JP6911461B2 - Separator and column filler - Google Patents
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- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
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Description
本発明は、分離材及びカラム充填材に関する。 The present invention relates to a separating material and a column filler.
アフィニティークロマトグラフィー用のカラムに充填される担体としては、通常、不溶性担体に、分離又は精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を固定化したリガンド固定担体が用いられる。アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、タンパク質、核酸等の生体関連物質の分離又は精製に用いられている（例えば、特許文献１を参照）。 As the carrier to be packed in the column for affinity chromatography, a ligand-fixed carrier in which a substance (ligand) that specifically binds to a substance intended for separation or purification is immobilized on an insoluble carrier is usually used. Affinity chromatography is used, for example, for the separation or purification of biological substances such as proteins and nucleic acids (see, for example, Patent Document 1).
アフィニティークロマトグラフィー用の上記担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子又は合成ポリマを主成分とする粒子が用いられている。 As the carrier for affinity chromatography, for example, crosslinked particles of sugar chains typified by agarose gel or particles containing a synthetic polymer as a main component are used.
ところで、抗体等のバイオセパレーションにおいては、吸着させた抗体は、通常、ｐＨを変化させることにより、回収されている。一方で、温度応答による抗体吸着脱離プロセスも提案されている（例えば、特許文献２を参照）。 By the way, in bioseparation of an antibody or the like, the adsorbed antibody is usually recovered by changing the pH. On the other hand, an antibody adsorption / elimination process based on a temperature response has also been proposed (see, for example, Patent Document 2).
しかしながら、ｐＨを変化させることにより抗体を回収する方法においては、抗体の凝集物が発生し易い傾向にある。また、温度応答による抗体吸着脱離プロセスに用いられる従来の分離材は、抗体の吸着性及び回収性を充分なレベルで満足するものではない。 However, in the method of recovering the antibody by changing the pH, aggregates of the antibody tend to be easily generated. Further, the conventional separating material used in the antibody adsorption / desorption process by temperature response does not satisfy the adsorption property and recoverability of the antibody at a sufficient level.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れる分離材及びカラム充填材を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a separating material and a column filler which can recover the adsorbed antibody by changing the temperature and have excellent adsorptivity and recoverability of the antibody. ..
本発明は、下記［１］〜［１０］に記載の分離材及び下記［１１］に記載のカラム充填材を提供する。
［１］スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、被覆層が、水酸基を有する高分子に、温度応答性ポリマがグラフトしているグラフトポリマを含み、温度応答性ポリマが、アミノ基に対して反応性を有する官能基を有する、分離材。
［２］温度応答性ポリマが、イソプロピルアクリルアミドをモノマ単位として含む、［１］に記載の分離材。
［３］イソプロピルアクリルアミドのモノマ単位の含有量が、温度応答性ポリマを構成するモノマ単位の全モル量を基準として、８０ｍｏｌ％以上である、［２］に記載の分離材。
［４］上記官能基が、活性エステル基、カルボキシ基又はエポキシ基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］細孔径分布におけるモード径が、０．０５〜０．５０μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］粒径の変動係数が５〜１５％である、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］水酸基を有する高分子が、多糖類又はその変性体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］水酸基を有する高分子が、アガロース、デキストラン、ポリグリセリンモノメタクリレート、ポリビニルアルコール及びこれらの変性体からなる群より選ばれる少なくとも一種である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［９］温度応答性ポリマの重量平均分子量が５０００〜２０００００である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材の官能基に結合した、抗体を特異的に吸着する部位、を有する、カラム充填材。
The present invention provides the separating material according to the following [1] to [10] and the column filler according to the following [11].
[1] A polymer containing a polymer containing a polymer containing a styrene-based polymer as a monoma unit and a coating layer that covers at least a part of the surface of the porous polymer particles, and the coating layer has a hydroxyl group. A separating material comprising a graft polymer grafted with a temperature responsive polymer, wherein the temperature responsive polymer has a functional group reactive with an amino group.
[2] The separating material according to [1], wherein the temperature-responsive polymer contains isopropylacrylamide as a monoma unit.
[3] The separating material according to [2], wherein the content of isopropylacrylamide in monoma units is 80 mol% or more based on the total molar amount of monoma units constituting the temperature-responsive polymer.
[4] The separating material according to any one of [1] to [3], wherein the functional group is an active ester group, a carboxy group or an epoxy group.
[5] The separating material according to any one of [1] to [4], wherein the mode diameter in the pore size distribution is 0.05 to 0.50 μm.
[6] The separating material according to any one of [1] to [5], wherein the coefficient of variation of the particle size is 5 to 15%.
[7] The separating material according to any one of [1] to [6], wherein the polymer having a hydroxyl group is a polysaccharide or a modified product thereof.
[8] The polymer according to any one of [1] to [6], wherein the polymer having a hydroxyl group is at least one selected from the group consisting of agarose, dextran, polyglycerin monomethacrylate, polyvinyl alcohol and modified products thereof. Separator.
[9] The separating material according to any one of [1] to [8], wherein the temperature-responsive polymer has a weight average molecular weight of 5000 to 20000.
[10] A column filler having a site that specifically adsorbs an antibody, which is bound to the functional group of the separating material according to any one of [1] to [9].
本発明によれば、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れる分離材及びカラム充填材を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a separating material and a column filler which can recover the adsorbed antibody by changing the temperature and have excellent adsorptivity and recoverability of the antibody.
以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described, but the present invention is not limited to these embodiments.
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、被覆層が、水酸基を有する高分子に、温度応答性ポリマがグラフトしているグラフトポリマを含み、温度応答性ポリマが、アミノ基に対して反応性を有する官能基を有するものである。このような分離材は、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れる。また、本実施形態の分離材によれば、温度による吸脱着を簡便に行うことができると共に、抗体凝集物量を低減することができる。
<Separation material>
The separating material of the present embodiment includes porous polymer particles containing a polymer containing a styrene-based polymer as a monoma unit, and a coating layer that covers at least a part of the surface of the porous polymer particles. A polymer having a hydroxyl group contains a graft polymer grafted with a temperature-responsive polymer, and the temperature-responsive polymer has a functional group reactive with an amino group. Such a separating material can recover the adsorbed antibody by changing the temperature, and is excellent in the adsorptivity and recoverability of the antibody. Further, according to the separating material of the present embodiment, adsorption / desorption by temperature can be easily performed, and the amount of antibody aggregates can be reduced.
なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。 In the present specification, the "surface of the porous polymer particles" includes not only the outer surface of the porous polymer particles but also the surface of the pores inside the porous polymer particles. Further, in the present specification, (meth) acrylic acid means acrylic acid or methacrylic acid, and the same applies to other similar expressions such as (meth) acrylate.
［多孔質ポリマ粒子］
本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含むものである。多孔質ポリマ粒子がこのようなものであると、分離材の弾性率が向上し易く、カラム充填材として用いたときに、高い流速で精製し易い傾向にある。本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤の存在下で、スチレン系モノマを含むモノマを重合させて得られる粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合等により合成できる。ここで、スチレン系モノマとは、スチレン骨格を有するモノマをいう。スチレン系モノマとしては、例えば、以下のような多官能性モノマ及び単官能性モノマが挙げられる。
[Porous polymer particles]
The porous polymer particles according to the present embodiment include a polymer containing a styrene-based polymer as a monoma unit. When the porous polymer particles are such, the elastic modulus of the separating material tends to be improved, and when used as a column filler, it tends to be easily purified at a high flow velocity. The porous polymer particles according to the present embodiment are particles obtained by polymerizing a monoma containing a styrene-based monoma in the presence of, for example, a porosifying agent. Porous polymer particles can be synthesized, for example, by conventional suspension polymerization or the like. Here, the styrene-based monoma refers to a monoma having a styrene skeleton. Examples of the styrene-based monoma include the following polyfunctional monomas and monofunctional monomas.
スチレン系の多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のスチレン骨格を有するジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the styrene-based polyfunctional monoma include divinyl compounds having a styrene skeleton such as divinylbenzene, divinylbiphenyl, divinylnaphthalene, and divinylphenanthrene. These polyfunctional monomas can be used alone or in combination of two or more.
上記の中でも、耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性が向上する観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンをモノマ単位として含有するポリマを含んでいてもよい。 Among the above, it is preferable to use divinylbenzene from the viewpoint of improving durability, acid resistance and alkali resistance. That is, the porous polymer particles may contain a polymer containing divinylbenzene as a monoma unit.
スチレン系の単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。これらの単官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性が向上する観点から、スチレンを使用することが好ましい。 Examples of styrene-based monofunctional monomas include styrene, o-methylstyrene, m-methylstyrene, p-methylstyrene, α-methylstyrene, o-ethylstyrene, m-ethylstyrene, p-ethylstyrene, 2 , 4-Dimethylstyrene, pn-butylstyrene, pt-butylstyrene, pn-hexylstyrene, pn-octylstyrene, pn-nonylstyrene, pn-decylstyrene, p- Examples thereof include styrenes such as n-dodecylstyrene, p-methoxystyrene, p-phenylstyrene, p-chlorostyrene, and 3,4-dichlorostyrene and derivatives thereof. Styrene derivatives having functional groups such as carboxy group, amino group, hydroxyl group and aldehyde group can also be used. These monofunctional monomas may be used alone or in combination of two or more. Among the above, it is preferable to use styrene from the viewpoint of improving acid resistance and alkali resistance.
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the porosifying agent include aliphatic or aromatic hydrocarbons, esters, ketones, ethers, alcohols, etc., which are organic solvents that promote phase separation during polymerization and promote porosification of particles. Be done. Specific examples thereof include toluene, xylene, cyclohexane, octane, butyl acetate, dibutyl phthalate, methyl ethyl ketone, dibutyl ether, 1-hexanol, 2-octanol, decanol, lauryl alcohol, cyclohexanol and the like. These porosifying agents may be used alone or in combination of two or more.
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して、例えば、０〜３００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。 The porosifying agent can be used, for example, 0 to 300% by mass with respect to the total mass of the monoma. The porosity of the porous polymer particles can be controlled by the amount of the porosity agent. Further, the size and shape of the pores of the porous polymer particles can be controlled by the type of the porosifying agent.
溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、例えば、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化し得る。 Water used as a solvent can also be used as a porosifying agent. When water is used as a porosifying agent, the particles can be made porous by, for example, dissolving an oil-soluble surfactant in a monoma and absorbing water.
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。 Examples of the oil-soluble surfactant used for porosification include sorbitan monoesters of branched C16 to C24 fatty acids, chain unsaturated C16 to C22 fatty acids or chain saturated C12 to C14 fatty acids, for example, sorbitan monolaurate and sorbitan. Solbitan monoesters derived from monooleates, sorbitan monomillistates or coconut fatty acids; diglycerol monoesters of branched C16-C24 fatty acids, chain unsaturated C16-C22 fatty acids or chain saturated C12-C14 fatty acids, such as diglycerol monoesters. Diglycerol monoester of glycerol monooleate (eg, C18: 1 (18 carbons, 1 double bond) fatty acid), diglycerol monomillistate, diglycerol monoisostearate or diglycerol mono of coconut fatty acid Esters; diglycerol monofatty acids of branched C16-C24 alcohols (eg, gelve alcohols), chain unsaturated C16-C22 alcohols or chain saturated C12-C14 alcohols (eg palm fatty alcohols); and mixtures thereof. Can be mentioned.
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基及びミリストイル基）エーテル；又はこれらの混合物が好ましい。 Of these, sorbitan monolaurate (eg, SPAN® 20, purity preferably greater than about 40%, more preferably greater than about 50%, even more preferably greater than about 70% sorbitan monolaurate). Rate); sorbitan monooleate (eg, SPAN® 80, purity preferably greater than about 40%, more preferably greater than about 50%, even more preferably greater than about 70% sorbitan monooleate. ); Diglycerol monooleate (eg, diglycerol monooleate with a purity of preferably greater than about 40%, more preferably greater than about 50%, even more preferably greater than about 70%); diglycerol monoisostearate. (For example, diglyceride monoisostearate having a purity of preferably greater than about 40%, more preferably greater than about 50%, even more preferably greater than about 70%); diglyceride monomillistate (eg, preferably greater than purity). More than about 40%, more preferably more than about 50%, even more preferably more than about 70% sorbitan monomillistate); cocoyl (eg, lauryl and myristyl groups) ethers of diglycerol; or mixtures thereof are preferred. ..
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が向上し易いことから、大きな単一孔を形成し易い。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持し易くなる。 These oil-soluble surfactants are preferably used in the range of 5 to 80% by mass with respect to the total mass of the monoma. When the content of the oil-soluble surfactant is 5% by mass or more, the stability of water droplets is likely to be improved, so that a large single pore is easily formed. Further, when the content of the oil-soluble surfactant is 80% by mass or less, the porous polymer particles are more likely to retain their shape after polymerization.
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。 Examples of the aqueous medium used in the polymerization reaction include water, a mixed medium of water and a water-soluble solvent (for example, a lower alcohol), and the like. The aqueous medium may contain a surfactant. As the surfactant, any of anionic, cationic, nonionic and zwitterionic surfactants can be used.
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。 Examples of the anionic surfactant include fatty acid oils such as sodium oleate and potassium castor oil, alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate and ammonium lauryl sulfate, alkylbenzene sulfonates such as sodium dodecylbenzene sulfonate, and alkylnaphthalene sulfone. Dialkyl sulfosuccinates such as acid salts, alkane sulfonates, sodium dioctyl sulfosuccinate, alkernyl succinate (dipotassium salt), alkyl phosphate ester salts, naphthalene sulfonate formalin condensates, polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate Examples thereof include salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfate, and polyoxyethylene alkyl sulfates.
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、及びラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。 Examples of the cationic surfactant include alkylamine salts such as laurylamine acetate and stearylamine acetate, and quaternary ammonium salts such as lauryltrimethylammonium chloride.
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、及びパーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。 Examples of nonionic surfactants include hydrocarbon-based nonionic surfactants such as polyethylene glycol alkyl ethers, polyethylene glycol alkylaryl ethers, polyethylene glycol esters, polyethylene glycol sorbitan esters, polyalkylene glycol alkylamines, and amides. Examples thereof include polyether-modified silicon-based nonionic surfactants such as polyethylene oxide adducts and polypropylene oxide adductants of silicon, and fluorine-based nonionic surfactants such as perfluoroalkyl glycols.
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。 Examples of the zwitterionic surfactant include hydrocarbon surfactants such as lauryldimethylamine oxide, phosphoric acid ester-based surfactants and phosphite ester-based surfactants.
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。 As the surfactant, one type may be used alone or two or more types may be used in combination. Among the above-mentioned surfactants, anionic surfactants are preferable from the viewpoint of dispersion stability during polymerization of monoma.
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、例えば、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。 Examples of the polymerization initiator added as needed include benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, orthochlorobenzoyl peroxide, benzoyl orthomethoxy benzoyl peroxide, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, and tert-butylper. Organic peroxides such as oxy-2-ethylhexanoate, di-tert-butyl peroxide; and 2,2'-azobisisobutyronitrile, 1,1'-azobiscyclohexanecarbonitrile, 2,2 Examples thereof include azo compounds such as'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile). The polymerization initiator can be used in the range of, for example, 0.1 to 7.0 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monoma.
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、例えば、２５〜１１０℃であってもよく、５０〜１００℃であってもよい。 The polymerization temperature can be appropriately selected depending on the type of the monoma and the polymerization initiator. The polymerization temperature may be, for example, 25 to 110 ° C. or 50 to 100 ° C.
上記重合工程において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を添加してもよい。 In the above polymerization step, a polymer dispersion stabilizer may be added in order to improve the dispersion stability of the particles.
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、及びポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して、例えば、１〜１０質量部であってもよい。 Examples of the polymer dispersion stabilizer include polyvinyl alcohol, polycarboxylic acid, celluloses (hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, etc.), and polyvinylpyrrolidone, and inorganic water-soluble polymer compounds such as sodium tripolyphosphate. Can be used together. Of these, polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone is preferable. The amount of the polymer dispersion stabilizer added may be, for example, 1 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monoma.
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。 In order to prevent the monoma from polymerizing alone, a water-soluble polymerization inhibitor such as nitrites, sulfites, hydroquinones, ascorbic acids, water-soluble B vitamins, citric acid, and polyphenols may be used.
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、例えば、５００μｍ以下であってもよく、３００μｍ以下であってもよく、２００μｍ以下であってもよい。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、カラム充填後のカラム圧の増加を抑制し易い観点から、例えば、１０μｍ以上であってもよく、３０μｍ以上であってもよく、５０μｍ以上であってもよい。 The average particle size of the porous polymer particles may be, for example, 500 μm or less, 300 μm or less, or 200 μm or less. The average particle size of the porous polymer particles may be, for example, 10 μm or more, 30 μm or more, or 50 μm or more from the viewpoint of easily suppressing an increase in column pressure after column filling. May be good.
多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性が向上し易い観点から、例えば、５〜１５％であってもよく、５〜１０％であってもよい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。 The coefficient of variation (CV) of the particle size of the porous polymer particles may be, for example, 5 to 15% or 5 to 10% from the viewpoint of easily improving the liquid permeability. C. V. As a method of reducing the amount of waste, a monodisperse can be mentioned by using an emulsifying device such as a micro process server (Hitachi, Ltd.).
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子（多孔質ポリマ粒子又は分離材）を、水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径と粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。
C.I. V. The (coefficient of variation) can be obtained by the following measurement method.
1) Particles (porous polymer particles or separating material) are dispersed in water (including a dispersant such as a surfactant) to prepare a dispersion liquid containing 1% by mass of particles.
2) Using a particle size distribution meter (Sysmex Flow, manufactured by Sysmex Corporation), C.I. V. Measure (coefficient of variation).
多孔質ポリマ粒子の空隙率（細孔容積）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で、例えば、３０体積％以上７０体積％以下であってもよく、４０％体積以上７０体積％以下であってもよい。多孔質ポリマ粒子はマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。 The porosity (pore volume) of the porous polymer particles is based on the total volume of the porous polymer particles, and may be, for example, 30% by volume or more and 70% by volume or less, or 40% or more and 70% by volume or less. You may. The porous polymer particles preferably have macropores (macropores).
多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径は、例えば、０．０５〜０．５０μｍであってもよく、０．０５μｍ以上０．５μｍ未満であってもよく、０．０５μｍ以上０．３μｍ未満であってもよい。細孔径分布におけるモード径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．５以下であると、比表面積が充分なものになり易い傾向にある。 The mode diameter in the pore size distribution of the porous polymer particles may be, for example, 0.05 to 0.50 μm, 0.05 μm or more and less than 0.5 μm, or 0.05 μm or more and less than 0.3 μm. It may be. When the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.05 μm or more, substances tend to enter the pores easily, and when the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.5 or less, the specific surface area becomes sufficient. It tends to be easy.
多孔質ポリマ粒子の空隙率及び細孔径は、例えば、上述の多孔質化剤により調整可能である。 The porosity and pore size of the porous polymer particles can be adjusted by, for example, the above-mentioned porosity agent.
多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が多くなる傾向にある。 The specific surface area of the porous polymer particles is preferably 30 m 2 / g or more. From the viewpoint of higher practicality, the specific surface area is more preferably 35 m 2 / g or more, and further preferably 40 m 2 / g or more. When the specific surface area is 30 m 2 / g or more, the amount of adsorbed substances to be separated tends to increase.
［被覆層］
本実施形態に係る被覆層は、水酸基を有する高分子に、温度応答性ポリマがグラフトしているグラフトポリマを含み、温度応答性ポリマが、アミノ基に対して反応性を有する官能基を有するものである。被覆層がこのようなものであると、タンパク質の非特異吸着を抑制し易く、かつ、タンパク質の吸着性及び回収性が向上し易いと考えられる。水酸基を有する高分子は、カラム洗浄時に剥離することを防止し易い観点から、例えば、架橋されていることが好ましい。
[Coating layer]
The coating layer according to the present embodiment contains a graft polymer obtained by grafting a temperature-responsive polymer to a polymer having a hydroxyl group, and the temperature-responsive polymer has a functional group having reactivity with an amino group. Is. It is considered that when the coating layer is such, it is easy to suppress non-specific adsorption of the protein, and it is easy to improve the adsorptivity and recoverability of the protein. The polymer having a hydroxyl group is preferably crosslinked, for example, from the viewpoint of easily preventing peeling during column cleaning.
（水酸基を有する高分子）
水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子は、タンパク質の非特異吸着を更に低減し易い観点から、水溶性高分子であってもよい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、ポリグリセリンモノメタクリレート、及びポリビニルアルコールが挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース及びキトサンが挙げられる。水酸基を有する高分子の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、１００００〜５００００００であってもよい。水酸基を有する高分子は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
(Polymer having a hydroxyl group)
The polymer having a hydroxyl group preferably has two or more hydroxyl groups in one molecule, and more preferably a hydrophilic polymer. The polymer having a hydroxyl group may be a water-soluble polymer from the viewpoint of further reducing the non-specific adsorption of the protein. Examples of the polymer having a hydroxyl group include polysaccharides, polyglycerin monomethacrylate, and polyvinyl alcohol. Examples of polysaccharides include agarose, dextran, cellulose and chitosan. The weight average molecular weight (Mw) of the polymer having a hydroxyl group may be, for example, 1000 to 500000. As the polymer having a hydroxyl group, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
水酸基を有する高分子は、粒子との界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体（疎水基変性体）であってもよい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、及び炭素数６〜１０のアリール基が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基及びプロピル基が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。 The polymer having a hydroxyl group may be a modified product (hydrophobic group modified product) modified by a hydrophobic group from the viewpoint of improving the interfacial adsorption ability with particles. Examples of the hydrophobic group include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and an aryl group having 6 to 10 carbon atoms. Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group and a propyl group. Examples of the aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group and a naphthyl group.
水酸基を有する高分子は、例えば、多糖類又はその変性体であってもよい。多糖類の変性体としては、例えば、疎水基変性体が挙げられる。水酸基を有する高分子は、例えば、アガロース、デキストラン、ポリグリセリンモノメタクリレート、ポリビニルアルコール及びこれらの変性体からなる群より選ばれる少なくとも一種であってもよい。 The polymer having a hydroxyl group may be, for example, a polysaccharide or a modified product thereof. Examples of the modified polysaccharide include a modified hydrophobic group. The polymer having a hydroxyl group may be at least one selected from the group consisting of, for example, agarose, dextran, polyglycerin monomethacrylate, polyvinyl alcohol and modified products thereof.
（温度応答性ポリマ）
本実施形態に係る温度応答性ポリマは、アミノ基に対して反応性を有する官能基を有し、かつ、温度応答性を有するポリマである。温度応答性ポリマは、吸着させる抗体の変性を防止し易い観点から、４０℃以下で応答する温度応答性ポリマであることが好ましい。
(Temperature responsive polymer)
The temperature-responsive polymer according to the present embodiment is a polymer having a functional group reactive with an amino group and having temperature responsiveness. The temperature-responsive polymer is preferably a temperature-responsive polymer that responds at 40 ° C. or lower from the viewpoint of easily preventing denaturation of the antibody to be adsorbed.
温度応答性ポリマは、温度応答性を向上し易い観点及びイオン交換による吸着を低減し易い観点から、例えば、イソプロピルアクリルアミドをモノマ単位として含んでいてもよい。 The temperature-responsive polymer may contain, for example, isopropylacrylamide as a monoma unit from the viewpoint of easily improving the temperature responsiveness and easily reducing the adsorption due to ion exchange.
温度応答性ポリマがイソプロピルアクリルアミドをモノマ単位として含む場合、イソプロピルアクリルアミドのモノマ単位の含有量は、温度応答性を向上し易い観点から、温度応答性ポリマを構成するモノマ単位の全モル量を基準として、例えば、８０ｍｏｌ％以上であってもよく、８３ｍｏｌ％以上であってもよく、８７ｍｏｌ％以上であってもよい。イソプロピルアクリルアミドのモノマ単位の含有量は、温度応答性ポリマを構成するモノマ単位の全モル量を基準として、例えば、１００ｍｏｌ％以下であってもよく、１００ｍｏｌ％未満であってもよく、９９ｍｏｌ％以下であってもよく、９５ｍｏｌ％以下であってもよい。 When the temperature-responsive polymer contains isopropylacrylamide as a monoma unit, the content of the monoma unit of isopropylacrylamide is based on the total molar amount of the monoma unit constituting the temperature-responsive polymer from the viewpoint of easily improving the temperature responsiveness. For example, it may be 80 mol% or more, 83 mol% or more, or 87 mol% or more. The content of isopropylacrylamide in monoma units may be, for example, 100 mol% or less, less than 100 mol%, or 99 mol% or less, based on the total molar amount of monoma units constituting the temperature-responsive polymer. It may be 95 mol% or less.
アミノ基に対して反応性を有する官能基としては、例えば、活性エステル基、カルボキシ基及びエポキシ基が挙げられる。すなわち、上記官能基は、例えば、活性エステル基、カルボキシ基又はエポキシ基であってもよい。これらの官能基は、例えば、ポリマに温度応答性を付与しうるモノマと、上記官能基を有するモノマとを共重合することにより、温度応答性ポリマ中に導入することが好ましい。 Examples of the functional group having reactivity with the amino group include an active ester group, a carboxy group and an epoxy group. That is, the functional group may be, for example, an active ester group, a carboxy group or an epoxy group. These functional groups are preferably introduced into the temperature-responsive polymer, for example, by copolymerizing a monoma capable of imparting temperature responsiveness to the polymer and a monoma having the functional group.
カルボキシ基を有するモノマとしては、例えば、不飽和のモノ−、ジ−又はトリ−カルボン酸が挙げられる。 Monomas having a carboxy group include, for example, unsaturated mono-, di- or tri-carboxylic acids.
カルボキシ基を有するモノマの具体例は、（メタ）アクリル酸、フタル酸モノヒドロキシエチルアクリート、γ−カルボキシ−ポリカプロラクトンモノアクリート、メタクリル酸プロピルヘキサヒドロフタレート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、４’−［２−（アクリロイルオキシ）エトキシ］アゾベンゼン−４−カルボン酸、アクリル酸２−カルボキシエチル、４−［６−（アクリロイルオキシ）ヘキシルオキシ］安息香酸、４−（アクリロイルアミノ）酪酸、２−アクリルアミド−２−カルボキシメチルプロパンスルホン酸、３−（アクリロイルアミノ）プロピオン酸、２−カルボキシイソプロピルアクリルアミド、７−（アクリロイルアミノ）ヘプタン酸、α−［２，２，２−トリス（カルボキシメトキシ）エチル］アクリル酸１−メチル、α−［２−（カルボキシメトキシ）エチル］アクリル酸１−メチル、ヘキサン二酸ビス［４−（２−カルボキシエテニル）フェニル］、４，４’−［エチレンビス（イミノ）］ビス（４−オキソ−２−ブテン酸）、２，３−ジヒドロ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−カルボキシ−１，４−ベンゾジオキシン−６−アクリル酸、２−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−３−カルボキシ−７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−アクリル酸、アクリル酸８−（４−カルボキシフェノキシ）オクチル、及びアクリル酸３−カルボキシプロピルを含む。 Specific examples of monomas having a carboxy group include (meth) acrylic acid, monohydroxyethyl phthalate, γ-carboxy-polycaprolactone monoacrete, propylhexahydrophthalate methacrylate, 2- (meth) acryloyloxyethyl succinate, 4'-[2- (Acryloyloxy) ethoxy] azobenzene-4-carboxylic acid, 2-carboxyethyl acrylate, 4- [6- (Acryloyloxy) hexyloxy] benzoic acid, 4- (Acryloylamino) butyric acid, 2 -Acrylamide-2-carboxymethylpropansulfonic acid, 3- (acryloylamino) propionic acid, 2-carboxyisopropylacrylamide, 7- (acryloylamino) heptanic acid, α- [2,2,2-tris (carboxymethoxy) ethyl ] 1-methyl acrylate, α- [2- (carboxymethoxy) ethyl] 1-methyl acrylate, bis [4- (2-carboxyethenyl) phenyl], 4,4'-[ethylene bis ( Imino)] Bis (4-oxo-2-butenoic acid), 2,3-dihydro-2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3-carboxy-1,4-benzodioxin-6-acrylic acid, 2- (3-methoxy-4-hydroxyphenyl) -3-carboxy-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran-5-acrylic acid, 8- (4-carboxyphenoxy) octyl acrylate, and 3-carboxypropyl acrylate including.
活性エステル基を有するモノマとしては、例えば、上記のカルボキシ基を有するモノマに対して、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド等を反応させて活性エステル基を導入したモノマが挙げられる。 Examples of the monoma having an active ester group include the monoma having an active ester group introduced by reacting the monoma having a carboxy group with N-hydroxysuccinimide or the like.
エポキシ基を有するモノマとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリートグリシジルエーテル、Ｎ−［４−（２，３−エポキシプロパン−１−イルオキシ）−３，５−ジメチルベンジル］アクリルアミド、アクリル酸９，１０−エポキシオクタデカン酸無水物、アクリル酸（７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３−イル）メチル、及びアクリル酸＝３，４−エポキシトリシクロ［５．２．１．０２，６］デシルが挙げられる。また、エポキシ基を有するモノマは、例えば、複数のエポキシ基を有するマクロモノマーであってもよい。 Examples of monomas having an epoxy group include glycidyl (meth) acrylic acid, 4-hydroxybutyl (meth) acrylic acid glycidyl ether, and N- [4- (2,3-epoxypropane-1-yloxy) -3,5-dimethyl. Benzyl] acrylamide, acrylic acid 9,10-epoxy octadecanoic acid anhydride, acrylic acid (7-oxabicyclo [4.1.0] heptane-3-yl) methyl, and acrylic acid = 3,4-epoxytricyclo [ 5.2.1.02,6] Decyl can be mentioned. Further, the monomer having an epoxy group may be, for example, a macromonomer having a plurality of epoxy groups.
温度応答性ポリマの重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、５０００〜２０００００であってもよく、７５００〜２０００００であってもよく、１００００〜２０００００であってもよい。温度応答性ポリマの重量平均分子量が、５０００以上であると、抗体吸着部位の固定化量を多くし易い傾向にある。 The weight average molecular weight (Mw) of the temperature-responsive polymer may be, for example, 5000 to 20000, 7500 to 200,000, or 1000 to 20000. When the weight average molecular weight of the temperature-responsive polymer is 5000 or more, the amount of the antibody adsorption site immobilized tends to be increased.
温度応答性ポリマのグラフト量は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、例えば、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。 The graft amount of the temperature-responsive polymer may be, for example, 1 mg to 100 mg per 1 g of the porous polymer particles.
（被覆層の形成方法）
本実施形態に係る被覆層は、例えば、水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆する被覆工程と、水酸基を有する高分子に温度応答性ポリマをグラフトするグラフト工程とを備える方法により形成できる。
(Method of forming the coating layer)
The coating layer according to the present embodiment can be formed by, for example, a method including a coating step of coating porous polymer particles with a polymer having a hydroxyl group and a grafting step of grafting a temperature-responsive polymer to the polymer having a hydroxyl group. ..
（被覆工程）
多孔質ポリマ粒子への水酸基を有する高分子の被覆方法に特に制限はないが、例えば、水酸基を有する高分子を多孔質ポリマ粒子に吸着させた後、必要に応じ水酸基を有する高分子を架橋する方法（第１の被覆方法）、及び、多孔質ポリマ粒子に対して、水酸基を有する高分子をグラフトする方法（第２の被覆方法）が挙げられる。以下、第１の被覆方法及び第２の被覆方法について、それぞれ説明する。
(Coating process)
The method of coating the polymer having a hydroxyl group on the porous polymer particles is not particularly limited. For example, after adsorbing the polymer having a hydroxyl group on the porous polymer particles, the polymer having a hydroxyl group is crosslinked as necessary. Examples thereof include a method (first coating method) and a method of grafting a polymer having a hydroxyl group on the porous polymer particles (second coating method). Hereinafter, the first coating method and the second coating method will be described respectively.
（第１の被覆方法）
第１の被覆方法においては、まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。上記溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
(First coating method)
In the first coating method, first, a solution of a polymer having a hydroxyl group is adsorbed on the surface of the porous polymer particles. The solvent for the solution is not particularly limited as long as it can dissolve a polymer having a hydroxyl group, but water is the most common. The concentration of the polymer dissolved in the solvent is preferably 5 to 20 (mg / mL).
具体的には、例えば、上記溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。このとき、溶液中の粒子を分散させる目的等により、例えば、攪拌してもよい。含浸時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常、６〜２４時間含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。 Specifically, for example, the above solution is impregnated into the porous polymer particles. In the impregnation method, porous polymer particles are added to a polymer solution having a hydroxyl group and left for a certain period of time. At this time, for the purpose of dispersing the particles in the solution, for example, stirring may be performed. The impregnation time varies depending on the surface condition of the porous polymer particles, but usually, when impregnated for 6 to 24 hours, the polymer concentration becomes an equilibrium state with the external concentration inside the porous polymer particles. Then, it is washed with a solvent such as water and alcohol to remove the polymer having an unadsorbed hydroxyl group.
（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。
(Crosslinking)
Next, a cross-linking agent is added to cause a cross-linking reaction of the polymer having a hydroxyl group adsorbed on the surface of the porous polymer particles to form a cross-linked product.
架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物、ジビニルスルホンなどのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライド化合物も架橋剤として使用できる。 Examples of the cross-linking agent include epihalohydrins such as epichlorohydrin, dialdehyde compounds such as glutaraldehyde, diisocyanate compounds such as methylene diisocyanate, glycidyl compounds such as ethylene glycol diglycidyl ether, and hydroxyl group-active functional groups such as divinyl sulfone. Examples thereof include compounds having two or more. When a compound having an amino group such as chitosan is used as the polymer having a hydroxyl group, a dihalide compound such as dichlorooctane can also be used as a cross-linking agent.
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類により異なるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、架橋剤がジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。 A catalyst is usually used for this cross-linking reaction. The catalyst varies depending on the type of cross-linking agent. For example, when the cross-linking agent is epichlorohydrin or the like, an alkali such as sodium hydroxide is effective, and when the cross-linking agent is a dialdehyde compound, a mineral acid such as hydrochloric acid is effective. Is.
架橋剤による架橋反応は、通常、水酸基を有する高分子を吸着させた多孔質ポリマ粒子を、適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類又はその変性体を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定することができる。架橋剤の添加量が０．１モル倍以上であると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離し難い傾向にある。架橋剤の添加量が１００モル倍以下であると、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合であっても、水酸基を有する高分子の特性を維持し易い傾向にある。 The cross-linking reaction with a cross-linking agent is usually carried out by adding a cross-linking agent to a system in which porous polymer particles having a polymer having a hydroxyl group adsorbed are dispersed and suspended in an appropriate medium. When a polysaccharide or a modified product thereof is used as the polymer having a hydroxyl group, the amount of the cross-linking agent added is within the range of 0.1 to 100 mol times, assuming that one unit of the monosaccharide is 1 mol. It can be selected according to the performance of the target separating material. When the amount of the cross-linking agent added is 0.1 mol times or more, the coating layer tends to be difficult to peel off from the porous polymer particles. When the amount of the cross-linking agent added is 100 mol times or less, the characteristics of the polymer having a hydroxyl group tend to be easily maintained even when the reaction rate with the polymer having a hydroxyl group is high.
また、架橋反応時の触媒の使用量としては、架橋剤の種類にもよるが、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合、通常、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して好ましくは０．０１〜１０モル倍の範囲、さらに好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。 The amount of the catalyst used in the cross-linking reaction depends on the type of cross-linking agent, but when a polysaccharide is used as the polymer having a hydroxyl group, one unit of the monosaccharide forming the polysaccharide is usually 1 mol. Then, it is preferably used in the range of 0.01 to 10 mol times, more preferably 0.1 to 5 mol times.
例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。 For example, when the cross-linking reaction condition is a temperature condition, the temperature of the reaction system is raised, and when the temperature reaches the reaction temperature, a cross-linking reaction occurs.
水酸基を有する高分子を吸着させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては、吸着させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては、水、アルコール等が挙げられる。 As a medium for dispersing and suspending porous polymer particles having a polymer having a hydroxyl group adsorbed, the polymer, a cross-linking agent, etc. are not extracted from the adsorbed polymer solution, and the cross-linking reaction is not possible. Must be active. Specific examples thereof include water, alcohol and the like.
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜３０時間かけて行うことができる。架橋反応は、例えば、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行ってもよい。架橋反応の温度は、好ましくは２５〜９０℃である。 The cross-linking reaction can usually be carried out at a temperature in the range of 5 to 90 ° C. over 1 to 30 hours. The cross-linking reaction may be carried out, for example, at a temperature in the range of 5 to 90 ° C. over 1 to 10 hours. The temperature of the cross-linking reaction is preferably 25 to 90 ° C.
架橋反応終了後、粒子をろ別し、次いで、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒又は水で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去する。これにより、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆され、かつ、水酸基を有する高分子が架橋されている分離材が得られる。必要に応じ、上記架橋処理を省略してもよい。 After completion of the cross-linking reaction, the particles are filtered off, and then washed with a hydrophilic organic solvent such as methanol or ethanol or water to remove unreacted polymers, suspension medium and the like. As a result, a separating material is obtained in which at least a part of the surface of the porous polymer particles is covered with a coating layer containing a polymer having a hydroxyl group and the polymer having a hydroxyl group is crosslinked. If necessary, the above-mentioned cross-linking treatment may be omitted.
（第２の被覆方法）
第２の被覆方法は、多孔質ポリマ粒子に対して、水酸基を有する高分子をグラフトする方法である。グラフトを行う方法としては、水酸基を有する高分子に、開始基を導入し、グラフトする方法（リビングラジカル重合、ラジカル重合等）、Ｃｅを触媒とするグラフト重合、過酸化物を利用した水素引き抜きによるグラフト重合などを使用することができる。
(Second coating method)
The second coating method is a method of grafting a polymer having a hydroxyl group onto the porous polymer particles. As a method of grafting, a starting group is introduced into a polymer having a hydroxyl group and grafted (living radical polymerization, radical polymerization, etc.), a Ce-catalyzed graft polymerization, or hydrogen extraction using a peroxide. Graft polymerization and the like can be used.
水酸基を有する高分子は、分子量を制御し易い観点から、リビングラジカル重合であるＡＴＲＰ法を用いて多孔質粒子表面からグラフトすることが好ましい。 From the viewpoint of easily controlling the molecular weight, the polymer having a hydroxyl group is preferably grafted from the surface of porous particles by using the ATRP method, which is a living radical polymerization.
ＡＴＲＰ法としては、例えば、多孔質ポリマ粒子表面にＡＴＲＰ開始基を導入後、水酸基を有するラジカル重合性モノマを重合させる方法が挙げられる。 Examples of the ATRP method include a method in which an ATRP initiating group is introduced on the surface of porous polymer particles and then a radically polymerizable monoma having a hydroxyl group is polymerized.
ＡＴＲＰ開始基の導入方法は特に限定はないが、多孔質ポリマ粒子に二重結合が残存している場合、例えば、臭酸、塩酸等を二重結合に反応させる方法が挙げられる。また、多孔質ポリマ粒子が、その表面に水酸基を有する場合、例えば、当該水酸基に、２−ブロモプロピオニルブロミドを反応させる方法が挙げられる。２−ブロモプロピオニルブロミドをドーパミンと反応させた物質を使用して、多孔質ポリマ粒子表面に膜を形成することにより開始基を導入することもできる。 The method for introducing the ATRP initiating group is not particularly limited, but when the double bond remains in the porous polymer particles, for example, a method of reacting an odoric acid, hydrochloric acid or the like with the double bond can be mentioned. When the porous polymer particles have a hydroxyl group on the surface thereof, for example, a method of reacting the hydroxyl group with 2-bromopropionyl bromide can be mentioned. Starting groups can also be introduced by forming a film on the surface of the porous polymer particles using a substance obtained by reacting 2-bromopropionyl bromide with dopamine.
水酸基を有するラジカル重合性モノマとしては、例えば、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸３−ヒドロキシブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、糖単位を有する（メタ）アクリレート及びグリセリンモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。 Examples of the radically polymerizable monoma having a hydroxyl group include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 3-hydroxybutyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, and 2-(meth) acrylate. 2-Hydroxyethoxy) ethyl, (meth) acrylate 2,3-dihydroxypropyl, polyethylene glycol (meth) acrylate, N- (2-hydroxyethyl) acrylamide, (meth) acrylate with sugar unit and glycerin mono (meth) Acrylate can be mentioned.
水酸基を有するラジカル重合性モノマとしては、分離材としたときの非特異吸着を防止し易い観点から、水に溶解するモノマを使用することが好ましい。 As the radically polymerizable monoma having a hydroxyl group, it is preferable to use a monoma that dissolves in water from the viewpoint of easily preventing non-specific adsorption when used as a separating material.
ＡＴＲＰ法においては、触媒を用いてもよい。当該触媒に特に制限はなく、ＡＴＲＰ法において通常使用される触媒から適宜選択してもよい。このような触媒としては、例えば、遷移金属錯体が挙げられる。当該遷移金属錯体は、例えば、以下に例示する配位子と遷移金属とを適宜組み合わせたものであってもよい。 In the ATRP method, a catalyst may be used. The catalyst is not particularly limited, and may be appropriately selected from the catalysts usually used in the ATRP method. Examples of such a catalyst include transition metal complexes. The transition metal complex may be, for example, an appropriate combination of a ligand illustrated below and a transition metal.
配位子としては、例えば、２，２’−ビピリジン、４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジノニル−２，２’−ビピリジン、Ｎ−ブチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−オクチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−ドデシル−Ｎ−（２−ピリジル−メチレン）アミン、Ｎ−オクタデシル−Ｎ−（２−ピリジル−メチレン）アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−ジエチレントリアミン、トリス（２−ピリジルメチル）アミン、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレン−テトラミン、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン、１，４，８，１１−テトラメチル−１−４−８−１１−テトラアザシクロテトラデカン及びＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミンが挙げられる。 Examples of the ligand include 2,2'-bipyridine, 4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridine, 4,4'-di-tert-butyl-2,2'-bipyridine, 4,4. '-Dinonyl-2,2'-bipyridine, N-butyl-2-pyridylmethaneimine, N-octyl-2-pyridylmethaneimine, N-dodecyl-N- (2-pyridyl-methylene) amine, N-octadecyl- N- (2-pyridyl-methylene) amine, N, N, N', N', N'-pentamethyl-diethylenetriamine, tris (2-pyridylmethyl) amine, 1,1,4,7,10,10-hexa Methyltriethylene-tetramine, tris [2- (dimethylamino) ethyl] amine, 1,4,8,11-tetraazacyclotetra-decane, 1,4,8,11-tetramethyl-1--4-8- Examples include 11-tetraazacyclotetradecane and N, N, N'N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) -ethylenediamine.
遷移金属としては、例えば、ＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ、ＣｕＢｒ２、ＴｉＣｌ２、ＴｉＣｌ３、ＴｉＣｌ４、ＴｉＢｒ４、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＦｅＢｒ２、ＦｅＢｒ３、ＣｏＣｌ２、ＣＯＢｒ２、ＮｉＣｌ２、ＮｉＢｒ２、ＭｏＣｌ３、ＭｏＣｌ５及びＲｕＣｌ３が挙げられる。 Examples of transition metals include CuCl, CuCl 2 , CuBr, CuBr 2 , TiCl 2 , TiCl 3 , TiCl 4 , TiBr 4 , FeCl 2 , FeCl 3 , FeBr 2 , FeBr 3 , CoCl 2 , COBr 2 , NiCl 2 , and so on. Examples thereof include NiBr 2 , MoCl 3 , MoCl 5 and RuCl 3 .
遷移金属錯体としては、一価又は二価の銅錯体が好ましい。二価の銅錯体としては、例えば、ＣｕＢｒ２／トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン錯体が挙げられる。 As the transition metal complex, a monovalent or divalent copper complex is preferable. Examples of the divalent copper complex include CuBr 2 / tris [2- (dimethylamino) ethyl] amine complex.
ＡＴＲＰ法においては、溶媒を用いることもできる。溶媒に特に制限はないが、触媒を均一に溶解できるものが好ましい。 In the ATRP method, a solvent can also be used. The solvent is not particularly limited, but a solvent capable of uniformly dissolving the catalyst is preferable.
溶媒としては、例えば、水、エーテル類、アミド類、ニトリル類及びアルコール類からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。 Examples of the solvent include at least one selected from the group consisting of water, ethers, amides, nitriles and alcohols.
エーテル類としては、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジフェニルエーテル、アニソール及びジメトキシベンゼンが挙げられる。 Examples of ethers include diethyl ether, tetrahydrofuran, diphenyl ether, anisole and dimethoxybenzene.
アミド類としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドが挙げられる。 Examples of amides include N, N-dimethylformamide (DMF) and N, N-dimethylacetamide.
ニトリル類としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル及びベンゾニトリルが挙げられる。 Examples of nitriles include acetonitrile, propionitrile and benzonitrile.
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びイソアミルアルコールが挙げられる。 Examples of alcohols include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, n-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and isoamyl alcohol.
溶媒としては、水、エーテル類、アミド類及びアルコール類からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、水、アニソール又はＤＭＦがより好ましい。 As the solvent, at least one selected from the group consisting of water, ethers, amides and alcohols is preferable, and water, anisole or DMF is more preferable.
溶媒は、上記以外のその他の溶媒を更に含んでいてもよい。その他の溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素化合物；及びクロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素化合物が挙げられる。 The solvent may further contain other solvents other than the above. Examples of other solvents include aromatic hydrocarbon compounds such as benzene and toluene; and halogenated hydrocarbon compounds such as chlorobenzene, methylene chloride, chloroform and chlorobenzene.
水酸基を有する高分子の被覆量に特に制限はないが、例えば、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、１００〜４００ｍｇであってもよい。上記被覆量が、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、４００ｍｇ以下であると、カラム充填材として用いたときのカラム圧の上昇を抑制し易い傾向にある。 The coating amount of the polymer having a hydroxyl group is not particularly limited, and may be, for example, 100 to 400 mg per 1 g of the porous polymer particles. When the coating amount is 400 mg or less per 1 g of the porous polymer particles, it tends to be easy to suppress an increase in column pressure when used as a column filler.
（温度応答性ポリマのグラフト工程）
温度応答性ポリマのグラフト方法としては、例えば、水酸基を有する高分子の水酸基に、ブロモイソブチリルブロマイドを反応させ、ＡＴＲＰ開始基を導入した後、温度応答性ポリマを構成するモノマ単位に対応するモノマを重合させる方法が挙げられる。当該方法においては、例えば、上述のＡＴＲＰ法で例示した触媒及び溶媒を用いることができる。温度応答性ポリマは、例えば、温度応答性ポリマを合成した後に、温度応答性ポリマと水酸基を有する高分子とを反応させることによりグラフトしてもよい。
(Temperature-responsive polymer grafting process)
As a method for grafting a temperature-responsive polymer, for example, bromoisobutyryl bromide is reacted with a hydroxyl group of a polymer having a hydroxyl group, an ATRP initiating group is introduced, and then the monoma unit constituting the temperature-responsive polymer is supported. A method of polymerizing a monoma can be mentioned. In this method, for example, the catalyst and solvent exemplified in the above-mentioned ATRP method can be used. The temperature-responsive polymer may be grafted, for example, by synthesizing the temperature-responsive polymer and then reacting the temperature-responsive polymer with a polymer having a hydroxyl group.
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１００〜４００ｍｇの被覆層を備えることが好ましい。被覆層の量は熱分解の重量減少、アンスロン法等で測定することができる。 The separating material of the present embodiment preferably includes a coating layer of 100 to 400 mg per 1 g of the porous polymer particles. The amount of the coating layer can be measured by the weight reduction of thermal decomposition, the Anthrone method or the like.
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーで使用する場合、分離材の平均粒径は、カラム内圧の極端な増加を避け易い観点から、例えば、５０〜２００μｍであることが好ましい。 The average particle size of the separating material of the present embodiment is preferably 10 to 300 μm. When used in preparative or industrial chromatography, the average particle size of the separating material is preferably, for example, 50 to 200 μm from the viewpoint of easily avoiding an extreme increase in column internal pressure.
本実施形態の分離材の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性が向上し易い観点から、例えば、５〜１５％であってもよく、５〜１０％であってもよい。 The coefficient of variation (CV) of the particle size of the separating material of the present embodiment may be, for example, 5 to 15% or 5 to 10% from the viewpoint of easily improving the liquid permeability. good.
本実施形態の分離材の細孔径分布におけるモード径は、例えば、０．０５〜０．５０μｍであってもよく、０．０５μｍ以上０．５μｍ未満であってもよく、０．０５μｍ以上０．３μｍ未満であってもよい。細孔径分布におけるモード径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．５以下であると、比表面積が充分なものになり易い傾向にある。 The mode diameter in the pore size distribution of the separating material of the present embodiment may be, for example, 0.05 to 0.50 μm, may be 0.05 μm or more and less than 0.5 μm, and may be 0.05 μm or more and 0. It may be less than 3 μm. When the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.05 μm or more, substances tend to enter the pores easily, and when the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.5 or less, the specific surface area becomes sufficient. It tends to be easy.
本実施形態において、粒子（多孔質ポリマ粒子、分離材等）の比表面積、空隙率及び細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径）は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。 In the present embodiment, the specific surface area, porosity, and mode diameter (mode of pore diameter distribution, maximum frequency pore diameter) of particles (porous polymer particles, separating material, etc.) are determined by a mercury intrusion measuring device (the most frequent value of the pore diameter distribution, the maximum frequency pore diameter). Autopore: A value measured by Shimadzu Corporation), and is measured as follows. About 0.05 g of a sample is added to a standard 5 mL powder cell (stem volume 0.4 mL) and measured under the condition of an initial pressure of 21 kPa (about 3 psia, equivalent to a pore diameter of about 60 μm). The mercury parameters are set to the device default mercury contact angle of 130 ° and mercury surface tension of 485 days / cm. Further, each value is calculated by limiting the pore diameter to the range of 0.05 to 5 μm.
＜カラム充填材＞
本実施形態のカラム充填材は、本実施形態の分離材の上記官能基（アミノ基に対して反応性を有する官能基）に結合した、抗体を特異的に吸着する部位、を有するものである。このようなカラム充填材によれば、上記部位に吸着し得る抗体を、選択的に回収することができる。また、本実施形態のカラム充填材によれば、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れる。また、本実施形態のカラム分離材によれば、吸着させた抗体を温度変化により回収できることから、抗体の凝集物の発生を抑制し易いと考えられる。
<Column filler>
The column filler of the present embodiment has a site that specifically adsorbs an antibody, which is bound to the above-mentioned functional group (functional group having reactivity with an amino group) of the separating material of the present embodiment. .. According to such a column filler, the antibody that can be adsorbed on the above-mentioned site can be selectively recovered. Further, according to the column filler of the present embodiment, the adsorbed antibody can be recovered by changing the temperature, and the adsorbability and recoverability of the antibody are excellent. Further, according to the column separating material of the present embodiment, since the adsorbed antibody can be recovered by changing the temperature, it is considered that it is easy to suppress the generation of antibody aggregates.
抗体を特異的に吸着する部位は、例えば、抗体を特異的に吸着する部位になり得る化合物を、上記官能基に対して反応させることにより導入できる。 The site that specifically adsorbs the antibody can be introduced, for example, by reacting the functional group with a compound that can be a site that specifically adsorbs the antibody.
上記官能基が、カルボキシ基である場合、抗体を特異的に吸着する部位は、例えば、カルボジイミド等の縮合材を介して、官能基と結合していてもよい。 When the functional group is a carboxy group, the site that specifically adsorbs the antibody may be bonded to the functional group via, for example, a condensing material such as carbodiimide.
上記官能基が、エポキシ基又は活性エステル基（例えば、ＮＨＳ基）である場合、例えば、抗体を特異的に吸着する部位になり得る化合物を含む緩衝液の中に、分離材を投入することにより、上記官能基と、抗体を特異的に吸着する部位とを結合し得る。 When the functional group is an epoxy group or an active ester group (for example, NHS group), for example, by putting the separating material into a buffer solution containing a compound that can be a site for specifically adsorbing an antibody. , The functional group can be bound to a site that specifically adsorbs an antibody.
抗体が特異的に吸着する部位は、例えば、プロテインＡ；ペプチド；５員又は６員の芳香族環；５員又は６員のヘテロ芳香族環；スルフィド基；スルホニル基；アミド基；アミノ酸；核酸；糖；シクロファン、カリックスアレン等の疎水性空間を有する環状化合物からなる群より選択される少なくとも一種の分子構造を有するモノマ；並びに、ベンゼン骨格、ピリジン骨格、ピラジン骨格、ピロール骨格、トリアジン骨格、ジアゾール骨格、及び、トリアゾール骨格からなる群より選択される少なくとも一種の骨格を有する分子であってもよい。ベンゼン骨格、ピリジン骨格、ピラジン骨格、ピロール骨格、トリアジン骨格、ジアゾール骨格、及び、トリアゾール骨格からなる群より選択される少なくとも一種の骨格を有する機能性分子は、タンパク、核酸等を標的物質とした場合に、多点結合による相互作用を形成させ易い傾向にある。 The site where the antibody is specifically adsorbed is, for example, protein A; peptide; 5- or 6-membered aromatic ring; 5- or 6-membered heteroaromatic ring; sulfide group; sulfonyl group; amide group; amino acid; nucleic acid. Sugars; monomas having at least one molecular structure selected from the group consisting of cyclic compounds having a hydrophobic space such as cyclophane and calix allene; as well as benzene skeletons, pyridine skeletons, pyrazine skeletons, pyrrol skeletons, triazine skeletons, It may be a molecule having at least one skeleton selected from the group consisting of a diazole skeleton and a triazole skeleton. When a functional molecule having at least one skeleton selected from the group consisting of a benzene skeleton, a pyridine skeleton, a pyrazine skeleton, a pyrrole skeleton, a triazine skeleton, a diazole skeleton, and a triazole skeleton is a target substance such as a protein or a nucleic acid. In addition, it tends to easily form an interaction due to multipoint coupling.
本実施形態の分離材及びカラム充填材を用いて分離する生体高分子としては、水溶性の物質が好ましい。具体的には、例えば、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質が挙げられる。これらの物質の分子量は、例えば、２００万以下であってもよく、５０万以下であってもよい。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材及びカラム充填材の性質、条件等を選んでもよい。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報に記載の方法が挙げられる。 A water-soluble substance is preferable as the biopolymer to be separated by using the separating material and the column filler of the present embodiment. Specific examples thereof include proteins such as blood proteins such as immunoglobulin. The molecular weight of these substances may be, for example, 2 million or less, or 500,000 or less. Further, according to a known method, the properties, conditions, etc. of the separating material and the column filler may be selected according to the isoelectric point of the protein, the ionization state, and the like. As a known method, for example, the method described in JP-A-60-169427 can be mentioned.
本実施形態の分離材及びカラム充填材は、カラムクロマトグラフィーで使用した場合、使用する溶出液の性質によらず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。本実施形態の分離材及びカラム充填材は、例えば、液体クロマトグラフィー用に用いられてもよい。 When the separating material and the column filler of the present embodiment are used in column chromatography, they are excellent in operability because there is almost no volume change in the column regardless of the nature of the eluate used. The separating material and column filler of the present embodiment may be used, for example, for liquid chromatography.
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）を１６ｇ、スパン８０を６ｇ、過酸化ベンゾイルを０．６４ｇ加え、分散相とした。また、０．５質量％のポリビニルアルコール水溶液を連続相として使用した。この連続相と分散相とをマイクロプロセスサーバーを使用して乳化した後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ別した後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子１を得た。
(Synthesis of Porous Polymer Particle 1)
16 g of divinylbenzene (manufactured by Nippon Steel & Sumikin Chemical Co., Ltd., trade name: DVB960) having a purity of 96%, 6 g of span 80, and 0.64 g of benzoyl peroxide were added to a 500 mL three-necked flask to prepare a dispersed phase. Moreover, 0.5 mass% of polyvinyl alcohol aqueous solution was used as a continuous phase. The continuous phase and the dispersed phase were emulsified using a microprocess server, and then the obtained emulsion was transferred to a flask and stirred using a stirrer for about 8 hours while heating in a water bath at 80 ° C. The obtained particles were filtered off and then washed with acetone to obtain porous polymer particles 1.
（多孔質ポリマ粒子２の合成）
スパン８０の量を７ｇに変更したこと以外は、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子２を得た。
(Synthesis of Porous Polymer Particles 2)
Porous polymer particles 2 were obtained in the same manner as the porous polymer particles 1 except that the amount of the span 80 was changed to 7 g.
（多孔質ポリマ粒子３の合成）
スパン８０の量を８ｇに変更したこと以外は、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子３を得た。
(Synthesis of Porous Polymer Particles 3)
Porous polymer particles 3 were obtained in the same manner as in the porous polymer particles 1 except that the amount of the span 80 was changed to 8 g.
（実施例１）
デキストラン（Ｍｗ：１００万）水溶液（２質量％）１００ｍＬに、水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．４ｇを加え、７０℃で１２時間反応させ、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをメタノールで再沈殿させ、洗浄した後、２０ｍｇ／ｍＬの変性デキストラン水溶液を調製した。
(Example 1)
To 100 mL of an aqueous solution of dextran (Mw: 1 million) (2% by mass), 4 g of sodium hydroxide and 0.4 g of glycidyl phenyl ether were added and reacted at 70 ° C. for 12 hours to introduce a phenyl group into dextran. The obtained modified dextran was reprecipitated with methanol, washed, and then a 20 mg / mL modified dextran aqueous solution was prepared.
調製した変性デキストラン水溶液７００ｍＬに、１０ｇの多孔質ポリマ粒子１を投入し、５５℃で６時間攪拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性デキストランを吸着させた。変性デキストランが吸着した粒子をろ別して、更に熱水で洗浄した。 10 g of the porous polymer particles 1 were added to 700 mL of the prepared modified dextran aqueous solution, and the mixture was stirred at 55 ° C. for 6 hours to adsorb the modified dextran particles on the porous polymer particles 1. The particles adsorbed by the modified dextran were filtered off and further washed with hot water.
変性デキストランは次のようにして架橋した。変性デキストランが吸着した粒子１０ｇを、３５０ｇの０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、エピクロロヒドリンを１０ｇ添加し、１２時間室温にて攪拌して、水酸基を有する高分子の被覆粒子を得た。 The denatured dextran was crosslinked as follows. 10 g of particles adsorbed by modified dextran are dispersed in 350 g of 0.4 M aqueous sodium hydroxide solution, 10 g of epichlorohydrin is added, and the mixture is stirred at room temperature for 12 hours to obtain polymer coated particles having a hydroxyl group. rice field.
（ＡＴＲＰ開始基の導入）
上記被覆粒子１０ｇに対して、トリエチルアミン０．１７ｇ、ブロモイソブチリルブロマイド０．３８ｇ、及びＤＭＦ６０ｍＬを加え、１２時間攪拌して、水酸基を有する高分子にＡＴＲＰ開始基を導入した。その後、得られた粒子を、アセトンで洗浄した。
(Introduction of ATRP starting group)
To 10 g of the coated particles, 0.17 g of triethylamine, 0.38 g of bromoisobutyryl bromide, and 60 mL of DMF were added, and the mixture was stirred for 12 hours to introduce an ATRP initiating group into a polymer having a hydroxyl group. Then, the obtained particles were washed with acetone.
（温度応答性ポリマのグラフト）
ＡＴＲＰ開始基を導入後の粒子１０ｇと、イソプピルアクリルアミド１１．１ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）１．９ｇ、２臭化銅６７０ｍｇ、トリスジメチルアミノエチルアミン３３５ｍｇ、及びＤＭＦ８０ｇとを混合した後、当該混合物を窒素でバブリングした。その後、１１９０ｍｇのアスコルビン酸を溶解させたＤＭＦ１００ｇを更に添加し、５時間重合させ、温度応答性ポリマをグラフトした。得られた粒子をろ別した後、ＤＭＦ及びアセトンで洗浄して、分離材を得た。得られた分離材について、粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。また、水銀圧入法にて分離材の細孔径（細孔径分布におけるモード径）を測定した。結果を表１に示す。
(Temperature-responsive polymer graft)
After mixing 10 g of particles after introducing the ATRP initiating group with 11.1 g of isoppilacrylamide, 1.9 g of N-acrylicoxysuccinimide (ANHS), 670 mg of copper bromide, 335 mg of trisdimethylaminoethylamine, and 80 g of DMF, The mixture was bubbled with nitrogen. Then, 100 g of DMF in which 1190 mg of ascorbic acid was dissolved was further added, polymerized for 5 hours, and the temperature-responsive polymer was grafted. The obtained particles were filtered off and then washed with DMF and acetone to obtain a separating material. The particle size of the obtained separating material was measured with a flow-type particle size measuring device, and the average particle size and the particle size of C.I. V. The value was calculated. In addition, the pore diameter (mode diameter in the pore diameter distribution) of the separating material was measured by the mercury press-fitting method. The results are shown in Table 1.
（抗体を特異的に吸着する部位（抗体吸着部位）の結合）
０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム及び０．５Ｍ ＮａＣｌを混合しｐＨ８．３の水溶液を調製した。得られた水溶液に、プロテインＡを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、プロテインＡ溶液を得た。プロテインＡ溶液１ｍＬに対して、分離材１ｍＬを混合し、室温で６時間攪拌して、プロテインＡを分離材の官能基に結合させた。その後、１Ｍのエタノールアミン水溶液（ｐＨ８）中で６時間攪拌し、ブロッキングすることにより、カラム充填材を得た。
(Binding of the site that specifically adsorbs the antibody (antibody adsorption site))
0.2M sodium hydrogen carbonate and 0.5M NaCl were mixed to prepare an aqueous solution having a pH of 8.3. Protein A was dissolved in the obtained aqueous solution at a concentration of 10 mg / mL to obtain a protein A solution. 1 mL of the separating material was mixed with 1 mL of the protein A solution, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours to bond protein A to the functional group of the separating material. Then, the mixture was stirred in 1 M aqueous ethanolamine solution (pH 8) for 6 hours and blocked to obtain a column filler.
（抗体の吸着評価）
得られたカラム充填材１ｍＬを２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７（ＮａＣｌ １５０ｍＭ含む）１０ｍＬに分散させた。得られた分散液とは別に、上記リン酸緩衝液に、γ−グロブリン（ＩｇＧ）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で混合したＩｇＧ溶液を得た。次いで、上記分散液に対して、ＩｇＧ溶液１０ｍＬを混合し、６時間攪拌した後、溶液の吸光度からＩｇＧ吸着量を算出した。その後、溶液の温度を３５℃に昇温し、１時間攪拌後、溶液中のＩｇＧ濃度を算出し、回収率を算出した。
(Evaluation of antibody adsorption)
1 mL of the obtained column filler was dispersed in 10 mL of 20 mM phosphate buffer pH 7 (including 150 mM NaCl). Separately from the obtained dispersion, an IgG solution was obtained in which γ-globulin (IgG) was mixed with the above phosphate buffer at a concentration of 20 mg / mL. Next, 10 mL of the IgG solution was mixed with the above dispersion, and after stirring for 6 hours, the amount of IgG adsorbed was calculated from the absorbance of the solution. Then, the temperature of the solution was raised to 35 ° C., and after stirring for 1 hour, the IgG concentration in the solution was calculated, and the recovery rate was calculated.
（実施例２）
温度応答性ポリマのグラフトにおいて、イソプピルアクリルアミドの量を１６．５ｇに、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）の量を２．９ｇに、それぞれ変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 2)
In the graft of the temperature-responsive polymer, the amount of isoppilacrylamide was changed to 16.5 g, and the amount of N-acrylic oxysuccinimide (ANHS) was changed to 2.9 g, respectively, in the same manner as in Example 1. Column fillers were prepared and evaluated.
（実施例３）
温度応答性ポリマのグラフトにおいて、イソプピルアクリルアミドの量を２２．２ｇに、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）の量を３．８ｇに、それぞれ変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 3)
In the graft of the temperature-responsive polymer, the amount of isoppilacrylamide was changed to 22.2 g, and the amount of N-acrylic oxysuccinimide (ANHS) was changed to 3.8 g, respectively, in the same manner as in Example 1. Column fillers were prepared and evaluated.
（実施例４）
温度応答性ポリマのグラフトにおいて、イソプピルアクリルアミドの量を１６．３ｇに変更したこと、及びＮ−アクリルオキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）に代えて４−ヒドロキシブチル アクリレート グリシジルエーテル（ＢＧＭＡ）３．２ｇを使用したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 4)
In the graft of the temperature responsive polymer, the amount of isoppilacrylamide was changed to 16.3 g and 3.2 g of 4-hydroxybutyl acrylate glycidyl ether (BGMA) was used in place of N-acrylic oxysuccinimide (ANHS). Except for this, a column filler was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1.
（実施例５）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子２に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 5)
A column filler was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that the porous polymer particles 1 were changed to the porous polymer particles 2.
（実施例６）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子３に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 6)
A column filler was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that the porous polymer particles 1 were changed to the porous polymer particles 3.
（実施例７）
デキストランを、アガロース（Ｍｗ：１０万）に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Example 7)
A column filler was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that the dextran was changed to agarose (Mw: 100,000).
（実施例８）
変性デキストランをポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（日本合成化学工業株式会社製、商品名：ゴーセノールＧＨ−２３）に変更したこと及び架橋処理をしなかったこと以外は、実施例１と同様にしてカラム充填材を作製し、評価した。
(Example 8)
Column filler in the same manner as in Example 1 except that the modified dextran was changed to polyvinyl alcohol (PVA) (manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., trade name: Gosenol GH-23) and no cross-linking treatment was performed. Was prepared and evaluated.
（実施例９）
１０ｇの多孔質ポリマ粒子１と、０．１ｍｍｏｌのチオグリセロールと、１ｍｍｏｌのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を、１００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に添加し、７０℃で１２時間攪拌した。得られた粒子をアセトンで洗浄した。洗浄後の粒子１０ｇと、イソブチリルブロマイド１ｇと、ＤＭＦ ５０ｇと、トリエチルアミン０．５ｇと、を室温で３時間攪拌して、Ｂｒ開始基が導入された粒子を得た後、当該粒子をアセトンで洗浄した。洗浄後の粒子１０ｇを、グリセリンモノメタクリレート（ＧＭＡ）１３ｇと、二臭化銅６７０ｍｇと、トリスジメチルアミノエチルアミン３３５ｍｇと、ＤＭＦ８０ｇとの混合液中に添加した後、窒素でバブリングした。その後、１１９０ｍｇのアスコルビン酸を溶解させたエタノール２００ｇを、更に添加し、５時間重合した。重合後の粒子をろ別して、ＤＭＦにて洗浄した。これにより、多孔質ポリマ粒子に水酸基を有する高分子をグラフトした。グラフト後の粒子１０ｇを、０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３５０ｇに分散させた後、更にエピクロロヒドリンを１０ｇ添加し、室温で１２時間攪拌して、エポキシ基を導入した。得られた粒子をろ別した後、２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液及び水で洗浄して、水酸基を有する高分子の被覆粒子を得た。
(Example 9)
10 g of porous polymer particles 1, 0.1 mmol of thioglycerol and 1 mmol of azobisisobutyronitrile (AIBN) were added to 100 mL of N, N-dimethylformamide (DMF) and at 70 ° C. for 12 hours. Stirred. The resulting particles were washed with acetone. The washed particles (10 g), isobutyryl bromide (1 g), DMF (50 g), and triethylamine (0.5 g) are stirred at room temperature for 3 hours to obtain particles into which Br-initiating groups have been introduced, and then the particles are subjected to acetone. Washed with. 10 g of the washed particles were added to a mixed solution of 13 g of glycerin monomethacrylate (GMA), 670 mg of copper dibromide, 335 mg of trisdimethylaminoethylamine, and 80 g of DMF, and then bubbling with nitrogen. Then, 200 g of ethanol in which 1190 mg of ascorbic acid was dissolved was further added, and the mixture was polymerized for 5 hours. The polymerized particles were filtered off and washed with DMF. As a result, a polymer having a hydroxyl group was grafted onto the porous polymer particles. After 10 g of the grafted particles were dispersed in 350 g of a 0.4 M aqueous sodium hydroxide solution, 10 g of epichlorohydrin was further added, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours to introduce an epoxy group. The obtained particles were filtered off and then washed with 2% by mass of a hot sodium dodecyl sulfate aqueous solution and water to obtain polymer-coated particles having a hydroxyl group.
水酸基を有する高分子の被覆粒子として上記粒子を用い、これに対して温度応答性ポリマのグラフトさせたこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。 A column filler was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that the above particles were used as the coating particles of the polymer having a hydroxyl group and grafted with a temperature-responsive polymer.
（比較例１）
温度応答性ポリマのグラフトにおいて、イソプピルアクリルアミドを用いなかったこと、及びＮ−アクリルオキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）の量を１３ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様にして、カラム充填材を作製し、評価した。
(Comparative Example 1)
A column filler was prepared in the same manner as in Example 1 except that isoppilacrylamide was not used in the graft of the temperature responsive polymer and the amount of N-acrylic oxysuccinimide (ANHS) was changed to 13 g. And evaluated.
（比較例２）
実施例１と同様にして、変性デキストランを吸着し、架橋して、水酸基を有する高分子の被覆粒子を得た。架橋後の溶液に、エチレングリコールジグリシジルエーテル１０ｇを加え、１２時間攪拌することにより、被覆粒子にエポキシ基を導入した。続いて、エポキシ基に、プロテインＡを固定化させた後、ブロッキングを施し、カラム充填材を得た。なお、プロテインＡの固定化及びブロッキングの条件は実施例１と同様にした。得られたカラム充填剤を用いて、実施例１と同様に評価した。
(Comparative Example 2)
In the same manner as in Example 1, the modified dextran was adsorbed and crosslinked to obtain polymer-coated particles having a hydroxyl group. Epoxy groups were introduced into the coated particles by adding 10 g of ethylene glycol diglycidyl ether to the crosslinked solution and stirring for 12 hours. Subsequently, protein A was immobilized on the epoxy group and then blocked to obtain a column filler. The conditions for immobilization and blocking of protein A were the same as in Example 1. The obtained column packing material was used and evaluated in the same manner as in Example 1.
（比較例３）
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア製）を比較粒子１として準備した。比較粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。結果を表１に示す。比較粒子１をそのままカラム充填材として、実施例１と同様に評価した。
(Comparative Example 3)
Mabselect SuRe (manufactured by GE Healthcare) was prepared as Comparative Particle 1. The particle size of the comparative particle 1 was measured with a flow-type particle size measuring device, and the average particle size and the particle size of C.I. V. The value was calculated. The results are shown in Table 1. The comparative particles 1 were evaluated as they were as the column filler in the same manner as in Example 1.
各実施例及び比較例における分離材の構成及び評価結果を表２に示す。なお、実施例１〜９において、表２中の水酸基を有する高分子にグラフトしているポリマは、温度応答性ポリマである。また、表２中の水酸基を有する高分子にグラフトしているポリマの重量平均分子量は、例えば、熱重量分析により算出できる。 Table 2 shows the composition and evaluation results of the separating materials in each Example and Comparative Example. In Examples 1 to 9, the polymer grafted on the polymer having a hydroxyl group in Table 2 is a temperature-responsive polymer. Further, the weight average molecular weight of the polymer grafted on the polymer having a hydroxyl group in Table 2 can be calculated by, for example, thermogravimetric analysis.
表２に示すとおり、実施例のカラム充填材は、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れることがわかる。すなわち、本実施形態の分離材及びカラム充填材は、吸着させた抗体を温度変化により回収できると共に、抗体の吸着性及び回収性に優れたものであり得ることを確認した。 As shown in Table 2, it can be seen that the column filler of the example can recover the adsorbed antibody by changing the temperature, and is excellent in the adsorptivity and recoverability of the antibody. That is, it was confirmed that the separating material and the column filler of the present embodiment can recover the adsorbed antibody by changing the temperature, and can be excellent in the adsorptivity and recoverability of the antibody.
Claims (6)
前記多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、
前記被覆層が、水酸基を有する高分子に、温度応答性ポリマがグラフトしているグラフトポリマを含み、
前記水酸基を有する高分子が、アガロース、デキストラン、ポリグリセリンモノメタクリレート及びこれらの変性体からなる群より選ばれる少なくとも一種であり、
前記温度応答性ポリマが、イソプロピルアクリルアミドをモノマ単位として含み、かつ、アミノ基に対して反応性を有する官能基を有し、
前記官能基が、活性エステル基、カルボキシ基又はエポキシ基である、分離材。 Porous polymer particles containing a polymer containing a styrene-based polymer as a monoma unit,
A coating layer that covers at least a part of the surface of the porous polymer particles is provided.
The coating layer contains a graft polymer obtained by grafting a temperature-responsive polymer to a polymer having a hydroxyl group.
The polymer having a hydroxyl group is at least one selected from the group consisting of agarose, dextran, polyglycerin monomethacrylate and modified products thereof.
The temperature-responsive polymer comprises isopropyl acrylamide as monomer units, and have a functional group reactive with an amino group,
The functional group is an active ester group, Ru carboxy group or an epoxy group der, separation material.
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