JP6935049B2

JP6935049B2 - Ｘ連鎖性網膜色素変性症の治療のためのｒｐ２及びｒｐｇｒベクター

Info

Publication number: JP6935049B2
Application number: JP2017547425A
Authority: JP
Inventors: ウー、ジジャン; スワループ、アナンド; マッカージー、スッドハジル; ヒリヤンナ、スージャー
Original assignee: Government of the United States of America
Current assignee: Government of the United States of America
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2021-09-15
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: WO2016145345A1; AU2016228751B2; EP3268481B1; EP3268481A1; CA2979229A1; EP3268481A4; US20200289670A1; EP3719134A1; US20180043035A1; JP2018509154A; US11617801B2; US10646588B2; JP2021019611A; EP3719134B1; AU2016228751A1

Description

関連出願
本特許出願は、２０１５年３月１１日に出願された米国仮特許出願第62/131,661号の利益を主張する。参照することにより、その全体が本明細書に援用される。

電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出され、コンピューターで読み取り可能な以下のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により、本明細書に援用される：２０１６年３月１１日付けの「723551_ST25.txt」という名前の77,632バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件

Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）は、Ｘ連鎖性であり、光受容器細胞の進行性喪失によって特徴づけられる遺伝性の網膜変性症であり、視力障害又は失明に繋がる。ＸＬＲＰは、錐体細胞の死滅が後に続く、桿体光受容器の死滅を含んでも良い。結果として、ＸＬＲＰ患者は通常、夜盲症の早期発症を経験し、周辺の視野が徐々にではあるが進行的に喪失し、中心視野が最終的に喪失する。現在、ＸＬＲＰの治療法はない。従って、ＸＬＲＰを治療するための組成物や方法に対するニーズが存在する。

発明の簡易な説明
本発明の一実施形態は、（ａ）ＲＰ２又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列及び（ｂ）ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）又はその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。

本発明の別の実施形態では、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ここで（ｉ）前記ベクターは、ＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロン及び／又はヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナルをさらに含み；及び
（ｉｉ）ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列が、任意でロドプシン・キナーゼ・プロモーターの転写調節下にある。

本発明の追加的な実施形態では、関連する医薬組成物、及びＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターを作製する方法を提供する。

本発明の別の実施形態では、治療又は予防を必要とする哺乳動物において、Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）の治療又は予防方法を提供し、前記方法は、哺乳動物におけるＸＬＲＰを治療又は予防するための有効量で、本発明のベクター又は医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む。

本発明のさらに別の実施形態では、哺乳動物の網膜における光受容器数を増加させる方法を提供し、前記方法は、哺乳動物の網膜における光受容器数を増加させるための有効量で、本発明のベクター又は医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む。

発明の詳細な説明
本発明の実施態様によれば、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターは、ＸＬＲＰのマウスモデルにおいて光受容器の機能及び生存（viability）を効果的に維持したことを発見している。

ＸＬＲＰ患者の約１５％が、網膜色素変性症２（ＲＰ２）遺伝子に変異を有する。ヒトＲＰ２遺伝子は５つのエキソンを有し、３５０アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ＲＰ２タンパク質は、アルギニン・アデノシン−５’−ジホスホリボシル化（ＡＤＰリボシル化）因子様３（ＡＲＬ３）、光受容器の結合繊毛に位置する微小管関連小ＧＴＰアーゼにとっての、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）である。ヒトＲＰ２タンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の例は、配列番号１のヌクレオチド配列である。ヒトＲＰ２タンパク質をコードするタンパク質配列の例は、配列番号２のアミノ酸配列である。

本発明の一実施形態は、（ａ）ＲＰ２又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）ＡＡＶ２ＩＴＲ又はその機能的断片、を含む核酸を含むＡＡＶベクターを提供する。ＲＰ２をコードするヌクレオチド配列は、任意の種に由来するＲＰ２をコードする任意の適したヌクレオチド配列である場合がある。好ましい実施形態においては、ＲＰ２はヒトＲＰ２である。本発明の一実施形態においては、ヒトＲＰ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ヒトＲＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態においては、ヒトＲＰ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

ＸＬＲＰ患者の約７５％は、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子に突然変異を有する。複数のＲＰＧＲ転写産物が、網膜において検出されている。疾患を引き起こす変異の大部分は、網膜において発現しているＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５変異体アイソフォームにおいて、検出されている。ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質は、桿体及び錐体の光受容器の両方において、中心体−繊毛タンパク質と相互作用し、結合繊毛に局在する。野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の例は、配列番号２７のヌクレオチド配列である。野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質をコードするタンパク質配列の例は、配列番号４のアミノ酸配列である。野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の機能的変異体をコードするｃＤＮＡ配列の例は、配列番号３のヌクレオチド配列である。野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の機能的変異体をコードするタンパク質配列の例は、配列番号２５のアミノ酸配列である。

本発明の別の実施形態は、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む、ＡＡＶベクターを提供し、
（ｉ）前記ベクターは、ＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロン及び／又はヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナルをさらに含み；及び
（ｉｉ）ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードする前記ヌクレオチド配列は、任意で、ロドプシン・キナーゼ・プロモーターの転写調節下にある。本発明の一実施形態においては、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む、前記ＡＡＶベクターは、（ｉ）ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードする前記ヌクレオチド配列は、ロドプシン・キナーゼ・プロモーターの転写調節下にあり、及び／又は、（ｉｉ）前記ベクターは、ＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロン及び／又はヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナルをさらに含む。野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードする前記ヌクレオチド配列は、任意の生物種に由来する野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードする、任意の適したヌクレオチド配列である場合がある。好ましい実施形態においては、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５は、ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５である。本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列を含む野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体をコードする、任意の適したヌクレオチド配列である場合がある。好ましい実施形態においては、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体は、ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体である。本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。以降、野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５及び野生型ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体は、別段の記載がない限り、まとめて「ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５」として参照する。

前記ＡＡＶベクターは、眼の細胞に投与するために適した、任意のＡＡＶ血清型又はその変異体にパッケージする（packaging into）ために適している場合がある。適したＡＡＶ血清型の例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びそれらの任意の変異体が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ８又はＡＡＶ９にパッケージされる。

前記ＡＡＶベクターは、本明細書に記載の、いずれかのＡＡＶ血清型のキャプシド・タンパク質又はその断片に、パッケージされる場合がある。好ましくは、前記ベクターは、ＡＡＶ８のキャプシドにパッケージされる。本発明の一実施形態においては、ＡＡＶ８のキャプシドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

適した組換え体ＡＡＶは、本明細書において定義されるように、ＡＡＶ血清型キャプシド・タンパク質又はその断片をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、本明細書に記載の任意の本発明のベクター、及びＡＡＶキャプシド・タンパク質に本発明のベクターをパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能、を含有するパッケージング細胞を培養することによって生成しても良い。ＡＡＶキャプシドに本発明のＡＡＶベクターをパッケージするためにパッケージング細胞が必要とする要素を、宿主細胞にin transで提供しても良い。代替的には、必要とする要素（例えば、本発明のベクター、ｒｅｐ配列、キャプシド配列及び／又はヘルパー機能）の任意の１以上は、当業者に公知である方法を用いて、必要とされる要素の１以上を含有するように操作されている、適したパッケージング細胞によって提供される場合がある。

本発明の一実施形態においては、前記ＡＡＶベクターは、自己相補的である。自己相補的であるベクターは、有利に、２本目のＤＮＡ鎖を合成する律速的な段階を克服し、遺伝子発現のより早期の開始及びより強力な遺伝子発現をもたらし得る。好ましくは、ＲＰ２をコードするヌクレオチド配列を含む前記ＡＡＶベクターは、自己相補的である。一実施形態においては、前記ベクターは、一本鎖ＤＮＡを含む。

本明細書において用いられる場合、「核酸」としては、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」が挙げられ、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、天然の供給源から合成又は取得（例えば、単離及び／又は精製）でき、天然、非天然又は改変したヌクレオチドを含み得、天然のヌクレオチド間結合、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見られるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミダイト結合又はホスホロチオエート結合のような、非天然又は改変したヌクレオチド間結合を含み得る。一般的に、好ましくは、前記核酸は、任意の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含まない。しかし、本明細書において検討されるように、前記核酸にとって、１以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが、いくつかの例においては適する場合がある。

一実施形態においては、本発明の核酸は組換え体である。本明細書において用いられる場合、用語「組換え体」は、（ｉ）生細胞において複製し得る核酸分子に、天然の又は合成した核酸断片を連結することにより（by joining）、生細胞の外側で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載のものの複製の結果得られる分子を指す。本明細書の目的のために、前記複製は、in vitroでの複製又はin vivoにおける複製であり得る。

前記核酸は、当該技術分野において公知である手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的なライゲーション反応に基づいて構築し得る。例えば、Greenら編、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4^th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)を参照。例えば、核酸は、天然で生じたヌクレオチド、又は前記分子の生物学的安定性を増強するように、若しくはハイブリダイゼーションの際に形成された二重鎖の物理的安定性を増強するように（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）設計された、様々な修飾されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成し得る。前記核酸の生成に用い得る修飾されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、５−ブロモウラシル（5-bromouracil）、５−クロロウラシル（5-chlorouracil）、５−ヨードウラシウル（5-iodouracil）、ヒポキサンチン（hypoxanthine）、キサンチン（xanthine）、４−アセチルシトシン（4-acetylcytosine）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル（5-(carboxyhydroxymethyl) uracil）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine）、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル（5-carboxymethylaminomethyluracil）、ジヒドロウラシル（dihydrouracil）、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン（inosine）、Ｎ^６−イソペンテニルアデニン（N⁶-isopentenyladenine）、１−メチルグアニン（1-methylguanine）、１−メチルイノシン（1-methylinosine）、２，２−ジメチルグアニン（2,2-dimethylguanine）、２−メチルアデニン（2-methyladenine）、２−メチルグアニン（2-methylguanine）、３−メチルシトシン（3-methylcytosine）、５−メチルシトシン（5-methylcytosine）、Ｎ^６−置換アデニン（N⁶-substituted adenine）、７−メチルグアニン（7-methylguanine）、５−メチルアミノメチルウラシル（5-methylaminomethyluracil）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル（5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil）、β−Ｄ−マンノシルクェオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル（5'-methoxycarboxymethyluracil）、５−メトキシウラシル（5-methoxyuracil）、２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンテニルアデニン（2-methylthio-N⁶-isopentenyladenine）、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）（uracil-5-oxyacetic acid (v)）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル（pseudouracil）、キューオシン（queosine）、２−チオシトシン（2-thiocytosine）、５−メチル−２−チオウラシル（5-methyl-2-thiouracil）、２−チオウラシル（2-thiouracil）、４−チオウラシル（4-thiouracil）、５−メチルウラシル（5-methyluracil）、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル（3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil）及び２，６−ジアミノプリン（2,6-diaminopurine）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、本発明の前記核酸の１以上は、Macromolecular Resources（Fort Collins, CO）及びSynthegen（Houston, TX）のような企業から購入し得る。

本発明の一実施形態においては、前記ベクターは組換え発現ベクターである。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」は、宿主細胞によってｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド・コンストラクトを意味する。前記コンストラクトが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むとき、前記ベクターを、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを細胞内において発現させるのに十分な条件下で、細胞と接触させる。本発明のベクターは、全体として自然に存在した物でない。しかし、ベクターの一部については、自然に存在した物であり得る。本発明の組換え発現ベクターは、任意の型のヌクレオチドを含み得、一本鎖又は二本鎖であり、合成されたか又は部分的に自然のソースから得られ、及び天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含み得る、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、これらに限定されない。組換え発現ベクターは、天然で生じたヌクレオチド間の結合、非天然で生じたヌクレオチド間の結合又は両方の型の結合を含み得る。好ましくは、非天然で生じたか、又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間の結合は、ベクターの転写又は複製を妨げない。

本発明の組換え発現ベクターは、例えば、Greenら（上記）に記載された標準的な組換えDNA技術を用いて、調製し得る。発現ベクターのコンストラクトは、環状又は直鎖状であり、原核又は真核の宿主細胞において機能的である複製システムを含有するよう調製し得る。複製システムは、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシ・パピローマ・ウイルス等に由来し得る。

組換え発現ベクターは、１以上のマーカー遺伝子を含み得、形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を付与するための栄養要求性宿主における相補性等が挙げられる。本発明の発現ベクターにとって適したマーカー遺伝子としては、例えばネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

前記ベクターは、ベクターでトランスフェクトしたか、又はベクターを含むウイルスを感染させた細胞において、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の転写、翻訳及び発現のうちの１以上を可能にする様式で、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列に作動可能なようにつながれた調節配列を、さらに含んでも良い。本明細書において用いられる場合、「作動可能につながれた」配列としては、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列と隣接する調節配列、及びＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列を調節するために、in trans又は少し離れて作用する調節配列の両方が挙げられる。

前記調節配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列のようなＲＮＡプロセッシング・シグナル、細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を促進する配列（即ち、コザック・コンセンサス配列）、タンパク質の安定性を促進する配列、及び所望により、コードされた産物の分泌を促進する配列、を含んでもよい。ポリＡシグナル配列は、合成しても良く、又は、例えば、ＳＶ−４０、ヒト及びウシを含む、多くの適切な生物種に由来しても良い。好ましくは、該ベクターは全長又はトランケートされた（truncated）ヒトβグロビン・ポリＡシグナル配列を含む。本発明の一実施形態においては、ヒトβグロビン・ポリＡシグナル配列は、配列番号６（全長）又は配列番号７（トランケート）のヌクレオチド配列を含む。

前記調節配列はまた、イントロンを含んでも良い。好ましくは、イントロンは、プロモーター配列及びＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列の間に位置する。適したイントロン配列の例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／ヒトβグロビン・イントロン及びＳＶ−４０由来のイントロン（ＳＤ−ＳＡとして参照する）が挙げられる。好ましくは、イントロンはＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロンである。本発明の一実施形態においては、ＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロンは、配列番号８又は９のヌクレオチド配列を含む。

前記調節配列はまた、プロモーターを含んでも良い。プロモーターは標的細胞、例えば眼の細胞において、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５を発現するために適した任意のプロモーターであっても良い。プロモーターは誘導的又は構成的であっても良い。本発明の一実施形態においては、プロモーターは、特定の眼の細胞の種類において、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５を発現するために適している。この点、プロモーターは細胞特異的であっても良い。例えば、プロモーターは、眼の細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容器細胞の任意の１以上においてか、桿体においてか、又は錐体細胞においての発現にとって特異的であっても良い。適したプロモーターの例としては、ヒトＧタンパク質共役受容体タンパク質キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（ヒト・ロドプシン・キナーゼ・プロモーターとしても参照する)、ヒト光受容器間レチノイド結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーター、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のネイティブ・プロモーター、ＲＰＧＲ近位プロモーター、桿体オプシン・プロモーター、赤及び緑オプシン・プロモーター、青オプシン・プロモーター、ｃＧＭＰ−β−ホスホジエステラーゼ・プロモーター、マウス・オプシン・プロモーター、ロドプシン・プロモーター、錐体トランスデューシンのαサブユニット、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター、ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、網膜変性スロー／ペリフェリン２（slow/peripherin 2）（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈＺ）プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、及び前記のいずれかの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列は、ＧＲＫ１プロモーター（ヒト・ロドプシン・キナーゼ・プロモーターとしても参照する)の転写制御下にある。本発明の一実施形態においては、ヒト・ロドプシン・キナーゼ・プロモーターは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態においては、ベクターはＩＴＲ又はその機能的断片を含む。好ましくは、ベクターは５’及び３’ＡＡＶＩＴＲを含む。ＩＴＲは、本明細書に記載の、いずれかのＡＡＶ血清型を含む、任意の適したＡＡＶ血清型であっても良い。ＩＴＲは、当該技術分野において公知である技術を用いて容易に単離され、公的な又は商業的な供給源（例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション、Manassas, VA）から単離又は取得しても良い。代替的には、ＩＴＲ配列は、公開された配列を参照して、合成又は他の適した方法によって取得しても良い。好ましくは、ベクターは５’及び３’ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。本発明の一実施形態においては、ベクターはトランケート５’ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。本発明の一実施形態においては、ベクターは配列番号１１のヌクレオチド配列を含む５’ＡＡＶ２ＩＴＲ及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含む３’ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。本発明の別の実施形態においては、ベクターは配列番号１３のヌクレオチド配列を含むトランケート５’ＡＡＶ２ＩＴＲ及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含む３’ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。

本明細書に記載のタンパク質の機能的断片をコードする、本明細書に記載の、いずれかのヌクレオチド配列の機能的断片を含むベクターは、本発明の範囲に含まれる。ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質を参照する際に用いられる場合、用語「機能的断片」は、一部分（part）又は部分（portion）が、一部分であるタンパク質（親タンパク質）の生物学的活性を維持している、タンパク質の任意の一部分又は部分を指す。機能的なタンパク質断片は、例えば、親タンパク質と類似する程度、同じ程度又はより高い程度に、ＸＬＲＰを治療又は予防を認識する、光受容器数を増加する、哺乳動物における網膜剥離を低減する、哺乳動物における光受容器の電気的応答が上昇する、哺乳動物の網膜におけるタンパク質発現が上昇する、哺乳動物の網膜における桿体外節にタンパク質が局在する、又は哺乳動物の視力が上昇する能力を維持するタンパク質の一部分を包含する。例えば、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列の機能的断片は、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするが、反復領域において、６５４塩基対（ｂｐ）短くなっている（Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 46(2): 435-441 (2005)）ｃＤＮＡであっても良く、それはマウスにおいてＲＰＧＲ機能を再構成することが示されている。

ポリＡシグナル配列又はＩＴＲを参照する際に用いられる場合、用語「機能的断片」は、ヌクレオチド配列の任意の一部分又は部分を指し、一部分又は部分は、それが一部分であるヌクレオチド配列（親ヌクレオチド配列）の生物学的活性を維持している。機能的なタンパク質断片は、例えば、親ヌクレオチド配列と、類似する程度、同じ程度又はより高い程度に、ＲＮＡ切断複合体によって認識される能力を維持しているポリＡシグナル配列の一部分、又は複製を可能にする能力を維持しているＩＴＲの一部分を包含する。親ヌクレオチド配列又はタンパク質を参照すると、機能的断片は、例えば親ヌクレオチド配列又はタンパク質の約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上を含み得る。

本明細書に記載のＲＰ２及びＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の機能的変異体をコードするベクターは、本発明の範囲に含まれる。本明細書において用いられる場合、用語「機能的変異体」は、親タンパク質と実質的な又は有意な配列の同一性又は配列の類似性を有するタンパク質を指し、機能的変異体は変異体であるタンパク質の生物学的活性を維持している。機能的変異体は、例えば、親ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質と、類似する程度、同じ程度又はより高い程度に、ＸＬＲＰを治療又は予防する、光受容器数を増加する、哺乳動物における網膜剥離を低減する、哺乳動物における光受容器の電気的応答が上昇する、哺乳動物の網膜におけるタンパク質発現が上昇する、哺乳動物の網膜における桿体外節にタンパク質が局在する、及び／又は哺乳動物の視力が増加する、能力を維持している、本明細書に記載のＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質（親タンパク質）の変異体を包含する。親ＲＰ２又は親ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質を参照すると、機能的変異体は、例えば、親ＲＰ２又は親ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質と、アミノ酸配列において、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上一致し得る。

機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質のアミノ酸配列を含み得る。代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＲＰ２又はＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合において、好ましくは、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性に干渉しないか又はそれを阻害しない。非保存的アミノ酸置換は、親ＲＰ２又は親ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質と比べて機能的変異体の生物学的活性が上昇するように、機能的変異体の生物学的活性を促進する場合がある。

親ＲＰ２又は親ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質のアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、ある物理的及び／又は化学的な性質を有する１のアミノ酸が、同じか又は類似する化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸に変換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負電荷の極性アミノ酸が、別の酸性／負電荷の極性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）の代わりとなり、非極性側鎖を有するアミノ酸が、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ等）の代わりとなり、塩基性／正電荷の極性アミノ酸が、別の塩基性／正電荷の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ等）の代わりとなり、極性側鎖を有し電荷を有していないアミノ酸が、別の極性側鎖を有し電荷を有していないアミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）の代わりとなり、β位で分枝した側鎖を有するアミノ酸が、別のβ位で分枝した側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ及びＶａｌ）の代わりとなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸が、別の芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の代わりとなる等、であり得る。

ＲＰ２若しくはＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質又は機能的変異体は、他の構成要素、例えば他のアミノ酸がＲＰ２若しくはＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質又は機能的変異体の生物学的活性を実質的に変化させないように、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列から本質的になり得る。

本発明の一実施形態においては、ＲＰ２ベクターは、表１に記載された構成要素を含むヌクレオチド配列を含む。この点、全長ＲＰ２ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含んでも良い。

本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の機能的変異体をコードするベクターは、表２に記載の構成要素を含むヌクレオチド配列を含む。この点、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５（配列番号２５）の機能的変異体をコードする全長ベクターは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含んでも良い。

本発明の一実施形態においては、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするベクターは、表３に記載の構成要素を含むヌクレオチド配列を含む。この点、野生型ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５（配列番号４）をコードする全長ベクターは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含んでも良い。

本発明の一実施形態は、マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む、ＡＡＶベクターを提供する。マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでも良い。該ベクターは、本発明の他の態様に関して、本明細書に記載のマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列に、作動可能につながれた調節配列を、さらに含んでも良い。本発明の一実施形態においては、マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むＡＡＶベクターは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態においては、該ベクターはまた、本明細書に記載の、いずれかのヌクレオチド配列と、約７０％以上、例えば約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含んでも良い。

本発明の一実施形態は、本明細書に記載のＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的断片若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含むいずれかのＡＡＶベクターを作製する方法を提供する。前記方法は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的変異体のプリン・リッチ領域を増幅することを含んでも良い。増幅は、当該技術分野において公知の任意の適した方法によって行う場合がある。例えば、増幅は、ＰＣＲによって行ってもよい。前記方法は、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５又はその機能的変異体のエキソン１〜１４をコードするヌクレオチド配列に、プリン・リッチ領域を結合することを含んでも良い。結合することは、当該技術分野において公知の任意の適した方法によって行う場合がある（例えば、Greene（上記）を参照）。前記方法は、ＸＬ１０−ｇｏｌｄ細菌株における、ベクターの増殖をさらに含んでも良い。

本発明のベクターは、医薬組成物のような組成物に製剤化し得る。この点、本発明は本明細書に記載の、いずれかのベクター及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。任意の適した担体は、本発明の文脈内で使用することができ、そのような担体は、当該技術分野において周知である。担体の選択は、組成物が投与される特定の部位によって（例えば、眼細胞、ＲＰＥ細胞、光受容器細胞、桿体及び錐体）、及び組成物を投与するために用いる特定の方法によって、ある程度決定される。前記医薬組成物は、任意で無菌であるか、又は１以上のアデノ随伴ウイルス・ベクターを例外的に含む無菌であり得る。

医薬組成物に適した製剤としては、水溶液及び非水溶液、等張な滅菌された溶液が挙げられ、それらは、抗酸化剤、緩衝剤及び静菌薬、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る水溶性及び非水溶性の滅菌された懸濁液を含有し得る。該製剤は、アンプル及びバイアルのような１回投与量又は多数回投与量で封入された容器において存在することができ、使用する直前に、例えば水といった滅菌された液状担体を添加することだけを要するフリーズドライ（凍結乾燥）条件において保管し得る。即時溶液及び懸濁剤は、滅菌された粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。好ましくは、該担体は、緩衝生理食塩水溶液である。より好ましくは、本発明の方法において使用するための前記医薬組成物は、投与する前の損傷からアデノ随伴ウイルス・ベクターを保護するために製剤化される。例えば、該医薬組成物は、ガラス器具、シリンジ又は針のような、発現ベクターを調製するか、保管するか、又は投与するために使用される装置において、アデノ随伴ウイルス・ベクターの減耗を減らすよう、製剤化し得る。該医薬組成物は、アデノ随伴ウイルス・ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を低減するよう、製剤化し得る。この目的のために、該医薬組成物は、好ましくは、例えば、上記したような医薬的に許容される液状担体を含み、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース及びそれらの組合せからなる群より選択される安定剤を含む。そのような組成物の使用によって、該ベクターの保存可能期間が延び、投与が容易になり、本発明の方法の有効性が増す場合がある。医薬組成物はまた、アデノ随伴ウイルス・ベクターの形質導入効率を促進するよう製剤化し得る。加えて、当業者であれば、該医薬組成物が、他の治療的又は生物学的活性がある剤を含み得ることを十分理解する。例えば、イブプロフェン又はステロイドのような、炎症を制御する因子は、アデノ随伴ウイルス・ベクターをin vivoに投与することに伴って起こる、腫脹及び炎症を低減するための医薬組成物の一部であり得る。抗生物質、即ち殺菌剤及び抗真菌剤は、存在している感染を治療するために、及び／又は遺伝子導入手順と関連する感染のような、将来的な感染のリスクを低減するために、提供し得る。

本発明のベクター及び医薬組成物（本明細書においては）、以後、まとめて「本発明のＡＡＶベクター材料」として参照する）は、ＸＬＲＰを治療又は予防する方法において使用し得ると考えられる。この点、本発明の一実施形態は、哺乳動物におけるＸＬＲＰを治療又は予防するための有効量で、本明細書に記載の、いずれかの本発明のＡＡＶベクター材料を、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＸＬＲＰを治療又は予防する方法を提供する。

本明細書において用いられる場合、用語「治療」及び「予防」とそれらから派生する用語は、１００％若しくは完全な治療又は予防であることを意味する必要はない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する治療又は予防の様々な程度がある。この点、本発明の方法は、哺乳動物におけるＸＬＲＰの治療又は予防の任意の量又は任意のレベルを提供し得る。さらに、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、ＸＬＲＰの１以上の状態、症状又は兆候を治療又は予防することを含み得る。幾つかのケースにおいては、本発明の方法はＸＬＲＰを治療（cure）し得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、ＸＬＲＰの発症、又はその症状、兆候（sign）若しくは状態を遅らせることを包含し得る。

例えば、本発明の方法は、外核層（ＯＮＬ）の菲薄化又は肥厚、外網状層（ＯＰＬ）の菲薄化又は肥厚、桿体及び錐体の内側部分の短縮、双極細胞樹状突起の退縮、内核層、内網状層、神経節細胞層及び神経線維層を含む内網膜層の菲薄化又は肥厚、オプシンの誤局在、神経フィラメントの過剰発現、哺乳動物における網膜剥離、哺乳動物における光受容器の電気的応答の低下、網膜電図（ＥＲＧ）機能の喪失、視力及びコントラスト感度の喪失、視覚誘導行動の喪失、周辺視力の低下、中心視力の低下、夜間視力の低下、コントラスト感度の喪失、及び色覚の喪失である、光受容器構造及び／又は機能の喪失の任意の１以上の進行を、改善し、修正し又は停止し得る。

本発明の方法、ベクター及び医薬組成物は、任意の１以上の利点を提供し得る。例えば、本発明の方法、ベクター及び医薬組成物は、網膜の健全性又は質を改善する場合があり、視覚障害を低減するか又は予防する場合がある。従って、本発明の方法、ベクター及び医薬組成物は、例えば、自動車の運転や独立した生活などの、視覚によって誘導される活動を行うための、患者の能力を有利に改善する場合がある。

本発明のベクター及び医薬組成物は、哺乳動物の網膜における、光受容器数を増加させる方法において使用し得ると考えられる。この点、本発明の一実施形態は、哺乳動物の網膜における光受容器数を増加させる方法を提供し、該方法は、哺乳動物の網膜の光受容器数を増加させるための有効量で、本明細書に記載された、いずれかの本発明のＡＡＶベクター材料を、哺乳動物に投与することを含む。

本発明のベクター及び医薬組成物はまた、哺乳動物の視力を増加させるために有用であり得る。この点、本発明の一実施形態は、哺乳動物の視力を増加させる方法を提供し、前記方法は、哺乳動物の視力を増加させるための有効量で、本明細書に記載された任意の本発明のＡＡＶベクター材料を、哺乳動物に投与することを含む。

本発明のベクター及び医薬組成物はまた、哺乳動物における網膜剥離を低減するために有用であり得る。この点、本発明の一実施形態は、哺乳動物における網膜剥離を低減する方法を提供し、前記方法は、哺乳動物における網膜剥離を低減するための有効量で、本明細書に記載された、いずれかの本発明のＡＡＶベクター材料を、哺乳動物に投与することを含む。

本発明のベクター及び医薬組成物はまた、哺乳動物における光受容器の電気的応答を増加させるために有用であり得る。この点、本発明の一実施形態は、哺乳動物における光受容器の電気的応答を増加させる方法を提供し、前記方法は、哺乳動物における光受容器の電気的応答を増加させるための有効量で、本明細書に記載された、いずれかの本発明のＡＡＶベクター材料を、哺乳動物に投与することを含む。光受容器は、例えば、桿体及び錐体の一方又は両方を含んでも良い。光受容器の電気的応答は、当該技術分野において公知である、例えば網膜電図（ＥＲＧ）のような、任意の適した方法によって、測定する場合がある。

本発明の別の実施形態は、哺乳動物の網膜におけるタンパク質の発現を増加させる方法を提供する。前記方法は、哺乳動物の網膜におけるタンパク質の発現を増加させるための有効量で、本明細書に記載の、いずれかの本発明のＡＡＶＲＰ２ベクター又は前記ベクターを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含んでも良い。本発明の一実施形態においては、前記タンパク質はＲＰ２、錐体オプシン又は錐体ＰＤＥ６である。

本発明の別の実施形態は、哺乳動物の網膜におけるタンパク質の発現を増加させる方法を提供し、前記方法は、哺乳動物の網膜におけるタンパク質の発現を増加させるための有効量で、本明細書に記載の、いずれかの本発明のＲＰＧＲベクター又は該ベクターを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む。本発明の一実施形態においては、該タンパク質はＲＰＧＲである。

本発明の別の実施形態は、哺乳動物の網膜における桿体外節に、タンパク質を局在させる方法を提供する。前記方法は、哺乳動物の網膜における桿体外節にタンパク質を局在させるための有効量で、本明細書に記載の、いずれかの本発明のＲＰＧＲベクター又は該ベクターを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含んでも良い。本発明の一実施形態においては、前記タンパク質はロドプシン又はＰＤＥ６である。

本発明の方法は、哺乳動物の目に、例えば、眼内に、網膜下に、又は硝子体内に、ＡＡＶベクター材料を投与することを含んでも良い。好ましくは、ＡＡＶベクター材料は、網膜下に投与される。

本発明の目的のために、投与される本発明のＡＡＶベクター材料の量又は投与量は、望ましい応答、例えば合理的な時間枠での哺乳動物における、治療的又は予防的な応答をもたらすために十分でなければならない。例えば、投与時から約２時間以上、例えば１２〜２４時間以上の期間で、ＸＬＲＰを治療又は予防するため、光受容器を増加させるため、及び／又は視力を増加させるために、本発明のＡＡＶベクター材料の投与量は十分でなければならない。ある実施形態では、期間をより長くすることができる。投与量は、特定の本発明のＡＡＶベクター材料の有効性、並びに哺乳動物（例えばヒト）の状態及び哺乳動物（例えばヒト）の体重によって決定される。

投与量を決定するための多くのアッセイ法は、当該技術分野において公知である。投与される量は、in vitro（例えば細胞培養）で又はin vivo（例えば動物実験）で決定する場合がある。例えば、投与される量は、ＩＣ_５０値（疾患の兆候について、最大時の半分阻害を達成する投与量）、ＬＤ_５０値（集団の５０％が致死的である投与量）、ＥＤ_５０値（集団の５０％で、治療効果が得られる投与量）、細胞培養、動物実験又はその組合せでの治療指数によって決定してもよい。治療指数は、ＥＤ_５０値に対するＬＤ_５０値の比（即ちＬＤ_５０／ＥＤ_５０）である。

本発明のＡＡＶベクター材料の投与量はまた、特定の本発明のＡＡＶベクター材料を投与したことに伴い得る、任意の不利な副作用の存在、性質及び程度によって決定する場合がある。典型的には、主治医が、年齢、体重、一般的健康状態、食事、性別、投与される本発明のＡＡＶベクター材料、投与経路及び治療される状態の深刻度のような様々な要因を考慮に入れて、各患者個人を治療するための、本発明のＡＡＶベクター材料の投与量を決定する。例として（本発明を限定することを意図していない）、本発明のＡＡＶベクター材料の投与量は、約１×１０^８〜約２．５×１０^８ベクター・ゲノム（ｖｇ）／眼、約１×１０^８〜約１×１０^９ベクター・ゲノム（ｖｇ）／眼、又は約１×１０^６〜約１×１０^１３であり得る。本発明の一実施形態においては、本発明のＲＰ２ベクターの投与量は、約５×１０^６〜約５×１０^１２、約５×１０^６〜約５×１０^８、又は約５×１０^７〜約５×１０^８ベクター・ゲノム（ｖｇ）／眼である。本発明の別の実施形態においては、本発明のＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターの投与量は、約５×１０^６〜約５×１０^１２、約１×１０^８〜約５×１０^９ｖｇ／眼であり、好ましくは、約５×１０^８〜約２×１０^９ｖｇ／眼である。約１×１０^９ｖｇ／眼の、本発明のＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターの投与量が特に好ましい。本発明の別の実施形態においては、本発明のマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターの投与量は、約１×１０^８〜約５×１０^８ｖｇ／眼であり、好ましくは、約３ｘ１０^８ｖｇ／眼である。

本明細書において用いられる場合、用語「哺乳動物」は、マウス及びハムスターのようなげっ歯目の哺乳動物、ウサギのようなウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。好ましくは、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含むネコ目に由来する哺乳動物である。より好ましくは、ウシ科（ウシ）及びブタ科（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目に由来する哺乳動物である。最も好ましくは、霊長類、セボイド（Ceboids）目、シモイド（Simoids）目（サル）又は真猿亜（Anthropoids）目（ヒト及び類人猿）の哺乳動物である。特に好ましくは、哺乳動物はヒトである。

以下の実施例は本発明について、さらに説明するが、もちろん、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。

実施例１−６
以下の材料及び方法を、実施例１〜６で用いた。

マウスの系統と飼育
Ｒｐｇｒ-ノックアウト（ＫＯ）マウスは、国立衛生研究所（ＮＩＨ）において、１２時間（ｈ）の明／１２ｈの暗のサイクルで制御された周囲照明の動物飼育施設で維持した。研究は、眼及び視力研究における動物の使用に関する視覚と眼科学研究協会（ＡＲＶＯ）の声明を遵守している。動物プロトコールは、国立眼科研究所（ＮＥＩ）の動物実験委員会によって承認された。

ＡＡＶベクターの構築及び産生
マウス又はヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５エキソンのプリン・リッチ領域を、雄のＣ５７マウス又は健常な成人男性のドナーの、それぞれのゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応増幅した。ＳａｐＩ制限酵素部位及び近接するプリン・リッチ領域を含む、エキソンＯＲＦ１５の３’ＤＮＡを、健常な成人男性のドナーのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プライマーの配列は以下の通り：
・ｍＲｐｇｒフォワード（Ｆ）：配列番号１６；
・ｍＲｐｇｒリバース（Ｒ）：配列番号１７；
・ｈＲＰＧＲＦ：配列番号１８；及び
・ｈＲＰＧＲＲ：配列番号１９

ＰＣＲは、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲＨＳＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック・ラボラトリーズ社、Mountain View, CA）を用いて行った。ＰＣＲ条件は、９４℃×１分の後、９８℃×１０秒、７２℃×８０秒で３０サイクル、７２℃で７分の伸長、及び４℃で維持であった。ＰＣＲ産物は、シーケンス解析（Sequetech Inc., Redwood City, CA）によって確認し、ヒト又はマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５全長のｃＤＮＡを生成するために、合成した上流のエキソンに結合した。エキソン１〜１４、及びＳａｐＩ部位を有する、エキソンＯＲＦ１５の５’部分を合成した。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片及び合成したＤＮＡ断片をＳａｐＩでそれぞれ消化し、次いで、ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５全長のｃＤＮＡ（配列番号３）を組み立てるために結合した。マウスＲｐｇｒ−ＯＲＦ１５全長のｃＤＮＡは、同じ戦略を用いて生成した。

ＡＡＶタイプ２逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）（配列番号１１及び１２）を、ＡＡＶベクターの構築において用いた。ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５発現カセットは、ヒト・ロドプシン・キナーゼ・プロモーター（配列番号１０）（Khaniら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48: 3954-3961 (2007)）、キメラＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロン（配列番号８）、ヒト（配列番号３）又はマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のｃＤＮＡ、及びヒトβグロビン・ポリアデニル化部位（配列番号６）を含んでいた。ベクター・プラスミドは、ＸＬ１０−ｇｏｌｄ細菌株（アジレント・テクノロジーズ社、Santa Clara, CA）内で増幅した（propagated）。

ＡＡＶベクターは、Grimmら、Blood, 102: 2412-2419 (2003)に記載されているように、ＨＥＫ２９３細胞に３重のプラスミド・トランスフェクションを行うことによって産生した。ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ＡＡＶコンストラクトをＡＡＶ８にパッケージした一方で、マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５コンストラクトは、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の両方にパッケージした。ベクターは、Grimm（上記参照）に記載されているように、ポリエチレングリコール沈殿後、塩化セシウム密度勾配分画によって精製した。精製したベクターは、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４に配合し、直鎖化プラスミド標準を用いてリアルタイムＰＣＲによって定量し、使用まで−８０℃で保管した。ベクターの完全性は、精製後に毎回、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ｃＤＮＡのプリン・リッチ領域を増幅することによって検証した。

網膜下注射
幾つかの点は変更したが、Sunら、Gene Ther., 17: 117-131 (2010)に記載されているように、ＡＡＶベクターを網膜下に注射した。簡易には、マウスに、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、麻酔した。瞳孔を、局所的なアトロピン（１％）及びトロピカミド（１％）で拡張させた。手術は、眼科手術用顕微鏡の下で行った。１８ゲージの針を用いて、縁の近傍で角膜を僅かに切開した。３３ゲージのブラント（blunt）針をハミルトン・シリンジに装着し、切開部を通して、レンズを避けながら挿入し、網膜にまで突き刺した。全ての注入は、網膜の鼻側象限（nasal quadrant）内の位置で、網膜下に行った。各動物には、１ｍＬあたり１×１０^１１〜１×１０^１３ベクター・ゲノムの濃度で、１μＬのＡＡＶベクターを注入した。治療ベクターは右目に投与し、対照のビヒクルはもう片方の目に注入した。注入している間の可視化は、ベクター懸濁液に０．１体積％のフルオレセイン（１００ｍｇ／ｍｌのＡＫ−ＦＬＵＯＲ、Alcon, Fort Worth, TX）を添加して補助した。１００を超えるＲｐｇｒノックアウト・マウスにおいて、投与による有効性研究を行った。

イムノブロット分析
１×プロテアーゼ阻害剤を含有する放射性同位体免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解バッファー中で、マウス網膜を短時間の超音波破砕によって、ホモジェナイズした。組織片を、短時間の遠心によって除去した。網膜タンパク質を、電気泳動によってドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。５％脱脂粉乳を用いて、室温で１時間、プレ吸着した後、ブロットした膜（membrane blots）を、４℃で一次抗体と共に、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、ブロットを、ＴＷＥＥＮ２０界面活性剤を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ：１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）で洗浄し、二次抗体である、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧのヤギ抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）と共に、室温で１時間、インキュベートした。次に、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬＷｅｓｔＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、Rockford, IL）で発色させた。本研究で用いた一次抗体は、ウサギ抗マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５抗体Ｃ１００及びウサギ抗ヒトＲＰＧＲ抗体６４３であり、それぞれ、マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のＣ末端並びにヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５及びＲＰＧＲ^１−１９アイソフォーム（isoforms）の共通領域を認識する。マウスモノクローナル抗βアクチン抗体（シグマ）を、ローディング（loading）対照として用いた。

組織処理、免疫蛍光及び形態的分析
安楽死の後、マウスの眼球を採取した。ベクターで処置した眼及びビヒクルで処置した眼と同等の領域において、免疫染色が行われたことを確認するために、摘出前に眼の位置（orientation）に印を付けるよう青色色素を用いた。固定のために、眼を直ぐに、４％パラホルムアルデヒド中に１時間置いた。固定された組織を、オーバーナイトで、３０％スクロースを含むＰＢＳに浸漬し、低温保持装置を用いて、急速に凍結し、１０μｍの厚さの切片にした。Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44: 2413-2421 (2003)に記載されているように、結合繊毛に局在化したＲＰＧＲを検出するために、代替的なプロトコールを用いた。簡易には、固定及び液体窒素中での急速な凍結を行わず、眼を最適薄切温度（optimal cutting temperature）化合物（ＯＣＴ）に包埋した。凍結切片は、１０μｍで薄切し、前処理したスライドガラス（Superfrost Plus；フィッシャー・サイエンティフィック、Pittsburgh, PA）上に収集した。切片は−８０℃に保管し、２〜３日以内に使用した。使用の直前に、切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）中の１％ホルムアルデヒドで、２分間、スライドガラス上で固定した。切片を１週間より長く保管した場合、０．１％２−メルカプトエタノール（ＰＢＳ中）で追加の処理を５分間行った後、１％ホルムアルデヒド固定を５分間行った。次いで、切片をＰＢＳで１回洗浄し、免疫蛍光染色を行った。

免疫蛍光染色のために、Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44: 2413-2421 (2003)に記載されている通りに、凍結切片を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の５％ヤギ血清の中で、１時間プレ吸着させ、次いで、５％ヤギ血清中で希釈した一次抗体の中で、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。切片をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、蛍光色素をコンジュゲート化した二次抗体及び０．２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と共に、１時間、インキュベートした。切片を再度洗浄し、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ−Ｇ封入剤（SouthernBiotech, Birmingham, AL）中で、マウントした（mounted）。画像は、蛍光顕微鏡ＡＸＩＯＩＭＡＧＥＲＺ１又は共焦点走査顕微鏡ＬＳＭ７００（Zeiss、Germany）を用いて撮影した。

一次抗体としては、ヒト及びマウスにおけるＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５及びＲＰＧＲ^１−１９アイソフォームの共通領域を、それぞれ認識する、ポリクローナル・ウサギ抗ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５抗体６３６及びウサギ抗マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５抗体Ｓ１（Hong ら、 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 43: 3373-3382 (2002)）が挙げられた。本研究で用いた他の一次抗体としては、ロドプシン（１Ｄ４、Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX）及びM錐体オプシン（Millipore, Billerica, MA）に対するモノクローナル抗体が挙げられる。二次抗体としては、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５５５及び５６８色素でコンジュゲート化した抗ウサギ及び抗マウスのヤギ抗体（ライフテクノロジーズ、Grand Island, NY）が挙げられた。

外核層（ＯＮＬ）の厚さの形態的分析については、視神経頭（optic nerve head）の各側面に対する、各々５００μｍ隔てられた４カ所において、垂直な経線（vertical meridian）に沿って計測した。計測は、その視神経頭自体から約５００μｍの位置で開始した。

網膜電図（ＥＲＧ）
マウスをオーバーナイトで、暗順応させた。麻酔及び瞳孔拡張を上記の通りに行った。コンピューター・ベース・システム（ＥＳＰＩＯＮＥ２網膜電図システム、Diagnosys LLC, Lowell, MA）を、発光ダイオード（ＬＥＤ）又はキセノン電球で生じたフラッシュへの応答における、ＥＲＧを記録するために用いた。２．５％ヒプロメロース眼用鎮痛溶液の液滴を有するゴールド・ワイヤー・ループ電極を用いて、両目の角膜ＥＲＧを記録した。口中に留置したゴールド・ワイヤー・ループ電極を基準として使用し、接地電極を尾部に置いた。ＥＲＧのプロトコールは、−２〜＋３ｌｏｇｓｃｃｄ．ｓ．ｍ^−２／フラッシュの短時間のフラッシュを用いて、暗順応ＥＲＧを記録することからなる。応答は、コンピューターで平均化し、刺激の強さに依存して、３〜６０秒間隔で記録した。明順応ＥＲＧは、白色３２ｃｄ．ｍ^−２桿体抑制バックグラウンドに２分間順応させた後に、記録した。ＥＲＧは、−０．５２〜＋２ｌｏｇｓｃｃｄ．ｓ．ｍ^−２の刺激強度について記録した。

光コヒーレンス・トモグラフィ（ＯＣＴ）
ＯＣＴボリューム・スキャン画像は、スペクトル・ドメイン（ＳＤ）ＯＣＴシステム（SPECTRALIS system, Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA）を用いて得た。マウスを麻酔し、上述のように瞳孔を拡張させた。視神経頭を、直径約１．０ｍｍ以内の視野の中心にした。網膜の厚さを示す図を、ハイデルベルグ・アイ・エクスプローラー・ソフトウェアによって作製した。

統計分析
ベクターで処置した眼とビヒクルで処置した眼における結果を比べるために、対応のある両側Ｔ検定を用いた。ＧＲＡＰＨＰＡＤＰｒｉｓｍ６ソフトウェア（GraphPad Software, La Jolla, CA）を統計分析のために用いた。

実施例１
この実施例は、マウス及びヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ＡＡＶベクターの生成を実証する。

マウス又はヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５発現カセットのいずれかを有するＡＡＶベクターを構築した。末端のＯＲＦ１５エキソンのプリン・リッチ領域のために、逆転写ＰＣＲを用いたＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５全長のｃＤＮＡを獲得するための以前の試みは、成功しなかった。この問題を克服するために、プリン・リッチ領域を増幅するための鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて、通常のＰＣＲを行い、次いで、該プリン・リッチ領域を上流エキソンをコードする合成ＤＮＡ断片に結合した。マウス及びヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のｃＤＮＡの両方を獲得するために、この戦略を採用した。産物を検証するために、完全ｃＤＮＡのシーケンスを行った。桿体及び錐体細胞特異性を示すヒト・ロドプシン・キナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号１０）（Khani ら、 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48: 3954-3961 (2007)）を、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５を発現させるために用いた。これらの２つのベクターをＡＡＶ８型にパッケージした。これらは以降、それぞれＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒ及びＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲとして参照する。マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターはまた、非ヒト霊長類の錐体細胞を効率的に形質導入する血清型であるＡＡＶ９型（Vandenbergheら、PLoS Pne, 8: e53463 (2013)）にパッケージした（以降、ＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒとして参照する）。

ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５及び２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）のプリン・リッチ領域を含有するベクター・プラスミドは、プラスミド・クローンを一般的に使用される細菌株内で増殖させたときに、欠失又は再構成が起こりやすかった。広範なテストを行った後、該ベクター・プラスミドがＸＬ１０Ｇｏｌｄ細胞内において、完全性を維持していることを観察した。マウス又はヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のｃＤＮＡにおける、グルタミン酸−グリシンの繰り返しをコードする配列が広がっている領域のＰＣＲ増幅によって、ベクター・プラスミド及び全てのベクター調製物において、期待された１．３ｋｂ又は１．６ｋｂの断片が産生された。ＰＣＲアッセイでは、殆どのＡＡＶベクター調製物において、目に見える欠失は同定されなかった。しかし、小さな欠失は、２つのベクター調製物において検出された。全長ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターは、配列番号１５を含み、配列番号２５のアミノ酸配列（野生型ヒトＲＰＧＲの機能的変異体）をコードしていた。全長マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターは、配列番号２４を含み、配列番号２３のアミノ酸配列（マウスＲＰＧＲ）をコードしていた。

実施例２
本実施例は、ＡＡＶベクターが媒介するＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の発現を実証する。

実施例１のベクターが、マウス網膜において全長ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質の発現を媒介するかどうかテストするために、ベクターで処置したＲｐｇｒ−ＫＯマウスに由来する網膜溶解物のイムノブロット分析を行った。マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５のＣ末端に対する抗体を用い、ＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクターで処置したＲｐｇｒ−ＫＯ網膜において、ＲＰＧＲタンパク質を同定した。１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクターを網膜下に注入した、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスに由来する網膜溶解物は、野生型（ＷＴ）Ｃ５７／Ｂｌ６マウス網膜において検出可能なものと同じである、全長ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質に相当する約２００ｋＤａのタンパク質バンドを明らかにした。このタンパク質が、野生型（ＷＴ）ＲＰＧＲタンパク質と同じサイズであったことは、全長マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質を生成する該ベクターの能力を示唆している。同様に、ＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲベクターは、Ｒｐｇｒ−ＫＯ網膜において、全長ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質を生成することができた。１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｈＲｐｇｒベクターを網膜下に注入した、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスに由来する網膜溶解物は、市販されているヒト網膜溶解物由来のものと同じである、全長ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質に相当する約２００ｋＤａのタンパク質バンドを明らかにした。ベクターを注射した眼に由来する網膜溶解物の１／１０量を含むレーンでは、シグナルが検出されなかった。このことは、本アッセイの感度限界を明らかにするものである。ＯＲＦ１５エキソンの上流のエピトープに対する抗体を用いたとき、ＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲで処置した網膜において、一式の、より低分子量のタンパク質もまた検出された。これらのより短いタンパク質が、ＡＡＶベクター調製物のＯＲＦ１５エキソンにおける欠失によって生じた可能性を除外することはできないが、これらのより短いタンパク質は、ＷＴマウス網膜で観察されたように（Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 43: 3373-3382 (2002)）、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の選択的スプライシング又はＣ末端のトランケート形態である可能性もある。マウスＲＰＧＲのＯＲＦ１５エキソンの上流のエピトープに対する抗体を用いたとき、ＡＡＶ８−ｍＲＰＧＲで処置したＲｐｇｒ−ＫＯ網膜においても、より短いタンパク質が同定されている。

マウス及び他の哺乳動物種においては、光受容器の結合繊毛にＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質が局在する（Hong ら、 Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 3649-3654 (2000)、Hong ら、 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44: 2413-2421 (2003)）。ベクターによって発現したマウス及びヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５もまた、結合繊毛に局在するかどうかをテストするため、従来通りの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定する代わりに、１％ホルムアルデヒドを用いて（４％ＰＦＡは、この領域に対する抗体の浸透をブロックするためである（Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44: 2413-2421 (2003)））、凍結した網膜切片をスライドガラス上で簡易に（brief on-slide）固定し、免疫蛍光アッセイに用いた。ＷＴタンパク質と同様、ベクターによって発現したＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５は、主に結合繊毛の位置に対応する内側（inner）（ＩＳ）及び外節（ＯＳ）の間に、ドットとして見られた。従来通りに４％ＰＦＡで固定したとき、ベクターによって発現したＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５は、その結合繊毛への局在に加えて、頻繁にＩＳにおいて観察され、時々、光受容器の核及びシナプス末端で観察された。改変した固定法を用いたとき、ＷＴ及びＡＡＶ８−ｍＲＰＧＲで処置した網膜の両方の、結合繊毛領域において、ＲＰＧＲ免疫染色が観察された。習慣的な固定法を用いたとき、ＲＰＧＲはＷＴ網膜においては検出できなかったが、ＡＡＶ８−ｍＲＰＧＲで処置した網膜のＩＳ、ＯＮＬ及びシナプス領域では染色が観察された。ＡＡＶ５ＲＰＧＲベクターで処置したイヌ網膜においても観察された（Beltranら、Proc. Natl. Acad. Sci., 109: 2132-2137 (2012)）が、ＷＴマウス網膜では観察されていないことから、この見かけ上のＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の誤局在には、ベクターが関連しているようである。特定の理論又は機構に縛られることはないが、比較的高いベクター投与量（１×１０^９ベクター・ゲノム（ｖｇ））及び強力なＲＫプロモーターを用いたことによるタンパク質の過剰発現が、この観察結果を説明し得ると思われる。ＲＫプロモーターの光受容器特異性のために、他の網膜層においては、検出可能なＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の発現は認められなかった。同じ投与量を用いたとき、ＡＡＶ９ベクターによって送達されたマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５は、ＡＡＶ８ベクターのときと類似するレベルでタンパク質を発現し、該タンパク質は同じ細胞内位置に向かった。

実施例３
本実施例は、マウス及びヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ベクターの短期間投与量毒性（short-term dose-toxicity）プロファイルを実証する。

長期間での効能研究のための投与量範囲を明らかにするために、短期間でのベクター毒性研究を４カ月間に亘って行った。８週齢Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスに、網膜下注射によって、一方の眼に、１×１０^１０又は１×１０^９ｖｇ／眼のＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲ又はＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクターを注射した。もう片方の眼は、同量のビヒクルを注射することによって対照として用いた。免疫蛍光分析のためにマウスを屠殺する前、注射後（ＰＩ）４カ月で、桿体及び錐体光受容器に由来する応答を評価するために、暗順応及び明順応ＥＲＧを記録した。Ｒｐｇｒ−ＫＯマウス系統における、遅い網膜変性のために、ベクター処置後、４カ月での治療効果は期待されなかった。

１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲ又はＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクターの注射を受けたマウスにおける、暗順応ａ波、b波及び明順応b波のＥＲＧ振幅においては、ベクター及びビヒクルで処置した眼の間には、統計的な有意差は見られなかった。しかし、１×１０^９ｖｇ／眼のベクターの投与では、有意なＥＲＧ変化を起こさなかった一方で、１×１０^１０ｖｇのベクターを投与された眼においては、３つのＥＲＧ要素の全てで顕著に小さい振幅が観察された。このことは、高い投与量では、ベクター毒性があることを示している。この観察結果は、ベクターで処置した網膜の免疫蛍光分析によっても裏付けられた。網膜切片を凍結前に４％ＰＦＡ中で固定したので、ＩＳへの誤局在を起こした組換えＲＰＧＲのプールのみが観察された（上で説明した通り）。１×１０^１０ｖｇのベクターで処置した網膜においては、より強いＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５発現が観察され、遥かに薄い外側核層（ＯＮＬ）及びより短いＩＳも伴って観察された。対照的に、１×１０^９ｖｇのベクターで処置した網膜のＯＮＬの厚さは、ビヒクルで処置した網膜とは顕著な差が見られなかった。ＥＲＧ及び免疫蛍光分析の両方で、１×１０^９ｖｇ／眼の投与量では十分に耐性があることを示す一方で、１×１０^１０ｖｇではマウス網膜に毒性があった。特定の理論又は機構に縛られることはないが、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５タンパク質を過剰発現することの組合せ効果、大量のＡＡＶキャプシド・タンパク質及び網膜細胞の処理能力を超えるベクターＤＮＡが、高いベクター投与量の毒性を説明し得ると思われる。それ故、後の長期間効能研究には、１×１０^１０ｖｇ／眼の投与量を含めなかった。

実施例４
本実施例は、マウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の遺伝子送達後のＲｐｇｒ−ＫＯマウスにおける、治療効果を実証する。

ＡＡＶ８又はＡＡＶ９ベクターによって送達されたマウスＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５ｃＤＮＡが有効であるかどうかを試験するために、６〜８週齢のマウスの網膜下の空間に、１×１０^８〜１×１０^９ｖｇ／眼の範囲の投与量で、該ベクターを注射した。各マウスに片側（眼）へのベクター注射を行い、反対側の眼にはビヒクルを注射した。Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスにおいては網膜変性の進行が緩やかなので（Hongら、Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 3649-3654 (2000)、Hongら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 46: 435-441 (2005)）、１８カ月の追跡調査期間中、長期的なＥＲＧモニタリングを実施した。個々のマウス間でＥＲＧ振幅における大きな変動があることを前提として、ベクター及びビヒクルで処置した眼を比較する研究ではずっと、対応のあるＴ検定を用いた。全てのコホートの間では、３×１０^８ｖｇのＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒの投与を受けたマウスは、ベクターで処置した眼において最も強い治療効果を示した。注射後（ＰＩ）１２ヶ月で、ベクターで処置した眼においては、僅かな改善しか観察されなかったが、注射後（ＰＩ）１８カ月での治療効果はより顕著になり、フラッシュ刺激を強くしていった際の応答においては、暗順応ａ波及び明順応ｂ波について、有意により大きい振幅が観察された。これらの眼はまた、注射後（ＰＩ）１２ヶ月では観察されなかった、有意により大きい暗順応ｂ波振幅を示した。このことは、双極細胞への視覚シグナリングが、より良く維持されていることを反映していた。１８カ月モニタリングで生存した７尾全てのマウスにおいて、各動物は個々に、ベクターで処置した眼における最高のフラッシュ強度から誘発された、より強い暗順応ａ波、ｂ波及び明順応ｂ波の振幅を示した。他のベクター投与量（１×１０^９ｖｇ／眼のＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクター、１×１０^８ｖｇ／眼のＡＡＶ８−ｍＲｐｇｒベクター又は１×１０^９ｖｇ／眼のＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒベクター）を受けたコホートは、３×１０^８ｖｇのＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒベクターを投与されたものと比較して、注射後（ＰＩ）１８カ月の時点で、次善のレスキュー（suboptimal rescue）を示した。

ベクターで処置した網膜の機能的なレスキューは、構造的な改善と相関していた。注射後（ＰＩ）１８カ月において、光コヒーレンス・トモグラフィ（ＯＣＴ）の網膜画像によって明らかにされたように、３×１０^８ｖｇのＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒで処置した眼においては、対照の眼よりも、かなり厚いＯＮＬが観察された。視神経頭（ＯＮＨ）が位置する中心領域を除いて、直径約１．０ｍｍ^２の視野の内側で、ベクターで処置した眼における網膜の厚さの上昇が観察された。ＯＣＴに続き、治療したマウス網膜の免疫蛍光分析では、断面のおよそ半分に及ぶＡＡＶが媒介するＲＰＧＲ発現を示した。ＯＣＴの結果と一致して、対照の眼よりも、ベクターで処置した眼は、有意により多い光受容器の列を維持していた。対照の眼においては、４〜６列であったのに比べ、ベクターで処置した眼の大部分においては、７〜１０列の光受容器が維持されていた。網膜切片上で、縦（背側−腹側）の経線に沿って、５００μｍおきに測定したＯＮＬの厚さは、これらの結果をさらに裏付けた。ベクターで処置した網膜の異なる位置におけるＯＮＬの平均の厚さは、３１．７μｍ〜４３．５μｍの範囲であった一方、対照の網膜においては、１９．０μｍ〜２８．３μｍの範囲であった。１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｍＲＰＧＲの注射を受けたマウスの１群においては、注射後（ＰＩ）２４カ月で、治療効果はより顕著になりさえするようだった。対照の網膜のＯＮＬは、上部分において殆ど消失しており、１〜３列の光受容器のみが下領域（inferior）網膜に残存していた一方で、ＲＰＧＲが発現していた、ベクターで処置した網膜の下領域においては、６〜８列の光受容器が生存していた。

（外節に向かって、輸送／標的指向性が変化したことによる）オプシンの誤局在は、ＲＰＧＲ変異を有する動物モデル及びヒト保因者において検出可能である。オプシンの輸送を、Ｒｐｇｒ遺伝子の送達によって修正し得るかどうかを評価するために、注射後（ＰＩ）１８カ月で、３×１０^８ｖｇのＡＡＶ９−ｍＲｐｇｒで処置した網膜において、免疫染色を行った。ＷＴ網膜においては、Ｍ錐体オプシンが、専ら錐体細胞の外節において見られた。ビヒクルで処置したＲｐｇｒ−ＫＯ網膜においては、Ｍオプシンは外節に加えて、内節並びに核周囲及びシナプス領域において検出された。より多くのＭオプシンが、下領域の網膜と比べ、上領域の網膜の光受容器内節に存在していた。特定の理論又は機構に縛られることはないが、これは恐らく、上領域から下領域にかけてのＭオプシンの発現の勾配によるものと考えられる。このＭオプシンの外節への輸送は、ベクターで処置した網膜の注射後（ＰＩ）１８カ月で、部分的にレスキューされた。

ロドプシンは、ＷＴ網膜の桿体外節にのみ局在していた。この誤局在は、ベクターを注射したＫＯ網膜の、ＲＰＧＲ発現領域においては見られなかった。ロドプシンは、ビヒクルを注射したＫＯ網膜の、ＩＳ及び核周囲で追加的に観察された。若いＲｐｇｒ−ＫＯマウスの網膜においては、ロドプシンは適切に局在していた。しかし、ロドプシン免疫染色は、２０月齢ビヒクル注射Ｒｐｇｒ−ＫＯ網膜においては、内節及び核周囲領域において検出された。ベクターで処置したＲｐｇｒ−ＫＯマウスの網膜の、ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５を発現する領域においては、ロドプシンの局在は修正された。

実施例５
本実施例は、ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５の遺伝子送達後の、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスにおける治療効果を実証する。

将来的なヒトでの試験のための、潜在的なベクター候補として、ＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲを、４つの異なる投与量（３×１０^９、１×１０^９、３×１０^８及び１×１０^８ｖｇ／眼）で、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスにおける有効性を試験した。６〜８週齢のマウスの網膜下に該ベクターを注射し、注射後（ＰＩ）１２及び１８カ月でＥＲＧを実施した。４つの投与量群の間では、１×１０^９ｖｇで処置した群において、最適な結果が観察された。この投与量では、ベクターで処置した眼は、注射後（ＰＩ）１８カ月での、強度が増加していくフラッシュ刺激に応答して、有意により高い振幅の暗順応ａ波、ｂ波及び明順応ｂ波を示した。このことは、ヒトＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５遺伝子送達の後、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスにおいて、網膜機能がレスキューされたことを示している。１８カ月のモニタリング期間を生存した１１尾全てのマウスは、ベクターで処置した眼において、より高い明順応ｂ波振幅を示した。それらのうち１０尾及び９尾のマウスが、それぞれ、より高い暗順応ｂ波及び暗順応ａ波を示した。

３×１０^９ｖｇのベクター投与を受けたマウスは、注射後（ＰＩ）１８カ月で、対照の眼と比べて、ベクターで処置した眼において、かなり低いＥＲＧ振幅を示した。但し、この投与量での長期間毒性を示す注射後（ＰＩ）１２カ月では、この差異は統計的に有意でなかった。３×１０^８ｖｇ及び１×１０^８ｖｇのベクターで処置した眼は、ＥＲＧ振幅について対照の眼と異なることを示さなかった。治療効果が、検出するには小さすぎたかどうかを調べるために、６か月後（これらのマウスがほぼ２６月齢の時）、再びＥＲＧを実施した。両方の投与量群の、ベクターで処置した眼において、ＥＲＧの改善は未だ観察されなかった。このことは、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスにおける機能的なレスキューを達成するには、これら２つのベクター投与量では、少なすぎたことを示している。

１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲベクターで処置したＲｐｇｒ−ＫＯマウスにおいて、注射後（ＰＩ）１８カ月で、ＯＣＴ網膜のイメージングを行った。対照よりも、ベクターで処置した網膜においては、かなり厚いＯＮＬが観察され、ベクターで処置した眼の網膜全体は、対照よりも、直径約１．０ｍｍ^２の視野の内部において、より厚かった。免疫蛍光分析によって、ベクターで処置した網膜では、断面の約半分の領域において、ｈＲＰＧＲの発現が明らかにされた。ＯＣＴの結果と一致して、ベクターで処置した網膜においては、対照よりも、多くの光受容器の列が維持されており、縦（背側−腹側）経線に沿って、網膜の各所で４ｍｍのＯＮＬの厚さが測定されたことは、これらの観察を裏付けていた。ベクターで処置した網膜の異なる位置におけるＯＮＬの平均的な厚さは、２１．２μｍ〜３３．４μｍの範囲であった一方、ビヒクルで処置した網膜は、１４．３μｍ〜２４．１μｍ（の範囲）のＯＮＬを有していた。より低い量のベクター投与（３×１０^８ｖｇ）を受けた網膜の免疫蛍光分析では、より小さい領域におけるｈＲＰＧＲの染色が明らかになった。但し、隣接する領域と比べ、この領域においては、より多くの光受容器が維持されていた。それゆえ、全領域（full-field）ＥＲＧによって評価されたように、全体的な機能的な保存性を欠いているにも関わらず、より低い量の投与を受けた群においては、ベクターが形質導入された領域の光受容器の維持が、依然として達成されていた。ロドプシンはＷＴ網膜の桿体ＯＳにおいてのみ観察されたが、ビヒクルで処置したＲｐｇｒ−ＫＯ網膜の、内節（ＩＳ）、核周囲及びシナプス末端で追加的な染色が観察された。対照の網膜においてはロドプシンの誤局在は明らかであった一方、ベクターで処置した（１×１０^９ｖｇのＡＡＶ８−ｈＲＰＧＲ）網膜におけるｈＲＰＧＲ発現が適切な領域においては、このロドプシンの誤局在は検出されなかった。

実施例６
本実施例は、より老齢なＲｐｇｒ−ＫＯマウスへのＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５遺伝子送達後の、網膜機能及び構造のレスキューについて実証する。

より大幅な変性を有する網膜がなお、治療の利益を得るかを評価するために、３×１０^８ｖｇのＡＡＶ８−ｍＲＰＧＲを１歳齢のＲｐｇｒ−ＫＯマウスの網膜下に注射した。注射後（ＰＩ）５カ月で検査したとき、ベクター及びビヒクルで処置した眼の間には、検知できるほどの違いは見られなかった。しかし、マウスが２３月齢であったとき、注射後（ＰＩ）１１カ月では、ベクターで処置した眼においてＥＲＧのレスキューが明らかになった。ＯＣＴイメージングでは、ビヒクルを注射した対照よりも、ベクターを注射した網膜におけるＯＮＬがかなり厚いことが明らかになった。この発見は続いて形態分析によって確認された。ベクターを注射した眼で、ＲＰＧＲが発現している領域においては、対照の網膜と比べて、大幅により多くの光受容器の列が観察された。これらの結果は、網膜における活発な変性を伴う高齢時の処置であるときであっても、Ｒｐｇｒ−ＫＯマウスがなお、Ｒｐｇｒ遺伝子送達に有利に応答し得ることを示唆する。

実施例７〜１２
以下の材料及び方法は、実施例７〜１２において用いられた：

Ｒｐ２−ＫＯマウス系統の生成及び動物飼育
Ｒｐ２−ＫＯマウス系統はＲｐ２^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}系統と、遍在的にＣｒｅを発現する系統（ＣＡＧｃｒｅ及びＺｐ３Ｃｒｅ系統）との交配によって作製した。上記の実施例１〜６で記載した方法の「マウス系統及び飼育」の節において記載したように、全てのマウスを維持した。

ＡＡＶベクターの構築及び産生
ＣｌａＩとＸｈｏＩ部位を有する、合成ヒトＲＰ２のｃＤＮＡ（配列番号１）を、ロドプシン・キナーゼ・プロモーター（配列番号１０）、キメラ（βグロビン／ＣＭＶ）イントロン（配列番号９）及びβグロビン・ポリＡテイル（配列番号７）を有するベクターにクローニングした。ＡＡＶ２型の逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）（配列番号１２及び１３）をＡＡＶベクター構築に用いた。それを自己相補的ＡＡＶベクターにするために、左のＩＴＲ（プロモーター領域に近いＩＴＲ）（配列番号１３）は、末端解離部位（terminal resolution site）及びＡＡＶＤ配列を除去するように変異させた。

Grimmら、Blood, 102: 2412-2419 (2003)に記載されているように、ＡＡＶベクターを産生するために、ＨＥＫ２９３細胞に対する三重プラスミド・トランスフェクションを用いた。自己相補的なヒトＲＰ２コンストラクト（配列番号１４）をＡＡＶ８キャプシド（配列番号５）にパッケージした。ウイルス量は、以下のプライマー及び蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって測定した：
・フォワード・プライマー（5'-3'）：-GCACCTTCTTGCCACTCCTA（配列番号２０）；
・リバース・プライマー（5'-3'）：-GACACAGCACCAGGCTAAATCC（配列番号２１）；及び
・プローブ（5'-3'）：-CGTCCTCCGTGACCCCGGC（配列番号２２）。

網膜下注射
網膜下注射は、幾つかの点を改良し、Sunら、Gene Therapy, 17: 117-131 (2010)に記載されているように行った。マウスは、ケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。局所的なアトロピン（１％）及びトロピカミド（０．５％）で、瞳孔を拡張させた。プロパラケイン（０．５％）を局所麻酔として用いた。眼科手術用顕微鏡の下で、手術を行った。１８ケージの皮下注射針を用いて、縁の近傍で角膜を僅かに切開した。ハミルトン・シリンジに取り付けた３３ゲージのブラント針（blunt needle）を、切開部を通し、水晶体を避けて挿入し、網膜に突き刺した。治療用ベクター又は生理的食塩水溶液のいずれかを含有する試料を１μｌ、網膜下に送達した。治療用ベクターは、右目に投与し、ビヒクルをもう片方の眼に投与した。ベクター懸濁液の０．１体積％で、フルオレセイン（１００ｍｇ／ｍｌＡＫ−ＦＬＵＯＲ（フルオレセイン、注入用、USP）、Alcon, Fort Worth, TX, USA）を添加し、注入している間の可視化を助けた。

ＥＲＧ
ＥＳＰＩＯＮＥＥ２網膜電図システムを用いて、ＥＲＧを行った。マウスを、オーバーナイトで暗順応させた。局所的なアトロピン（１％）及びトロピカミド（０．５％）で、瞳孔を拡張させた。マウスは、ケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）及びキシラジン（８ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。上記の手順は全て、薄暗い赤色光の下で行った。０．５％のプロパラケイン局所麻酔及び角膜湿潤（hydration）のための２％メチルセルロースの液滴を含むゴールド・ワイヤー・ループを用いて、両目からＥＲＧを記録した。口の中に設置したゴールド・ワイヤー・ループを基準として用い、接地電極を尾部に設置した。−４ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２〜＋３ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２の範囲の、短時間の白色フラッシュ強度で、暗闇中での暗順応ＥＲＧを測定した。白色光で２分の明順応後、明順応ＥＲＧを記録した。バックグラウンドの白色光強度を２０ｃｄ／ｍ^２として、−０．５３ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２〜＋２ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２の範囲の、短時間の白色フラッシュ強度で、ＥＲＧを記録した。フリッカー応答（flicker response）は、１０Ｈｚのライトフリック（light flicks）で取得した。Ｍ及びＳオプシンを介したＥＲＧ応答を記録するために、マウスを最初に２０ｃｄ／ｍ^２の光強度の緑色光の下で、２分間、明順応させた。ＥＲＧは、緑色及び紫外線（ＵＶ）のフラッシュを交互にすることにより記録した。緑色フラッシュについては−０．５２〜＋２ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２の範囲の強度、ＵＶフラッシュについては−４〜−０．５２ｌｏｇｃｄ−ｓ／ｍ^２の範囲の強度、バックグラウンドの緑色照明は２０ｃｄ／ｍ^２とした。様々なベクター投与量で処置したＲｐ２−ＫＯマウス、及び同腹子の野生型マウスから、ＥＲＧを記録した。

視力の決定
マウスの視力は、Douglasら、 Vis. Neurosci., 22: 677-684 (2005)及びPruskyら、 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 45: 4611-4616 (2004)に記載のプロトコールに従って、Cerebral Mechanicsが開発した、視運動性反射（ＯＫＲ）アリーナ（arena）における、視運動テストによって決定した。簡易には、４つのコンピューター画面、及び上部には動物の動きをモニターするためのカメラに囲まれた、閉鎖されたＯＫＲアリーナの中心に、マウスを置いた。コンピューター画面は、３次元確認（3D confirmation）における正弦波格子を有する回転しているドラムの仮想イメージを作り出す。マウスによる格子の追跡は、頭及び首の動きによってスコア化した。格子の空間周波数は、ＯＰＴＯＭＯＴＲＹソフトウェア（Version 14）によって制御し、モニターした。動物による追跡の動きを生成する、１００％背景のコントラストにおける、最大の空間周波数を、各眼について記録した。

免疫ブロッティング
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡバッファーの中で、全体の網膜溶解物を超音波破砕によって調製した。溶解物は、遠心分離によって透明にし、ブラッドフォード試薬を用いてタンパク質を見積もった。約２０μｇのタンパク質を、１０％変性タンパク質ゲル（BioRad, Hercules, CA）の全てのレーンで用いた。ヒトＲＰ２及びβアクチンに対する一次抗体を用いた標準的な手順を用いて、免疫ブロッティングを行った。タンパク質を、ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化二次抗体と適切な試薬で可視化した。

免疫組織化学
免疫組織化学のために、マウスを安楽死させ、眼を摘出した。眼を４％ＰＦＡ溶液で１〜２時間、固定し、凍結防止のための一連のスクロース溶液を浸透させて、ＯＣＴ溶液内で急速に凍結した。１２μｍの厚さの一連の網膜切片を、低温保持装置によって、上下極配向で切った。下記のプロトコールを用いて、該切片を、特異的抗体（Ｍ及びＳ錐体オプシン、ロドプシン、ＰＮＡ、ＲＰ２）で染色した。簡易には、切片を、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の５％ヤギ血清で、１時間ブロックし、続いて、２％ヤギ血清中で希釈した一次抗体中で、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。切片をＰＢＳＴで３回洗浄し、蛍光色素コンジュゲート化二次抗体及び０．２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩと共に、１時間インキュベートした。切片を再度、ＰＢＳで洗浄し、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ−Ｇ封入剤（SouthernBiotech, Birmingham, Alabama）の中で、マウントした。切片を可視化し、共焦点走査顕微鏡ＬＳＭ７００（Zeiss, Germany）で、画像を撮影した。

網膜の均一な厚さのマウントを調製するため、安楽死させたマウスから摘出された眼を、最初に、氷上にて、冷却ＰＢＳ溶液中で、１５分間、インキュベートした。その後、次いで、眼球を数回徐々に絞り、網膜を剥離した。次いで、眼球を４％ＰＦＡ中で、１時間固定し、眼の他の部分から網膜を分離し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含有するＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％ヤギ血清で、４時間ブロックした後、２％ヤギ血清中で希釈した一次抗体中で、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。網膜は再度、ＰＢＳＴ中で３回（２回は４５分ずつ、１回は１時間）洗浄し、蛍光色素コンジュゲート化二次抗体と共に、４時間インキュベートした。切片は再度、上記のようにして、ＰＢＳＴ中で洗浄し、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ−Ｇ封入剤（SouthernBiotech, Birmingham, Alabama）の中で、光受容器層が上向になるようにマウントした。共焦点走査顕微鏡ＬＳＭ７００（Zeiss, Germany）上で、画像を撮影した。

統計分析
ベクターで処置した眼とビヒクルで処置した眼における結果を比較するために、対応のある及び対応のない両側Ｔ検定を用いた。ＧＲＡＰＨＰＡＤＰｒｉｓｍ６ソフトウェア（GraphPad Software, La Jolla, CA）を統計分析のために用いた。

実施例７
本実施例は、Ｒｐ２−ＫＯマウスで、錐体光受容器の進行性の変性がみられることを実証する。

Ｒｐ２−ＫＯマウスモデルは、Ｒｐ２^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}マウスと、Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)に報告されている、ＣＡＧＣｒｅトランスジェニックマウス系統又はＺＰ３Ｃｒｅマウス系統のいずれかとを、交配させることによって生成した。ＺＰ３−Ｃｒｅ系統においては、Ｃｒｅが卵母細胞において特異的に発現している。Ｃｒｅは、ＣＡＧ−Ｃｒｅ系統に遍在的に発現しているが、Ｃｒｅ発現それ自体は、Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)に示されているように、網膜機能に影響しない。Ｒｐ２−ＫＯ系統においてでさえ、ＣＡＧ−Ｃｒｅ導入遺伝子の追加は、網膜に更なる影響を与えない。結果として得られたＲｐ２−ＫＯマウス系統においては、ＲＰ２エキソン２は欠失しており、網膜及び他の組織においてＲＰ２タンパク質は検出されなかった（Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)）。このモデルにおける網膜変性の進行を評価するために、野生型（ＷＴ）の同腹子と共に、マウスの大きなコホートを、１８カ月の期間、網膜電図（ＥＲＧ）によってモニターした。暗順応ａ波の振幅には、主に、桿体が寄与する。錐体に由来するａ波は、明順応条件下では比較的小さいが、ｂ波は内網膜神経（inner retina neuron）によって産生され、錐体システムの活性を反映している。それ故、暗順応ａ波及び明順応ｂ波は、ぞれぞれ桿体及び錐体の機能を表わすために用いられる。以前の観察結果（Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)、Zhangら、FASEB J., 29: 932-942 (2014)）と一致して、Ｒｐ２−ＫＯマウスは実験期間中の全体を通して、有意に減少した暗順応ａ波及び明順応ｂ波の振幅を示した。暗順応及び明順応ＥＲＧの刺激強度は、それぞれ、−４．０〜３．０及び−１．０〜２．０ｌｏｇｃｄｓ／ｍ^２であった。このＥＲＧ振幅の減少は、観察したマウスの小群においては、早くも１月齢においてさえ起こった。このことは、若齢における、桿体及び錐体の両方の機能的障害を示している。しかしながら、ＥＲＧ振幅についての、ＷＴに対するＫＯの比の測定によって、１８カ月間を通して、ＫＯマウスにおいては、桿体及び錐体機能の間の、異なる動態が明らかになった。ＫＯの暗順応ａ波振幅は、ＷＴのそれと比べて追加的な減少がなく、４月齢後に、安定を維持していたのに対し、明順応ｂ波振幅の、ＷＴに対するＫＯの比は、４〜１８カ月の間で、一定に近い割合で、連続的に低下した。結果として、たった３３％の錐体ＥＲＧ振幅と比べて、桿体ＥＲＧ振幅の約７８％が、１８カ月において維持されていた。このことは、ＫＯマウスの、錐体機能の、より深刻な障害を実証している。さらに、薄暗いフラッシュ強度での暗順応ｂ波について、ＫＯとＷＴマウス間で相違が観察されなかったことから、桿体機能における比較的軽度の障害は、内網膜機能に有意な影響を与えなかった。ＫＯ網膜における錐体機能の進行性の悪化はまた、フリッカー応答における顕著な減少を反映した。

ＷＴの同腹子と比べたとき、明順応ｂ波のキネティックスにおける有意な変化が、Ｒｐ２−ＫＯマウスにおいて観察された。このことは、Zhangら、FASEB J., 29: 932-942 (2014)における結果と一致している。応答キネティックスを評価するために、ｂ波の振幅頂点における振幅の５０％まで上昇させるのに掛かる時間（Ｔ_{５０ｒｉｓｅ}）、振幅の頂点に到達するのに掛かる時間（Ｔ_ｍａｘ、潜時と同じ）及びその頂点から振幅頂点の５０％に低下させるのに掛かる時間（Ｔ_５０ｄｅｃａｙ）を測定した。３つの測定項目全てにおいて、４月齢のＫＯマウスは、ＷＴの同腹子よりも、有意に長い経時変化を示した。特に、かなり長いＴ_５０ｄｅｃａｙ（ＷＴでは４０．１±１．６ｍｓであるのに対し、ＫＯでは８１．８±５．５ｍｓ、平均値±標準誤差）に反映されるように、ｂ波の下降局面のキネティックスは、ＷＴと比べ、ＫＯマウスにおいて明らかにゆっくりであった。より長いＴ_ｍａｘ及びＴ_５０ｄｅｃａｙが、１月齢のＫＯマウスにおいて既に観察されたことから、キネティックスにおけるこの変化は、早く始まっている。ＫＯとＷＴマウスの間のキネティックスの相違は、錐体システムに特異的であるようであった。純粋な桿体システムの機能を反映している、低いフラッシュ刺激強度での暗順応ｂ波では、そのような変化が観察されなかったからである。

錐体を介したＥＲＧでの結果と一致して、ＷＴ網膜と比べて、非常に少ないＭ又はＳ錐体光受容器が、１８月齢において観察された。このことは、Ｒｐ２−ＫＯ網膜における深刻な錐体の変性を示している。それに対して、桿体が優先する光受容器層の厚さにおいては、１８カ月間、検出可能な変化がみられなかった。さらに、Ｒｐ２−ＫＯマウスにおけるロドプシンの分布は、ロドプシンが主にＯＳにおいて（それ本来の位置で）検出されるＷＴマウスと同じ状態を維持していた。桿体が優先する光受容器層の厚さは、１８月齢のＫＯ網膜においてさえ有意に変化しなかった。ＫＯマウスにおける、比較的軽度の桿体の機能障害は、超微細構造分析によって明らかにされたように（Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)）、組織的にやや乱れたＯＳによって引き起こされるようである。桿体の乱れは、光学顕微鏡分析によっては、捉えられなかった。

実施例８
本実施例は、ヒトＲＰ２ｃＤＮＡを有するＡＡＶ８ベクターが、マウス光受容器における安定なＲＰ２発現を媒介することを実証する。

ＲＰ２関連網膜変性の遺伝子治療法を開発するために、ヒトＲＰ２発現カセットを有するＡＡＶベクターを設計し、構築した。該ベクター（配列番号１４）は、光受容器特異的ヒト・ロドプシン・キナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号１０）、ＣＭＶ及びヒトβグロビン・ハイブリッド・イントロン（配列番号９）、ヒトＲＰ２ｃＤＮＡ（配列番号：１）、及びヒトβグロビン・ポリアデニル化部位（配列番号７）（２つのＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）（配列番号１２及び１３）由来の逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）が隣接する）からなる。ＲＫプロモーターは、マウスにおける桿体及び錐体の両方において、細胞特異的な導入遺伝子発現を起こし得ることが示されている（Khaniら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48: 3954-3961 (2007)）。このヒトＲＰ２発現カセットの長さは、より早期の発現を媒介する能力がある自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターに良く適合するサイズである、２キロベースペア（ｋｂ）より短く、従来の一本鎖（ｓｓ）ベクターよりも効率的に導入遺伝子を発現する。ｓｃベクターを構築するために、末端解離部位及びＡＡＶＤ配列が欠失した変異ＩＴＲで、ＷＴＩＴＲの一方を置き換えた。マウス及び非ヒト霊長類の光受容器に、非常に効率的に形質導入する血清型である、ＡＡＶ８（配列番号５）に該ベクターをパッケージし、配列番号２（ヒトＲＰ２）のアミノ酸配列をコードするＡＡＶ８−ｓｃＲＫ−ｈＲＰ２ベクター（配列番号１４）と名付けた。

該ベクターが、ヒトＲＰ２発現を媒介するかどうかを試験するために、該ベクターをＲＰ２−ＫＯマウスの網膜下に注射し、網膜抽出物を４週間後に、マウス及びヒトＲＰ２タンパク質の両方を認識するポリクローナル抗体と共に、イムノブロット分析に掛けた。ビヒクルで処置した網膜が、ＲＰ２特異的なバンドを何ら示さなかった一方で、ベクターで処置した網膜は、ヒト網膜溶解物のそれと同じである、予期された約４０ｋＤａの分子量において、バンドを示した。このことは、ヒトＲＰ２タンパク質を発現するベクターの能力を示している。ＷＴ網膜における内在性マウスＲＰ２タンパク質は、対応するヒトのタンパク質よりも、僅かに速く移動した。特定の理論又は機構に縛られることはないが、マウス及びヒトＲＰ２タンパク質は、類似した数のアミノ酸残基（a.a.）を含有するので（ヒトＲＰ２は、３５０ａ．ａ．、マウスＲＰ２は３４７ａ．ａ．)、この泳動移動度の違いは、２つのタンパク質の、異なるアミノ酸組成及び／又は翻訳後修飾を反映している可能性があると考えられる。

網膜において、ベクターによって発現したＲＰ２タンパク質の細胞局在及び細胞内局在を調べるために、免疫蛍光分析を行った。ＩＳ、外網状層及び内網状層（ＯＰＬ及びＩＰＬ）を含むＷＴ網膜の複数の層において、内在性マウスＲＰ２タンパク質が検出され、Ｒｐ２−ＫＯ網膜においては検出されなかった。該ベクターによって発現したヒトＲＰ２タンパク質は、最初に光受容器のＩＳ及び核に位置していたが、網膜の他の層においては、いずれも観察されなかった。特定の理論又は機構に縛られることはないが、これは恐らく、ＲＫプロモーターの特異性のため、及び網膜下投与の後に内網膜層に該ベクターが到達できないためであると考えられる。該ベクターによって媒介されるＲＰ２発現は、１８カ月の研究期間全体の間中、検出可能な喪失はなく、維持されていた。ビヒクルを注射したＲｐ２−ＫＯマウスにおいては、ＲＰ２タンパク質の発現が検出されなかった。

実施例９
本実施例は、広い投与量範囲でのＲｐ２遺伝子送達が、Ｒｐ２−ＫＯマウスにおける錐体機能をレスキューすることを実証する。

ＡＡＶ８−ｓｃＲＫ−ｈＲＰ２ベクターの治療効果を試験するために、４〜６週齢のＲｐ２−ＫＯマウスの網膜下に、３つの投与量：１×１０^８、３×１０^８及び１×１０^９ベクター・ゲノム（ｖｇ）／眼で、ベクターを投与した。マウスは、片側にベクターを注射し、反対側の眼には、対照としてビヒクルを注射した。マウスが１８月齢に達するまで、長期的なＥＲＧモニタリングを行った。個々のマウス間で、ＥＲＧ振幅における変動が大きいことを前提として、ベクター及びビヒクルで処置した眼を比較する研究を通してずっと、対応のあるＴ検定を用いた。ベクターで処置した眼における明順応ＥＲＧのｂ波振幅が、ビヒクルを注射したもう片方の眼と比べ、有意に大きかったことに反映されるように、１×１０^８及び３×１０^８ｖｇ／眼を投与した群においては、錐体機能のレスキューが達成された。この治療効果は、試験における最も早い時点である、４月齢において早くも観察され、その効果は試験期間全体を通して続いた。１８カ月において、対照の眼においては、たった約２８％しか残存していなかったのに対し、ベクターで処置した眼で、明所視ｂ波振幅のほぼ７５％（７１〜７８％）が維持されていた。明順応ｂ波振幅の維持に加えて、４月齢のマウスのベクターで処置した眼において測定された、ほぼ正常なＴ_５０ｒｉｓｅ、Ｔ_ｍａｘ及びＴ_５０ｄｅｃａｙによって明らかになったように、処置はＫＯ網膜におけるｂ波キネティックスの変性を完全に修正した。１８か月の研究期間の桿体ＥＲＧ応答（暗順応ａ波）について、ベクター及びビヒクルで処置した眼の間で、有意な差が観察されなかったので、１×１０^８ｖｇ／眼でのベクター処置は、桿体にとっては毒性が無いようであった。同様に、３×１０^８ｖｇ／眼でのベクター処置は、ある時点においては、僅かに低い暗順応応答が観察されたものの、一般に桿体においては顕著な効果がなかった。桿体における効果の欠落は、Ｒｐ２−ＫＯマウスの桿体における機能障害のより遅い進行を通して、早期の発症（１月齢以内且つベクター投与前、データ非表示）によって説明され得る。

１×１０^８及び３×１０^８ｖｇ／眼でのベクター処置の効果は、より低い投与量でなお機能し得るかどうかについての探索を促した。それゆえ、ベクターをマウスの１群に、５×１０^７ｖｇ／眼の投与量で投与し、治療したマウスを、６．５及び１８月齢でＥＲＧによって検査した。対照の眼に比べ、ベクターで処置した眼においては、有意により高い明順応ｂ波振幅が観察された。このことは、この低い投与量でのベクターの効力を示している。ベクターで処置した眼は、Ｍ及びＳ錐体によるＥＲＧ応答が同等の維持を示したので、錐体機能レスキューは、Ｍ又はＳ錐体に偏っていなかった。

ＲＰ２遺伝子送達が視力をより良くできるかどうかを決定するため、１×１０^８ｖｇ又は３×１０^８ｖｇのベクターで処置したマウスに、１９月齢で、明所視条件下において視運動性試験を行った。ベクターで処置した眼の視力は、ビヒクルで処置した眼のそれよりも有意に高かった。しかし、野生型対照よりも低かった。このことは、処置によって、ＲＰ２−ＫＯマウスにおける、錐体が媒介する視覚行動の改善を示している。

実施例１０
本実施例は、広い投与量範囲でのＲｐ２遺伝子送達が、Ｒｐ２−ＫＯマウスにおける錐体機能をレスキューすることを実証する。

既往の結果（Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)）と一致して、ＭオプシンはＷＴ錐体のＯＳに局在したが、ビヒクルで処置したＲｐ２−ＫＯの錐体においては、ＩＳ、核周囲及びシナプス末端への誤局在が見られた。加えて、ビヒクルで処置したＫＯ網膜のＭ錐体数は、ＷＴ網膜と比べ、６．５月齢で、減少しているようであった。このことは、実質的な錐体の変性を示している。しかし、ベクターで処置した網膜においては、Ｍオプシンの誤局在は緩和され、より多くのＭ錐体細胞が維持されていた。Ｍオプシンの正常な細胞内局在は、ベクターで処置した網膜において観察された。このことは、治療が、Ｍ錐体の輸送ミス（mis-trafficking）を防ぐか、反転させたかのいずれかであったことを示唆している。同様に、ビヒクル又はベクターのいずれかで処置した、ＫＯの眼においてはＳオプシンの検出できる程度の誤局在が見られなかったが、ベクターで処置した網膜においては、より多くのＳ錐体が観察された。Zhangら、FASEB J., 29(3):932-42 (2015)の結果と一致して、錐体ＰＤＥ６発現は、ビヒクルで処置したＲｐ２−ＫＯ網膜の外節において殆ど検出出来なかった一方で、ベクターで処置した網膜は、外節におけるタンパク質の正常に近い発現を保持していた。２つの桿体特異的タンパク質である、ロドプシン及びＰＤＥ６βの局在もまた検査した。これらの２つのタンパク質は主に、ＷＴ網膜の光受容器のＯＳに局在しており、ＫＯ網膜におけるそれらの発現又は局在は、ベクター処置による影響を受けなかった。

網膜の上側及び下側の両方における、ピーナッツ・アグルチニン（ＰＮＡ）で染色された細胞数が、対照の眼のそれと比べ、有意に多かったことで明らかになったように、最終の１８カ月時点において、処置した眼の錐体レスキューがより顕著であった。網膜のホール・マウント及び切片の両方の免疫蛍光分析は、ビヒクルで処置した網膜よりも、ベクターで処置したＫＯ網膜におけるＭ及びＳ錐体数が有意に多いことを明らかにした。

実施例１１
本実施例は、遅い時期のＲＰ２遺伝子送達が、Ｒｐ２−ＫＯマウスにおける錐体機能及び生存率を維持することを実証する。

錐体機能の障害は、Ｒｐ２−ＫＯマウスモデルにおいては、１月齢の前に始まる（実施例７、Liら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54: 4503-4511 (2013)）。より進行した錐体機能障害を有するＲｐ２−ＫＯマウスが、なお、処置による利益を受けるかどうかを評価するため、１０月齢のＲｐ２−ＫＯマウスに、ベクターを３×１０^８ｖｇ／眼の用量で投与し、１８月齢に達した時に、それらの網膜機能及び構造を検査した。桿体ＥＲＧにおいては違いは見られなかったが、ベクターで処置した眼は、ビヒクルで処置した眼と比べて、有意に高い明順応ｂ波振幅を示した。このことと一致して、実質的なＭ及びＳオプシン並びに錐体ＰＤＥ６発現細胞が、ビヒクルで処置した網膜とは対照的に、ベクターで処置した網膜において観察された。

実施例１２
本実施例は、Ｒｐ２−ＫＯマウスで使用するためのＲＰ２ベクターの効果的な投与量を実証する。

５×１０^７〜３×１０^８ｖｇ／眼の範囲のベクター投与量で、上記のように、Ｒｐ２−ＫＯマウスの錐体・光受容器の機能及び生存性をレスキューする際に効能が見られた。３×１０^８ｖｇの投与量群においては、８及び１２ヶ月で、僅かな低下が見られたが、これらの投与量は、１８カ月の研究期間において、桿体機能には影響しないようであった。毒性の大部分は、暗順応ＥＲＧ応答に限られていた。このことは、この投与量では、桿体に対してベクターの一時的な毒性があることを示している。しかし、錐体機能は、３×１０^８ｖｇの投与量では、有意に改善した。それに対して、暗順応ａ波及びｂ波の顕著に減衰した振幅に反映していたように、１×１０^９ｖｇ／眼の投与を受けたマウスは、ＥＲＧ検査の全ての時点（４カ月、８カ月及び１８カ月）において、桿体機能に有意な障害を呈していた。この投与量は４及び８カ月で錐体機能を維持したが、１８カ月では、この処置の利益は結局、減退した。特定の理論又は機構に縛られることはないが、これは恐らく桿体が最終的に消失したことによって引き起こされた、二次的な錐体の細胞死のためであると考えられる。最終の１８カ月時点での網膜切片の免疫蛍光分析によって、１×１０^９ｖｇで処置した眼においては、複数領域において、外核層が、かなり薄くなっていたか、又は小さくさえなっていたことが明らかになった。それに対して、１×１０^８ｖｇで処置した眼においては、明らかな変化は見られなかった。それゆえ、１×１０^９ｖｇ／眼の投与では、網膜に毒性があった。

本明細書において引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に、具体的に、参照によって取り込まれることが示されるように、かつ全体が明細書に記載されているのと、同程度に、（文献を）参照することによって本明細書に取り込まれる。

本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも１つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。１以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、記された項目（Ａ又はＢ）から選択された１つの項目、又は列記された項目（Ａ及びＢ）の２以上の任意の組合せを意味するものとして解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（すなわち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明ことを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために、本発明者らに知られている最良の形態を含め、本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読めば、当業者にとって明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予期しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形例における上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。

Claims

下記の成分：
（ａ）ＲＰ２又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列であって、ＲＰ２の機能的断片はＡＤＰリボシル化因子様３（ＡＲＬ３）のためのＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質としてのその機能を維持するヌクレオチド配列；
（ｂ）第一のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）又はその機能的断片、及び第二のＩＴＲ又はその機能的断片であって、第一及び第二のＩＴＲの機能的断片はベクターの複製を可能にする能力を維持するＡＡＶ２ＩＴＲ又はその機能的断片；
（ｃ）ヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナル、又はその機能的断片であって、当該機能的断片はＲＮＡ切断複合体によって認識される能力を維持する、ヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナルの機能的断片；
（ｄ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／ヒトβグロビン・イントロン；
（ｅ）配列番号１０のヌクレオチド配列を含むヒトロドプシン・キナーゼ・プロモーターであって；ＲＰ２をコードするヌクレオチド配列が又はその機能的断片が前記ロドプシン・キナーゼ・プロモーターの転写調節下にある、ヒトロドプシン・キナーゼ・プロモーター；
を含む核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、及び
ここでベクターの成分は５’から３’に：第一のＩＴＲ又はその機能的断片、ヒトロドプシン・キナーゼ・プロモーター、ＣＭＶ／ヒトβグロビン・イントロン、ＲＰ２又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列；ヒトβグロビン・ポリアデニル化シグナル又はその機能的断片、及び第二のＩＴＲ又はその機能的断片、の順序である、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
前記核酸が自己相補的である、請求項１に記載のベクター。
前記核酸が配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のベクター。
前記ベクターがＡＡＶ８又はＡＡＶ９ベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
前記第一のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が、配列番号１２と１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
前記第二のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が、配列番号１２と１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物であって、医薬的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む、その治療又は予防を必要とする哺乳動物における、Ｘ連鎖性網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）を治療又は予防するための剤。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物の網膜における光受容器数を増加させるための剤。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物の視力を増加させるための剤。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物における網膜剥離を低減するための剤。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物における光受容器の電気的応答を増加させるための剤。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物の網膜におけるタンパク質の発現を増加させるための剤であって、前記タンパク質がＲＰ２、錐体オプシン又は錐体ＰＤＥ６である、剤。
前記ベクターが、ＲＰ２をコードするヌクレオチド配列を含み、５×１０^６〜５×１０^１２ベクター・ゲノム（ｖｇ）／眼の投与量で投与される、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の剤。
前記哺乳動物がヒトである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の剤。