JP6931046B2

JP6931046B2 - ｍＴＯＲ阻害剤を含有する黄斑変性治療用薬学組成物

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Publication number: JP6931046B2
Application number: JP2019514034A
Authority: JP
Inventors: イ、ヨン−イル; イ、スティーブン・ヒョン・ソン; パク、テ・カン
Original assignee: シドゥモゼン・カンパニー・リミテッド
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2021-09-01
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: EP3517133B1; US20190192551A1; CN109937053B; US10583150B2; CA3035675C; CN109937053A; JP2019530675A; AU2017323898A1; CA3035675A1; EP3517133A2; EP3517133A4; JP2021095411A; AU2017323898B2; KR20180028890A; KR101951787B1

Description

本発明は、黄斑変性治療用薬学組成物に関し、より詳細には、ｍＴＯＲ遺伝子の発現を阻害する阻害剤を含有する黄斑変性治療用薬学組成物に関する。

加齢黄斑変性（Ａｇｅ‐ＲｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＡＭＤ）は、多くの先進国において、６５才以上の人口で失明を引き起こす最も主な疾病となっている。この疾患は、全種類の動物で視機能の核心的な役割を担っている網膜の恒常性および生理的な機能の維持において決定的な役割を担う網膜色素上皮細胞層（ＲｅｔｉｎａｌＰｉｇｍｅｎｔＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＲＰＥ）の機能低下、および年齢の増加による萎縮が最も主な原因であると知られている。また、その他に、ＲＰＥの基底膜の役割をするブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓＭｅｍｂｒａｎｅ）の年齢による変化に起因した異常変化や、ＲＰＥおよび神経網膜の最外側に位置し、光伝達（ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が起こる光受容細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌ）に栄養分および酸素を供給する役割を担う脈絡膜毛細血管（Ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）の退化などが、ともに作用すると考えられている。

このような変化により現れる表現型によって、加齢黄斑変性は大別して２つに分類されるが、ＲＰＥとブルッフ膜、脈絡膜毛細血管の退化および機能低下を特徴とする乾性黄斑変性（ＤｒｙＡＭＤ）と、ＤｒｙＡＭＤの様相に加えて、脈絡膜に起源する新生血管（Ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）が伴われる湿性黄斑変性（ｗｅｔＡＭＤ）と、に分類される。

ＤｒｙＡＭＤは、ＲＰＥと脈絡膜毛細血管との間に、補体系タンパク質とアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）類のタンパク質が蓄積されるドルーゼン（ｄｒｕｓｅｎ）の発生が特徴である。恐らく、これらの存在が脈絡膜毛細血管における酸素および栄養分の移動を妨害し、ドルーゼンの発生自体が、ＲＰＥ細胞の機能低下を反映することであって、結果として、さらなる酸素の不足と物質移動の妨害、そして炎症の発生を引き起こすこととなり、結局、ＲＰＥ細胞の死滅をもたらし、時間が経過するにつれて、ＲＰＥ組織の広範囲な欠損を示す地図状萎縮（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｔｒｏｐｈｙ；ＧＡ）が特徴として現れる。

かかる表現型を有するｄｒｙＡＭＤに対する治療としては、現在のところ特になく、単に抗酸化効果を有するビタミンや微量元素およびルテインを含有する健康食品で、その進行をやや遅延させることが知られている。近年、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍ）関連タンパク質をターゲットとする様々な臨床研究が行われたが、Ｃ３、Ｃ５などをターゲットとした研究は何れも失敗しており、ｆａｃｔｏｒｂｌｏｃｋａｄｅのために開発された単クローン抗体薬剤であるＬａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ社で開発）は、臨床２床で１８ヶ月間観察した結果、毎月１回の硝子体腔内注射によりＧＡの拡大が２０％抑制される効果が現れ、現在、３床の研究が行われている。

ＷｅｔＡＭＤは、ｄｒｙＡＭＤの患者の５〜１０％で発生しており、視力の低下が数年もしくは十〜二十年の期間にわたって進行されるｄｒｙＡＭＤと異なって、治療しない場合、数ヶ月内に失明を引き起こし得る急性型の表現型を示す。この場合、網膜下腔（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌｓｐａｃｅ）および網膜色素上皮下空間（ｓｕｂＲＰＥｓｐａｃｅ）にわたった広範囲な酸素分圧および栄養分の低下、すなわち、組織内虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）現象と、それに伴われる炎症反応が主な役割をする。また、その他に、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ）、免疫学的機序で重要な役割をする補体系がまた働き、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ；Ｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が特徴的に網膜下腔もしくは網膜色素上皮下空間で生じ、漿液流出および出血を引き起こすことになる。

脈絡膜新生血管は、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）、ＲＰＥ細胞、および単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などの炎症細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ）が発生させると知られている。ＷｅｔＡＭＤに対する治療としては、２００５年頃から始まった抗ＶＥＧＦ抗体（ａｎｔｉ‐ＶＥＧＦａｎｔｉｂｏｄｙ）の使用により、多くの患者での失明を減少させている。このような薬剤の使用は、脈絡膜新生血管の発生においてＶＥＧＦが主な役割をすると知られているからである。しかし、抗ＶＥＧＦ抗体の使用は、脈絡膜新生血管の形成および成長を完璧に抑制することはできず、特に、脈絡膜新生血管が生じる網膜の中央部である中心窩部位の光受容細胞は、下に存在するＲＰＥ組織の崩壊により、結局、数年の時間が経過するとその機能を失うことになる。また、抗ＶＥＧＦ抗体を使用しても、脈絡膜新生血管の表面に存在する内皮細胞にのみ作用するため、脈絡膜新生血管のサイズは減少されず、増加し続ける。

このような背景下で、脈絡膜新生血管の発生に関与する種々の信号伝逹体系のうちＶＥＧＦ経路以外の経路を対象とする薬剤の開発が必ず必要であるといえる。近年、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社では、抗ＶＥＧＦ抗体が効果的に血管内皮細胞に作用することを妨害する主原因と考えられるペリサイト（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）を脈絡膜新生血管の内皮細胞から分離させ、抗ＶＥＧＦ抗体が内皮細胞とより十分に結合するようにすることで薬剤の効果を高めるという目的で、抗ＰＤＧＦ効果を有する薬剤を開発している。

一方、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、細胞の増殖とオートファジーにおいて重要な役割を担っており、悪性腫瘍の治療で潜在的なターゲットとされているため、多くの研究者らによって治療剤の開発が進んでいる。主に、ｍＴＯＲの作用を抑制させて細胞の増殖を抑え、オートファジーを活性化させることを目的として用いられている。

そこで、本発明者らは、黄斑変性を治療するにあたり、抗ＶＥＧＦ抗体による効果では期待されない新しい機序の薬剤開発ターゲットを開発するために鋭意努力した結果、レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルをｍＴＯＲ阻害剤で処理する場合、黄斑変性の病変のサイズが減少することを確認し、本発明を成すに至った。

本発明の目的は、新しい機序の薬剤開発ターゲットを有する黄斑変性治療用薬学組成物を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物を提供する。

本発明はまた、配列番号１の塩基配列で表されるｍＴＯＲ阻害能を有するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）が導入されている組換えベクターを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物を提供する。

本発明はまた、配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡを患者に投与することを特徴とする黄斑変性の治療方法を提供する。

本発明はまた、配列番号１の塩基配列で表されるｍＴＯＲ阻害能を有するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）が導入されている組換えベクターを患者に投与することを特徴とする黄斑変性の治療方法を提供する。

レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、ｓｈＲＮＡを投与した後、脈絡膜新生血管の蛍光漏出が減少したことを蛍光眼底血管造影により確認したものであって、（Ａ）は、黄斑変性誘導、ｓｈＲＮＡ投与、および蛍光眼底血管造影のスケジュールを示した図であり、（Ｂ‐Ｄ）は、ｓｈＲＮＡ投与前の蛍光眼底血管造影の結果を示した図であり、（Ｅ‐Ｇ）は、ｓｈＲＮＡ投与後の蛍光眼底血管造影の結果を示した図である。ｓｃＡＡＶベクターを硝子体内に注入した後、該ベクターが導入された細胞およびｍＴＯＲの発現変化を示した写真であって、（ａ）はベクターが導入された細胞を示した図であり、（ｂ）はｍＴＯＲの発現変化を示した図である。レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、ｓｈＲＮＡを投与した後、ＣＤ３１の発現変化を確認したものであって、（ａ）および（ｂ）は、網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本で確認した写真（ａ）およびグラフ（ｂ）であり、（ｃ）は、神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本で確認した写真である。レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、ｓｈＲＮＡを投与した後、炎症細胞の変化を確認したグラフであって、（ａ）はＣＤ１１ｂ陽性細胞を示し、（ｂ）はＦ４／８０陽性細胞を示した図である。レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、ｓｈＲＮＡを投与した後、オートファジーの変化を確認した写真であって、（ａ）はＬＣ３Ｂ陽性細胞を示し、（ｂ）はＡＴＧ７陽性細胞を示した図である。レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、ｓｈＲＮＡを投与した後、細胞死滅の変化を確認した写真（ａ）およびグラフ（ｂ）である。

本発明では、網膜色素上皮細胞層の機能低下および老化による萎縮により発生する加齢黄斑変性を、既存の抗ＶＥＧＦ抗体を用いた方法による新生血管抑制機序以外の他の機序で治療しようとしており、細胞増殖とオートファジーにおいて重要な役割を担うタンパク質であるｍＴＯＲの作用を抑える場合、黄斑変性の治療効果があるかを確認した。そのために、レーザー誘発黄斑変性動物モデルをｓｈＲＮＡベースのｍＴＯＲ阻害剤で処理する場合、治療群で有意な病変のサイズ減少を確認した。

したがって、一観点において、本発明は、配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物に関する。

本発明による配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡは、ｍＴＯＲの阻害剤として作用するｓｉＲＮＡであって、ｍＴＯＲの阻害により、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）で脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の形成に関与する種々の炎症細胞の流入および増殖が遮断可能であると考えられる。このようなことは、抗ＶＥＧＦ抗体によっては奏することができない効果であって、新しい機序の薬剤開発ターゲットとなり得る。ｍＴＯＲの阻害により、脈絡膜新生血管のさらに他の主構成員である血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）の増殖を抑えるだけでなく、オートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を活性化させる。また、神経網膜組織に存在する神経細胞の細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を改善する。

本発明で用いられるｓｈＲＮＡの配列は、次の通りである:
配列番号１: GAAUGUUGACCAAUGCUAU。

本発明で用いられるｓｈＲＮＡベースのｍＴＯＲ阻害剤は、最初の開発時に、悪性腫瘍の細胞でオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の活性化を媒介することが知られ、本発明では、黄斑変性動物モデルから、オートファジーの活性化を病変および病変周囲で確認した。

本発明の一態様では、レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、治療していない生理食塩水対照群および非特異的ｓｈＲＮＡ対照群と比較したときに、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡ実験群では有意な病変のサイズ減少が確認され、黄斑変性に対する治療効果が確認された（図１および図３）。

本発明の他の態様では、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡを投与した脈絡膜新生血管病変の周囲で炎症細胞の数が減少し、細胞死滅も減少することを確認した。これは、ｓｈＲＮＡベースのｍＴＯＲの阻害が、単に脈絡膜新生血管のサイズを減少させる機能の他に、炎症反応の改善および周辺神経網膜組織に存在する神経細胞の死滅化過程を改善する結果を示すことを意味する（図４および図６）。

本発明で用いられるｓｉＲＮＡは、当業界で公知のＲＮＡ分子の製造方法により製造可能である。ＲＮＡ分子の製造方法としては、化学的合成方法および酵素的方法が使用できる。例えば、ＲＮＡ分子の化学的合成としては、文献に開示の方法を用いてよく(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999)、ＲＮＡ分子の酵素的合成としては、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのようなファージＲＮＡポリメラーゼを用いる方法が文献に開示されている(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180: 51-62, 1989)。

本発明において、ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを伝達するのに有用なウイルスまたはベクターとしては、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科などがあるが、これに制限されない。

本発明によるｍＴＯＲ標的ｓｉＲＮＡを薬学組成物として用いる場合には、薬学組成物の製造時に通常用いる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。

本発明で使用可能な担体、賦形剤または希釈剤としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油が挙げられる。

前記組成物は、各々通常の方法により剤形化できるが、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いられる。

製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調製される。

また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれてもよい。

非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ)、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール(ｗｉｔｅｐｓｏｌ)、マクロゴール、ツイン(ｔｗｅｅｎ) ６１、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が使用されてもよい。

前記組成物の使用量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得るが、０．１〜２．０ｍｇ/ｋｇの量を１日１回または数回に分けて投与してもよい。

また、このような組成物の投与量は、投与経路、疾患の重症度、患者の性別、体重、年齢などによって増減可能であるため、前記投与量が、どの面からでも本発明の範囲を限定するものではない。

前記組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒト等のほ乳動物に多様な経路で投与でき、投与の全ての方式は予想され、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内(intracerebroventricular)の注射によって投与されてもよい。

他の観点において、本発明は、配列番号１の塩基配列で表されるｍＴＯＲ阻害能を有するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）が導入されている組換えベクターを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物に関する。

さらに他の観点において、本発明は、配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡまたは配列番号１の塩基配列で表されるｍＴＯＲ阻害能を有するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）が導入されている組換えベクターを患者に投与することを特徴とする黄斑変性の治療方法に関する。

本発明において、ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを伝達するのに有用なウイルスとしては、アデノ付随ウイルス（ＡｄｅｎｏＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ、ＡＡＶ）を用いることが最も好ましい。アデノ付随ウイルスは、免疫反応と細胞毒性を殆ど誘発しない。特に、アデノ付随ウイルス血清型２（ｓｅｒｏｔｙｐｅ２）は、ＣＮＳの神経細胞への効率的な遺伝子伝達が可能であり、また、神経系で形質転換遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を効果的に長期間発現することができる。

本発明において、ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを伝達するのに有用な非ウイルスベクターとしては、上述のウイルスベクターを除いた遺伝子療法で通常用いられる全てのベクターを含み、例えば、真核細胞で発現可能な種々のプラスミドおよびリポソームなどが挙げられる。

また、本発明において、ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡを伝達するのに有用な非ウイルスベクターとしては、上述のウイルスベクターを除いた遺伝子療法で通常用いられる全てのベクターを含み、例えば、真核細胞で発現可能な種々のプラスミドおよびリポソームなどが挙げられる。

一方、本発明において、ｍＴＯＲを標的とするｓｉＲＮＡは、伝達された細胞で適切に転写されるように、少なくともプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。前記プロモーターとしては、真核細胞で機能できるプロモーターであれば何れもよいが、ヒトＨ１ポリメラーゼ‐ＩＩＩプロモーターがより好ましい。ｍＴＯＲを標的とするｓｉＲＮＡの効率的な転写のために、必要に応じて、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー、アップストリーム活性化配列、信号ペプチド配列、および転写終止因子を始めとする調節配列をさらに含んでもよい。

［実施例］
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：レーザー誘発脈絡膜血管新生（ｌａｓｅｒ‐ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ、ＣＮＶ）黄斑変性モデルの作製
加齢黄斑変性動物モデルを樹立するために、動物の眼球にレーザー施術して脈絡膜新生血管を誘導した。８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（オス）を４０ｍｇ／ｋｇのゾラゼパム／チレタミン（ｚｏｌａｚｅｐａｍ／ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ）および５ｍｇ／ｋｇのキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）で麻酔させた後、０．５％のトロピカミド（ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）および２．５％のフェニレフリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）で瞳孔を拡張した。脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を誘導するために、ＰＡＳＣＡＬｄｉｏｄｅｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｌａｓｅｒｓｙｓｔｅｍ (Nd:YAG, 532nm, Topcon Medical Laser Systems, Inc., Santa Clara, CA, USA)を用いてマウスの右眼にレーザー光凝固化（ｌａｓｅｒｐｈｏｔｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、ＬＰ）を起こした。視神経円板（ｏｐｔｉｃｎｅｒｖｅｈｅａｄ）の周りにおける５個または６個の点にレーザーを照射した後、レーザーの照射点で気泡が生成されることから、ブルッフ膜の破裂を確認した。脈絡膜新生血管の形成は、図１のＢ‐Ｄに示されたように、レーザーの照射５日後に、蛍光眼底血管造影により確認することができた。

実施例２：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡの導入およびそれによるｍＴＯＲ発現阻害の確認
２‐１：ｓｃＡＡＶベクターの作製およびその硝子体内への注入
本実施例では、ｓｃＡＡＶ２（ｓｅｌｆ‐ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ２ｖｅｃｔｏｒ）に由来のベクターを使用した。麻酔状態でレーザー光凝固化を誘導し、６日後にマウスの右眼の瞳孔を拡張してからベクターを硝子体内に注入した。ベクターの注入では、太さ３５ゲージであって先端が丸くなっている針付きのナノフィル注射器を使用し、５．０ｘ１０^１０ｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅｓ（ｖｇ）／ｍｌの濃度で１μｌを注入した。表１に示されたように、脈絡膜新生血管が形成されたマウスを１５匹ずつ３つのグループに分け、生理食塩水、非特異ｓｈＲＮＡ、または配列番号１のｍＴＯＲｓｈＲＮＡを硝子体内に注入した。５匹のマウスは、脈絡膜血管新生と硝子体内への注入を行わず、陰性対照群として使用した。

２‐２：ｓｃＡＡＶベクター導入細胞の確認
硝子体内に注入されたｓｃＡＡＶベクターが、どのような種類の細胞に導入されたかを確認するために、ＧＦＰをコードする遺伝子が挿入されたｓｃＡＡＶベクターを使用した。実施例２‐３に記載のように凍結切片標本を作製し、抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いてＧＦＰ発現を調査した結果、ｉｎｎｅｒｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌｓだけでなく、ＣＤ３１陽性血管内皮細胞で発現することが示された（図２（ａ））。ｓｃＡＡＶベクターは、野生型マウスの網膜の場合、網膜神経節細胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌ）および内顆粒層（ｉｎｎｅｒｎｕｃｌｅａｒｌａｙｅｒ）に位置した細胞を含んでｉｎｎｅｒｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌに導入されると知られているが（ＬｅｅＳＨｅｔａｌ．，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓ２５：１５９‐６１，２０１５）、レーザー誘発脈絡膜新生血管が形成される場合には、ｓｃＡＡＶベクターがＣＤ３１陽性血管内皮細胞にも導入されることが示された。これは、黄斑変性が発生した場合、ｓｃＡＡＶベクターを用いて血管内皮細胞をターゲットとした治療が可能であるということを意味する。

２‐３：組織標本の作製
免疫蛍光染色のための組織標本の作製は、次のような順序を経た。動物を麻酔した後、１５０Ｕ／ｍｌのヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）が含有された０．１ＭのＰＢＳを心臓を貫通して貫流させ、次いで４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）／０．１ＭのＰＢを流した。固定された眼球を摘出した後、角膜および水晶体が含まれた前眼部（ａｎｔｅｒｉｏｒｓｅｇｍｅｎｔ）を除去した。このように作製された神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本を４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｍａｌｄｅｈｙｄｅ）／０．１ＭのＰＢでさらに固定した。凍結切片標本を作製するために、固定された組織を３０％のスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）／ＰＢＳに移し、浸された状態で一晩置いた。その後、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ(Sakura Finetek, Torrance, CA)に陥凹させた凍結状態で、厚さ１０μｍの矢状切断（ｓａｇｉｔｔａｌｓｅｃｔｉｏｎ）切片を作製し、顕微鏡用スライドに付着した。

２‐４：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるｍＴＯＲ発現阻害の確認
配列番号１のｍＴＯＲｓｈＲＮＡが挿入されたｓｃＡＡＶベクターを硝子体内に注入した後、ｍＴＯＲの発現を調査した。ｍＴＯＲの発現は、実施例２‐３に記載のように作製された凍結切片標本に、抗ｍＴＯＲ抗体（１：２００；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｉｓ、ＭＮ、ＡＦ１５３７１）を用いて免疫蛍光染色した。レーザーが照射されていない陰性対照群ではｍＴＯＲの発現が観察されないが、レーザーの照射により脈絡膜新生血管が形成された場合には、神経網膜（ｎｅｕｒａｌｒｅｔｉｎａ）および網膜下（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ）部位でその発現が増加することが示された。このｍＴＯＲの発現は、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡによっては変わらないが、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによって減少することが示され、前記配列がｍＴＯＲの発現阻害において効果的であるということが確認された（図２）。

実施例３：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡの黄斑変性に対する治療効果の確認
配列番号４のｍＴＯＲｓｈＲＮＡが、黄斑変性動物モデルで治療効果を示すかを調べるために、脈絡膜新生血管黄斑変性動物モデルで、実施例２に記載のようにｍＴＯＲｓｈＲＮＡが挿入されたｓｃＡＡＶベクターを硝子体内に注入し、ｓｈＲＮＡによる治療効果を実施例３‐１〜３‐５で確認した。

３‐１：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによる脈絡膜新生血管の蛍光漏出減少効果の確認
蛍光眼底血管造影（ＦｕｎｄｕｓＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＡｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ、ＦＦＡ）により、脈絡膜新生血管の蛍光漏出を測定した。蛍光眼底血管造影では、走査型レーザー検眼鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇｌａｓｅｒｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ）(Heidelberg Retina Angiograph 2; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)機器を使用した。麻酔状態のマウスに、２％のフルオレセインナトリウム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｏｄｉｕｍ）０．１ｍｌを腹腔内に注入し、３〜５分待ってから瞳孔を散瞳させた後、ＦＦＡ画像を得た。脈絡膜新生血管が十分に形成されたことをレーザー照射５日後に確認し、その後、実施例２‐１に記載のように硝子体内にｓｃＡＡＶ‐ｍＴＯＲｓｈＲＮＡを注入して７日後（レーザー照射１３日後）に、治療効果を検査した。図１に示されたように、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡ処理時には、病変部位における蛍光漏出の変化がなかったが、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡ処理時には蛍光漏出が減少することが示され、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるｍＴＯＲの阻害が、黄斑変性の治療において有効であることが確認された。

３‐２：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによる血管成長阻害の確認
ｍＴＯＲｓｈＲＮＡが脈絡膜新生血管の形成に与える影響を確認するために、血管内皮細胞を選択的に確認することができる抗ＣＤ３１抗体(1:200; BD Pharmingen, Inc., San Diego, CA, 550274)を用いて血管内皮細胞を観察した。免疫蛍光染色のための組織標本の作製では、次のような順序を経た。動物を麻酔した後、１５０Ｕ／ｍｌのヘパリンが含有された０．１ＭのＰＢＳを心臓を貫通して貫流させ、次いで４％のパラホルムアルデヒド／０．１ＭのＰＢを流した。固定された眼球を摘出した後、角膜および水晶体が含まれた前眼部（ａｎｔｅｒｉｏｒｓｅｇｍｅｎｔ）を除去した。網膜色素上皮細胞層組織標本（ＲＰＥｗｈｏｌｅｍｏｕｎｔ）を作製するために、神経網膜（ｎｅｕｒａｌｒｅｔｉｎａ）をさらに除去して網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体を製作し、４％のパラホルムアルデヒド／０．１ＭのＰＢでさらに固定した。また、神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本を作製するために、前眼部を除去し、神経網膜が付着された状態で４％のパラホルムアルデヒド／０．１ＭのＰＢでさらに固定した。このように作製された網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体または神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体は、凍結切片標本を作製するために、３０％のスクロース／ＰＢＳに移し、浸された状態で一晩置いた後、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に陥凹させて凍結状態で、厚さ１０μｍの矢状切断（ｓａｇｉｔｔａｌｓｅｃｔｉｏｎ）切片を製作し、顕微鏡用スライドに付着した。

網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体切片を抗ＣＤ３１抗体とファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, A22287)で染色した結果、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡを注入した場合に比べて、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによって脈絡膜新生血管領域が有意に減少することが示され（図３）、神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体切片を調査した結果でも、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡが導入され、ＧＦＰを発現する細胞のうちＣＤ３１陽性細胞が減少したことが確認された（図３）。

これは、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡが血管内皮細胞に作用して血管成長を阻害し、黄斑変性治療において効果を奏することを示唆する。

３‐３：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによる抗炎症効果の確認
ｍＴＯＲの阻害による黄斑変性の改善が、炎症細胞活性の調節により起こることであるかを調べるために、マクロファージおよび単核球を選択的に染色する抗ＣＤ１１ｂ抗体(1:200; Serotec, Oxford, UK, MCA711G) および抗Ｆ４／８０抗体(1:200; Serotec, Oxford, UK, MCA497GA)を用いて網膜の横断面を染色した。免疫蛍光染色のための組織標本の作製にあたっては、実施例３‐２に記載のように神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本を作製した。

マクロファージおよび単核球の細胞数の測定時には、５個の網膜横断面切片でＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０陽性細胞を計数した。数値は平均値±平均の標準誤差として算術し、ＳＰＳＳソフトウェア(ver. 20.0 for Windows; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)を用いて統計分析(Kruskal-wallis test, posthoc analysis, Bonferroni's mehtod)して、ｐ＜０．０５を基準として有意なレベルを判断した。

網膜下および網膜内で観察されるＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０陽性染色細胞の数を測定した結果、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡを注入した場合に比べて、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡの場合に有意に減少していることが示された。すなわち、網膜に流入されたＦ４／３０陽性炎症細胞の数は、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡの注入時に８４．４±１７または８２．８±１０．０であったが、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡの注入時に４２．４±１０．４に減少し、ＣＤ１１ｂ陽性炎症細胞の数も、１２３．８±１３．０または１２７．６±１４．４から９０．０±１１．６に減少したことが示された（図４）。

これは、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるｍＴＯＲの阻害が、炎症細胞の網膜内流入および増殖を減少させることで、黄斑変性に対する治療効果を奏するということを意味する。

３‐４：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）増加の確認
ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによって脈絡膜新生血管の病変が減少することに、オートファジーが関与するかを調べるために、オートファジーを選択的に確認することができる抗ＬＣ３抗体(1:200; Novus Biologicals, Littleton, CO, NB110-2220) および抗ＡＴＧ７抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。免疫蛍光染色のための組織標本の作製は、実施例３‐２に記載の神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本の作製過程に従って行った。その結果、生理食塩水または非特異的ｓｈＲＮＡを注入した場合、ＬＣ３ＢまたはＡＴＧ７陽性細胞が観察されなかったが、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡを注入した場合には病変部位および周りで観察され、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによってオートファジーが増加することが示された（図５）。

これは、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるｍＴＯＲの阻害がオートファジーを増加させることで、黄斑変性に対する治療効果を奏するということを意味する。

３‐５：ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによる細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）減少
レーザー誘発脈絡膜新生血管でｍＴＯＲｓｈＲＮＡが細胞死滅に与える影響を調査するために、ＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌｄＵＴＰｎｉｃｋ‐ｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ）を行った。免疫蛍光染色のための組織標本の作製は、実施例３‐２に記載の神経網膜‐網膜色素上皮‐脈絡膜の複合体組織標本の作製過程に従って行った。レーザー照射１４日後に観察した結果、生理食塩水、非特異ｓｈＲＮＡ、およびｍＴＯＲｓｈＲＮＡを処理した全ての対象群で、ＴＵＮＥＬ陽性細胞がｏｕｔｅｒｎｕｃｌｅａｒｌａｙｅｒ（ＯＮＬ）およびＣＮＶで発見された。生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡを注入した場合に比べてｍＴＯＲｓｈＲＮＡの場合に、ＯＮＬ領域でＴＵＮＥＬ陽性細胞が有意に減少していることが示された。すなわち、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は、生理食塩水または非特異ｓｈＲＮＡの注入時に１７．８±４．８または１９．４±４．０であったが、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡの注入時に８．４±３．０に減少していることが示された（図６）。

これは、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡによるｍＴＯＲの阻害が、ｏｕｔｅｒｎｕｃｌｅｒａｌａｙｅｒに位置した細胞を減少させることで、黄斑変性に対する治療効果を奏するということを意味する。

まとめると、図１および図３に示されたように、レーザー誘発脈絡膜血管新生黄斑変性モデルで、治療をしていない生理食塩水対照群および非特異的ｓｈＲＮＡ対照群と比較した時に、ｍＴＯＲｓｈＲＮＡ実験群では有意な病変のサイズ減少が確認され、黄斑変性に対する治療効果が確認された。

また、図４および図６に示されたように、脈絡膜新生血管病変の周囲で炎症細胞の数が減少し、細胞死滅も減少することが、２つの対照群と比較して観察された。これは、ｓｈＲＮＡベースのｍＴＯＲの阻害が、単に脈絡膜新生血管のサイズを減少させる機能の他に、炎症反応の改善、および周辺神経網膜組織に存在する神経細胞の死滅化過程を改善する結果を示すということを意味する。

本発明によると、成人失明の原因となる代表的な網膜疾患である加齢黄斑変性を効果的に治療することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
本発明は一態様において、下記を提供する。
［項目１］
配列番号１の塩基配列で表されるｓｉＲＮＡを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物。
［項目２］
配列番号１の塩基配列で表されるｍＴＯＲ阻害能を有するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）が導入されている組換えベクターを含有する、黄斑変性の治療または予防用薬学組成物。
［項目３］
前記組換えベクターは、ＡＡＶであることを特徴とする項目２に記載の黄斑変性の治療または予防用薬学組成物。

Claims

ｍＴＯＲ阻害能部位を含み、配列番号１の塩基配列で表されるｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ‐ｍＴＯＲ）がＡＡＶベクターに導入されている組換えベクターを含有する、硝子体内注射用黄斑変性の治療または予防用薬学組成物。
前記組換えベクターは、ｓｃＡＡＶ２ベクターであることを特徴とする請求項１に記載の硝子体内注射用黄斑変性の治療または予防用薬学組成物。