JP6914838B2 - 迅速な細菌感染診断のための診断システムとプロセス - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５条§１１９（ｅ）の下に２０１４年９月１６日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６２／０５１，０９９号 発明の名称：「迅速な細菌感染診断のための診断システムとプロセス」の優先権を主張し、その開示は本願明細書に参照によって組み入れられる。
本願は、３５条§１１９（ｅ）の下に２０１５年９月８日に出願されたアメリカ合衆国仮出願６２／２１５，３７９号 発明の名称：「迅速な細菌感染診断のための診断システムとプロセス」の優先権を主張し、その開示は本願明細書に参照によって組み入れられる。

連邦支援研究または開発に関する陳述
本発明は、国立科学基金から許可番号１１２５５３５号で財政援助を得てなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明の幾分かの権利を保有する。

一世紀以上にわたり、細菌感染のための主要な臨床同定法は、細菌を栄養系寒天培地を用いて一晩単離および精製するプレート培養であった。迅速で自動化された器具は、細菌同定を進めるための次のステップとして広く考えられているが、これらの装置は、プレート培養から得られる純粋なバクテリアコロニーを依然として必要とするため、同定が行われる前に少なくとも１８−２４時間のリードタイムが必要である（Cherkaoui, A., et al., Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level. J Clin Microbiol, 2010. 48(4): p. 1169-75. Holland, R.D., et al., Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1996. 10(10): p. 1227-1232.)。
同様に、ポリメラーゼ連鎖反応などの分子診断法は、純粋な細菌コロニーおよび数時間の処理を必要とする(Meng, J., et al., Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157: H7. Int J Food Microbiol, 1996. 32(1-2): p. 103-13.)。その結果、臨床関連細菌種の迅速なスクリーニングは、より迅速なポイントオブケア診断を求める病院にとって魅力的な選択肢となっている。緑膿菌やその他の臨床関連バクテリアの迅速なスクリーニングにより、医師に広範囲の抗生物質から特異的な治療法に切り替え、病院支出を減らし、薬剤耐性を最小限に抑え、患者ケアの結果を改善することができる（Trenholme, G.M., et al., Clinical impact of rapid identification and susceptibility testing of bacterial blood culture isolates. J Clin Microbiol, 1989. 27(6): p. 1342-5.）。

さらに、抗生物質が細菌に対して及ぼす影響を監視する能力は、感染制御にとって重要である。抗生物質効能を決定するための従来のアプローチでは、一連の濃度で抗生物質カクテルを選択した培養プレートを作成する必要がある(J. M. Andrews, J. Antimicrob Chemother, 2001, 48, 5-16.)。培養後（株によって２４時間またはそれ以上）、プレートを増殖のために視覚的に検査する。最小阻害濃度（ＭＩＣ）として知られる特定の濃度で、細菌の増殖は観察されない。この濃度はその後、患者のための抗生物質スケジュールを設計するために使用される。この効果的なアプローチは、培養プレートを作成するのに必要な大量の試薬の使用を必要とする。さらに、これらのスクリーニングは、プランクトン細胞増殖に対する抗生物質の有効性を測定するだけであり、バイオフィルムの除去ではなく、それは、一般に感染に関連し、処置するのがはるかに困難である(P. K. Singh, A. L. Schaefer, M. R. Parsek, T. O. Moninger, M. J. Welsh and E. P. Greenberg, Nature, 2000, 407, 762-764. C. F. Schierle, M. De la Garza, T. A. Mustoe and R. D. Galiano, Wound Repair Regen, 2009, 17, 354-359.)。

代替案は結合マイクロ流体工学で、抗生物質スクリーニングで細菌を増殖させる。Ｋｉｍら（２０１２）は、微小流体システムを利用して、１つのチップ上の８つの異なる濃度の抗生物質に大腸菌のバイオフィルムを同時に曝露した(J. Kim, M. Hegde, S. H. Kim, T. K. Wood and A. Jayaraman, Lab Chip, 2012, 12, 1157-1163.)。マイクロ流体デバイスに固有の小さな体積は、複数の濃度勾配を生成する能力と共に、現在の抗生物質感受性試験のより速くより安価な代替物を提供した。増殖したバイオフィルム上に抗生物質を流すことにより、研究者は生体内の状態をより詳細にシミュレートした。現在の多くのマイクロ流体研究は、抗生物質への曝露中の蛍光タンパク質の存在に基づいてバイオフィルムの生存率を決定する(J. Kim, H. D. Park and S. Chung, Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation, Molecules, 2012, 17, 9818-9834. K. P. Kim, Y. G. Kim, C. H. Choi, H. E. Kim, S. H. Lee, W. S. Chang and C. S. Lee, Lab Chip, 2010, 10, 3296-3299.)。

これらの方法は確かに強固で有望である一方で、蛍光信号は高価な光学機器および遺伝子学的に変性した細菌または選択ラベルを必要とする(L. Richter, C. Stepper, A. Mak, A. Reinthaler, R. Heer, M. Kast, H. Bruckl and P. Ertl, Lab Chip, 2007, 7, 1723-1731. H.-Y. N. Holman, R. Miles, Z. Hao, E. Wozei, L. M. Anderson and H. Yang, Anal Chem, 2009, 81, 8564-8570. Y. Yawata, K. Toda, E. Setoyama, J. Fukuda, H. Suzuki, H. Uchiyama and N. Nomura, J Biosci Bioeng, 2010, 110, 130-133. Y. Yawata, K. Toda, E. Setoyama, J. Fukuda, H. Suzuki, H. Uchiyama and N. Nomura, J Biosci Bioeng, 2010, 110, 377-380.)。抗生物質への曝露下でのバイオフィルム中の生存細胞の相対量を決定するより安価で簡単な方法は、系の電気化学的反応をモニターすることによって達成し得る。強力な細菌のバイオフィルムは、コミュニケーションを促進し、コロニーを防御し、感染を引き起こす過剰の分子を産生する(M. B. Miller and B. L. Bassler, Annu Rev Microbiol, 2001, 55, 165-199. M. D. P. Willcox, H. Zhu, T. C. R. Conibear, E. B. H. Hume, M. Givskov, S. Kjelleberg and S. A. Rice, Microbiology, 2008, 154, 2184-2194. G. W. Lau, D. J. Hassett, H. Ran and F. Kong, Trends Mol Med, 2004, 10, 599-606.)。電気化学的方法で検出できる、バイオフィルムの条件についての情報を提供する分子に興味がある。

本発明は、緑膿菌の存在による細菌感染の即時同定のための簡単で安価な代替手段を提供する電気化学的方法およびデバイスに関する。いくつかの実施態様において、安価で使い捨ての電気化学センサは、臨床的な創傷排液試料中の緑膿菌の存在を迅速にスクリーニングするために使用することができる。この技術は緑膿菌の迅速なポイントオブケア診断に組み込むことができ、より良い抗菌管理と患者ケア結果の改善を可能にする。

当該方法およびデバイスの他の側面は以下を含有する：
１．患者における緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ）細菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法であって、
（ａ）患者からの流体試料を作用電極および参照電極を含有するマイクロ流体デバイスに導入すること、
（ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するために電気化学的測定を行うこと、
（ｃ）ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
ここで、流体試料中のピオシアニン濃度が、バイオフィルムの生存率の尺度を提供する、前記方法。
２．ステップ（ｃ）で決定されたピオシアニン濃度に基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の生存細胞数を推定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
３．ピオシアニンの濃度が、作用電極を通る電流の線形関係に基づいて、ステップ（ｃ）において測定される、項目１または２に記載の方法。
４．ピオシアニン濃度（μＭ）が作用電極を通る電流（μＡ）を０．１８で除した電流値に等しい、項目３に記載の方法。
５．作用電極を通る電流が１μＡ未満の場合、ピオシアニン濃度が０とみなされる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。

６．作用電極を通る電流が１μＡ未満の場合、バイオフィルムが非生存または不存在とみなされる、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
７．電気化学的測定が、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択される、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
８．電気化学的測定が矩形波ボルタンメトリーであり、電流が１以上の矩形波電位に応答して測定される、項目７に記載の方法。
９．マイクロ流体デバイスは第２の作用電極を含み、
作用電極は酸化電極および還元電極の一方であり、第２作用電極は酸化電極および還元電極の他方であり、
ピオシアニンの濃度は、酸化電極および還元電極を通る電流として決定される、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ピオシアニンを酸化電極で酸化するのに適した電位およびピオシアニンを還元電極で還元するのに適した電位を印加するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。

１１．酸化電極と還元電極が約２００〜１００ｎｍの距離だけ離間している、項目９〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．１０μＬ以下の流体試料体積が導入される、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．ステップ（ａ）において、流体試料をマイクロ流体デバイスに連続的に導入することを含む、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
１５．ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が少なくとも６時間ごとに繰り返される、項目１４に記載の方法。

１６．流体試料をデバイスへくみ出すためにマイクロ流体デバイスの入口またはその近傍にキャピラリまたは芯材を配置する、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．マイクロ流体デバイスは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能なポテンシオスタットと通信する、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．マイクロ流体デバイスがポテンシオスタットにケーブルで接続可能である、項目１７に記載の方法。
１９．マイクロ流体デバイスが使い捨てである項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．マイクロ流体デバイスが患者によって着用されるか、または患者に埋め込まれる、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。

２１．マイクロ流体デバイスが創傷被覆材、または創傷被覆材用の吸収パッド内あるいは近傍に埋め込まれる、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．マイクロ流体デバイスが創傷被覆材、包帯、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスク、顔面マスク、外科用マスク、または挿管チューブに存在する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
２３．マイクロ流体デバイスがコンタクトレンズケース、尿収集カップ、または尿バッグに存在する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
２４．マイクロ流体デバイスが遠隔モニタリング・ステーションと無線で通信する、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．流体試料が、嚢胞性線維症、人工呼吸器関連肺炎、慢性創傷、火傷、外科用インプラント、または手術部位を有するヒト由来である、項目１〜２４のいずれかに記載の方法。

２６．流体試料が、創傷滲出液、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、髄液、涙および血液からなる群から選択される体液である、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
２７．患者における緑膿菌感染の抗生物質処置の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）患者からの流体試料を作用電極および参照電極を含むマイクロ流体デバイスに導入すること、
（ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うこと、および
（ｃ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、液体試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
ここで、流体試料中のピオシアニン濃度が、抗生物質処置の有効性の尺度を提供する、前記方法。
２８．ピオシアニンの濃度が閾値レベルを上回る場合、抗生物質の増加した用量を投与することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
２９．ピオシアニンの閾値レベルが少なくとも５μＭの濃度である、項目２８に記載の方法。
３０．ピオシアニンの濃度が所定の時間間隔の後に閾値レベルを下回らない場合、抗生物質の増加した用量を投与することをさらに含む、項目２７に記載の方法。

３１．所定の時間間隔が少なくとも１２時間である、項目３０に記載の方法。
３２．ピオシアニンの閾値レベルが少なくとも５μＭの濃度である、項目３０または３１に記載の方法。
３３．ピオシアニンの濃度が閾値レベル未満に低下した場合、減少された用量の抗生物質を投与するか、または抗生物質を停止させることをさらに含む、項目２７に記載の方法。
３４．ピオシアニンの閾値レベルが少なくとも５μＭの濃度である、項目３３に記載の方法。
３５．抗生物質が硫酸コリスチンまたはシプロフロキサシンである、項目２７〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．さらに追加の抗菌剤またはその他の薬剤を投与することを含む、項目２７〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．ステップ（ｂ）において、流体試料をマイクロ流体デバイスに連続的に導入する、項目２７〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、項目２７〜３６のいずれかに記載の方法。

３９．ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を少なくとも６時間ごとに繰り返す、項目３８に記載の方法。
４０．電気化学的測定が、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択される、項目２７〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．電流が１以上の矩形波電位に応答して測定される、項目４０に記載の方法。
４２．マイクロ流体デバイスは第２の作用電極を含み、
作用電極は酸化電極および還元電極の一方であり、第２作用電極は酸化電極および還元電極の他方であり、
ピオシアニンの濃度は、酸化電極および還元電極を通る電流として決定される、項目２７〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．ピオシアニンを酸化電極で酸化するのに適した電位およびピオシアニンを還元電極で還元するのに適した電位を印加するステップをさらに含む、項目４２に記載の方法。
４４．酸化電極と還元電極が約２００〜１００ｎｍの距離だけ離間している、項目４２または４３に記載の方法。

４５．流体試料をデバイスへくみ出すためにマイクロ流体デバイスの入口またはその近傍にキャピラリまたは芯材を配置する、項目２７〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．マイクロ流体デバイスは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能なポテンシオスタットと通信する、項目２７〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．マイクロ流体デバイスがポテンシオスタットにケーブルで接続可能である、項目４６に記載の方法。
４８．マイクロ流体デバイスが使い捨てである項目２７〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．マイクロ流体デバイスが患者によって着用されるか、または患者に埋め込まれる、項目２７〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．マイクロ流体デバイスが創傷被覆材、または創傷被覆材用の吸収パッド内または近傍に埋め込まれる、項目２７〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．マイクロ流体デバイスが創傷被覆材、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスク、または挿管チューブに存在する、項目２７〜４９のいずれかに記載の方法。

５２．マイクロ流体デバイスがコンタクトレンズケース、尿収集カップ、または尿バッグに存在する、項目２７〜４８のいずれかに記載の方法。
５３．マイクロ流体デバイスが遠隔モニタリング・ステーションと無線で通信する、項目２７〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．流体試料が、嚢胞性線維症、人工呼吸器関連肺炎、慢性創傷、火傷、外科用インプラント、または手術部位を有するヒト由来である、項目２７〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．流体試料が、創傷滲出液、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、髄液、涙および血液からなる群から選択される体液である、項目２７〜５４のいずれかに記載の方法。
５６．緑膿菌を含むバイオフィルムに対する抗生物質の有効性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）作用電極および参照電極を含むマイクロ流体デバイス内の増殖チャンバ内に緑膿菌を含む試料を導入することと、
（ｂ）緑膿菌を増殖させて増殖チャンバ内にバイオフィルムを形成させること、
（ｃ）選択された濃度の抗生物質をデバイスの増殖チャンバに導入すること、
（ｄ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うこと、
（ｅ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を使用することによって試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
ここで、閾値未満のピオシアニンの濃度は抗生物質の有効性を示す、
前記方法。

５７．閾値レベルが少なくとも５μＭの濃度を含む、項目５６に記載の方法。
５８．ピオシアニンの濃度が閾値レベルを超え、当該閾値レベルが少なくとも５μＭの濃度を含む場合、緑膿菌の存在の指標を提供することをさらに含む、項目５６または５７に記載の方法。
５９．ピオシアニンの濃度に基づいて緑膿菌の細胞数を推定することをさらに含む、項目５６〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．ステップ（ａ）が、緑膿菌を含む試料を、マイクロ流体デバイス内の複数の増殖チャンバに導入することを含む、項目５６〜５９のいずれかに記載の方法で、ステップ（ｃ）は、複数の濃度の抗生物質の有効性をスクリーニングするために、選択された異なる濃度の抗生物質を各増殖チャンバに同時に導入することを含む、前記方法。

６１．抗生物質の異なる濃度でステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を繰り返すことを含む、項目５６〜６０のいずれかに記載の方法。
６２．ステップ（ｂ）において、抗生物質を増殖チャンバ内に連続的に導入することをさらに含む、項目５６〜６０のいずれかに記載の方法。
６３．電気化学的測定が、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択される、項目５６〜６２のいずれかに記載の方法。
６４．電流が１つ以上の矩形波電位に応答して測定される、項目６３に記載の方法。
６５．マイクロ流体デバイスは第２の作用電極を含み、
作用電極は酸化電極および還元電極の一方であり、第２作用電極は酸化電極および還元電極の他方であり、
ピオシアニンの濃度は、酸化電極および還元電極を通る電流として決定される、項目５６〜６２のいずれかに記載の方法。

６６．ピオシアニンを酸化電極で酸化するのに適した電位およびピオシアニンを還元電極で還元するのに適した電位を印加するステップをさらに含む、項目６５に記載の方法。
６７．酸化電極と還元電極が約２００〜１００ｎｍの距離だけ離間している、項目６５または６６に記載の方法。
６８．流体試料をデバイスへくみ出すためにマイクロ流体デバイスの入口またはその近傍にキャピラリまたは芯材を配置する、項目５６〜６７のいずれかに記載の方法。
６９．マイクロ流体デバイスは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能なポテンシオスタットと通信する、項目５６〜６８のいずれかに記載の方法。
７０．マイクロ流体デバイスがポテンシオスタットにケーブルで接続可能である、項目６９に記載の方法。
７１．マイクロ流体デバイスが使い捨てである、項目５６〜７０のいずれかに記載の方法。

７２．患者における緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ）細菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法であって、
（ａ）流体試料を作用電極および参照電極を含有するマイクロ流体デバイスに導入すること、
（ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するために電気化学的測定を行うこと、
（ｃ）ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
ここで、流体試料中のピオシアニン濃度が、バイオフィルムの生存率の尺度を提供する、前記方法。
７３．マイクロ流体デバイスが、コンタクトレンズケース、尿バッグ、尿収集カップ、投薬ポンプ、水パイプ、バイオリアクター、または水ポンプに配置されている、項目７２に記載の方法。
７４．電気化学的測定が、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択される、項目７２または７３に記載の方法。
７５．電気化学的測定が矩形波ボルタンメトリーであり、電流が１以上の矩形波電位に応答して測定される、項目７４に記載の方法。

７６．マイクロ流体デバイスは第２の作用電極を含み、
作用電極は酸化電極および還元電極の一方であり、第２作用電極は酸化電極および還元電極の他方であり、
ピオシアニンの濃度は、酸化電極および還元電極を通る電流として決定される、項目７２〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．ピオシアニンを酸化電極で酸化するのに適した電位およびピオシアニンを還元電極で還元するのに適した電位を印加することをさらに含む、項目７６に記載の方法。
７８．酸化電極および還元電極が約２００〜１００ｎｍの距離だけ離間されている、項目７６または７７に記載の方法。
７９．流体試料をデバイス内にくみ出すために、キャピラリまたは芯材が、マイクロ流体デバイスの入口またはその近傍に配置される、項目７２〜７８のいずれかに記載の方法。
８０．マイクロ流体デバイスが、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能なポテンシオスタットと通信する、項目７２〜７９のいずれかに記載の方法。
８１．マイクロ流体デバイスが、ケーブルによってポテンシオスタットに接続可能である、項目８０に記載の方法。

８２．マイクロ流体デバイスが使い捨てである、項目７６〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニターするためのデバイスであって、
基板に配置されたマイクロ流体またはナノ流体チャネル、マイクロ流体またはナノ流体チャネル内に配置された作用電極と、マイクロ流体またはナノ流体チャネル内に配置された参照電極とを含む、マイクロ流体またはナノ流体電極アセンブリを含むセンサと、
プロセッサとメモリを含む制御システムであって、メモリに保存される機械可読命令は、プロセッサによって実行されると、前記作用電極および前記参照電極における電圧を制御し、既知の濃度のピオシアニンと作用電極を通る電流との間の予め決定された相関関係を使用することによって、マイクロ流体またはナノ流体における流体試料中のピオシアニンの濃度を決定する、前記制御システムとを含む前記デバイス。
８４．約５μＭ〜約１ｍＭの範囲にわたるピオシアニンの濃度の指標を提供するように動作可能である、項目８３に記載のデバイス。
８５．ピオシアニン濃度が約５μＭからピオシアニンの溶解度限界までの範囲にわたるピオシアニンの濃度の指標を提供するように動作可能である、項目８４に記載のデバイス。
８６．ピオシアニンの濃度が約５μＭの閾値レベルを上回るとき、コントローラは、緑膿菌の存在の指標を提供するように動作可能である、項目８３〜８５のいずれかに記載のデバイス。

８７．コントローラが、決定されたピオシアニンの濃度に基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の細胞数を決定するように動作可能である、項目８３〜８６のいずれかに記載のデバイス。
８８．ピオシアニンの濃度が、作用電極を通る電流のメモリに記憶された線形関係から決定される、項目８３〜８７のいずれかに記載のデバイス。
８９．μＭ単位のピオシアニンの濃度が、作用電極を通るμＡ単位の電流を０．１８で除した値に等しい、項目８８に記載のデバイス。
９０．制御システムが、プロセッサおよびセンサと通信するポテンシオスタットをさらに含み、ポテンシオスタットは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能である、項目８３〜８９のいずれかに記載のデバイス。
９１．ポテンシオスタットは、ハードワイヤード接続、取り外し可能なケーブル、または無線接続を介してプロセッサと通信する、項目９０に記載のデバイス。
９２．ポテンシオスタットが電池式である、項目９１に記載のデバイス。
９３．センサが使い捨てであり、ケーブルによってポテンシオスタットに接続可能である、項目８３〜９２のいずれかに記載のデバイス。

９４．コントローラは、矩形波ボルタンメトリー、線形スイープボルタンメトリー、階段ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、クロノアンペロメトリーからなる群から選択される電気化学的測定を行うように動作可能である、項目８３〜９３のいずれかに記載のデバイス。
９５．電流が、１以上の矩形波電位に応答して測定される、項目９４に記載のデバイス。
９６．コントローラと通信するディスプレイをさらに含み、前記ディスプレイは、決定されたピオシアニン濃度、緑膿菌の存在の指標、および緑膿菌細胞数の指標のうちの１以上を表示するように動作可能である、項目８３〜９５のいずれかに記載のデバイス。
９７．センサが、創傷被覆材に埋め込まれているか、または創傷被覆材のための吸収パッドの内部または近傍に埋め込まれている、項目８３〜９６のいずれかに記載のデバイス。
９８．センサが創傷被覆材、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスト、挿管チューブ、またはコンタクトレンズケースに存在する、項目８３〜９６のいずれかに記載のデバイス。
９９．コントローラが電気通信ネットワーク接続をさらに含有する、項目８３〜９９のいずれかに記載のデバイス。

本発明は、添付する以下の図面を併せて受け入れ以下の詳細な記載からより十分に理解されるであろう。
図１は、小体積分析のためのメッシュ変性した使い捨てのスクリーン印刷した電極センサを示す。 図２は、ピオシアニンのピークが試料中の緑膿菌の存在を示す矩形波ボルタモグラムのグラフである。 図３は、創傷流体滲出液の一連の矩形波ボルタモグラムを示す。 図４は、図３の創傷流体滲出液のベースラインを差し引いた矩形波ボルタモグラムを示す。 図５は、ベースラインを差し引く前（左）と後（右）の試験された２つの異なる体積の創傷流体滲出液の矩形波ボルタモグラムを示す。 図６は、ネガティブコントロール（左）、ポジティブコントロール（中）、および異なる体積でのポジティブコントロール（右）の創傷流体滲出液の矩形波ボルタモグラムを示す。 図７は、ネガティブコントロール（左）、ポジティブコントロール（中）、および異なる体積でのポジティブコントロール（右）の図６の創傷流体滲出液のベースラインを差し引いた矩形波ボルタモグラムを示す。 図８は、小体積分析のための電極センサの上に配置された膜メッシュの明視野画像である。

図９Ａは、緑膿菌バイオフィルムの感受性をモニタリングするに際して使用された実験装置を示す。Ａ）ポテンシオスタットに接続された完成デバイス。入口と出口には、ＰＡ１４が溝を残すことを防止するために、フィルタ（孔径０．２μｍ）を含む。 図９Ｂは、緑膿菌バイオフィルムの感受性をモニタリングするに際して使用された実験装置を示す。Ｂ）ミクロ流体チャンバでカバーされたセンサの概略図（薄片が剥がれないように）。細菌は流体が出入りする間にチャンバ内に捕捉される。 図９Ｃは、緑膿菌バイオフィルムの感受性をモニタリングするに際して使用された実験装置を示す。Ｃ）停滞した条件下で一晩増殖させた後の炭素作用電極の上に増殖したＰＡ１４の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）。対照、作用、および対電極（それぞれＲＥ、ＷＥ、およびＣＥ） 図１０は、Ａ）０時間、Ｂ）１２時間、Ｃ）２２時間、Ｄ）３５時間、Ｅ）４０時間、およびＦ）４５時間後の一晩培養物２４μＬを負荷した後のトリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中で培養したＰＡ１４および大腸菌（それぞれ実線および破線）の矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）を示す。新鮮なＴＳＢの１００ｎＬ／分での流れは２２時間で開始した。ＳＷＶスキャンは、１５Ｈｚの周波数および５０ｍＶの振幅電圧で−０．５〜０．２Ｖで実施した。 図１１Ａは、４８時間の実験中の選択された時点でのＰＡ１４バイオフィルムの応答を示す。左軸：０（右スラッシュ）、４（左スラッシュ、低ＭＩＣ）、１６（十字、高ＭＩＣ）、および１００ｍｇ／Ｌ（スラッシュ線なし）の硫酸コリスチンに曝露されたＰＡ１４培養物において経時的に測定された平均ピーク電流（ブランクを差し引いたもの）。右軸：検量線に基づくピオシアニン濃度の近似値。*は、２回の反復のみが使用された時点を示す。**は、ＡＮＯＶＡ分析からＰ＜０．０５を示す。 図１１Ｂは、０，４，１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露した後のＰＡ１４からの生存細胞数を示す。エラーバーは、３つの試料の平均の１つの標準偏差である。**は、細胞数間のＡＮＯＶＡ分析からのＰ＜０．０５を示す。

図１２は、ＰＤＭＳチャンバ内で２０時間、１００ｍｇ／Ｌおよび４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露され、その後、ＴＳＢプレート上にスポットされたＰＡ１４を示す。３７℃で、Ａ）４．３時間、Ｂ）６．５時間、およびＣ）７４．３時間（乾燥を避けるために２４時間後にインキュベータから取り出し、室温（約２３℃）で増殖させた）培養した後のプレートの写真。矢印は、最初に観察されたＰＡ１４コロニーの位置を強調する。縦線は、１００ｍｇ／Ｌ（左）および４ｍｇ／Ｌ（右）の硫酸コリスチンに曝露されたＰＡ１４が滴下されたプレート上の領域を分割する。 図１３は、０〜５０μＭの３０ｇ／Ｌ ＴＳＢにおけるピオシアニンのＳＷＶからの最大電流を示す。ＳＷＶは、１５Ｈｚの周波数および５０ｍＶの振幅電圧で−０．５Ｖから０Ｖまで行われた。線形フィット：Ｉ／μＡ＝０．１８［ＰＹＯ］／μＭ；ここで、Ｉ＝電流および［ＰＹＯ］=ＴＳＢ中のピオシアニンの濃度。 図１４は、３電極細胞の作用電極上に成長した緑膿菌のＳＥＭ画像を示す。左から順に、ＳＥＭ画像を、３ｋＶで９，０００Ｘ、１５，０００Ｘ、および３０，０００Ｘの倍率で撮影した。３つの画像すべてにおいて多数の細胞の存在が織り合わされ、細胞外マトリックスに埋め込まれていることに注意されたい。 図１５は、Ａ）センサを含むチャンバ領域に通じるＰＤＭＳデバイスのアクセス孔内の緑膿菌細胞、およびＢ）検出チャンバの頂部を形成するＰＤＭＳの表面に取り付けられた細胞のＳＥＭ画像を示す。

図１６は、４８時間の実験の間の選択された時点でのＰＡ１４バイオフィルムの応答を示す。（ＢＬ＝チャンバ内に負荷された細菌）。左軸：０（右スラッシュ）、４（左スラッシュ、低ＭＩＣ）、１６（十字、高ＭＩＣ）、および１００ｍｇ／Ｌ（スラッシュラインなし）で硫酸コリスチンに曝露されたＰＡ１４培養物における経時的に測定された平均ピーク電流（ブランクを差し引いたもの）。右軸：検量線に基づくピオシアニン濃度の近似値。*は、２回の反復のみが使用された時点を示す。**は対照に対する１６および１００ｍｇ／Ｌの抗生物質濃度のＡＮＯＶＡ分析からＰ＜０．０５を示す。 図１７は、Ａ）０時間、Ｂ）１２時間、Ｃ）２２時間、Ｄ）３５時間、Ｅ）４０時間、およびＦ）４５時間後に一晩培養物２４μＬを負荷した後、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中で培養したＰＡ１４（実線）および大腸菌（破線）のＳＷＶを示す。１００ｎＬ／分の新鮮なＴＳＢ中の４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンのフローを２２時間で開始された。ＳＷＶは周波数１５Ｈｚ、振幅電圧５０ｍＶで−０．５〜０．２Ｖで行った。

図１８は、Ａ）０時間、Ｂ）１２時間、Ｃ）２２時間、Ｄ）３５時間、Ｅ）４０時間、およびＦ）４５時間後の一晩培養物２４μＬを負荷した後、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中で培養したＰＡ１４（実線）および大腸菌（破線）のＳＷＶを示す。１００ｎＬ／分の新鮮なＴＳＢ中の１６ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンの流れが２２時間で開始された。ＳＷＶは周波数１５Ｈｚ、振幅電圧５０ｍＶで−０．５〜０．２Ｖで行った。 図１９は、Ａ）０時間、Ｂ）１２時間、Ｃ）２２時間、Ｄ）３５時間、Ｅ）４０時間、およびＦ）４５時間後の一晩培養物２４μＬを負荷した後、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中で培養したＰＡ１４（実線）および大腸菌（破線）のＳＷＶを示す。１００ｎＬ／分の新鮮なＴＳＢ中の１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンの流れが２２時間で開始された。ＳＷＶは周波数１５Ｈｚ、振幅電圧５０ｍＶで−０．５〜０．２Ｖで行った。 図２０は、Ａ）１２時間の間、流れのないＴＳＢ中で成長した緑膿菌のＳＷＶを示す。細胞はその後、Ｂ）２２時間で開始するＴＳＢ中の流れる１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（明線）または硫酸コリスチン（暗線）に曝露した。ＳＷＶ 実験開始後Ｃ）３５時間およびＤ）４０時間。結果のスキャンからベースライン信号を差し引いた。ＳＷＶは、１５Ｈｚの周波数および５０ｍＶの振幅電圧で−０．５ボルト〜０．２ボルトで行われた。

図２１は、硫酸コリスチンの種々の濃度と混合したセトリミド寒天プレート上に３７℃で２０時間増殖させた後のＰＡ１４コロニーの画像を示す。 図２２は、ＰＤＭＳフローチャンバー内で２０時間、１００ｍｇ／Ｌおよび４ｍｇ／Ｌのコリスチンに曝露した後のＴＳＢにストリークしたＰＡ１４を示す。写真は、培養のＡ）４．３３時間、Ｂ）６．５時間、およびＣ）７４．３時間後のプレートを示す。プレートを最初の２４時間３７℃で培養し、次いで寒天が乾燥するのを防ぐために残りの時間室温で増殖させた。 図２３は、緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングし、本明細書に記載の他の方法を実施するためのセンサの一実施態様の概略図である。 図２４は、緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングするためのデバイスの一実施態様の概略図である。

この出願は、「迅速な細菌感染診断のための診断システムおよびプロセス」と題する２０１４年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，０９９号、および「迅速な細菌感染診断のための診断システムおよびプロセス」と題する２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５，３７９号の全開示を参照によって組み入れる。

本発明は、臨床患者試料における緑膿菌の迅速な同定のための安価な使い捨て電気化学センサの使用に関する。緑膿菌の存在は、ユニークなレドックス活性化学マーカーであるピオシアニン（ＰＹＯ）の産生によって電気化学的に決定することができる。いくつかの実施態様において、試料調製を必要とせず、操作に１分未満を要し、分析を完了するために７．５マイクロリットルの試料しか必要としない簡単な電気化学的検出手段が提供される。

マイクロ流体システムにおける緑膿菌細胞の生存率を電気化学的にモニタリングすることは以前に実証されている（L. Pires, K. Sachsenheimer, T. Kleintschek, A. Waldbaur, T. Schwartz and B. E. Rapp, Biosens Bioelectron, 2013, 47, 157-163.）。Ｐｉｒｅｓ（２０１３）らは、緑膿菌細胞の増殖と呼吸を同時にモニターするためのインピーダンスと電流測定を組み合わせた。このアプローチは緑膿菌を非破壊的に観察する可能性を強調しているが、細胞生存率および病原性の潜在的マーカーの生産されたＰＹＯ自体を測定する能力、が欠如している(X. Mulet, G. Cabot, A. A. Ocampo-Sosa, M. A. Dominguez, L. Zamorano, C. Juan, F. Tubau, C. Rodriguez, B. Moya, C. Pena, L. Martinez-Martinez and A. Oliver, Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57, 5527-5535.)。

排泄されたＰＹＯを電気化学的に測定する１つの方法は、以下の反応を介してＰＹＯが減少する電圧範囲（１／２波電位はＡｇ／ＡｇＣｌ基準に対して約−２５０ｍＶ）にわたる矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）によって完成された。

(T. A. Webster and E. D. Goluch, Lab Chip, 2012, 12, 5195-5201.)。抗生物質への曝露中にバイオフィルム中の生存細胞の量に関係するので、病原性因子を測定する能力は、有効な処置手順の決定を助けることができる。

本明細書で使用するように、マイクロ流体デバイスは、ナノ流体デバイスを含有することができる。また、本明細書で使用する「ナノスケール」という用語は、サイズが約１ｎｍ〜約９９９ｎｍの範囲内、または１μｍ未満の範囲内にある物体または特徴を指す。「マイクロスケール」という用語は、サイズが約１μｍ〜約９９９μｍの範囲、または１ｍｍ未満の特徴の対象を指す。本明細書で使用されるナノ流体デバイスは、ナノスケールサイズの少なくとも１つの寸法、例えばチャネル直径を有するデバイスである。本明細書で使用されるマイクロ流体デバイスは、マイクロスケール範囲のチャネル直径またはチャネル長などの少なくとも１つの寸法を有するデバイスである。

いくつかの実施態様において、ピオシアニンの検出に基づいて緑膿菌細菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施態様において、患者の緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法は、（ａ）患者からの流体試料を作用電極および参照電極を含むマイクロ流体デバイスに導入するステップと、（ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するために電気化学的測定を行うステップと、（ｃ）ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定するステップを含有する。液体試料中のピオシアニン濃度は、バイオフィルムの生存率の尺度を提供する。

より詳細には、作用電極および参照電極を含有するマイクロ流体装置に患者からの流体試料が導入される。適切なマイクロ流体デバイスは、ＷＯ／２０１４／０１５３３３およびＷＯ／２０１５／０３１７９８に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。電気化学的測定を行って流体試料中のピオシアニンを検出し、ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて流体試料中のピオシアニンの濃度を決定する。液体試料中のピオシアニン濃度は、バイオフィルムの生存率の尺度を提供する。

ピオシアニンの濃度は、作用電極を通る電流の線形関係に基づいて決定することができる。例えば、図１３を参照されたい。以下にさらに説明する。いくつかの実施態様において、ピオシアニンのμＭ単位の濃度は、作用電極を通るμＡ単位の電流を０．１８で除したものに等しい。他の実施態様において、０．１０、０．１４、０．１６、０．２０、０．２２または０．２６で除された作用電極を通るμＡの電流が流れる。いくつかの実施態様において、作用電極を流れる電流が１μＡ未満である場合、ピオシアニン濃度はゼロであると見なされる。

いくつかの実施態様において、作用電極を流れる電流が１μＡ未満である場合、バイオフィルムは生存不能または存在しないと考えられる。いくつかの実施態様において、決定された濃度のピオシアニンに基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の生存細胞の数を推定し得る(T.A. Webster, H.J. Sismaet, A.F. Sattler, E.D. Goluch, Improved monitoring of P.aeruginosa on agar plates, Anal. Methods, 2015, 7, 7150-7155.)。

電気化学的測定は、任意の適切な方法で行うことができる。例えば、電気化学的測定は、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、階段ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーによって行うことができる。いくつかの実施態様において、電気化学的測定は矩形波ボルタンメトリーであり、電流フローは１以上の矩形波電位に応答して測定される。

いくつかの実施態様において、ミクロ流体デバイスは酸化電極と還元電極（作用電極）を含有する。ピオシアニンの濃度は酸化電極と還元電極を通る電流フローとして測定される。ピオシアニンを酸化するために適する電位は、酸化電極に印加され、ピオシアニンを還元するために適する電位は、還元電極に印加される。

作用電極は、流体試料が導入され、その中で酸化還元反応が起こる、マイクロ流体チャネルまたはナノ流体チャネルなどのチャネルの壁または壁の一部を構成することができる。いくつかの実施態様において、酸化電極および還元電極は、約２００〜１００ｎｍの距離だけ離間している。他の実施態様において、その距離は、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍである。

作用電極の表面積は、装置の所望のサイズに適合するように選択することができる。より大きな表面積は、一般に、装置の信号および感度を改善する。例えば、異なる実施態様において、各作用電極の表面積は、約１００，２００，３００，４００，５００，８００，１０００，２００，３０００，５０００，１００００，５００００，１０００００，２０００００または５０００００ｎｍ^２であり得るか、または １，２，５，１０μｍ^２以上であり得る。

他の実施態様においては、流体試料は、反応が起こり得るウェル、チャンバ、または別の形態の容器に導入することができる。チャネル、ウェル、チャンバまたは他の容器の体積は、約５０ナノリットル（ｎＬ）未満、約１０ｎＬ未満、約１ｎＬ未満、約１００ピコリットル（ｐＬ）未満、約５０ｐＬ未満、約１０ｐＬ未満、約５ｐＬ未満、または約１ｐＬ未満であり得る。
いくつかの実施態様においては、マイクロ流体デバイスに導入される試料体積は、１００μＬ未満、５０μＬ未満、２０μＬ未満、１０μＬ未満、５μＬ未満、２μＬ未満、または１μＬ未満であり得る。

いくつかの実施態様において、流体試料は、マイクロ流体デバイスに連続的に導入され得る。他の実施態様においては、流体試料は、マイクロ流体デバイスに繰り返し導入される。例えば、流体試料をデバイス内に導入し、流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行い、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定するステップは、時間間隔で繰り返し行い得る。いくつかの実施態様においては、このステップは、少なくとも６時間毎、１２時間毎、１８時間毎、２４時間毎、または４８時間毎に繰り返すことができる。

いくつかの実施態様においては、流体試料をデバイス内に引き込むために、マイクロ流体デバイスの入口またはその近傍にキャピラリまたは芯材を配置し得る。いくつかの実施態様においては、マトリクス材料をマイクロ流体デバイスの入口またはその近傍に配置して、例えば電極を細菌から隔離することができ、一方でピオシアニンの通過を許可し、電極にアクセスする。

マイクロ流体デバイスの１つの例示的な実施態様を図２３に示す。このデバイスは、第１の作用電極５１０および第２の作用電極５２０を含有する。電極間のチャネル内のピオシアニン４００は、第１の電極５１０および第２の電極５２０において還元−酸化サイクルを受け、矢印で概略的に示される。

いくつかの実施態様においては、マイクロ流体デバイスは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように操作可能なポテンシオスタットと通信し得る。図２４を参照されたい。マイクロ流体デバイスは、ケーブルによってポテンシオスタットに接続可能である。マイクロ流体デバイスは、遠隔監視ステーションと無線通信し得る。マイクロ流体デバイスは、新鮮なセンサを使用できるようにポテンシオスタットから切り離すことができる使い捨てセンサのような使い捨てであり得る。

いくつかの実施態様においては、マイクロ流体デバイスは、患者によって着用されるか、または患者に埋め込まれ得る。例えば、いくつかの実施態様においては、微小流体デバイスを創傷被覆材に、または創傷被覆材のための吸収パッドの内部または近傍に埋め込むことができる。このような実施態様においては、緑膿菌の存在について創傷を連続的または反復的にモニターすることができ、ピオシアニンの検出時に、適切な選択的抗生物質を患者に投与することができる。

他の実施態様において、微小流体デバイスは、創傷被覆材、包帯、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスク、顔面マスク、外科用マスク、または挿管チューブ内に存在することができる。さらに他の実施態様においては、マイクロ流体デバイスは、コンタクトレンズケース、尿収集カップ、または尿バッグ中に存在することができる。

流体試料は、嚢胞性線維症、人工呼吸器関連肺炎、慢性創傷、火傷、外科用インプラント、または手術部位を有するヒト由来であり得る。流体試料は、創傷滲出液、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、脊髄液、涙、および血液を持つヒトに由来し得る。

他の側面において、緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニターする方法は、他の応用に使用することができる。例えば、医療廃棄物または他の廃棄物を処理するためのバイオリアクターは、細菌によって汚染される可能性がある。細菌は、廃棄物を通じて、給水管を通じて、または廃棄物を分解するために使用される他の添加物の添加を通じてを含む、さまざまなメカニズムを通じて導入することができる。いくつかの実施態様においては、本願明細書に記載され使用されるマイクロ流体デバイスは、コンタクトレンズケース、尿バッグ、尿収集カップ、投薬ポンプ、水パイプ、バイオリアクター、または水ポンプに配置され得る。

本発明の別の側面において、患者における緑膿菌感染の抗生物質処置の有効性をモニタする方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、（ａ）患者からの流体試料を作用電極および参照電極を含有する微小流体デバイスに導入するステップと、（ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するために電気化学的測定を行うステップと、（ｃ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関関係を使用することによって、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定するステップを含有する。流体試料中のピオシアニン濃度は、抗生物質処置の有効性の尺度を提供する。

ピオシアニンの濃度が閾値レベルを上回る場合、抗生物質の増加する用量を投与することができる。いくつかの実施態様において、ピオシアニンの閾値レベルは、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、または少なくとも１０μＭの濃度であり得る。いくつかの実施態様において、ピオシアニンの濃度が所定の時間間隔後に閾値レベルを下回らない場合、本方法は抗生物質の増加した用量を投与することを含有し得る。所定の時間間隔は、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施態様において、本方法は、ピオシアニンの濃度が閾値レベル未満に低下した場合、抗生物質の投与量を減少させるか、または抗生物質を停止させることを含むことができる。いくつかの実施態様において、ピオシアニンの閾値レベルは、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、または少なくとも１０μＭの濃度であり得る。

いくつかの実施態様において、抗生物質は、硫酸コリスチンまたはシプロフロキサシンであり得る。他の実施態様において、本方法は、追加の抗生物質または他の医薬品を投与することを含有する。

本発明のさらなる側面において、緑膿菌を含むバイオフィルムに対する抗生物質の有効性をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、（ａ）緑膿菌を含む試料を、作用電極および参照電極を含むマイクロ流体デバイスの増殖チャンバに導入するステップと、（ｂ）緑膿菌を増殖させて増殖チャンバ内にバイオフィルムを形成させるステップ；（ｃ）選択された濃度の抗生物質をデバイスの増殖チャンバに導入するステップと、（ｄ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うステップと、（ｅ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、試料中のピオシアニンの濃度を決定するステップを含有する。閾値未満のピオシアニンの濃度は、抗生物質の有効性を示す。

いくつかの実施態様において、ピオシアニンの閾値レベルは、１μＭ、５μＭ、または１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ未満の濃度であり得る。
いくつかの実施態様において、本方法は、ピオシアニンの濃度が１μＭ、５μＭ、または１０μＭ以上であり得るとき、緑膿菌の存在の指標を提供することを含有する。いくつかの実施態様においては、本方法は、ピオシアニンの濃度に基づいて緑膿菌の細胞の数を推定することを含有する。

いくつかの実施態様において、本方法は、緑膿菌を含む試料をマイクロ流体デバイスの複数の増殖チャンバに導入すること、選択された異なる濃度の抗生物質を各増殖チャンバに同時に導入して、抗生物質の複数の濃度の有効性をスクリーニングすることを含有する。
いくつかの実施態様において、本方法のステップは、抗生物質の異なる濃度で繰り返すことができる。いくつかの実施態様においては、本方法は、抗生物質を増殖チャンバへ連続的に導入することを含有し得る。

本明細書に記載の方法を実施するためのデバイスを提供することができる。
いくつかの実施態様においては、緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングするためのデバイスは、基板中に配置されたマイクロ流体（またはナノ流体）チャネルを含むマイクロ流体（またはナノ流体）電極アセンブリを有するセンサを含有することができる。作用電極および参照電極は、マイクロ流体チャネル内に配置することができる。プロセッサおよびメモリを含有する制御システムが提供される。機械可読命令は、プロセッサによって実行されると作用電極および参照電極における電圧を制御し、既知の濃度のピオシアニンと作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を使用することによって、マイクロ流体チャネル内の流体試料中のピオシアニンの濃度を決定するように、メモリに記憶することができる。

いくつかの実施態様においては、デバイスは、約１μＭ〜約１ｍＭ、または約５μＭ〜約１ｍＭの範囲にわたるピオシアニンの濃度の指標を提供するように動作可能である。いくつかの実施態様において、濃度範囲は、１μＭ、５μＭまたは１０μＭの下限を有し得る。いくつかの実施態様においては、濃度範囲は、５０μＭまたは約１ｍＭの上限を有することができる。いくつかの実施態様においては、濃度範囲は、ピオシアニンの溶解度限界の上限を有し得る。

いくつかの実施態様において、制御システムは、ピオシアニンの濃度が閾値レベルを上回るときに緑膿菌の存在の指標を提供するように動作可能である。いくつかの実施態様において、閾値レベルは、約１μＭ、または約５μＭ、または約１０μＭである。いくつかの実施態様において、制御システムは、決定されたピオシアニンの濃度に基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の細胞の数を決定するように動作可能である。

いくつかの実施態様において、ピオシアニンの濃度は、メモリに記憶された作用電極を通る電流の直線関係から決定することができる。いくつかの実施態様において、ピオシアニンのμＭ単位の濃度は、作用電極を通るμＡ単位の電流を０．１８で割ったものに等しい。他の実施態様において、０．１０，０．１４，０．１６，０．２０，０．２２または０．２６で割った作用電極を通るμＡ単位の電流が流れる。いくつかの実施態において、作用電極を流れる電流が１μＡ未満である場合、ピオシアニン濃度はゼロであると見なされる。

いくつかの実施態様において、制御システムは、プロセッサおよびセンサと通信するポテンシオスタットを含有する。ポテンシオスタットは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能である。ポテンシオスタットは、ハードワイヤード接続、取り外し可能なケーブル、またはワイヤレス接続を介してプロセッサと通信できる。ポテンシオスタットは、ケーブルを介してセンサと通信することができ、これは切断可能である。ポテンシオスタットはバッテリーで駆動できる。

制御システムは、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、階段ボルタメトリー、サイクリックボルタメトリー、通常パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーを用いて電気化学的測定を行うように動作可能である。いくつかの実施態様において、電流フローは、１つ以上の矩形波電位に応答して測定される。

装置はまた、決定された濃度のピオシアニン、緑膿菌の存在の表示、および緑膿菌の細胞の数の指標を表示するように動作可能な、制御システムと通信することができるディスプレイを含有する。
いくつかの実施態様において、センサは使い捨て可能であり、ケーブルによってポテンシオスタットに接続可能である。センサ、特に使い捨てセンサは、創傷被覆材に、または創傷被覆材用の吸収パッド内または近傍に埋め込むことができる。いくつかの実施態様において、センサは、創傷被覆材、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスト、または挿管チューブ内に存在することができる。他の実施態様において、センサは、コンタクトレンズケース、尿バッグまたは尿収集カップに埋め込むことができる

制御システムは、例えば遠隔監視ステーションへの通信を可能にする電気通信ネットワーク接続を含有し得る。
制御システムは、本明細書に記載の方法および装置を制御するためのプログラミングを実行するコンピュータシステムの一部であり得ることが理解されよう。コンピューティングシステムは、ハードウェア、ソフトウェア、およびファームウェアの組み合わせを含有するコンピューティングデバイスとして実装され得るか、または含有することができ、コンピューティングデバイスがアプリケーション層を走行すること、またはそうでなければさまざまな処理タスクを実行することを可能にする。コンピューティングデバイスは、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバー、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、モバイルデバイス、携帯デバイス、ワイヤレスデバイス、スマートフォン、ウェアラブルデバイス、組み込みデバイス、マイクロプロセッサ系デバイス、マイクロコントローラ系デバイス、プログラム可能の民生用電子機器、ミニコンピュータ、メインフレイムコンピュータなどが限定されずに含有される。

コンピューティングデバイスは、ハードウェアコンポーネントを管理し、ハードウェアとソフトウェアとの間のインターフェースを調整し、起動などの基本動作を管理するソフトウェアとしての基本入出力システム（ＢＩＯＳ）およびオペレーティングシステムを含有することができる。コンピューティングデバイスは、コンピューティングデバイスに基本機能を提供するためにオペレーティングシステムと協働する１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含有し得る。オペレーティングシステムは、アプリケーション層およびその他の処理タスクのサポート機能を提供する。コンピューティングデバイスは、さまざまなハードウェア、ソフトウェア、およびファームウェアコンポーネント間および任意の外部デバイス間の通信を提供するためのシステムバスまたは他のバス（メモリバス、ローカルバス、周辺バスなど）を含有し得る。構成要素が互いに通信し相互作用することを可能にする任意のタイプのアーキテクチャまたはインフラストラクチャを使用し得る。

処理タスクは、１つ以上のプロセッサによって実行し得る。単一プロセッサまたは複数プロセッサ、中央処理装置（ＣＰＵ）、マルチコアプロセッサ、並列プロセッサまたは分散型プロセッサを含む、さまざまなタイプの処理技術を使用し得る。グラフィックス（例えば、グラフィックス処理ユニットまたはＧＰＵ）、ビデオ、マルチメディア、または数学的処理能力のような付加的な特殊処理リソースを提供して、特定の処理タスクを実行し得る。処理タスクは、コンピューティングデバイスによって実行されるアプリケーションプログラムまたは他のプログラムモジュールなどのコンピュータ実行可能命令で実装し得る。アプリケーションプログラムおよびプログラムモジュールは、特定のタスクを実行するかまたはデータを操作するルーチン、サブルーチン、プログラム、ドライバ、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含有し得る。

コンピューティングデバイスは、システムバスまたはその他の方法でアクセス可能なメモリまたはストレージを含有する。メモリは、制御ロジック、命令、および／またはデータを格納することができる。メモリは、キャッシュメモリ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、スタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、メインメモリ、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）、およびメモリスタ・メモリセルなどの一時メモリを含有し得る。メモリは、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）および消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ）などのファームウェアまたはマイクロコード用の記憶装置を含有し得る。メモリは、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードディスクドライブ、光記憶デバイス、コンパクトディスクドライブ、フラッシュドライブ、フロッピーディスクドライブ、磁気テープドライブ、メモリチップ、およびメモリスタ・メモリセルなどの非一時的または不揮発性または永続メモリを含有し得る。非一時的メモリは、リムーバブル記憶装置上に提供し得る。

コンピュータ可読媒体は、本明細書で説明される方法およびシステムの実施態様を実装するためにプロセッサによって後に使用され得る命令を符号化および／またはデータを格納することができる任意の物理媒体を含有し得る。物理メディアには、フロッピーディスク、光ディスク、ＣＤ、ミニＣＤ、ＤＶＤ、ＨＤ−ＤＶＤ、ブルーレイ・ディスク、ハードドライブ、テープドライブ、フラッシュメモリ、またはメモリチップなどを含有し得る。これらの実施態様においては、プロセッサに命令および／またはデータを提供することができる任意の他のタイプの有形の非一時的記憶装置を使用し得る。

コンピューティングデバイスは、入力デバイスおよび出力デバイスをコンピューティングデバイスのさまざまな他のコンポーネントに接続するための１つ以上の入出力インターフェースを含有し得る。入出力装置には、キーボード、マウス、ジョイスティック、マイク、ディスプレイ、モニター、スキャナー、スピーカー、プリンターなどを含有するが、これらに限定されない。インターフェースは、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ポート、シリアルポート、パラレルポート、ゲームポートなどを含有し得る。

コンピューティングデバイスは、コンピューティングデバイスに電気通信能力を提供するネットワーク接続を介してネットワークにアクセスし得る。ネットワーク接続により、コンピューティングデバイスは、通信リンクを介して、リモートデバイス、リモートネットワーク、およびリモートエンティティの任意の組み合わせと通信し、交流し得る。通信リンクは、有線または無線リンクを含むがこれに限定されない任意のタイプの通信リンクであり得る。例えば、ネットワーク接続は、コンピューティングデバイスが、有線ネットワークおよび／または無線ネットワークであり得、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、企業全体のネットワーク、中域ネットワーク、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、インターネットなどを含有し得るネットワークに渡って遠隔デバイスと通信することを可能にする。制御ロジックおよび／またはデータは、ネットワーク接続を介してコンピューティングデバイスへ送信され、およびコンピューティングデバイスから送信され得る。ネットワーク接続は、通信リンクを介したデータの送受信を可能にするためのモデム、ネットワークインターフェース（イーサネット（登録商標）カードなど）、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどを含有し得る。

コンピューティングデバイスは、ユーザが通信リンクを介してウェブサーバによって提供されるページまたは他のコンテンツを閲覧したり眺めたりすることを可能にするブラウザおよびディスプレイを含有し得る。ウェブサーバー、サーバー、およびデータベースは、同一または異なる場所に配置することができ、同じコンピューティングデバイス、異なるコンピューティングデバイス、またはネットワークの至る箇所に配布することができる。データセンターは、遠隔地に配置され、ネットワークを介してコンピューティングデバイスによってアクセスさせ得る。

コンピュータシステムは、例えばクラウドコンピューティングアーキテクチャなど、１つ以上のネットワークを介して配布されたアーキテクチャを含有し得る。クラウドコンピューティングには、例えばサービスとしてのソフトウェア（ＳａａＳ）、サービスとしてのインフラストラクチャ（ＩａａＳ）、サービスとしてのプラットフォーム（ＰａａＳ）、サービスとしてのネットワーク（ＮａａＳ）、サービスとしてのデータ（ＤａａＳ）、サービスとしてのデータベース（ＤＢａａＳ）、サービスとしてのバックエンド（ＢａａＳ）、サービスとしてのテスト環境（ＴＥａａＳ）、サービスとしてのＡＰＩ（ＡＰＩａａＳ）、およびサービスとしての統合プラットフォーム（ＩＰａａＳ）を含有し得る。
本明細書に記載の方法および装置は、手術後設備、救急室、ＩＣＵ、火傷病棟、中央検査室、および糖尿病患者用などの外来施設などのさまざまなもてなしその他の医療環境で使用することができる。

例１
ある研究では、緑膿菌の存在のために慢性創傷を有する患者から得られた創傷流体滲出液をスクリーニングするための安価な使い捨て電気化学センサの使用が評価された。

材料と方法
この研究は、George Washington University Institutional Review Board（041408）の認可した慢性創傷の研究のために設計された生体特異性およびデータリポジトリである創傷病因学および治癒（WE-HEAL）検討を通じて行われた。被験者は、評価時点で開放創を有し、１８歳よりも年長の場合、この検討の対象となる。すべての被験者は標本とデータの収集に関する書面による同意を与えた。
この実験のために、１２人の患者からの１４対の創傷液およびバイオフィルム試料を分析のために選択した。これは、同じ採取日からの創傷液および創傷マイクロバイオーム試料の利用可能性に基づいて選択された便利な試料であった。

WE-HEAL検討の標準操作手順に従って、Ｌｅｖｉｎｅ法を用いて創傷流出物標本を収集した（Levine, N.S., et al., The quantitative swab culture and smear: A quick, simple method for determining the number of viable aerobic bacteria on open wounds. J Trauma, 1976. 16(2): p. 89-94.）。この技術は、WE-HEAL検討で収集されたすべての検体にわたって標準化を確実にするために十分に検証されている。収集後、綿棒標本を０．６５μｍ孔径の遠心フィルタ（Ultrafree-MC DV，Merck Millipore，MA，USA）に直ちに入れた。試料を１２０００ｒｐｍで４分間遠心分離して、創傷滲出液を抽出し、細胞および線維状の破片を除去した。試料を分析まで−８０℃で保存した。

ＷＥ−ＨＥＡＬ検討のための標準操作手順に従って、Ｌｅｖｉｎｅ技術を用いて綿棒で創傷を拭き取ることにより、創傷バイオフィルム標本を収集した（Levine, N.S., et al., The quantitative swab culture and smear: A quick, simple method for determining the number of viable aerobic bacteria on open wounds. J Trauma, 1976. 16(2): p. 89-94. Angel, D.E., et al., The clinical efficacy of two semi-quantitative wound-swabbing techniques in identifying the causative organism(s) in infected cutaneous wounds. Int Wound J, 2011. 8(2): p. 176-85.）。次いで、試料を分析まで−８０℃で保存した。

１６Ｓシークエンシングのための細菌ＤＮＡを、バイオフィルム試料から、酵素的溶解、続いてフェノール−クロロホルム イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿を用いて単離した（Chomczynski, P. and N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987. 162(1): p. 156-9.）。確立された４５４ ＦＬＸ配列決定法（454 Life Sciences，Roche Inc.，Branford，CT，USA）を用いて、固有のバーコード識別子を有するユニバーサルＰＣＲプライマーを使用して、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域を増幅した。分類学的分類は、リボソームデータベースプロジェクトからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子参照配列に基づいて、ｍｏｔｈｕｒソフトウェア（University of Michigan，USA）を用いて行った(Cole, J.R., et al., The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res, 2009. 37(Database issue): p. D141-5.) 。バイオフィルム標本は、相対存在量に関係なく、標本中にシュードモナスの読み取り値が検出された場合、シュードモナス種（Pseudomonas spp.）に対して陽性と見なされた。

臨床試料中のピオシアニンの存在を検出するために、使い捨てのスクリーン印刷電極センサ（TE100、Zensor、Taichung City、台湾）を用いた（図１）。センサは、炭素ベースの作用（直径３ｍｍのディスク）および対電極をＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極とともに含む３電極構成を利用する。図８は、小体積分析のために電極センサの上部に配置された膜メッシュの明視野像を示す。ポータブルポテンシオスタット（μStat 200, Dropsens, Parque Tecnologico de Asturias, Spain）を使用して、すべての電気化学的測定を記録した。検知面は、分析に必要な試料体積の量を減らすために高分子膜（DRP-MEMB, Dropsens, Parque Tecnologico de Asturias, Spain）で覆った。

各試験について、７．５μＬの創傷滲出液を検出器ウェルにピペットで入れた。矩形波ボルタンメトリスキャンは、０．０５Ｖの振幅電圧、０．００４Ｖのステップ電圧、および１５Ｈｚの周波数で、−０．７〜０．０Ｖの範囲の電位で実施した（図２〜図７参照）。

各臨床試料は、毎回新しいセンサを使用して二回テストを行った。研究者は、センサ検出実験の時点で、マイクロバイオーム１６ＳｒＲＮＡの結果を知らされていなかった。データはＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ９．１（OriginLab Corporation）を使用して２人の独立した研究者によって分析された。３２基点のスプライン補間を使用して各データセットに対してベースラインを作成した。得られたベースライン−減算データセットを使用して、電流のピークを特定し、これらのピークの最大電流を決定した（図４）。０．０３０μＡのカットオフを用いて、これらの最大電流値から、プローブがピオシアニン（陽性）を検出しているか否か（陰性）について２値測定を行った（表２）。

統計分析
GraphPad Prism 5.03（Windows用、GraphPad Software、San Diego、 California、USA）を用いてデータを分析した。カテゴリー変数にはフィッシャーの正確確率検定とカイ二乗検定を用い、連続変数にはスチューデントのｔ検定を用いた。結果は、平均±ＳＤとして表される。０．０５未満のｐ値は統計的有意性を示す。すべての有意性検定が実施され、そして両面で解釈された。
１６ＳリボソームＲＮＡ配列決定によって生成されたミクロバイオームプロファイルから得られた結果を概観し、任意の陽性シュードモナス菌読み取り値を有する試料は、シュードモナス陽性を検定すると見做された。これらの結果をピオシアニン検出器の結果と比較し、センサの感度および特異性を計算した。

結果
１２人の患者（異なる時点で収集された連続試料を有する２人の患者が利用可能であった）から得られた１４の独自の試料から、対になった創傷流出物およびバイオフィルム試料を分析した。患者の平均年齢は５０．１８歳であった。１６ＳｒＲＮＡ配列決定によって微生物プロファイリングを行った１４個の試料のうち、７個は検出可能なシュードモナス種（配列決定陽性）を有していた。検体収集時に１４創傷すべてが治療抵抗性であった。
１６ＳｒＲＮＡ配列決定を用いた緑膿菌にその試料が陽性であった患者の年齢、性別、人種、または併存疾患に有意差はなかった（表１−２）。１６ＳｒＲＮＡ配列決定を用いて緑膿菌に対して陽性であった創傷はより大きい傾向があったが、これは統計的有意性には達しなかった。

ピオシアニン検出器についての陽性試験は、０．０３０μＡのカットオフを有するＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して約−０．２５Ｖ付近の酸化ピークであると見做された（Sismaet, H.J., T.A. Webster, and E.D. Goluch, Up-regulating pyocyanin production by amino acid addition for early electrochemical identification of P. Aeruginosa. Analyst, 2014. 139(17): p. 4241-6. Bellin, D.L., et al., Integrated circuit-based electrochemical sensor for spatially resolved detection of redox-active metabolites in biofilms. Nat Commun, 2014. 5: p. 3256.）。データは２回の平均として分析した。１４個の試料のうち、８個は、ピオシアニン検出器カットオフ０．０３０μＡを用いて陽性であった。

マイクロビオーム配列決定に基づくシュードモナス種を含む試料を検出するためのピオシアニン・プローブの感度および特異性、および結果は、表３に報告されている。プローブは、１６ＳｒＲＮＡ配列決定においてシュードモナスに対して陽性である７試料中の５個において陽性であり、陰性の１６ＳｒＲＮＡ結果を有する７つの試料のうち４個で陰性であり、７１％の感度（９５％ＣＩ ０．２９−０．９６）および５７％（９５％ＣＩ ０．１８−０．９０）の特異性を与えた。

ピオシアニン・プローブは使用が簡単であり、陽性結果の解釈に関する高い観察者間一致を有していた。ピオシアニンプローブは、１６ＳｒＲＮＡ配列決定の診断上の金標準と比較すると、７１％の感度および５７％の特異性を有し、これは、ヒトの創傷液中のシュードモナスの存在をスクリーニングする際のポイント・オブ・ケア試験として有用であり得ることを示している 。

プローブの開発中、ヒトの試料を試験するためのこのプローブの有用性について提起された懸念の１つは、プローブ性能を妨害する他の分子を生成する複数の他の生物が存在する可能性があることであった。ヒト創傷試料はしばしば微生物フローラを有し、これは実際にここに報告された標本の場合であった。報告された結果は、ピオシアニン・プローブの参照窓に他のレドックスピークを示さなかった。このことは、ヒトの標本に複数の他の生物が存在するにもかかわらず、臨床状況においてプローブの性能を妨げる他の酸化還元活性分子は存在しないようである。しかしながら、ピオシアニンピークが生じた場所では小さな電位シフトが観察された。これは、試料媒体の塩およびｐＨ濃度の違い、および使い捨てセンサのＡｇ／ＡｇＣｌ準参照電極の安定性の限界に起因すると考えられる。

緑膿菌を含有する試料の大部分は、現在の電気化学的手法を用いてピオシアニン陽性を検査したことが判明した。カットオフの最大電流の測定値を下げることにより、センサの感度は８５．７％に改善され、特異度は４２．９％に減少した。電気化学センサの検出限界は、マイクロおよびナノ加工電極に切り替えることによって改善し得る(Zevenbergen, M.A., et al., Stochastic sensing of single molecules in a nanofluidic electrochemical device. Nano Lett, 2011. 11(7): p. 2881-6.）。

この試験により、ピオシアニン・プローブを用いたいくつかの偽陰性結果が明らかになった。ピオシアニンは、シュードモナスのみによって産生される非常に特異的な分子であるが、ピオシアニン産生が低いシュードモナスのインビトロ培養においてさえもいくつかの環境が存在する。ここで検討されたいくつかの臨床事例では、創傷微小環境がピオシアニン産生に影響を与えた可能性がある。

さらに、これは仮説生成のために設計されたパイロット検討であるため、試料サイズは小さい。また、１６ＳｒＲＮＡ検査は、創傷における細菌の存在および特定の細菌の相対的存在量を検体の全微生物プロファイルと比較するための良好な金標準試験であるが、１６ＳｒＲＮＡ検査のみでは、他の標本と比較して１つの標本中の特定の細菌の定量的存在量に関する情報は得られない。この検討における偽陽性および偽陰性のいくつかは、試料中のシュードモナスの非常に低い存在量に起因することが可能であり、この装置がさらに臨床的適応の観点で精製され開発されたため、偽陽性および偽陰性検査の臨床的関連性を理解するためにさらなる検査が必要である。さらに、１６ＳｒＲＮＡはシュードモナス種間を区別せず、それに対してピオシアニン・プローブは緑膿菌のみを検出する。このことを考慮すると、我々の偽陰性の１つが潜在的に説明され、配列決定が緑膿菌以外のシュードモナス種の存在を示し得る。
この検討の結果は、臨床試料中の緑膿菌の検出に関する有用で予想されないデータを提供し、この電気化学的アプローチを迅速なポイントオブケア診断として有効とする。

例２
異なる濃度の抗生物質である硫酸コリスチンに曝露されたときに、使い捨て三電極細胞でＳＷＶを用いて検出されたＰＹＯを介して緑膿菌バイオフィルム（マイクロ流体環境で増殖させたもの）の内部の細胞滅殺を調べるための検討を行った。
緑膿菌バイオフィルム中の細胞の状態を、使い捨て三電極セルと結合された製作されたマイクロ流体増殖チャンバ中の電気活性毒性因子ピオシアニンの電気化学的検出によって監視した。一晩増殖させた後、４、１６および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに細胞を曝露した。検査の最後に、１６および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンにそれぞれ曝露された緑膿菌において、測定された最大ピーク電流（したがってピオシアニン濃度）がそれぞれ約６８％および８２％低下した。試料をマイクロ流体チャンバから取り出し、染色を用いて生存率を分析し、緑膿菌細胞が抗生物質によって影響されたことを確認するために、培養プレート上にストリークした。抗生物質曝露後の電気的信号低下と緑膿菌細胞の生存率との間の相関関係は、将来の安価な抗生物質スクリーニング応用のためのこのアプローチの有用性を強調する。

材料と方法
緑膿菌ＰＡ１４株およびm-cherry大腸菌Ｋ１２株を全ての抗生物質試験に用いた。トリプチカーゼ大豆ブロス（ＢＤ ２１１７６８）を、これらの試験で栽培したすべての細菌の栄養源として使用した。硫酸コリスチン（Adipogen AG-CN2-0065-G001）をトリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）に１ｇ／Ｌで溶解し、ストック溶液として使用した。使用していないときは、ストック溶液を４℃で保存した。すべてのマイクロ流体デバイスを調製するために、ポリジメチルシロキサン（Ellsworth Adhesives 184 Sil. Elast. Kit 0.5 kg）を使用した。この検討では、使い捨ての３つの電極セル（Zensor TE100）をすべての測定に使用した。電気化学セルは、カーボン作用電極およびＡｇ／ＡｇＣｌペースト参照電極との対電極からなる。マイクロ流体接続用の管類およびルアーロック継手は、Amazon Supply（B001GMWZM）およびValue Plastic（MTLL230）から購入した。細菌がマイクロ流体増殖チャンバに残されるのを防ぐため、Minisart RC4 ０．２ミクロン再生セルロースルアーロックシリンジフィルター（17821K）を１９ゲージのルアーロックシリンジ（NE192PL-25）を介して装置の入口および出口に取り付けた。シリンジポンプ（Harvard Apparatus Fusion 200 211097）を使用して、マイクロ流体チャンバを通る増殖培地および抗生物質の流速を制御した。電気化学的測定は、マルチポテンンシオスタット（CHI1040C A2728）を用いて行った。

ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ウェルを、ガラススライド（3M Scotch Tape、テープ厚さ約５０μｍ）上に作製した９ｍｍｘ９ｍｍのテープモールドから標準的な方法を用いて作製した（A.B. Shrirao and R. Perez-Castillejos, Simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters, Chips Tips, 17 May 2010.）。ＰＤＭＳウェルは約４μＬの最終体積を有し、電気化学セル全体をカバーするように設計された（図９Ａ）。ウェル内の入口および出口を穿孔し、得られたマイクロ流体デバイスを、空気プラズマ（Anatech SP-100、100Wで５〜７秒）を用いてＰＤＭＳを使い捨て電気化学セルに不可逆的に接合することによって作製した。マイクロ流体チャネルにトリプチケース大豆ブロス（ＴＳＢ）を１０μＬ／分の流速で満たした。チャンバの完全な充填（気泡の除去）を容易にするために、空のシリンジを出口に取り付けた。出口を真空に引っ張って解放することによって、ＴＳＢをチャンバを通して引っ張り、如何なる気泡をも置換した。

抗生物質試験のために、ＰＡ１４および大腸菌の培養物を３ｍＬのＴＳＢ（濃度約１０^１１細胞／ｍＬ）で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、試料を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を捨て、培養物を３ｍＬの新しいＴＳＢに再構成した。入口シリンジフィルタを除去した後、約２４μＬの再構成細胞培養物を１０μＬ／分の流速で増殖チャンバに充填した。この流速では、チャンバ内の速度は、ＰＡ１４が流れに抵抗できないようなものであり（緑膿菌速度≒３０−５０μｍ／ｓ）、出口フィルタは細胞の脱出を妨げた(T. S. Murray and B. I. Kazmierczak, J Bacteriol, 2006, 188, 6995-7004.)。細胞をローディングした後、フィルタを交換して、バクテリアを増殖チャンバ内に密閉した。次いで、バイオフィルムを、停滞条件下で一晩、室温で増殖させた。滞留条件は、細胞が表面に接着し、センサ上にバイオフィルムを形成するのに十分な時間を確保するように選択された。一晩増殖させた後、ＴＳＢまたはＴＳＢ中の硫酸コリスチンのいずれかを用いて０．１μＬ／分の流速を開始し、電気化学応答を監視した（K. P. Kim, Y. G. Kim, C. H. Choi, H. E. Kim, S. H. Lee, W. S. Chang and C. S. Lee, Lab Chip, 2010, 10, 3296-3299.）。

使い捨て電気化学セル（Ｚｅｎｓｏｒ）上の内部Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して、試料を−０．５〜０．２Ｖで走査した。矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）を、振幅電圧５０ｍＶおよび周波数１５Ｈｚで使用した。ＳＷＶは、感度の向上と他のボルタンメトリーおよびアンペロメトリック技術と比較して、ＰＹＯの電気化学的ピークをモニターする能力のために選択された（L. Pires, K. Sachsenheimer, T. Kleintschek, A. Waldbaur, T. Schwartz and B. E. Rapp, Biosens Bioelectron, 2013, 47, 157-163. A. J. Bard and L. R. Faulkner, Electrochemical methods fundamentals and applications, John Wiley & Sons Inc., 2011.）。

図１３に示すように、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中で増殖させたＰＡ１４の検量線を得た。より詳細には、３つの異なる使い捨てＺｅｎｓｏｒ電極を用いて、０〜５０μＭのピオシアニン濃度の矩形波ボルタモグラムを得た。希釈シリーズを２回繰り返し、各濃度を使い捨て電極あたり３回スキャンした。希釈シリーズを通る両方のランの平均最大電流を平均し、電流に対してプロットした。図１３は、０〜５０μＭの３０ｇ／Ｌ ＴＳＢにおけるピオシアニンのＳＷＶからの最大電流を示す。ＳＷＶは、１５Ｈｚの周波数および５０ｍＶの振幅電圧で−０．５Ｖから０Ｖまで行われた。直線フィットはＩ/μＡ=０．１８［ＰＹＯ］／μＭである；ここで、Ｉ＝電流と［ＰＹＯ］＝ＴＳＢ中のピオシアニンの濃度である。

ＰＹＯ濃度はＴＳＢ中のＰＹＯの検量線から近似した（図１３）。ＰＤＢＳチャンバにＴＳＢを負荷した後、試料を１０回スキャンし、平均をとってＴＳＢの平均応答を得た。すべてのその後の測定値をこの応答と比較した。細胞の装填の間に３回の測定を行い、残りの試験の間に３０分毎に追加測定を行った。試験した抗生物質の各濃度について、３つの異なるマイクロ流体装置を使用した。電気化学的測定は、ベースライン信号を差し引くことによって処理した。一元配置変動分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、得られた測定値の統計的有意性を決定した。

試料は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（EMSDIASUM 11654）中の２．５％グルタルアルデヒド（EMSDIASUM 16120）中に固定することによってＳＥＭ画像化用に調製した。固定後、試料をカコジル酸緩衝液で洗浄し、次にエタノール濃度を増加させて脱水した（Fisher BP2818-4 30-100％）。脱水後、液体ＣＯ_２を用いて臨界点乾燥（Samdri-PVT-3D）によりエタノールを除去した。ＳＥＭ調製の最後のステップは、それらを導電性にする試料上への５ｎｍのパラジウム金属のプラズマスパッタリング（Cressington Sputter Coater 208HR）であった。画像化のために一旦調製されたら、試料を電界放出ＳＥＭ（Hitachi S-4800）に装填し、３ｋＶおよび１０ｍＡのそれぞれ加速電圧および放出電流で探査した。

ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色キット（EMD Chemicals Millipore 50-231-0606）を用いて硫酸コリスチンに曝露した後の細胞生存率を評価した。製造者の操作手順ごとに汚れを調製した。染色の後、ＩＮＣＹＴＯ Ｃチップ使い捨て血球計（DHC-N01）に１０μＬの試料を注入した。細胞を蛍光顕微鏡を用いて画像化し、曝露後に生存していたＰＡ１４細胞の数を、ＩＭＡＧＥ Ｊ（ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij /）を用いて決定した。

結果
ＳＷＶは、電気活性分子が産生されているかどうかを決定するために、ＰＤＭＳチャンバに装填された時点から開始して、ＴＳＢ中のＰＡ１４の一晩培養物から３０分ごとに収集された。緑膿菌は、実験中に電気化学的に監視することができるプランクトンおよびバイオフィルムの両方の表現型において、増殖するにつれてＰＹＯを連続的に産生する（D. Sharp, P. Gladstone, R. B. Smith, S. Forsythe and J. Davis, Bioelectrochemistry, 2010, 77, 114-119.）。このアプローチの有用性は、図１０に強調されており、そこにおいては、ＴＳＢ中で増殖したＰＡ１４の電気化学的応答を経時的にモニターする。

（ＳＥＭ分析のために緑膿菌が調製され、増殖チャンバにおいて、細菌が収集されるところを決定する。ＰＤＭＳを電極から剥がし、４℃、２時間０．１Ｍカコダイアラート緩衝液（ｐＨ７．２）中の２．５％グルタルアルデヒドを用いて細菌を固定することによって試料を調製した。この試料をエタノールの増加する希釈シリ−ズ中で脱水し、その後臨界点において液体ＣＯ_２で乾燥した。得られたＳＥＭを図１４および図１５に報告し、チャンバ内で増殖するバイオフィルムの明確な存在を示す。）

装填中に観察可能なピークがないことから、新鮮なＴＳＢ細胞懸濁液中に検出可能なＰＹＯが最初に存在しなかったことが示された（図１０、グラフＡ）。停滞条件下で形成されたバイオフィルムとして、酸化ピークの高さは経時的に増加した（図１０、グラフＡ〜Ｂ）。ＰＤＭＳ増殖チャンバおよび作用電極基板のＳＥＭ画像は、細菌が、停滞条件下で一晩増殖した後の両方の表面をカーペット処理することを示した（図１４および１５参照）。一晩の増殖後に新しいＴＳＢを溝に流入させることにより、バイオフィルムがよく成長することを可能にした。実際、ＴＳＢフローが開始された後に電気信号が増加し（図２のグラフＤ−Ｆ）、これはＰＹＯの生成速度の増加を示している。後の時点での第２のピークの存在が観察された。第１のピークはＰＹＯによるものであるが、第２のピークの出現は文献で５−メチルフェナジン−１−カルボン酸またはその誘導体の１つとして報告されている第２のフェナジン誘導体の電気化学的反応に起因する（V. B. Wang, S. L. Chua, B. Cao, T. Seviour, V. J. Nesatyy, E. Marsili, S. Kjelleberg, M. Givskov, T. Tolker-Nielsen, H. Song, J. S. Loo and L. PloS One, 2013, 8, e63129. D. L. Bellin, H. Sakhtah, J. k. Rosenstein, P. M. Levine, J. Thimot, K. Emmett, L. E. Dietrich and K. L. Shepard, Nat Commun, 2014, 5, #3256.）。

ピーク電流が測定された流れの開始後の酸化電位の変化は、これらの検討の参考として使用された内部Ａｇ／ＡｇＣｌペレットに起因する可能性がある。流体の流れによるドリフトは、試験流体との直接接触における基準を有することの避けられない結果である（M. W. Shinwari, D. Zhitomirsky, I. A. Deen, P. R. Selvaganapathy, M. J. Deen and D. Landheer, Sensors, 2010, 10, 1679-1715. 40. L. Rassaei, K. Mathwig, E. D. Goluch and S. G. Lemay, J Phy Chem C, 2012, 116, 10913-10916.）。測定されたピーク電位は、一定の流体流量で経時的に安定化され、この新しい電位におけるピーク電流を計算に使用した。時間の経過に伴うピークの移動は、図１６−１７で観察される。従来のＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（BASi MW-2030）を用いたＰＡ１４培養物の測定は、ＰＹＯピーク電流が予想される電位で現れたことを示した。

ＳＷＶは、硫酸コリスチンに細胞を曝露している間に３０分ごとに採取した。緑膿菌および大腸菌を、４，１６および１００ｍｇ／Ｌのコリスチン硫酸に１００ｎＬ／分の流速で別々に曝露した。興味深いことに、緑膿菌と比較して硫酸コリスチンに曝露された大腸菌細胞について、ＳＷＶからの識別可能なピークの完全な欠如がある（図Ｓ５−Ｓ７）。スキャンは１回の反復で行われるが、取得されたすべてのスキャンを代表する。

全体的な電気信号は経時的に増加したが、流体の流れの開始時には一貫して減少が観察された。観察された結果には２つの可能性がある。第１に、バイオフィルムが如何にしっかりとマイクロ流体チャネルの表面に付着しているかの指標となり得る。細胞接着に対するせん断応力の役割はこれまでに検討されてきた。結果は、細胞が高いせん断応力で表面から除去され得ることを示す（J.-C. Ochoa, C. Coufort, R. Escudie, A. Line and E. Paul, Chem Engin Sci, 2007, 62, 3672-3684. Y.-P. Tsai, Biofouling, 2005, 21, 267-277.）。増殖培地が溝を通って流れるので、バイオフィルムがしっかりと取り付けられていない場合、細菌を除去する可能性がある（M. M. Salek, S.M.Jones and R.J.Martinuzzi,Biofouling, 2009, 25, 711-725）。細菌の除去は、次にセンサ付近のＰＹＯの生成を減少させる（電気信号を低下させる）。この研究での適用流量は他のグループで使用されているものと類似しており、細菌バイオフィルムの有意な除去を回避するのに十分遅いはずであるので、これは起こりそうもない（J. Kim, H. D. Park and S. Chung, Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation, Molecules, 2012, 17, 9818-9834. K. P. Kim, Y. G. Kim, C. H. Choi, H. E. Kim, S. H. Lee, W. S. Chang and C. S. Lee, Lab Chip, 2010, 10, 3296-3299.）。

第２に、信号の減少は、流れ中に溶液中のＰＹＯが除去されていることによるものであり、信号がリバウンドするのは、対流輸送を克服するために十分に高い濃度のＰＹＯが生成された場合に限られる。Ｋｏｌｅｙら（２０１１）は、走査型電気化学顕微鏡法を用いて緑膿菌のバイオフィルムにＰＹＯ勾配（電子連続体；electrocline）が存在することを実証した（M. M. R. D. Koley, A.J. Bard, M. Whiteley, Proc Nat Acad Sci USA, 2011, 108, 19996-20001.）。著者らは、この電子連続体がバイオフィルムの表面上に数百ミクロン広がっていることを示した。流体の流れによるＰＹＯ電子連続体の変化は、バルク流体の流れが開始したときの信号の初期低下の原因となりそうである。それにもかかわらず、マイクロ流体チャンバ内の流れの開始後でさえも、ピーク電流は、細胞が実際にチャンバ内で増殖していることを依然示している（図１１Ａ、１１Ｂ、および１７−１９）。

ＴＳＢ中の大腸菌は、この電圧ウィンドウにおいてレドックス活性である分子を産生することは期待されないので、対照として使用した（D. Sharp, P. Gladstone, R. B. Smith, S. Forsythe and J. Davis, Bioelectrochemistry, 2010, 77, 114-119. T. A. Webster, H. J. Sismaet, J. L. Conte, I. P. J. Chan and E. D. Goluch, Biosens Bioelectron, 2014, 60, 265-270.）。識別可能なピークの欠如は、大腸菌によって産生される電気化学分子が存在しないこと、および実験の間に環境から緑膿菌によるチャンバの汚染がないことを確認する（図１７および１９参照）。大腸菌細胞からの酸化ピークの欠如は、他の細菌種の抗生物質感受性を電気化学的にモニターするための提案されたアプローチの限界を強調する。あるいは、ＰＹＯの産生によるＰＡ１４の生存率を電気化学的に測定する能力は、患者試料中の緑膿菌の有用な選択マーカーであり得る（T. A. Webster, H. J. Sismaet, J. L. Conte, I. P. J. Chan and E. D. Goluch, Biosens Bioelectron, 2014, 60, 265-270.）。さらに、増殖チャンバを作製するために使用されるＰＤＭＳの透明性は、文献に報告されているように、蛍光細菌種およびマーカーの使用を容易にする（J. Kim, H. D. Park and S. Chung, Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation, Molecules, 2012, 17, 9818-9834. K. P. Kim, Y. G. Kim, C. H. Choi, H. E. Kim, S. H. Lee, W. S. Chang and C. S. Lee, Lab Chip, 2010, 10, 3296-3299.）。

緑膿菌の一晩増殖後、ＴＳＢ中の４，１６および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンフローを０．１００μＬ／分で開始した。これらの濃度は、文献で報告されている硫酸コリスチンＭＩＣ値の範囲をカバーするように選択した(J. M. Andrews, J. Antimicrob Chemother, 2001, 48, 5-16.）。硫酸コリスチン（４および１６ｍｇ／Ｌ）の報告されたＭＩＣ濃度がＰＹＯ産生にどのような影響を及ぼすかを決定するためにＳＷＶ測定を行った。これは、次に、硫酸コリスチンに対する緑膿菌バイオフィルム感受性の指標となり得る。硫酸コリスチン濃度当たり３個のデバイスを使用し、平均ピーク電流を報告した（図１１Ａおよび１６）。エラーバーは、特に断らない限り、その時点での３回の別々の測定の平均の標準偏差を表す。対照として、大腸菌バイオフィルムを同じ濃度の硫酸コリスチンに曝露した。これらの試験のために、１濃度あたり１回の反復を行った。電気化学的に活性な分子の欠如を意味する硫酸コリスチンに曝露された大腸菌について、酸化ピークは観察されなかった（図Ｓ２〜Ｓ４）（D. Sharp, P. Gladstone, R. B. Smith, S. Forsythe and J. Davis, Bioelectrochemistry, 2010, 77, 114-119. E. Kim, T. Gordonov, W. E. Bentley and G. F. Payne, Anal Chem, 2013, 85, 2102-2108.）。

ＡＮＯＶＡを用いて、３つの抗生物質濃度の平均ピーク電流と抗生物質を含まない対照実験との間の有意差を同定した（図１１Ａ）。この分析は、対照と比較した場合、１６および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチン濃度に曝露されたＰＡ１４の平均ピーク電流が有意に低かった（Ｐ＜０．０５）ことを示した。１６および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露されたＰＡ１４についての試験終了時の最大ピーク電流の平均減少率は、対照実験の細胞によって生成された電流と比較してそれぞれ６８％および８２％であった。対照細胞と比較した測定電流の平均減少率は、％減少=１００＊（Ｉｔ−Ｉｃ）／Ｉｃにより計算した。ここで、Ｉｔは時間ｔにおける平均ピーク電流に等しく、Ｉｃは対照の緑膿菌細胞の平均ピーク電流である。減少した電流応答は、測定されたＰＹＯの減少に直接関係しており、硫酸コリスチン濃度とＰＹＯ生成との間の相関を示している。対照的に、４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンで処理した細胞の平均応答は、ＴＳＢのみに曝露したバイオフィルムと比較して有意な差を示さず、より低いＭＩＣ値がＰＹＯの生成に有意に影響しないことを示した。

重要なことに、図１１Ａおよび１１Ｂは、連続的な電気化学的モニタリングが、研究者がＰＹＯ産生の減少を介して抗シュードモナス抗生物質の有効性を見ることを可能にすることを示す。図２０は、この種に対して有効でない抗生物質であるアンピシリンに曝露されたＰＡ１４がＰＹＯ産生に効果を奏さないことを示すことによって、これらの結果を支持する。細菌によって産生されるＰＹＯの量を減少させることにより、ホストの身体は感染をより効果的に撲滅することができる (G. M. Denning, L. A. Wollenweber, M. A. Railsback, C. D. Cox, L. L. Stoll and B. E. Britigan, Infect Immun, 1998, 66, 5777.) 。（図２０に関して、ＰＡ１４細胞は、１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチン曝露を受けたものと同じ条件下で１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンに曝露された。）２つの抗生物質とのＳＷＶの比較を図２０に示す。アンピシリンに曝露された細胞は、硫酸コリスチンに曝露された細胞と比較して電気化学的応答を示し続けた。これは、アンピシリンは緑膿菌を殺すのに効果がないことが知られているので予想された。

この検討で使用された最も低いＭＩＣ値に対するＰＡ１４の固有抵抗は、なぜピオシアニン応答がブランク測定値と有意に異ならないのかを説明することができた。４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチン寒天プレート上で培養されたＰＡ１４の液体試料は増殖することができ、この濃度が浮遊細胞付着および増殖に効果を奏さないことを示した（図２１）。このように、この濃度に曝露されたＰＡ１４のバイオフィルムは影響を受けず、同レベルのピオシアニンを生成することは理に適っている。

図２１に示すように、３ｍＬのＴＳＢ中で一晩増殖させたＰＡ１４の液体培養物を、０、４、および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンを含有するセトリミド寒天プレート上に直接蒔いた。これらのプレートを３７℃で一晩培養した。次いで、プレートを細菌増殖について検査した（図２１）。０および４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンを含むプレートは増殖を示したが、１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンを含むプレートはコロニー形成を示さなかった。４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンのより低いＭＩＣ値でのコロニー形成は、図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１２に報告された結果と一致する。

３つの異なる濃度の硫酸コリスチンに曝露した後に測定した生存細胞の数を比較した（図１１Ｂ）。バイオフィルムをデバイス内の抗生物質に曝露した後、ＰＤＭＳチャンバを剥がし、１００μＬの新鮮なＴＳＢをバイオフィルム上にスポット滴下し、激しくピペットで採取して電極の表面から物質を除去した。取り除かれた試料は、血球計を使用して、Millipore 3P Live / Dead Stainで行った生存細胞数の測定に使用した。各測定は三回実施され、誤差バーは平均の標準偏差の１つを示す。硫酸コリスチンに曝露されていないバイオフィルムにおいて、約４×１０^５個の生存細胞／ｍＬの濃度が測定された。バイオフィルムは、典型的には、撹拌された液体培養物よりも低い濃度の生細胞を有する。生きたＰＡ１４細胞の数の統計学的に有意な減少を、１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された試料について、０および４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された細胞と比較して測定した。生存細胞数の約２倍の減少は、ＰＹＯシグナルの減少が生存細胞数の減少と相関するという仮説を支持する。最近、Ｃｏｎｎｅｌｌら（２０１４）は、チャンバ内に閉じ込められた細胞の数と細胞周囲に存在するＰＹＯの濃度との間の相関関係を示すことによって、これらの発見も支持した（J. L. Connell, J. Kim, J. B. Shear, A. J. Bard, and M. Whiteley, Proc Nat Acad Sci USA, 2014, 111, 18255-18260.）。

図１２は、マイクロ流体デバイス中の４および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された細胞についての３つの異なる時点での培養結果を示す。わずか４．３時間の培養後に４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された試料では、この濃度が細胞の生存率にほとんど影響を与えないことを示唆した（図２２）。６．５時間培養後に１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された細胞について、増殖は観察されなかった。７４時間後に１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露されたチャンバから採取した試料について増殖が観察され、これはチャンバ内からの生存細菌の完全な除去が達成されなかったことを示している。生存細胞染色の定性的結果は、培養プレート実験と一致する。しかし、１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチン（図１１Ｂ）に曝露されたバイオフィルム中の生存細胞濃度は、寒天プレート上でのコロニー形成速度の減少と比較して、予想よりも高い（図１２）。まとめると、これらの結果は、この抗生物質に曝露された細胞が代謝活性を低下させて抗生物質に対する感受性を低下させる可能性があることを示唆している。

図２２に関して、４および１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに１００ｎＬ／分で流して曝露した後、ＰＤＭＳチャンバを使い捨て電極から剥がした。滅菌ループを電極上に置き、その後、新鮮なＴＳＢ寒天プレート上に筋付けした。試料を３７℃で培養し、増殖を監視した。４ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された細胞は、わずか４時間の培養後に可視のコロニーを産生し始めた。１００ｍｇ／Ｌの硫酸コリスチンに曝露された細胞からコロニーを形成するためには、２４時間以上の培養が必要であった。これは、細胞が、高濃度の溶液中の硫酸コリスチンの存在によって影響されたことを示す。

これらの結果は、文献の発見を支持し、微生物バイオフィルムに対する報告されたＭＩＣより低い効力への注意を喚起する（K. P. Kim, Y. G. Kim, C. H. Choi, H. E. Kim, S. H. Lee, W. S. Chang and C. S. Lee, Lab Chip, 2010, 10, 3296-3299.）。図１１Ａ、１１Ｂおよび１２の結果から、硫酸コリスチンへの曝露下でのＰＹＯ産生の減少がＰＡ１４の生存率の低下と相関することは明白である。このピオシアニンの減少および阻害された増殖速度は、ヒトの免疫応答が細菌感染をうまく解消することを可能にする（L. Allen, D. H. Dockrell, T. Pattery, D. G. Lee, P. Cornelis, P. G. Hellewell and M. K. B. Whyte, J Immunol, 2005, 174, 3643-3649. L. R. Usher, R. A. Lawson, I. Geary, C. J. Taylor, C. D. Bingle, G. W. Taylor and M. K. B. Whyte, J Immunol, 2002, 168, 1861-1868. R. Wilson, T. Pitt, G. Taylor, D. Watson, J. Macadermot, D. Sykes, D. Roberts, and P. Cole, J Clin Invest, 1987, 79, 221-229.）。

この検討は、抗生物質に曝露されたバイオフィルムによって産生される代謝産物をモニタするために、電気化学センサを使用する可能性を初めて示している。この電気化学的アプローチ（〜４５時間）を用いて検出する時間は、標準的な培養プレート技術に匹敵する。細菌種の単純な同定は２４時間以内に達成することができるが、感度試験では、いくつかのプレートでさらに２４〜７２時間の培養が必要であった。最初の２４時間のコロニー形成期間後数分以内に感度情報を提供する生化学的および分子的方法が市販されているが、高価な試薬／器具および追加の試料処理が必要である。提案された方法の分析時間は、小型の微細加工された電気化学センサを使用することによって低下させることができ、今度は、この現在の検討で利用されているマイクロ流体チャンバと比較してより小さいマイクロ流体チャンバを使用することができる。より小さいチャンバは、細胞に課された閉じ込めのために、検出するための時間を潜在的に減少させるであろう。

創傷感染などの医療状況では、バイオフィルムは急速に形成され、即時処置が必要である。このアプローチは、より成熟した、または任意の数の他の実験変数に曝されたバイオフィルムを検討するためにも利用することができる。最終的に、感受性の決定のための電気化学的センサは、低資源設定または抗生物質で処置されている間のインビボでの感染の状態をモニタリングするために価値があり得る。

本明細書に記載の実施態様のさまざまな特徴は、さまざまな方法で組み合わせることができることが理解されよう。例えば、ある実施態様に関連して説明された特徴は、その実施態様と関連して明示的に記載されていなくても、別の実施形態に含まれてもよい。
本発明を特定の好ましい実施態様に関連して説明した。本発明は、示され説明された構成、動作、正確な材料または実施態様の正確な詳細に限定されず、本明細書に開示された実施態様に対するさまざまな変更、等価物の置換、組成物の変更、およびその他の変更は、当業者には明らかであろう。

Claims (21)

1. 患者における緑膿菌細菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法であって、
   （ａ）患者からの流体試料を、作用電極および参照電極を含有する、患者に埋め込まれないマイクロ流体デバイスに導入すること、
   （ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するために電気化学的測定を行うこと、
   （ｃ）ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定し、
   ここで、流体試料中のピオシアニン濃度が、バイオフィルムの生存率の尺度を提供し、そして
   （ｄ）ステップ（ｃ）で決定されたピオシアニン濃度に基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の生存細胞数を推定することを含む、
   前記方法。
   
2. ピオシアニンの濃度が、作用電極を通る電流の線形関係に基づいて、ステップ（ｃ）において決定される、請求項１に記載の方法。
3. 作用電極を通る電流が１μＡ未満の場合、バイオフィルムが非生存または不存在とみなされる、請求項１に記載の方法。
4. 電気化学的測定が、矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択され、好ましくは電気化学的測定が矩形波ボルタンメトリーであり、電流が１以上の矩形波電位に応答して測定される、請求項１に記載の方法。
5. マイクロ流体デバイスは第２の作用電極を含み、
   作用電極は酸化電極および還元電極の一方であり、第２作用電極は酸化電極および還元電極の他方であり、
   ピオシアニンの濃度は、酸化電極および還元電極を通る電流として測定される、請求項１に記載の方法。
6. １０μＬ以下の流体試料体積が導入される、請求項１に記載の方法。
7. ステップ（ａ）において、流体試料をマイクロ流体デバイス中に連続的に導入することをさらに含む、またはステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 流体試料をデバイスへくみ出すためにマイクロ流体デバイスの入口またはその近傍にキャピラリまたは芯材を配置する、請求項１に記載の方法。
9. マイクロ流体デバイスが患者によって着用される、または
   マイクロ流体デバイスが創傷被覆材内、または創傷被覆材用の吸収パッド内または近傍に埋め込まれる、請求項１に記載の方法。
10. マイクロ流体デバイスが創傷被覆材、包帯、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスク、顔面マスク、外科用マスク、または挿管チューブ、コンタクトレンズケース、尿収集カップ、または尿バッグに存在する、請求項１に記載の方法。
11. 流体試料が、嚢胞性線維症、人工呼吸器関連肺炎、慢性創傷、火傷、外科用インプラント、または手術部位を有するヒト由来であるか、または、創傷滲出液、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、髄液、涙および血液からなる群から選択される体液である、請求項１に記載の方法。
12. 患者における緑膿菌感染の抗生物質処置の有効性をモニタリングする方法であって、
    （ａ）患者からの流体試料を、作用電極および参照電極を含む、患者に埋め込まれないマイクロ流体デバイスに導入すること、
    （ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うこと、
    （ｃ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、液体試料中のピオシアニンの濃度を決定し、
    ここで、流体試料中のピオシアニン濃度が、抗生物質処置の有効性の尺度を提供し、そして
    （ｄ）ステップ（ｃ）で決定されたピオシアニン濃度に基づいて、バイオフィルム中の緑膿菌の生存細胞数を推定することを含む、
    前記方法。
13. ピオシアニンの濃度が、閾値レベルを上回る場合か、または、ピオシアニンの濃度が所定の時間間隔後に閾値レベルを下回らない場合、抗生物質の増加した用量を投与するための、請求項１２に記載の方法。
14. ピオシアニンの閾値レベルが５μＭ未満の濃度である、請求項１３に記載の方法。
15. 所定の時間間隔が少なくとも１２時間である、請求項１３に記載の方法。
16. ピオシアニンの濃度が閾値レベル未満に低下した場合、抗生物質の減少した用量を投与するか、または抗生物質を停止させるための、請求項１２に記載の方法。
17. ピオシアニンの閾値レベルが５μＭ未満の濃度である、請求項１６に記載の方法。
18. 抗生物質が硫酸コリスチンまたはシプロフロキサシンである、請求項１２に記載の方法。
19. 緑膿菌を含むバイオフィルムに対する抗生物質の有効性をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）作用電極および参照電極を含有する、患者に埋め込まれないマイクロ流体デバイス内の増殖チャンバ内に緑膿菌を含む試料を導入すること、
    （ｂ）緑膿菌を増殖させて増殖チャンバ内にバイオフィルムを形成させること、
    （ｃ）選択された濃度の抗生物質をデバイスの増殖チャンバ内に導入すること、
    （ｄ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うこと、
    （ｅ）ピオシアニンの既知の濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を使用することによって試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
    ここで、閾値未満のピオシアニンの濃度は抗生物質の有効性を示し、
    ここで、値レベルが、好ましくは少なくとも５μＭの濃度を含み；
    および好ましくは1以上の：
    ピオシアニンの濃度が閾値レベルを超える場合、緑膿菌の存在の指標を提供すること；または
    ステップ（ａ）が、緑膿菌を含む試料を、マイクロ流体デバイス内の複数の増殖チャンバ内に導入することを含み、およびステップ（ｃ）が、複数の濃度の抗生物質の有効性をスクリーニングするために、選択された異なる濃度の抗生物質を各増殖チャンバ内に同時に導入することを含む；または
    抗生物質の異なる濃度でステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を繰り返すこと；またはステップ（ｂ）において、抗生物質を増殖チャンバ内に連続的に導入することを含む、前記方法。
20. 緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングする方法であって、
    （ａ）作用電極および参照電極を含む、患者に埋め込まれないマイクロ流体デバイスに流体試料を導入すること、
    （ｂ）流体試料中のピオシアニンを検出するための電気化学的測定を行うこと、
    （ｃ）ピオシアニン濃度と作用電極を通る電流との間の予め決定された相関を用いて、流体試料中のピオシアニンの濃度を決定することを含み、
    ここで、流体試料中のピオシアニン濃度は、バイオフィルムの生存率の尺度を提供し、；および
    マイクロ流体デバイスが、好ましくは、コンタクトレンズケース、尿バッグ、尿収集カップ、投薬ポンプ、水パイプ、バイオリアクター、または水ポンプに配置される、前記方法。
21. 緑膿菌を含むバイオフィルムの生存率をモニタリングするためのデバイスであって、
    基板内に配置されたマイクロ流体またはナノマイクロ流体チャネル、マイクロ流体またはナノ流体チャネル内に配置された作用電極と、マイクロ流体またはナノ流体チャネル内に配置された参照電極とを含む、マイクロ流体またはナノ流体電極アセンブリを含むセンサと、
    プロセッサおよびメモリを含む制御システムであって、メモリに記憶された機械可読命令がプロセッサによって実行されると、作用電極および参照電極における電圧を制御し、既知の濃度のピオシアニンと作用電極を通る電流との間の予め決定された相関関係を使用することによって、マイクロ流体またはナノ流体チャネル中の流体試料中のピオシアニンの濃度を決定する、前記制御システムとを含み；および、ここで
    デバイスは、好ましくは約５μＭ〜約１ｍＭの範囲にわたるピオシアニンの濃度の指標を提供するように動作可能であるか、またはピオシアニンの濃度が約５μＭの閾値レベルを上回る場合に、緑膿菌の存在の指標を提供するように動作可能である；または、
    ピオシアニンの濃度は、好ましくはメモリに記憶された作用電極を通る電流の線形関係から決定される；または
    センサは、好ましくは使い捨てであるか、または
    センサは、創傷被覆材に埋め込まれているか、創傷被覆材のための吸収パッドの内部または近傍に埋め込まれているか、または、創傷被覆材、外科用インプラント、カテーテル、人工呼吸器マスク、挿管チューブ、またはコンタクトレンズケース内に存在し；または
    制御システムは、好ましくはプロセッサおよびセンサと通信するポテンシオスタットをさらに含み、ポテンシオスタットは、作用電極および参照電極における電圧を制御するように動作可能であり、ポテンシオスタットがバッテリー駆動であるか、またはケーブルによってポテンシオスタットに接続可能であり；または
    制御システムは、好ましくは矩形波ボルタンメトリー、線形掃引ボルタンメトリー、ステアケースボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、方形波パルスボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、およびクロノアンペロメトリーからなる群から選択される、電気化学的測定を行うように動作可能であり、およびより好ましくは、電流は、１つ以上の矩形波電位に応答して測定される；または
    制御システムは、好ましくは電気通信ネットワーク接続をさらに含有するか、または
    制御システムは、好ましくは決定されたピオシアニン濃度、緑膿菌の存在の指標、および緑膿菌の細胞数の指標の１以上を表示するように動作可能なディスプレイと通信する、前記デバイス。

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