JP6905623B2 - イオン化方法及び質量分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、イオン化方法及び質量分析方法に関する。

従来、質量分析等を行うために生体試料等の試料をイオン化する手法として、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ：Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization）が知られている。ＭＡＬＤＩは、紫外線レーザを吸収するマトリックスと呼ばれる低分子量の有機化合物を試料と混合し、これにレーザを照射することにより、試料をイオン化する手法である。この手法によれば、熱に不安定な物質や高分子量物質を非破壊でイオン化すること（いわゆるソフトイオン化）ができる。しかし、ＭＡＬＤＩでは、マトリックス由来のバックグラウンドノイズが発生する。

そこで、マトリックスを使用せずにイオン化を行う手法として、表面に微細な凹凸構造を有する基板を使用することにより、試料をイオン化する表面支援レーザ脱離イオン化法（ＳＡＬＤＩ：Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization）が知られている。例えば、ＳＡＬＤＩによる試料のイオン化法としては、表面に微細な凹部を有する陽極酸化ポーラスアルミナ及び陽極酸化ポーラスシリコン等を試料保持面として使用する方法が存在する（下記特許文献１及び２参照）。このイオン化法では、微細な凹部を有する試料保持面に対して分析対象の試料を滴下し、乾燥後にレーザを照射することにより、試料のイオン化を行っている。

特許第５１２９６２８号公報 米国特許６２８８３９０号公報

しかしながら、上述のイオン化法では、試料の滴下時に基板に対する試料の位置ずれが生じてしまうため、元々の試料の位置情報（試料を構成する分子の二次元分布）を維持したまま試料のイオン化を行うことは困難である。このため、試料領域の各位置にどのような分子がどれだけ存在するかを測定し、試料分子の二次元分布図を画像化するイメージング質量分析等に上記イオン化法を利用することは困難である。また、基板上に試料を滴下する代わりに試料を基板に転写させる方式を採用したとしても、試料の転写時に基板に対する試料の位置ずれが生じたり、試料の転写ムラが生じたりするといった問題がある。

そこで、本発明の一側面は、試料の位置情報を維持したまま試料のイオン化を行うことができるイオン化方法及び質量分析方法を提供することを目的とする。

本発明の一側面に係るイオン化方法は、一面から他面にかけて貫通する複数の貫通孔が設けられた基板と、導電性材料からなり、少なくとも一面において貫通孔が設けられていない部分を覆う導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、試料が試料台に載置され、且つ、他面が試料に対向するように試料支持体が試料上に配置され、試料の粘性を低くするための溶液が試料に加えられる第２工程と、一面にレーザが照射されることにより、毛細管現象によって他面側から貫通孔を介して一面側に移動した試料がイオン化される第３工程と、を含む。

本発明の他の側面に係るイオン化方法は、導電性材料からなり、一面から他面にかけて貫通する複数の貫通孔が設けられた基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、試料が試料台に載置され、且つ、他面が試料と接触するように試料支持体が試料上に配置され、試料の粘性を低くするための溶液が試料に加えられる第２工程と、一面にレーザが照射されることにより、毛細管現象によって他面側から貫通孔を介して一面側に移動した試料がイオン化される第３工程と、を含む。

本発明の更に他の側面に係る質量分析方法は、上記イオン化方法の各工程と、第３工程においてイオン化された試料が検出される第４工程と、イオン化された試料の検出結果に基づいて、試料を構成する試料分子の二次元分布図を画像化する第５工程と、を含む。

本発明によれば、試料の位置情報を維持したまま試料のイオン化を行うことができるイオン化方法及び質量分析方法を提供することができる。

一実施形態に係る質量分析方法の概略を示す図である。 本実施形態に係る質量分析方法に用いられる試料支持体の斜視図である。 図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。 図２の試料支持体の実効領域Ｒにおける拡大平面図である。 図２の試料支持体の要部拡大断面図である。 図２の基板の製造工程を示す図である。 本実施形態に係る質量分析方法の手順を示す図である。 本実施形態に係る質量分析方法の手順を示す図である。 本実施形態に係る質量分析方法の手順を示す図である。 貫通孔の孔幅とマススペクトルとの関係を示す図である。 貫通孔の孔幅とマススペクトルとの関係を示す図である。 貫通孔の孔幅とマススペクトルとの関係を示す図である。 貫通孔の孔幅とマススペクトルとの関係を示す図である。 基板の厚さと信号強度との関係を示す図である。 試料支持体の第１の変形例を示す図である。 試料支持体の第２の変形例を示す図である。 試料支持体の第３の変形例を示す図である。 焼成前の試料支持体を用いた質量分析によるマススペクトルと焼成後の試料支持体を用いた質量分析によるマススペクトルとを示す図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、各図において同一部分又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。また、図面に示される各部材（又は部位）の寸法又は寸法の比率は、説明をわかり易くするために、実際の寸法又は寸法の比率とは異なることがある。

図１を用いて、本実施形態に係る質量分析方法（表面支援レーザ脱離イオン化法を含む）の概要について説明する。図１の（ａ）に示すように、上記質量分析方法では、まず、質量分析の対象となる一の試料１０が試料台１に載置される。さらに、複数の貫通孔が設けられた基板を備える試料支持体２が、試料１０の上に配置される。ここで、分析対象となる試料１０は、例えば組織切片等の薄膜状の生体試料（含水試料）である。

続いて、図１の（ｂ）に示すように、試料１０は、毛細管現象によって、試料支持体２の下面側から貫通孔を介して試料支持体２の上面側に移動する。そして、試料１０は、試料支持体２の上面側に表面張力によって留まる状態となる。

続いて、図１の（ｃ）に示すように、試料支持体２の上面側に紫外線レーザが照射されることにより、試料支持体２の上面側に移動した試料１０は、イオン化されて真空中に放出される。具体的には、紫外線レーザのエネルギーを吸収した試料支持体２から、試料支持体２の上面側に移動した試料１０にエネルギーが伝達される。そして、エネルギーを獲得した試料１０は、気化するとともに電荷を獲得することにより、試料イオン（イオン化された試料）１１となる。このようにして空気中に放出された試料イオン１１が検出器３によって検出され、検出された試料イオン１１の測定が行われる。このようにして、試料１０の質量分析が行われる。

本実施形態に係る質量分析方法は、一例として、飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ：Time-of-Flight Mass Spectrometry）を利用する。ＴＯＦ−ＭＳの概要を以下に示す。ＴＯＦ−ＭＳでは、試料支持体２と検出器３との間に、グランド電極（不図示）が設けられるとともに、試料支持体２に対して所定の電圧が加えられる。これにより、試料支持体２とグランド電極との間に電位差が生じ、試料支持体２の上面側で発生した試料イオン１１は、当該電位差によってグランド電極に向かって加速しながら移動する。その後、試料イオン１１は、グランド電極から検出器３までの間に設けられた電場及び磁場が存在しないドリフト空間（Drift Space）を飛行し、最終的に検出器３に到達する。ここで、試料支持体２とグランド電極との間の電位差はどの試料イオン１１に対しても一定であるため、各試料イオン１１に与えられるエネルギーは一定である。このため、分子量の小さい試料イオン１１ほどドリフト空間を高速で飛行し、短時間で検出器３に到達することになる。ＴＯＦ−ＭＳでは、このような試料イオン１１の検出器３への到達時間差に基づいて質量分析が行われる。

次に、図２〜図５を用いて試料支持体２について説明する。図２は、試料支持体２の外観（基板２１及び枠体２２）を示す斜視図である。なお、実際には、基板２１には複数の貫通孔Ｓが設けられており、試料支持体２は、基板２１及び枠体２２を接着する接着層Ｇと、基板２１及び枠体２２の表面（貫通孔Ｓの内面を含む）を覆う導電層２３と、を備える。しかし、これらは基板２１及び枠体２２に対して非常に小さいため、図２においてはこれらの図示を省略している。一方、図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である図３においては、貫通孔Ｓ、導電層２３、及び接着層Ｇの配置構成を説明するために、貫通孔Ｓ、導電層２３、及び接着層Ｇの寸法を実際の寸法よりも大きく図示している。

図２及び図３に示すように、試料支持体２は、表面支援レーザ脱離イオン化法（ＳＡＬＤＩ：Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization）用の試料支持体であって、一面２１ａから他面２１ｂにかけて複数の貫通孔Ｓが設けられた矩形板状の基板２１と、基板２１の一面２１ａの外縁部に取り付けられた枠体２２と、を有する。

基板２１の一面２１ａ及び他面２１ｂの形状は、例えば一辺の長さＤ１が１ｃｍの正方形である。基板２１の一面２１ａから他面２１ｂまでの厚さｄ１は、１〜５０μｍである。本実施形態では一例として、基板２１は、絶縁性材料からなっている。基板２１は、例えばＡｌ（アルミニウム）を陽極酸化することによって孔径がほぼ一定の貫通孔Ｓが複数形成されたアルミナポーラス皮膜である。なお、基板２１は、Ｔａ（タンタル）、Ｎｂ（ニオブ）、Ｔｉ（チタン）、Ｈｆ（ハフニウム）、Ｚｒ（ジルコニウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｗ（タングステン）、Ｂｉ（ビスマス）、Ｓｂ（アンチモン）等のＡｌ以外のバルブ金属を陽極酸化することにより形成されてもよいし、Ｓｉ（シリコン）を陽極酸化することによって形成されてもよい。

枠体２２は、基板２１の一面２１ａの外縁部に沿って四角環状に設けられている。枠体２２の幅Ｄ２は、例えば２ｍｍである。枠体２２の厚さｄ２は、例えば１０〜５００μｍである。基板２１の一面２１ａのうち枠体２２に覆われていない実効領域Ｒは、０．６ｍｍ四方の正方形領域となっている。実効領域Ｒは、後述する毛細管現象によって試料１０を他面２１ｂから一面２１ａに移動させるための領域として機能する。枠体２２が基板２１の外縁部に設けられることにより、基板２１のしなりが抑制される。また、枠体２２が設けられた部分を固定したり把持したりすることが可能となるため、試料支持体２を支持したり移動させたりする際の取扱いが容易となる。なお、本実施形態では、枠体２２は四角環状に設けられているが、基板２１の外縁部に沿って円環状に設けられていてもよい。枠体２２を円環状に設けることで、枠体２２を四角環状に設けた場合よりも基板２１のしなりがより一層抑制される。

図３に示すように、枠体２２は、接着層Ｇを介して基板２１の表面（一面２１ａ）に接着されている。接着層Ｇの材料としては、例えば低融点ガラスや真空用接着剤等の放出ガスの少ない接着材料を用いることができる。なお、本実施形態では一例として、枠体２２は、基板２１の一面２１ａにおいて貫通孔Ｓが設けられた部分と重なるようにして、基板２１に接着されている。このため、基板２１において枠体２２が設けられた部分と枠体２２が設けられていない部分との境界面のしなりが貫通孔Ｓによって許容される。これにより、当該境界面で基板２１が割れることが抑制される。

枠体２２は、基板２１と略同等の熱膨張係数を有する。枠体２２は、例えば基板２１と同様の組成を有するセラミック部材等である。枠体２２は、例えばガラスや金属等である。このように基板２１及び枠体２２の熱膨張係数を近づけることにより、温度変化に起因する変形（例えば熱膨張時における基板２１及び枠体２２のひずみ）等を防止することができる。

図３及び図５に示すように、試料支持体２は、基板２１の一面２１ａ、他面２１ｂ、及び貫通孔Ｓの内面、並びに枠体２２の表面を覆う導電層２３を備える。導電層２３は、絶縁性の基板２１に導電性を付与するために設けられた導電性材料からなる層である。ただし、基板２１が導電性材料からなる場合であっても導電層２３を設けることは妨げられない。導電層２３の材料としては、以下に述べる理由により、試料１０との親和性（反応性）が低く、導電性が高い金属が好ましい。

例えばタンパク質等の試料１０と親和性が高いＣｕ（銅）等の金属で導電層２３を形成した場合、後述する試料１０のイオン化の過程において、試料分子にＣｕ原子が付着した状態で試料１０がイオン化する場合がある。すなわち、検出器３によって検出された試料イオン１１の分子量を測定する際に、付着したＣｕの質量分だけ実際の試料１０の分子量からずれてしまうため、正確な測定が行えなくなってしまう。従って、導電層２３の材料としては、試料１０との親和性が低い金属が好ましい。

一方、導電性の高い金属の方が一定の電圧を容易に且つ安定して付与することができる。このため、導電性が高い金属を導電層２３とすることにより、上述したグランド電極と基板２１との間に一定の電位差を生じさせるために基板２１に一定の電圧をかけることが容易となる。また、導電性の高い金属ほど熱伝導性も高い傾向にあるので、基板２１に照射されたレーザのエネルギーを、導電層２３を介して試料１０に効率的に伝えることが可能となる。従って、導電層２３の材料としては、導電性の高い金属が好ましい。

上記観点から、導電層２３の材料としては、例えばＡｕ（金）及びＰｔ（白金）等が用いられる。例えば、導電層２３は、メッキ法、原子層堆積法（ＡＬＤ：Atomic Layer Deposition）、蒸着法、及びスパッタ法等を用いて、Ａｕ又はＰｔを基板２１の一面２１ａ、他面２１ｂ、及び貫通孔Ｓの内面、並びに枠体２２の表面に成膜することによって形成することができる。なお、導電層２３の材料としては、上述したＡｕ及びＰｔ以外にも、例えばＣｒ（クロム）、Ｎｉ（ニッケル）、及びＴｉ（チタン）等を用いることもできる。

図４は、試料支持体２の実効領域Ｒの拡大平面図である。図４において、黒色の部分は貫通孔Ｓを示し、白色の部分は貫通孔Ｓが形成されていない隔壁部分を示す。図４に示すように、基板２１の表面には、略一定の大きさの貫通孔Ｓが複数形成されている。複数の貫通孔Ｓは、後述する毛細管現象による試料１０の他面２１ｂから一面２１ａへの移動（上昇）が可能な大きさに形成されていればよい。図４の例のように、貫通孔Ｓの大きさが不揃いになっていてもよいし、複数の貫通孔Ｓ同士が互いに連結している部分が存在していてもよい。実効領域Ｒにおける貫通孔Ｓの開口率（貫通孔Ｓが形成されている部分の面積／全体面積）は、実用上１０〜８０％であり、特に６０〜８０％であることが好ましい。

図５に示すように、貫通孔Ｓは、基板２１の一面２１ａ側から他面２１ｂ側に延在している。貫通孔Ｓの幅ｄ３は、１〜７００ｎｍである。また、導電層２３の厚さｄ４は、例えば１〜２５ｎｍ程度である。ここで、貫通孔Ｓの幅ｄ３は、貫通孔Ｓ内に導電層２３が形成された後の孔幅である。孔幅が１〜７００ｎｍの貫通孔Ｓを有する基板２１を用いることにより、上述した毛細管現象による試料１０の移動をよりスムーズに行わせることができる。本実施形態のように貫通孔Ｓの断面形状が略円形である場合、貫通孔Ｓの幅ｄ３とは、孔の径を意味する。一方、貫通孔Ｓの断面形状が円形以外の場合には、貫通孔Ｓの幅とは、貫通孔Ｓに収まる仮想的な円筒の径（有効径）を意味する。

次に、図３及び図６を用いて、試料支持体２の製造工程について説明する。まず、図６を用いて、基板２１の製造工程について説明する。図６の（ａ）に示すように、基板２１の材料となるＡｌ基板５０が用意される。続いて、図６の（ｂ）に示すように、Ａｌ基板５０を陽極酸化することにより、Ａｌ基板５０が表面から酸化され、複数の凹部５１ａを有する陽極酸化皮膜５１が形成される。続いて、図６の（ｃ）に示すように、陽極酸化皮膜５１をＡｌ基板５０から剥離し、剥離された陽極酸化皮膜５１の底部５１ｂを除去或いは貫通処理することにより、一面２１ａから他面２１ｂにかけて貫通する複数の貫通孔Ｓが設けられた基板２１が得られる。

上述のようにして基板２１が製造された後、基板２１の外縁部に、低融点ガラスや真空用接着剤等の接着層Ｇを介して枠体２２が取り付けられる。これにより、図３に示した試料支持体２のうち導電層２３が形成される前の状態となる。最後に、基板２１の一面２１ａ、他面２１ｂ、及び貫通孔Ｓの内面、並びに枠体２２の表面を覆うように、Ａｕ又はＰｔからなる導電層２３が設けられる。上述した通り、導電層２３は、メッキ法や原子層堆積法等で、Ａｕ又はＰｔを基板２１の一面２１ａ、他面２１ｂ、及び貫通孔Ｓの内面、並びに枠体２２の表面に成膜することによって形成される。以上により、図３に示した試料支持体２が製造される。

なお、上記のＡｌの陽極酸化処理においては、基板２１の厚さｄ１が１〜５０μｍとなり、貫通孔Ｓの幅ｄ３が１〜７００ｎｍとなるように調節される。具体的には、最初に用意するＡｌ基板５０の厚みや陽極酸化における温度及び電圧等の条件を適切に設定することにより、基板２１の厚さｄ１及び貫通孔Ｓの幅ｄ３は、予め定められた大きさ（上記範囲に含まれる大きさ）に形成される。

次に、図７〜図９を用いて、試料支持体２を用いた質量分析方法の手順について説明する。なお、図７〜図９においては、導電層２３、貫通孔Ｓ、及び接着層Ｇの図示は省略している。

まず、図９を用いて、試料支持体２を用いた質量分析を実行する質量分析装置１００について説明する。質量分析装置１００は、試料１０が載置される試料台１と、レーザ照射部４と、検出器（検出部）３と、を備える。

レーザ照射部４は、試料台１に載置された試料１０上に試料支持体２が配置された状態で、照射位置を変えながら一面２１ａにレーザＬを照射する。ここで、試料支持体２は、他面２１ｂが導電層２３を介して試料１０と接触するように、試料１０上に載置される。レーザ照射部４によって照射されるレーザＬは、例えば波長３３７ｎｍの窒素レーザ（Ｎ２レーザ）等の紫外線レーザである。

検出器３は、レーザ照射部４によるレーザＬの照射によってイオン化された試料１０（試料イオン１１）を照射位置毎に検出する。具体的には、レーザ照射部４は、試料支持体２の実効領域Ｒを予め定められた移動幅及び移動方向に従って２次元走査し、各走査位置においてレーザＬの照射を行う。検出器３は、各走査位置でのレーザＬの照射によって発生する試料イオン１１を検出する。これにより、実効領域Ｒ上の位置毎に質量分析を行うことが可能となる。このようにして得られる試料１０中の各位置における質量分析結果を総合することにより、試料分子の二次元分布図を画像化するイメージング質量分析を行うことが可能となる。以下、図７〜図９を用いて、質量分析装置１００による質量分析手順について詳細に説明する。

まず、上述した試料支持体２が用意される（第１工程）。試料支持体２は、質量分析装置１００を用いて質量分析を実行する者が自ら製造することにより用意されてもよいし、試料支持体２の製造者及び販売者等から取得することにより用意されてもよい。

続いて、図７の（ａ）に示すように、質量分析対象となる試料１０が試料台１の載置面１ａに載置され、且つ、図７の（ｂ）に示すように、他面２１ｂが導電層２３（図３参照）を介して試料１０と接触するように試料支持体２が試料１０上に配置される（第２工程）。ここで、分析対象となる試料１０を毛細管現象によって基板２１の一面２１ａ側に移動させるために、試料支持体２は、平面視において実効領域Ｒ内に試料１０が含まれるように、試料１０上に配置される。なお、後述する毛細管現象による試料１０の移動をスムーズにするために、試料１０の粘性を低くするための溶液（例えばアセトニトリル混合液等）を試料１０に混ぜてもよい。

続いて、図８の（ａ）に示すように、試料支持体２は、試料台１に固定される（第２工程続き）。ここでは一例として、カーボンテープ等の導電性を有する粘着テープＴによって、試料支持体２の四辺（枠体２２の上面及び側面、並びに基板２１の側面）が、試料台１の載置面１ａに対して固定される。このように、試料台１に対して試料支持体２を固定することにより、試料１０と試料支持体２とを密着させ、後述する毛細管現象による試料１０の移動をよりスムーズに行わせることができる。また、試料１０上に配置された試料支持体２の横滑りが防止され、試料支持体２の横滑りによって試料１０の位置情報が失われることを抑制できる。

ここで、試料台１が導電性を有している場合、試料台１と試料支持体２とは、導電性を有する粘着テープＴによって電気的に接続される。従って、図８の（ａ）に示すように粘着テープＴで試料支持体２を試料台１に固定した状態で、試料台１に所定の電流を流すことにより、基板２１に所定の電圧をかけることができる。これにより、上述したグランド電極と基板２１との間に一定の電位差を生じさせることができる。また、本実施形態では、導電層２３が枠体２２を覆っており、粘着テープＴが枠体２２上の導電層２３に接触しているため、試料支持体２と電源（試料台１に電流を流す所定の電源）とのコンタクトを、枠体２２上で取ることができる。すなわち、基板２１上の実効領域Ｒを減らすことなく、試料支持体２と電源とのコンタクトを取ることができる。

図８の（ｂ）に示すように、上述のように試料支持体２が試料１０上に配置されることにより、毛細管現象によって、試料１０が基板２１の他面２１ｂ側から貫通孔Ｓを介して一面２１ａ側に向かって移動（上昇）する。そして、試料１０は、試料支持体２の一面２１ａ側に表面張力によって留まる状態となる。ここで、試料台１の載置面１ａと基板２１の一面２１ａ及び他面２１ｂとは、互いに略平行に配置される。従って、試料台１に載置された試料１０は、毛細管現象によって、試料台１の載置面１ａに直交する方向に沿って、基板２１の他面２１ｂ側から貫通孔Ｓを介して一面２１ａ側に移動することになる。これにより、毛細管現象による移動の前後において、試料１０（試料１０を構成する各試料分子）の位置情報が維持される。言い換えると、試料１０を構成する各試料分子の２次元座標（試料台１の載置面１ａと平行な２次元平面における位置）は、毛細管現象による移動前後において大きく変化しない。従って、このような毛細管現象によって、試料１０の位置情報を維持したまま、試料１０を基板２１の他面２１ｂ側から一面２１ａ側に移動させることができる。

続いて、図９に示すように、レーザ照射部４によって、基板２１の一面２１ａにレーザＬが照射され、毛細管現象によって他面２１ｂ側から貫通孔Ｓを介して一面２１ａ側に移動した試料１０がイオン化される（第３工程）。そして、検出器３によって、イオン化された試料１０（試料イオン１１）が検出される（第４工程）。第３工程でのレーザＬの照射、及び第４工程での試料イオン１１の検出は、レーザＬの照射位置を変えながら当該照射位置毎に行われる。具体的には、レーザ照射部４が、実効領域Ｒを予め定められた移動幅及び移動方向に従って走査し、レーザＬの照射位置を変えながら、各照射位置においてレーザＬを照射する。そして、各照射位置でのレーザ照射部４によるレーザＬの照射によって真空中に放出された試料イオン１１を検出器３が検出する。その結果、各照射位置において検出された試料イオン１１の測定結果に基づいて、試料分子の二次元分布図を画像化するイメージング質量分析を行うことが可能となる。

上記表面支援レーザ脱離イオン化法（第１〜第３工程）によれば、複数の貫通孔Ｓが設けられた基板２１が試料１０上に配置されることで、毛細管現象によって、基板２１の他面２１ｂ側から貫通孔Ｓを介して一面２１ａ側に向けて試料１０を上昇させることができる。これにより、試料１０の位置情報（試料１０を構成する分子の二次元分布）を維持したまま、試料１０を基板２１の他面２１ｂ側から一面２１ａ側に移動させることができる。そして、レーザＬが基板２１の一面２１ａに照射され、一面２１ａ側に移動した試料１０に導電層２３を介してエネルギーが伝達されることにより、試料１０がイオン化される。その結果、試料１０の位置情報を維持したまま試料１０のイオン化を行うことができる。従って、上記方法によれば、複数の貫通孔Ｓが設けられた基板２１を試料１０上に載置する簡単な操作によって、試料１０の位置情報を維持したまま試料１０のイオン化を行うことができる。

また、Ａｌを陽極酸化することで複数の貫通孔Ｓが設けられた基板２１を備える試料支持体２を用いることにより、上述した毛細管現象による試料１０の移動を適切に実現することができる。ここで、Ａｌの代わりにＡｌ以外のバルブ金属又はＳｉを陽極酸化することで得られた基板２１を備える試料支持体２を用いても、同様の効果が得られる。

また、孔幅ｄ３が１〜７００ｎｍの貫通孔Ｓを有する基板２１を用いることにより、上述した毛細管現象による試料１０の移動をよりスムーズに行わせることができる。

また、試料支持体２が、基板２１の一面２１ａの外縁部に取り付けられた枠体２２を備えているので、枠体２２によって基板２１のしなりが抑制されるとともに、試料支持体２を支持したり移動させたりする際の取り扱いが容易となる。このため、第２工程における試料支持体２の試料１０上への配置を容易に行うことができる。

また、上記質量分析方法（第１〜第４工程）によれば、試料１０上に試料支持体２を配置する簡単な操作で、試料１０の位置情報を維持したまま試料１０のイオン化を行うことができる。そして、レーザＬの照射位置を変えながら、イオン化された試料１０（試料イオン１１）を当該照射位置毎に検出することにより、試料分子の二次元分布を把握することができる。従って、上記質量分析方法によれば、簡単な操作で、試料分子の二次元分布図を画像化するイメージング質量分析を行うことができる。

また、上記質量分析装置１００によれば、試料１０上に試料支持体２を配置する簡単な操作で、試料１０の位置情報を維持したまま試料１０のイオン化を行うことができる。そして、レーザ照射部４が照射位置を変えながらレーザＬを照射し、検出器３がイオン化された試料１０（試料イオン１１）を当該照射位置毎に検出することにより、試料分子の二次元分布を把握することができる。従って、上記質量分析装置１００によれば、簡単な操作で、試料分子の二次元分布図を画像化するイメージング質量分析を行うことができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

例えば、基板２１は、半導体等の導電性材料からなっていてもよい。この場合、試料支持体２は、基板２１に導電性を付与するための導電層２３を省略することができる。試料支持体２が導電層２３を備えない場合には、上記第２工程において、他面２１ｂが直接試料１０と接触するように試料支持体２が試料１０上に配置されることになる。このように基板２１が導電性材料からなり、導電層２３が省略された試料支持体２を用いる場合にも、上述した導電層２３を備える試料支持体２を用いる場合と同様の効果を得ることができる。

また、上記表面支援レーザ脱離イオン化法（第１〜第３工程）による試料１０のイオン化は、本実施形態で説明した試料１０のイメージング質量分析のみならず、イオンモビリティ測定等の他の測定・実験にも利用できる。

また、導電層２３は、少なくとも基板２１の一面２１ａを覆うように、蒸着等によって設けられてもよい。すなわち、導電層２３は、基板２１の他面２１ｂ及び貫通孔Ｓの内面に設けられなくともよい。この場合、上記第２工程において、他面２１ｂが試料１０に対向するように試料支持体２が試料１０上に配置され、他面２１ｂが直接試料１０に接触する。また、導電層２３が少なくとも基板２１の一面２１ａ及び枠体２２の表面を覆うように設けられていれば、基板２１と電極とのコンタクトを枠体２２上で取ることができる。

図１０〜図１３は、貫通孔Ｓの孔幅と上記質量分析方法によって測定されたマススペクトルとの関係を示す。ここで、試料支持体としては、導電層２３（ここではＰｔ）を基板２１の他面２１ｂ及び貫通孔Ｓの内面には設けずに一面２１ａ及び枠体２２の表面を覆うように設けたものを用いた。また、基板２１の厚さｄ１は１０μｍであり、測定対象の試料は「質量電荷比（ｍ／ｚ）＝１０４９」のペプチドである。図１０〜図１３において、（ａ）は貫通孔Ｓの孔幅を５０ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｂ）は貫通孔Ｓの孔幅を１００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｃ）は貫通孔Ｓの孔幅を２００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｄ）は貫通孔Ｓの孔幅を３００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｅ）は貫通孔Ｓの孔幅を４００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｆ）は貫通孔Ｓの孔幅を５００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｇ）は貫通孔Ｓの孔幅を６００ｎｍとした場合の測定結果であり、（ｈ）は貫通孔Ｓの孔幅を７００ｎｍとした場合の測定結果である。図１０〜図１３において、縦軸は、ピーク値を１００（％）として規格化された信号強度（Intensity）を示す。

図１０〜図１３に示すように、基板２１の貫通孔Ｓの孔幅が５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、及び７００ｎｍのいずれの場合にも、ピークを観測可能な適切なスペクトルが得られた。このように、少なくとも一面２１ａに導電層２３が設けられた基板２１を備える試料支持体を用いることで、質量分析を適切に行うことができる。

図１４は、基板２１の厚さｄ１（Thickness）と上記質量分析方法によって測定されたピークの信号強度との関係を示す。図１４において、縦軸は、基板２１の厚さｄ１が１０μｍのときの信号強度を“１”とした場合の相対的な信号強度（Relative intensity）である。ここで、試料支持体としては、上述のように導電層２３（ここではＰｔ）を基板２１の他面２１ｂ及び貫通孔Ｓの内面には設けずに一面２１ａ及び枠体２２の表面を覆うように設けたものを用いた。貫通孔Ｓの孔幅は２００ｎｍである。また、測定対象の試料は「質量電荷比（ｍ／ｚ）＝１０４９」のペプチドである。

上記測定結果において、基板２１の厚さｄ１が１０μｍの場合における信号強度は、質量分析において十分な大きさであった。また、図１４に示すように、基板２１の厚さｄ１が小さい程信号強度が大きくなる傾向があり、基板２１の厚さｄ１が３〜１０μｍの範囲にある場合に、十分な信号強度が得られた。一方、基板強度を確保する観点からは、基板２１の厚さｄ１は大きい方がよい。このことから、基板２１の厚さｄ１は、５〜１０μｍとされてもよい。これにより、基板２１の強度を保つとともに、質量分析において十分な信号強度を得ることができる。

また、上記実施形態では、試料支持体２の枠体２２を粘着テープＴによって試料台１に固定する形態について説明したが、試料支持体２を試料台１に固定する形態は上記形態に限定されない。以下、図１５〜図１７を用いて、試料支持体２の第１〜第３の変形例とともに、試料支持体２を試料台１に固定する形態のバリエーションについて説明する。なお、図１５〜図１７においては、導電層２３及び貫通孔Ｓの図示を省略している。また、図１６及び図１７においては、枠体と基板とを接着する接着層Ｇの図示についても省略している。

（第１の変形例）
図１５に示すように、第１の変形例に係る試料支持体２Ａは、基板２１に枠体２２が設けられておらず、基板２１の一面２１ａに粘着テープＴが直接貼り付けられている点で、試料支持体２と主に相違する。粘着テープＴは、粘着面Ｔａが基板２１の一面２１ａに対向し、且つ、基板２１の外縁よりも外側に延在する部分を有するように、一面２１ａの外縁部に貼り付けられている。これにより、図１５に示すように、粘着面Ｔａを基板２１の外縁及び試料台１の載置面１ａに貼り付けることができる。その結果、試料支持体２Ａは、粘着テープＴによって試料台１に対して固定される。試料支持体２Ａによれば、例えば表面に凹凸を有する試料１０の質量分析を行う場合等において、試料１０に対する基板２１の追従性を向上させることができる。

また、試料台１が導電性を有している場合、試料台１と試料支持体２Ａ（具体的には、基板２１の一面２１ａ上に設けられた導電層２３）とは、導電性を有する粘着テープＴを介して電気的に接続される。従って、図１５に示すように粘着テープＴを介して試料支持体２を試料台１に固定した状態で、試料台１に所定の電流を流すことにより、基板２１に所定の電圧をかけることができる。

なお、試料支持体２Ａは、基板２１の外縁に粘着テープＴが貼り付けられ、且つ、基板２１の外縁よりも外側に延在する部分の粘着面Ｔａに粘着保護シートが設けられた状態で流通させられてもよい。この場合、試料支持体２Ａの使用者は、試料支持体２Ａを試料台１に固定する直前に粘着保護シートを剥がし、粘着面Ｔａを載置面１ａに貼り付けることで、試料１０の質量分析の準備を容易に行うことができる。

（第２の変形例）
図１６に示すように、第２の変形例に係る試料支持体２Ｂは、基板２１の外縁よりも外側に延在する部分を有する枠体１２２を備える点で、試料支持体２と主に相違する。このような枠体１２２により、試料支持体２Ｂを持ち運ぶ際等において、基板２１の端部の破損を適切に抑制することができる。さらに、図１６に示すように、枠体１２２において基板２１の外縁よりも外側に延在する部分には、ネジ３０を挿通させるための挿通孔１２２ａが設けられている。この場合、例えば挿通孔１２２ａに対応する位置にネジ孔１ｂを有する試料台１Ａを用いることで、ネジ留めによって試料支持体２Ｂを試料台１Ａに確実に固定することができる。具体的には、挿通孔１２２ａ及びネジ孔１ｂにネジ３０を挿通させることで、試料支持体２Ｂを試料台１Ａに固定することができる。

また、試料台１Ａが導電性を有し、且つ、ネジ３０が導電性を有する場合、試料台１Ａと試料支持体２Ｂ（具体的には、枠体１２２の表面に形成された導電層２３）とは、ネジ３０を介して電気的に接続される。従って、図１６に示すようにネジ３０を介して試料支持体２Ｂを試料台１Ａに固定した状態で、試料台１Ａに所定の電流を流すことにより、基板２１に所定の電圧をかけることができる。

（第３の変形例）
図１７に示すように、第３の変形例に係る試料支持体２Ｃは、基板２１の他面２１ｂの外縁部に設けられ、一面２１ａから他面２１ｂに向かう方向を向く粘着面２４ａを有する粘着層２４を備える点で、試料支持体２と主に相違する。粘着層２４は、例えば測定対象の試料１０の厚みに応じて予め設定された厚さを有する両面テープ等である。例えば、粘着層２４の一方の粘着面２４ｂは、予め基板２１の他面２１ｂの外縁部に貼り付けられており、粘着層２４の他方の粘着面２４ａは、試料支持体２Ｃを試料台１に固定する際に、載置面１ａに貼り付けられる。試料支持体２Ｃによれば、試料支持体２Ｃを試料台１に固定する構成を単純化することができる。

また、試料台１が導電性を有し、且つ、粘着層２４が導電性を有する場合、試料台１と試料支持体２Ｃ（具体的には、基板２１）とは、粘着層２４を介して電気的に接続される。従って、図１７に示すように粘着層２４を介して試料支持体２Ｃを試料台１に固定した状態で、試料台１に所定の電流を流すことにより、基板２１に所定の電圧をかけることができる。

なお、試料支持体２Ｃは、粘着層２４の粘着面２４ｂが基板２１の他面２１ｂの外縁部に貼り付けられ、且つ、粘着面２４ａに粘着保護シートが設けられた状態で流通させられてもよい。この場合、試料支持体２Ｃの使用者は、試料支持体２Ｃを試料台１に固定する直前に粘着保護シートを剥がし、粘着面２４ａを載置面１ａに貼り付けることで、試料１０の質量分析の準備を容易に行うことができる。

また、上記実施形態及び変形例に係る試料支持体２，２Ａ，２Ｂ，２Ｃは、導電層２３が形成された後に、焼成されてもよい。すなわち、上記実施形態における試料支持体の製造工程において、導電層２３が形成された後の試料支持体を焼成する焼成工程が含まれてもよい。枠体２２が設けられる場合には、基板２１、枠体２２、及び導電層２３を備える試料支持体に対して焼成工程が実施される。また、枠体２２が省略される場合には、基板２１及び導電層２３を備える試料支持体に対して焼成工程が実施される。

このような焼成工程の実施により、導電層２３（例えばＰｔ）の結晶性を向上させることができ、質量分析に一層適した試料支持体を得ることができる。ここで、試料支持体の焼成は、焼成後の導電層２３（試料支持体）に対するＸ線回折（ＸＲＤ：X-ray diffraction）測定において、当該導電層２３を形成する導電性材料（ここではＰｔ）の結晶の回折ピークが示されるように、実施されるのが好ましい。ここで、「導電性材料の結晶の回折ピークを示す」とは、焼成前の試料支持体に対するＸ線回折測定によって得られる測定結果よりも、導電性材料の結晶の回折パターン（ピーク強度等）を明確に示すことを意味する。

図１８の（ａ）は、焼成前の試料支持体を有する質量分析装置１００によって測定されたマススペクトルを示す。一方、図１８の（ｂ）は、焼成温度４００℃での焼成後の試料支持体を有する質量分析装置１００によって測定されたマススペクトルを示す。なお、図１８の（ａ）及び（ｂ）の間で、焼成の有無以外の測定条件（試料の種類及び試料支持体の構成等）は同一である。また、図１８の（ａ）及び（ｂ）の縦軸は、焼成後の試料支持体を用いた場合のピークの信号強度（すなわち、図１８の（ｂ）のグラフのピーク値）を“１００”とした場合の相対的な信号強度を示す。図１８に示すように、焼成後の試料支持体を用いることにより、焼成前の試料支持体を用いる場合よりも、質量分析における信号強度を向上させることができる。このように、上述の焼成工程を実施することにより、質量分析に一層適した試料支持体を得ることができる。

１…試料台、２，２Ａ，２Ｂ，２Ｃ…試料支持体、３…検出器、４…レーザ照射部、１０…試料、１１…試料イオン、２１…基板、２１ａ…一面、２１ｂ…他面、２２，１２２…枠体、２３…導電層、２４…粘着層、２４ａ，２４ｂ…粘着面、３０…ネジ、１２２ａ…挿通孔、Ｌ…レーザ、Ｓ…貫通孔、Ｔ…粘着テープ、Ｔａ…粘着面。

Claims (11)

1. 一面から他面にかけて貫通する複数の貫通孔が設けられた基板と、導電性材料からなり、少なくとも前記一面において前記貫通孔が設けられていない部分を覆う導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、
   試料が試料台に載置され、且つ、前記他面が前記試料に対向するように前記試料支持体が前記試料上に配置され、前記試料の粘性を低くするための溶液が前記試料に加えられる第２工程と、
   前記一面にレーザが照射されることにより、毛細管現象によって前記他面側から前記貫通孔を介して前記一面側に移動した前記試料がイオン化される第３工程と、を含むイオン化方法。
2. 前記溶液は、アセトニトリルを含む、請求項１に記載のイオン化方法。
3. 前記基板はバルブ金属又はシリコンを陽極酸化することにより形成されている、請求項１又は２に記載のイオン化方法。
4. 前記貫通孔の幅は１〜７００ｎｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイオン化方法。
5. 前記基板の厚さは５〜１０μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のイオン化方法。
6. 前記試料支持体が、前記基板の前記一面の外縁部に取り付けられた枠体を更に備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載のイオン化方法。
7. 前記第２工程では、前記試料支持体が前記試料台に固定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のイオン化方法。
8. 導電性材料からなり、一面から他面にかけて貫通する複数の貫通孔が設けられた基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、
   試料が試料台に載置され、且つ、前記他面が前記試料と接触するように前記試料支持体が前記試料上に配置され、前記試料の粘性を低くするための溶液が前記試料に加えられる第２工程と、
   前記一面にレーザが照射されることにより、毛細管現象によって前記他面側から前記貫通孔を介して前記一面側に移動した前記試料がイオン化される第３工程と、を含むイオン化方法。
9. 前記溶液は、アセトニトリルを含む、請求項８に記載のイオン化方法。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のイオン化方法の各工程と、
    前記第３工程においてイオン化された前記試料が検出される第４工程と、
    前記イオン化された前記試料の検出結果に基づいて、前記試料を構成する試料分子の二次元分布図を画像化する第５工程と、を含む、質量分析方法。
11. 前記第３工程での前記レーザの照射、及び前記第４工程でのイオン化された前記試料の検出は、前記レーザの照射位置を変えながら当該照射位置毎に行われる、請求項１０に記載の質量分析方法。

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