JP6921960B2 - 微小毛包を調製するための胚細胞の使用 - Google Patents

Description

本発明は、胚細胞の培養および増幅により微小毛包を産生する「インビトロ」法に関する。

同様に、本発明は、上記方法により産生される微小毛包に、ならびに脱毛症を治療するため、およびさらには化粧用、医薬および皮膚用製品の効果を評価するためのその使用に関する。

脱毛症は、種々の因子：遺伝子、ホルモンおよび環境因子を、食事を、ならびに身体活動を条件として発症する。毛髪は、不可欠な美容およびアイデンティティの役割を有する。したがって、女性または男性における脱毛症は、かなりの心理的苦痛の原因となり得る。

したがって、ほとんどの女性および男性において、生涯にわたる健康で強靭な毛髪および稠密な頭髪が熱望される。

脱毛症を治療するための多くの技術、例えば、細胞療法、レーザ療法または手術を伴わないインプラントが公知である。後者は即効的結果を与え、手術よりもはるかに侵襲性が低い。

インプラントを得るため、ヒト毛包は、毛球中に存在する種々の細胞タイプを培養することにより得られる。

毛球は洋ナシ形状であり、それは、以下のものから構成される：
− 皮膚由来の出芽物であり、毛包の基部に位置する毛乳頭。これは成長因子および細胞外毛母体タンパク質のその貯蔵を介する毛髪の栄養摂取およびその成長の調節に関与する血管の多い部位である。
− 毛乳頭を包み込む区域であり、それほど分化していない毛母細胞の集塊から構成される毛母体。これは、強力な有糸分裂活性のシートである。毛球中に位置し、毛乳頭周囲の小細胞集塊を形成する毛母細胞は、主として、胚芽層を構成し、急激に増殖して分化して毛幹を形成するケラチノサイトの前駆体から構成され、したがって、毛周期における不可欠な役割を担う。成長期の開始から前記期の終了まで、それらの毛母細胞は退行期まで増殖し、次いで休止期において消失する。（（非特許文献１）、（非特許文献２）。細胞分化は、外上皮鞘（ｏｕｔｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｈｅａｔｈ）（ＯＲＳ）の、内上皮鞘（ｉｎｎｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｈｅａｔｈ）（ＩＲＳ）の、および次いで毛幹の種々の細胞タイプの形成を可能とする。毛髪の形状を調整するのも、この毛母体である。毛母体は、直毛についてはほぼ対称軸で均一に分布する一方、縮毛については片側で大きく分布する（（非特許文献３）；（非特許文献４））。毛母体は、毛髪の色素沈着を担う毛包メラノサイトも含む。これらの毛母細胞の増殖および分化は、毛乳頭により制御される（（非特許文献５））；
− 角化区域としても公知の毛球の上方毛母体により産生される外および内上皮鞘。外上皮鞘は毛包の外殻を構成し：これは表皮の陥入である。これは、毛包が周期的に再生される特定の幹細胞を包む。内上皮鞘は、外上皮鞘を毛幹から離隔する。この鞘は、毛髪の成長を伴う同心円状の角化層において組織化される３つの細胞タイプから構成される。ヘンレ層、ハックスレー層および扁平細胞から形成され、毛母体に方向付けされる毛小皮が区別される；
− 部分的に可視的である毛幹、すなわち毛髪。毛幹の構造は、外側から内側まで３つの区別される層から構成される。毛小皮、毛皮質および毛髄質が存在し、全て、角化細胞の全てを構成する。

毛髪は、その生涯について、極めて不均等な期間の発生の３つの期を経る：
− 成長期は、毛髪の活性期であり、その間、毛髪は生存し、規則的に成長する。これは、４〜７年続く。毛根の毛球の毛乳頭を包囲する胚細胞は、毛髪の生存および成長を可能とする材料を継続的に産生する。次に、胚細胞の増大は、毛包の基部において停止する。次いで、毛髪の活性期が終了し；別の期が開始し、それはかなり短期である。
− 退行期：わずか１５日後、毛球は消失し（それというのも、胚芽細胞の遮断のためそれはもはや栄養供給されないため）、加速速度において変形する。毛乳頭は消失し、すなわち、中空の毛球が中実になり；それは角化し、硬化し、角質化する。次いで、毛髪は死滅し；毛包は、死滅毛髪を放出するように縮む。

休止期は、約３ヵ月続く期であり、その間、死滅毛髪は抜け落ちを待つ。抜け落ちのため、毛髪は、次いで同一の毛包中で成長し、古い毛髪を放出する新たな毛髪により押し出されなければならない。

次いで、毛包の再生が、「毛隆起」中に位置する胚細胞と称される幹細胞から出発して生じる。

「毛隆起」は、毛包の中央部分中に、より正確には立毛筋挿入区域中に位置する胚細胞と称される外上皮鞘の細胞下位集団により形成される。これらの細胞は、毛包の恒常的部分の最下部に相当する。

「毛隆起」において、ケラチノサイトは、生化学的および超微細構造的に比較的未分化である。

この「毛隆起」は、後期休止期の間に、上昇する毛乳頭と相互作用して新たな毛包の成長期を開始させるための極めて重要な場所である。したがって、胚細胞は、毛髪の再発生に不可欠な細胞である。休止期毛髪の胚細胞（胚芽細胞または多能性細胞または幹細胞）は、休眠期からの毛包の抜け出しおよびしたがって毛髪の再成長に関与する。

本発明の目的のため、用語「胚細胞」は、「毛隆起」中に存在する幹細胞を意味するものとする。

数年間にわたり、顕微解剖により入手が容易なコンパートメントからの毛包細胞が培養されている、（特許文献１）、（特許文献２）。

しかしながら、休止期毛包の解剖は、頭皮上に存在する毛包の全ての１５％未満に相当する特にその希少性のため、特に困難である。休止期毛包の解剖は、特にその皮膚環境のため、さらに特に困難である。したがって、困難性の１つは、再発生し得る毛包を再生するために十分な量の胚細胞を得ることである。２００５年のＳ．Ｌｙｌｅのチームは、ディスパーゼによる消化により調製され、次いで引き抜かれた休止期毛包から出発する増幅によるそれらの細胞の初代培養を実施し、それによっては、培養物中に配置するため、およびインビトロで胚細胞特異的マーカーの発現を維持して毛包を再生するために十分な量の胚細胞の全てを抽出することが可能でない（（非特許文献６））。

細胞療法に関して、Ｒｅｐｌｉｃｅｌ社は、結合組織鞘細胞を使用して色素沈着されておらず、リサイクリングしない微細毛幹を得ており；それというのも、結合組織鞘細胞は、皮膚のケラチノサイトをリクルートするためである（Ｊａｈｏｄａ，１９９９；Ｈｉｇｇｉｎｓ，２０１３により使用される方法）。

これらのモデルは、存在および量がヒト微小毛包の特徴のほとんど、特にその再発生能を有する微小毛包の形成に不可欠である胚細胞を含有しない。

欧州特許第２２７４４１９号明細書 欧州特許第２４４７３５７号明細書

Ｅｂｌｉｎｇ ＦＪ．Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈａｉｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ．１９８７ Ｊｕｌ；５（３）：４６７−８１．Ｒｅｖｉｅｗ Ｓａｉｔｏｈ Ｍ，Ｕｚｕｋａ Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｃｙｃｌｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７０，Ｊａｎ ５４，ｐａｇｅｓ ６５−３２ Ｖｏｙａｇｅ ３Ｄ ａｕ Ｃｏｅｕｒ ｄｕ ｃｈｅｖｅｕ ［３Ｄ ｖｏｙａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｉｒ］ｗｅｂ ｓｉｔｅ−ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｈａｉｒ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ Ｍｅｌｉｓｓｏｐｏｕｌｏｓ Ａ ａｎｄ Ｌｅｖａｃｈｅｒ Ｃ．Ｌｅｓ ａｎｎｅｘｅｓ ｃｕｔａｎｅｅｓ［Ｔｈｅ ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅｓ］．Ｉｎ：Ｌａ ｐｅａｕ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ［Ｔｈｅ ｓｋｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ］，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ；１９９８．Ｐ．５７−９９ Ｂｏｔｃｈｋａｒｅｖ ＶＡ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｙｃｌｉｎｇ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｙｍｐ Ｐｒｏｃ．２００３ Ｊｕｎ；８（１）：４６−５５．Ｒｅｖｉｅｗ Ｒｏｈ Ｃ，Ｔａｏ Ｑ，Ｐｈｏｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ，Ｌｙｌｅ Ｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００５，１２５：１０９９−１１０５

驚くべきことに、本発明者らは、胚細胞を毛乳頭線維芽細胞およびさらには結合組織鞘線維芽細胞と接触させた場合、微小毛包を担う管状構造が形成し、胚細胞の存在のため、リサイクリングし得るのに十分な量の胚細胞を得ることに成功した。

実際、本出願人は、Ｒｏｃｋ Ｙ２７６３２阻害剤の存在下での胚細胞の培養により、それらの細胞のかなりの増殖ならびにＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへのそれらの分化が可能となることを実証した。さらに、それらの細胞は、高い核／細胞質比および均一な表現型を有する小さな細胞であることに留意することができる。

これらの細胞を結合組織鞘線維芽細胞およびさらには毛乳頭線維芽細胞と接触させた場合、微小毛包の形成を担う管状構造の形成が観察される。

３Ｄ培養物中に配置された結合組織鞘線維芽細胞およびさらには真皮群の線維芽細胞を用いて得られた細胞の混合により、予想外に、胚細胞ならびに毛乳頭線維芽細胞およびさらには結合組織鞘線維芽細胞から構成される混合スフェロイドからの出芽の形成を得ることが可能となる。この出芽物は、毛包の形成を担う管状構造の形態である。

本発明の目的のため、用語「管状構造」は、混合スフェロイドから形成する出芽物を意味するものとする。

本発明の目的のため、用語「混合スフェロイド」は、胚細胞の、ならびに毛乳頭線維芽細胞およびさらには結合組織鞘線維芽細胞の３Ｄ培養物を意味するものとする。

本発明の目的のため、用語「管状構造」は、胚細胞の、および毛乳頭線維芽細胞または結合組織鞘線維芽細胞の３Ｄ培養後に観察される出芽物を意味するものとする。この管状構造は、一方では、毛髪の上皮幹細胞から構成され、他方では、毛髪の間葉細胞から構成され、微小毛包の形成を担う。

したがって、本発明による方法は、ヒト微小毛包の特徴のほとんどを有し、特に再生し得る毛包の形成に要求される、毛髪の線維芽細胞および胚細胞を使用して毛包を得ることを可能とするために有利であることが証明される。

したがって、本発明の第１の主題によれば、本発明は、毛包を得るための胚細胞の使用に関する。

図面により本発明のより良好な説明を付与することが可能となるが、本発明の範囲を限定するものではない。

胚細胞の位置を示す図である。 針による結合組織鞘細胞の、および胚細胞の分離を示す図である。 胚細胞を含有する休止期毛包の単離を示す図である。 ３Ｔ３のフィーダー層上に堆積した休止期毛包および休止期毛包周囲の第一の胚細胞の移動を示す図である。 培養１０日後のコンフルエンスにおける胚細胞を示す図である。 コンフルエンスにおける細胞の特徴付け、Ｋ１５＋、ＣＤ２９＋およびＣＤ２００＋ケラチノサイトを示す図である。 Ｒｏｃｋ阻害剤あり（図７ａ）およびＲｏｃｋ阻害剤なし（図７ｂ）の胚細胞の増殖を示す図である。 培養３、７および１０日後の毛包を担う管状構造の形成を示す図である。

微小毛包を調製するための胚細胞の使用
胚細胞は、以下の方法によりサンプリングすることができる：休止期の毛包を、２％の抗生物質および非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿中に配置する。

胚細胞の領域は、毛隆起とも称され、結合組織鞘から抽出し、次いで３Ｔ３ｉ線維芽細胞のフィーダー層を含有するペトリ皿中に配置する。

微小毛包を得るために十分な量の胚細胞を得るため、本出願人は、それらの細胞がＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５ケラチノサイトに分化するようにそれらの細胞を増幅させる方法を開発した。

したがって、本出願人は、微小毛包を調製する方法であって、胚細胞を、ＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへの前記細胞の分化を可能とするために十分な期間、有効量のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で増幅させる少なくとも１つのステップを含む方法を開発した。

微小毛包を調製するこの方法は、以下のステップ：
ａ−頭皮試料から休止期の毛包を単離するステップ；
ｂ−結合組織鞘から胚細胞を分離するステップ；
ｃ−Ｇｒｅｅｎ７Ｆ培地中で放射線照射され、またはマイトマイシンにより遮断された３Ｔ３ｉ線維芽細胞のフィーダー層上で細胞集合体を堆積させるステップ；
ｄ−胚細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で前記担体の表面において増幅させるステップ；
ｅ−ＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーを示すケラチノサイトを回収するステップ；
ｆ−ステップｅ）において得られたケラチノサイトを結合組織鞘からのおよび／または毛乳頭からの線維芽細胞の存在下で３Ｄ培養物中で培養するステップ
を含むことを特徴とする。

結合組織鞘からのおよび／または毛乳頭からの線維芽細胞の存在下での３Ｄ培養物中での胚細胞の培養により、胚細胞の存在により再発生し得る微小毛包を担う毛髪構造を得ることが可能となる。

したがって、胚細胞の培養から得られた微小毛包は、再発生し得る。

特に、結合組織鞘からのおよび／または毛乳頭からの線維芽細胞の存在下での胚細胞の培養から得られた微小毛包は、再発生し得る。

顕微解剖
克服すべき困難性の１つは、顕微解剖により休止期の毛包を得ることである。

これは、通常条件下、毛髪が抜け落ちる時、胚細胞と称される幹細胞を含有する毛隆起コンパートメントが新たな毛周期の発生の開始を可能とし、新たな毛包を再度生じさせるためである。

したがって、休止期毛髪の引き抜きによってはそれらの胚細胞を得ることが可能でなく；したがって、頭髪生検を実施し、次いでそれらの細胞を顕微解剖により単離することが必要である。

本発明によれば、胚細胞は、細胞の量および統合性を保存する新規顕微解剖技術により得られる。それというのも、細胞が互いに分離されないためである。実際、休止期の毛髪は、担体上に単離され、毛隆起中に位置する胚細胞を含有する休止期毛幹が抽出される。この顕微解剖により、胚細胞の全てを単離および保存することが可能となる。

本発明の目的のため、用語「休止期」は、休止期の毛髪を含有した毛包を意味するものとする。

増幅
胚細胞は、単離困難であることに加え、少なくとも以下の理由のため培養も困難である：
ａ）胚細胞の数が特に少ない；
ｂ）胚細胞は増幅が困難である。

本出願人は、胚細胞を単離し、それらの細胞を培養する方法を開発した。具体的には、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２成長因子の存在下で、それらの細胞は、急速に増殖し、それらがコンフルエンスに達するまでＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５ケラチノサイトに分化する。

ＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎ（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６，３３１−３４４，１９７５）の技術に従って、成長因子、特にアミノ酸、血清、コレラ毒素、インスリン、トリヨードサイロニンおよびｐＨ緩衝溶液の存在下で、当業者に公知の好適な培地中で線維芽細胞から構成されるフィーダー担体上で培養することにより細胞を増幅させる。特に、このような培養培地は、特に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２が添加された、ケラチノサイトのための少なくとも１つの細胞分裂成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）および／またはケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、特にＫＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび任意選択的に抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ）を含有し得る。

有利には、前記培地は、例えば、ウシ由来の血清もしくは下垂体抽出物、エピネフリン、トランスフェリンおよび／または非必須アミノ酸も含み得る。

この培養に使用される線維芽細胞は、より好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞である。３Ｔ３線維芽細胞は当業者に周知である。これは、１９６２年から公知である線維芽細胞系である。「３Ｔ３」は、「３日毎の継代、３×１０^５個の細胞の接種材料」を意味する。

細胞培養は、好ましくは、線維芽細胞（好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞）上での培養であり、その増殖は、好ましくは、既にそれを放射線照射（例えば、ガンマ線照射による）することにより、または既にそれをマイトマイシンにより処理することにより事前に停止されている。マイトマイシン（特にマイトマイシンＣ）はそれらの細胞の増殖を遮断するが、線維芽細胞がケラチノサイト増殖に有用な栄養物質を産生するのを妨害しない。

この技術を用いると、胚細胞はそれが他の細胞タイプから分離された担体上で増殖する。これにより、十分な数の胚細胞を保存することが可能となる。細胞は、Ｙ２７６３２の存在下でコンフルエンスまで急速に増殖し、マーカーＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５について陽性である細胞に分化する。

本発明によれば、用語「有効量」は、コンフルエンスにおけるＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５ケラチノサイトの培養物を得るために要求される量を示す。

本発明によれば、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の有効量は、１〜１００μＭであり、好ましくは、５〜２５μＭであり、好ましくは、１０μＭである。

本発明によれば、胚細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間培養する。

好ましくは、細胞は、１ｃｍ^２当たり１０００〜４０００個の細胞の細胞数で、好ましくは、３０００個の細胞数で培養物中に配置する。

用語「コンフルエンスにおける」は、適切な担体、例えば、培養皿上で単層で培養されるそれぞれの接着細胞間の間隔を有さない細胞層を意味するものとする。

微小毛包を得るための３Ｄ培養物中でのＣＤ２００、ＣＤ２９、Ｋ１５細胞の培養
３Ｄスフィアは、ハンギングドロップ法または非接着細胞を培養するためのマイクロプレートを用いる方法（ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ白色紙システム）によりＩｎｓｐｈｅｒｏタイプの９６ウェルマイクロプレート上で細胞を播種することにより得る。

次いで、胚細胞ならびに結合組織鞘および／または毛乳頭からの線維芽細胞をｇｒｅｅｎ培地中で３７℃において培養し；微小毛包の出現は培養の少なくとも３日後に観察される。

一実施形態によれば、細胞は、培養物中で少なくとも３日間、好ましくは、少なくとも５日間維持する。

好ましくは、培養物中に配置される細胞の数は、１ｃｍ^２当たり１０００〜４０００個の細胞であり、好ましくは、３０００個の細胞である。

本発明の別の主題は、本発明による方法により得ることができる微小毛包である。

この微小毛包により、一方では、毛量低減状態、特に脱毛症の予防的治療または治療処置のためにそれを使用すること、他方では、化粧用および／もしくは医薬活性剤の活性または局所成分の副作用についての予測試験を構成することが可能となる。

毛量低減状態、特に脱毛症の予防的治療または治療処置
微小毛包がインビボでの毛包の特徴を有することを考慮すると、それを任意選択的に、代用皮膚と組み合わせたインプラントとして使用することができる。

したがって、本発明による微小毛包は、皮膚障害、例えば、火傷、治癒不全または白色もしくは灰色に変色した毛髪を治療するためのインプラントおよび／または代用皮膚の調製にも使用される。

治療効果は、全体的か部分的かにかかわらず、正常な毛量状態への復帰として定義される。

本発明の目的のため、予防的治療は、対象が脱毛についての条件、例えば、家族性体質を有する場合に推奨される。

毛髪量低減の病態は、脱毛症、遺伝性禿頭、瘢痕、火傷または突発的損傷による結果であり得る。

化粧用および／または医薬活性剤の活性についての予測試験
本発明による微小毛包同等物により、特に体毛または頭髪の経時的成長ならびにしたがって、インビボ状況で生存し、可能な限り完全な多数の毛髪を要求する任意の試験、例えば、毛周期の試験およびこの周期に影響し得る因子の試験（毛髪成長を促進する活性剤の試験まで及ぶ）、脱毛の撲滅を可能とする活性剤の試験または体毛成長を減速させる活性剤の試験を実施することが可能となる。

新規活性剤を同定する目的のための産物スクリーニングプロセスは、前記試験産物を、本発明による微小毛包と接触させるステップ（ａ）、次いで微小毛包の少なくとも１つのパラメータに対する前記産物の効果を分析するステップ（ｂ）および前記パラメータを改変する産物を選択するステップ（ｃ）を含む。

好ましくは、ステップ（ａ）を実施するため、試験産物を局所的に施与し、例えば、慣用の局所配合物中に配合し、または培養培地中に導入する。

ステップ（ｂ）は、特に、微小毛包の品質と、および／またはそのホメオスタシスと関連するマーカー、例えば、構造タンパク質についての毛包マーカーの発現、産生および／または活性を分析することにより実施することができる。構造タンパク質の一例としては、毛髪ケラチンを挙げることができる。

このため、毛幹の成長に対する産物の効果をスクリーニングプロセスのステップ（ｂ）において分析する。

産物の効果を分析するステップ（ｂ）は、好ましくは、試験産物と接触させた本発明による微小毛包に対して計測された少なくとも１つのパラメータと、同一条件下で培養されたが試験産物を受けなかった対照微小毛包に対して計測されたものとの比較である。

微小毛包のパラメータを改変する産物を選択するステップ（ｃ）は、事前に決定された基準に応じて実施する。

このパラメータの改変は、マーカーの発現の、産生の、および／もしくは活性の、ならびに／または毛幹の成長の刺激、減少または全体もしくは部分阻害であり得る。

前記産物を選択する基準は、例えば、この産物が計測パラメータに対する刺激または阻害効果を有することである。

本発明による微小毛包は、新規活性剤の同定のために化粧用、医薬または皮膚用化合物をスクリーニングする自動化プロセスにおいて使用することもできる。

以下に挙げる実施例は、本発明の非限定的な説明として提示する。

実施例１
胚細胞の調製
実験プロトコル
毛隆起とも称される胚細胞領域（図１）を結合組織鞘から抽出し（図２）、次いで３Ｔ３ｉ細胞を含有するペトリ皿中に配置する（図３）。

ｉ．胚細胞顕微解剖
毛包を頭皮の手術残渣から抽出する。前記残渣を最初に５ｍｍ^２片に切断し、次いで外科用メスを真皮および皮下組織間で使用して分割する。

毛包は、眼科手術用鉗子を使用して抽出し、次いで外科用メスにより毛乳頭真上で分割する。次いで、毛球を回収する。この段階において、毛球は２つのコンパートメント：真皮コンパートメント（毛乳頭および結合組織鞘）および細胞塊を形成する毛母細胞を含む。

上皮部分は、灌流針を使用して真皮部分から分離する。上皮部分のみを培養する。

ｉｉ．培養条件：
培養条件は、３つの主要な構成要素を有する：
・基礎培地：
特に示されない限り、本実施例において使用される培地および緩衝液の全ては、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９７９，（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７６，１２７４−１２７８）、Ａｓｓｅｌｉｎｅａｕ ａｎｄ Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ，１９８４，（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｄｅｒｍ．，１１１，２１９−２２２）またはＡｓｓｅｌｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，（Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏ．，ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｅｄ．Ｌｏｗｅ ＆ Ｍａｉｂａｃｈ，１−７）に記載されている。

ＭＥＭ培地＋１０％のＦＣＳ＋７Ｆ（Ｇｒｅｅｎ７Ｆ培地と称する）は、以下の組成を有する。

・培養補給物：成長因子、例えば、１０μＭのＹ２７６３２。
・接着表面：胚細胞は、マイトマイシン処理により細胞周期を停止させたネズミ３Ｔ３線維芽細胞のフィーダー層の存在下でＧｒｅｅｎベース培地中で増殖する。

ケラチノサイトの培養−増幅
顕微解剖後、休止期の毛包を直径６０ｍｍペトリ皿中で堆積させ、それに１００万個の３Ｔ３細胞を事前に播種し、完全Ｇｒｅｅｎ７Ｆ培養培地により被覆し；コンフルエンスにおける胚細胞の培養物を得る。

スフィアを生成するため、細胞をサブコンフルエント段階において酵素処理により回収する。スフィアは、既に記載されている慣用の技術（ハンギングドロップ、遠心分離、非接着担体）により種々の手法で得ることができる。ハンギングドロップの場合、３０００個の細胞をプレート中でインスフェロで（ｉｎ ｓｐｈｅｒｏ）配置する。これらの細胞を４８時間後に９６ウェルプレート中で回収してそれらの進行をモニタリングする。

非分離胚細胞集塊を有する休止期毛髪を単離し、３Ｔ３フィーダー層上で堆積させる（図３）。培養３日後、細胞は、胚細胞集塊周囲でコロニーの形態で増殖し始める（図４）。細胞は７日後にサブコンフルエンスに達する（図５）。

これらの細胞は、極小サイズおよび強力な増殖能を特徴とする。増幅を確保するため、次いで、細胞をＴ７５フラスコ中に播種する。したがって、３つの毛球の培養３週間後、第１継代において約４０００万個の胚細胞を生成することが可能である。

胚細胞がｇｒｅｅｎ７Ｆ培地中で１０μＭの濃度のＲｏｃｋ Ｙ２７６３２阻害剤の存在下でコンフルエンスに極めて急速に達し得る（図７ａ））一方、ｒｏｃｋ阻害剤を添加しない同一の培地中では細胞は増殖しない（図７ｂ））ことを観察することが可能であった。

したがって、ｒｏｃｋ阻害剤を含有する７Ｆ培地中で培養された胚細胞により、Ｋ１５、ＣＤ２９およびＣＤ２００マーカーについて陽性であるケラチノサイト（図６）を十分な量で得ることが可能となる。さらに、これらの細胞は、サイズが小さく、高い核／細胞質比および均一な表現型を有する。

次いで、十分な量で得られ、Ｋ１５、ＣＤ２９およびＣＤ２００マーカーを均一におよび再現可能に有する細胞を、結合組織鞘からのおよび／または毛乳頭からの線維芽細胞の存在下で３Ｄ培養物中に配置する。

これらの細胞は、培養３日後にスフィアを形成する。

培養のさらに約３日後、これらのスフィアは立体構造を変化させ、極性化された組織化を示す。出芽物が出現し、それは、毛包の形成を担う管状構造へのスフィアの分化を示すと考えられる。

Claims (12)

1. 再発生し得る微小毛包を調製する方法であって、毛隆起中に存在する幹細胞である胚細胞を、ＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーについて陽性であるケラチノサイトへの前記細胞の分化を可能とするために少なくとも２日間、１〜１００μＭのＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養し、ならびに、
   毛隆起中に存在する幹細胞である前記胚細胞を、結合組織鞘線維芽細胞および／または毛乳頭線維芽細胞の存在下で培養する、
   少なくとも１つのステップを含む方法。
2. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＲＯＣＫ阻害剤の量が、５〜２５μＭである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＲＯＣＫ阻害剤の量が、１０μＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 以下のステップ：
   ａ−頭皮試料から休止期の毛包を単離するステップ；
   ｂ−結合組織鞘から、毛隆起中に存在する幹細胞である前記胚細胞を分離するステップ；
   ｃ−ｇｒｅｅｎ７Ｆ培地中でマイトマイシンにより遮断された３Ｔ３ｉ線維芽細胞のフィーダー層上で細胞集合体を堆積させるステップ；
   ｄ−毛隆起中に存在する幹細胞である前記胚細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で担体の表面において増幅させるステップ；
   ｅ−ＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーについて陽性であるケラチノサイトを回収するステップ；
   ｆ−ステップｅ）において得られたケラチノサイトを結合組織鞘線維芽細胞および／または毛乳頭線維芽細胞と３Ｄ培養物中で培養するステップ
   を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＣＤ２００、ＣＤ２９およびＫ１５マーカーについて陽性である前記ケラチノサイトを、それらがコンフルエンスに達する一方、規則的なクラスタを形成した時に回収する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ステップｆ）において、培養物中に配置されるケラチノサイトの数が、１ｃｍ^２当たり１０００〜４０００個の細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
8. 前記微小毛包が、毛量低減状態の予防的治療または治療処置のために使用されることを意図する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって、再発生し得る微小毛包を調製する方法。
9. 前記微小毛包が、脱毛症の治療のために使用されることを意図する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって、再発生し得る微小毛包を調製する方法。
10. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって、再発生し得る微小毛包を調製する工程、および、
    前記微小毛包を、毛髪特性に対する活性剤の効果のインビトロ試験のために使用する工程、
    を含む方法。
11. 体毛および／または頭髪の成長を変調する化合物の同定のための、請求項１０に記載の方法。
12. 新規活性剤を同定する目的のための産物スクリーニング方法であって、
    請求項１から７のいずれか一項に記載の方法によって、再発生し得る微小毛包を調製する工程、前記試験産物を、前記微小毛包と接触させるステップ（ａ）、次いで前記微小毛包の少なくとも１つのパラメータに対する前記産物の効果を分析するステップ（ｂ）および前記パラメータを改変する前記産物を選択するステップ（ｃ）を含む方法。

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