JP6938964B2

JP6938964B2 - 生体試料の前処理器具

Info

Publication number: JP6938964B2
Application number: JP2017037207A
Authority: JP
Inventors: 真希子平岡; 裕川南; 岡本　淳; 淳岡本; 圭三米田; 米田　　圭三
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2021-09-22
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: JP2018141739A

Description

本発明は、生体試料中のヘモグロビンを定量する際に、測定誤差の原因となるビリルビン等の夾雑物質を除去するための前処理器具に関する。

糖尿病診断項目の一つである糖化ヘモグロビン（以下、ＨｂＡ１ｃと略すことがある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと略すことがある）に糖（グルコース）が結合した糖化ヘモグロビンの内、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総ヘモグロビン量に対するＨｂＡ１ｃ濃度が過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。

近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔＯｆＣａｒｅＴｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。

ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは毛細管現象を利用した免疫測定法であり、イムノクロマト法を利用した妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬などで用いられる分析技術であり世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、クロマトリーダー等の分析装置を利用し、検体中に含まれる物質の濃度を定量化する技術が開発されつつある。

しかし、血液中には、ビリルビンやアスコルビン酸等の還元物質が存在し、これらの物質の存在により、ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンの測定値は大きく影響を受け、測定値に誤差を生じることがある。また、ビリルビン等は色素としても作用することから、測定波長によっては誤差の原因となりうる。

ビリルビンの影響を回避する方法として、両性界面活性剤を測定試薬に添加する方法が知られている。例えば、特許文献１には、ビリルビンの影響を回避する目的で第１試薬に両性界面活性剤を添加することが記載されている。また、特許文献２には、酵素反応により生成される過酸化水素をペルオキシターゼ及び被酸化性発色剤で検出する生体成分の測定法において、第一試薬又は第一試薬と第二試薬両方に、両性界面活性剤とフェロシアン化合物を存在させる生体成分の測定方法が記載されている。

特開平７−０３９３９４号公報特開平７−１５５１９６号公報

本発明は、生体試料中のヘモグロビン濃度を定量的に測定する際に、測定誤差の原因となるビリルビン等の測定阻害物質を選択的、効率的に除去することができる生体試料の前処理器具を提供することを課題とする。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の構成を有する前処理器具を用いて生体試料を処理することにより、生体試料中の夾雑物質を選択的かつ瞬時に除去できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）生体試料中のヘモグロビンを定量的に分析する際に、前記生体試料からビリルビンを除去するための前処理器具であって、
前記器具は前記生体試料の入口と出口を有するハウジングケースと前記ハウジングケース内にビリルビンの除去材料が充填され、
前記除去材料は、粒状活性炭または活性炭素繊維であり、
前記除去材料の全細孔容積が０．２５〜１．００ｃｃ／ｇであることを特徴とする前処理器具。

本発明によれば、特定の構成を有する前処理器具に生体試料を接触させることにより、生体試料中の夾雑物質を選択的、効率的、速やかに除去できるので、夾雑物質の影響を受けずにヘモグロビン濃度を定量的に測定することができる。また、夾雑物質の影響が低減されるので、ヘモグロビンの極大吸収波長域での測定が可能となり、生体試料中のヘモグロビン濃度が低い場合にも高精度に測定することができる。

本発明の前処理器具の実施形態の一例（シリンジフィルタタイプ）を示す概略図。本発明の前処理器具の実施形態の他の一例（スポイトタイプ）を示す概略図。

本発明において、生体試料は、血液、血しょう、血清、便、尿などのヘモグロビンを含有する体液等を意味するが、それらの中には、ヘモグロビンを定量的に分析、特に吸光光度法を利用して分析（測定）する際に、測定誤差を与える多様な夾雑物質（測定阻害物質）が含まれている。

本発明は、生体試料を検出装置（イムノクロマト試験片）等に供する前に予め、生体試料中の夾雑物質を除去するための器具であって、前記器具は前記生体試料の入口と出口を有するハウジングケースと前記ハウジングケース内に夾雑物質の除去材料が充填されたものであることを特徴とする。以下、本発明の前処理器具の詳細について、図１を参照して説明する。

［実施形態１］
図１は、シリンジフィルタタイプの前処理器具の断面図を示す。図１において、１は、生体試料を導入するための試料入口である。また、２は、夾雑物質の除去材料である。また、３は、処理された生体試料への除去材料自体や除去材料からの溶出物のコンタミを防止するためのメンブレンフィルタである。さらに、４は、処理された生体試料を取り出すための試料出口である。なお、３は目的、用途により有っても無くてもよい。また、コンタミ防止を達成できるものであれば、他のものを代用してもよい。

試料入口１は、シリンジが液密に接続できるような構造を有していればよく、必要によりメス型ルアロック構造を有していてもよい。一方、試料出口４は、イムノクロマト試験片に直接試料を適量滴下できるように形状等を調節するのが好ましい。イムノクロマト試験片を用いた測定においては、その大きさにもよるが、凡そ１００μＬ〜５００μＬ程度を滴下できる形状とすればよい。

本発明において、夾雑物質の除去材料は、活性炭、活性炭素繊維（以下、活性炭と活性炭素繊維をあわせて単に活性炭と称することがある）、酸化チタン、ジビニルベンゼン／グリシジルメタクリレート共重合体および疎水性シリカからなる群から選ばれる１種以上であることが好ましい。これらの中で、活性炭が入手のしやすさやコストの面より好ましい。また、活性炭の中でも水処理用のものがより好ましい。

本発明において、夾雑物質の除去材料は、繊維、織布、不織布、粒子および粉末からなる群から選ばれる１以上の形態であることが好ましい。前処理器具をコンパクトにできることから、不織布や粒子、粉末の形態であることがより好ましい。ここで、酸化チタンおよび疎水性シリカは粒子状または粉末状のものが入手でき、それ以外は繊維状、不織布状、粒子状または粉末状のいずれも入手および調製可能である。

前記活性炭は、その原料（前駆体）は特に限定されるものではなく、例えばフェノール、セルロース、レーヨン、ポリアクリロニトリル系、ピッチ系、アラミド、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンベンゾビスオキサゾール、ポリビニルアルコール、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフェニレンオキサイドなどを挙げることができる。これらの材料を用いて、繊維、織布、不織布、粒子、粉末に成形した後、炭化、賦活化、必要により精製することで製造することができる。

本発明において、夾雑物質の除去材料は、多孔質体を用いる場合、その全細孔容積は０．２５〜１．００ｃｃ／ｇの範囲内であることが好ましい。全細孔容積が小さすぎると、生体試料中の夾雑物質を十分に除去できないことがあり、大きすぎると、単繊維の強度が著しく低下し、形態を保てないことがある。なお、全細孔容積は、例えば比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を用いて測定することができる。

本発明において、夾雑物質の除去材料は、その比表面積は５〜２５００ｍ^２／ｇの範囲内であることが好ましい。比表面積が小さすぎると、生体試料中の夾雑物質を十分に除去できないことがあるとか、前処理器具を必要以上に大きくする必要がある。また、比表面積が大きすぎると、単繊維の強度が著しく低下し、形態を保てないことがある。比表面積とは、液体窒素温度での窒素ガス吸着等温線によるＢＥＴ法により求められる比表面積を意味し、例えば比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を用いて測定することができる。

本発明において、夾雑物質の除去材料は、多孔質体を用いる場合、細孔直径が１０Å以下のマイクロポア容積が全マイクロポア容積の９５％以上であることが好ましい。細孔直径が１０Å以下のマイクロポア容積が全マイクロポア容積の９５％未満である場合には、細孔が大きくなりすぎて、夾雑物質が十分に除去されないことがある。なお、細孔直径１０Å以下のマイクロポア容積の割合は、例えば比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を用いて測定することができる。

本発明において、夾雑物質の除去材料が繊維形状の場合は、単繊維径が５〜３０μｍであることが好ましい。単繊維径が小さすぎると、夾雑物質を除去するための有効細孔を確保できないことがある。一方、単繊維径が大きすぎると、前処理器具のコンパクト性を損なうことがある。また、夾雑物質の除去材料が粒子状または粉末状である場合は、平均粒子径が１ｎｍ〜１ｍｍであることが好ましい。平均粒子径が小さすぎると、夾雑物質を除去するための有効細孔を確保できないことがある。一方、平均粒子径が大きすぎると、前処理器具のコンパクト性を損なうことがある。

本発明において、前記した材料を用いて構成された前処理器具がヘモグロビンは除去しないが、ビリルビンや乳ビ等の夾雑物質は除去するという選択性が発揮される理由は実は明らかでない。しかし、後述するようにヘモグロビンを溶解した溶液を前処理器具で処理しても処理前後で吸光度はほぼ低下しないが、ビリルビンを溶解した溶液を前処理器具で処理すると吸光度が大きく低下することからもビリルビンが選択的に除去されることは明らかである。

実施形態１において、例えばシリンジに希釈液で希釈された生体試料を必要量吸上げた後、シリンジの先端に本発明の前処理器具を装着し、シリンジのプランジャーを押し込んで生体試料または希釈された生体試料を前処理器具の試料出口より押し出すことにより、容易にビリルビン等の測定阻害物質を除去することができる。

［実施形態２］
実施形態１は、前処理器具が試料採取器具と別体となっているのに対して、実施形態２においては、試料採取器具が前処理器具と一体となっている点で異なる（図２参照）。

（比表面積の測定）
夾雑物質除去材料を約３０ｍｇ採取し、１２０℃で１２時間真空乾燥して秤量し、比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を使用して測定した。液体窒素の沸点（−１９５．８℃）における窒素ガスの吸着量を相対圧が０．０２〜０．９５の範囲で測定し、前記材料の吸着等温線を作成した。相対圧０．０２〜０．１５の範囲での結果をもとに、ＢＥＴ法により重量あたりの比表面積（単位：ｍ^２／ｇ）を求めた。

（全細孔容積の測定）
夾雑物質除去材料を約３０ｍｇ採取し、１２０℃で１２時間真空乾燥して秤量し、比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を使用して測定した。液体窒素の沸点（−１９５．８℃）における窒素ガスの吸着量を相対圧が０．０２〜０．９５の範囲で測定し、前記材料の吸着等温線を作成した。相対圧０．９５での結果より全細孔容積（単位：ｃｃ／ｇ）を算出した。

（全マイクロポア容積（Ａ））
夾雑物質除去材料を約３０ｍｇ採取し、１２０℃で１２時間真空乾燥して秤量し、比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を使用して測定した。液体窒素の沸点（−１９５．８℃）における窒素ガスの吸着量を相対圧が０．０２〜０．９５の範囲で測定し、前記材料の吸着等温線を作成した。この結果をＭＰ法によって解析範囲０〜２０Å、ｔ決定式Ｈ．Ｊの条件で解析し、吸着時のマイクロポア径分布数表の結果より全マイクロポア容積（Ａ）（単位：ｃｃ／ｇ）を算出した。

（細孔直径１０Å以下のマイクロポア容積（Ｂ））
夾雑物質除去材料を約３０ｍｇ採取し、１２０℃で１２時間真空乾燥して秤量し、比表面積・細孔分布測定装置Ｇｅｍｉｎｉ２３７５（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）を使用して測定した。液体窒素の沸点（−１９５．８℃）における窒素ガスの吸着量を相対圧が０．０２〜０．９５の範囲で測定し、前記材料の吸着等温線を作成した。この結果をＭＰ法によって解析範囲０〜２ｎｍ、ｔ決定式Ｈ．Ｊの条件で解析し、吸着時のマイクロポア径分布数表の結果より全マイクロポア容積（Ａ）から細孔直径１０．０３Å以上のマイクロポア容積を引いて、細孔直径１０Å以下のマイクロポア容積Ｂ（単位：ｃｃ／ｇ）を算出した。

（吸光度の測定）
各測定用試料について、分光光度計ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）を用いて、４２０ｎｍの吸光度を測定した。なお、測定用セルは、１ｍＬ容ディスポーザブルセルを用い、光路長１０ｍｍで測定した。

（前処理冶具１の作製）
図１に示されるような入口および出口を有するポリプロピレン製のフィルターホルダーにフェノール繊維を炭化、賦活化して得られた比表面積９７３ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．４２ｃｃ／ｇの活性炭素繊維を３４ｍｇ充填し、前処理器具１を作製した。

（前処理冶具２の作製）
フェノール繊維を炭化、賦活化して得られた比表面積１９６２ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．８５ｃｃ／ｇの活性炭素繊維３４ｍｇを充填した以外は、前処理器具１と同様にして前処理器具２を作製した。

（前処理冶具３の作製）
ピッチ系繊維を炭化、賦活化して得られた比表面積８５０ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．３５ｃｃ／ｇの活性炭素繊維３４ｍｇを充填した以外は、前処理器具１と同様にして前処理器具３を作製した。

（前処理冶具４の作製）
フェノール繊維を炭化、賦活化して得られた比表面積１５２０ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．６５ｃｃ／ｇの活性炭素繊維３４ｍｇを充填した以外は、前処理器具１と同様にして前処理器具４を作製した。

（前処理冶具５の作製）
ピッチ繊維を炭化、賦活化して得られた比表面積１７００ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．８０ｃｃ／ｇの活性炭素繊維３４ｍｇを充填した以外は、前処理器具１と同様にして前処理器具５を作製した。

（前処理冶具６の作製）
粒状活性炭（ユーイーエス社製、ＫＤ−ＧＷ−Ａ、比表面積１３２９ｍ^２／ｇ、全細孔容積０．４４ｃｃ／ｇ）３４ｍｇを充填した以外は、前処理器具１と同様にして前処理器具６を作製した。

［参考例１］
干渉チェックＡプラス（シスメックス社）の溶血ヘモグロビンを蒸留水で１３５ｇ／Ｌになるように溶解した後、希釈液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．１）で５００倍希釈し測定用試料１を得た。１ｍＬ容のシリンジに前記測定用試料１を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具１を取付け、前記測定用試料１をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１にまとめた。

［参考例２］
干渉チェックＡプラス（シスメックス社）のビリルビンＦを蒸留水で２００ｍｇ／ｄＬになるように溶解した後、参考例１と同様の希釈液で５００倍希釈し測定用試料２を得た。１ｍＬ容のシリンジに前記測定用試料２を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先の前処理器具１を取付け、前記測定用試料２をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１にまとめた。

表１の結果から明らかなように、ヘモグロビンを溶解した溶液を前処理器具に接触させた場合に、吸光度は接触前後でほぼ変化しなかったが、ビリルビンを溶解した溶液を前処理器具に接触させた場合には、吸光度は大きく低下した。これは、本発明の前処理器具を用いると、生体試料中のヘモグロビンは除去されないが、ビリルビンに代表される夾雑物質は除去されることを示している。

［実施例１］
１ｍＬ容のシリンジに前記測定用試料１を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具１を取付け、測定用試料１をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。また、前記測定用試料２についても同様の処理を施して吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［実施例２］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具２を取付け、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［実施例３］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具３を取付け、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［実施例４］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具４を取付け、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［実施例５］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具５を取付け、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［実施例６］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具６を取付け、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

［比較例１］
１ｍＬ容のシリンジに実施例１と同様の測定用試料を１ｍＬ吸い上げた後、シリンジの先に前処理器具を取付けずに、測定用試料をセルに押し出した。前記セルを分光光度計にセットし、４２０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２にまとめた。

表２の結果から明らかなように、前処理器具１−６を用いた実施例１−６は、比較例１に比較して、波長４２０ｎｍの吸光度が大きく低下している。ヘモグロビンＡ１ｃ（％）は、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度／ヘモグロビン濃度×１００で求められる糖尿病診断の指標であり、ヘモグロビン濃度の測定値に誤差が含まれると正確な診断ができない。本発明によれば、より正確なヘモグロビン濃度を測定することができる。

本発明によれば、夾雑物質の影響を受けずにヘモグロビン濃度を定量的に測定することができる。また、夾雑物質の影響が低減されるので、ヘモグロビンの極大吸収波長域での測定が可能となり、生体試料中のヘモグロビン濃度が低い場合にも高精度に測定することができるので、糖尿病診断において極めて好適である。

１．試料入口
２．夾雑物質の除去材料
３．メンブレンフィルタ
４．試料出口

Claims

生体試料中のヘモグロビンを定量的に分析する際に、前記生体試料からビリルビンを除去するための前処理器具であって、
前記器具は前記生体試料の入口と出口を有するハウジングケースと前記ハウジングケース内にビリルビンの除去材料が充填され、
前記除去材料は、粒状活性炭または活性炭素繊維であり、
前記除去材料の全細孔容積が０．２５〜１．００ｃｃ／ｇであることを特徴とする前処理器具。