JP6935896B2 - 体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法 - Google Patents

Description

本開示は、体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法に関するものである。

従来、ｉＰＳ細胞は、無限の増殖能と、すべての体細胞に分化し得る能力を有するので、再生医療等に使用される細胞ソースとして期待されており、細胞を培養するために、各種の方法や装置が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０１４−２２６０４６号公報

しかしながら、前記従来の技術では、培養された細胞を生体内に移植すると免疫細胞による攻撃を受けてしまう、という問題があった。

ここでは、前記従来の技術の問題点を解決して、細胞をコアに含むハイドロゲルファイバを作製し、該ハイドロゲルファイバを体内に移植することによって、前記細胞が免疫攻撃を受けることがなく、表面が線維化してしまうことがなく、体外への取出しも可能な体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法を提供することを目的とする。

そのために、体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、体内移植用のハイドロゲルファイバであって、細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下である。

他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記シェルは、半透膜として機能する。

更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記半透膜は、酸素、栄養分及び前記細胞の分泌物質の透過を可能とし、前記細胞並びに前記生体内の免疫細胞及び抗体の透過を不可とする。

更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記コアは、細胞外マトリックスを更に含む。

更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記細胞は、分化細胞である。

更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記外径は、０．５〜４０．０〔ｍｍ〕である。

ハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、ハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法であって、細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバをヒトを除く生体の体内に移植する工程、を含む。

他のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、さらに、前記ハイドロゲルファイバを前記生体の体内から取り出して回収する工程を更に含む。

更に他のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、さらに、前記外径は、０．５〜４０．０〔ｍｍ〕である。

本開示によれば、免疫攻撃を受けることなく、細胞を体内移植することができ、かつ、体外へ取り出すこともできる。

本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ及びその製造方法を示す模式図である。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの体内移植方法を示す模式図である。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの外径と細胞の付着及び線維化との関係を示す図である。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの物性評価結果を示す図である。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示す図である。 本実施の形態における生体内への移植前後のハイドロゲルファイバを示す図である。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの長期移植による血糖値の変化を示すグラフである。 本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの移植後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果を示すグラフである。 本実施の形態におけるコアにＥＣＭを含まないハイドロゲルファイバを移植した結果を示す図である。

以下、本実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ及びその製造方法を示す模式図である。

図において、２０は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバであり、１０は該ハイドロゲルファイバ２０を作製するための作製装置である。前記ハイドロゲルファイバ２０は、中央のコア２１と該コア２１を被覆するシェル（被覆）２２とを備える、いわゆるコアシェル型の同心型ファイバであって、例えば、特許文献２に記載されたマイクロファイバと同様のものである。また、前記作製装置１０も、特許文献２に記載されたものと同様である。そして、前記ハイドロゲルファイバ２０は、特許文献２に記載されたマイクロファイバの製造方法に従って製造される。
特許第５６３３０７７号公報

典型的には、前記コア２１は、マトリゲル、コラーゲンゲル等のゲルや液体培地から成る細胞外マトリックス、すなわち、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）と、該ＥＣＭ内に混入された複数の細胞２３とを含んでいる。なお、ＥＣＭは、省略することもできる。また、前記シェル２２は、アルギン酸ゲル等の高強度ハイドロゲルを含んでいる。さらに、前記細胞２３は、いかなる種類のものであってもよく、例えば、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞であってもよいし、幹細胞を分化することで得られる種々の機能性を有する細胞（分化細胞）であってもよいし、肝臓、膵臓等の臓器の細胞であってもよいし、分化可能な幹細胞由来の膵臓β細胞であってもよい。

本実施の形態における実験例では、細胞２３としてラットの膵島（Ｉｓｌｅｔ）が選択され、ＥＣＭとしてコラーゲンが選択された。そして、図に示されるように、作製装置１０の同軸マイクロ流路に、ＥＣＭとしてコラーゲンと細胞２３としてラットの初代膵島細胞との混合流体がコア流体として供給された。また、Ｇ／Ｍ比が０．６より大きい高純度アルギン酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｌｇ）水溶液がシェル流体として供給された。なお、Ｇ／Ｍ比は、アルギン酸中のマンヌロン酸（Ｍ）とグルロン酸（Ｇ）との比である。さらに、塩化バリウム（ＢａＣｌ₂ ）水溶液がシース流体として供給された。

これにより、シェルとシースとの界面でゲル化が誘起され、図に示されるようなハイドロゲルファイバ２０が作製された。該ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２は、アルギン酸バリウム（Ｂａ−Ａｌｇ）のゲルから成り、半透膜として機能する。また、コア２１は、細胞２３としてのラットの初代膵島細胞を内包する膵島懸濁液である。

本実施の形態における実験例では、外径が相違する６種類のハイドロゲルファイバ２０が作製されて使用された。前記外径は、０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である。なお、前記外径の数値は、不可避的な公差を含むものであり、例えば、１．０〔ｍｍ〕は、公差を考慮して表現すれば、１．０±０．０９〔ｍｍ〕である。また、ハイドロゲルファイバ２０の長さは、正規化されてすべて同一であり、１０〔ｃｍ〕である。

次に、前記ハイドロゲルファイバ２０の体内移植方法について説明する。

図２は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの体内移植方法を示す模式図である。

図において、３０は、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体としてのマウスである。前記ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体は、いかなる種類の動物であってもよく、例えば、ヒト、ペット、家畜等であってもよいが、ここでは、マウスであるものとして説明する。

本実施の形態における実験例では、マウス３０として、免疫機能を有する糖尿病モデルマウス（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍｏｕｓｅ）であって、化学物質ＳＴＺ（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）で誘起されたＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウスが選択された。具体的には、該糖尿病モデルマウスは、三協ラボサービス株式会社が販売するものである。そして、前述のように、コア２１にラットの初代膵島細胞を内包する（Ｉｓｌｅｔ−ｌａｄｅｎ）ハイドロゲルファイバ２０が、マウス３０の腹腔内へ移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）された。

前述のように、ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２が半透膜として機能するので、膵島細胞である細胞２３が生成するインシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）は、シェル２２を透過してマウス３０の腹腔内に供給されるが、マウス３０の腹腔内の免疫細胞（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ）は、シェル２２を透過することができず、コア２１内に進入することがない。なお、酸素（Ｏ₂ ）及び栄養分（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ）は、シェル２２を透過することができ、コア２１内の細胞２３に供給される。

また、移植されたハイドロゲルファイバ２０は、必要に応じて、いつでも、マウス３０の腹腔内からの取出し（Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）が可能である。

次に、本実施の形態における実験例について詳細に説明する。

図３は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの外径と細胞の付着及び線維化との関係を示す図である。なお、図において、（ａ）は細胞が付着した各種外径のハイドロゲルファイバの顕微鏡写真、（ｂ）はハイドロゲルファイバに付着した細胞のカウント数をハイドロゲルファイバの外径毎に示すグラフ、（ｃ）はハイドロゲルファイバに付着した細胞のカウント数を、移植動物の腹囲の最大直径に対するハイドロゲルファイバの外径の比率毎に示すグラフである。

前述のように、長さはすべて１０〔ｃｍ〕であるが、外径が、それぞれ、０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である６種類のハイドロゲルファイバ２０が、前記作製装置１０によって作製された。いずれのハイドロゲルファイバ２０も、シェル２２がアルギン酸バリウムのゲルから成り、コア２１にラットの初代膵島細胞を内包する。

そして、６種類のハイドロゲルファイバ２０は、ピンセットを使用して、免疫機能を有する健常な（糖尿病でない）Ｃ５７ＢＬ／６型マウスの腹腔内に、それぞれ、移植され、１４日間経過した後、前記腹腔内から取り出された。なお、１４日間という期間は、移植された組織に対する異物反応（ＦＢＲ：Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｂｏｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を観察するのに適した期間とされている。

前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面を観察すると、図３（ａ）に示されるように、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０への細胞付着（線維化）が少ないことが分かった。なお、図３（ａ）には、左から順に、外径が０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である前記腹腔内から取り出されたハイドロゲルファイバ２０の顕微鏡写真が示されている。

また、図３（ｂ）には、前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面に付着している細胞の数をカウントした結果を、ハイドロゲルファイバ２０の外径毎にまとめた結果が示されている。なお、図３（ｂ）に示される結果は、その縦軸に記載されているように、細胞数を各ハイドロゲルファイバ２０の断面積で除した値（Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を示している。

さらに、図３（ｂ）には、前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面に付着している細胞の数をカウントした結果を、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体である移植動物の腹囲の最大直径に対するハイドロゲルファイバ２０の外径の比率毎にまとめた結果が示されている。ここでは、移植動物であるマウスの腹囲の最大直径が３〔ｃｍ〕であるものとした。なお、図３（ｃ）において、縦軸は、細胞数を各ハイドロゲルファイバ２０の断面積で除した値を示し、横軸は、ハイドロゲルファイバ２０の直径をマウスの腹囲の最大直径で除した値を示している。

図３に示される結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０への細胞付着は少ないが、外径が０．７５〔ｍｍ〕未満及び１．５〔ｍｍ〕を超えるハイドロゲルファイバ２０への細胞付着が多いことが分かる。また、外径が０．７５〔ｍｍ〕未満のハイドロゲルファイバ２０は、絡み合って大きく凝集することが分かる。

なお、外径が２．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスのうちの何匹かは、移植して１日経過した後、死んでしまった。

これらの結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０では、表面への細胞付着及びその結果としての線維化が低減される、と言える。特に、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、生体から確実に取り出すことができ、かつ、異物反応を著しく緩和するものである、と言える。

次に、実験例で使用したハイドロゲルファイバ２０の物理化学的性質について説明する。

図４は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの物性評価結果を示す図、図５は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示す図である。なお、図４において、（ａ）は応力−ひずみ曲線を示すグラフ、（ｂ）は破断荷重を示すグラフ、（ｃ）は透過性を示す写真及びグラフであり、図５において、（ａ）は外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバを示す写真、（ｂ）は（ａ）に示されるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示すグラフ、（ｃ）は外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバを示す写真、（ｄ）は（ｃ）に示されるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示すグラフである。

ハイドロゲルファイバ２０の機械的性質は、操作の取扱い適正及び生体内での安定性と強く結び付いている。そこで、異なる太さのハイドロゲルファイバ２０の機械的性質を評価するために、外径が０．５０〔ｍｍ〕及び１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０によって作製され、引っ張り試験により、それらの引っ張り応力及びひずみと破断荷重とが計測された。その結果は、図４（ａ）及び（ｂ）に示されている。

図４（ａ）に示される結果から、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、引っ張り応力が７７〔ｋＰａ〕及びひずみが１．２となると破断したこと、外径０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、引っ張り応力が７４〔ｋＰａ〕及びひずみが１．１９となると破断したことが分かる。一方、図４（ｂ）に示される結果から、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の破断荷重、すなわち、耐荷重性は、外径０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の３倍であることが分かる。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０の外径が大きいほど耐荷重性が大きい、と言える。

細胞治療用の材料の包含にハイドロゲルファイバ２０を適用するためには、シェル２２は、材料の良好な分散と、栄養分及び酸素の透過とが可能でありながら、免疫細胞及び抗体の進入を防止する半透膜として機能することが求められる。そこで、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、半透膜としての性質を示すか否かの評価が行われた。具体的には、用意された外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識されたこととなる分子量（１０〔ｋＤａ〕、１５０〔ｋＤａ〕及び５００〔ｋＤａ〕）のデキストランであってシェル２２の半透膜性を調査するための蛍光マーカとして機能するデキストランを含有する食塩水中に浸漬された。

図４（ｃ）の共焦点の顕微鏡写真は、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから０時間後及び２４時間後の食塩水中のハイドロゲルファイバ２０の写真であって、ＦＩＴＣで標識された分子量１０〔ｋＤａ〕のデキストランが、実験開始後数分間以内に、ハイドロゲルファイバ２０内で急速に増加したことを示している。なお、顕微鏡写真内のスケールバーは、１００〔μｍ〕を表している。ＦＩＴＣで標識されたデキストランの分子量が１５０〔ｋＤａ〕の場合、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから０時間後では、ハイドロゲルファイバ２０の蛍光強度が変化しなかった。ＦＩＴＣで標識されたデキストランの分子量が５００〔ｋＤａ〕の場合、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから２４時間後でも、ハイドロゲルファイバ２０の蛍光強度が変化しなかった。これらの結果から、グルコース、インシュリン及び酸素を含む分子量１０〔ｋＤａ〕未満の小さな分子は、アルギン酸バリウムのゲルから成る膜であるシェル２２を透過して分散するのに対して、分子量５００〔ｋＤａ〕近傍の大きな分子及びミクロンサイズの免疫細胞はハイドロゲルファイバ２０内に進入することが困難である、と言える。

ハイドロゲルファイバ２０に内包された膵島細胞のインシュリン分泌をインビトロで評価するために、ラットの初代膵島細胞をコア２１に内包するハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０で作製されて用意された。前記ハイドロゲルファイバ２０では、図１に示されるように、ハイドロゲルのシェル２２によって周囲が完全に覆われたコア２１内に、細胞２３としてのラットの初代膵島細胞とＥＣＭとが内包されている。なお、作製装置１０の同軸マイクロ流路には、コア流体として、ラットの初代膵島細胞を含む天然のコラーゲン溶液が３〔ｍｇ／ｍＬ〕で供給され、シェル流体として、１．８〔％〕のアルギン酸ナトリウムが供給され、シース流体として、２５０〔ｍＭ〕のＤ−マニトール及び２５〔ｍＭ〕のＨＥＰＥＳを含む２０〔ｍＭ〕の塩化バリウム水溶液が供給された。

図５（ａ）及び（ｃ）の顕微鏡写真は、ラットの初代膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０の写真である。なお、顕微鏡写真内のスケールバーは、２００〔μｍ〕を表している。図５（ａ）は、６７０の膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の写真であり、図５（ｂ）は、該ハイドロゲルファイバ２０のグルコース刺激性インシュリン分泌（ＧＳＩＳ：Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を示すグラフであって、周囲のグルコース濃度が異なる３つのサンプルの平均値をそれぞれ示すものである。また、図５（ｃ）は、１０００の膵島細胞を内包する外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の写真であり、図５（ｄ）は、該ハイドロゲルファイバ２０のグルコース刺激性インシュリン分泌を示すグラフであって、周囲のグルコース濃度が異なる３つのサンプルの平均値をそれぞれ示すものである。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２は、十分な量の栄養分及び膵島細胞から分泌されたインシュリンの透過を可能としながら、膵島細胞の漏出を防止することができる、と言える。

次に、免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの生体内に移植されたラットの初代膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０について説明する。

図６は本実施の形態における生体内への移植前後のハイドロゲルファイバを示す図、図７は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの長期移植による血糖値の変化を示すグラフ、図８は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの移植後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果を示すグラフ、図９は本実施の形態におけるコアにＥＣＭを含まないハイドロゲルファイバを移植した結果を示す図である。なお、図６において、（ａ）〜（ｃ）は外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの移植前、生体内及び回収後の状態をそれぞれ示す写真、（ｄ）〜（ｆ）は外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの移植前、生体内及び回収後の状態をそれぞれ示す写真、（ｇ）はハイドロゲルファイバが移植されたマウスの血中グルコース濃度の変化を示すグラフ、（ｈ）はピンセットを使用した外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの取出しプロセスを示す写真であり、図９において、（ａ）はハイドロゲルファイバが移植されたマウスの血糖濃度の変化を示すグラフ、（ｂ）はハイドロゲルファイバの移植後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果を示すグラフ、（ｃ）は回収後のハイドロゲルファイバの状態を示す写真である。

外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０との比較において、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の生体からの取出し適正を評価するために、図６（ａ）及び（ｄ）にそれぞれ示されるように、１０００のラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕及び０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０によって作製されて用意された。これらのハイドロゲルファイバ２０は、免疫機能を有するＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウスの腹腔内に移植された。

そして、移植後には、生体内での構造変化を解析するために、移植されたハイドロゲルファイバ２０が生体内から取り出されて回収された。図６（ｂ）及び（ｅ）には、移植して３６日経過後及び２１日経過後における腹腔内のハイドロゲルファイバ２０の構造が示されている。図６（ｂ）及び（ｅ）から、移植されたハイドロゲルファイバ２０は、ばらばらに分解することなく、移植された部位に留まっていることが分かった。しかし、図６（ｅ）に示されるように、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、移植して２１日経過後には、厚い線維化した組織によって覆われた大きな凝集体を形成し、宿主の脂肪組織に付着していた。

また、図６（ｃ）及び（ｆ）には、移植して３６日経過後及び２１日経過後に腹腔内から取り出されて回収されたハイドロゲルファイバ２０のＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）染色された組織断面が示されている。図６（ｆ）に示されるように、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の場合、凝集体の裂け目が線維化し、内包された膵島細胞の核が失われていた。これは、移植が失敗したことを示している。

これに対して、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、図６（ｂ）に示されるように、移植して３６日経過後でも、凝集体を形成することなく、元の形状を保持しており、図６（ｈ）に示されるように、腹腔内から容易に取り出されて回収された。また、図６（ｃ）に示されるように、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０のＨＥ染色された組織断面は、内包された膵島細胞の核が生きていた。

移植後のハイドロゲルファイバ２０の機能性を評価するために、移植処置が行われた糖尿病モデルマウスの非空腹時の血糖濃度の測定が、少なくとも１日１回、行われた。なお、血糖濃度が２００〔ｍｇ／ｍＬ〕以下のマウスは、正常血糖と定義された。図６（ｇ）に示されるように、ハイドロゲルファイバ２０移植後の数日は、すべての糖尿病モデルマウスが正常血糖であった。しかし、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスは、１０日間正常血糖を維持することができなかった。一方、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスのすべて（ｎ＝３）は、ハイドロゲルファイバ２０の回収までの３６日間、血糖制御の回復が可能であった。

外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、移植して３６日経過後に糖尿病モデルマウスの腹腔内から取り出されて回収された。ハイドロゲルファイバ２０が回収された糖尿病モデルマウスのすべてにおいて、高血糖（血糖濃度が２００〔ｍｇ／ｍＬ〕より高い）の再現が確認された。このことは、移植された外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０に内包された膵島細胞が糖尿病モデルマウスの血糖濃度を制御していることを示している。

これらの結果から、膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０と比較して、回収性及び移植機能が高い、と言える。

糖尿病モデルマウスにおける長期の血糖制御のため、免疫機能を有する糖尿病モデルマウス（化学物質ＳＴＺで誘起されたＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウス）の腹腔内にラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０（マウス１匹当たり１５００のラットの初代膵島細胞を内包する長さ２０〔ｃｍ〕、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０）が３月間移植された。また、比較のために、膵島細胞を内包しないハイドロゲルファイバ２０の移植も行われた。図７に示されるように、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植された後、９１日経過後にハイドロゲルファイバ２０が回収されるまで、糖尿病モデルマウスのすべてにおいて、拒絶反応を示すことなく、血糖制御が回復された。９１日経過後であっても、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、糖尿病モデルマウスの臓器に付着することなく、腹腔内から取り出されて回収された。なお、回収後には、血糖濃度が高血糖に戻った。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０に内包されていない膵島細胞及び膵島細胞を内包する外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０と比較して、膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、回収可能な移植片として機能し、かつ、生体内での膵島細胞の機能性を向上させるものである、と言える。

図６（ａ）に示されるような外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されてから２８日経過後に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）が行われた。図８には、当該経口ブドウ糖負荷試験の遂行中におけるマウスの空腹時の血糖濃度の変化が示されている。この結果から、ハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスは、健常なマウスと同程度に、血糖濃度が正常に変化する、と言える。

ハイドロゲルファイバ２０のコア２１内におけるＥＣＭの存在が糖尿病モデルマウスに移植されたラットの膵島細胞の持続性に影響するか否かを確認するために、コア２１にＥＣＭを含むことなく５００のラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が、免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの腹腔内に移植された。図９（ａ）に示されるように、コア２１にＥＣＭを含むことなくラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスのすべてにおいて、血糖濃度は、正常血糖になり、当該実験を終了するためにハイドロゲルファイバ２０を回収するまでの１０５日間維持された。図９（ｂ）には、コア２１にＥＣＭを含むことなくラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されてから１０２日経過後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果が示されている。図９（ｂ）に示されるように、コア２１にＥＣＭが含まれていない場合でも、ハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスの空腹時の血糖濃度の変化は、健常なマウスと同程度であって、正常であった。また、図９（ｃ）の写真に示されるように、コア２１にＥＣＭが含まれていない場合でも、ハイドロゲルファイバ２０は、移植から１０５日後に腹腔内から容易に取り出されて回収することができ、しかも、凝集体を形成することなく、元の形状を保持していた。なお、写真内のスケールバーは、５〔ｍｍ〕を表している。これらの結果から、コア２１内におけるＥＣＭの存在は、ハイドロゲルファイバ２０によるラットの膵島細胞に必ずしも必要でない、と言える。

このように、本実施の形態における実験例の結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、外径がより小さいもの又はより大きいものよりも、著しく生体親和性が高い、と言える。特に、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、表面への細胞付着及び線維化が最小限になる。外径が０．７５〔ｍｍ〕未満のハイドロゲルファイバ２０は、生体内に移植されると、２週間以内に凝集体を形成する傾向がある。凝集体の形成は、マウスの腹腔内における物理的応力に対する機械的強度が低いことに起因する、と考えられる。凝集体の表面粗さ及びファイバの湾曲は、細胞付着及びコラーゲン吸着を容易にし、線維化を増進し、移植片であるハイドロゲルファイバ２０の機能不全を引き起こす、と考えられる。一方、外径が１．５〔ｍｍ〕を超えるハイドロゲルファイバ２０は、ファイバの湾曲が比較的小さく、細胞付着が低減されるものの、ファイバの体積がマウスの腹腔内空間に対して大きすぎるので、応力が大きくなり、炎症反応を引き起こして線維化が生じる、と考えられる。それに対し、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、凝集体の形成を防止し得る程度に機械的強度が高く、細胞付着を低減する程度に湾曲しているので、ＦＢＲを効果的に低減することができるとともに、多量の移植及び回収を可能にする、と考えられる。

また、本実施の形態における実験例の結果から、ラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、化学物質ＳＴＺで誘起された免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの血糖濃度の調整機能による治療能力を備えることが分かる。膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されることによって、糖尿病モデルマウスの血糖濃度が、ハイドロゲルファイバ２０が回収されるまでの３月間に亘り、拒絶反応を起こすことなく、正常化された。最適な直径のファイバ状の移植片である外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、細胞付着及び線維化を最小限にし、生体内での長期の生き残り及び移植後の回収の容易化を可能とした。なお、コア２１内に膵島細胞とともにＥＣＭが存在することによって膵島細胞の機能性が高まると考えられたが、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０のコア２１内におけるＥＣＭの存在は、化学物質ＳＴＺで誘起された免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの血糖濃度の調整機能の回復には、わずかな効果しか発揮しないことが分かった。これは、単離された膵島細胞の高い品質と、該膵島細胞自体によってＥＣＭプロテインの分泌に依るものである可能性がある。分化可能な幹細胞由来の膵臓β細胞又は細胞系を移植する場合、細胞とともに内包されるＥＣＭプロテインは、生体内で細胞の機能性を維持可能なものであることが望ましい。

また、ハイドロゲルファイバ２０では、内包された膵島細胞の損失及びはみ出しが発生しない。さらに、外径が数値範囲内であってラットの膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０を免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの生体内に移植することによって、免疫抑制なしに、長期間に亘る当該モデルマウスの血糖濃度制御が可能となる。

このように、本実施の形態における体内移植用のハイドロゲルファイバ２０は、細胞２３を含むコア２１と、ハイドロゲルを含み、コア２１を被覆するシェル２２とを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下である。これにより、免疫攻撃を受けることなく、細胞２３を生体の体内に移植することができ、体外へ取り出すこともできる。そして、ハイドロゲルファイバ２０は、表面が線維化してしまうことがなく、凝集してしまうこともなく、体外へ容易に取り出して回収することができる。

また、シェル２２は、半透膜として機能し、かかる半透膜は、酸素、栄養分及び細胞の分泌物質の透過を可能とし、細胞２３並びに生体内の免疫細胞及び抗体の透過を不可とする。さらに、コアは、細胞外マトリックスを更に含んでいる。さらに、細胞２３は、分化細胞である。これにより、移植された生体内で細胞２３はその機能性を維持することができる。

さらに、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕であることが望ましい。この場合、生体の体内への移植に最適である。なお、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜２．０〔ｍｍ〕であることがより望ましく、１．０±０．０９〔ｍｍ〕であることがさらに望ましい。

本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０を用いた体内移植方法は、細胞２３を含むコア２１と、ハイドロゲルを含み、コア２１を被覆するシェル２２とを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバ２０を製造する工程と、ハイドロゲルファイバ２０を生体の体内に移植する工程と、を含んでいる。これにより、免疫攻撃を受けることなく、細胞２３を生体の体内に移植することができる。

また、ハイドロゲルファイバ２０を用いた体内移植方法は、ハイドロゲルファイバ２０を生体の体内から取り出して回収する工程を更に含んでいる。したがって、必要に応じて、移植した細胞２３を体外へ取り出すことができる。

さらに、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕であることが望ましい。この場合、生体の体内への移植に最適である。なお、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜２．０〔ｍｍ〕であることがより望ましく、１．０±０．０９〔ｍｍ〕であることがさらに望ましい。

なお、移植の対象としての生体がヒトであることに、倫理的乃至法律的な制約がある場合には、前記生体からヒトを除外してもよい。

近年の再生医療工学の発展によって、ヒト由来の幹細胞を分化することで様々な機能性を有する細胞（分化細胞）を人工的に作製することが可能となってきている。しかしながら、実際の分化細胞を生体内に移植する際には、安全性及び機能性維持の観点から、細胞をデバイスに包埋して移植することが適切であると考えられ、生体適合性の高い移植デバイスの開発が急務となっている。本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０に内包された細胞２３は、免疫細胞に攻撃されることなく、異種生体内において機能を維持することが可能であり、必要に応じて生体から取り出すことも可能である。そのため、本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０は、再生医療分野における移植材料として利用価値が高い、と言える。

なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。

本開示は、体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法に適用することができる。

２０ ハイドロゲルファイバ
２１ コア
２２ シェル
２３ 細胞
３０ マウス

Claims (9)

1. 体内移植用のハイドロゲルファイバであって、
   細胞を含むコアと、
   ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、
   外径が０．５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であることを特徴とする体内移植用のハイドロゲルファイバ。
2. 前記シェルは、半透膜として機能する請求項１に記載の体内移植用のハイドロゲルファイバ。
3. 前記半透膜は、酸素、栄養分及び前記細胞の分泌物質の透過を可能とし、前記細胞並びに前記生体内の免疫細胞及び抗体の透過を不可とする請求項２に記載の体内移植用のハイドロゲルファイバ。
4. 前記コアは、細胞外マトリックスを更に含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の体内移植用のハイドロゲルファイバ。
5. 前記細胞は、分化細胞である請求項１〜４のいずれか１項に記載の体内移植用のハイドロゲルファイバ。
6. 前記外径は、０．５〜４０．０〔ｍｍ〕である請求項１〜５のいずれか１項に記載の体内移植用のハイドロゲルファイバ。
7. ハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法であって、
   細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバをヒトを除く生体の体内に移植する工程、を含むことを特徴とするハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法。
8. 前記ハイドロゲルファイバを前記生体の体内から取り出して回収する工程を更に含む請求項７に記載のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法。
9. 前記外径は、０．５〜４０．０〔ｍｍ〕である請求項７又は８に記載のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法。

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