. %, 0.024%, 0.04%, 0.08% were added, and 0.08% DMSO was added as a control (no culture extract added). The shortage was added so that the amount of DMSO added to the medium of each fraction was 0.08%. The culture broth on the 8th day was sampled, and the number of viable cells in the culture broth was measured. Table 1 shows the results of the number of growths for each culture extract. The fraction in which the number of viable cells on the 8th day is suppressed by 20% or more (assuming the number of viable cells of the control is 100) as compared with the control is indicated by ◯.

（実施例２〜４、比較例１）培養抽出物の効果
表１に示した８日目の生細胞数がコントロール（培養抽出物無添加）と比べ、２０％以上抑制されていた培養抽出画分を添加した培地について、培養液中のＩｇＧ濃度を測定した。生細胞数の測定結果を図３に示す。また、ＩｇＧ濃度と生細胞数より算出した培養８日目の抗体比生産速度を図４に示す。 (Examples 2 to 4, Comparative Example 1) Effect of culture extract The culture extract image in which the number of viable cells on the 8th day shown in Table 1 was suppressed by 20% or more as compared with the control (without addition of the culture extract). The IgG concentration in the culture broth was measured for the medium to which the minutes were added. The measurement result of the number of living cells is shown in FIG. In addition, FIG. 4 shows the antibody ratio production rate on the 8th day of culture calculated from the IgG concentration and the number of viable cells.

効果のあった培養抽出画分のうち、添加量が最も低濃度である培養抽出画分（１−ａ：画分３０．０４％、２−ａ：画分８０．０２４％、３−ａ：画分１３０．０１６％）を添加した培地について、培養液中のＨＣＰ濃度（Ｈｏｓｔｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）を測定し、抗体量当たりのＨＣＰを求めた。培養８日目の抗体量当たりの不純物量を図５に示す。 Among the effective culture extract fractions, the culture extract fraction having the lowest concentration (1-a: fraction 3 0.04%, 2-a: fraction 8 0.024%, 3- The HCP concentration (Host cell protein) in the culture medium was measured with respect to the medium to which a: fraction 13 0.016%) was added, and the HCP per antibody amount was determined. The amount of impurities per antibody amount on the 8th day of culture is shown in FIG.

図３、４より、特定の微生物の培養抽出物を培地に添加することにより、細胞増殖性を抑制して細胞密度を低減できると共に、細胞においてタンパク質等の有用物質の比生産速度を増大させることができることがわかった。また、図５より、特定の微生物の培養抽出物を培地に添加することにより、不純物量を低減できることがわかった。 From FIGS. 3 and 4, by adding a culture extract of a specific microorganism to the medium, cell proliferation can be suppressed, cell density can be reduced, and the specific production rate of useful substances such as proteins can be increased in cells. I found that I could do it. Further, from FIG. 5, it was found that the amount of impurities can be reduced by adding a culture extract of a specific microorganism to the medium.

本発明が提供する促進剤、培地および製造方法は、細胞における有用物質の比生産速度を増大させることができ、抗体を利用した臨床診断薬製造、抗体医薬生産、再生医療、細胞治療等の分野で応用が可能である。
The accelerator, medium and production method provided by the present invention can increase the specific production rate of useful substances in cells, and are used in fields such as clinical diagnostic agent production using antibodies, antibody drug production, regenerative medicine, and cell therapy. It can be applied with.

Claims

Extraction was performed by adding an organic solvent to a culture of at least one microorganism selected from the group consisting of the genus Streptomyces and the genus Sitonetake, and the ratio of recombinant proteins in transformed CHO cells containing the obtained culture extract. Production rate accelerator.

A transformed CHO used for recombinant protein production, which comprises the obtained culture extract obtained by adding an organic solvent to a culture of at least one microorganism selected from the group consisting of the genus Streptomyces and the genus Citonetake and performing extraction. Medium for cell culture.

The accelerator or medium according to claim 1 or 2, wherein the recombinant protein is an IgG antibody.

A method for producing a recombinant protein , which comprises a step of culturing transformed CHO cells using the accelerator or medium according to any one of claims 1 to 3.

The method of claim 4 recombinant protein Ru IgG antibody der.