JP6921805B2 - ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチン - Google Patents

Description

本発明は、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。

乳腺炎は、乳房組織の炎症であり、乳牛で最も頻繁に起こり、費用のかかる疾患である。乳腺炎による財政損失は、この疾患の無症状期と臨床病期の両方に生じる。無症状の乳腺炎に起因する損失は、十分に文書化されている。５０，０００細胞／ｍｌを超える体細胞数（ＳＣＣ）が各々２倍になると、最初の泌乳牛およびそれ以降の乳牛において、それぞれ１日あたり０．４ｋｇおよび０．６ｋｇの乳の損失となる（Ｈｏｒｔｅｔ Ｐ，Ｈ．Ｓｅｅｇｅｒｓ．１９９８．Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｏｓｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ：ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．Ｖｅｔ Ｒｅｓ．２９（６）：４９７−５１０）。臨床的乳腺炎に起因する損失としては、廃棄乳、乳生産量の一時的な減少および早期淘汰が挙げられる。乳腺炎の治療は、可能な限り原因となる細菌を標的とするべきである。

Ｐｙｏｒａｌａ Ｓ ｉｎ Ｉｒｉｓｈ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌｕｍｅ ６２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４０−４４ ２００９は、異なる病原菌による臨床的乳腺炎の抗菌剤治療について以下のように示唆する：

乳牛の乳腺炎の治療用の最近の医薬組成物は、グラム陰性とグラム陽性の両方の乳腺炎原因細菌に対して薬効範囲の広い抗生物質である、ウブロレキシン（Ｕｂｒｏｌｅｘｉｎ）（登録商標）である。ウブロレキシン（登録商標）は、セファレキシンとカナマイシンの組合せであり、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ディスガラクティカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、ストレプトコッカス・ウベリスおよび大腸菌による臨床的乳腺炎の治療に適応される。セファレキシンの作用様式は、細菌細胞壁合成を妨害する、Ｄ−アラニントランスペプチダーゼとの不可逆結合である。カナマイシンは、膜結合リボソームの３０Ｓサブユニットに結合することによって作用し、細菌のタンパク質合成を阻害する。

先行技術の抗生物質に繰り返し起こる問題は、病原体が、それらが原因である疾患の治療に用いられる薬剤に対する耐性を発現することがあることである。そのため、新しい医薬品有効成分は常に追求されている。

リソバクチンは、最初にリソバクター種（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＣ−１４０７６（ＡＴＣＣ ５３０４２）発酵培養液から単離された。独立に、科学者らは、カタノシン（ｋａｔａｎｏｓｉｎ）ＡおよびＢをサイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属（産生株ＰＢＪ−５３５６）に関連する土壌細菌から見出した。カタノシンＢは、リソバクチンと同一であることが分かった。細菌細胞壁生合成がこれらの抗生物質の主な標的である；しかし、作用機序はバンコマイシンのものとは異なっている。リソバクチンは、数個の非タンパク質性Ｄ−およびＬ−アミノ酸を含有する環状デプシペチド（ｄｅｐｓｉｐｅｔｉｄｅｓ）である。

天然物のリソバクチンおよび一部の誘導体は、米国特許第４，７５４，０１８号において抗菌活性を有すると記載されている。リソバクチンの単離および抗菌活性は、欧州特許第１９６０４２号および特開平０１−１３２６００号にも記載されている。

リソバクチンおよびカタノシンＡの抗菌活性は、さらに、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：１７４０−１７４４，Ｂｏｎｎｅｒ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：１７４５−１７５１，Ｓｈｏｊｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：７１３−７１８およびＴｙｍｉａｋ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）５４：１１４９−１１５７に記載されている。

セファレキシンおよびカナマイシンの作用様式とは対照的に、リソバクチンは、細菌細胞壁前駆体脂質ＩＩと直接相互作用することが示唆されている（Ｂｒｅｕｋｉｎｋ Ｅ．およびｄｅ Ｋｒｕｉｊｆｆ Ｂ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．（２００６）５：３２１−３２３）。

リソバクチンの誘導体は、特許出願、国際公開第２００４／０９９２３９号、国際公開第２００６／０４２６５３号、国際公開第２００６／０４２６５４号、国際公開第２００６／０４２６５５号、国際公開第２００６／０４８１３９号、国際公開第２００６／０４８１４０号、国際公開第２００６／０４８１５６号、国際公開第２００７／０８５４５６号、国際公開第２００７／１１８６９１号および国際公開第２００７／１１８６９３号の主題である。

先行技術はどれもリソバクチンを使用するウシ乳腺炎の治療に関心を持っていない。

欧州特許第１９６０４２号 特開平０１−１３２６００号 国際公開第２００４／０９９２３９号 国際公開第２００６／０４２６５３号 国際公開第２００６／０４２６５４号 国際公開第２００６／０４２６５５号 国際公開第２００６／０４８１３９号 国際公開第２００６／０４８１４０号 国際公開第２００６／０４８１５６号 国際公開第２００７／０８５４５６号 国際公開第２００７／１１８６９１号 国際公開第２００７／１１８６９３号

Ｈｏｒｔｅｔ Ｐ，Ｈ．Ｓｅｅｇｅｒｓ．１９９８．Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｏｓｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ：ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．Ｖｅｔ Ｒｅｓ．２９（６）：４９７−５１０ Ｐｙｏｒａｌａ Ｓ ｉｎ Ｉｒｉｓｈ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌｕｍｅ ６２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４０−４４ ２００９ Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：１７４０−１７４４ Ｂｏｎｎｅｒ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：１７４５−１７５１，Ｓｈｏｊｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８８）４１：７１３−７１８ Ｔｙｍｉａｋ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）５４：１１４９−１１５７ Ｂｒｅｕｋｉｎｋ Ｅ．およびｄｅ Ｋｒｕｉｊｆｆ Ｂ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃ．（２００６）５：３２１−３２３

ウシ乳腺炎治療の分野では、有効成分に対する細菌の耐性という欠点がないことが必要である。本発明の目的は、そのような治療のための薬剤を提供することである。

したがって、本発明は、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンを対象とする。

本発明の文脈において、用語「リソバクチン」とは、ＣＡＳ番号１１８３７４−４７−３の物質およびその生理学的に許容される塩をさす。リソバクチンは、次の構造を有する：

対処するウシ乳腺炎は、特に乳牛の乳腺炎である。

リソバクチンの生理学的に許容される塩としては、無機酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩が挙げられる。

また、リソバクチンの生理学的に許容される塩としては、従来の塩基の塩、例として、好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）ならびに１〜１６個のＣ原子を有するアンモニアまたは有機アミンに由来するアンモニウム塩、例として、好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、アルギニン、リジン、エチレンジアミンおよびＮ−メチルピペリジンなども挙げられる。

リソバクチンは、全身に、かつ／または局所に作用することができる。このために、リソバクチンは、適した方法で、例えば、経口、非経口、肺の、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、耳介内、皮膚または経皮経路によって、あるいはインプラントまたはステントとして、投与することができる。

リソバクチンは、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。

経口投与に適しているのは、先行技術に従って機能し、リソバクチンを素早く、かつ／または変更された形態で送達し、リソバクチンを結晶形態で、かつ／またはアモルファス化された形態で、かつ／または溶解された形態で含む投与形態、例えば、錠剤（素錠またはコーティング錠、例えば腸溶コーティング、または、不溶性であるか遅れて溶解してリソバクチンの放出を制御するコーティングを有する錠剤）、口の中で素早く崩壊する錠剤、またはフィルム／ウエハー、フィルム／凍結乾燥物、カプセル（例えば硬または軟ゼラチンカプセル）、糖衣錠、顆粒、ペレット、粉末、乳濁液、懸濁液、エアロゾルまたは溶液である。

非経口投与は、吸収ステップを避けて（例えば、乳腺内、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内に）、または吸収を含めて（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮的または腹腔内に）行うことができる。非経口投与に適した投与形態は、とりわけ、溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥物または滅菌粉末の形態の注射および点滴用製剤である。

その他の投与経路に適した投与形態は、例えば、水性懸濁液用の剤形（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁液、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチなど）、ミルク、ペースト、フォーム、撒布剤、インプラントまたはステントである。

リソバクチンは、述べた投与形態に変換することができる。これは、それ自体公知の方法で、不活性で無毒の薬剤的に適した賦形剤と混合することによって行うことができる。これらの賦形剤としては、とりわけ、担体（例えば微結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然高分子（例えばアルブミン）、安定剤（例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸など）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄など）ならびにマスキング香料および／または臭気が挙げられる。

本発明は、以下の態様および実施形態を参照してさらに説明される。それらは文脈上明らかに示されている場合を除いて自由に組み合わせることができる。

一実施形態は、リソバクチンが乳腺内に投与される、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。

もう一つの実施形態は、ウシ乳腺炎が臨床的に明らかなウシ乳腺炎である、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。

もう一つの実施形態は、ウシ乳腺炎が無症状のウシ乳腺炎である、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。

もう一つの実施形態は、リソバクチンが１乳房区あたり２５〜１０００ｍｇの用量で、好ましくは１乳房区あたり５０〜５００ｍｇの用量で、より好ましくは１乳房区あたり１００〜３００ｍｇの用量で提供される、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。

しかし、適切な場合は、特に体重、投与経路、有効成分に対する個体の応答、製剤の性質および投与を行う時間または間隔の関数として、述べた量から外れることが必要であろう。よって、一部の例では上述の最小量よりも小さい量で済ませることが十分であることがあるのに対して、他の例では述べた上限を上回らなければならない。より多くの量を投与する場合には、これらを１日の間の複数回の個別用量に分割することが望ましい。

もう一つの実施形態は、ウシ乳腺炎が、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、トゥルエペレラ（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ）細菌および／またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌に起因する、ウシ乳腺炎の治療に使用するためのリソバクチンに関する。特に、ウシ乳腺炎は、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）および／またはストレプトコッカス・アガラクティエに起因することがある。さらに、ウシ乳腺炎は、トゥルエペレラ・ピオゲネス（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に起因することがある。また、ウシ乳腺炎は、ウシコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）に起因することがある。これらの微生物は、ウシ乳腺炎の場合に見出される最も一般的な病原体であり、本発明によるリソバクチンを用いる治療に特に感受性が高いことが見出された。

本発明のもう一つの態様は、ウシ乳房への乳腺内投与用に処方された医薬組成物であり、該組成物はリソバクチンを含む。好ましくは、この組成物は、製薬上許容される賦形剤、特に製薬上許容される担体をさらに含む。

これらの賦形剤としては、とりわけ、担体（例えば微結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然高分子（例えばアルブミン）、安定剤（例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸など）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄など）ならびにマスキング香料および／または臭気が挙げられる。

本発明のもう一つの態様は、ウシ乳腺炎の治療用の医薬品の調製のためのリソバクチンの使用である。

本発明による使用の一実施形態では、ウシ乳腺炎は、臨床的に明らかなウシ乳腺炎である。

本発明による使用のもう一つの実施形態では、ウシ乳腺炎は、無症状のウシ乳腺炎である。

本発明による使用のもう一つの実施形態では、ウシ乳腺炎は、ブドウ球菌細菌、連鎖球菌細菌、トゥルエペレラ細菌および／またはコリネバクテリウム細菌に起因する。特に、ウシ乳腺炎は、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）および／またはストレプトコッカス・アガラクティエに起因することがある。さらに、ウシ乳腺炎は、トゥルエペレラ・ピオゲネスに起因することがある。また、ウシ乳腺炎は、ウシコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）に起因することがある。

本発明はさらに、ウシ乳腺炎を治療する方法に関し、この方法は、治療を必要とする乳牛に治療上有効な量のリソバクチンを投与するステップを含む。

本発明は、それに限定されない以下の実施例および図面を参照して、さらに解明される。

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）に対するリソバクチンの殺菌動態を示す図である（実施例２）。 連続継代中の黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ウベリスに対するリソバクチンのＭＩＣ変化を示す図である（実施例４）。 黄色ブドウ球菌の急性マウス乳腺炎モデルにおけるリソバクチンの効力を示す図である（実施例５）。 ストレプトコッカス・ウベリス曝露マウス乳腺炎モデルにおけるリソバクチンの効力を示す図である（実施例６）。 泌乳するホルスタイン牛への乳腺内（ＩＭＡＭ）適用後の乳中のリソバクチンの濃度−時間プロファイルを示す図である（実施例７）。

［実施例１］インビトロでの乳腺炎病原体に対する抗菌活性
細菌の視認できる発育を防ぐ物質の最小濃度として定義される、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を得るために、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、トゥルエペレラ・ピオゲネス、大腸菌、またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの一般的な乳腺炎病原体に対するリソバクチンのインビトロでの抗菌活性を、臨床・検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＣＬＳＩ）に記載される微量液体希釈法のＭＩＣ方法によって評価した。結果はＭＩＣ_９０として示され、下の表に要約される。ここで、ＭＩＣ_９０は、所定の種の菌株の発育の少なくとも９０％が抑制される濃度と定義される。

［実施例２］インビトロでの乳腺炎病原体の殺菌動態
リソバクチンが乳中の細菌を死滅させる能力を評価するために、店で購入した無調整乳（ｆｕｌｌ−ｆａｔ ｍｉｌｋ）中、異なる濃度のリソバクチンを含有するフラスコに、スタフィロックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）かまたはストレプトコッカス・ウベリスのいずれかの代表的な菌株１−２×１０^６コロニー形成単位／ｍｌを植菌した。フラスコを３５＋／−２℃の振盪水浴中で２４〜４８時間インキュベートし、試料を希釈し、寒天板で平板培養することによって、数回の時点で各フラスコ中の生菌数を決定した。初回接種菌液中の生細菌の数の少なくとも９９．９％の減少を殺菌作用と定義する。

乳中の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９７４０およびストレプトコッカス・ウベリスＡＴＣＣ２７９５８に対するリソバクチンの殺菌動態を、４、８、１６、３２および６４μｇ／ｍＬの濃度のリソバクチンについて測定した。結果を図１に表す（ＣＦＵ：コロニー形成単位）。２４時間と４８時間の殺菌性（ｃｉｄａｌｉｔｙ）を、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＳ．ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）について仮定することができる。

［実施例３］インビトロでの自発的耐性発現の評価
自発的耐性発現の頻度は、少なくとも１×１０^９コロニー形成単位のそれぞれの細菌株を、４倍かまたは８倍のＭＩＣでリソバクチンを含有する寒天板で平板培養し、この板を３５＋／−２℃でインキュベートすることによって評価した。４８時間後、ＭＩＣを上回るリソバクチン濃度で播種した板の上で発育したコロニーの数を、最初に蒔いた細菌の数で除算した。得られる数字は自発的耐性頻度と定義され、感染中に耐性分離株が出現する可能性の指標である。

結論として、４倍および８倍のＭＩＣのリソバクチンは、非常に良好な耐性プロファイルを提示した。つまり、耐性分離株は検出できなかった。結果を下の表に要約する：

［実施例４］インビトロでの連続継代中の耐性発現の評価
ＭＩＣ以下のリソバクチン濃度に細菌を常に曝露する間のＭＩＣ変化の出現を、連続継代実験によって評価した。１日目に、黄色ブドウ球菌およびＳ．ウベリスのＭＩＣを、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）に記載される微量液体希釈法のＭＩＣ方法によって評価した。以降の連続する３３日の毎日、十分な成長を可能にする最大濃度を含有するウェルから細菌を回収し、新しい９６ウェルプレートに播種し、リソバクチンに常に曝露している間のＭＩＣを評価するために使用した。それぞれの日に得たＭＩＣを、経時的にプロットした。結果を図２に示す。ＭＩＣの素早い変化をもたらすことが公知のリファンピシンを陽性対照として用いた。

黄色ブドウ球菌およびＳ．ウベリスのＭＩＣは３３日の期間にわたって一定のままであったので、これらの結果は、絶えず曝露されている間の耐性発現についてのリソバクチンの非常に良好なプロファイルを示す。

［実施例５］黄色ブドウ球菌による急性マウス乳腺炎モデルにおける効力
リソバクチン（ｐＨ４．７のヒドロゲルに配合）の効力を、シャーブルック大学（カナダ）で確立された黄色ブドウ球菌急性マウス乳腺炎モデル（参照により本明細書に援用される（Ｂｒｏｕｉ−ｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）４：２５３−２６２））で試験した。泌乳しているＣＤ−１マウスの両方の腹部乳腺（Ｌ４およびＲ４）を、１００ＣＦＵ（コロニー形成単位）の黄色ブドウ球菌に乳腺内感染させた。感染の４時間後に、このマウスをリソバクチンで乳腺内処置した。各処置群は少なくとも３匹のマウス（６乳房区）を含めた。１４時間後（接種後１８時間）にマウスを屠殺し、乳腺を回収し、乳腺ホモジネートの１０倍段階希釈平板培養することによってＣＦＵ含有量を評価した。ＣＦＵ含有量は、ＣＦＵ含量はｌｏｇ_１０（計数値）として表した。検出限界は、２００ＣＦＵ／ｇ乳腺であった。２００ＣＦＵ／ｇ未満の乳腺は、除菌されたとみなした。結果を図３に示す。

５０μｇのリソバクチンを乳腺内に滴下注入することにより、ＣＦＵ含量の中央値が約４ｌｏｇ_１０減少し、４００μｇのリソバクチンにより、全ての感染乳腺から感染が除去される。

［実施例６］Ｓ．ウベリスによる急性マウス乳腺炎モデルにおける効力
リソバクチン（ｐＨ４．７のヒドロゲルに配合）の効力を、ストレプトコッカス・ウベリス曝露マウス乳腺炎モデルで試験した。結果を図４に示す。

子の出産から約１２〜１５日後の２０匹の泌乳マウスをＳ．ウベリスによって４番目の乳腺対に実験的に感染させた。接種の４時間後に、４匹のマウスからなる群を同じ乳腺にヒドロゲルとして製剤した１００、２００、４００、または８００μｇ／乳腺のリソバクチンで処置した。５番目の群は、陰性対照としてヒドロゲル媒体だけで処置した。感染の１８時間後に、動物を安楽死させ、乳腺を取り出し、ホモジナイズし、細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を確立された微生物学的方法によって決定した。その後、ＣＦＵ／ｍＬホモジネートならびにＣＦＵ／ｇ乳腺を計算した。検出限界は、約１００ＣＦＵ／ｇ乳腺であった。ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐ ｕｂｅｒｉｓ）に対するリソバクチンの抗菌活性を、異なる投薬群と陰性対照群のＣＦＵ／乳腺の平均値を比較することによって決定した。

対照群の全ての動物の乳腺は、感染の１８時間後に最適な感染率（≧１０^７ＣＦＵ／ｇ乳腺）を示した。最大投薬群の１つを除いて、リソバクチン処置群の全ての乳腺の細菌数は、検出限界（１０^２ＣＦＵ／ｇ）よりも低かった。ヒドロゲルとして製剤されたリソバクチンは、１００〜８００μｇ／乳腺の乳腺内投与量でＳ．ウベリスに対して顕著な抗菌効力を有すると結論付けることができる。

［実施例７］リソバクチンの牛生体内データ−泌乳するホルスタイン牛における乳の薬物動態研究
この研究は、泌乳期乳牛への１回の大槽内適用後の活性物質リソバクチンの乳薬物動態を調査するのに適した、枢要でない研究として設計された。

活性物質は、１０ｇの油性懸濁液中に１５０ｍｇのリソバクチンＢを含有する、大槽内適用に適したパラフィン系の服用製剤（ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の形で提供された。

試験項目は、１回の大槽内処置として、４頭の泌乳乳牛の各々の後部乳房区の１つに対して１５０ｍｇのリソバクチンの供与量率で投与された。

研究される乳牛（ホルスタイン牛）は、年齢、泌乳数、泌乳段階、乳生産量および品種で標的集団を代表した。動物は牛小屋（ｔｉｅ−ｂａｒｎ）に入れられ、トウモロコシとグラスサイレージ（ｇｒａｓ ｓｉｌａｇｅ）からなる乳牛用の標準的な飼料および泌乳能力を高める飼料を与えられた。搾乳は、１日２回、１２時間間隔でバケツ型搾乳装置を使用して行われた。

処置乳房区およびそれぞれの対照乳房区から、処置の前（０時間）および処置後１６８時間にわたって（０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１２０、１４４、および１６８時間）それぞれの乳房区を手で後搾りすることによって頻繁に乳のサンプリングを実施した。通例の搾乳時の乳試料は、搾乳の前に集めた。

活性物質リソバクチンの乳中の濃度は、タンデム質量分析による検出を含むＨＰＬＣによって分析した。定量下限は０．０５ｍｇ／Ｌであった。

乳濃度データの薬物動態評価は、非コンパートメント法に基づくものであり、乳中の活性物質の吸収、分布および消失プロファイルを適切に説明するＰＫパラメータを含んでいた。

処置した乳房区から導かれた要約結果を下の表に示す。リソバクチンは対照試料（非処置乳房区）では検出されなかった。

リソバクチンの濃度時間曲線は図５に表される。

［実施例８］リソバクチンの牛生体内データ−黄色ブドウ球菌による乳牛乳房感染モデル
１５頭の健康な泌乳乳牛を、４つ全ての乳房区で乳腺炎病原体黄色ブドウ球菌に実験的に感染させた。乳房区が乳腺炎の臨床症状、例えば腫脹、疼痛、異常な乳コンシステンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を示すとすぐに、それを２種の異なる濃度のリソバクチンパラフィン系軟膏か、またはウブロレキシン（登録商標）（セファレキシン＋カナマイシン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）か、または陰性対照として生理食塩水溶液のいずれかで処置した。処置は、合計４２の乳房区に無作為に、乳房区あたり５０ｍｇのリソバクチン（１１乳房区）、あるいは１５０ｍｇのリソバクチン（１１乳房区）、またはウブロレキシン（登録商標）（９乳房区）、または生理食塩水溶液（１１乳房区）のいずれかに割り当てられた。処置の直前に曝露生物について細菌学的に陽性であった乳房区だけが（ｎ＝４２）、微生物学的かつ臨床的治癒の評価に適格であった。罹患した乳房区は、これらの乳腺内製剤で２回、その間に２４時間の間隔を開けて処置した。乳房を臨床的に調べ、乳試料を治療前と、その後数回、２回目の投与後から３週間までに採取した。乳を、そのコンシステンシーの逸脱について目視検査し、曝露生物の存在、および体細胞数について試料を評価して乳腺炎の診断を確認した。罹患した乳房区は、処置の少し前に乳試料中で発見された黄色ブドウ球菌が、２回目の処置の後、３日目と２１日目との間の期間内に採取されたどの乳試料からも単離できなかった場合に、微生物学的に治癒したとみなした。臨床的治癒は、乳腺炎の局所的な症状が完全に消失した場合に達成され、乳房炎のパラメータとしての体細胞数（ＳＣＣ）の回復は、上述の期間に全ての体細胞数が５００．０００細胞／ｍＬ乳よりも低いままであった場合に達成された。

２回目の処置の後の３日目および２１日目の微生物学的治癒率は、それぞれ、リソバクチン５０ｍｇについて７３％および２７％であり、リソバクチン１５０ｍｇについて７３％および４５％であり、ウブロレキシン（登録商標）について７８％および４４％であり、生理食塩水溶液について０％および０％であった。２回目の処置の後の３日目および２１日目の局所的臨床治癒率は、それぞれ、リソバクチン５０ｍｇについて４５％および７３％であり、リソバクチン１５０ｍｇについて３７％および８２％であり、ウブロレキシン（登録商標）について３３％および６７％であり、生理食塩水溶液について５５％および７３％であった。２回目の処置の後の３日目および２１日目のＳＣＣ回復率は、それぞれ、リソバクチン５０ｍｇについて３６％および４５％であり、リソバクチン１５０ｍｇについて３６％および９１％であり、ウブロレキシン（登録商標）について５６％および６７％であり、生理食塩水溶液について３６％および２７％であった。

リソバクチン１５０ｍｇは、陽性対照製品ウブロレキシン（登録商標）と比較して同程度かまたは一層良好な効力を示し、微生物学的かつ臨床的治癒、およびＳＣＣ回復のパラメータでは、リソバクチン５０ｍｇおよび生理食塩水溶液よりも優れていると結論付けることができる。

［実施例９］リソバクチンの牛生体内データ−Ｓ．ウベリスによる乳牛乳房感染モデル
７２頭の健康な泌乳乳牛を、１頭の乳牛あたり２つの乳房区で乳腺炎病原体ストレプトコッカス・ウベリスに実験的に感染させた。乳房区が乳腺炎の臨床症状（例えば、熱、腫脹、発赤、疼痛、異常な乳コンシステンシー）を示すとすぐに、それを２種の異なる濃度のリソバクチンパラフィン系軟膏か、またはウブロレキシン（登録商標）（セファレキシン＋カナマイシン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）のいずれかで処置した。

処置は、合計４１（臨床）または３７（微生物学的）の乳房区に無作為に、乳房区あたり５０ｍｇのリソバクチン（１５／１３乳房区）、あるいは１５０ｍｇのリソバクチン（１５／１４乳房区）、または陽性対照としてウブロレキシン（登録商標）（１１／１０乳房区）のいずれかに割り当てられた。罹患した乳房区は、これらの乳腺内製剤で２回、その間に２４時間の間隔を開けて処置した。乳房を臨床的に調べ、乳試料を治療前と、その後数回、２回目の投与後から３週間までに採取した。乳を、そのコンシステンシーの逸脱について目視検査し、曝露生物の存在について試料を評価して乳腺炎の診断を確認した。罹患した乳房区は、処置の少し前に乳試料中で発見されたストレプトコッカス・ウベリスが、２回目の処置の後、７日目と２１日目との間の期間内に採取されたどの乳試料からも単離できなかった場合に、微生物学的に治癒したとみなした。臨床的治癒は、乳腺炎の局所的な症状が完全に消失したか、または多くても非常にわずかな性質であった場合に達成された。

２回目の処置の後の７日目および２１日目の微生物学的治癒率は、それぞれ、リソバクチン５０ｍｇについて８４．６％および９２．３１％であり、リソバクチン１５０ｍｇについて７１．４％および８５．７１％であり、ウブロレキシン（登録商標）について３０％および３０％であった。２回目の処置の後の７日目の臨床治癒率は、それぞれ、リソバクチン５０ｍｇおよびリソバクチン１５０ｍｇの両方について８６．７％であり、ウブロレキシン（登録商標）について３６．４％であった。

リソバクチン５０および１５０ｍｇは、陽性対照製品ウブロレキシン（登録商標）と重要なパラメータ、微生物学的かつ臨床的治癒の点で比較して、明らかにより効果的であったと結論付けることができる。

Claims (14)

1. リソバクチンを含む、ウシ乳腺炎の治療における使用のための医薬組成物であって、該治療において乳腺内に投与される、医薬組成物。
2. 前記ウシ乳腺炎が臨床的に明らかなウシ乳腺炎である、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. 前記ウシ乳腺炎が無症状のウシ乳腺炎である、請求項１に記載の使用のための組成物。
4. リソバクチンが、１乳房区あたり２５〜１０００ｍｇの用量で提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
5. 前記ウシ乳腺炎が、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、トゥルエペレラ（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ）細菌および／またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌に起因する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
6. 前記ウシ乳腺炎が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）および／またはストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）に起因する、請求項５に記載の使用のための組成物。
7. 前記ウシ乳腺炎が、トゥルエペレラ・ピオゲネス（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に起因する、請求項５に記載の使用のための組成物。
8. 前記ウシ乳腺炎が、ウシコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）に起因する、請求項５に記載の使用のための組成物。
9. ウシ乳房への乳腺内投与用に処方された、ウシ乳腺炎の治療のための医薬組成物であって、前記組成物がリソバクチンを含むことを特徴とする、医薬組成物。
10. ウシ乳腺炎の治療用の医薬品の調製のためのリソバクチンの使用。
11. 前記ウシ乳腺炎が、臨床的に明らかなウシ乳腺炎である、請求項１０に記載の使用。
12. 前記ウシ乳腺炎が、無症状のウシ乳腺炎である、請求項１０に記載の使用。
13. 前記ウシ乳腺炎が、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌、トゥルエペレラ（Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ）細菌および／またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌に起因する、請求項１０〜１２の一項に記載の使用。
14. ウシ乳腺炎を治療する方法であって、前記方法が、治療を必要とするウシに治療上有効な量のリソバクチンを投与するステップを含む、方法。

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