JP6917040B2 - 破骨細胞の形成または活性化抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、破骨細胞の形成または活性化抑制剤に関する。詳しくは、歯周病の予防または治療の分野に関する。

歯周病は、歯周病原性細菌によって引き起こされる炎症性疾患であり、炎症の増大と慢性化に伴い、歯を支える骨組織（歯槽骨）が破壊される疾患である。日本における歯周病の患者数は２，０００万人を超えると推定される。近年、Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（生活の質）向上に向けたオーラルケアの重要性が注目されているが、超高齢化社会の到来により、その重要性がさらに高くなることが見込まれる。

従来、歯周病の予防、改善にはその一番の原因である歯周病原性細菌の殺菌、除去を目的とした殺菌剤、抗菌剤が用いられており、また、歯周組織の炎症予防、治療には抗プラーク剤によるプラーク抑制および抗炎症剤が用いられている。歯周病原性細菌を殺菌、除去し、プラークを除去した口腔内環境を維持することで、軽度な歯周病の場合には炎症が改善され、歯周組織は健全な状態に戻ることが知られている。歯周病の治療方法としては外科的治療方法；ペリオクリンやファンギゾンという抗生物質による薬物治療法；チアゾール化合物もしくはその薬学的に許容される塩からなる骨粗鬆症、骨折、歯周病等、種々の骨疾病・障害の治療薬（特許文献１）；抗ＣＤ１４抗体を有効成分として含有する歯周病治療薬（特許文献２）；血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）に対する抗体を含む製剤からなることを特徴とする歯周病治療薬（特許文献３）等が知られている。

一方、骨の吸収については、骨粗鬆症の問題から研究が進められており、骨形成促進効果を有する剤や骨吸収抑制効果を有する剤が、医薬品や食品成分から見出され利用されている。アミノ酸については多様な生理作用が報告されているが、例えば、骨成長、骨量増加、骨粗鬆症防止のために、アシルアミノ酸を使用する方法が知られている（特許文献４）。内因性のＮ−長鎖アシルアミノ酸であるオレオイルセリンは、骨吸収を阻害し、骨リモデリングと骨量の調節作用を有することが知られている（非特許文献１）。アシルアミノ酸を歯周病の予防、改善のために使用することも知られている。例えば、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸を含む歯磨剤であって、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸が虫歯の発生の主因となっているラクトバチルス属細菌、および歯槽膿漏の発生の主因となっているスタフィロコッカス属細菌に対し顕著な抗菌作用を有することが知られている（特許文献５）。また、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸塩と水溶性第２リン酸塩を含む歯磨剤であって、炭素原子数８ないし２２個の飽和または不飽和のアシル基を有するアミノ酸塩と水溶性第２リン酸塩との併用による歯垢付着防止効果が知られている（特許文献６）。

特開平１１−２０９２８４号公報 特開平１０−１１４６７９号公報 特開２００２−０９７１５７号公報 国際公開第２００９／１２５４０９号 特公昭第４５−２４４８０号公報 特開昭第５０−５３５４５号公報

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.107, No.41, 17710-17715 (2010)

しかしながら、歯周病が進行し、歯槽骨の吸収が引き起こされるレベルに至ると、改善の可能性は低下し、まして歯槽骨の吸収の結果、歯が喪失されてしまった場合には、健全な歯周組織および歯の回復は望めない。歯周病による歯槽骨の吸収は、歯周病原性細菌により進行するために局所的、かつ、骨粗鬆症に比べてより速い速度で進行する。そのため、骨粗鬆症に有効な剤ではなく、歯周病による歯槽骨の吸収に有効な歯槽骨吸収抑制剤が求められている。
本発明の目的は、歯槽骨の吸収抑制剤として有用な破骨細胞の形成または活性化抑制剤、さらには、歯周病を予防または治療するために有効な口腔用組成物を提供することにある。

アミノ酸の骨吸収に関わる研究は少なく、また、口腔内炎症への作用も不明である。そこで、本発明者らは、多様な生理作用が報告されているアミノ酸に着目し、アミノ酸による口腔環境の維持作用の主因として、アミノ酸および関連因子（アミノ酸類）の骨代謝調節への影響を鋭意検討した結果、特定のＮ−アシル分岐鎖アミノ酸が破骨細胞の形成または活性化を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を含有する、破骨細胞の形成または活性化抑制剤。
［２］アシル基の炭素数が８〜１６である、［１］に記載の抑制剤。
［３］Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸がＮ−アシルバリンである、［１］または［２］に記載の抑制剤。
［４］Ｎ−アシルバリンがＮ−デカノイルバリンまたはＮ−ラウロイルバリンである、［３］に記載の抑制剤。
［５］歯槽骨の吸収抑制剤である、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の抑制剤。
［６］Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を含有する、歯周病の予防または治療用口腔用組成物。
［７］アシル基の炭素数が８〜１６である、［６］に記載の組成物。
［８］Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸がＮ−アシルバリンである、［６］または［７］に記載の組成物。
［９］Ｎ−アシルバリンがＮ−デカノイルバリンまたはＮ−ラウロイルバリンである、［８］に記載の組成物。
［１０］歯磨剤、洗口剤、口腔用軟膏剤、口腔用ゲル剤、口中清涼剤、口腔用パスタまたは含嗽剤である、［６］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物。

本発明の破骨細胞の形成または活性化抑制剤は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩が前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制することにより、特に、歯槽骨における骨吸収活性を有意に低減する効果を奏する。
従って、本発明の破骨細胞の形成または活性化抑制剤は、歯槽骨の吸収抑制剤として特に有用である。
また、本発明の歯周病の予防または治療用口腔用組成物は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩が、歯槽骨における骨吸収活性を有意に低減する作用と界面活性作用とを併せ持つことにより、歯周病の予防または治療を目的としたオーラルケア製品として優れる。

実施例１において、マウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養系における破骨細胞の分化に及ぼすバリンおよびＮ−アシルバリンの影響を示すグラフである。グラフの上段は、ＴＲＡＰ染色の結果を示す。 実施例２において、マウス頭頂骨器官培養系における骨吸収活性に及ぼすバリンおよびＮ−アシルバリンの影響を示すグラフである。 実施例３において、マウス歯槽骨器官培養系における骨吸収活性に及ぼすバリンおよびＮ−アシルバリンの影響を示すグラフである。 実施例４において、マウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養系でのＴＲＡＰ染色の結果を示す。図中、Ｃ１２はＣ１２−Ｖａｌを示し、括弧内の数字は濃度（μＭ）を示す。 実施例４において、マウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養系における破骨細胞の分化に対するＮ−アシルアミノ酸の抑制効果を示すグラフである。

（破骨細胞の形成または活性化抑制剤）
本発明の破骨細胞の形成または活性化抑制剤（以下、本明細書において「本発明の剤」ともいう）は、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を有効成分として含有する。

本発明において破骨細胞とは、骨再構築過程において骨を破壊（骨吸収）する役割を担っている細胞をいい、数個（例えば５個）ないし数十個（例えば２０個）あるいはそれ以上の核をもつ多核巨細胞である。破骨細胞の細胞質は好酸性を示し、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を有する。細胞が破骨細胞である否かは、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を測定することにより確認することができる。ＴＲＡＰ活性の測定方法は、実施例に記載されている。

本発明において破骨細胞の形成または活性化抑制とは、分化した破骨細胞数の増加を抑制すること、または前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制すること、あるいは、分化した破骨細胞の活性化（骨吸収活性の増加）を抑制することをいう。ここで、前駆細胞としては、骨髄由来の単球（monocyte）、マクロファージ（macrohage）等が挙げられる。

本発明の剤に有効成分として含まれるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸は、分岐鎖アミノ酸のアミノ基がアシル基で置換されているものである。ここで、分岐鎖アミノ酸としては、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられ、好ましくは、バリンである。また、分岐鎖アミノ酸は、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれであってもよいが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。

前記アシル基は、好ましくは、炭素数が８〜１６の飽和または不飽和のアシル基である。具体的には、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基等が挙げられる。より好ましくは、炭素数が１０〜１４の飽和または不飽和のアシル基であり、具体的には、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、ミリストレイル基が挙げられる。さらに好ましくは、炭素数が１０〜１２の飽和アシル基であり、具体的にはデカノイル基、ラウロイル基が挙げられる。

前記Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸としては、１種のみを用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。破骨細胞の形成または活性化抑制作用の観点からは、Ｎ−アシルバリンが好ましく、Ｎ−デカノイルバリンまたはＮ−ラウロイルバリンがより好ましい。

また、前記Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸は、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、低級アルコールアミン塩等を挙げることができ、薬理上許容される塩を選択することが好ましい。
薬理上許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩等の低級アルコールアミン塩等が挙げられる。

前記Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩は、公知の方法により製造することができる。公知の方法としては、例えば、アミノ酸と脂肪酸ハライドとのショッテンバウマン反応が挙げられる。また、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩は、市販品を用いることもできる。

本発明の剤は、あらゆる骨における破骨細胞の形成または活性化を抑制するものであってもよいが、歯槽骨における破骨細胞の形成または活性化を抑制するものであることが、歯槽骨の吸収抑制剤として有用であるため、好ましい。

本発明の剤に含まれるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩の含有量は、破骨細胞の形成または活性化抑制作用を奏する限り、特に限定されるものではないが、通常、０．００１重量％〜１００重量％であり、好ましくは、０．０１重量％〜９９重量％である。

本発明の剤は、液状、半固形状、固形状のいずれの形態であってもよく、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、泥膏（パスタ）剤、硬膏剤、散剤、顆粒剤、錠剤等、種々の剤形で提供することができる。

本発明の剤は、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩以外に、任意の担体または添加剤を含んでもよい。任意の担体または添加剤としては、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩の破骨細胞の形成または活性化を抑制する作用を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、本発明の剤の剤形に応じて、後述する本発明の歯周病の予防または治療用口腔用組成物で用いられる任意の担体または添加剤から、限定なく選択することができる。

各種剤形の本発明の剤は、一般的な製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された製法に準じて、調製することができる。

本発明の剤の適用対象としては、歯周病に罹患するおそれのある哺乳動物、たとえばヒトの他、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。
本発明の剤の摂取または投与量は、適用対象、年齢、症状等により適宜決定される。本発明の剤の１日あたりの摂取または投与量は、１回で摂取させまたは投与してもよく、数回に分けて摂取させまたは投与してもよい。

本発明の剤は、前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制し、特に、歯槽骨における骨吸収活性を良好に低減することができる。
従って、本発明の剤は、歯槽骨の吸収抑制剤として有用である。

（歯周病の予防または治療用口腔用組成物）
本発明はまた、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を有効成分として含む、歯周病の予防または治療用口腔用組成物（以下、本明細書において「本発明の組成物」ともいう）を提供する。

本発明の組成物において、有効成分として含まれるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩は、上記した本発明の剤に含まれるものと同様である。

本発明の組成物は、歯周病の予防または治療を目的として、口腔内に適用されるものである。ここで、歯周病の治療とは、治療のみならず、歯周病の改善および少なくとも進行の抑制をも含む概念である。このような目的のため、本発明の組成物は、例えば口腔用液剤、口腔用ゲル剤、口腔用軟膏剤、口腔用パスタ、口腔用クリーム剤、口腔用錠剤（咀嚼錠、トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、ガム剤）、歯周ポケット挿入剤、口腔用貼布剤、含嗽剤、口腔用スプレー剤、各種歯磨剤、洗口剤、口中清涼剤（マウスウオッシュ）、義歯安定剤等、液状、乳状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、固形状等の種々の剤形に調製し、適用することができる。本発明の組成物の好ましい剤形は、歯磨剤、洗口剤、口腔用軟膏剤、口腔用ゲル剤、口中清涼剤、口腔用パスタまたは含嗽剤である。

本発明の組成物におけるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩の含有量は、歯周病の病態、予防または治療の達成目標の程度、組成物の剤型等に応じて、適宜設定することができる。通常０．０１重量％〜５０重量％であり、好ましくは０．０５重量％〜２０重量％であり、より好ましくは０．１重量％〜１０重量％である。

本発明の組成物は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩以外に、各種薬効成分や、任意の担体または添加剤を含むことができる。かかる薬効成分、担体または添加剤としては、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩の作用を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、組成物の剤型に応じて適宜選択することができる。

各種薬効成分としては、例えば、クロルヘキシジン、塩化ベンゼトニウム、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、ヒノキチオール等の抗菌剤；フッ化ナトリウム、フッ化第一錫、モノフルオロリン酸ナトリウム等のフッ素化合物；デキストラナーゼ、ムタナーゼ、プロテアーゼ等の歯垢形成抑制剤；トラネキサム酸、ε−アミノカプロン酸等の止血剤；アズレン、アラントイン、塩化リゾチーム、グリチルリチン酸類、グリチルレチン酸類等の抗炎症剤；ポリリン酸類等の歯石予防剤；塩化ナトリウム等の歯肉収れん剤；デキストラナーゼ、アミラーゼ等の酵素；トウキ、オウバク、チョウジ、オウゴン、ベニバナ等の植物抽出物；酢酸トコフェロール等の各種ビタミン；グリシン、プロリン、グルタミン酸、アルギニンなどのアミノ酸類が挙げられる。

担体または添加剤としては、例えば、溶剤、基剤、発泡剤、研磨剤、湿潤剤、界面活性剤、甘味剤、酸味剤、香料、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、着色剤、顔料、有機粉体、賦形剤等、食品または医薬品の経口製品に配合可能な成分が挙げられる。

溶剤としては、エタノール、プロパノール、イソプパノール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール；精製水；生理食塩水；リンゲル液等が挙げられる。

基剤としては、オリーブ油、カカオ脂、ヒマシ油等の植物性油脂；白色ワセリン、流動パラフィン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素；カルナウバロウ、サラシミツロウ等のロウ；ミリスチルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等の脂肪族アルコール；ミリスチン酸、ステアリン酸等の脂肪酸；カラギーナン、キサンタンガム等の多糖類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；ポリオキシエチレングリコール１５００、ポリオキシエチレングリコール４０００、ポリオキシエチレングリコール６０００等のポリオキシエチレングリコール等が挙げられる。

発泡剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム，ラウロイルサルコシンナトリウム等が挙げられる。また、本発明の組成物の有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩、ならびに後述する界面活性剤も、発泡剤として作用し得る。

研磨剤としては、第二リン酸カルシウム二水和物および無水物、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、無水ケイ酸、含水ケイ酸、アルミノシリケート、アルミナ、水酸化アルミニウム等が挙げられる。

湿潤剤としては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、１，５−ペンタンジオール、ソルビット、ポリエチレングリコール３００等の多価アルコール；ラウロイルグルタミン酸ジ（コレステリル／ベヘニル／オクチルドデシル）、ラウロイルグルタミン酸ジ（コレステリル／オクチルドデシル）等のアミノ酸類のエステル；ポリアスパラギン酸ナトリウム等のアミノ酸ポリマー；ピロリドンカルボン酸およびその塩等が挙げられる。

界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル（デカグリセリン脂肪酸エステル等）、プロピレングリコール・ペンタエリストール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリン・ラノリンアルコール・ミツロウ誘導体、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、単一鎖長ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン性界面活性剤；アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸及びその塩、Ｎ−アシルメチルタウリン塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩、アルキルスルホカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩等のアニオン性界面活性剤；アルキルアンモニウム塩、アルキルベンジルアンモニウム塩、脂肪酸アシルアルギニンエステル等のカチオン性界面活性剤；酢酸ベタイン、イミダゾリニウムベタイン、レシチン等両性の界面活性剤が挙げられる。

甘味剤としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、グリチルリチン、ペリラルチン、ｐ−メトキシシンナミックアルデヒド、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ソーマチン、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、水飴等が挙げられる。

酸味剤としては、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、クエン酸、グルコノデルタラクトン、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、酪酸、氷酢酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸等の有機酸類、及び、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩類が挙げられる。

香料としては、ペパーミント油、スペアミント油等の精油、ｌ−メントール、カルボン、オイゲノール、アネトールの他、食品添加物として添加可能な、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等のシトラス系香料、アップル、バナナ、グレープ、ピーチ、ストロベリー、パイナップル等のフルーツ系香料、ペッパー、シンナモン、ナツメグ、クローブ等のスパイス系香料、バニラ、コーヒー、ココア、ヘーゼルナッツ等のナッツ系香料、紅茶、緑茶等の茶系香料、リナロール、シトロネロール等のフローラル系の各種香料が挙げられる。

安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等のキレート剤；ビタミンＣ、ビタミンＥ、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール等の酸化防止剤；アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン等の分散剤；β−シクロデキストリン等の包接剤等が挙げられる。

防腐剤としては、ブチルパラペン、エチルパラペン等のパラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム等が挙げられる。

ｐＨ調整剤としては、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グリシン、グルコン酸、リン酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、コハク酸、酢酸、酢酸ナトリウム等が挙げられる。

増粘剤としては、グリセリン、ソルビット、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の粘稠剤；カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、アラビアガム、ビーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール等の粘結剤等が挙げられる。

着色剤としては、食用青色１号、食用黄色４号、食用赤色２号等のタール色素、銅クロロフィリンナトリウム等が挙げられる。

顔料としては、酸化亜鉛、酸化チタン等が挙げられる。

有機粉体としては、ラウロイルリジン、ウンデシノイルグリシン等が挙げられる。

賦形剤としては、ヒドロキシアパタイト、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、タルク、乳糖等が挙げられる。

上記薬効成分、担体または添加剤の配合量は、本発明の効果を妨げない範囲で、通常各種剤形の口腔用組成物において用いられる量とすることができる。

各種剤形の本発明の組成物は、通常の製剤化手段、たとえば、第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された製法に準じて、調製することができる。
たとえば、歯磨剤等のペースト状の組成物は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩と、賦形剤、基剤等の担体または添加剤とを混合し、水を加えて混練して調製することができる。
また、洗口剤、口中清涼剤、含嗽剤等の液状の組成物は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を、必要に応じて各種添加剤とともに水、エタノール等の適切な溶剤に溶解し、または乳化もしくは懸濁し、必要に応じてろ過して調製することができる。
口腔用ゲル剤は、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を、増粘剤等の添加剤とともに水等の溶剤に加えて混合し、加熱して溶解させた後、冷却して調製することができる。
口腔用軟膏剤および口腔用パスタは、油脂性基剤を加温して融解し、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を加え、混和して溶解または分散させ、均質になるまで練り合わせる、または、水溶性基剤を加温して融解し、有効成分であるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を加え、均質になるまで練り合わせることにより、調製することができる。

本発明の組成物の適用対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ等）が挙げられる。

本発明の組成物は、適用対象動物の種類、年齢、症状の重症度、予防または治療の達成目標の程度、組成物の剤形などに応じて、適用量および適用回数を適宜設定することができる。
本発明の組成物は、ヒト成人の場合、通常１日に１〜１０回程度、好ましくは１日に１〜５回口腔内に適用することができる。

本発明の組成物は、有効成分として含有されるＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩の、上記した歯槽骨における骨吸収活性低減作用により、歯周病を予防しまたは治療する効果に優れる。
また、Ｎ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩が本来有する界面活性作用により、オーラルケア製品としても優れる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の実施範囲はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

バリン（Ｖａｌ）に対するアシル基付加が、破骨細胞の形成、分化等に及ぼす影響を明らかにするため、Ｖａｌ、Ｎ−オクタノイルバリン（Ｃ８−Ｖａｌ）、Ｎ−デカノイルバリン（Ｃ１０−Ｖａｌ）およびＮ−ラウロイルバリン（Ｃ１２−Ｖａｌ）を用い、骨髄細胞および骨芽細胞共存培養系における破骨細胞の分化、ならびに頭頂骨器官培養系における骨吸収活性に対する作用を比較検討した。さらに、歯周病のＥｘ ｖｉｖｏ評価系である歯槽骨器官培養を実施し、歯周病を想定した炎症性骨吸収活性に及ぼすＶａｌ類の作用を比較検討した。
また、比較例としてＮ−オレオイルセリン（Ｏ−Ｓｅｒ）を用いて、骨髄細胞および骨芽細胞共存培養系における破骨細胞の形成、分化に対する作用を、Ｎ−アシルバリンの作用と比較検討した。

（試薬）
アミノ酸（ＶａｌおよびＳｅｒ）は東京化成工業株式会社製を使用した。Ｎ−アシルアミノ酸は、下記参考例の通り合成したものを使用した。
使用した試薬および培地は、フナコシ株式会社、シグマ−アルドリッチ社およびコスモ・バイオ株式会社の各社より購入した。
マウスは、日本エスエルシー株式会社より購入して使用した。

［参考例１］Ｃ１０−Ｖａｌの合成
５０ｍＬビーカーにバリン（２９．２９ｇ、２５０．０２ｍｍｏｌ）、水７８．６ｇ、アセトン３６．３ｇを加え溶解させた。氷冷下、２７重量％水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを１２に調整した。この溶液にｐＨ１２を保持するように、カプリノイルクロリド（４６．４２ｇ、２４３．４２ｍｍｏｌ）と２５重量％水酸化ナトリウムを７０分間かけて同時に滴下し、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物に７５重量％硫酸を加え、ｐＨを１．３に低下させ結晶を析出させて、ろ取し、水、ヘキサンで洗浄し、終夜減圧乾燥した。

［参考例２］Ｃ１２−Ｖａｌの合成
５０ｍＬビーカーにバリン（２９．３０ｇ、２５０．１１ｍｍｏｌ）、水７８．６ｇ、アセトン３６．３ｇを加え溶解させた。氷冷下、２５重量％水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを１２に調整した。この溶液にｐＨ１２を保持するように、ラウロイルクロリド（５３．２５ｇ、２４１．４２ｍｍｏｌ）と２５重量％水酸化ナトリウムを４５分間かけて同時に滴下し、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物に７５重量％硫酸を加え、ｐＨを２．０１に低下させ結晶を析出させて、ろ取し、水、ヘキサンで洗浄し、終夜減圧乾燥した。
また、鎖長の異なるアシル基を有するＮ−アシルバリンは、該当する炭素鎖長の酸クロリドを用い、同様の反応を行うことで容易に合成可能である。

［参考例３］Ｏ−Ｓｅｒの合成
５０ｍＬビーカーにセリン（２．１３ｇ、２０．２７ｍｍｏｌ）、水１２．９ｇ、イソプロパノール ３．７ｇを加え、溶解させた。氷冷下、２５重量％水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを１０に調整した。この溶液にｐＨ１０を保持するように、オレオイルクロリド（５．５４ｇ、１８．４１ｍｍｏｌ）と２５重量％水酸化ナトリウムを３０分間かけて同時に滴下し、室温で２．５時間撹拌した。反応混合物に７５重量％硫酸を加え、ｐＨを１．４８に低下させ結晶を析出させて、ろ取し、室温にて終夜減圧乾燥した。得られた結晶を酢酸エチルから再結晶し、目的物を得た。

（統計学的解析）
得られたデータは平均値±標準誤差で表し、スチューデントのｔ検定を用いて、有意差検定を行った。

［実施例１］破骨細胞形成実験１
（１）ｄｄｙマウス（雄、６週齢）より骨髄細胞を常法により採取し、骨髄細胞を２×１０^６個／ｗｅｌｌ及び初代骨芽細胞を１×１０^４個／ｗｅｌｌの細胞濃度で播種し、終濃度２ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−１（ＩＬ−１）を含む１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）／フェノールレッド（ＰＲ）（−）α改変イーグル最小必須培地（αＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ_２−９５％Ａｉｒ気相下、３７℃にて７日間共存培養した。この培養系に、バリンおよびＮ−アシルバリン各１５０μＭをＩＬ−１と共に添加した。
なお、ＩＬ−１およびバリン類の双方を添加せずに培養した場合を対照とした。
（２）破骨細胞検定染色 (ＴＲＡＰ染色)
培養後、細胞をＴＲＡＰ染色キット（コスモ・バイオ株式会社製）を用いて染色後、室温で乾燥し、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を検出した。３核以上のＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞として計測し、破骨細胞形成数として評価した。

（３）結果
染色した細胞の顕微鏡観察（「倒立型顕微鏡 ＣＫＸ４１」、オリンパス株式会社製、倍率＝４０倍）像と、破骨細胞形成数の評価結果を図１に示した。
図１に示されるように、ＩＬ−１添加により、破骨細胞の分化が誘導される（ｐ＜０．００１で有意）。１５０μＭのＶａｌの添加により、ＩＬ−１誘導性の破骨細胞の分化が抑制される傾向が見られた。１５０μＭのＣ８−Ｖａｌ添加群で有意（ｐ＜０．０１）な抑制が認められ、Ｃ１０−ＶａｌおよびＣ１２−Ｖａｌの各添加群では、コントロールレベルまで破骨細胞の分化が抑制された（ｐ＜０．００１）。

［実施例２］マウス頭頂骨器官培養系を用いた骨吸収活性実験
（１）ｄｄｙ系仔マウス（哺乳５日齢）より頭頂骨を採取し、ＢＧＪｂ培地（ペニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）含有）にて３７℃で２４時間培養した。その後、前記培地にＩＬ−１（２ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地および、ＩＬ−１と共にバリンおよびＮ−アシルバリンのそれぞれを０．２ｍＭ〜１ｍＭ添加した培地に交換して、培養を継続した。６日間培養後、培養上清中のカルシウム濃度を、o-Cresolphthalein Complexone（ＯＣＰＣ）法により測定した。測定結果から、培養液のみで培養した場合（対照）のカルシウム濃度を差引いたカルシウム濃度の上昇分（ΔＣａ）を頭頂骨から遊出したカルシウムと判定し、骨吸収活性の指標とした。

（２）結果
培養上清中に遊出したカルシウムを指標とした骨吸収活性についての評価結果を、図２に示した。
図２に示されるように、ＩＬ−１により、骨吸収活性の有意な（ｐ＜０．００１）上昇が認められるが、Ｖａｌ添加群では骨吸収活性に対する抑制作用は見られず、Ｃ８−Ｖａｌ添加群では軽度の抑制作用が見られた（ｐ＜０．０５）。また、Ｃ１０−ＶａｌおよびＣ１２−Ｖａｌ添加群において、ＩＬ−１により惹起される骨吸収活性が濃度依存的に抑制された。Ｃ１０−Ｖａｌ添加群では、０．７５ｍＭ以上の濃度で顕著に抑制され（ｐ＜０．００１）、Ｃ１２−Ｖａｌ添加群では、０．２ｍＭの濃度で有意に抑制され（ｐ＜０．０５）、０．３ｍＭ以上の濃度で顕著に抑制された（Ｐ＜０．００１）。

［実施例３］マウス歯槽骨器官培養系を用いた骨吸収活性実験
（１）特許第４６６２０４３号公報等に記載の公知の手法に従い、歯槽骨器官培養におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘導性骨吸収活性に及ぼすバリンおよびＮ−アシルバリンの影響を検討した。
歯槽骨にＬＰＳを添加すると、炎症性の歯槽骨破壊が発症する。具体的には、特許第４６６２０４３号公報に記載された方法に従ってマウスから歯槽骨を採取して器官培養し、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであるＬＰＳにより惹起される歯槽骨破壊（歯槽骨の炎症性骨吸収）に対するバリンおよびＮ−アシルバリンの抑制作用を、ＬＰＳとともにバリン類を添加し、骨吸収活性に対する作用を比較検討して解析した。ＬＰＳの濃度は１μｇ／ｍＬ、バリン類の濃度はそれぞれ０．５ｍＭとした。骨吸収活性は、実施例２と同様に、培養上清中のカルシウム濃度の測定結果から算出したカルシウム濃度の上昇分（ΔＣａ）を、歯槽骨から遊出したカルシウムとして評価した。

（２）結果
評価結果を図３に示した。
図３に示されるように、Ｖａｌ添加群ではＬＰＳにより惹起された歯槽骨の炎症性骨吸収が抑制される傾向が見られ、Ｃ８−Ｖａｌ添加群では軽度な抑制作用が見られた（ｐ＜０．０１）。Ｃ１０−ＶａｌおよびＣ１２−Ｖａｌ添加群では、それぞれより顕著な抑制作用が認められた（ｐ＜０．００１）。

（実施例１〜３に関する考察）
ＩＬ−１誘導性の骨吸収活性化に対するバリンおよびＮ−アシルバリンの作用を検討した結果、Ｃ１０−ＶａｌおよびＣ１２−Ｖａｌに強い抑制作用が観察され、Ｎ−アシルバリンが骨吸収の抑制作用を有する可能性が示唆された。
また、歯周病原性細菌の内毒素であるＬＰＳを用いた歯周病のＥｘ ｖｉｖｏ 評価系である歯槽骨器官培養において、Ｃ１０−ＶａｌとＣ１２−ＶａｌがＬＰＳ による炎症性骨吸収を阻害することが明らかとなり、歯周病に対するＮ−アシルバリンの改善作用が示唆された。
本試験系により、Ｃ１０−ＶａｌおよびＣ１２−Ｖａｌが、骨吸収因子による骨の破壊に対し、有効な治療効果を有する可能性が示された。

［実施例４］ 破骨細胞形成実験２
（１）実施例１と同様の手順で、骨髄細胞とマウス骨芽細胞の共存培養系において、Ｎ−アシルバリンおよび、比較例としてオレオイルセリンをそれぞれ５μＭ〜３００μＭの各濃度で培地に添加し、培養後、破骨細胞の検出、計測を行った。
Ｎ−アシルバリンとしてはＣ１２−Ｖａｌを用い、共存培養系における破骨細胞分化に対する抑制作用を比較検討した。

（２）結果
ＴＲＡＰ染色した細胞の顕微鏡による観察像を図４に示した。
図４に示されるように、ＩＬ−１刺激によりＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞形成が誘導された。Ｃ１２−ＶａｌおよびＯ−Ｓｅｒ添加群の双方において、多核破骨細胞数の減少が濃度依存的に認められたが、Ｃ１２−Ｖａｌ添加群では１５０μＭ、Ｏ−Ｓｅｒ添加群では３００μＭの濃度で破骨細胞分化が完全に抑制されることが認められた。前記破骨細胞分化の抑制は、破骨細胞の形態学的な縮小を伴っていた。
また、破骨細胞形成数の計測結果を図５に示した。
図５に示される結果からも同様に、Ｃ１２−Ｖａｌ添加群では１５０μＭの濃度で破骨細胞の分化が完全に抑制され（ｐ＜０．００１）、Ｏ−Ｓｅｒ添加群では３００μＭの濃度で破骨細胞の分化が完全に抑制された（ｐ＜０．００１）。
以上の結果より、破骨細胞の分化に対し、Ｃ１２−Ｖａｌは、非特許文献１に記載されたオレオイルセリンよりもが強い抑制作用を有することが示唆された。

（実施例４に関する考察）
ＩＬ−１誘導性の骨吸収活性に対するＮ−アシルアミノ酸類の作用を検討した結果、Ｃ１２−Ｖａｌにおいて強度な破骨細胞の分化抑制が観察され、効果的な骨吸収抑制作用を有する可能性が示唆された。本試験により、Ｃ１２−Ｖａｌは骨吸収因子による骨の破壊を改善する効果を有する可能性が示唆された。

本発明により、破骨細胞の形成もしくは分化を有効に抑制し得る破骨細胞の形成または活性化抑制剤を提供することができる。本発明の破骨細胞の形成または活性化抑制剤は、特に、歯槽骨における骨吸収活性を有意に低減する効果を奏する。
また、本発明により、歯周病の予防または改善を目的としたオーラルケア製品として優れる歯周病の予防または治療用口腔用組成物を提供することができる。

Claims (4)

1. 炭素数が８〜１６の飽和または不飽和のアシル基を有するＮ−アシル分岐鎖アミノ酸またはその塩を含有する、破骨細胞の形成または活性化抑制剤。
2. 炭素数が８〜１６の飽和または不飽和のアシル基を有するＮ−アシル分岐鎖アミノ酸が、炭素数が８〜１６の飽和または不飽和のアシル基を有するＮ−アシルバリンである、請求項１に記載の抑制剤。
3. 炭素数が８〜１６の飽和または不飽和のアシル基を有するＮ−アシルバリンが、Ｎ−デカノイルバリンまたはＮ−ラウロイルバリンである、請求項２に記載の抑制剤。
4. 歯槽骨の吸収抑制剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤。

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