JP6919098B2 - 筋強直性ジストロフィー１型に対するマイクロｒｎａの変調及びそのためのマイクロｒｎａのアンタゴニスト - Google Patents

Description

本発明は、疾患に対する治療用途でのリボヌクレオチド又はその類似体の単位を含む小分子の使用に関する。より具体的には、本発明は、筋強直性ジストロフィー１型の治療のためのａｎｔａｇｏｍｉＲ等のマイクロＲＮＡアンタゴニストの使用に関する。

筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、最もよく見られる成人発症型筋ジストロフィーであることに加え、極めて大きな障害を引き起こすことから深刻な臨床的問題となっている、不治の神経筋障害である。臨床的には、ＤＭ１は、主に骨格筋及び平滑筋、神経系、並びに心臓に影響を及ぼし、呼吸不全及び死亡につながる可能性のある筋肉量の低下（筋ジストロフィー）、虹色（iridescent）後嚢下白内障、心臓インパルス伝導障害（cardiac impulse conduction defects）、内分泌変化、筋強直（随意収縮後の筋肉の弛緩が困難なこと）、並びに注意欠陥、特徴的な人格型、睡眠障害及び遂行機能障害症候群（dysexecutive syndrome）を含む中枢神経系の機能障害を特徴とする全身性（multisystemic）障害とみなされる。この臨床像には、先天型（生まれつき）から小児ＤＭ１、成人期及び老齢期での発病に及ぶ極めて多様な発病年齢が含まれる。青年期又は１０代で発病する最もよく見られる病型では、患者の平均寿命は４８歳〜５５歳まで低下する（非特許文献１、非特許文献２）。ＤＭ１は、人口集団における有病率が２０００分の１未満と推定され、希少疾患に分類される。

遺伝学的には、ＤＭ１は、常染色体優性遺伝性疾患であることが知られ、筋強直性ジストロフィーのプロテインキナーゼ遺伝子（ＤＭＰＫ：筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（dystrophia myotonica-protein kinase））の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中の伸長したＣＴＧ^*ＣＡＧリピートの存在に起因する（最近の概説については、例えば非特許文献３を参照されたい）。正常なヒトＤＭＰＫ遺伝子（ＨＣＮＧ：２９３３、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１７６０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０４９３６、ＯＭＩＭ：６０５３７７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０９０１３）は、５コピー〜３７コピーのトリヌクレオチドモチーフを有するが、動的突然変異により、この数が５０００コピーを超えるリピートまで増大する可能性がある。疾患の重症度はリピートの数、すなわち伸長のサイズと大まかに相関する。

ヒト２３番染色体中に存在する異なる遺伝子であるＣＮＢＰ遺伝子の突然変異による、より低頻度の、いわゆる筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）も存在する。ＤＭ２でも筋肉の機能不全が見られるが、主に四肢の付け根（肩、臀部、大腿部等）の筋肉が侵され、ＤＭ１は主として四肢の末端部の筋肉を侵す。ＤＭ１とは異なり、ＤＭ２は平均寿命には影響を及ぼさないようであり、より穏やかな症状を呈することが多い。

伸長したＤＭ１対立遺伝子の発現は、突然変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ核内繋留及びＤＭＰＫタンパク質レベルの低下をもたらす（非特許文献４）。突然変異転写産物は、ＤＭ１を患う成体において、ショウジョウバエＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質（ＭＢＮＬ、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様の略称）と同様のスプライシング因子を捕捉し（sequester）、多くの他の転写産物の異常な選択的スプライシング及び対応するタンパク質の胎児型の発現を生じる（非特許文献５、非特許文献６）。実際に、ショウジョウバエＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ１６０１１、ＣＧ３３１９７）及び脊椎動物のその相当物ＭＢＮＬ１−３の両方が、スプライシング調節因子であることが知られている。ＭＢＮＬ１遺伝子及びＭＢＮＬ２遺伝子の転写産物は、それら自体が選択的スプライシングを受け、多数のタンパク質アイソフォームを生成する（非特許文献７）。ＭＢＮＬ１は、骨格筋組織及び心筋組織において、また筋芽細胞分化時に強く発現される。その発現は脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び膵臓等の他の組織ではより低い。ＭＢＮＬ２は、大きく重複した発現を有し、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓において検出される。ＭＢＮＬ３は一方で、胎盤及び衛星細胞において発現される。より詳細な情報については、Fernandez-Costa et al.の概説を参照されたい（非特許文献８）。

したがって、スプライス異常（spliceopathy）がＤＭ１発症の根底にある主な要因であると考えられる。しかしながら、遺伝子発現の付加的な変化、アンチセンス転写産物、翻訳有効性、選択的ポリアデニル化の調節解除及びｍｉＲＮＡ調節解除等の異なる代替機構がＤＭ１発症に寄与する可能性がある（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。

幾つかの治療アプローチがＤＭ１動物モデルにおいて試験されている。中でも、最も興味深い結果が、突然変異ＤＭＰＫ転写産物を分解するために小分子、ペプチド、モルホリノ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びギャップマー（gapmers）を用いたＭＢＮＬと毒性ＲＮＡとの間の相互作用の遮断から得られる（非特許文献１２）。

あまり調査されていないＤＭ１の代替策は、ＭＢＮＬ１（ＨＣＮＧ：６９２３、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：４１５４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５２６０１、ＯＭＩＭ：６０６５１６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＲ５６。以前にＨＣＮＧにおいてＭＢＮＬという記号で特定されている）及びＭＢＮＬ２の遺伝子発現の治療的変調である。ＣＵＧ伸長の発現は種々の分子改変を誘発するが、現在の証拠からＭＢＮＬタンパク質の捕捉が疾患の症状の主な原因であることが指摘されている。不活性化Ｍｂｎｌ１遺伝子を有するマウスモデル（Ｍｂｎｌ１のノックアウトマウス；ＫＯと略される）は筋強直、筋肉の転写産物の不正確なスプライシング及び白内障を示し、これらは全てＤＭ１疾患の特徴的な症状である（非特許文献１３）。さらに最近では、２ヶ月齢Ｍｂｎｌ１突然変異マウスにおいて、心機能障害の最も重要な特徴（肥大、間質性線維症及びスプライシング改変）が報告されており、ＤＭ１心臓障害におけるＭｂｎｌ１減少の役割が示唆される（非特許文献１４）。加えて、ヒトＭＢＮＬ１遺伝子プロモーターにおける遺伝的多型が疾患の重症度と関連付けられている（非特許文献１５）。

しかしながら、Ｍｂｎｌ１のＫＯマウスは、ＤＭ１の症状の全てを示すわけではない。このため、Ｍｂｎｌ２がこれらのマウスにおいてＭｂｎｌ１の機能の喪失を補償し得るという仮説が立てられた。実際に、Ｍｂｎｌ２の発現が低下したＭｂｎｌ１のＫＯマウス（Ｍｂｎｌ１^-/-；Ｍｂｎｌ２^+/-）は生存能力があるが、平均寿命の減少、心臓閉塞（cardiac blockage）、重度の筋強直、線維萎縮（atrophic fibres）及び骨格筋の進行性衰弱を含む疾患の主要な異常の殆どを示す。補償仮説の裏付けとして、Ｍｂｎｌ２レベルがＭｂｎｌ１^-/-のＫＯマウスにおいて増大すると、Ｍｂｎｌ２が通常はＭｂｎｌ１によって調節されるエクソンを調節し得ることが留意される（非特許文献１６）。

幾つかの観察結果から、ＭＢＮＬ１の過剰発現がＤＭ１病状の治療の可能性を有し得ることが示唆される。第一に、ＭＢＮＬ１過剰発現は、トランスジェニックマウスの骨格筋において忍容性良好であり、寿命に影響を及ぼすことなくスプライシングの比較的僅かな変化しか引き起こさない（非特許文献１７）。第二に、ＤＭ１のＨＳＡ^LRマウスモデルへの組み換えＭｂｎｌ１タンパク質の投与は、ＤＭ１の筋強直及びスプライシング改変の特性を回復させる（rescues）（非特許文献１８）。

Harper, 2001 Gagnon et al., 2007 Thornton, 2014 Davis et al., 1997 Lin et al., 2006 Du et al., 2010 Pascual et al, 2006 Fernandez-Costa et al., 2011 Batra et al., 2014 Yadava et al., 2016 Kalsotra et al., 2014 Klein et al., 2015（改訂） Kanadia et al., 2003 Dixon et al., 2015 Huin et al., 2013 Lee et al., 2013 Chamberlain et al., 2012 Kanadia et al., 2006

患者の早死につながる可能性のあるＤＭ１の症状の重症度、またその効果的な治療が現在存在しないことを考慮すると、代替的な治療戦略を調査することに関心が持たれる。

このため、単独での又はＭＢＮＬ２の変調と組み合わせたＭＢＮＬ１の過剰発現が、ＤＭ１を有するヒトにおいても治療に適用され得るかを確かめることに関心が持たれる。しかしながら、ヒトにおける投与のための安全な発現ベクターの設計及び適用の認可が複雑であることから、ＭＢＮＬ１タンパク質又はＭＢＮＬ２タンパク質のレベルをヒトにおいて、それらが通常転写される同じ組織で、人工ベクターからのこのタンパク質の発現に対する何らかの代替方法によって増大する方法を見つけることに関心が持たれる。さらに、このレベルの増大は、疾患の特に顕著な症状が現れる関連組織及び器官：骨格筋及び平滑筋、心臓、並びに神経系の少なくとも１つ以上において生じさせるのが好ましい。

本発明は、この問題に対する解決策を提供する。

本発明は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する患者における天然標的との相互作用に利用可能なＭＢＮＬ（Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様）タンパク質の不十分な量を補償することに基づく。これは、このタンパク質が、その発現、細胞内分布及びｉｎ ｖｉｖｏ活性に影響を及ぼすことができる機構の中でも、ＤＭＰＫ遺伝子の突然変異転写産物と共にリボ核内フォーカス（ribonuclear foci）に捕捉されるためである。ＭＢＮＬタンパク質の量を補償することによって、疾患の症状の改善が試みられる。そうするために、本発明者らは、これらのタンパク質のレベルの上方調節を、それらの翻訳の調節及び安定性に負に介入するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の作用を、好ましくはＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２遺伝子の或る特定のｍｉＲＮＡリプレッサーの作用を特異的に遮断することが可能なオリゴリボヌクレオチド、その類似体、又は概してオリゴリボヌクレオチド分子を用いて遮断することによる発現の増大によって達成することを提案する。

したがって、本発明の第１の態様は、ヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節するマイクロＲＮＡのアンタゴニストであるオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子、又は該分子の２つ以上の混合物に関する。上記分子は、本発明のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子とみなされるものとする。分子は少なくとも脳、小脳、海馬、骨格筋及び心臓の群から選択される１つ以上の器官、又は該器官の１つの初代培養物からの、若しくは該器官の１つに由来する樹立細胞株（ｉＰＳＣとして知られる人工多能性幹細胞を含む）の１つ以上の細胞、又は該器官の幹細胞において発現されるマイクロＲＮＡのアンタゴニストであるのが好ましい。分子が相補的であり、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の配列のフラグメントを含み、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、それが結合するはずである内在性分子（マイクロＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ）の窒素塩基の配列に対して少なくとも５０％（又は少なくとも５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、若しくは１００％）相補的であることが好ましい。分子は、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ又はヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐのアンタゴニストであるのが好ましい。上記の選好のいずれかに対応して、アンタゴニストがａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｂｌｏｃｋｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ又はマイクロＲＮＡスポンジであることが好ましく、分子がａｎｔａｇｏｍｉＲ、中でもリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、それが結合するはずであるマイクロＲＮＡの窒素塩基の配列に対して少なくとも８０％相補的／同一であるａｎｔａｇｏｍｉＲであることが特に好ましい。特に、分子がａｎｔａｇｏｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ又はマイクロＲＮＡスポンジである場合、分子がヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ若しくはマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの配列に相補的であるか、又はリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド類似体単位の配列を含み、リボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、配列番号１若しくは配列番号２のオリゴリボヌクレオチドの窒素塩基の配列に対して少なくとも８０％（又は少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、若しくは１００％）同一であるのが好ましい。特に、分子がａｎｔａｇｏｍｉＲである場合、この分子がヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐの配列若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの配列に相補的であるか、又はリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド類似体単位の配列を含み、リボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ又若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの窒素塩基の配列に対して少なくとも５０％（又は少なくとも５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、若しくは１００％）相補的であるのであるのが好ましく、少なくとも８０％相補的であることが特に好ましい。分子がａｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体であり、ここで単位の少なくとも１つがリボース部分、リン酸結合又はその両方に１つ以上の化学修飾を示すリボヌクレオチド類似体であり、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、配列番号１のオリゴリボヌクレオチド又は配列番号２のオリゴリボヌクレオチドのリボヌクレオチド単位の窒素塩基の配列と同一であり、任意に、５’末端及び／又は３’末端にアデノリボヌクレオチド（adenoribonucleotide）又はリボヌクレオチド部分ではない１つ以上の付加的な部分を示すのが非常に好ましい。中でも最も好ましくは、分子がａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８（配列番号１０）又はａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１１）である。別の考え得る実施の形態では、ａｎｔｉｍｉＲの場合に、オリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体が、それがアンタゴニストであるマイクロＲＮＡのシード領域に対して１００％相補的なフラグメントを含むことに特に関心が持たれる。別の考え得る実施の形態では、ｂｌｏｃｋｍｉＲの場合に、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、それがアンタゴニストであるマイクロＲＮＡによって認識される（すなわち、マイクロＲＮＡによって下方調節される）標的ｍＲＮＡ中の領域の窒素塩基の配列に対して少なくとも８０％相補的である、一連のリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位から構成されるフラグメントを含むオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子に特に関心が持たれる。

第２の態様では、本発明は、本発明のオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子、それらの混合物、又は該オリゴリボヌクレオチド分子の少なくとも１つのコード配列を含む発現ベクターの少なくとも１つを含む組成物に関する。１つの考え得る実施の形態では、組成物は、担体及び／又は１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を付加的に含む。別の考え得る好ましい実施の形態では、先行のものに対応して、組成物は、配列番号１０によって表されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ）若しくは配列番号１１によって表されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ）、又はそれらの混合物を含む。別の考え得る実施の形態では、先行の全てに対応して、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ及び／又はａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐが組成物中に存在し、オリゴリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子が５０ｎＭ〜２００ｎＭ（両端を含む（both included））の濃度である場合が特に好ましい。

もう１つの態様では、本発明は、筋強直性ジストロフィー１型の治療のための医薬品の製造への本発明のオリゴリボヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチド類似体分子の１つ、それらの２つ以上の混合物、又は上記分子の少なくとも１つを含む組成物の使用に関する。したがって、筋強直性ジストロフィー１型の治療における使用のための本発明のオリゴリボヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチド類似体分子の１つ、それらの２つ以上の混合物、又は組成物は本発明の範囲に含まれ、本発明の一態様とみなされる。好ましくは、医薬品の製造のための使用に言及し、したがって筋強直性ジストロフィー１型の治療における使用に関する本発明の本態様では、考え得る実施の形態は、分子がヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐのアンタゴニスト、ヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−５ｐの阻害剤、それらの混合物、若しくはそれらを含む組成物であるか、又は組成物がヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐのアンタゴニスト、ヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−５ｐの阻害剤、それらの混合物、若しくはそれらを含む組成物を含むものである。考え得る一実施の形態では、治療は筋強直性ジストロフィー１型の１つ以上の症状の姑息的治療である。このうち、考え得る選好は、治療が筋強直性ジストロフィー１型の症状の一部である筋障害の１つ以上の姑息的治療である場合である。

特異的ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４組織サイレンシングが、ショウジョウバエ筋肉においてＲＮＡ及びタンパク質レベルでのｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの過剰発現を引き起こすことを示す図である。（ａ）筋肉におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−９２ａ、ｄｍｅ−ｍｉＲ−１００、ｄｍｅ−ｍｉＲ−１２４、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４についてのｍｉＲＮＡスポンジ構築物を発現するハエからｑＲＴ−ＰＣＲによる増幅によって得られる内在性対照に対するｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現レベル。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現レベルは、マイクロＲＮＡスポンジｍｉｒ−２７７ＳＰ及びｍｉｒ−３０４ＳＰを発現するハエにおいてＵＡＳ−ＳｃｒａｍｂｌｅｄＳＰ構築物を発現するハエに対して強く上方調節された。（ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームのレベルの分析。筋肉におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７のサイレンシングがアイソフォームｍｂｌＢの上方調節を引き起こし、アイソフォームｍｂｌＣ及びｍｂｌＤの発現のレベルがｍｉＲ−２７７ＳＰを発現するハエにおいて低下したことが観察される。逆に、ｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するハエにおいて、ｍｂｌＣ及びｍｂｌＤのレベルは増大し、アイソフォームｍｂｌＢのレベルは低下した。（ｃ）ウエスタンブロットによるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質の検出。Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質の過剰発現がｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するハエにおいて検出された。指定の全ての導入遺伝子を、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４を用いて筋肉に指向させた。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングがＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現を増強し、ＤＭ１状況での不正確なスプライシング事象を回復させることを示す図である。（ａ）グラフの下に示すスポンジ構築物を発現するハエｉ（ＣＴＧ）４８０におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって得られたデータによるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現レベルを示す棒グラフ。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−２７７ＳＰ及びｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するモデルハエにおいて、伸長を発現しないハエ（対照、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４／＋）又はｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現するモデルハエ（図中のｓｃｒａｍｂｌｅ−ＳＰ）と比較して有意に上方調節されたことが示される。（ｂ）同じハエのサンプルにおけるウエスタンブロット転写分析。ｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するモデルハエにおいてのみＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ Ｃの過剰発現が示された。（ｃ〜ｆ）ＤＡＰＩによる核の対比染色（元画像で青色のシグナル、グレースケールでぼやけた（faded）灰色）と共に、抗Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄシグナルの位置（元画像で緑色、グレースケールで薄灰色）を示す、右下隅に示されるｍｉＲＮＡスポンジを発現する又は発現しないハエのＩＦＭ（間接飛翔筋）の縦断面の共焦点像。Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄシグナルが対照ハエのサルコメアバンド（sarcomeric bands）において観察される（ｃ）；逆に、ＣＴＧ伸長が発現されるＩＦＭの核凝集体（nuclear aggregates）においてＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄが見られた（ｄ）；モデルハエにおけるｍｉＲ−２７７ＳＰの発現は、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄを凝集体から放出させ、サルコメアバンド中のその分布を元に戻した（ｅ）；ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、核及び細胞質の両方でＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの分散過剰発現を生じた。（ｇ）写真中に示すように、異なる遺伝子型及びマイクロＲＮＡスポンジの発現を有するハエにおけるＦｈｏｓエクソン１６’の包含（＋ｅ１６’）又はその除外（−ｅ１６’）を評価するためのＲＴ−ＰＣＲ後に得られた結果。内在性対照として検出したＲｐ４９転写産物に対応する結果も示す。（ｈ）パネルＧに示される結果からのＦｈｏｓエクソン１６’の包含パーセンテージの定量化。ｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するモデルハエにおけるＦｈｏｓの誤ったスプライシングの改善が確認された。（ｉ、ｌ）Ｒｐ４９に対するＳｅｒｃａエクソン１３（Ｓｅｒｃａ ｅ１３）及び遺伝子ＣｙＰ６Ｗ１のエクソン２（ＣｙＰ６Ｗ１ ｅ２）の発現のｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた結果を示す棒グラフ。ｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するモデルハエにおけるＳｅｒｃａスプライシング及びこれらのハエにおけるＣｙＰ６Ｗ１の相対発現の有意な回復が確認された。（ｊ）遺伝子ＴｎＴのエクソン３〜５（＋ｅ３−５）の包含を評価するためのＲＴ−ＰＣＲ後に得られた結果。これは研究した遺伝子型では異ならなかった。（ｋ）パネルｊに示される結果からのＴｎｔのエクソン３〜５の包含パーセンテージの定量化。指定の全ての遺伝子型の導入遺伝子を、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４を用いて筋肉に指向させた。スケールバー＝２マイクロメートル。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 Ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングが、モデルハエにおいて筋萎縮及びリボ核内フォーカスの存在を回復させることを示す図である。（ａ〜ｃ、ｅ〜ｇ）：画像の下に示す遺伝子型を有するハエの樹脂に包埋した胸部の背腹断面（Dorsoventral sections）。対照ハエ（ａ）と比較して、ｍｉＲ−２７７ＳＰの発現が筋面積の顕著な減少を生じたが（ｂ）、ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現がこの表現型には影響を有しなかったことが留意される（it is noted how）（ｃ）；ＤＭ１モデルハエでは、筋面積は正常に対して４０％まで減少したが（ｅ）、ｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰのいずれか１つを発現するモデルハエでは、筋面積は正常に対して６０％まで増大した（ｆ、ｇ）。（ｄ、ｈ）：バーの下に示す遺伝子型による筋面積の平均パーセンテージの定量化。グラフは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。１遺伝子型当たり６匹の個体を分析し、各々６枚の写真を定量化した。全ての画像で背部が上にある。（ｉ〜ｋ）写真の下に示す遺伝子型を有するハエの筋肉組織の横断面のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：フォーカスが明らかに存在する対照ハエ（ｉ）と比較して、ｍｉＲ−２７７ＳＰ及びｍｉＲ−３０４ＳＰの発現がこれらの顕著な減少を生じ、後者の場合では実質的に感知することができなかったことが留意される（ｊ及びｋ）。指定の全ての遺伝子型を、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４を用いて筋肉に指向させた。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の阻害が、ＤＭ１モデルハエの運動及び生存を改善することを示す図である。（ａ、ｅ）グラフの下に示す関連遺伝子型を有するハエの平均着地高さ（landing height）。対照被験体（ａ）では、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７のサイレンシングは着地高さを減少させたが、ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは飛行に影響を及ぼさなかった。ＤＭ１モデルハエ（ｅ）では、ｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、観察された飛行能力の低下を回復させた。（ｂ、ｆ）平均速度±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｍｍ／秒）として表される表面からの上昇速度のヒストグラム。対照ハエ（ｂ）では、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のいずれかのサイレンシングは、上昇速度に影響を有しなかった。しかしながら、非常に低い上昇速度を有するＤＭ１モデルハエ（ｆ）では、ｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、この表現型を有意に回復させた。（ｃ、ｇ）生存曲線及び（ｄ、ｈ）平均生存。ｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰの発現が対照ハエには影響を有しなかったが、ＤＭ１モデルハエの生存を改善したことが示される。各遺伝子型の１４０匹〜１６０匹の個体を分析した。指定の全ての導入遺伝子を、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４を用いて筋肉に指向させた。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２のｍｉＲＮＡリプレッサーの一次スクリーニング結果の検証を示す図である。（ａ、ｂ）種々のヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３７２）を発現するｐＣＭＶ−ＭＩＲに由来するプラスミドをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるＭＢＮＬ１（ａ）及びＭＢＮＬ２（ｂ）の相対発現レベルの２進対数表示（ｌｏｇ２）。両方の遺伝子の参照値は、空プラスミドｐＣＭＶ−ＭＩＲ（図中のＶＴＣ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において検出された値であり、内在性遺伝子ＧＡＰＤＨを正規化に用いる。トランスフェクションの対照として、ベクターにＧＦＰタンパク質を発現させた。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。（ｃ、ｄ）（ａ）及び（ｂ）に示される試験のプラスミドをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるタンパク質ＭＢＮＬ１（パネルｃ）及びＭＢＮＬ２（パネルｄ）の発現の相対レベルの表示。同様に、両方の遺伝子の参照値として、空プラスミドｐＣＭＶ−ＭＩＲ（図中のＶＴＣ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において検出された値を用い、内在性対照としてβ−アクチンを用いる。^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ルシフェラーゼレポーターを用いた３’ＵＴＲ中の候補ｍｉＲＮＡによって認識される標的配列の実験的確認を示す図である。（Ａ）ＭＢＮＬ１の３’ＵＴＲ上の指定のマイクロＲＮＡのプログラムｍｉＲａｎｄａ及びＴａｒｇｅｔｓｃａｎによって予測される結合部位の概略図（オンスケール）。上記遺伝子は選択的スプライシングを受けるが、既知のアイソフォームのいずれも転写産物中の示される標的の存在に影響を及ぼさない。（Ｂ）内部対照ＳＥＡＰに対して標準化したガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼの相対単位（Ｇｌｕｃ／ＳＥＡＰ）で表されるセンサーｌｕｃ：３’−ＵＴＲ ＭＢＮＬ１に対する種々のマイクロＲＮＡの活性のグラフ表示。（Ｃ）ｍｉＲ−２３ｂの直接結合を検証するために、予測突然変異標的配列を有するこの候補ｍｉＲＮＡ（ＭＵＴ）、及び更には完全相補標的を有するバージョン（ＰＭ）のセンサー３’ＵＴＲのデータ、並びに天然標的（ＷＴ）がセンサー３’ＵＴＲ中に存在する場合に得られたデータも示す。センサー３’ＵＴＲに対するｍｉＲ−２３ｂ（天然、突然変異及びＰＭ）の活性を、内部対照Ｓｅａｐに対して標準化したガウシアルシフェラーゼの相対単位（Ｇｌｕｃ／ＳＥＡＰ）で表す。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲ上の指定のマイクロＲＮＡのプログラムｍｉＲａｎｄａ及びＴａｒｇｅｔｓｃａｎによって予測される結合部位の概略図（オンスケール）。ＭＢＮＬ１の場合と同様、この遺伝子は選択的スプライシングを受けるが、既知のアイソフォームのいずれも転写産物中の示される標的の存在に影響を及ぼさない。（Ｅ）内部対照ＳＥＡＰに対して標準化したガウシアルシフェラーゼの相対単位（Ｇｌｕｃ／ＳＥＡＰ）で表されるＭＢＮＬ２のセンサーｌｕｃ：３’ＵＴＲ ＭＢＮＬ２に対する種々のマイクロＲＮＡの活性のグラフ表示。（Ｆ、Ｇ）以前の試験では陽性であったマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ（Ｆ）、ｍｉＲ−２１８（Ｇ）の活性のグラフ表示。ＭＢＮＬ１の場合と同様、各候補ｍｉＲＮＡについて設計された予測突然変異標的配列を有するセンサー３’ＵＴＲのバージョン（ＭＵＴ）、及び更には完全相補標的を有するバージョン（ＰＭ）を用いて得られたデータ、並びに天然標的（ＷＴ）がセンサー３’ＵＴＲ中に存在する場合に得られたデータも示す。３’ＵＴＲに対する種々のマイクロＲＮＡ（天然、突然変異及びＰＭ）の活性を、内部対照ＳＥＡＰに対して標準化したガウシアルシフェラーゼの相対単位（Ｇｌｕｃ／ＳＥＡＰ）で表す。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ｑＰＣＲによる種々のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３７２）の相対発現レベルのグラフ表示である。遺伝子Ｕ１及びＵ６を発現の正規化のための内在性対照として用いた。（Ａ）種々のマウス組織（ＦＶＢ系統）におけるマイクロＲＮＡの発現。（Ｂ）対照個体及びＤＭ１患者の線維芽細胞におけるマイクロＲＮＡの発現。（Ｃ）対照個体及びＤＭ１患者の筋肉生検組織におけるマイクロＲＮＡの発現。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。 正常筋芽細胞におけるマイクロＲＮＡ２１８及び２３ｂのａｎｔａｇｏｍｉＲによる毒性試験を示す図である。化合物のナノモル濃度の１０進対数に対する、漸増量のａｎｔａｇｏｍｉＲによる用量応答試験と関連した毒性によって引き起こされる対照筋芽細胞において得られた６０時間の時点での細胞生存阻害のパーセンテージのグラフ表示。対照筋芽細胞における試験量を対応する曲線上に示す。 マイクロＲＮＡ２１８及び２３ｂのａｎｔａｇｏｍｉＲの用量応答試験を示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８（５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）で処理した健常対照、ＤＭ１及び筋芽細胞におけるＭＢＮＬ１（ａ、ｂ）又はＭＢＮＬ２（ｃ、ｄ）の発現レベルのグラフ表示。ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子を発現の正規化のための内在性対照として用いた。左側のパネルは、ａｎｔａｇｏｍｉＲによるトランスフェクション及び分化転換の４８時間後のＭＢＮＬ１（ａ）又はＭＢＮＬ２（ｃ）の発現を示し、右側のパネルは、ａｎｔａｇｏｍｉＲによるトランスフェクション及び分化転換の９６時間後のＭＢＮＬ１（ｂ）又はＭＢＮＬ２（ｄ）の発現を示す。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 マイクロＲＮＡ２１８及び２３ｂ ａｎｔａｇｏｍｉＲの用量応答試験を示す図である。健常対照の筋芽細胞（ＣＮＴ）及び非処理ＤＭ１筋芽細胞（ＤＭ１）、又は指定の濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ）のａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８で処理した筋芽細胞のサンプルにおける半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた遺伝子ｃＴＮＴ、ＤＭＤ、ＳＥＲＣＡ１、ＢＩＮ、ＩＲ及びＧＡＰＤＨの選択的スプライシングの評価。分化転換の４８時間（パネルＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）又は９６時間（パネルＢ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）後に得られる結果を示す。パネルＡ及びＢは、ＲＴ−ＰＣＲ後に行った電気泳動ゲルの対応するフラグメントの写真を示す。各遺伝子に対応する試験の右側には、包含（符号「＋」で始まる表示）又は除外（符号「−」を有する表示）を検証したエクソンを示す。パネルＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ（４８時間の時点での試験）及びＨ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ（９６時間の時点）は、対照ＣＮＴ及びＤＭ１に対するこれらの各々のエクソンの除外（薄灰色の部分）又は包含（より濃い灰色の上部）のパーセンテージによる棒グラフを示し、各ａｎｔａｇｏｍｉＲの濃度をバーの下に示す。 ＤＬＧ１エクソン９（ＤＭ１において変化しない）及びＣＡＰＺＢエクソン８（ＣＥＬＦ依存性である）におけるスプライシング事象の筋芽細胞（「対照細胞ｓｃ」）、及びｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｍｉＲＮＡ（「ＤＭ１細胞ｓｃ」）、又はａｎｔａｇｏｍｉＲ ２３ｂ若しくは２１８をトランスフェクトしたＤＭ１患者に由来する筋肉生検組織（バーの下に示す）における半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。付加的な対照としてＤＭ１細胞におけるＢＩＮ１（エクソン１１）、ＡＴＰ２Ａ１（エクソン２２）、ｃＴＮＴ（エクソン５）、ＩＮＲ（エクソン１１）及びＰＫＭアイソフォームを用いた。ＧＡＰＤＨを内部対照として用いた。 ５０ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ又は２００ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８によるトランスフェクションの４８時間後（Ａ列）又は９６時間後（Ｂ列）のヒト筋芽細胞におけるＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ遺伝子に対するＭＢＮＬ１（上のグラフ）及びＭＢＮＬ２（下のグラフ）の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。 ヒト筋芽細胞におけるｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８のサイレンシング時のＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の増加を示す図である。（ａ〜ｆ）５０ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ、２００ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８又はｓｃｒａｍｂｌｅｄ対照ａｎｔａｇｏｍｉＲ（ｓｃ）によるトランスフェクションの９６時間後の健常対照（対照細胞）及びＤＭ１ヒト筋芽細胞におけるＭＢＮＬ１（ａ、ｄ）、ＭＢＮＬ２（ｂ、ｅ）及びＣＥＬＦ１（ｃ、ｆ）の発現レベルのウエスタンブロット定量化。β−アクチン発現を内在性対照として用いた（ｎ＝３）。エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定における^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。（ｇ〜ｎ）健常対照（対照細胞）、並びにｍｉＲ−２３ｂ（５０ｎＭ）又はｍｉＲ−２１８（２００ｎＭ）に対するａｎｔａｇｏｍｉＲ、及びｓｃｒａｍｂｌｅｄ対照ａｎｔａｇｏｍｉＲ（ＤＭ１細胞）によるトランスフェクションの９６時間後のＤＭ１ヒト筋芽細胞におけるＭＢＮＬ１（緑色）及びＭＢＮＬ２（赤色）の染色の代表的な共焦点像。核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。ＤＭ１細胞では、内在性ＭＢＮＬ１（ｈ）及びＭＢＮＬ２（ｌ）が核凝集体に見られ（緑色及び赤色の点）、どちらの総量も対照細胞（ｇ）及び（ｋ）と比較してそれぞれ低下した。対照的に、ｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８に対するａｎｔａｇｏｍｉＲで処理したＤＭ１細胞は、ＤＭ１細胞と比較して細胞質及び核ＭＢＮＬ１（ｉ、ｊ）及びＭＢＮＬ２（ｍ、ｎ）のレベルの大幅な２０倍の増大を示した。スケールバー＝２０μｍ。 ＨＳＡ^LRマウスにおけるａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ又はａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８の皮下注射が、Ｃｅｌｆ１のレベルに影響を及ぼすことなく標的ｍｉＲＮＡレベルを低下させ、Ｍｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２を増大したことを示す図である。（ａ）前脳（ｆｂ）、小脳（ｃｂ）、海馬（ｈｐ）、心臓（ｈｔ）、並びに四頭筋（ｑｄ）及び腓腹筋（ｇｔ）の筋肉におけるｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の発現レベルのｑＰＣＲ定量化（ｎ＝３）。Ｕ１及びＵ６の平均発現レベルを正規化に用いた。（ｂ〜ｅ）ＨＳＡ^LR処理マウス（ｎ＝１）の腓腹筋（ｂ、ｄ）及び四頭筋（ｃ、ｅ）の凍結切片におけるＣｙ３標識ａｎｔａｇｏｍｉＲの免疫検出。（ｆ、ｇ）非処理マウス（ＰＢＳ、各群の最初のバー、元画像で灰色のバー）、又はａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（各群の２番目のバー、元画像でピンク色のバー）若しくはａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８（各群の３番目のバー、元画像で青色のバー）で処理したマウスのｇｔ及びｑｄの筋肉におけるｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の定量化。相対値（Ｕ１及びＵ６発現の平均に対する）を非処理マウスにおけるレベルに対して更に正規化した。（ｈ、ｉ）ｇｔ及びｑｄの筋肉におけるＭｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２転写レベルのリアルタイムＰＣＲ定量化。内在性Ｇａｐｄｈに対する発現レベルを非処理マウスにおけるレベルに対して正規化した。（ｊ〜ｏ）マウスのｇｔ及びｑｄの筋肉におけるＭｂｎｌ１（ｊ、ｍ）、Ｍｂｎｌ２（ｋ、ｎ）及びＣｅｌｆ１（ｌ、ｏ）タンパク質のウエスタンブロット分析。（ｍ〜ｏ）において定量化に用いた代表的なブロットを（ｊ〜ｌ）に示す。データは、非処理ＨＳＡ^LRマウスと比較した対応のないスチューデントｔ検定によって分析した。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。ＨＳＡＬＲ ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＨＳＡＬＲ ＰＢＳ ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（ｎ＝４）。ＨＳＡ^LR ＰＢＳ ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（ｎ＝４）。 ａｎｔａｇｏｍｉＲの全身送達が、ＨＳＡ^LRマウスにおけるＭｂｎｌ依存性転写産物のスプライシング異常（missplicing）、筋強直及び筋肉組織病理を改善したことを示す図である。（ａ、ｂ）腓腹筋（ｇｔ）（ａ）及び四頭筋（ｑｄ）（ｂ）の筋肉におけるＡｔｐ２ａ１エクソン２２、Ｃｌｃｎ１エクソン７ａ、Ｎｆｉｘエクソン７及びＣａｐｚｂエクソン８のスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｇａｐｄｈ値を図１６及び図１７中のエクソン包含の定量化における正規化に用いた。（ｃ）注射前（ｂｉ）及び注射の４日後（ａｉ）のａｎｔａｇｏｍｉＲ（各群の２番目及び３番目のバー、元画像でピンク色及び青色のバー）又はＰＢＳ（各群の最初のバー、元画像で灰色のバー）で処理したＨＳＡ^LRマウスにおける筋電図による筋強直グレード。（ｄ）対照ＦＶＢ（白色のバー）、及びＰＢＳ（灰色のバー）又はａｎｔａｇｏｍｉＲ（ピンク色及び青色のバー）で処理したＨＳＡ^LRマウスのｇｔ及びｑｄの筋肉における中心核を有する筋線維のパーセンテージの定量化。（ｅ〜ｈ）４つ全てのマウス群からのｇｔ筋肉の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色。矢印は、筋線維中の中央に位置する核の例を指す。スケールバー＝５０μｍ。データは、非処理ＨＳＡＬＲマウスと比較した対応のないスチューデントｔ検定によって分析した。^*ｐ＜０．０５。ＦＶＢ（ｎ＝３）、ＨＳＡ^LR ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＨＳＡＬＲ ＰＢＳ ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（ｎ＝４）及びＨＳＡ^LR ＰＢＳ ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（ｎ＝４）。 指定の濃度のＸ軸に示すａｎｔｉｍｉＲを用いて行ったアッセイにおいて得られた、細胞増殖阻害（図１８Ａ）、並びに定量ＰＣＲによって得られるＭＢＮＬ１（図１８Ｂ）及びＭＢＮＬ２（図１８Ｃ）の相対発現として表される毒性アッセイを示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果も示す。 指定の濃度のＸ軸に示すｂｌｏｃｋｍｉＲを用いて行ったアッセイにおいて得られた、細胞増殖阻害（図１９Ａ）、並びに定量ＰＣＲによって得られるＭＢＮＬ１（図１９Ｂ）及びＭＢＮＬ２（図１９Ｃ）の相対発現として表される毒性アッセイを示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果も示す。 指定の濃度のＸ軸に示すＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行ったアッセイにおいて得られた、ジムノティック送達（gymnotic delivery）後に（図２０Ａ）又はトランスフェクション剤を用いて（図２０Ｂ）得られる細胞増殖阻害として表される毒性アッセイを示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果も示す。 指定の濃度のＸ軸に示すＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行ったアッセイにおいて得られた、定量ＰＣＲによって得られるＭＢＮＬ１相対発現の結果を示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果も示す。ジムノティック送達後に（図２１Ａ）又はトランスフェクション剤を用いて（図２１Ｂ）得られる結果を示す。 指定の濃度のＸ軸に示すＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行ったアッセイにおいて得られた、定量ＰＣＲによって得られるＭＢＮＬ２相対発現の結果を示す図である。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果も示す。ジムノティック送達後に（図２２Ａ）又はトランスフェクション剤を用いて（図２２Ｂ）得られる結果を示す。

上で解説したように、本発明は、ＤＭ１患者においてＭＢＮＬファミリータンパク質の活性が制限され、これが少なくとも部分的に、３’のＵＴＲ領域に何百もの付加的なＣＵＧリピートを示すＤＭＰＫ遺伝子の突然変異対立遺伝子の転写産物ｍＲＮＡが、フォーカス中に蓄積し、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様（ＭＢＮＬ）タンパク質が捕捉され、それらを機能的標的から引き離すことによって生じることを示唆する知識に基づく。したがって、本発明者らは、内在性ＭＢＮＬタンパク質のレベルの上方調節がＤＭ１に対する治療アプローチとなり、その症状を緩和する助けとなり得ることを提唱する。

本発明の基礎は、ＭＢＮＬタンパク質の発現に対して負に作用するｍｉＲＮＡの特定、及びそれらの遮断又は阻害により、ＭＢＮＬタンパク質のレベルに対する負の影響を減少させる又は妨げることで、ＭＢＮＬタンパク質のレベルの増大をもたらすことである。

遺伝子発現の調節におけるｍｉＲＮＡの基本的な役割は確立されている。マイクロＲＮＡ（一般にｍｉＲＮＡと略される）は、転写後に働き、主に標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域に結合することによって調節作用を発揮し、ｍＲＮＡの脱アデニル化をもたらすことで、翻訳の減少若しくは抑制、又は稀にはｍＲＮＡ除去を引き起こす、おおよその長さが２２ヌクレオチドの内在性ノンコーディングＲＮＡである。この最後の効果であるｍＲＮＡ除去は、ｍＲＮＡとそれに結合するｍｉＲＮＡとの間に完全な相補性が見られ、ｍＲＮＡ除去が可能であり、その直接分解をもたらすアルゴノートと呼ばれるタンパク質ファミリーのメンバー、具体的にはＡｇｏ２が作用することが可能となる場合に生じる可能性がある。マイクロＲＮＡが対応するメッセンジャーＲＮＡに結合するためには、かかるｍＲＮＡは本質的に、約６ヌクレオチド〜８ヌクレオチド（通常は７ヌクレオチド）のフラグメントである、いわゆる「シード領域」を有する必要がある。これは、マイクロＲＮＡが結合するｍＲＮＡ領域の一部であり、マイクロＲＮＡの一部、通常はそのヌクレオチド２〜８又は９と完全な相補性を有し、シード領域と呼ばれることが多い。マイクロＲＮＡとその対応するｍＲＮＡとの間の相補性が対合域（pairing zone）全体を通して完全でなくとも、これはシード領域中にある。これにより、マイクロＲＮＡは、それを含有するｍＲＮＡに対応する遺伝子の発現の調節において機能的となり得る。

例えば、Zhonghan Li and Tariq M. Rana（Li and Rana, 2014）によって、又はＷｉｋｉｐｅｄｉａ（https://en.wikipedia.org/wiki/MicroRNA）において概説されるように、動物のマイクロＲＮＡは、通常はＲＮＡステムループの一方のアームの一部としてＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから転写され、これが、同様にｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ中に存在する相補的な配列とヘアピンループを形成する１つ〜６つのｍｉＲＮＡ前駆体を含有し得る、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と称される１つの数百ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ前駆体を形成する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写産物は、５’末端が特別に修飾されたヌクレオチドでキャッピングされ、ポリＡテールでポリアデニル化され、スプライシングされる。各ヘアピンループ構造は、それぞれ約７０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドから構成され、効率的なプロセシングに必要とされる配列が隣接する。標準的なｍｉＲＮＡ生合成においては、ヘアピンの二本鎖ＲＮＡ構造が、酵素Ｄｒｏｓｈａと複合体を形成する酵素Ｐａｓｈａによって認識され、Ｄｒｏｓｈａがヘアピン塩基を切断し、ヘアピンを遊離させる。生成物は、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａ媒介消化を回避するｍＲＮＡスプライシング機構によっても生成し得る。生成プロセスに関わらず、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンは、シャッター（shutter）であるエクスポーチン−５によって核外に輸送される。細胞質に出ると、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンは、３’アームと５’アームとを接合するループを切除する酵素Ｄｉｃｅｒによって切断され、約２２ヌクレオチド長の不完全なｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二重鎖が生じる。二重鎖のいずれの鎖も潜在的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡとして作用し得るが、通常は一方の鎖のみがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこでｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的とが相互作用する。

このため、本発明者らは、発現に対して負に作用するｍｉＲＮＡの１つ以上の捕捉を引き起こし、それにより内在性ＭＢＮＬタンパク質のレベルの上方調節、結果として増大を生じさせる、内在性ＭＢＮＬタンパク質の変調からなるＤＭ１の改善のための治療アプローチを提案する。したがって、発現の調節に関与する特異的ｍｉＲＮＡのサイレンシング又はその抑制活性の減少により内在性タンパク質の変調を引き起こすことが目的である。特に、この場合には、筋肉が疾患の影響を受ける主要器官の１つであることから、筋肉において発現されるｍｉＲＮＡが好ましい。

上記によると、また本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡの阻害剤、サイレンサー又は遮断剤は、該ｍｉＲＮＡの内在性活性の減少を生じることが可能な化合物である。「拮抗作用」についての同様の戦略と関連する文献によく見られるように（例えば、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングについてのLandford et al., 2010による論文を参照されたい）、これら３つの用語は、ｍｉＲＮＡの「アンタゴニスト」という種類に含まれている。

一般に、従来、ｍｉＲＮＡの機能を効率的に阻害する戦略は、成熟ｍｉＲＮＡを直接標的化するように設計されている。しかしながら、ｍｉＲＮＡを前駆体段階で標的化する代替戦略が、この問題に対処する上で有効なアプローチとなる可能性がある。例えば、Kloosterman et al.（Kloostermann et al., 2007）は、ｍｉＲＮＡの生合成及び成熟プロセスをモルホリノによってｍｉＲＮＡ特異的に効率的に阻害し得ることを報告している。Kloosterman et al.は、モルホリノが一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのプロセシングを遮断することができ、成熟ｍｉＲＮＡの活性を阻害し得ることを報告している。特に、ｍｉＲ−３７５の阻害が膵島細胞の欠陥形態につながり、この表現型が複数の前駆体を標的化するモルホリノによって観察され得ることが示されている。また、国際公開第２０１６／０９１７４７号は、ｍｉＲ−１７−９２クラスターの一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の領域に結合し、ｍｉＲ−１７−９２クラスターのｍｉＲＮＡのいずれかの過剰発現と関連する腫瘍の治療に使用することができるＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーを特異的にもたらす、ｍｉＲ−１７−９２クラスターの阻害剤及び薬剤としてのそれらの使用に言及している。このため、成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ又は一次ｍｉＲＮＡを標的化することによってｍｉＲＮＡ機能を阻害するか又は減少させることができると言える。また、Li and Ranaが概説中で解説しているように（Li and Rana, 2014）、ｍｉＲＮＡの発現及び機能は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの生成を妨げることによって標的化することができる。ｐｒｉｍ−ｍｉＲＮＡの特定の例では、それらが通常は成熟ｍｉＲＮＡ中に見られない配列を含有し、これらの配列が（同じファミリーであっても）異なるｍｉＲＮＡの間で保存されないことから、化学修飾された短いオリゴヌクレオチドを、これらの配列に特異的に結合するように設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドが高い結合親和性を有し得ることから、それらが標的化ｍｉＲＮＡのヘアピン構造を破壊し、Ｄｒｏｓｈａ−Ｐａｓｈａ複合体によるその更なるプロセシングの欠陥を引き起こすことで、下流の成熟ｍｉＲＮＡのレベル及びその機能を実行する全能力を低下させ得る可能性が極めて高い。

本発明が或る特定の遺伝子の発現のｍｉＲＮＡリプレッサーの活性の低減に焦点を合わせていることから、この抑制能力が、それらのアンタゴニストである阻害剤、サイレンサー又は遮断剤の存在によって減少する。厳密に言えば、「サイレンシング」という用語は、かかる活性の絶対的な無効化として解釈され得るが、かかる抑制活性の無効化又は絶対的でない減少の差が使用される化合物の濃度によって左右され得ることから、これら４つの用語（阻害剤、サイレンサー、遮断剤又はアンタゴニスト）は、本明細書において同義語として使用され、化合物がｍｉＲＮＡの抑制活性の減少を生じるのに十分であれば、その阻害剤、サイレンサー、遮断剤、又は要するにアンタゴニストとみなされる。また、成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ又は一次ｍｉＲＮＡを標的化することによってｍｉＲＮＡ機能を阻害する可能性に関する知識を考慮すると、本願において使用される場合、化合物は、成熟ｍｉＲＮＡを標的とする場合だけでなく、前駆体ｍｉＲＮＡ又は一次ｍｉＲＮＡを標的とする場合にも、該ｍｉＲＮＡの内在性活性の減少を生じることが可能な限りにおいて本発明によるｍｉＲＮＡの阻害剤、サイレンサー、遮断剤又はアンタゴニストとみなされ得る。

ｍｉＲＮＡアンタゴニストの定義と同様に、阻害剤、サイレンサー又は遮断剤によって生じる効果は、本明細書の別の部分でｍｉＲＮＡの阻害、サイレンシング又は遮断と呼ばれるが、これら３つの用語がいずれも、その作用の拮抗作用を示唆し、意味していることが理解される。或る特定の点では、特にｍｉＲＮＡスポンジを使用した試験に関する場合、「枯渇（depletion）」という用語も、これらのスポンジ中の結合部位の数が相補的な配列を有するｍｉＲＮＡ分子の殆ど又は実質的に全ての結合をもたらし、スポンジが存在する細胞中の他の分子又は化合物との相互作用に利用可能なｍｉＲＮＡ分子の枯渇を生じると考えることができることから、かかるスポンジが存在する場合に生じる効果に言及するために使用される。

本発明は、好ましくはこれらのｍｉＲＮＡの特異的アンタゴニストに関し、これはまた、特に２’−メトキシ（２’−Ｏ−メチル：２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）基及び／又はホスホロチオエートによる一部又は全てのヌクレオチドの修飾等のように、より分解されにくいか又は生物学的に利用可能となるようにオリゴリボヌクレオチド分子を修飾する通常の化学修飾の幾つかを含むオリゴリボヌクレオチド又はそれに由来する分子である。本明細書中で使用される場合、オリゴリボヌクレオチドは、リン酸基、窒素塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）、及びリボースとして知られるペントースから構成されるモノマーである、ＲＮＡと略される分子をもたらす最大５０単位のモノマーの結合によって生じる分子である。それらの広範な用途に基づくと、単位がヌクレオチドイノシンを含む分子もその定義に含まれるとみなされる。

本発明で使用される場合、「オリゴリボヌクレオチド分子」という用語は、上記に規定されるオリゴリボヌクレオチド自体及び「オリゴリボヌクレオチド類似体」の両方を含む。「オリゴリボヌクレオチド類似体」は、幾らかの化学修飾が類似体を形成するリボヌクレオチド単位の少なくとも１つ、リン酸基、ペントース又は窒素塩基の１つのいずれかに組み込まれたオリゴリボヌクレオチドに由来する分子である。５’末端及び／又は３’末端の非ヌクレオチド基の付加からなる修飾も含まれる。延長として、本発明の目的上、また本明細書で使用される場合、「オリゴリボヌクレオチド分子」及び「オリゴリボヌクレオチド類似体」又は「オリゴヌクレオチド類似体分子」はｍｉＲＮＡのスポンジ、すなわちｍｉＲＮＡスポンジも含む。これは、その主要構成要素がオリゴヌクレオチドのタンデムリピートであり、これらの各オリゴヌクレオチド自体が対象のマイクロＲＮＡの結合部位であるか又はそれを含有することを特徴とすると考えることができるためである。

オリゴリボヌクレオチド類似体中に含まれる考え得る化学修飾に関して、この用語は、特に基礎研究の点での、特にこれらの分子の治療用途の探索における分子生物学の当業者に既知の通常の修飾の１つ以上の場合にも当てはまる。かかる修飾に関する情報は、Kole et al.による概説（Kole et al., 2012）等の概説に見ることができる。特に、本発明の目的上、加水分解に対する耐性が増大したＲＮＡ類似体を生じ、通常は２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ（２’−メトキシ修飾）；２’−Ｏ−メトキシエチル置換ＲＮＡ；ＬＮＡ（「ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）」：リボース部分が２’酸素と４’炭素とを接続する追加の架橋で修飾され、リボースを３’−エンド立体配座に固定するロックド核酸）；ＢＮＡ（「架橋化核酸（Bridged nucleic acid）」）；ＰＭＯ（リボースがカルボニルクロリド基に置換された核酸）、又はＰＮＡ（「ペプチド核酸」：ヌクレオチド類似体の骨格がペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンの反復単位の構造となるように、リボース−リン酸基がアミノ酸部分に置き換えられたペプチド核酸）を生じる修飾のようなリボース中の修飾である、より長いオリゴリボヌクレオチド又はリボ核酸に有効な修飾に特に興味が持たれる（また、本発明の範囲内の分子を生じる修飾に含まれるとみなされる）。Ａ型二重鎖（ＲＮＡ構造）に見られることが多く、標的ＲＮＡに対して並外れた親和性を生じる高３’−エンド立体配座に糖環を固定する点で２’−ＭＯＥ及び２’−ＯＭｅ修飾とは異なる、２’フルオロ修飾（２’Ｆ：リボース２’位のフッ素原子の導入）も既知である。

このため、本発明の目的に有用である可能性があり、本発明の範囲に含まれる分子を生じる修飾は、通常はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され、高配列特異的な標的ＲＮＡの効率的なノックダウン又は調節に加えて、トランスフェクション剤、配合物、コンジュゲート又はウイルスベクター等の外部原因なしに効率的な送達（ジムノティック送達と呼ばれる）を示すアンチセンス２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸（２’Ｆ−ＡＮＡ）であるＦＡＮＡオリゴの修飾である（Souleimanian et al., 2012）（例えば、より詳細な情報についてはAUM Biotechのウェブページ：https://www.aumlifetech.com/technology-platform/を参照されたい）。有意義なことに、ＦＡＮＡ一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ媒介切断を誘発し、この様式のｍＲＮＡノックダウンはｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンよりも単純であり、ｓｉＲＮＡにより観察されることが多いＲＩＳＣ関連オフターゲット作用を排除する（AUM Biotechのウェブページ：www.aumbiotech.comに説明される）。加えて、細胞質中でプロセシングされるｓｉＲＮＡとは異なり、ＦＡＮＡオリゴは核内に入ることができ、核内に存在するＲＮＡを標的化するために用いることができる。

近年、主に新たな特性を有するａｎｔａｇｏｍｉＲを得るために用いられる修飾である、リボース部分がコネクタとして作用する化学的部分により強固な立体配座に固定された、更なるタイプの化学的性質を有するヌクレオチドであるＣＲＮ（「配座固定ヌクレオチド（Conformationally Restricted Nucleotides）」）も用いられている（例えば、ウェブサイト：http://www.marinabio.com/pipeline/nucleic-acid-druqs/に提示される情報を参照されたい）。

ヌクレオチド鎖の「骨格」の一部であるリン酸基に影響を及ぼし、ヌクレオチド間の架橋として働かないリン酸基の酸素原子の代わりに硫黄原子の導入をもたらす修飾である、ホスホロチオエート結合を生じる修飾も一般的であり、本発明のオリゴリボヌクレオチド類似体を生じる考え得る修飾に含まれるとみなされる。これらの修飾は、ヌクレオチド間の結合をヌクレアーゼによって分解されにくいものにすることから、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害し、安定性を増大するために、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の最後の３つ〜５つのヌクレオチドの間に一般に挿入される。ホスホロチオエートリボヌクレオチド類似体は、通常は塩基の略称の前にｒを付け、その後に星印を付けることによって表され（例えば、ｒＡ^*）、ホスホロチオエートに結合した２’−Ｏ−メチル化塩基は、その略称の前の文字ｍ及びその後の星印によって表すことができる（例えば、ｍＡ^*）。

ａｎｔｉｍｉＲ群においてよく使用されることから、標的と共に形成される二重鎖の安定性を増大するようである窒素塩基シトシン（Ｃ）の５’メチル化も、本発明のオリゴリボヌクレオチド類似体を生じる化学修飾に含まれる。

同様にオリゴリボヌクレオチド類似体を生じる考え得る修飾に含まれる他の化学修飾が可能であり、既知である。「オリゴリボヌクレオチド分子」の定義及び「オリゴリボヌクレオチド類似体」の定義から推定することができるように、一部の単位が修飾を示し、残りが修飾を示さないハイブリッド分子、並びに核酸及びペプチドの類似体間のハイブリッド、又は更にはヌクレオチド単位の幾つかがリボヌクレオチド（又はその類似体）であり、残りがデオキシリボヌクレオチド（糖がデオキシリボースであるヌクレオチド）であるハイブリッド分子、及び後者の類似体、すなわちＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド及びその類似体もオリゴリボヌクレオチド類似体の定義に含まれる。

本発明の目的上、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｂｌｏｃｋｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ及びｍｉＲＮＡスポンジとして知られるタイプのｍｉＲＮＡの阻害剤、遮断剤又はアンタゴニスト、並びにそれらの配列がｍＲＮＡの配列に相補的であるが、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの適切な化学修飾が分子中に存在する限りにおいてａｎｔａｇｏｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ又はｂｌｏｃｋｍｉＲとして設計することができるという点で、それらの作用機構がｂｌｏｃｋｍｉＲの作用機構と似ていると説明されることが認められ得るＦＡＮＡオリゴヌクレオチドとして知られるものがオリゴリボヌクレオチド分子又はオリゴリボヌクレオチド類似体に含まれる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに対して作用し、通常はｍｉＲＮＡ生合成を変化させ、主に活性の利用可能なｍｉＲＮＡの減少のためにｍｉＲＮＡ活性に対して負の影響を有するｍｉＲＮＡの阻害剤、遮断剤又はアンタゴニストも、本発明の目的に有用であり、本発明の範囲に含まれるオリゴリボヌクレオチド分子又はオリゴリボヌクレオチド類似体の概念に含まれる。

このため、例えば本明細書の実施例１では、この化合物群に相当し、幾つかのリボヌクレオチド単位によって形成される分子、又はタンデムに（in tandem）配置された対象のマイクロＲＮＡに対する複数の結合部位を含有する強いプロモーターから発現される転写産物であるｍｉＲＮＡスポンジを使用する。ｍｉＲＮＡスポンジは、特異的ｍｉＲＮＡに対する標的配列全体を含有していてもよいが、通常は同じモチーフを有するｍｉＲＮＡのファミリー全体を遮断するために単一のスポンジ構築物を用いることができるように、相補的な七量体又は八量体フラグメント（シード領域）を有するｍｉＲＮＡを阻害するように設計される。「スポンジ構築物」という用語は、ｍｉＲＮＡスポンジが発現されるベクター及びそれにより発現されるＲＮＡ分子を指すために区別なく用いられることがある。明確にするために、本明細書では、「スポンジ構築物」という用語を、ｍｉＲＮＡスポンジが発現されるベクター自体又は発現されるｍｉＲＮＡスポンジをコードするベクターの特異的フラグメントに限定することを試みているが、試験中に対応するｍｉＲＮＡスポンジの発現が細胞又は組織に生じた場合に見られる効果に言及する場合、これらの構築物の効果を指す。

ｍｉＲＮＡスポンジが完全には特異的でないが、同じモチーフを有する幾つかのｍｉＲＮＡを遮断、サイレンシング又は阻害することができることから、可能な限り多くの望ましくない影響及びＤＭ１に関与しない影響を及ぼす遺伝子を回避するために、本発明では、いわゆるｂｌｏｃｋｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ又はａｎｔａｇｏｍｉＲの群の特異的阻害剤、特にａｎｔａｇｏｍｉＲが好ましい。３つ全ての場合が、幾らかの差異が認められるが、一連の分子がｍＲＮＡ分子の特異的な位置に結合するのを防ぐ化学修飾を有するオリゴヌクレオチドに関する。

本明細書で使用される場合、ｂｌｏｃｋｍｉＲは、原則としてそれぞれが転写産物に対するそのｍｉＲＮＡの影響のみを抑制解除するように、特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中の特定のｍｉＲＮＡが検出する配列に対して設計された特別な化学的性質を有する小型ＲＮＡであり、極めて特異的な効果が予想される。したがって、ｂｌｏｃｋｍｉＲは、通常はｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）の３’末端、言い換えると内在性ｍｉＲＮＡが通常結合する領域に結合するようにｍｉＲＮＡに対する結合部位として働く、ｍＲＮＡ配列のフラグメントの配列に相補的な配列を有するように設計される。

一方、ａｎｔａｇｏｍｉＲは概して、内在性ｍｉＲＮＡをサイレンシングするために用いられる。したがって、ａｎｔａｇｏｍｉＲは、リボヌクレオチド単位のみから構成される対応するＲＮＡオリゴマーに対して化学修飾され、標的ｍｉＲＮＡに相補的な小型合成ＲＮＡを指す。したがって、ａｎｔａｇｏｍｉＲは、特定のｍｉＲＮＡに特異的に結合し、ｍｉＲＮＡ阻害剤／遮断剤として作用するオリゴヌクレオチド類似体とみなすことができる。ｍｉＲＮＡが多くの標的転写産物を有し得ることから、ａｎｔａｇｏｍｉＲの使用は、場合によっては、変調すべきでなかったｍＲＮＡに影響を及ぼすことにより望ましくない副作用を生じる可能性がある。通例、ａｎｔａｇｏｍｉＲは、リボヌクレオチドと比較して、単位中に２−Ｏ−メチル基、ホスホロチオエート及びコンジュゲートしたコレステロール部分等の化学修飾を含む。ａｎｔａｇｏｍｉＲは一般に、Ａｇｏ２タンパク質の性能の或る種の障害又はａｎｔａｇｏｍｉＲと標的ｍｉＲＮＡとの間の不完全な対合のいずれかを生じることで、Ａｇｏ２媒介切断を回避する、少なくとも１つの修飾も含む。Wang et al.によって肝疾患におけるマイクロＲＮＡの関与の概説中に記載されるように（Wang et al., 2012）、ａｎｔａｇｏｍｉＲが裸の分子として静脈投与した場合に、マウスの種々の組織において標的ｍｉＲＮＡを用量依存的に阻害することが報告されている。幾つかある効果の中でも、ｍｉＲ−２２１のａｎｔａｇｏｍｉＲがマウスにおけるＨＣＣ腫瘍の異種移植片の成長を遮断し、マウスの生存を延長することが可能であったことが知られている。皮膚経路もａｎｔａｇｏｍｉＲの一般的な投与経路である。

ａｎｔｉｍｉＲは、それらに関する限り、通常は標的である成熟ｍｉＲＮＡの一部、いわゆるシード領域にのみ相補的であるが、上記のＬＮＡの修飾、又は場合によっては更には、言及したように、同様に標的と共に形成される二重鎖の安定性を増大するようである窒素塩基シトシン（Ｃ）の５’メチル化等の標的との結合を大幅に増大する修飾を示すことから、大きな親和性でシード領域に結合する。Rottiers et al.は、ＬＮＡ型の修飾を有する８単位のみのヌクレオチド類似体を含むこれらのｍｉＲＮＡのシード領域に対するａｎｔｉｍｉＲを用いて、ｍｉＲＮＡファミリーの効果的な阻害だけでなく、非ヒト霊長類における長期間のこれらの処理の有効性及び安全性も観察している。Wang et al.によって上述の参照文献に記載されるように（Wang et al., 2012）、これらの小分子は、裸の分子としての全身投与後に他の阻害剤よりも大幅に低い用量でマウス、ラット、類人猿及びチンパンジーにおいて全範囲の組織で強力な活性を示す。例えば、ＡｎｔｉｍｉＲ ＳＰＣ３６４９（Landford et al., 2010）は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を有する患者に対するフェーズ２ａ臨床試験に使用されている（ClinicalTrials.gov番号ＮＣＴ０１２００４２０）。

上記の定義から推定することができるように、マイクロＲＮＡ阻害剤／アンタゴニストの設計は、通常は阻害すべきマイクロＲＮＡに相補的な配列であり得るリボヌクレオチドの短い基本配列（ａｎｔａｇｏｍｉＲ及びａｎｔｉｍｉＲ、並びにマイクロＲＮＡスポンジにおいて通例である）、又はマイクロＲＮＡ自体の配列、又はマイクロＲＮＡが結合するｍＲＮＡ領域に相補的な配列（ｂｌｏｃｋｍｉＲの場合）に基づく。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド分子の２本の鎖が、５’−３’方向で読まれるそれらの１つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体配列が、３’−５’方向で読まれる他の配列のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の窒素塩基と対になる窒素塩基を示すヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の配列である場合に、１００％相補的である（又は本明細書でより簡潔に表現されるように、それらの配列が相補的である）ことが理解される。すなわち、配列５’−ＵＡＧＣ−３’は、それぞれ５’−３’方向で読むと配列５’−ＧＣＵＡ−３’及び５’−ＧＣＴＡ−３’となる、配列３’−ＡＵＣＧ−５’（リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位である場合）及び３’−ＡＴＣＧ−５’（デオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド類似体単位である場合）に相補的である。場合によっては、特にａｎｔｉｍｉＲの設計において、重要なことには、アンタゴニスト分子は、少なくとも窒素塩基の相補性に関して、拮抗すべきマイクロＲＮＡのシード領域の配列に相補的な配列に同一のフラグメントを含むものとする。また、しばしば、特にａｎｔａｇｏｍｉＲ及びａｎｔｉｍｉＲの場合、修飾は、対応するリボヌクレオチド単位に組み込まれ、主にリボース部分及び／又はリン酸に影響を及ぼし、所与の位置に存在するヌクレオチドが、その一部である窒素塩基の略称によって特定されるヌクレオチド配列の通常の表現では表すことが困難な修飾である。したがって、本発明では、単位中に存在するリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列間の同一性のパーセンテージを示すマイクロＲＮＡアンタゴニストの分子が比較されるが、これはこれが２つの分子又は配列フラグメントが同じ元の基本リボヌクレオチド配列から設計されるかを示すものであるためであり、いずれの場合にも種々の化学修飾がリボヌクレオチドに含まれていてもよい。

アンタゴニスト分子を設計するためには、阻害／拮抗作用／サイレンシングの所望の効果が実際にもたらされるように、それらを結合させるべき内在性分子との十分な相補性があることに留意することが重要である。この意味で、ｍｉＲＮＡとその標的との間の「典型的な」相補性が５０％であり得る例を考慮に入れることができ（例えば、参照http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/detail.php?mirtid=MIRT000125#targetを参照されたい）、したがって、本発明のオリゴリボヌクレオチド分子が、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、それを対になるべき内在性分子のフラグメントの配列、すなわちそれが結合すべき内在性マイクロＲＮＡの配列（ａｎｔａｇｏｍｉＲ及びスポンジｍｉＲＮＡの反復配列の場合）又はメッセンジャーｍＲＮＡフラグメントの配列（ｂｌｏｃｋｍｉＲの場合）に相補的な配列に対して少なくとも５０％（又は少なくとも５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、若しくは１００％）同一である、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の配列のフラグメントを含むのが望ましい。長さが作用を拮抗させるべきｍｉＲＮＡの長さにほぼ等しいａｎｔａｇｏｍｉＲの場合、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体単位の窒素塩基の配列が、拮抗すべき内在性マイクロＲＮＡの配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％（又は少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、若しくは１００％）同一であることが特に好ましい。これは、ヒトマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８−５ｐ及びｍｉＲ−２３ｂ−３ｐに対するａｎｔａｇｏｍｉＲの設計について従った基準である。ａｎｔｉｍｉＲの場合、ａｎｔｉｍｉＲが、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の窒素塩基の配列が、それらの標的である成熟ｍｉＲＮＡのシード領域のヌクレオチドの窒素塩基の配列に相補的である（好ましくは１００％相補的である）フラグメントを含むことが最も重要であり、ａｎｔｉｍｉＲ中に存在するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の残りの部分の相補性の重要性は、たとえあるにせよより低いものである。

比較のための配列アラインメントは、Smith及びWatermanのアルゴリズムAdv. Appl. Math. 2:482 (1981)；若しくは（o）Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)により；Pearson及びLipmanの類似性検索法Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)を使用して；又はIntelligenetics（Mountain View，California，USA）によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ；Wisconsin Genetics（Genetics Computer Group（GCG），Wisconsin USA）によるソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されないこれらのアルゴリズム及び方法論に基づくコンピュータアプリケーションを用いて行うことができる。特に、Altschul et al.によるアルゴリズム（Altschul et al., 1990）に基づくＢＬＡＳＴファミリープログラムが一般に公開されており（例えば、U.S. National Center for Biotechnological Informationのウェブページ：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiによる）、特に本発明の目的上、ヌクレオチドに特化したＢＬＡＳＴＮを、同一性の検索及び算出を行うために用いることができる。

本明細書の実施例に記載及び報告されるアッセイに見られるように、本発明者らは、ＣＵＧトリヌクレオチドリピートが筋肉で過剰発現したキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＤＭ１モデルにおける概念実証から開始した。このモデルは、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現を促進することによる特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）サイレンシングの治療可能性を探るために用いた。実施例１に記載のこのモデルを用いて行った試験から、特に「スポンジ」構築物を用いて、それらの発現を負に変調するｍｉＲＮＡの捕捉によって内在性ショウジョウバエｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質を上方調節することが可能であることが示される。このために、潜在的Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ調節因子として特定された一連のｍｉＲＮＡを基礎とし、初期セットのｍｉＲＮＡの２つであるｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の特異的サイレンシングのみが、所望の直接効果であるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質及び対応するｍＲＮＡの両方のレベルの増大をもたらしたことが見出された。この上方調節は、幾つかの誤ったスプライシング事象の逆転、ひいては筋萎縮の低減等のＤＭ１症状と同様の幾つかの表現型の回復を生じた。試験したハエは、飛行及び表面上昇（surface ascent）試験における筋肉機能の改善、並びに平均寿命の増大を示した。

同様に、本明細書は、ＨｅＬａ細胞におけるヒトのＭＢＮＬ（ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２）を負に調節し得る潜在的ｍｉＲＮＡの特定、実際に調節作用を有するようであったｍｉＲＮＡの選択、動物モデル、具体的にはマウスにおけるＤＭ１の場合に概して影響を受ける対象の組織でのそれらの発現の検証、幾つかの特異的ｍｉＲＮＡに対する阻害剤（具体的にはａｎｔａｇｏｍｉＲ）の設計、ヒト筋芽細胞においてＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を増大するその有効性の検証、並びに通例ＤＭ１を患う患者の筋芽細胞において変化する選択的スプライシングの幾つかの事象の回復との相関性の検証を記載している。かかるアッセイを、マウスＤＭ１モデルにおける阻害剤（特にａｎｔａｇｏｍｉＲ）の活性を検証することによって補完したが、アッセイしたａｎｔａｇｏｍｉＲが骨格筋に到達し、Ｍｂｌｎタンパク質発現を増大し、筋肉転写産物のスプライシング異常を回復させ、筋肉組織病理を改善し、筋強直グレードを低減することが観察された。ａｎｔｉｍｉＲ及びｂｌｏｃｋｍｉＲを用いて行ったアッセイも本願に提示され、ａｎｔｉｍｉＲ及びｂｌｏｃｋｍｉＲが比較的低い毒性を示し、ｂｌｏｃｋｍｉＲ、特にｍｉＲ−２３ｂ活性を標的とするｂｌｏｃｋｍｉＲがＭＢＮＬ１発現の顕著な増大をもたらすことが見出された。これらの試験は、ショウジョウバエにおいて行った概念実証と共に、設計された戦略の有効性を実証する。

実施例１に記載のショウジョウバエにおいて行った概念実証も、ｍｉＲＮＡ特異的阻害剤、遮断剤又はサイレンサーの設計、特に哺乳動物、特にヒトにおけるＤＭ１の治療へのそれらの適用のために考慮に入れられる幾つかの注目すべき事実を示したことから重要である。特に、以下の点が注目に値する：
解説したように、本発明者らの以前のデータ及びバイオインフォマティクス分析に基づき、潜在的ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ調節因子として特定された一連のｍｉＲＮＡを基礎としたが、それらの２つのみ、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７（配列番号２９）及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４（配列番号３０）のサイレンシングが、ｍＲＮＡ及びタンパク質自体の両方についてのショウジョウバエｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ遺伝子の発現の上方調節を生じた。したがって、ｍｉＲＮＡがＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２発現調節に対して影響を有し得ることを示す可能性がある構造モチーフの特定でしかなく、特にこのタンパク質レベルの増大が適切な組織において生じ、ＤＭ１症状の改善を伴うことを目的とする場合に、それが発現に対して負の影響を有するｍｉＲＮＡであるか、又はその特異的阻害剤の設計が或るタンパク質及び／又は他のタンパク質のレベルの増大に対して所望の効果を生じ得ることを保証するものではない。
定量分析により各スポンジ構築物が種々のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄアイソフォームのレベルの増大を生じることが確認されたことに留意することも興味深い。興味深いことに、両方のスポンジ構築物ｍｉＲ−２７７ＳＰ及びｍｉＲ−３０４ＳＰ（ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４をサイレンシングするために特異的に設計されたスポンジ構築物）が、それぞれｍｂｌＢ及びｍｂｌＣアイソフォームの発現を増大するのではなく、発現を負に調節することが可能であり、ＭＢＮＬタンパク質について以前に実証されたように（Kino et al., 2015、Terenzi et al., 2010）、或る種のアイソフォーム間調節が示唆された。この事実から、本発明者らは、２つのタンパク質間又はそれらの発現を調節するｍｉＲＮＡ間に生じ得る調節作用又は補償効果を制御するために、ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２のいずれかの阻害剤又は両方の阻害剤であるｍｉＲＮＡのヒト細胞における特定を考慮することとなった。
スポンジ構築物ｍｉＲ−３０４ＳＰ及びｍｉＲ−２７７ＳＰの１つを発現するハエの筋組織におけるタンパク質の免疫検出試験により、異なる細胞内位置ではあるが、どちらの場合にもｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの過剰発現が示された。ｍｉＲ−２７７ＳＰはサルコメアバンド中、ｍｉＲ−３０４ＳＰは核内でより増大を引き起こした。これらの場合のいずれにおいても、伸長を検出するように設計されたプローブ（「ＣＡＧ」プローブ）を用いてハエ胸部のＩＦＭ切片に検出されない、リボ核内フォーカスにおけるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの保持は検出されなかったことが注目に値する。最後に、ｍｉＲ−３０４ＳＰによるＭｂｌＣの発現の選択的調節によりアイソフォームＭｂｌＣが核内に位置することを示す以前の知識と一致して、ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現がＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄに依存する多数の誤ったスプライシング事象を回復させることが確認された。まとめると、特異的調節ｍｉＲＮＡのサイレンシングによって達成されるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの上方調節が、ハエのＤＭ１モデルにおいて変化した重要な分子特性を回復させるのに十分であることがこれらのデータから確認される。
実施例１では、ＤＭ１の特徴的な表現型である筋萎縮の回復に対するスポンジ構築物ｍｉＲ−２７７ＳＰ及びｍｉＲ−３０４ＳＰの発現の正の効果についても記載される。
ドライバーＭｈｃ−Ｇａｌ４によりスポンジ構築物を発現することで、長期的なｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ過剰発現の影響も試験した。対照ハエでは、ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現がｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの相対発現の６倍の増大を引き起こし、筋面積、生存又は運動器官の機能には影響を有しないことが観察された。しかしながら、１５倍のｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの上方調節を生じたｍｉＲ−２７７ＳＰの発現は、着地高さの減少と相関する筋面積の顕著な減少を引き起こした。しかしながら、ＣＴＧを発現する背景では、いずれのスポンジ構築物の発現も有益な効果を生じ、遮断されるｍｉＲＮＡの付加的な天然標的の転写産物の過剰発現の制限が、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ発現を刺激する正の効果と比較してごく僅かであることが示唆された。このことは、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７が筋肉において最高の発現を有するｍｉＲＮＡの１つであることから、ｍｉＲ−２７７ＳＰの有害作用がその標的の幾つか及びＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの過剰発現によって生じ得るために重要である。以前の研究から、マウスモデルにおけるＭＢＮＬ１の長期過剰発現が骨格筋に限定した場合に忍容性良好であることが確認されている。１０倍〜１７倍の範囲で増大したＭＢＮＬ１過剰発現は、検出可能な組織病理又は機能的異常（functional anomalies）を引き起こさなかった（非特許文献１７）。これらの結果は、治療を必要とする個体の他の機能に対して望ましくない副作用を生じることなくＤＭ１の症状を緩和する手段としての哺乳動物、特にヒトにおけるＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２タンパク質の負の調節に関与する特定のｍｉＲＮＡの活性阻害／サイレンシング／減少／拮抗を試みる戦略を支持するものと考えられた。

このため、これらの結果から、ヒト又は他の哺乳動物におけるＭＢＮＬのｍｉＲＮＡリプレッサーの遮断もＤＭ１の症状を軽減する可能性があり、ＤＭ１患者における特異的ｍｉＲＮＡ遮断剤によるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの上方調節の治療可能性の概念実証をもたらすことが示された。このため、本明細書において報告されるショウジョウバエＤＭ１モデルを用いた研究は、ＤＭ１治療の有効かつ効果的な治療標的としてのｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ（又はむしろヒト等の哺乳動物における相同タンパク質）の発現を抑制するｍｉＲＮＡの遮断剤の評価の基礎を築く。

これに基づき、本発明者らは、ヒトＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２タンパク質の考え得るｍｉＲＮＡリプレッサーの特定の研究に取り組み、同様の戦略がこれらのｍｉＲＮＡの１つ以上を阻害／遮断し、ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２タンパク質のレベルを増大することで、ＤＭ１の特徴的な表現型を回復させるために用いられ得るかを、これらのｍｉＲＮＡの阻害がこの疾患の典型的な症状の治療に役立ち得ることの証拠として後に検証した。

実施例２に記載のように、これらの遺伝子の一方又は両方の潜在的リプレッサーを特定するために初期スクリーニングを行ったが、合計２３個の候補マイクロＲＮＡが特定され、そのうち結合標的が一方又は両方の遺伝子の３’ＵＴＲ領域にあることが予測されるものを選択するバイオインフォマティクスプログラムにより予選択を行った。しかしながら、行った検証試験から、非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ）における対応するマイクロＲＮＡの結合標的の存在が相補的バイオインフォマティクスアプリケーションにより確認されたにも関わらず、予め選択されたマイクロＲＮＡの一部のみが、原則としてｍｉＲＮＡにより調節される遺伝子の対応するタンパク質（ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２）生成物のレベルの減少を効果的に生じることが示された。生じたタンパク質のレベルの減少は、実際に減少する場合においても、全てのマイクロＲＮＡで同じではなく、場合によってはより顕著であり、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ（本明細書ではｍｉＲ−２３ｂと略して称される）及びｍｉＲ−２１８−５ｐ（ｍｉＲ−２１８と略される）が強調された（略称ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８が本願の或る特定の箇所で成熟型ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−２１８−５ｐを意味するだけでなく、かかる成熟型を生じるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを指すためにも用いられていることに留意すべきである）。これにより、ショウジョウバエモデルにおいて行われた先の試験で既に述べたように、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの３’ＵＴＲ中の仮想結合標的又は想定される相互作用を示す可能性がある他のモチーフの特定は、マイクロＲＮＡが実際に、好ましくは直接的な遺伝子モジュレーターであること、またかかるマイクロＲＮＡの遮断又は阻害が実際に、この場合はＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２タンパク質のレベルの増大であった所望の変調をもたらすことを保証するものでも、又は当然とするものでもないことが示される。

加えて、予め選択されたｍｉＲＮＡが脳、小脳又は海馬等の中枢神経系器官、並びに骨格筋及び心臓のような疾患の特徴的な症状により最も影響を受ける器官において発現されるかを検証した。種々のマウス組織を用いて行った試験から、この動物の記載の器官（前脳、小脳、海馬、心臓、四頭筋及び腓腹筋）と関連する種々の組織における内在性マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の発現が、特に全ての組織においてはるかに高かったｍｉＲ−２３ｂの場合に、予め選択された残りのマイクロＲＮＡの発現よりもはるかに高いことが示された。これらのデータから、同じマイクロＲＮＡの阻害が他の哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型の症例の治療に役立ち得ることが示される。

ヒトの筋肉生検組織からの遺伝子発現決定も行い、疾患を患っていない対照と比較してｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂレベルがＤＭ１患者において明らかに増大することが観察された。ＤＭ１患者から得られた線維芽細胞における、対照と比較したｍｉＲ−２１８の増大も認められた。これらのデータは、実施例３においてａｎｔａｇｏｍｉＲを用いて行った有効性試験と併せると、樹立系統の培養物又は骨格筋細胞等の患者の対象の組織から得られた細胞の初代培養物が、試験を行い、種々のｍｉＲＮＡの考え得る遮断剤又は阻害剤の有効性を確認し、疾患の症状に対する緩和効果の指標として、疾患に特徴的な或る特定の分子異常が試験した阻害剤によって改善を示すか、又は緩和されるかを観察するのに有用であり得ることが示されることから興味深いものである。また、このことは、既存のマウスモデルがヒト疾患の全ての症状ではなく、主に筋肉の機能不全と関連する症状を再現することから、研究を推進するのに重要である。また、実際に、実施例３の終わりにアッセイが記載されるが、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８がＤＭ１筋芽細胞においてＭＢＮＬタンパク質を上方調節し、それらの正常細胞内分布に戻すことが分かる。最後に、実施例４に記載されるマウスＤＭ１モデルにおけるａｎｔａｇｏｍｉＲの有効性の検証から、アッセイしたａｎｔａｇｏｍｉＲが骨格筋に到達し、Ｍｂｌｎタンパク質発現を増大し、筋肉転写産物のスプライシング異常を回復させ、筋肉組織病理を改善し、筋強直グレードを低減することが示され、使用した特異的ａｎｔａｇｏｍｉＲが筋肉において以前に報告された（Krutzfeldt et al., 2005、Dey et al., 2012）よりも低い用量で効果的であることも見出された。マウス筋肉においてａｎｔｉｍｉＲによりｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８を阻害することによって、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２タンパク質レベルをそれぞれおよそ２倍超及び４倍超上方調節することが可能であった。重要なことには、ｍｉｒ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８サイレンシングによるＭＢＮＬタンパク質の上方調節はマウスにおいて忍容性良好であり、４日間の処理中に有害な表現型を有しなかった。さらに、ａｎｔａｇｏｍｉＲが成熟ＭＢＮＬ転写産物に対して作用することから、一連のＭＢＮＬタンパク質アイソフォームに直接影響を与えるとは予想されない。

これらの試験は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂと対応するメッセンジャーｍＲＮＡとの直接相互作用を確認する試験（ガウシアルシフェラーゼ試験を参照）と併せて、阻害剤／アンタゴニストを開発すべき阻害／拮抗に選好されるマイクロＲＮＡとしてのこれらのマイクロＲＮＡの選択をもたらした。

この結論を、ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂに対するｂｌｏｃｋｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ及びＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いたアッセイを記載する実施例５及び実施例６に示されるアッセイによって確認した。実施例５では、ｂｌｏｃｋｍｉＲ及びａｎｔｉｍｉＲはＤＭ１線維芽細胞において低い毒性を示したことから、それらの濃度を使用において増大することが可能であることが分かる。しかしながら、ａｎｔａｇｏｍｉＲは、ａｎｔｉｍｉＲよりも良好に作用することが示された。ｍｉＲ−２３ｂ標的を遮断した場合、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の顕著な増加が観察された。ｍｉＲ−２１８標的を遮断した場合にも同じことが起こったが、それらの毒性の低さでは、投与濃度の増大が可能であり、おそらくは影響が観察されるであろう。実施例６に示されるように、ＦＡＮＡ ＲＮＡサイレンシング及び調節技術から、２５０ｎＭ又は１μＭ範囲のＦＡＮＡオリゴヌクレオチドがＤＭ１筋芽細胞に対してそれほど毒性でないことが示され、以前の実施例のａｎｔａｇｏｍｉＲはＭＢＮＬ１に対してより強力であるようであるが、少なくともｍｉＲ−２３ｂと関連するＦＡＮＡオリゴヌクレオチドがＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２レベルを増大し、この場合も本発明の一般的アプローチである筋強直性ジストロフィー１型の治療における使用のためのｍｉＲ−２３ｂ及び／又はｍｉＲ−２１８アンタゴニストの使用の実現可能性が確認される。

上述のように、ｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの標的化及びそれらの生合成の変化により上記マイクロＲＮＡのレベルを減少させることで、それらの活性の減少も生じ得ることを理解すべきである。したがって、本発明の目的上、ｍｉＲ−２３ｂのアンタゴニスト又はｍｉＲ−２１８のアンタゴニストが、成熟型に作用することが可能な分子だけでなく、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ＲＮＡに作用し、成熟型のｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８のレベルを減少させることが可能な分子も含むことを理解すべきである。これらを設計するために、以下の点を考慮に入れる必要がある：
ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ−３ｐの一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子Ｃ９０ｒｆ３（ＥＮＳＧ０００００１４８１２０）の転写産物内にある遺伝子間マイクロＲＮＡであり、この遺伝子（ｃｈｒ９：９７４８８９８３−９７８４９４４１）はｍｉＲ−２３ｂのｐｒｉ−ｍｉＲとみなされ得る。ｍｉＲ−２３ｂの成熟配列に加えて、ｍｉＲ−２３ｂ成熟マイクロＲＮＡをコードする同じゲノム領域内で近くにあることから、同じクラスターの一部とみなすことができる他のマイクロＲＮＡが存在する（ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ：ｃｈｒ９：９７８４７７２７−９７８４７８２３［＋］、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０７４：ｃｈｒ９：９７８４８２９６−９７８４８３７６［−］及びｈｓａ−ｍｉｒ−２４−１：ｃｈｒ９：９７８４８３０３−９７８４８３７０［＋］）。好ましくは、望ましくない二次的影響を回避するために、このｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを標的とするアンタゴニストを有することが所望される場合、同じクラスターの他の３つのｍｉＲＮＡが影響を受けないように、それを選択することが好ましい場合がある。同じ理由から、ｍｉＲ−２３ｂのアンタゴニストは、それが成熟ｍｉＲＮＡ及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのアンタゴニストであるように設計されることが好ましい。
ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ−３ｐのマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、ゲノム位置ｈｇ１９ ｃｈｒ９：９７８４７４９０−９７８４７５８６［＋］及び配列：ＣＵＣＡＧＧＵＧＣＵＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＧＧＧＵＵＣＣＵＧＧＣＡＵＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＡＣＵＵＡＡＧＡＵＵＡＡＡＡＵＣＡＣＡＵＵＧＣＣＡＧＧＧＡＵＵＡＣＣＡＣＧＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＵＵＧＧＣ（配列番号８１）に対応する。これがｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂよりも長い配列であることから、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに特異的なアンタゴニストを設計することが可能である。
ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−５ｐは、それをコードする２つのゲノム位置、並びに２つの前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであるＰｒｅ−ｍｉＲ−２１８−１（ｃｈｒ４：２０５２９８９８−２０５３０００７）：ＧＵＧＡＵＡＡＵＧＵＡＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＣＵＧＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵＵＧＣＧＡＧＧＵＡＵＧＡＧＵＡＡＡＡＣＡＵＧＧＵＵＣＣＧＵＣＡＡＧＣＡＣＣＡＵＧＧＡＡＣＧＵＣＡＣＧＣＡＧＣＵＵＵＣＵＡＣＡ（配列番号８２）及びＰｒｅ−ｍｉＲ−２１８−２（ｃｈｒ５：１６８１９５１５１−１６８１９５２６０）：ＧＡＣＣＡＧＵＣＧＣＵＧＣＧＧＧＧＣＵＵＵＣＣＵＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵＧＧＡＡＣＧＡＵＧＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＵＧＧＵＵＣＵＧＵＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＣＣＵＧＣＡ（配列番号８３）を有する。どちらの前駆体もアンタゴニストの設計に用いることができる。
ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８の一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、ｍｉＲ−２１８−１については遺伝子ＳＬＩＴ２（ＥＮＳＧ０００００１４５１４７：ｃｈｒ４：２０２５４８８３−２０６２２１８４）、ｍｉＲ−２１８−２については遺伝子ＳＬＩＴ３（ＥＮＳＧ０００００１８４３４７、ｃｈｒ５：１６８０８８７４５−１６８７２８１３３）の転写産物内にある遺伝子間マイクロＲＮＡである。他の成熟ｍｉＲＮＡは同じクラスターの一部ではない。次いで、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８の場合、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの両方を、ＭＢＮＬタンパク質レベルの増大を目的とするアンタゴニストの考え得る標的として想定することができる。

マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８−５ｐ及びｍｉＲ−２３ｂ−３ｐは、初めに試験した他のマイクロＲＮＡとは異なり、ＤＭ１の特徴的な症状を緩和するためのそれらに対する阻害剤の開発のために候補マイクロＲＮＡが満たすことが意図された特性を実現するという共通点がある。例えば、
どちらも、実施例２における試験によると、他の経路に影響を及ぼすそれらの潜在的阻害剤のリスクを減少させるか、又はそれらの影響が標的遺伝子に対するそれらの作用までに必要な中間工程の内在性調節により減少する、対応するメッセンジャーＲＮＡに対する直接作用を有するリプレッサーである、ショウジョウバエｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ遺伝子に対応するヒト遺伝子ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２である作用すべき遺伝子の少なくとも１つのマイクロＲＮＡリプレッサーであるようである。
どちらも、運動障害及び心機能障害の両方に関連する筋肉の変化、又は神経障害等の疾患の特徴的な症状と関連する器官の組織において発現を示す。特に、どちらも、ＤＭ１患者に由来する筋肉生検組織のサンプルにおけるレベルの明らかな増大を示すため、細胞におけるこれらのマイクロＲＮＡの遮断又は阻害試験、及び選択的スプライシング改変等の疾患と関連する分子改変に対するそれらの効果の観察が、疾患の症状の緩和に対するそれらの遮断又は阻害の有効性の指標となり得る。

それらの遮断又は阻害を進めるためのこれらのマイクロＲＮＡの優先的選択が単一の発明概念に対応することを示すこれらの一致にも関わらず、ｍｉＲ−２１８がＭＢＮＬ２のみのリプレッサーであり、ｍｉＲ−２３ｂがＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方のリプレッサーであるという、それらの間の顕著な差異に留意すべきである。加えて、ｍｉＲ−２１８は、患者筋肉生検組織において有意に増大し（利用可能な実験データにおいて有意ではないが、ｍｉＲ−２３ｂは増加傾向を示す）、その遮断により、治療標的となることが既知のＭＢＮＬ２の抑制解除が予測されるだけでなく、ｍｉＲ−２１８の過剰発現が他の筋肉転写産物に対して引き起こし、それ自体が治療標的を構成する下流効果が軽減される。

さらに、本明細書に提示する試験により疾患の症状と関連する対象の組織における両方のマイクロＲＮＡの発現が確認されるが、データベースｍｉＲＧａｔｏｒバージョン３．０（ｖ３．０）（http://mirgator.kobic.re.kr）における発現組織の検索により、２つのマイクロＲＮＡ間の幾らかの差異が明らかとなり、ｍｉＲ−２３ｂはより広範な組織を示す。具体的には、ｍｉＲＧａｔｏｒ ｖ３．０によると、ｍｉＲ−２１８は脂肪組織、脳、中枢神経系、腎臓、心臓、肝臓及び胆管系、肺、咽頭、鼻咽頭、鼻、胎盤、脾臓、幹細胞、睾丸、子宮において発現され、ｍｉＲ−２３ｂは一方で中枢神経系、胃腸管、脂肪組織、乳房、膀胱、心臓、ケラチノサイト、腎臓、肝臓及び胆管系、肺、リンパ系細胞、鼻、咽頭、胎盤、前立腺、皮膚、脾臓、幹細胞、睾丸、甲状腺、並びに子宮において発現される。このため、検討される本発明の考え得る実施形態は、少なくとも脳、小脳、海馬、若しくは中枢神経系の他の器官、骨格筋、心臓、脂肪組織、腎臓、肝臓及び胆管系、肺、咽頭、鼻咽頭、鼻、胎盤、脾臓、睾丸、子宮、胃腸管、乳房、膀胱、前立腺、皮膚、ケラチノサイト及びリンパ系細胞の群から選択される１つ以上の器官、又はこれらの器官の１つに由来する初代培養物、若しくはこれらの器官の１つに由来する樹立細胞株（頭字語ＩＰＳＣによって知られる人工多能性幹細胞を含む）の１つ以上の細胞、又はこれらの器官の１つに由来する幹細胞において発現される、ヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節するマイクロＲＮＡのアンタゴニストであるオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子、又は該分子の２つ以上の混合物である。拮抗すべき特異的マイクロＲＮＡの選択、特に具体的にはヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ又はヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐにおける選択により、拮抗作用を発揮することができる組織の範囲も決定される。一方、考え得るその発現ベクターによるアンタゴニストの投与により、発現を組織又は特定の組織の群に、基本ベクター自体の指向性に従って及び／又は特定の組織においてのみそれらに連結したコード配列の発現を生じる制御要素を選択することによって指向させることが可能となる。加えて、幾つかの特定の投薬形態により或る器官又は他の器官への更なる接近が促進され得る。このため、その治療用途により直接的に言及する、本発明の態様の他の実施形態と組み合わせることができる、同様に考え得る実施形態は、脳、小脳、海馬、若しくは他の中枢神経系器官、骨格筋、心臓、脂肪組織、腎臓、肝臓及び胆管系、肺、咽頭、鼻咽頭、鼻、胎盤、脾臓、睾丸、子宮、胃腸管、乳房、膀胱、前立腺、皮膚、ケラチノサイト及びリンパ系細胞の群から選択される少なくとも１つ以上の器官、又はこれらの器官の１つ以上に由来する幹細胞におけるヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節するマイクロＲＮＡの作用の阻害又は拮抗作用による筋強直性ジストロフィー１型の治療のための医薬品の製造への本発明のオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子の１つ、それらの２つ以上の混合物、又は上記分子の少なくとも１つを含む組成物の使用として規定することができる。また、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐに対する阻害又は拮抗作用に特別な選好が見られるため、このことは、器官（単数又は複数）が脳、小脳、海馬、若しくは中枢神経系の別の器官、骨格筋、心臓、脂肪組織、腎臓、肝臓及び胆管系、肺、咽頭、鼻咽頭、鼻、胎盤、脾臓、睾丸及び子宮、又はこれらの器官の１つに由来する幹細胞の群から選択されることが好ましいが、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐの選択により、現在の知識に従って選択可能性を、少なくとも胃腸管、乳房、膀胱、前立腺、皮膚、ケラチノサイト及びリンパ系細胞、又はこれらの器官の１つ以上に由来する幹細胞、又はそれらの組合せにまで拡張することが可能になる。

ヒトマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８−５ｐ（ｍｉＲ−２１８）及びｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ（ｍｉＲ−２３ｂ）は、それらを形成するリボヌクレオチドの配列、及びそれらのそれぞれに対する特異的阻害剤／サイレンサー／アンタゴニストの設計について考慮に入れる必要があるそれらのシード領域も異なる。それらの成熟バージョンの配列を以下に示すが、それらのそれぞれのシード領域は、下線及びｍｉＲｂａｓｅデータベース（www.mirbse.org）におけるそれらのアクセスコード（Ｍｉｍａｔ）で表す：
ｍｉＲ−１２８−５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００２７５）：５’− ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ−３’（配列番号３）
ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４１８）：５’−ＡＵＣＡＣＡＵＵＧＣＣＡＧＧＧＡＵＵＡＣＣ−３’（配列番号４）

ショウジョウバエモデルにおいて行った試験から、マイクロＲＮＡスポンジによりリプレッサーマイクロＲＮＡの作用を阻害する実現可能性が実証され、３’ＵＴＲへのマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂの結合に関する試験により、ｂｌｏｃｋｍｉＲの開発がマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８又はｍｉＲ２３ｂの作用の遮断／阻害にとっても可能な戦略であることが示されたが、本発明者らは、上で説明したように、ヒトへのそれらの考え得る直接投与にとって興味深く、また多くの場合それらの末端に付加される親油性又は脂質部分の付加のために、通常はそれらの細胞への侵入を容易にする、それらに対して行われる化学修飾が通常は安定性の増大をもたらすことから、ａｎｔａｇｏｍｉＲを選ぶことを好んだ。このことから、筋強直性ジストロフィー１型の治療における使用のためのヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節するマイクロＲＮＡの阻害剤、特にヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ又はヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの阻害剤であるオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子の開発又は特定について考え得る選択肢の中でも、ａｎｔａｇｏｍｉＲが、試験が行われた選好される阻害剤であった。しかし、本願の実施例５及び実施例６では、ｂｌｏｃｋｍｉＲ及びａｎｔｉｍｉＲも同じ目的で使用するために設計することができ、それらの毒性がより低く、投与濃度の増大を考えることができることから、それらが場合によっては有用な代替物であり得ることが示される。ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドに関しても、特定の場合においてではあるが、それらがトランスフェクション試薬を必要としないことから、それらが或る特定の場合で選択肢となり得るという事実から、それらの使用の実現可能性について同様に意見することができる。

実施例３で認められるように、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂと称される開発された特異的ａｎｔａｇｏｍｉＲは、全てのリボース部分の２’−Ｏ−メチル（２’−メトキシ）修飾、ホスホロチオエートによるヌクレオチドの類似モノマー単位の間の幾つかのリン酸結合の置換、又は分子の一方の端、特に３’末端へのコレステロール部分の組込み等のこのタイプのオリゴリボヌクレオチド類似体に典型的な或る特定の化学修飾を示すが、上に詳述したように、同様に本発明に適合する分子をもたらし得る他の修飾も可能である。また、実施例５において使用される特異的ｂｌｏｃｋｍｉＲ及びａｎｔｉｍｉＲは、これらをｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適な安定した分子とする、ホスホロチオエートによるヌクレオチドの類似モノマー単位間の幾つかのリン酸結合の置換、多くのリボース部分の２’−Ｏ−メチル（２’−メトキシ）修飾、及び付加的に幾つかのＬＮＡヌクレオチドの存在等の或る特定の化学修飾を示す。

ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及び２１８は、行ったトランスフェクション実験において細胞に透過することが可能であることが証明された。毒性試験から、細胞においてこれらのａｎｔａｇｏｍｉＲの相当の検出シグナルを生じる濃度が、細胞の１０％を死滅させる阻害濃度（ＩＣ１０）よりも低いことが示され、それらの安全性及び筋強直性ジストロフィー１型の治療における使用のためのそれらが候補分子となる機会が支持され、試験の継続が可能となった。

実施例５においてアッセイしたａｎｔｉｍｉＲは、ＤＭ１線維芽細胞においてａｎｔａｇｏｍｉＲよりもはるかに低毒性であるようであったが、ＭＢＮＬタンパク質発現の修飾についてａｎｔａｇｏｍｉＲほど良好には作用しないようである。

異なる用量の一方のａｎｔａｇｏｍｉＲを用いてＤＭ１患者の筋芽細胞において行った用量応答試験から、これらのａｎｔａｇｏｍｉＲが特徴的にＤＭ１患者において変化したプロセスを有する幾つかの遺伝子の異常スプライシングを逆転させることが可能であることが示され、特に疾患の症状、特に筋肉の機能不全と関連する症状を緩和する筋強直性ジストロフィー１型の治療のための医薬品の調製へのそれらの使用が支持される。一方のａｎｔａｇｏｍｉＲによって逆転される事象の間にも、好ましい濃度にも絶対的一致が見られなかったため、場合によっては両方の組合せが興味深いが、他の場合にはａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８が選好され得る。

ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ及びｂｌｏｃｋｍｉＲ、中でもＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を考慮すると、例えば皮下又は全身経路による、好ましくは静脈内への、例えば水、又は生理食塩緩衝液若しくはリン酸緩衝液等の水溶液等の薬学的に許容可能な担体に溶解又は懸濁した、ヒトへの直接投与を検討することができる。それらを投与する組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含有し得る。ｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの特定の場合に、滅菌水又は生理食塩緩衝液へのＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの再懸濁が推奨され（例えば、https://www.aumbiotech.com/InVivoに提示される情報を参照されたい）、３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの用量が適切であり得るが、他の濃度が器官又は腫瘍内送達により好適である場合がある。他のオリゴヌクレオチドとしては、ＦＡＮＡオリゴを種々の経路：静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）、腫瘍内（ＩＴ）、鼻腔内（ＩＮ）、気管内、急速大容量尾注射（hydrodynamic tail injection）、吸入又は局所器官送達で投与することができる。

これらのａｎｔａｇｏｍｉＲの１つ若しくはそれらの混合物、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐに対する１つの及び任意の他のａｎｔａｇｏｍｉＲ、若しくはそれらの混合物、又は本願の実施例において使用されるｂｌｏｃｋｍｉＲ、ａｎｔｉｍｉＲ又は特異的ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドのいずれか１つ又はそのいずれかの混合物を含む、概して、ヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節するこれらのマイクロＲＮＡの１つ又は別のマイクロＲＮＡの阻害剤である任意のオリゴリボヌクレオチド及び／又はオリゴリボヌクレオチド類似体分子を含み、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む組成物も含む、組成物も本発明の範囲に含まれる。加えて、ｍｉＲＮＡスポンジ、又は更には最終的に抑制効果を有する成熟マイクロＲＮＡの前駆体を発現する発現ベクター間の直接関係を考慮すると、上記オリゴリボヌクレオチド分子の１つの発現ベクター、特にヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐに相補的な複数のタンデム部位、又はそれらのそれぞれに相補的な複数のタンデム結合部位の混合物を含むマイクロＲＮＡスポンジのコード配列を含むベクターを含む組成物も本発明の範囲に含まれる。

その臨床用途については、この場合本発明の医薬組成物とみなされる本発明の組成物は、所望の用途に適切な形態で調製することができる。国際公開第２０１２１４８３７３号等のマイクロＲＮＡの阻害剤／アンタゴニストの臨床用途にも関連する文献において収集されるように、これは概して、本質的にパイロジェンフリーであり、ヒト又は動物に対して有害であり得る他の不純物を含まない組成物の調製を意味する。上記国際公開第２０１２１４８３７３号の対象は、本発明の化合物と似た化合物及びその治療用途であるため、医薬組成物の調製及び提供の形態、考え得る投与に適切な担体、又は投与の形態及び経路についての情報は、本発明に適用可能であると考えることができ、本発明の組成物の参照とみなすことができる。上記情報の一部を下記に転載する。

考え得る一実施形態では、医薬組成物は、有効量のヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの阻害剤若しくはアンタゴニスト、又はそれらの混合物を含む。例えば、医薬組成物は、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ若しくはヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの阻害剤／アンタゴニスト、又はそれらの混合物を含み得る。好ましくは、存在するヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐの阻害剤／アンタゴニストは、本発明の実施例において使用されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型阻害剤（配列番号１０によって表される）であり、存在するヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの阻害剤／アンタゴニストは、配列番号１１によって表されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型阻害剤である。存在するヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐの阻害剤／アンタゴニスト及び／又は存在するヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐの阻害剤／アンタゴニストが本願の実施例５又は実施例６において使用されるｂｌｏｃｋｍｉＲ又はａｎｔｉｍｉＲ型阻害剤のいずれかであることも好ましい。より好ましくは、存在する阻害剤（複数の場合もある）／アンタゴニスト（複数の場合もある）は、治療有効量の投与を可能にする濃度で存在する。

「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の臨床転帰を達成するのに十分な量である。他のマイクロＲＮＡに対する分子を用いて得られた以前の結果によるマイクロＲＮＡの阻害剤／アンタゴニストの有効量は、およそ１ｍｇ／ｋｇ〜およそ１００ｍｇ／ｋｇ、およそ２．５ｍｇ／ｋｇ〜およそ５０ｍｇ／ｋｇ、又はおよそ５ｍｇ／ｋｇ〜およそ２５ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量とみなされ得る量の正確な決定は、大きさ、年齢を含む各患者についての個々の因子、及び阻害剤又はアンタゴニスト（例えば、発現構築物である場合、ａｎｔａｇｏｍｉＲ又はａｎｔｉｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体）の性質に基づく可能性がある。したがって、本明細書及び当該技術分野における知識に基づいて当業者は投与量を容易に決定することができる。特定の治療期間中に被験体に複数回投与を行い、毎日、毎週、毎月、２ヶ月に一度、３ヶ月に一度又は６ヶ月に一度投与を行うことが必要又は好都合であり得る。或る特定の実施形態では、被験体に１つ以上の後続の用量又は維持用量よりも多い初期用量を最初に与える。

巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、パール（pearls）並びに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系等のコロイド分散系を、本発明の医薬組成物を形成する本発明の阻害剤／アンタゴニストの投与ビヒクルとして用いることができる。被験体へのオリゴリボヌクレオチド分子の送達に好適な市販の脂肪エマルションとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標） ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標） ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ及び他の同様の脂質エマルションが挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏ投与ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。かかる系の調製及び使用は当該技術分野で既知である。例示的な配合物は、米国特許第５，９８１，５０５号、米国特許第６，２１７，９００号、米国特許第６，３８３，５１２号、米国特許第５，７８３，５６５号、米国特許第７，２０２，２２７号、米国特許第６，３７９，９６５号、米国特許第６，１２７，１７０号、米国特許第５，８３７，５３３号、米国特許第６，７４７，０１４号及び国際公開第０３／０９３４４９号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）にも記載されている。

別の可能性は、以前に言及されているように、投与ビヒクルを安定したものにし、標的細胞による捕捉を補助する適切な塩及び緩衝液を用いて本発明の医薬組成物を調製することである。本発明の組成物は、有効量の投与ビヒクルを含み、薬学的に許容可能な担体又は水性媒体に溶解又は分散させた、独立した、若しくはリポソーム若しくは他の複合体を形成する本発明のオリゴリボヌクレオチド分子、又はその発現ベクターを含む水性組成物とすることができる。「薬学的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」という表現は、動物又はヒトに投与した場合に任意の有害反応、アレルギー反応又は他の反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能なビヒクル」は、ヒトへの投与に好適な医薬品等の医薬品の配合への使用に許容可能な溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤（absorption retarding agents）等を含む。医薬活性物質へのかかる媒体及び作用物質の使用は当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体又は作用物質が本発明の活性成分と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物へのそれらの使用が企図される。付加的な活性成分を、それらが本発明の分子又はそれらの発現ベクターを不活性化しない限りにおいて組成物に組み込んでもよい。

本発明の活性組成物は、標的組織がその経路により利用可能である限りにおいて、一般的な経路のいずれかで投与することができる。これには経口、経鼻又は口腔内経路が含まれ、好ましくは、投与は皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内経路によるものであり得る。先に解説したように、ａｎｔａｇｏｍｉＲ又はａｎｔｉｍｉＲを含む組成物は、静脈内又は皮下投与用に配合するのが一般的である。例としては、遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中、また油中でも調製することができる。通常の保管及び使用条件下では、これらの調製物は概して、微生物の増殖を防ぐために保存料を含有する。

注射用途に好適な剤形としては、例えば滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。これらの調製物は概して、容易に注射可能である限りにおいて滅菌かつ流体である。調製物は、製造及び保管条件で安定し、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保存される必要がある。適切な溶媒又は分散媒は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール等）、好適なそれらの混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には所要の粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、幾つかの抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによって生じさせることができる。

滅菌注射用溶液は、適切な量の活性化合物を、必要に応じて任意の他の成分（例えば、上記に指定される）と共に溶媒に組み込み、続いて濾過減菌を行うことによって調製することができる。分散液は概して、様々な滅菌済活性成分を、基本分散媒及び例えば上記に指定される他の所望の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、活性成分（複数の場合もある）＋先に滅菌した濾過溶液からの所望の任意の付加的な成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥法が挙げられる。

本発明の組成物は、通常は中性形態又は塩形態で配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）等が挙げられる。タンパク質の遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄）又は有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等）に由来していてもよい。

いずれの場合でも、本発明の組成物の調製は、Q7 Working Group Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients of the International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceutical Agents for human use（http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q7/ICH_Q7-IWG_QA_v5_0_14Apr2015_FINAL_for_publication_17June2015.pdfにてインターネット上で利用可能な２０１５年６月１０日のその質疑応答の補完と共に、http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q7/Step4/Q7_Guideline.pdfにてインターネット上で利用可能なＩＣＨ Ｑ７ガイドライン「原薬ＧＭＰガイドライン（Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients）」）に記載されるようなヒトへの使用のための最低限の品質を保証する慣行に従うことが推奨される。好ましくは、http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.htmlのページでアクセスすることができる、製剤開発に関するＱ８又は医薬品品質システムに関するＱ１０等の同じ出所の他の品質ガイドラインも考慮に入れられる。

配合後に、溶液は剤形に適合する形態かつ治療上有効な量で投与するのが好ましい。配合物は注射用溶液、薬物放出カプセル等のような様々な投薬形態で容易に投与することができる。水溶液中での非経口投与については、例えば、溶液は、通常は適切に緩衝され、液体希釈剤を初めに、例えば十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。かかる水溶液を、例えば静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用することができる。好ましくは、当業者に既知であるように、特に本明細書を考慮して選択される滅菌水性媒体を使用する。例としては、一回量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液（hypodermoclysis fluid）を添加するか、又は提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Remington Pharmaceutical Sciences」第１５版、１０３５頁〜１０３８頁及び１５７０頁〜１５８０頁を参照されたい）。治療を受ける被験体の状態に応じて投与量の幾らかの変動が必然的に生じる。いずれの場合にも、投与の責任者が個々の被験体に適切な投与量を決定するものとする。一方、ヒト投与については、調製物は必要に応じて、例えば上記に引用したＩＣＨ品質ガイドライン又はＦＤＡ規制による無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の生物学的標準を満たす必要がある。

ここで、本発明を下記に示す実施例及び図面を用いてより詳細に説明する。

下記に提示する実施例に記載の試験は、以下の材料及び方法論を用いて行った。

ショウジョウバエのストック
キイロショウジョウバエ種のハエＭｈｃ−Ｇａｌ４系統は、ショウジョウバエミオシン重鎖遺伝子発現パターンと共に酵母の転写因子Ｇａｌ４を発現する。したがって、Ｇａｌ４は体性筋組織すなわち骨格筋組織、内臓筋組織すなわち平滑筋組織、特に咽頭及び背脈管又は心臓の筋肉を含む、この昆虫の筋肉組織全体で発現される。これらは中央リポジトリ（http：//flystocks.bio.indiana.edu/）から、その維持に貢献する料金を支払うことによって購入することができる。ショウジョウバエのｍｉＲＮＡであるｄｍｅ−ｍｉＲ−９２ａ、ｄｍｅ−ｍｉＲ−１００、ｄｍｅ−ｍｉＲ−１２４、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７、ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４に対するｍｉＲＮＡスポンジ（ＵＡＳ−ｍｉＲ−ＳＰ）、及び陰性対照としてのランダム配列に対するｍｉＲＮＡスポンジ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰとして知られる、対照）を有する系統は、T. Fulga博士から入手した（Fulga et al., 2015）。簡潔に述べると、ｍｉＲ−ＳＰの構築物を、４ヌクレオチドの可変結合配列によって分離されたｍｉＲＮＡに相補的な２０反復配列のサイレンシングカセットを用いて設計した（ｍｉＲ−９２ＳＰ：配列番号６２；ｍｉＲ−１００ＳＰ：配列番号６３；ｍｉＲ−１２４ＳＰ：配列番号６４；ｍｉＲ−２７７ＳＰ：配列番号６５；ｍｉＲ−３０４ＳＰ：配列番号６６）。組み換え系統ＭＨＣ−Ｇａｌ４ ＵＡＳ−ｉ（ＣＴＧ）４８０は、Llamusi et al.に記載のように生成した（Llamusi et al., 2013）。ハエ系統ＵＡＳ−ｍｂｌＣ及びＵＡＳ−ＩＲ−ｍｂｌの構築及び特性は、以前に記載されている（それぞれGarcia-Casado et al., 2002及びLlamusi et al., 2013）。ＵＡＳ−ｍｂｌＣは、ＧａＬ４／ＵＡＳシステムの制御下でｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームｍｂｌＣ（アクセス番号ＮＭ １７６２１０で表される）を発現する導入遺伝子であり、ＵＡＳ−ＩＲ−ｍｂｌは、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ遺伝子から選択的スプライシングによって生成する全ての転写産物をサイレンシングする干渉構築物を発現し、ｍｂｌの発現を、その正常値の少なくとも５０％まで低減することが以前の試験で示されている導入遺伝子である。全ての交雑を標準ハエ給餌により２５℃で行った。

ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲ
各生物学的複製について１０匹の雄性成体の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Sigma）を用いて抽出した。１マイクログラムのＲＮＡをＤＮアーゼＩ（Invitrogen）で消化し、ランダムヘキサヌクレオチドを用いるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Invitrogen）を用い、製造業者の推奨に従って逆転写した（retrotranscribed）。２０ｎｇのｃＤＮＡを、Ｇｏ Ｔａｑポリメラーゼ（Promega）及びＦｈｏｓ遺伝子のエクソン１６’及びＴｎｔ遺伝子のエクソン３〜５のスプライシングを分析するための特異的プライマーを用いた標準ＰＣＲ反応に使用し、内在性対照としてＲｐ４９を０．２ｎｇのｃＤＮＡとともに使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲを２ｎｇのｃＤＮＡ鋳型からＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystems）及び特異的プライマー（配列番号３１〜配列番号５０：表１を参照されたい）を用いて行った。参照遺伝子Ｒｐ４９については、ｑＲＴ−ＰＣＲを０．２ｎｇのｃＤＮＡから行った。熱サイクルは、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）において標準条件に従って行った。各実験において３回の生物学的反復試験及び３回の技術的反復試験を行った。内在性遺伝子及び対照群に関する相対発現のデータは、２^-ΔΔ^Ct法によって得た。サンプル対は、両側Ｔ検定（α＝０．０５）を用い、必要であればウェルチ補正を適用して比較した。

ウエスタンブロット
キイロショウジョウバエの全タンパク質の抽出のために、２０個の雌の胸部をＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）＋プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Science）中でホモジナイズした。全タンパク質を、ウシ血清アルブミンを標準として用いたＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）によって定量化した。２０μｇのサンプルを１００℃で５分間変性させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。膜をＰＢＳ−Ｔ（８ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）中の５％粉末スキムミルクでブロッキングし、免疫検出を膜上で標準手順に従って行った。ショウジョウバエのＭｂｌタンパク質の検出のために、抗Ｍｂｌ抗体（Houseley et al., 2005）を初期野生型胚（産卵後０時間〜６時間）に対して予め吸着処理し、非特異的抗体の結合を排除した。膜を吸着処理済み（preabsorbed）一次抗体（終夜、１０００倍）、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗ヒツジＩｇＧ抗体（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）と共にインキュベートした。ロード対照（Load control）を、抗チューブリン抗体（終夜のインキュベーション、５０００倍、Sigma-Aldrich）を用いて行い、続いてＨＲＰコンジュゲート二次抗マウスＩｇＧ抗体（１時間、３０００倍、Sigma-Aldrich）とのインキュベーションを行った。ウエスタンブロットＥＣＬ基質（Pierce）を用いてバンドを検出した。画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（GE Healthcare）により撮影した。

細胞からの全タンパク質抽出のために、ＨｅＬａ細胞及びヒト筋芽細胞を超音波処理し、マウス筋肉（腓腹筋及び四頭筋）を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Science）を添加したＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）中でホモジナイズした。全タンパク質を、ウシ血清アルブミンを標準濃度範囲として用いたＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）によって定量化した。免疫検出アッセイのために、２０μｇのサンプルを１００℃で５分間変性させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、０．４５μｍニトロセルロース膜（GE Healthcare）上に転写し、ＰＢＳ−Ｔ（８ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）中の５％脱脂粉乳でブロッキングした。ＨｅＬａ細胞、ヒト筋芽細胞及びマウスサンプルについては、膜を一次マウス抗ＭＢＮＬ１（１０００倍、ａｂ７７０１７、Abcam）又はマウス１３抗ＣＵＧ−ＢＰ１（２００倍、クローン３Ｂ１、Santa Cruz）抗体のいずれかと共に４℃で一晩インキュベートした。ＭＢＮＬ２を検出するために、マウス抗ＭＢＮＬ２（１００倍、クローンＭＢ２ａ、Developmental Studies Hybridoma Bank）をヒト筋芽細胞及びマウスサンプルに使用し、ウサギ抗ＭＢＮＬ２（１０００倍、ａｂ１０５３３１、Abcam）抗体をＨｅＬａ細胞に使用した。ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）を必要とするＨｅＬａ細胞サンプル中のＭＢＮＬ２抗体を除く全ての一次抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）を用いて検出した。ローディング対照は、細胞サンプルについては抗β−アクチン抗体（１時間、５０００倍、クローンＡＣ−１５、Sigma-Aldrich）、マウスサンプルについては抗Ｇａｐｄｈ（１時間、５０００倍、クローンＧ−９、Santa Cruz）、続いてＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）とした。免疫反応性バンドを、増強化学発光ウエスタンブロット基質（Pierce）を用いて検出し、画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（GE Healthcare）によって取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH）を用いて定量化を行い、統計学的差異を正規化データに対するスチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）を用いて推定した。

組織学的分析
ハエの飛翔筋（fly muscle）におけるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの免疫蛍光検出及びショウジョウバエの胸部における筋面積の分析を以前に記載のように行った（Llamusi et al., 2013）。Ｍｂｌの免疫検出のために、ハエ胸部の凍結切片を用い、ブロッキング溶液と共に３０分間、５００倍希釈の抗Ｍｂｌ抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。翌日、過剰な抗体をＰＢＳ−Ｔで洗い流し、２００倍希釈のビオチンとコンジュゲートした二次抗体抗ヒツジＩＧと共に４５分間インキュベートした。二次抗体を洗浄した後、ＡＢＣ溶液（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット）と共に３０分間インキュベートし、過剰な試薬を洗い流し、１０００倍の最終フルオロフォアとコンジュゲートしたストレプトアビジンと共に４５分間インキュベートした。調製物を、ＤＡＰＩを含む封入剤に封入した。

エポキシ樹脂に包埋した胸部断面から筋面積を決定した。簡潔に述べると、胸部を氷中の２００μｌの溶液１（１／４の４％パラホルムアルデヒド、１／４の８％グルタルアルデヒド、１／４の０．２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄及び１／４の０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄）の入ったチューブに入れた。次いで、２００μｌの溶液２（溶液１及び四酸化オスミウムの１：１混合物）を添加し、氷中で３０分間インキュベートした。次いで、混合物を２００μｌの溶液２に置き換え、氷中で１時間〜２時間インキュベートした。固定後に、サンプルを氷中で３０％、５０％及び７０％、室温で９０％及び１００％のエタノールに５分間（２回）通すことによって脱水した。次いで、プロピレンオキシドに１０分間、２回通した。最後に、サンプルをプロピレンオキシド及びエポキシ樹脂の１：１混合物中に一晩置いた。翌日、液体を純粋なエポキシ樹脂に置き換え、少なくとも４時間サンプル中に浸透させた。その後、ハエを樹脂の入った鋳型に入れ、整列させ、樹脂を７０℃のパスツール炉（Pasteur furnace）内で終夜重合させた。サンプルをウルトラミクロトームにおいてダイヤモンドブレードで１．５μｍの断面切片に切り出した。光学顕微鏡下での更なる観察のために切片をスライド上に置き、１滴のＤＰＸ封入剤をゲル化させ、カバーガラスをかぶせた。

フォーカスの検出
分析対象のハエの胸部をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で一晩固定した後、ＰＢＳ中の３０％スクロース溶液において２日間維持した。２日後に、胸部をＯＣＴに浸し、液体窒素中で凍結し、処理を行うまで−８０℃に維持した。この時点で、１５μｍの横断切片をクライオミクロトーム（cryomicrotome）Ｌｅｉｃａ ＣＭ １５１０Ｓで得た。胸部切片のスライドを１倍ＰＢＳで３回（５分間）洗浄し、アセチル化バッファーを添加した。１０分後に、スライドを１倍ＰＢＳで３回（５分間）洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液（１０ｍｌの脱イオン化ホルムアミド、１２μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、４００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝８、２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８、２ｇの硫酸デキストラン、４００μｌの５０倍デンハルト溶液、１ｍｌのニシン精子（１０ｍｇ／ｍ）、２０ｍｌの最終容量までのＨ₂Ｏ）を用いて３０分間プレハイブリダイズした。標識プローブ（Ｃｙ３−５’ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ３’−Ｃｙ３：配列番号６１、Sigma）を６５℃で５分間加熱した後にスライドに添加し、ハイブリダイゼーションバッファー（１／１００）に溶解し、多湿暗室において３７℃で一晩ハイブリダイズした。翌日、プレパラートを３２℃に維持しながら２倍ＳＳＣで洗浄し（２×１５分間）、ＰＢＳで３×５分間洗浄した。最後に、スライドにＶｅｃｔａｓｔａｉｎをマウントし、４０倍レンズを備える共焦点顕微鏡ＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００を用いて写真を撮影した。

ショウジョウバエにおける生存率の分析
適切な遺伝子型を有する合計１２０匹の新生ハエを収集し、２９℃に維持した。ハエを２日に１回、新たな新鮮栄養培地に移し、死亡数を毎日計数した。カプランマイヤー法を用いて生存曲線を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用いて対数範囲検定（logarithmic range test）（ログランク検定、マンテル−コックス）（α＝０．０５）により統計分析を行った。

機能試験
飛行試験をBabcok et al.によって記載される手順（Babcock et al., 2014）に従い、１群当たり１００匹の雄性ハエを用いて５日目に行った。試験は、じょうごを通して高さおよそ１メートル、直径１５ｃｍの円筒にハエの群を放すことからなる。この円筒を、接着剤を染み込ませたプラスチックシートで覆い、ハエが飛んで円筒の上部の空中に留まりそこで動けなくなるか、又は十分に飛べない場合に円筒の底部に落下して動けなくなるようにする。着地高さを、両側ｔ検定（α＝０．０５）を用いて群間で比較した。上昇速度を評定するために、１０匹の５日齢の雄の群を麻酔することなく２４時間経過後に使い捨てピペット（直径１．５ｃｍ、高さ２５ｃｍ）に移した。各ハエが１０秒間で到達するバイアルの底からの高さをカメラで記録した。各遺伝子型について３０匹のハエの２つの群を試験した。サンプル対を、両側Ｔ検定（α＝０．０５）を用い、必要であればウェルチ補正を適用して比較した。

マイクロＲＮＡ模倣物のライブラリー（ＳｕｒｅＦＩＮＤトランスクリプトームＰＣＲアレイ、Qiagen）に基づくスクリーニング
この研究では、キット「癌ｍｉＲＮＡ ＳｕｒｅＦｉｎｄトランスクリプトームＰＣＲアレイ」（Qiagen）を使用して、考え得るＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２を調節するｍｉＲＮＡを特定した。ｑＰＣＲ多重試験を、市販のＴａｑＭａｎプローブ（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔプローブＰＣＲキット、Qiagen）を用いて行い、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２（ThermoFisherによる蛍光マーカーＦＡＭ：フルオレセインで標識した対象の遺伝子）、並びにＧＡＰＤＨ（同様にThermoFisherからのＭａｘ又はＦｌｕｏｒｏ−Ｍａｘとして知られるフルオロフォアで標識した内在性遺伝子として）の発現を定量化した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎＰｌｕｓリアルタイムサーマルサイクラーを用いて行い、各々の特異的マイクロＲＮＡ模倣物による処理の結果としてのＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現の変化を、ＳｕｒｅＦＩＮＤ ｍｉＲＮＡトランスクリプトームＰＣＲアレイに付属するＥｘｃｅｌベースのデータ分析ソフトウェアを用いて分析し、模倣物陰性対照（天然には存在しないマイクロＲＮＡ）に対して算出し、ＧＡＰＤＨに対して標準化した。観察された変化をｌｏｇ２の形で表し、陽性ｍｉＲＮＡ候補の選択のために統計分析ΔΔＣｔ（ＭＡＤ）に供した。

検証試験
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich）を添加した、１０００ｍｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ培養培地（Sigma-Aldrich）中、３７℃で培養した。細胞を６ウェルプレートにおいて２ｍｌ容量の培地に４×１０⁵細胞／ウェルの密度で播種した。１６時間後に細胞が８０％コンフルエントな状態で、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ試薬（Roche）を用い、ＨｅＬａ細胞での使用についての製造業者の説明書に従ってベクターをトランスフェクトした。

ＨｅＬａ細胞に、マイクロＲＮＡの発現のための２μｇの各バージョンのベクター：いずれの場合にも、元のベクターのＣＭＶプロモーターに操作可能に連結した、ひいてはその制御下の５つのマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７、挿入配列：配列番号５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ：配列番号６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ：配列番号７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８：配列番号８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３７２：配列番号９）のうち１つの個々の前駆体のコード配列を含有する市販のプラスミドｐＣＭＶ−ＭＩＲ（OriGene）に由来するベクター、又はマイクロＲＮＡの前駆体配列を含まない空バージョンをトランスフェクトした。

これらの細胞のＲＮＡを、プラスミドのトランスフェクションの４８時間後にＴｒｉｚｏｌ（Sigma）を用いて抽出した。１マイクログラムのＲＮＡをＤＮアーゼＩ（Invitrogen）で消化し、ランダムヘキサマーを用い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Invitrogen）を用いて逆転写した。各ＲＮＡサンプルの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ−１０００分光光度計（Thermo Scientific，Waltham，MA）で決定した。ｑＰＣＲによる転写レベルでのＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現の定量化を、１０ｎｇのｃＤＮＡから市販のＴａｑＭａｎプローブ（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔプローブＰＣＲキット、Qiagen）を用い、先のセクションのように製造業者の説明書に従って行った。

ウエスタンブロット試験に使用した全てのタンパク質は、トランスフェクションの７２時間後にＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）＋プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Roche Applied Science）を用いて抽出した。サンプルを、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて定量化した。２０ｎｇのサンプルを１００℃で５分間変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％アクリルアミド）のロードに使用し、Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ電気泳動システム（Bio-Rad）を用いてタンパク質を分離した。ニトロセルロース膜（GE Healthcare）でのタンパク質の固定化を、Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ ＳＤ半乾式転写細胞システム（Bio-RAD）における電気泳動転写（electrotransference）によって行った。転写は定電圧（１５Ｖ）で１時間行った。電気泳動後に膜をＰＢＳＴ中で平衡化し、ブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中の５％スキムミルク）中で１時間ブロッキングした。これらの膜を続いて一次抗体である抗ＭＢＮＬ１及び抗ＭＢＮＬ２（終夜、１０００倍、Abcam）と共にインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体、抗マウス−ＨＲＰ及び抗ウサギ−ＨＲＰのそれぞれを添加した（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）。ロード対照として抗β−アクチンを使用し（終夜、５０００倍、Sigma-Aldrich）、続いて適切な洗浄を行い、二次抗体、この場合は抗マウス−ＨＲＰを使用した（１時間、５０００倍、Sigma-Aldrich）。化学発光検出を、ＥＣＬウエスタンブロット基質（Pierce）を用いて行った。ドキュメンテーションシステムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（GE Healthcare Australia Pty Ltd，Rydalmere，NSW，Australia）を用いて画像を得た。

３’ＵＴＲ領域に対する候補ｍｉＲＮＡの活性の検証試験（デュアルルシフェラーゼキット）
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Sigma-Aldrich）を添加した、１０００ｍｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ培養培地（Sigma-Aldrich）中、３７℃で培養した。細胞を２４ウェルプレートにおいて０．５ｍｌ容量の培地に４×１０⁵細胞／ウェルの密度で播種した。１６時間後に細胞が８０％コンフルエントな状態で、ｐＣＭＶ−ＭＩＲベクター（OriGene）の対応する誘導体から発現される上述のマイクロＲＮＡを、遺伝子ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方の３’ＵＴＲ領域を有するｐＥＺＸ−ＭＴ０５ベクター（GeneCopoeia）と共に、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ試薬（Roche）を用い、ＨｅＬａ細胞での使用についての製造業者の説明書に従ってコトランスフェクトした。いずれの場合にもｐＥＺＸ−ＭＴ０５ベクターに挿入される、対応するフラグメントの３’ＵＴＲに対応する部分の配列を、配列番号５１（ＭＢＮＬ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域：製品番号ＨｍｉＴ０１１０８４−ＭＴ０５）及び配列番号５４（ＭＢＮＬ２遺伝子の３’ＵＴＲ領域：製品番号ＨｍｉＴ０００１９２−ＭＴ０５）に示す。

最初の活性研究に陽性であった全てのｍｉＲＮＡについて、以下の３つのタイプの構築物を試験した：先に試験したＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲを有する野生型構築物（ＷＴ）、並びに２つの新たな構築物：３’ＵＴＲへのマイクロＲＮＡの結合を妨げるためにマイクロＲＮＡの予測標的中に欠失（通常は６ヌクレオチド、７ヌクレオチド又は８ヌクレオチドのシード領域に相補的な配列の欠失）を有するように設計された突然変異構築物（ＭＵＴ）、及び完全相補標的を有する構築物（ＰＭ）。これら全ての構築物は、GeneCopoeia社により本発明者らの注文に従って合成された。修飾３’ＵＴＲに対応する部分を配列番号５２（ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂとＭＢＮＬ１の３’ＵＴＲとの結合領域に欠失を有する構築物：ＭＵＴ−ｍｉＲ−２３ｂ）、配列番号５３（ＭＢＮＬ１の３’ＵＴＲとのＭｉＲ−２３ｂの結合領域において完全な相補性を有する構築物：ＰＭ−ｍｉＲ−２３ｂ）、配列番号５５（ＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲとのｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂの結合領域に欠失を有する構築物：ＭＵＴ−ｍｉＲ−２３ｂ）、配列番号５６（ＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲとのｍｉＲ−２３ｂの結合領域に完全な相補性を有する構築物：ＰＭ−ｍｉＲ−２３ｂ）、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９（ＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲとのｈｓａ−ｍｉＲ−２１８の第１、第２又は第３の結合領域それぞれに欠失を有する構築物：ＭＵＴ１−ｍｉＲ−２１８、ＭＵＴ２−ｍｉＲ−２１８、ＭＵＴ３−ｍｉＲ−２１８）及び配列番号６０（ＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲとのｈｓａ−ｍｉＲ−２１８の３つの結合領域において完全な相補性を有する構築物：ＰＭ−ｍｉＲ−２１８）に示す。

両方の遺伝子に対する３’ＵＴＲを有するこれら全ての構築物（ＷＴ、ＭＵＴ、ＰＭ）において、これは培地に分泌されるガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を発現するレポーター遺伝子の下流に位置する。ルシフェラーゼに対応する配列及び３’ＵＴＲ領域に対応する配列の両方が、哺乳動物細胞の発現プロモーターＳＶ４０下で一緒に転写され、キメラｍＲＮＡを生じる。加えて、このベクター（ｐＥＺＸ−ＭＴ０５）は、構成的発現により同様に培地に分泌される別のレポーターであるアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を有し、これはＣＭＶプロモーターの制御下で発現され、ガウシアルシフェラーゼについて得られる読み取り値の正規化の内部対照となる。

これらの実験の読取りを、プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯマイクロプレートリーダー、Tecan）に入れた白色９６ウェルプレートフォーマットにおいて、Ｓｅｃｒｅｔｅ−Ｐａｉｒ（商標）ガウシアルシフェラーゼデュアル発光アッセイキット（GeneCopoeia）を用い、製造業者の説明書に従って行った。研究した構築物のそれぞれについて、３回の技術的反復試験を３回の独立実験の各々で行った。

関連組織における候補ｍｉＲＮＡの発現
マウス組織（前脳、小脳、海馬、心臓、腓腹筋及び四頭筋）、ヒト筋肉生検組織及びヒト線維芽細胞の培養物に由来する小型ＲＮＡを富化した全ＲＮＡの抽出を、QiagenのＭｉＲＮｅａｓｙキットを用いて行った。１０ｎｇの全ＲＮＡから、ｍｉＲＮＡの画分をExiqonの汎用ｃＤＮＡ合成ＩＩキットを用いて逆転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲのために、ｃＤＮＡの８０倍希釈を行い、そのうち４μｌを１回の技術的反復試験に使用した。ｍｉＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ増幅を、各ｍｉＲＮＡに特異的な市販のプライマー（EXIQON）及びＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴを用いて行った。発現の差異を、２^-ΔΔ^Ct法を用いて算出した。

ａｎｔａｇｏｍｉＲによるトランスフェクションの試験
健常対照線維芽細胞を細胞培養ボトル中の１％Ｐ／Ｓ及び１０％不活性化ウシ胎仔血清を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ ４５００ｍｇ／ｌ、Gibco）において培養し、増殖させた。

本アッセイの細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たり１００００細胞）に１０⁵細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞の播種の約１６時間後に細胞が８０％コンフルエントな状態で、ａｎｔａｇｏｍｉＲ（合成をCreative Biogeneに委託した；ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐのヌクレオチド塩基配列：ＧＧＵＡＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＡＵＧＵＧＡＵ（配列番号２）、及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐのヌクレオチド塩基配列：ＡＣＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号１））によるこれらの細胞のトランスフェクションを、Ｘ−ＴｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ試薬（Roche）を用い、線維芽細胞での使用についての製造業者の説明書に従って行った。製造業者によって推奨されるよりも少量のトランスフェクション試薬（０．５μｌ及び１μｌ）を使用したことから、説明書に僅かに変更を加えた。これは、ａｎｔａｇｏｍｉＲが、細胞膜をより良好に透過することを可能にし、侵入に有利となるコレステロールを構造内に組み込む特別な化学的性質を有するため、それほどトランスフェクション試薬は必要とされず、生存能力が改善するためである。

具体的には、ａｇｏｍｉＲ及びａｎｔａｇｏｍｉＲの合成に関する対応するCreative Biogenのウェブサイト（http://www.creative-biogene.com/Services/MicroRNA-Agomir-Antagomir-Synthesis-Service.html）に反映されるような、本願において使用したａｎｔａｇｏｍｉＲ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ：配列番号１０及びａｎｔａｇｏｍｉＲ２３ｂ−３ｐ：配列番号１１）は、配列番号１及び配列番号２によって表される基本オリゴヌクレオチド配列とは以下の化学修飾を示す点で異なる：５’末端の２つのホスホロチオエート基、３’末端の４つのホスホロチオエート基、３’末端の４つのコレステロール基、及び全ヌクレオチド位置の、すなわちオリゴヌクレオチド配列全体にわたるリボース中の２’−メトキシ修飾。それらの各々の基本オリゴヌクレオチド配列である配列番号１及び配列番号２はそれぞれ、ブロッキングされるｍｉＲＮＡの配列、すなわちｍｉＲ−２３ｂ−３ｐの配列５’−ＡＵＣＡＣＡＵＵＧＣＣＡＧＧＧＡＵＵＡＣＣ−３’（配列番号１２）及びｍｉＲ−２１８−５ｐの配列５’−ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ−３’（配列番号１３）に相補的である。明確にするために、配列を以下のように転写することもできる：
５’−ｍＧ^*ｍＧ^*ｍＵｍＡｍＡｍＵｍＣｍＣｍＣｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵ^*ｍＧ^*ｍＡ^*ｍＵ^*−３’−ｃｈｏｌ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ）
５’−ｍＡ^*ｍＣ^*ｍＡｍＵｍＧｍＧｍＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡ^*ｍＣ^*ｍＡ^*ｍＡ^*−３’−ｃｈｏｌ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ）

トランスフェクション実験を患者に由来する線維芽細胞において行った。特に、これらの試験では、ＭｙｏＤ（筋芽細胞への分化転換を可能にする）のドキシサイクリンによって誘導可能な発現を可能にする構築物であるレンチウイルスベクターを形質導入した、ｈＴＥＲＴの発現によって不死化された細胞である皮膚線維芽細胞を使用した。これらの細胞は、Institute of Myology（http://www.institut-myologie.org/en/）のDenis Furling博士の研究室によるものである。

両方のａｎｔａｇｏｍｉＲを、上記の患者の線維芽細胞に漸増量：１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭを用いてトランスフェクトした。対照としては、トランスフェクション試薬のみを使用し、ａｎｔａｇｏｍｉＲは使用しなかった。トランスフェクション培地を細胞と共に４時間放置し、その後、培地を再びＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞の画像を顕微鏡で、細胞の存在及び形態を観察するために可視光により、また蛍光マーカーＣｙ３（赤色）で標識されるａｎｔａｇｏｍｉＲの分布及び存在を観察するために蛍光により撮影した。

細胞培養毒性試験
健常対照線維芽細胞を細胞培養ボトル中の１％Ｐ／Ｓ及び１０％不活性化ウシ胎仔血清を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ ４５００ｍｇ／ｌ、Gibco）において培養し、増殖させた。これらの細胞の接着増殖（adherent growth）を考慮すると、細胞を継代するためにＰＢＳで洗浄し、３７℃で２分間トリプシン処理した後、トリプシンの作用を阻害するために新鮮培地を添加した。

本アッセイの細胞を９６ウェルプレートに１０⁵細胞／ｍｌの密度で播種した（１ウェル当たり１００００細胞）。プレートに表２に表すテンプレートに従って播種したが、ここで、列の番号は最後の行に見ることができる。１列目の場合には、比色分析のブランクとなるために細胞を播種しない。Ａ行〜Ｄ行（下線の濃度）はｍｉＲＮＡ２３ｂ−３ｐのａｎｔａｇｏｍｉＲに対応し、Ｅ行〜Ｈ行はｍｉＲＮＡ−２１８のａｎｔａｇｏｍｉＲに対応する（太字の濃度）。

両方のａｎｔａｇｏｍｉＲを、患者の線維芽細胞に漸増量：１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ及び１０００ｎＭ（１μＭ）を用いてトランスフェクトし、対照としては、トランスフェクション試薬のみを使用し、ａｎｔａｇｏｍｉＲは使用しなかった。トランスフェクション培地を細胞と共に４時間放置し、その後、培地を分化転換培地に交換した。線維芽細胞を筋芽細胞に分化転換するために、ＭｙｏＤの発現を誘導した。このために、培地全体を１％Ｐ／Ｓ、２％ウマ血清（Gibco）、０．１ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン及び０．０２ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（Sigma）を添加したＤＭＥＭからなる筋肉分化培地（ＭＤＭ）に６０時間置き換えた。

この６０時間後に、１列目を含む全てのプレートウェルの分化転換培地を１００μｌの新たな培地に置き換え、２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標） Ａｑｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイキット）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、比色アッセイをTecanのＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯマイクロプレートリーダーで製造業者の説明書に従って読み取った。リーダーにより得られたデータを処理し、分析して、ＩＣ１０（細胞の１０％阻害濃度）及びＩＣ５０（細胞の５０％阻害濃度）を得た。これにより細胞モデルにおいて毒性とならないように取り扱うべきａｎｔａｇｏｍｉＲの量を知ることが可能となる。

定量ＰＣＲ及びスプライシングアッセイ
ＤＭ１患者及び健常対照に由来する線維芽細胞を、細胞培養ボトルにおいて１％Ｐ／Ｓ及び１０％不活性化ウシ胎仔血清を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（４５００ｍｇ／ｌ ＤＭＥＭ、Gibco）中で培養した。細胞を６０ｍｍペトリ皿に１２５０００細胞／プレートの密度で、１０ｍｌの細胞を各ウェルに入れて播種した。細胞の播種の約１６時間後に細胞が８０％コンフルエントな状態で、細胞に出願人の依頼に応じてCreative Biogeneにより合成されたａｎｔａｇｏｍｉＲ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ）を、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ試薬（Roche）を用い、５μｌのトランスフェクション試薬しか添加しなかったこと以外は、線維芽細胞での使用についての製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした。

両方のａｎｔａｇｏｍｉＲを、患者の線維芽細胞に漸増量：５０ｎＭ、１００ｎＭ及び（y）２００ｎＭを用いてトランスフェクトした。対照としては、健常対照細胞及び患者線維芽細胞のどちらにおいてもトランスフェクション試薬のみを使用し、ａｎｔａｇｏｍｉＲは使用しなかった。トランスフェクション培地を細胞と共に４時間放置し、その後、分化転換培地（１％Ｐ／Ｓ、２％ウマ血清（GIBCO）、０．１ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン、０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン及び０．０２ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（Sigma）を添加したＤＭＥＭ）に交換した。線維芽細胞を、４８時間及び９６時間の２つの時間にわたって筋芽細胞に分化転換した。

ＨｅＬａ細胞及びヒト筋芽細胞からの全ＲＮＡを、ａｎｔａｇｏｍｉＲによるトランスフェクションの４８時間後及び９６時間後にＴｒｉｚｏｌ（Sigma）を用いて抽出した。マウス筋組織からの全ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Quiagen，Valencia，OA）を用い、製造業者の説明書に従って単離した。いずれの場合にも、１マイクログラムのＲＮＡをＤＮアーゼＩ（Invitrogen）で消化し、ランダムヘキサマーを用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Invitrogen）で逆転写した。各ＲＮＡサンプルの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ １０００分光光度計（Thermo Scientific，Waltham，MA）で決定した。

ｑＰＣＲによる転写レベルでのＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現の定量化を、１０ｎｇのｃＤＮＡから市販のＴａｑＭａｎプローブ（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔプローブＰＣＲキット、Qiagen）を用いて行い、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２（ThermoFisherの蛍光マーカーＦＡＭ：フルオレセインで標識した対象の遺伝子）、ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢ（同様にThermoFisherからのＭＡＸ又はＦｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ及びＴＡＭＲＡのそれぞれとして知られるフルオロフォアで標識した内在性遺伝子として）の発現を定量化した。

ＲＴ−ＰＣＲによる転写産物の増幅のために、ＧｏＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）を使用した。このために、先の工程により鋳型として得られたｃＤＮＡを、製造業者の条件に従って使用した。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル中で分離した。研究した各スプライシング事象の分析に使用したプライマー、ＤＭ１患者の筋芽細胞において予想されるパターン、研究したエクソン及び使用した条件を以下の表に示す。

トランスジェニックマウス及びａｎｔａｇｏｍｉＲ投与
マウスの取扱い及び実験手順は、実験動物の世話及び実験法に関する欧州法（２００３／６５／ＣＥ）に準拠し、本施設内審査委員会によって認可された（参照番号Ａ１４５８８３２８００３７０）。ホモ接合体トランスジェニックＨＳＡＬＲ（２０ｂ系統）マウス２５は、C. Thornton教授（University of Rochester Medical Center，Rochester，New York，USA）によって提供され、対応する遺伝的背景（ＦＶＢ）を有するマウスを対照として使用した。合計４匹の性別及び年齢を適合させた（５月齢未満の）マウスに、肩甲骨間部に送達される１００μｌの１倍ＰＢＳ（ビヒクル）又はａｎｔａｇｏｍｉｒの３回の皮下注射（１２時間に１回）を行った。全注射に分割された最終的に投与されるａｎｔａｇｏｍｉｒの総量は、１２．５ｍｇ／ｋｇであった。最初の注射の４日後に、マウスを屠殺し、対象の組織を採取し、各２つのサンプルに分けた。上記セクションのＰＣＲアッセイを含む分子分析のために一方を液体窒素中で凍結し、他方を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、組織学的処理の前に３０％スクロース中で凍結保護した。Ｃｙ３標識ａｎｔａｇｏｍｉｒは、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射で上記のように投与した。

細胞増殖アッセイ
細胞を１０⁵細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに播種し、先に説明したようにａｎｔａｇｏｍｉＲをトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後に、細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標） ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を用い、製造業者の説明書に従って測定した。ＩＣ₁₀及び用量応答阻害曲線を、非線形最小二乗回帰を用いて算出し、吸光度レベルをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯプレートリーダー（Life Sciences）を用いて決定した。

免疫蛍光法
ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２については、免疫蛍光筋芽細胞を４％ＰＦＡにより室温（ＲＴ）で１５分間固定し、続いて１倍ＰＢＳ中で数回洗浄した。次いで、細胞をＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）で透過化処理し、ＲＴで３０分間ブロッキングし（ＰＢＳ−Ｔ、０．５％ＢＳＡ、１％ロバ血清）、一次抗体であるマウス抗ＭＢＮＬ１（２００倍、ａｂ７７０１７、Abcam）又はウサギ抗ＭＢＮＬ２（２００倍、ａｂ１０５３３１、Abcam）と共に４℃で一晩インキュベートした。数回のＰＢＳ−Ｔ洗浄後に、細胞をビオチコンジュゲート二次抗体、及び抗ＭＢＮＬ１を検出するための抗マウスＩｇＧ（２００倍、Sigma-Aldrich）又は抗ＭＢＮＬ２を検出するための抗ウサギＩｇＧ（２００倍、Sigma-Aldrich）と共に１時間インキュベートした。蛍光シグナルをＥｌｉｔｅ ＡＢＣキット（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）によりＲＴで３０分間増幅し、続いてＰＢＳ−Ｔ洗浄を行い、抗ＭＢＮＬ１を検出するためのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（２００倍、Vector）又は抗ＭＢＮＬ２を検出するためのストレプトアビジン−テキサスレッド（２００倍、Vector）と共にＲＴで４５分間のインキュベーションを行った。ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を、核の検出のためにＤＡＰＩを含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）封入剤（Vector）に封入した。

化合物の分布を可視化するためにＣｙ３部分をオリゴヌクレオチドの５’末端に合成的に付着させた。心臓、脳、腓腹筋及び四頭筋を含むマウス組織の凍結切片（１０μｍ）を抗Ｃｙ３抗体（５０倍、Santa Cruz）、続いて二次ヤギビオチンコンジュゲート抗マウス−ＩｇＧ（２００倍、Sigma-Aldrich）を用いて免疫染色した。Ｃｙ３標識したａｎｔａｇｏｍｉｒは筋芽細胞、肝臓及び腎臓組織において蛍光顕微鏡下で直接検出可能であった。筋芽細胞の画像をOlympusのＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１００共焦点顕微鏡で撮影し、Ｃｙ３−ａｎｔａｇｏｍｉｒを含有するヒト筋芽細胞及びマウス組織の画像を、LeicaのＤＭ４０００ Ｂ ＬＥＤ蛍光顕微鏡を用いて得た。全ての場合で画像を倍率４０倍で撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Adobe System Inc.）で処理した。

筋電図検査研究
筋電図検査を、処理前及び屠殺時に全身麻酔下で以前に記載されているように²⁶行った。簡潔に述べると、両後肢の各四頭筋に５回の針挿入を行い、ミオトニー放電（myotonic discharges）を５段階評価で格付けした：０、筋強直なし；１、針挿入の５０％以下で時折のミオトニー放電；２、挿入の５０％超でミオトニー放電；３、ほぼ全ての挿入でミオトニー放電；４、全ての挿入でミオトニー放電。

筋肉組織学
マウス腓腹筋及び四頭筋の筋肉の凍結１５μｍ切片をヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、標準手順に従ってＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）封入剤（Vector）に封入した。画像をLeicaのＤＭ２５００顕微鏡により倍率１００倍で撮影した。中心核を含有する線維のパーセンテージを、各マウスにおいて合計２００本の線維で定量化した。

実施例１． キイロショウジョウバエのＤＭ１モデルにおける概念実証
１．１． ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ショウジョウバエの筋肉におけるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの過剰発現を引き起こす
ＲＮＡのフォーカスにおけるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄによる捕捉及びその後のタンパク質機能の喪失が、ＤＭ１の分子病理の主要誘発因子の１つである。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄを抑制するｍｉＲＮＡを特定するために、本発明者らは候補ｍｉＲＮＡを選択し、次に特異的ｍｉＲＮＡスポンジを用いたそれらの活性の遮断を行った。

初めに、本発明者らのグループによって生成された以前のデータ及びヒトｍｉＲＮＡとのそれらのオルソロジー関係に基づき、ｄｍｅ−ｍｉＲ−９２ａ、ｄｍｅ−ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−ｄｍｅ−１２４を選択した。このデータを得るために、数あるツールの中でも、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Computational Biology Centerで開発されたｍｉＲａｎｄａアルゴリズム（数あるサイトの中でも、microRNA.orgのダウンロードウェブページ：http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doからダウンロード可能な２０１０年バージョン；http://cbio.mskcc.org/microrna_data/manual.htmlで入手可能なマニュアル）を用いた。候補ｍｉＲＮＡの検索を広げるために、Whitehead InstituteによってｍｉＲＮＡ標的の予測のために提供されるオンラインソフトウェアであるＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（www.targetscan.org）を用い、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの３’ＵＴＲ領域中のｍｉＲＮＡ認識部位を探索し、特に２つのｍｉＲＮＡ：ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の部位を特定した。表４に、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの３’ＵＴＲ領域において種々のアルゴリズムに従って予測された幾つかのｍｉＲＮＡの認識部位、並びにMiRBaseのデータベース（www.mirbase.org）におけるヘアピンループを有するそれらの前駆体配列（略称ＭＩで始まるコード）及び成熟ｍｉＲＮＡ（略称ＭＩＭＡＴで始まるコード）の両方のアクセス番号を示す。

ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄを調節するｍｉＲＮＡを検証するために、スポンジ構築物（Fulga et al., 2015）であるＵＡＳ−ｍｉＲ−ＸＳＰの発現を、Ｍｈｃ−Ｇａｌ４系統（遺伝子ミオシン重鎖のプロモーター要素、及びショウジョウバエを含む種々の生物において転写活性化因子として作用することが知られる酵母Ｇａｌ４の転写を活性化するタンパク質に対応する遺伝子Ｇａｌ４のコード領域の略称である）によりショウジョウバエの筋肉に指向させた。この系では、タンパク質ＧＡＬ４がＵＡＳ（上流活性化配列）要素に特異的に結合して遺伝子の転写を活性化することから、ＵＡＳ要素が転写エンハンサーとして作用するが、遺伝子Ｇａｌ４のコード領域が遺伝子Ｍｈｃの内在性プロモーターに操作可能に結合し、ｍｉＲＮＡスポンジの発現を筋肉に指向する。Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ転写レベルを、これまでに知られている全ての転写産物アイソフォームに共通する、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのエクソン２の領域を増幅するための特異的プライマーを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。対照として、ランダム配列を有する系統（ＵＡＳ−ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰ）を用いた。

ｍｉＲ−９２ａＳＰ、ｍｉＲ−１００ＳＰ又はｍｉＲ−１２４ＳＰをＭＨＣ−Ｇａｌ４の制御下で発現するハエにおいてｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現レベルの有意な増大は検出されなかった。対照的に、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ転写産物のレベルは、ｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰを筋肉に発現するハエにおいて、Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰの対照と比較して有意に増大した（図１ａ）。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ ＲＮＡのレベルは、遮断されるｍｉＲＮＡがｄｍｅ−ｍｉＲ−２２７である場合に１４倍高く、ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは６倍の増大を生じた。したがって、これらの結果から、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングがＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの過剰発現を引き起こすことが示される。

１．２． ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４は、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの種々のアイソフォームを調節する
キイロショウジョウバエのｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ遺伝子は、１１０ｋｂ超をカバーし、選択的スプライシングにより幾つかの異なる転写産物を生じる大きな遺伝子である（Begeman et al., 1997、Irion et al., 2012）。実験的証拠から、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームが機能的に冗長でないことが示唆される（Vicente et al., 2007）。どのｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームがｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４によって調節されるかを決定するために、ｍｉＲａｎｄａアルゴリズム（Enright et al., 2003）を用いて、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームの３’ＵＴＲ領域におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の認識部位を特定した（表４）。ＭｉＲａｎｄａが、上述の参照においてBegemann et al. 1997によって用いられる分類に従ってｍｂｌＡ、ｍｂｌＢ、ｍｂｌＣ及びｍｂｌＤの転写産物における探索を行い、近年特定されたアイソフォームであるｍｂｌＨ、ｍｂｌＨ’、ｍｂｌＪ及びｍｂｌＫ（Irion et al., 2012）を含まないことに留意することが重要である。

ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７の潜在的認識部位がアイソフォームｍｂｌＡにおいて、またｍｂｌＢ及びｍｂｌＤにおいて２つ見出された。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ｍｂｌＢレベルがｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７を遮断した／枯渇させた場合に有意に増大することが決定された。ｍｂｌＤの発現レベルは、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ｍｉＲ−２７７ＳＰにおいて低下し、ｍｂｌＡに関しては、Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現する対照ハエと比較して有意差は検出されなかった（図１ｂ）。不思議なことに、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７に対する認識部位が予測されなかったアイソフォームであるｍｂｌＣの発現レベルは、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ｍｉＲ−２７７ＳＰにおいて有意に低下した。

ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４については、認識部位がｍｂｌＣ及びｍｂｌＤの３’ＵＴＲ領域において見出され、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ｍｉＲ−３０４ＳＰにおいて、これら２つのアイソフォームの有意な上方調節が検出された（図１ｂ）。特に、筋肉におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の遮断／枯渇は、成虫ハエにおいて最も発現されるアイソフォームであるｍｂｌＣのレベルの強い増大を引き起こした（Vicente et al., 2007）。

ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングが各Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのアイソフォームの特異的発現レベルの変化を生じさせることから、これらのｍｉＲＮＡを介したｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ転写産物の直接調節が示唆される。

ｍｉＲＮＡが通例、ｍＲＮＡの安定性又はその翻訳の遮断の点で作用することを考慮して、候補調節ｍｉＲＮＡを検証するためにＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質のレベルを分析することにした。この目的で、抗Ｍｂｌ抗体をタンパク質ＭｂｌＡ、ＭｂｌＢ及びＭｂｌＣの上方調節の検出に使用した。ウエスタンブロット転写分析により、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ｍｉＲ−３０４ＳＰのみでｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質のレベルが増大することが明らかとなった（図１ｃ）。ｑＲＴ−ＰＣＲによる決定と一致して、ウエスタンブロット転写において検出されたバンドは、タンパク質ＭｂｌＣに対応していた。使用した抗体が以前に過剰発現実験においてのみ研究されたものであることに留意されたい（Houseley et al., 2005、Vicente-Crespo et al., 2008）。

ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングの影響を分析するために、間接飛翔筋（ＩＦＭ）の縦断切片を染色し、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの分布を検証した。抗Ｍｂｌシグナルは緑色で検出され、核はＤＡＰＩで青色に対比染色されて現れた。本発明者らのグループは、内在性タンパク質Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄが主に筋肉のサルコメアバンドＺ及びＨに位置することを以前に示した（Llamusi et al., 2013）。これと一致して、これらの切片から得られた共焦点像では、Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰの構築物を発現する対照ハエにおいて、筋肉サルコメアのバンド中でｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質がより検出され、これらの細胞の幾つかの核においては低いシグナルが得られた。興味深いことに、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の機能低下は、タンパク質分布に対して異なる影響を有していた。ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７のサイレンシングが細胞質ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質のシグナル、特にサルコメアバンド中のものを増大した一方で、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ｍｉＲ−３０４ＳＰでは強い核位置が検出された。

組み合わせると、これらの結果から、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７及びｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の阻害活性を遮断することによって、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの内在性アイソフォームを上方調節することができることが示される。

１．３． ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の機能の低下は、ショウジョウバエのＤＭ１モデルにおいてｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現に有利に働く
ショウジョウバエの以前のＤＭ１モデルは、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質を含有する筋細胞中にリボ核内フォーカスを有していた（Garcia-Lopez et al., 2008、Picchio et al., 2013）。ショウジョウバエＤＭ１モデルにおけるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのリプレッサーｍｉＲＮＡサイレンシングの特異的効果を試験するために、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現を、筋肉における発現の特異的決定因子ドライバーとしてのミオシン重鎖プロモーターと共に断続ＣＴＧ ４８０リピート（「ｉ（ＣＴＧ）４８０」）を発現し、スポンジ構築物の同時発現を有するハエ（Ｍｈｃ−Ｇａｌ４ ＵＡＳ−ｉ（ＣＴＧ）４８０ ＵＡＳ−ｍｉＲ−ＸＳＰ）において研究した。

ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｂｌ転写レベルの分析から、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングがＤＭ１モデルハエにおいてｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現の増大を生じることが示された（図２ａ）。Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの正の調節が、ＤＭ１モデルハエにおいてスポンジ構築物のみを発現するハエよりも強いことに留意することが重要である（図１ａと図２ａとの比較）。Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ転写レベルは、対照と比較してｉ（ＣＴＧ）４８０及びｍｉＲ−２７７ＳＰの両方を発現するハエで１９倍高く、ハエＭｈｃ−Ｇａｌ４ ＵＡＳ−ｉ（ＣＴＧ）４８０ ＵＡＳ−ｍｉＲ−３０４ＳＰで７倍高かった。一方、種々のスポンジ構築物の存在下で行ったタンパク質分析（図１ｃ）と一致して、ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ＤＭ１モデルハエにおいてタンパク質ＭｂｌＣのレベルの増大を引き起こした（図２ｂ）。

ＤＭ１モデルハエにおけるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの細胞内局在性へのｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングの影響を研究するために、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質の分布をＩＦＭにおいて免疫検出によって分析した（図２ｃ〜ｆ）。ＤＭ１モデルハエにおけるｍｉＲ−２７７ＳＰの発現（図２ｅ）及びｍｉＲ−３０４ＳＰの発現（図２ｆ）はどちらも、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄをリボ核内フォーカスから放出させ、核及び細胞質の両方でタンパク質のレベルを増大した。ｍｉＲ−２７７ＳＰを発現するモデルハエの場合、リピートを発現しない対照ハエに特徴的な筋肉のサルコメアバンド中のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの分布が完全に回復した。同様に、ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、核及び細胞質中に分散したＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの検出可能な増大をもたらした。したがって、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ＤＭ１モデルハエの筋肉においてＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄレベルを上方調節し、その細胞内分布を回復させる。

１．４． ｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ショウジョウバエのＤＭ１モデルにおいてスプライシング及び全体的な遺伝子発現レベルの変化を回復させる
スプライス異常は、症状に直接関連付けられている唯一の主要なＤＭ１の生化学的指標である。ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングによって引き起こされるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの増加が、ＤＭ１モデルハエにおいてスプライシングの変化を回復させるのに十分であるかを試験するために、特徴的に変化させたスプライシング事象を研究した。

これらの事象は、
本発明者らによって特定され、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄによって調節されることが検証されるＤＭ１モデルハエにおけるＦｈｏｓ遺伝子のエクソン１６’の除外、
Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄによって調節されるスプライシング事象であるＳｅｒｃａ遺伝子のエクソン１３の包含、
であった。

Ｍｂｌについて記載される別の分子機能である全体的な遺伝子発現レベルの調節を併うことも見出された。具体的には、ＤＭ１モデルハエにおける発現の増大が記載されている（Picchio et al., 2013）、遺伝子ＣｙＰ６Ｗ１のエクソン２を、その遺伝子の発現レベルを確認するために増幅させた。

ＤＭ１モデルハエでは、リピートを発現しない対照ハエと比較して、Ｆｈｏｓのエクソン１６’の包含の２倍の増大及びエクソン１３を有するＳｅｒｃａの転写産物の２．４倍の減少、並びにＣｙＰ６Ｗ１の転写産物の３倍の増加が確認された。

これらのハエにおけるｍｉＲ−３０４ＳＰの発現により、Ｆｈｏｓのエクソン１６’及び遺伝子ＣｙＰ６Ｗ１の正常な発現の完全な回復、並びにエクソン１３を含むＳｅｒｃａの転写産物の２０％の顕著な増加が達成された（図２ｇ〜ｉ、ｌ）。筋肉におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、スプライシング調節因子として作用することが以前に示されているアイソフォームである（Vicente et al., 2007）、ｍｂｌＣのレベルの強い増大を引き起こしたことが注目に値する（図２ｂ）。これに対し、細胞質におけるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ発現を回復させ、ｍｂｌＣの発現レベルを低下させたｍｉＲ−２７７ＳＰの発現は、これらのスプライシング事象を変更しなかった。対照として、ＤＭ１モデル成虫ハエでは変化しない（Garcia-Lopez et al., 2008）、Ｔｎｔのエクソン３〜５のスプライシングパターンがスポンジ構築物の発現によっても、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの発現の変化によっても変更されないことが確認された（図２ｊ、図２ｋ）。

これらの結果から、ｍｉＲＮＡスポンジによって得られるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの抑制解除のレベルが、潜在的に顕著な分子回復を誘発するのに十分であることが示される。

１．５． ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ショウジョウバエのＤＭ１モデルにおいて筋萎縮及び運動機能を回復させる
特異的スポンジ構築物の発現によって達成されるＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの増加の機能的関連性を評価するために、その変化がＤＭ１を有する個体を特徴付ける形質の１つである、筋萎縮に対するｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングの影響を研究した。筋萎縮の研究のために、筋肉中にｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰのいずれかを発現する対照ハエにおけるＩＦＭの背腹断面の筋面積を初めに測定した（図３ａ〜ｄ）。ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７の機能の低下は、対照としてのＳｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現するハエと比較してＩＦＭ面積の１５％の減少を誘導した。重要なことには、ｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、このパラメーターには影響を有しなかった。

本発明者らの研究グループは、筋肉中にｉ（ＣＴＧ）４８０を発現するハエにおける筋萎縮の存在について以前に報告している。これらのＤＭ１モデルハエでは、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の特異的組織サイレンシングが、筋面積のパーセンテージを顕著に回復させるのに十分であることが見出された（図３ｅ〜ｈ）。ＣＵＧリピートを発現しない対照ハエと比較して、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現するモデルハエにおけるＩＦＭの平均面積は、４０％まで大幅に減少した。ＣＵＧリピートとｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰのいずれか１つとの同時発現は、これらのハエにおいて筋面積の２０％の増大をもたらした。加えて、飛翔筋の断面についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験（図３ｉ〜ｋ）により、ｍｉＲ−２７７ＳＰ（図３ｊ）及びｍｉＲ−３０４ＳＰ（図３ｋ）の発現が、どのように疾患の典型的な病理組織学的パラメーターである、ハエのＤＭ１モデル（図３ｉ）のリボ核内フォーカスの顕著な減少を生じるかが示され、これはｍｉＲ−３０４ＳＰの発現後にごく僅かであった。これらのデータから、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの異なるアイソフォームの上方調節が、ショウジョウバエにおいて筋萎縮及びリボ核内フォーカスの形成を回復させるのに十分であったことが確認される。

筋面積と運動活性（locomotive activity）との相関を評価するために、種々の遺伝子型のハエの上昇能力及び飛行能力を分析した。筋肉におけるｍｉＲ−２７７ＳＰの発現は、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現する対照ハエと比較して約１０％の平均着地高さの減少をもたらし、これらのハエに見られる筋面積の減少が機能的相関を有することが示された（図４ａ）。しかしながら、表面上昇速度がこれらのハエにおいて変化しないままであったことから（図４ｂ）、筋萎縮はＩＦＭに特異的であるようであった。これに対し、筋肉におけるｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングは、ハエの運動活性に影響を及ぼさなかった（図４ａ、ｂ）。ＤＭ１モデルハエでは、リピートを発現しない対照ハエと比較して、ＣＵＧリピートとｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰ構築物との同時発現が、平均着地高さ及び表面上昇速度の劇的な減少をもたらした（図４ｅ、ｆ）。しかしながら、モデルハエにおけるｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰのいずれか１つの発現は、これら全てのパラメーターの回復を同様のレベルでもたらした（図４ｅ、ｆ）。したがって、これらの結果から、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄを調節するｍｉＲＮＡの特異的サイレンシングが、筋萎縮及びＤＭ１の特徴的な機能的表現型を回復させることができることが示された。

１．６． ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の機能的枯渇は、ＤＭ１モデルハエの生存率を上昇させる
筋肉機能、特に呼吸器系の筋肉機能の低下がＤＭ１の主要な死因である。本発明者らのグループは、筋肉中にｉ（ＣＴＧ）４８０を発現するハエが対照ハエと比較して生存率の低下及び平均生存の低下を有することを以前に報告した（Garcia-Lopez et al., 2008）。ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングがＤＭ１モデルハエの生存率を回復させるかを研究するために、種々の遺伝子型のハエにおける生存曲線の分析を行った。筋肉中にｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するハエの生存曲線がｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現するハエの生存曲線とは異ならず、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４のサイレンシングが生存率を変化させなかったことが示されることに留意することが重要である（図４ｃ、ｄ）。ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＳＰを発現するＤＭ１モデルハエの生存率は、ＣＴＧリピートを発現しない対照ハエと比較して有意に低下した（図４ｇ、ｈ）。モデルハエにおけるｍｉＲ−２７７ＳＰ又はｍｉＲ−３０４ＳＰの発現は、生存率及び平均生存を増大した。Ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７のサイレンシングは平均生存を８日間延長し、６日間の延長がｍｉＲ−３０４ＳＰを発現するＤＭ１モデルハエについて検出された（図４ｇ、ｈ）。したがって、ｄｍｅ−ｍｉＲ−２７７又はｄｍｅ−ｍｉＲ−３０４の機能の低下によって引き起こされるｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄの正の調節は、ＤＭ１モデルハエの生存を改善する。

全体として見ると、これらの結果から、ショウジョウバエにおける特異的ｍｉＲＮＡのサイレンシングが、生存の延長を含む幾つかの分子特性及び生理特性を回復させるのに十分なｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄのレベルの増大を引き起こすことが示される。したがって、これにより、ヒト及び他の哺乳動物におけるＤＭ１の治療の潜在的戦略としてのｍｉＲＮＡによりＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様抑制を遮断するアプローチが支持される。

したがって、本発明者らは次に、ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２のｍｉＲＮＡリプレッサーの特定を行い、中でもＤＭ１症状を呈する組織において発現され、その遮断がＤＭ１の分子特性の回復に効果的であり、疾患の症状を改善するものを探した。

実施例２：ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２のｍｉＲＮＡリプレッサーの特定、検証及び特性決定
２．１． ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２を負に調節するｍｉＲＮＡを特定するためのスクリーニング
初めに、ｍｉＲＮＡ模倣物のライブラリーに基づき初期スクリーニングを、Qiagenの市販のキットであるＳｕｒｅＦＩＮＤトランスクリプトームＰＣＲアレイを用いて、先の方法論のセクションに記載されるように行った。この研究により、対照ＧＡＰＤＨに対して少なくとも４倍の上述の遺伝子の発現の抑制を示す、ＨｅＬａ細胞におけるＭＢＮＬ１の潜在的リプレッサーとしての１８個のｍｉＲＮＡ及びＨｅＬａ細胞におけるＭＢＮＬ２の潜在的リプレッサーとしての９個のマイクロＲＮＡが初めに特定された。これらのｍｉＲＮＡのうち４個が、初めに両方の発現を阻害することが可能であると考えられた。

２．２． 抑制作用の確認
マイクロＲＮＡの数が検証には多かったことから、アッセイを続けるマイクロＲＮＡの数を、所与の遺伝子の転写産物における特異的マイクロＲＮＡの標的の存在に関する情報を与える合計９つの予測プログラムの情報を収集するデータベースｍｉｒＤＩＰ（https://omictools.com/mirdip-tool）及びｍｉＲｅｃｏｒｄｓ（https://omictools.com/mirecords-tool）において収集された、調節が存在することを示唆するバイオインフォマティクス予測数に基づいて選択することで合計６つに限定した。

直接調節により起こり得る変調を確認する、初期結果の確認試験を行うために、両方の遺伝子の潜在的調節因子及びＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２の特異的リプレッサーの両方を含む幾つかのｍｉＲ（ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方の潜在的調節因子としてのＭｉＲ−１４６ｂ及びｍｉＲ−２３ｂ、並びにＭＢＮＬ２の特異的リプレッサーとしてのｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−３７２）を初めに選択した。

以前の結果を、選択されたｍｉＲＮＡの前駆体を発現するｐＣＭＶ−ＭＩＲに由来する発現プラスミド（Origene）を空プラスミドｐＣＭＶ−ＭＩＲ、及び初期スクリーニングにおいてＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２の阻害剤としては特定されていない陰性対照としてのｍｉＲ−７と共に、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることによって幾つかのｍｉＲＮＡについて確認した。次いで、ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２の発現を、方法論のセクションの「検証試験」に関するパートに記載されるようにｍＲＮＡ及びタンパク質の点で定量化した。図５は、ｍｉＲ−１４６ｂ及びｍｉＲ−２３ｂ（初めにＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方の潜在的調節因子として特定された）、並びにｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−３７２（初めにＭＢＮＬ２の特異的リプレッサーとして特定された）について得られた結果を示す。

実際に、ＭＢＮＬ１の場合（図５ａ）及びＭＢＮＬ２の場合（図５ｂ）の両方で、選択されたマイクロＲＮＡが、初めに抑制効果が検出された遺伝子のメッセンジャーに対して抑制効果を発揮することが観察されたが、ｍｉＲ−１４６ｂによって引き起こされる抑制効果はあまり顕著ではなかった。

タンパク質の定量化に関して、ｍｉＲ−２３ｂの場合（図５ｃ）にトランスフェクションの７２時間後にタンパク質ＭＢＮＬ１のレベルで減少が観察され、ＭＢＮＬ２の場合（図５ｄ）は、このタンパク質レベルでの減少は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の両方で生じた。ｍｉＲ−３７２によって引き起こされる減少は、他の２つのマイクロＲＮＡよりもはるかに低かった。

したがって、得られたデータから、ｍｉＲ−２３ｂがタンパク質レベルでＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方を下方調節し、ｍｉＲ−２１８がＭＢＮＬ２を抑制することが確認された。

２．３． ｍｉＲＮＡ標的配列の特定及び潜在的ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の機能的関連性の実証
次いで、ｍｉＲＮＡが結合し、抑制作用を発揮する必要がある特異的配列を特定した。これは、ｂｌｏｃｋｍｉＲ型阻害剤を設計するために、また標的へのｍｉＲＮＡの直接結合を確認し、間接的調節を除外するために必要とされる。

この目的で、スクリーニング後に予め選択されたｍｉＲＮＡの標的のバイオインフォマティクス予測を、ショウジョウバエにおいて行った試験で既に使用したアプリケーションｍｉＲａｎｄａ及びＴａｒｇｅｔＳｃａｎを用いて行った。図６Ａ及び図６Ｆは、それぞれＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲ領域上の上述のプログラムによって予測される結合部位の縮尺通りの概略図を示す。どちらの場合も、選択的スプライシングによって生じる上記遺伝子のアイソフォームは、いずれも対応する転写産物中の予測標的の存在に影響を及ぼさない。

潜在的ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の機能的関連性を実証するために、センサーを使用して、実際に予め選択されたマイクロＲＮＡが両方の遺伝子の３’ＵＴＲ中のそれらの予測標的に結合することを示した。このことは、ｍｉＲＮＡの過剰発現によって生じる最終的な抑制調節が検出されるルシフェラーゼの量の減少として観察されるように、ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲ末端がレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼコード配列に融合した構築物を生成することによって実験的に実証された。具体的には、「３’ＵＴＲ結合試験（デュアルルシフェラーゼキット）」のセクションに記載される方法論を用いた。

同じ方法論のセクションにおいて説明したように、この試験では、３’ＵＴＲへのマイクロＲＮＡの結合がレポーターの翻訳を妨げ、したがって培地に放出されるＧｌｕｃを減少させるため、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のシグナルの低下は、３’ＵＴＲへのマイクロＲＮＡの結合を示す（具体的なGenecopoeiaのウェブサイト、http://www.genecopoeia.com/product/mirna-targets/に提示される図を参照されたい）。

マイクロＲＮＡを発現させるプラスミド及びベクターｐＥＺＸ−ＭＴ０５（ガウシアルシフェラーゼのコード配列の下流に両方の遺伝子ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の３’ＵＴＲ領域を有する）の両方のコトランスフェクションの４８時間後に観察された読み取り値から、ｍｉＲ−１４６ｂ及び陰性対照であるｍｉＲ−７を除く試験した全てのマイクロＲＮＡがレポーターに対して抑制効果を有することが観察され、標的遺伝子の３’ＵＴＲへの配列の特異的結合が推測された（図６Ｂ及び図６Ｅを参照されたい）。

前の実験が完了した時点で、観察された結合が直接的であることが検証され、３’ＵＴＲに対するマイクロＲＮＡの直接調節が示された。この目的で、予測標的配列が欠失によって突然変異した、各候補ｍｉＲＮＡに対する３’ＵＴＲセンサーを有する付加的な構築物のバージョン（ｍｕｔ）、更には３’ＵＴＲ中の上記予測標的が突然変異し、マイクロＲＮＡが完全に最も高い効率で結合する完全な標的である、対応するｍｉＲＮＡの完全相補標的を生じる別のバージョン（ＰＭ）を設計した。上述の方法論のセクションにおいて説明したように、突然変異３’ＵＴＲへの、またＰＭ標的との種々のマイクロＲＮＡの結合は、アルカリホスファターゼＳＥＡＰの内部対照に対して標準化したガウシアルシフェラーゼの相対単位（Ｇｌｕｃ／ＳＥＡＰ）で表した。これらの標的突然変異誘発試験を、ＭＢＮＬ１におけるｍｉＲ−２３ｂ（図６Ｃ）、並びにＭＢＮＬ２におけるｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂ（図６Ｆ及び図６Ｇ）について行った。

ＭＢＮＬ１の場合、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂの直接結合が図６Ｂに示され、ＨｅＬａ細胞にレポーター構築物ＭＢＮＬ１の突然変異バージョン（ｍｕｔ）及びｍｉＲ−２３ｂをトランスフェクトすることにより（図６Ｃ）、上記ｍｉＲＮＡは抑制を停止させ、センサー構築物に空ベクターｐＣＭＶ−ＭＩＲをトランスフェクトした対照において生じるものと同様のルシフェラーゼの増大を有していた。マイクロＲＮＡと共に、ＰＭで認められる完全結合に対する問題の遺伝子の３’ＵＴＲ（ＷＴ：野生型）へのマイクロＲＮＡの結合の有効性の程度を知ることを可能にする、結合標的の完全適合バージョンの構築物（ＰＭ）もトランスフェクトした。これらの試験は、ｂｌｏｃｋｍｉＲの設計において重要な基礎となることから非常に有用である。全ての場合で、天然標的により観察されるよりも大きなルシフェラーゼシグナルの減少が見られた。

ＭＢＮＬ２の場合、ＨｅＬａ細胞に標的の突然変異バージョンを有する構築物（ｍｕｔ）を、種々のマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ（図６Ｆ）及びｍｉＲ−２１８（図６Ｇ）共にトランスフェクトすることで、レポーターの抑制が失われ、センサー構築物に空ベクターｐＣＭＶ−ＭＩＲをトランスフェクトした対照によって生じるのと同様のルシフェラーゼの増大が観察されたことから、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の直接結合が存在することが示された。この場合も、結合標的の完全適合バージョンの構築物（ＰＭ）をマイクロＲＮＡと共にトランスフェクトした。どちらの場合にも、天然標的により観察されるよりも大きなルシフェラーゼシグナルの減少が見られた。

２．４． 関連組織における候補ｍｉＲＮＡの発現
抑制能力を検証することに加えて、作用を受けるｍｉＲＮＡが疾患に関係がある組織（中でも心臓、筋肉及び脳）において発現され、それに対する作用がこれらの組織と関連する疾患の症状に対して緩和効果を有し得るかを確認することが重要である。したがって、このことは、リプレッサーが特定されるが、関連組織において発現されない場合、その遮断が効果を有しないことから重要である。

次に、方法論のセクション「関連組織における候補ｍｉＲＮＡの発現」に記載されるように、健常個体及びＤＭ１患者に由来するヒト筋肉生検組織、同様に健常個体又はＤＭ１患者に由来するヒト線維芽細胞の培養物、並びにマウス組織（前脳、小脳、海馬、心臓、腓腹筋及び四頭筋）における候補ｍｉＲＮＡの発現の確認を行った。

マウスにおいて得られた結果（図７Ａ）は、公開データベース又は独自のデータのいずれかによる本発明者らが利用可能な以前の発現データと一致し、或る特定のｍｉＲＮＡが疾患に関係がある組織（心臓、筋肉、脳）において発現されることが示された。ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８を用いて得られた結果は、特に全ての組織における相対発現がｍｉＲ−１４６ｂよりも、また特に発現が検出されなかったマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−３７２に対してはるかに高かったｍｉＲ−２３ｂについて特に関連性がある。

したがって、ヒト個体に由来する筋肉生検組織において得られた結果（図７Ｃ）は、ｍｉＲ−２１８の発現の有意な増大及び明白な傾向を示し、ＤＭ１患者のサンプルにおけるｍｉＲ−２３ｂについて行った実験のデータでは有意ではないが、ｍｉＲ−１４６について観察されるよりもはるかに高かった。ヒト線維芽細胞を用いて行った試験（図７Ｂ）であっても、ｍｉＲ−２１８の相対発現は、ＤＭ１患者に由来する線維芽細胞の場合に、疾患による影響を受けない対照個体の線維芽細胞と比較してはるかに高い。

実施例３． ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂのａｎｔａｇｏｍｉＲのトランスフェクションの影響
ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現のリプレッサー能を確認するための試験の結果、ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２のｍＲＮＡに対する直接作用を確認するための試験の結果、並びに種々の組織における発現のデータを考え合わせることで、病理に関与する組織において最も大きな発現を有する２つのマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８の遮断剤又は阻害剤の設計に集中することにした。

先で説明したように、ｍｉＲＮＡへの結合をより安定させ、分解の影響を受けにくくし、細胞膜を透過する能力を増大する特定の化学的性質を有するＲＮＡに類似していることから、ＡｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド阻害剤を選択した（この場合のように、コレステロールを含むのが一般的である）。

以下の試験を行った具体的なａｎｔａｇｏｍｉＲの供給業者は、http://www.creative-biogene.com/Services/MicroRNA-Agomir-Antagomir-Synthesis-Service.htmlであった。先に記載するように、本明細書において言及されるａｎｔａｇｏｍｉＲは、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ：配列番号１０）及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ：配列番号１１）と略され、基本配列である配列番号１及び配列番号２（それぞれ、ヒトマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２１８−５ｐ及びｍｉＲ−２３ｂ−５ｐに相補的）とは配列表及び方法論のセクション「ＡｎｔａｇｏｍｉＲによるトランスフェクションの試験」中の詳細な変更点で異なる。

３．１． ＡｎｔａｇｏｍｉＲトランスフェクション試験
上記セクションに記載されるように、初めにフルオロフォアＣｙ３（赤色シグナルを発する）で標識した漸増濃度（１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）の各ａｎｔａｇｏｍｉＲ、及び２つの異なる濃度のトランスフェクション試薬ＸｔｒｅｍＧｅｎｅ（０．５μｌ及び１μｌ）によるＤＭ１患者に由来する線維芽細胞のトランスフェクションについての試験を行った。

この線維芽細胞トランスフェクション試験実験は、ａｎｔａｇｏｍｉＲを細胞内で検出可能な閾値濃度、及び使用するトランスフェクション試薬の量（この試薬がヒト線維芽細胞に対して強い毒性があることから、可能な限り最小の量を用いることを試みる）を決定するために行った。

構造中のＣｙ３の存在のために、ａｎｔａｇｏｍｉＲが細胞に入ると、蛍光顕微鏡下で赤く見え、ａｎｔａｇｏｍｉＲの存在が示される。

１０ｎＭ濃度では赤色シグナルが殆ど検出されず、細胞中のａｎｔａｇｏｍｉＲのわずかな存在が示されたため、シグナルを強くするために５０ｎＭ以上の濃度が必要であった。このため、ａｎｔａｇｏｍｉＲを用いて行われた後続の試験ではこれらの濃度が使用された。

３．２． 毒性試験
最初の概算は、化合物を細胞モデルにおいて扱う場合に、ＩＣ１０よりも低い濃度で扱うことが望ましいことから、ａｎｔａｇｏｍｉＲが細胞内で扱うには毒性となり始めるａｎｔａｇｏｍｉＲ濃度の閾値を確立するため用量応答細胞毒性試験を行うことであった。

両方のａｎｔａｇｏｍｉＲの毒性プロファイルを、「細胞培養毒性試験」のセクションに記載されるように、培地への添加の６０時間後に健常ヒト筋芽細胞において得た（図８ａ）。比色アッセイを行うことにより、漸増濃度のａｎｔａｇｏｍｉＲの添加による細胞増殖及び生存能力の迅速かつ高感度の定量化が可能となった。得られたデータにより、ＩＣ１０（細胞の１０％が化合物と関連する毒性のために死滅する濃度を示す）及びＩＣ５０（細胞の５０％が毒性のために死滅する濃度である）を算出した。得られた値は以下のとおりである。

正のＺ値が、毒性試験が正確に行われていることを示すことから、Ｚ値の値も算出した。この場合、Ｚ値は０．４６であった。

研究を行った後に、３つの濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ及び２００ｎＭ）で継続することにしたが、これらがＩＣ１０未満であり、すなわち毒性閾値をはるかに下回る濃度であることから、これらの濃度を用いて後続の試験を行った。

３．３． ＤＭ１患者の細胞におけるａｎｔａｇｏｍｉＲの用量応答試験
上述の濃度を用いて、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３又はａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８によるＤＭ１患者の筋芽細胞に分化転換した線維芽細胞のトランスフェクションについての試験を、「スプライシング試験」についての方法論のセクションに記載されるように行い、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２のＲＮＡの定量化アッセイを開始した。図９に見られるように、ａｎｔａｇｏｍｉＲ ｍｉｒ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ ｍｉｒ−２１８の両方が、ｑＰＣＲによるＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現をｍＲＮＡレベルで増大させ、この増大は、ａｎｔａｇｏｍｉＲの用量（トランスフェクションによる）に対応する。これは４８時間及び９６時間の時点で行った。典型的な釣鐘型の用量応答を仮定すると、得られる結果から、ａｎｔａｇｏｍｉＲ ｍｉｒ−２３ｂの最適濃度が５０ｎＭ以下であり、ａｎｔａｇｏｍｉＲ ｍｉｒ−２１８については２００ｎＭ以上であることが示唆される。

ＤＭ１において通例変化する選択的スプライシングの幾つかの事象を、患者の筋芽細胞においてａｎｔａｇｏｍｉＲ２３ｂ又はａｎｔａｇｏｍｉＲ２１８の存在下で回復させることが可能であるかについても、「スプライシングアッセイ」のセクションに記載される方法論に従って検証した。これらの実験を、ＡｎｔａｇｏｍｉＲのトランスフェクションの４８時間後（図１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）及び９６時間後（図１０Ｂ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）に行った。

これらの図面において認められるように、ａｎｔａｇｏｍｉＲによるＤＭ１細胞の処理は、両方のａｎｔａｇｏｍｉＲについて、全ての濃度及び両方のトランスフェクション後の時点でＢＩＮ１のエクソン１１の包含を改善した。

ａｎｔａｇｏｍｉＲでの処理は、４８時間の時点で行ったアッセイにおいて、ゲルにおいて反映されるように（上のバンド）、両方のａｎｔａｇｏｍｉＲについて全ての濃度でＤＭＤのエクソン７９の包含のパーセンテージを増大する。対照的に、９６時間の時点で行った試験では、ＤＭＤの異常スプライシングの変化は観察されなかった。

４８時間の時点で行ったアッセイでは、いずれの濃度のａｎｔａｇｏｍｉＲによってもＳＥＲＣＡ１の異常スプライシングの変化は観察されなかったが、９６時間の時点でのアッセイでは、両方のａｎｔａｇｏｍｉＲによる全ての濃度での処理が、ＳＥＲＣＡ１のエクソン２２の包含のパーセンテージの増大をもたらす。この増大は、特にａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂでより明白であった。

トランスフェクションの４８時間後のアッセイは、ＩＲの異常スプライシングにいかなる変化も生じなかった。ＩＲのエクソン１１の包含は、健常筋芽細胞の場合に見られるものと同様に、９６時間の時点ではより低濃度のａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ（５０ｎＭ）及び最高濃度のａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８（２００ｎＭ）でのみ改善された。

ｃＴＮＴの異常スプライシングの変化は、いずれの濃度のａｎｔａｇｏｍｉＲでも観察されなかった。ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８の特異性を試験するために、ＣＡＰＺＢのエクソン８の包含（ＣＥＬＦ１に依存する）を定量化した。これがａｎｔａｇｏｍｉＲによって回復しないことが観察された。付加的に、ＭＢＮＬ１及びＣＥＬＦ１に依存しないことが知られるＤＬＧ１のエクソン１９の包含の調節は、いずれの実験条件下でも変化せず、ａｎｔａｇｏｍｉＲ処理時の選択的スプライシング制御に対する全体的効果が棄却された（図１１Ａ及びＢを参照されたい）。これらの結果から、ａｎｔａｇｏｍｉＲによって媒介されるＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２抑制解除の結果としてＤＭ１筋芽細胞において生じる選択的スプライシングの欠陥のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ特異的な回復が確認される。

３．４． ＡｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８はＭＢＮＬタンパク質を上方調節し、ＤＭ１筋芽細胞におけるそれらの正常細胞内分布に戻す
ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの安定性及び翻訳レベルで遺伝子発現を調節することができるため、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２のタンパク質発現に対するａｎｔａｇｏｍｉＲの影響を決定しようとした。ａｎｔａｇｏｍｉＲ処理により、トランスフェクションの４８時間後（図１２Ａ）又は９６時間後（図１２Ｂ）にｑＰＣＲデータからＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２ ｍＲＮＡのレベルの有意な増大が確認された。タンパク質レベルでは、これらの差異が更に拡大し、ａｎｔａｇｏｍｉＲ処理の９６時間後（図１３ａ、ｂ、ｄ、ｅ）及び４８時間後にＤＭ１筋芽細胞においてウエスタンブロットにより４倍〜５倍多いＭＢＮＬ１及び３倍〜５倍多いＭＢＮＬ２タンパク質が検出された。対照的に、ＣＥＬＦ１タンパク質レベルは、ｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８サイレンシングの際に９６時間後（図１３ｃ、ｆ）及び４８時間後の両方で変化しないままであり、ＣＡＰＺＢ選択的スプライシングでは一貫して同じままであった。重要なことには、この増大が免疫蛍光により明らかに認められた。ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方がＤＭ１筋芽細胞のリボ核内フォーカスに捕捉された一方で（図４ｈ、ｌ）、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８は、タンパク質発現を確実に増大し、細胞質及び細胞核におけるそれらの分布を元に戻した（図１３ｉ、ｊ；ｍ、ｎ）。細胞核におけるＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２タンパク質の増加は、先に示したスプライシングの回復と一致していた。

実施例４． マウスＤＭ１モデルにおけるｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−２３ｂのａｎｔａｇｏｍｉＲの活性
４．１． ＡｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びＡｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８は、ＨＳＡ^LRモデルマウスにおいて骨格筋に到達し、Ｍｂｎｌタンパク質発現を増大する
次に、ＨＳＡ^LRマウスＤＭ１モデルにおけるａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８の活性を調査した（Mankodi et at., 2000）。初めに、本発明者らは、骨格筋に到達するａｎｔａｇｏｍｉＲの能力を評価した。ａｎｔａｇｏｍｉＲのＣｙ３標識バージョンを、４月齢ＨＳＡ^LRマウスに単回皮下注射によって投与した。注射の４日後に、標識オリゴヌクレオチドを検出するために後肢の腓腹筋及び四頭筋の６つの筋肉を処理した。ａｎｔａｇｏｍｉＲは、抗Ｃｙ３免疫蛍光により両方の種類の筋線維の核内に強い点状パターンで観察された。ａｎｔａｇｏｍｉＲは、細胞全体にも散在していた（図５ｂ〜ｅ）。これらのデータから、ｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８を遮断するａｎｔａｇｏｍｉＲオリゴヌクレオチドがＤＭ１マウスモデルの骨格筋に到達し得ることが実証される。

本発明者らは、同じ投与方法を用いて、非標識ａｎｔａｇｏｍｉＲを４匹の更なる群ＤＭ１動物に１２．５ｍｇ／ｋｇの最終用量までの連続注射（１２時間間隔）で注射することにした。対照には１倍ＰＢＳを注射した。初回注射の４日後に動物を屠殺し、組織学的分析及び分子的分析のために四頭筋及び腓腹筋を得た。ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２１８がそれらの相補的なａｎｔａｇｏｍｉＲによって強くサイレンシングされることが確認された。ｍｉＲ−２３ｂは非処理ＨＳＡ^LRマウスにおいて測定されるレベルの２０％、ｍｉＲ−２１８は５０％まで減少した（図１４ｆ、ｇ）。ｍｉＲＮＡの減少の結果として、Ｍｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２が両方の筋肉型において転写産物及びタンパク質レベルで増加した（図１４ｈ、ｉ；ｊ、ｍ；ｋ、ｎ）。それにもかかわらず、四頭筋では、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂは、Ｍｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２の両方のタンパク質レベルの重要な増大を達成し、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８は、Ｍｂｎｌ２のみを有意に上方調節した。重要なことには、Ｃｅｌｆ１タンパク質のレベルは、いずれの処理によっても変化しなかった（図１４ｌ、ｏ）。

４．２． ｍｉＲ−２３ｂ又はｍｉＲ−２１８活性の遮断は、マウスにおいてＭｂｎｌ発現を増強し、筋肉転写産物のスプライシング異常を回復させる
処理した腓腹筋及び四頭筋の筋肉におけるＭｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２の大幅な増加を考慮して、本発明者らは、ＨＳＡ^LRマウスにおけるＭｂｎｌ依存性スプライシング事象Ａｔｐ２ａ１、Ｃｌｃｎ１及びＮｆｉｘの回復を確認しようとした（図１５ａ、ｂ）。ＡｎｔａｇｏｍｉＲ投与は、ＨＳＡ^LRマウスの四頭筋ではなく腓腹筋においてＡｔｐ２ａ１（エクソン２２）及びＮｆｉｘ（エクソン７）の異常エクソン選択を改善し、Ｃｌｃｎ１エクソン７ａ ＰＳＩを増大した。ＨＳＡ^LRマウスの導入遺伝子発現の日常試験において、ＣＵＧ発現レベルが動物間で最大０．５倍変動し、その変動が腓腹筋及び四頭筋における選択的エクソンの異常な包含と正に相関することが発見された（図１６）。留意すべきは、Ａｔｐ２ａ１エクソン２２包含が二峰性であった。低レベルの導入遺伝子を発現する２匹のマウスが、エクソン２２を残りのＨＳＡＬＲマウスよりも有意に高い（正常に近い）レベルまで包含したため、分析から除外した（図１６及び図１７）。これらのデータから、筋肉におけるＣＵＧリピートＲＮＡの発現が低い程、スプライシング異常が少ないことが示唆される。対照的に、ａｎｔａｇｏｍｉＲで処理したＨＳＡ^LR筋肉サンプルでは、スプライシング欠損は、リピート発現ではなくＭｂｎｌ ｍＲＮＡレベルと相関し、スプライシング事象の回復におけるこれらのタンパク質７の因果的役割が支持される（図１６）。モデルの固有の変動性に関わらず、両方のａｎｔａｇｏｍｉＲが全ての腓腹筋スプライシング異常事象において同様のレベルの回復を達成したと結論付けられる。しかしながら、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂは、四頭筋においてＮｆｉｘ及びＣｌｃｎ１スプライシングをａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８よりも大きく回復させ、これは、この筋肉においてａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８によって達成されるＭｂｎｌ１及びＭｂｎｌ２のタンパク質レベルのより低い上方調節と相関していた。処理ＨＳＡ^LRマウスの筋肉において変化しないＣｅｌｆ１タンパク質のレベルと一致して、処理マウス及び対照マウスの腓腹筋及び四頭筋におけるＣａｐｚｂエクソン８包含は非常によく似ていた（図１５ａ、ｂ）。これらの結果から、ａｎｔａｇｏｍｉＲの全身送達がＤＭ１マウスモデルにおいて筋肉スプライシング異常をｉｎ ｖｉｖｏで回復させることが可能であることが示される。

４．３． ＡｎｔａｇｏｍｉＲは筋肉組織病理を改善し、筋強直グレードを低減する
胎児から成体への選択的スプライシングパターンの移行の欠陥は、ＤＭ１筋肉表現型４４によって生じることが提唱されている。ＨＳＡ^LR ＤＭ１モデルマウスでは、イオン電流の変化が、筋電図検査によって定量化することができる反復活動電位、すなわち筋強直を引き起こす。処理前に、全てのＤＭ１マウスがグレード３又は４の筋強直、すなわち電極挿入の大半で多くの反復放電を有していた。４日後に、ａｎｔａｇｏｍｉＲは、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８で処理したマウスの７５％及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂで処理したマウスの５０％のそれぞれで、筋強直をグレード２（挿入の５０％超でミオトニー放電）又はグレード１（時折のミオトニー放電）まで低減した（図１５ｃ）。ＤＭ１及びＨＳＡ^LRマウス筋線維の典型的な組織学的特徴は、再生しようとしているミオパシー性（myopathic）筋肉に起因する中央の核の位置である。両方のａｎｔａｇｏｍｉＲが、腓腹筋及び四頭筋の両方の筋肉において核の分散化を引き起こした（図１５ｄ〜ｈ）。まとめると、これらの結果から、哺乳動物においてＣＵＧリピートＲＮＡによって誘導されるミオパシーを抑制する薬物としてのａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ及びａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８の可能性が検証される。

実施例５． ＡｎｔｉｍｉＲ及びＢｌｏｃｋｍｉＲを用いて行われるアッセイ
他のタイプのアンタゴニストへのアプローチの適用性を検証するために、以下のａｎｔｉｍｉＲ及びｂｌｏｃｋｍｉＲがMiRx Therapeutics（Lyngby，Denmark）によって合成された：
ＭｂｌｏＣＫｎｏＭＩＲ ＴｂｓＧｂｓｃｓａｓｃｓｃｓｕｓｕｓｕｓｇｓＴｂｓＴｂｓＡｂｓＴｂｓＴｂｓＴｂ（配列番号８４）
Ｍ１ｂｌｏＣＫ２３−１ ＣｂｓＣｂｓＡｂｓＴｂｓＴｂｓＡｂｓｕｓｃｓａｓｃｓａｓｕｓｕｓｕｓＴｂｓＧｂ（配列番号８５）
Ｍ２ｂｌｏＣＫ２３−１ ＡｂｓｕｓｃｓａｓｃｓａｓｕｓｇｓａｓＴｂｓＴｂｓＣｂｓＡｂｓＡｂｓＣｂｓＧｂ（配列番号８６）
Ｍ１ｂｌｏＣＫ２１８−１ ＧｂｓＡｂｓｕｓｇｓｕｓｇｓｃｓｕｓｕｓｕｓＡｂｓＡｂｓＡｂｓＴｂｓＡｂｓＴｂ（配列番号８７）
Ｍ１ｂｌｏＣＫ２１８−２ ＧｂｓｕｓｕｓｇｓｕｓｇｓｃｓｕｓｇｓＴｂｓＣｂｓＴｂｓＡｂｓＴｂｓＴｂｓＧｂ（配列番号８８）
Ｍ２ｂｌｏＣＫ２１８−１ ＡｂｓＣｂｓＴｂｓｕｓｇｓｕｓｇｓｃｓｕｓｕｓＧｂｓＡｂｓＡｂｓｕｓＴｂｓＴｂ（配列番号８９）
Ｍ２ｂｌｏＣＫ２１８−２ ＧｂｓＴｂｓＴｂｓＧｂｓｕｓｇｓｕｓｇｓｃｓｕｓａｓａｓＴｂｓＡｂｓＡｂｓＴｂ（配列番号９０）
Ｍ２ｂｌｏＣＫ２１８−３ ＣｂｓＧｂｓＡｂｓＴｂｓＡｂｓｇｓｕｓｇｓｃｓｕｓｕｓＡｂｓＡｂｓＡｂｓＡｂ（配列番号９１）
ＡｎｔｉｍｉＲ−２３ｂ ＣｂｓｃｓｃｓｕｓｇｓｇｓＣｂｓａｓＡｂｓｕｓｇｓｕｓＧｂｓａｓＴｂ（配列番号９２）
ＡｎｔｉｍｉＲ−２１８ ＴｂｓｕｓａｓＧｂｓａｓｕｓｃｓＡｂｓａｓｇｓＧｂｓａｓＣｂｓａｓＡｂ（配列番号９３）
ＡｎｔｉｍｉＲ−ＳＣ ＧｂｓＣｂｓＡｂｓＴｂｓＡｂｓＡｂｓｕｓｇｓａｓｃｓｕｓｕｓｕｓａｓＴｂｓＧｂ（配列番号９４）
ここで、
ＬＮＡヌクレオチドは、大文字及び小文字の組合せ：Ａｂ、Ｇｂ、Ｔｂ、Ｃｂによって示される。
ホスホロチオエート結合は、小文字「ｓ」によって示される
２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドは、小文字：ａ ｇ ｃ ｕによって表される。

毒性及びトランスフェクションのアッセイのために、ｂｌｏｃｋｍｉＲ又はａｎｔｉｍｉＲを、ａｎｔａｇｏｍｉＲについて従った同じプロトコルに従って培養培地に添加した。ＲＮＡを同様にａｎｔａｇｏｍｉＲについて用いた同じ方法で処理して採取した。

５．１． ＡｎｔｉｍｉＲを用いたアッセイ
図１８Ａに見られるように、ａｎｔｉｍｉＲは、ＤＭ１線維芽細胞においてａｎｔａｇｏｍｉＲよりも低毒性であるようであり、更なるアッセイで濃度を増大することが可能である。トランスフェクション反応自体が２０％の細胞を死滅させたことを指摘することが重要である。

図１８Ｂ及び図１８Ｃに見られるように、先の実施例に用いたａｎｔａｇｏｍｉＲも含まれる比較アッセイでは、アッセイ濃度（Ｘ軸の下の表示を参照されたい）のａｎｔａｇｏｍｉＲは、ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２発現を増大するようにａｎｔｉｍｉＲよりも良好に働くようであった。注目すべきは、最高濃度（２００ｎＭ）の対照（ＣＮＴ：ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡ）がＭＢＮＬ２発現を改善した。

５．２． ｂｌｏｃｋｍｉＲを用いたアッセイ
トランスフェクション反応としてｂｌｏｃｋｍｉＲを用いて行われた毒性アッセイにより、ｂｌｏｃｋｍｉＲの比較的低い毒性が示され、同様に更なるアッセイで濃度を増大することが可能である（図１９Ａを参照されたい）。

図１９Ｂ及び図１９Ｃに見られるように、先の実施例に用いたａｎｔａｇｏｍｉＲも含まれる比較アッセイでは、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現の有意な増大が、ｍｉＲ−２３ｂについて、その標的を遮断した場合（Ｍ１ｂｌｏＣＫ２３−１及びＭ２ｂｌｏＣＫ２３−１、それぞれ）に見られた。しかしながら、それらのそれぞれの標的を遮断した場合（Ｍ１ｂｌｏＣＫ２１８−１及びＭ１ｂｌｏＣＫ２１８−２、又はＭ２ｂｌｏＣＫ２１８−１、Ｍ２ｂｌｏＣＫ２１８−２及びＭ２ｂｌｏＣＫ２１８−３）に、ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２の有意な増加を観察することは可能でなかった。驚くべきことに、ＭＢＮＬ１の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−２１８標的の遮断（Ｍ１ｂｌｏＣＫ２１８−２）は、ＭＢＮＬ２発現の有意な増大をもたらす。不思議なことに、最高濃度（２００ｎＭ）の対照（ＭｂｌｃｋｎｏＭＩＲ）がＭＢＮＬ２発現を改善した。

実施例６． ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行われるアッセイ
AUM Biotech LLC（Philadelphia，PA，United States）によって合成され、提供された以下のＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いたアッセイを行った：
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−１ ＧＧＵＡＡＵＣＣＣＴＧＧＣＡＡＵＧＵＧＡＵ（配列番号９５）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−２： ＧＧＵＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＵ（配列番号９６）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−３ ＧＧＵＡＡＵＣＣＣＵＧＧＣＡＡＵＧＵＧＡＵ（配列番号９７）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−４ ＧＧＵＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＵ（配列番号９８）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２１８−１ ＡＣＡＵＧＧＵＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号９９）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２１８−２ ＡＣＡＴＧＧＵＵＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号１００）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２１８−３ ＡＣＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号１０１）
ＡＵＭ−ｍｉＲ−２１８−４ ＡＣＡＴＧＧＵＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号１０２）
ＡＵＭ−ＳＣ−１ ＡＵＡＵＣＣＵＴＧＴＣＧＴＡＵＣＣＣＡＧＵ（配列番号１０３）
ＡＵＭ−ＳＣ−２ ＡＵＡＵＣＣＵＴＧＴＣＧＴＡＵＣＣＣＡＧＵ（配列番号１０４）

全てのオリゴヌクレオチドが末端に２’Ｆ−アラビノヌクレオチド、配列に沿ってホスホロチオエート結合を含有する。

毒性及びトランスフェクションのアッセイについては、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドをより高濃度：２５０ｎＭ及び１μＭで添加したジムノティック送達（図２０Ａ）の場合を除いて、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドをａｎｔａｇｏｍｉＲについて従った同じプロトコルに従って培養培地に添加した（また、ＲＮＡを同様にａｎｔａｇｏｍｉＲについて用いた同じ方法で処理して採取した）。ジムノティック送達については、オリゴヌクレオチドが単独で細胞に入ることが可能であることから、トランスフェクションのためにＸ−ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥを添加せず、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを細胞培養培地に直接添加した。ジムノティック送達におけるｑＲＴ−ＰＣＲアッセイについては、線維芽細胞を、ＦＡＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを添加した３ｍｌのＭＤＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコース、１％Ｐ／Ｓ、２％ウマ血清、１％アポトランスフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）及び０．０２％ドキシサイクリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ）の入ったペトリ皿に６時間プレーティングした（１×１０⁶細胞／ウェル）。その後、７ｍｌのＭＤＭ培地を添加し、サンプルを９６時間インキュベートした。

結果は、先の実施例のａｎｔａｇｏｍｉＲを用いた比較アッセイを示す図２０Ａ及びＢ、図２１Ａ及びＢ並びに図２２Ａ及びＢに見ることができる。

ジムノティック送達を用いて行った毒性アッセイ（図２０Ａ）から、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドがＤＭ１筋芽細胞に対してあまり毒性でないことが示された。ａｎｔａｇｏｍｉＲとの比較については、ａｎｔａｇｏｍｉＲを通常の方法でトランスフェクトすることから、毒性値が同等でないことを考慮すべきである。トランスフェクション試薬を用いて毒性をアッセイした場合（図２０Ｂ）、ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドは同じ濃度でａｎｔａｇｏｍｉＲよりも毒性であった。

ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の発現に対する影響のアッセイについても、ジムノティック送達及びトランスフェクション試薬によるトランスフェクションの影響を確認するために種々のアッセイを行った。

「ジムノティック送達」の場合（ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２のそれぞれについて図２１Ａ及び図２２Ａ）、ａｎｔａｇｏｍｉＲをトランスフェクトする一方で、ＦＡＮＡを直接供給し、非処理ＤＭ１細胞に対して比較を行った。２つのＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ ＦＡＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−１及びＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−４）がＭＢＮＬ１レベルを増大し、残りが大きな働きをしないようであったことを観察することができる。ＡＵＭ−２１８ ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドは、本アッセイでは作用しなかった。全体として、ａｎｔａｇｏｍｉＲがより強力であるようであったと言える。同様の結果がＭＢＮＬ２について得られた。２つのＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ ＦＡＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−１及びＡＵＭ−ｍｉＲ−２３ｂ−３）がＭＢＮＬ２レベルを増大し、残りが大きな働きをしないようであり、ＡＵＭ−２１８ ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドは本アッセイでは作用しなかったことを観察することができる。

トランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションをアッセイした場合（図２１Ｂ及び図２２Ｂ）、同じ濃度のＡＵＭ ｍｉＲ−２３ｂ、特にＡＵＭ ｍｉＲ−２３ｂ−１が対応するａｎｔａｇｏｍｉＲよりも僅かに良好にＭＢＮＬ１レベルを増大したようであり、ＡＵＭ ｍｉＲ２３ｂの付加的な設計が活性を示す（ジムノティック送達と比較して）。ＡＵＭ ｍｉＲ−２１８ ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドも活性を示した（図２１Ｂを参照されたい）。ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡで処理した細胞におけるＭＢＮＬ１発現レベルの非特異的増大が検出された。ＭＢＮＬ２について得られた結果は、ＭＢＮＬ１の場合と概ね同じであった（図２２Ｂを参照されたい）。データの品質は、以前のデータセットよりも低かった（おそらくはより少量のＲＮＡのため）。

書誌参照

Claims (8)

1. 筋強直性ジストロフィー１型の治療のための医薬であって、
   ヒト遺伝子ＭＢＮＬ１及び／又はＭＢＮＬ２の発現を下方調節する、ヒトマイクロＲＮＡ−２１８−５ｐ又はヒトマイクロＲＮＡ−２３ｂ−３ｐのアンタゴニストである、オリゴリボヌクレオチド分子、
   ２種以上の該分子の混合物、又は
   該オリゴリボヌクレオチド分子の少なくとも１つのコード配列を含む発現ベクターの少なくとも１つ
   を含む、医薬。
2. 前記オリゴリボヌクレオチド分子が、
   配列番号１０によって表されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２１８−５ｐ）又は配列番号１１によって表されるａｎｔａｇｏｍｉＲ型オリゴリボヌクレオチド類似体（ａｎｔａｇｏｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ）である、請求項１に記載の医薬。
3. 前記オリゴリボヌクレオチド分子が、
   配列番号８４〜配列番号９１からなる群より選択される配列によって表される、請求項１に記載の医薬。
4. 前記オリゴリボヌクレオチド分子が、
   配列番号９２〜配列番号９４からなる群より選択される配列によって表される、請求項１に記載の医薬。
5. 前記オリゴリボヌクレオチド分子が、
   配列番号９５〜配列番号１０４からなる群より選択される配列によって表される、請求項１に記載の医薬。
6. 担体及び／又は１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を付加的に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
7. 前記治療が筋強直性ジストロフィー１型の１つ以上の症状の姑息的治療である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
8. 前記治療が筋強直性ジストロフィー１型の症状の一部である筋障害の１つ以上の姑息的治療である、請求項７に記載の医薬。

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