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JP6940039B2 - Ｐａｒｐ阻害剤の製造方法、結晶型、及びその使用 - Google Patents
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JP6940039B2 - Ｐａｒｐ阻害剤の製造方法、結晶型、及びその使用 - Google Patents

Ｐａｒｐ阻害剤の製造方法、結晶型、及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は、ＰＡＲＰ１／２阻害剤、すなわち（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン（以下、化合物Ａと称する）の調製方法、化合物Ａ又はその水和物若しくは溶媒和物の結晶型（結晶多形）、特に化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ、結晶型の調製方法、及びその使用に関する。
癌の特徴と原動力の１つは遺伝的不安定性である［Hanahan D and Weinberg R A, Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 2011. 144(5): p. 646-74］。特に、家族性癌において、相同組換え（ＨＲ）の主要な役割を担う乳癌感受性のＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２腫瘍抑制遺伝子の変異は、乳癌又は卵巣癌の発症リスクの増大と関連している［Li X and Heyer W D, Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res, 2008. 18(1): p. 99-113］。この患者集団で、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤が最近注目されている。ＰＡＲＰファミリーのメンバーＰＡＲＰ１及びＰＡＲＰ２は、ＤＮＡ複製、転写調節及びＤＮＡ損傷修復において重要な役割を果たす［Rouleau M, Patel A, Hendzel M J, et al., PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nat Rev Cancer, 2010. 10(4): p. 293-301］。２００５年に、２つの画期的なＮａｔｕｒｅ論文が、単独で投与されたＰＡＲＰ阻害剤が、既存のＤＮＡ修復欠損、特にＢＲＣＡ１／２遺伝子変異を有する癌細胞を死滅させることができることを示した［Bryant H E, Schultz N, Thomas H D, et al., Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature, 2005. 434(7035): p. 913-7；Farmer H, McCabe N, Lord C J, et al., Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature, 2005. 434(7035): p. 917-21］。
ＰＡＲＰ阻害及びＢＲＣＡ変異は、前臨床モデルにおいて合成致死的であり、患者を治療するためのエレガントで標的化され毒性が最小限である方法を示唆している。
ここ数年、ＰＡＲＰ阻害剤の臨床試験が指数関数的に増加している。これらの臨床試験は、ＰＡＲＰ阻害剤を単剤で又は他のＤＮＡ損傷剤と組み合わせて使用して遺伝性の腫瘍を治療することから始まり、現在、多くの異なる種類の散発性の腫瘍の治療に移行している。オラパリブ（AZD2281，KU0059436，アストラゼネカ／ＫｕＤＯＳ）がＢＲＣＡ欠損の乳癌、卵巣癌及び前立腺癌の患者で活性であることが見出され、ＰＡＲＰ阻害剤に対する最初の興奮が起こった［Fong P C, Boss D S, Yap T A, et al., Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. N Engl J Med, 2009. 361(2): p. 123-34］。これらの特定の患者には有害事象（ＡＥ）は最小限であり、ＢＲＣＡキャリアにおけるＡＥの頻度は、非キャリアにおけるものに比べて増加しなかった。続く卵巣癌患者及び乳癌患者のコンセプト実証（proof of concept）第ＩＩ相試験で、ＢＲＣＡ変異癌患者のこの群におけるオラパリブの応答及び低い副作用プロファイルが確認された［Audeh M W, Carmichael J, Penson R T, et al., Oral poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and recurrent ovarian cancer: a proof-of-concept trial. Lancet, 2010. 376(9737): p. 245-51；Tutt A, Robson M, Garber J E, et al., Oral poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and advanced breast cancer: a proof-of-concept trial. Lancet, 2010. 376(9737): p. 235-44］。
興味深いことに、ＰＡＲＰ阻害剤に対するＢＲＣＡ１／２変異を有する卵巣癌患者の応答は、以前の白金治療に対する感受性と関連していた［Fong P C, Yap T A, Boss D S, et al., Poly(ADP)-ribose polymerase inhibition: frequent durable responses in BRCA carrier ovarian cancer correlating with platinum-free interval. J Clin Oncol, 2010. 28(15): p. 2512-9］。白金感受性と同様の相関が、ＢＲＣＡ変異を伴わない高悪性度漿液性卵巣癌患者においても見られた［Gelmon K A, Tischkowitz M, Mackay H, et al., Olaparib in patients with recurrent high-grade serous or poorly differentiated ovarian carcinoma or triple-negative breast cancer: a phase 2, multicentre, open-label, non-randomised study. Lancet Oncol, 2011. 12(9): p. 852-61］。もう１つの第ＩＩ相臨床試験で、維持療法としてのオラパリブが白金感受性のある再発性高悪性度漿液性卵巣癌患者に有益であることが示された［Ledermann J, Harter P, Gourley C, et al., Olaparib maintenance therapy in platinum-sensitive relapsed ovarian cancer. N Engl J Med, 2012. 366(15): p. 1382-92］。これらのデータに基づいて、オラパリブの乳癌患者及び卵巣癌患者における第ＩＩＩ相臨床試験が開始された。
最近の第ＩＩ相試験で、第一選択療法後に進行している再発性及び転移性胃癌患者においてパクリタキセルと組み合わせて投与された場合、オラパリブは良好な臨床的活性を示した［Bang Y-J, Im S-A, Lee K-W, et al., Olaparib plus paclitaxel in patients with recurrent or metastatic gastric cancer: A randomized, double-blind phase II study. J Clin Oncol, 2013. 31(suppl; abstr 4013)］。適格の患者を、毛細血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）状態によって層別化した。パクリタキセル／オラパリブの組み合わせは、パクリタキセル単剤と比較して、患者の全生存期間（ＯＳ）を、特に低ＡＴＭサブグループで延長した。ＡＴＭはセリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、ＤＮＡ損傷誘発シグナル伝達と、電離放射線等のＤＮＡ損傷剤に応答する細胞周期チェックポイントの開始とに重要な役割を果たす［Stracker T H, Roig I, Knobel P A, et al., The ATM signaling network in development and disease. Front Genet, 2013. 4: p. 37］。
２０１４年１２月１９日、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、オラパリブカプセル（Lynparza，アストラゼネカ製薬会社）を、３つ以上の先行する化学療法で治療された、有害な又は有害と疑われた生殖細胞系ＢＲＣＡ変異（ｇＢＲＣＡｍ：ＦＤＡ承認試験で確認された）の進行性卵巣癌患者の治療のための単剤療法として承認した。この承認と同時に、ＦＤＡは、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子の変異体の定性的検出及び分類のためのBRAC Analysis CDx（ミリアド・ジェネティクス）を承認した。
ベリパリブ（ABT-888，アボット・ラボラトリーズ）、ルカパリブ（AG014669，クロビス）、ニラパリプ（MK-4827，テサロ）、BMN-673（バイオマリン）、CEP-9722（セファロン）、E7016（エーザイ）を含む、いくつかの他のＰＡＲＰ阻害剤について臨床試験がなされている。これらの全てのＰＡＲＰ阻害剤は、その効力、選択性及びＤＮＡ捕捉活性が異なる。ＰＡＲＰ阻害剤複合体によるＤＮＡ捕捉が、細胞内で細胞傷害性をＰＡＲＰ阻害剤が誘導する主要メカニズムの１つであることを、最近の報告が示唆している［Murai J, Huang S Y, Das B B, et al., Trapping of PARP1 and PARP2 by Clinical PARP Inhibitors. Cancer Res, 2012. 72(21): p. 5588-99］。ベリパリブは強力なＰＡＲＰ１／２阻害剤であるが、ＢＲＣＡ変異細胞内ではＤＮＡ捕捉活性と細胞傷害性が弱い。その臨床開発のほとんどは、化学療法との組み合わせに焦点を当てている。最近、第ＩＩ相試験で、標準腫瘍免疫賦活化学療法にベリパリブとカルボプラチンの組み合わせを追加することで、トリプルネガティブ乳癌女性の臨床成績が改善されることが示された［Rugo H, Olopade O, DeMichele A, et al., Veliparib/carboplatin plus standard neoadjuvant therapy for high-risk breast cancer: First efficacy results from the I-SPY 2 TRIAL. 2013. Abstract S5-02］。ルカパリブ、ニラパリプ及びBMN-673の単剤療法によって、ＢＲＣＡ変異癌患者で良好な臨床活性が示された［Shapiro G, Kristeleit R, Middleton M, et al., Pharmacokinetics of orally administered rucaparib in patients with advanced solid tumors. Mol Cancer Ther, 2013. 12(11 Suppl):Abstract nr A218；Michie C O, Sandhu S K, Schelman W R, et al., Final results of the phase I trial of niraparib (MK4827), a poly(ADP)ribose polymerase (PARP) inhibitor incorporating proof of concept biomarker studies and expansion cohorts involving BRCA1/2 mutation carriers, sporadic ovarian, and castration resistant prostate cancer (CRPC). J Clin Oncol, 2013. 31(suppl; abstr 2513)；Bono J S D, Mina L A, Gonzalez M, et al., First-in-human trial of novel oral PARP inhibitor BMN 673 in patients with solid tumors. J Clin Oncol, 2013. 31(suppl; abstr 2580)］。
これらのＰＡＲＰ阻害剤の第ＩＩＩ相試験が、現在、ＢＲＣＡ変異又は白金感受性疾患を有する乳癌及び／又は卵巣癌の患者で進行中である。
（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン（又は化合物Ａ）は、高選択的なＰＡＲＰ１／２阻害剤である。化合物Ａは、細胞内ＰＡＲＰ活性を強力に阻害し、ＢＲＣＡ１／２変異又は他のＨＲ欠損を伴う細胞株の増殖を特異的に阻害する。化合物Ａは、ＢＲＣＡ１変異乳癌異種移植片モデルにおいてオラパリブよりもはるかに低い用量で腫瘍の退縮を著しく誘導する。化合物Ａは、優れたＤＭＰＫ特性及びかなりの脳浸透を有する。
前臨床生化学である細胞ベースの研究及び動物の研究で生成されたデータによって、ＢＲＣＡ遺伝子変異又は相同組換え欠陥を有する腫瘍の阻害において化合物Ａがかなりの患者の利益を提供し得ることが示唆される。化合物Ａは良好な脳浸透を有し、神経膠芽細胞腫等のより多くの適応症で活性を示すかもしれない。これらの独特な特性は、臨床研究において化合物Ａのさらなる評価を保証する。
遊離塩基、すなわち（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン（又は、化合物Ａ）は、高選択的で強力なＰＡＲＰ１／２阻害剤として開示されている（参照，ＷＯ２０１３／０９７２２５Ａ１，参照により本明細書に組み込まれる）。
Figure 0006940039
化合物Ａは、４級キラル中心を有する多環縮合複合分子である。化合物Ａの遊離塩基は、最初に「キラルプール」法で得られた。しかし、この方法は、中間体及び最終生成物の精製のために複数のクロマトグラフィーカラムが必要であったため、非常に非効率的でスケールアップが困難であった。さらに、このようにして調製された化合物Ａは、製造プロセス中に部分的なラセミ化が起こるため、光学純度が不満足である。ただし、部分的なラセミ化の根本的な理由は不明のままである。従って、製剤開発のための再現性及び良好な品質を有する化合物Ａ（特にその結晶型）の大規模での調製に適した方法が大いに必要とされている。
本出願の開示は、前述の課題及び必要性に対処するものである。
第１の側面において、本出願は、中間体及び最終生成物の精製のための複数のクロマトグラフィーカラムの使用を回避し、従ってコスト効率が高く商業的利益がある、化合物Ａの遊離塩基を調製する大規模な方法を提供する。
第２の側面において、本出願は、医薬製剤に適した優れた物理的性質を有し、高品質で良好な再現性で大規模な商業規模で製造できる化合物Ａ又はその水和物若しくは溶媒和物の結晶型を提供する。
本発明者らは、予想外で驚くべきことに、化合物Ａの遊離塩基が水和物及び／又は溶媒和物、特にセスキ水和物を結晶形態で形成することができることを発見した。特に、驚くべきことに、化合物Ａの遊離塩基の水和物／溶媒和物が、本明細書で結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬと称する、多数の結晶型（結晶多形）で存在しうることを発見した。化合物Ａの遊離塩基及びその水和物／溶媒和物の結晶型、具体的には結晶型Ｃは、スクリーニングされた他の溶媒和物と比べて、優れた化学的安定性、特に長期化学的／物理的安定性等の優れた特性を有しており、製剤及び臨床適用のための適切なＡＰＩ候補となる。結晶型Ｃ（すなわち、化合物Ａセスキ水和物）は水への溶解度が低い（約０．０４ｍｇ／ｍＬ）。水へのこの低い溶解度によって、水／アルコール溶液中でＡＰＩの再結晶及びスラリーを行うことができるため、ＡＰＩの大規模な製造方法が単純化される。かなり驚くべきことに、模擬胃液（ＳＧＦ）等の低ｐＨ水性媒体中におけるその溶解度（例えば約４．５ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ＝１．２）のために、胃で迅速に溶解されることが可能であり、動物及びヒトで良好な薬物吸収が達成され得る。水中での低い溶解性及び高い結晶安定性によって、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃは医薬品製造における湿式造粒及びコーティングのプロセスに特に適することにもなる。
従って、１つの側面において、本発明は化合物Ａの水和物／溶媒和物である式Ｉの化合物を提供する。
Figure 0006940039
 〔式中、ｎは約０．０〜約２．０の数である。
ｍは約０．０〜約２０．０の数である。
溶媒はイソプロパノール、エタノール、メタノール、アセトン、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、酢酸、アセトニトリル、水、又はこれらの組み合わせである。〕
他の実施態様において、本発明は化合物Ａの水和物である式ＩＩの化合物を提供する。
Figure 0006940039
 〔式中、ｎは約０．０〜約２．０の数である。〕
他の好ましい実施態様において、式ＩＩの化合物は結晶形態である。
他の好ましい実施態様において、ｎは約１．５であり、化合物は式ＩＩＩの（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンのセスキ水和物結晶である。
Figure 0006940039
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．３±０．２°、８．５±０．２°、８．６±０．２°、９．９±０．２°、１０．４±０．２°、１１．０±０．２°、１１．１±０．２°、１２．６±０．２°、１２．８±０．２°、１４．７±０．２°、１８．０±０．２°、１８．１±０．２°、２０．１±０．２°、２１．４±０．２°、２２．２±０．２°、２４．６±０．２°、２５．７±０．２°及び３０．０±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ａである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．３±０．２°、８．７±０．２°、１１．１±０．２°、１２．６±０．２°、１４．５±０．２°、１４．８±０．２°、１５．２±０．２°、１８．０±０．２°、２３．９±０．２°、２５．３±０．２°及び２５．８±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｂである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、５．３±０．２°、６．３±０．２°、６．５±０．２°、６．９±０．２°、８．７±０．２°、１０．６±０．２°、１１．１±０．２°、１１．６±０．２°、１２．６±０．２°、１３．１±０．２°、１３．７±０．２°、１４．４±０．２°、１４．８±０．２°、１５．１±０．２°、１５．９±０．２°、１６．２±０．２°、１７．３±０．２°、１８．０±０．２°、１８．７±０．２°、１９．０±０．２°、１９．４±０．２°、２０．２±０．２°、２０．６±０．２°、２１．０±０．２°、２±０．２°、２１．５±０．２°、２２．３±０．２°、２２．７±０．２°、２３．４±０．２°、２３．８±０．２°、２４．３±０．２°、２４．７±０．２°、２５．３±０．２°、２５．７±０．２°、２６．１±０．２°、２６．４±０．２°及び２７．４±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｃである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．１±０．２°、６．３±０．２°、６．９±０．２°、８．５±０．２°、１１．１±０．２°、１１．６±０．２°、１３．２±０．２°、１４．５±０．２°、１５．２±０．２°、１６．３±０．２°、１８．１±０．２°、２０．３±０．２°、２２．５±０．２°、２４．８±０．２°、２６．１±０．２°、２６．６±０．２°及び２７．７±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｃ＊である。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、５．７±０．２°、６．４±０．２°、６．８±０．２°、９．３±０．２°、９．８±０．２°、１０．３±０．２°、１１．５±０．２°、１２．４±０．２°、１２．９±０．２°、１３．４±０．２°、１３．９±０．２°、１７．８±０．２°、１８．３±０．２°、１８．８±０．２°、１８．９±０．２°、２３．７±０．２°、２５．０±０．２°、２５．７±０．２°、２５．９±０．２°及び２６．７±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｄである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．２±０．２°、８．６±０．２°、９．５±０．２°、１１．０±０．２°、１１．５±０．２°、１２．０±０．２°、１２．５±０．２°、１３．４±０．２°、１３．８±０．２°、１４．４±０．２°、１４．７±０．２°、１５．１±０．２°、１５．３±０．２°、１６．２±０．２°、１６．９±０．２°、１７．９±０．２°、１８．３±０．２°、１９．０±０．２°、１９．５±０．２°、２０．１±０．２°、２１．３±０．２°、２２．２±０．２°、２２．９±０．２°、２３．３±０．２°、２４．２±０．２°、２４．６±０．２°、２５．１±０．２°、２５．７±０．２°、２６．３±０．２°、２７．０±０．２°、２７．４±０．２°及び３０．９±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｅである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、５．２±０．２°、６．３±０．２°、７．７±０．２°、９．７±０．２°、１０．４±０．２°、１１．８±０．２°、１３．７±０．２°、１５．６±０．２°、１７．５±０．２°、１８．０±０．２°、１９．５±０．２°、２０．２±０．２°、２１．７±０．２°、２３．１±０．２°、２４．７±０．２°、２５．３±０．２°及び２７．３±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｆである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．３±０．２°、８．６±０．２°、９．６±０．２°、１０．３±０．２°、１１．０±０．２°、１２．６±０．２°、１７．５±０．２°及び２５．４±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる、結晶型Ｇである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、９．５±０．２°、１２．０±０．２°、１３．５±０．２°、１５．４±０．２°、１７．０±０．２°、１９．０±０．２°、２３．０±０．２°、２４．２±０．２°、２７．０±０．２°、２７．４±０．２°、３１．０±０．２°、３４．７±０．２°及び３４．８±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｈである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、９．８±０．２°、１０．０±０．２°、１１．１±０．２°、１１．７±０．２°、１２．９±０．２°、１３．３±０．２°、１３．９±０．２°、１４．４±０．２°、１７．１±０．２°、１７．４±０．２°、１７．６±０．２°、１７．９±０．２°、１８．４±０．２°、１８．５±０．２°、１９．４±０．２°、２０．８±０．２°、２１．９±０．２°、２３．７±０．２°、２６．４±０．２°、２６．９±０．２°及び２９．４±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｉである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．４±０．２°、８．７±０．２°、９．９±０．２°、１０．３±０．２°、１１．７±０．２°、１２．８±０．２°、１３．９±０．２°、１８．１±０．２°、１９．３±０．２°、２３．０±０．２°、２３．８±０．２°及び２５．８±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｊである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．４±０．２°、１０．８±０．２°、１２．６±０．２°、１２．８±０．２°、１９．２±０．２°、２５．２±０．２°、２５．８±０．２°、３２．４±０．２°及び３４．１±０．２°からなる群から独立して選択される３、４、５、６、７又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｋである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、６．８±０．２°、１７．８±０．２°、２０．６±０．２°、２３．４±０．２°及び２７．６±０．２°からなる群から独立して選択される３、４又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶型Ｌである。
他の実施態様において、式ＩＩの化合物は、図５、６、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６からなる群から選択される粉末Ｘ線回折パターンによって実質的に特徴付けられる結晶型である。
他の側面において、本発明は、以下の工程のいずれか１つを含む、式ＩＩＩの化合物Ａのセスキ水和物の結晶型を調製する方法。
（ａ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの遊離塩基を、溶媒又は溶媒混合物に溶解させて溶液又は懸濁液を生成させ、（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンのセスキ水和物の目的の結晶型を沈殿させる工程；
（ｂ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンのセスキ水和物を、溶媒又は溶媒混合物に溶解又は懸濁させ、（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの溶媒和物／水和物の目的の結晶型を沈殿させる工程；
（ｃ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの水和物／溶媒和物の結晶を長期間、保存して、目的の結晶型を得る工程；
（ｄ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの水和物／溶媒和物の結晶を高温で加熱し、水和物を冷却することで目的の結晶型を得る工程；及び
（ｅ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの水和物／溶媒和物の結晶を溶媒の蒸気に曝露して、目的の結晶型を得る工程。
この側面の１つの実施態様において、必要に応じて、工程（ａ）の前に、アルカリの存在下、適当な溶媒（例えば、イソプロピルアルコール等のアルコール）中で化合物Ａの遊離塩基を分割剤（例えば、（＋）−ジ−ｐ−メチルベンゾイル−Ｄ−酒石酸等のキラルな酸）と反応させる。
この側面の１つの実施態様において、工程（ａ）又は（ｂ）は、加熱、非溶解不純物の濾別、溶媒の蒸留、反溶媒又は反溶媒混合物の添加、結晶の種の添加、沈殿誘導剤の添加、冷却、沈殿、結晶生成物を回収するための濾過から独立して選択される１以上の工程をさらに含む。
この側面の１つの実施態様において、工程（ａ）又は（ｂ）における溶媒又は溶媒混合物は、水、低級アルキルアルコール、ケトン、エーテル、エステル、低級脂肪族カルボン酸、低級脂肪族ニトリル、ハロゲン化されていてもよい芳香族溶媒、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
この側面の１つの実施態様において、工程（ａ）又は（ｂ）における溶媒は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、アセトン、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、酢酸、アセトニトリル、水、又はこれらの混合物である。
この側面の１つの実施態様において、工程（ａ）における溶媒は、水と、イソプロパノール、エタノール、メタノール、アセトン、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、酢酸又はアセトニトリルのいずれか１つとの混合物である。この側面のさらなる実施態様において、工程（ａ）における溶媒は、水とイソプロパノールの混合物である。
この側面の他の実施態様において、工程（a）における遊離塩基は、単離され精製された遊離塩基、単離されたが未精製の遊離塩基、又は遊離塩基を含有する反応粗製物である。
この側面の他の実施態様において、工程（ｃ）における長期間は、少なくとも３日間、少なくとも１週間、又は少なくとも２週間である。
この側面の他の実施態様において、工程（ｄ）における高温は、少なくとも４０℃、少なくとも６０℃、少なくとも８０℃、又は少なくとも１００℃であるが、セスキ水和物の分解温度より低い。
この側面の他の実施態様において、工程（ｅ）における蒸気は酢酸の蒸気である。
この側面の他の実施態様において、方法は、
１）工程（ａ）又は（ｂ）が溶媒としてイソプロパノール−水（ｖ／ｖ＝２０／４０）を用いて結晶型Ｃ＊＊を生成させること；
２）工程（ａ）又は（ｂ）が溶媒としてＭＴＢＥを用いて結晶型Ｂを生成させること；
３）工程（ａ）又は（ｂ）が溶媒としてｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏを用いて結晶型Ｃ又はＣ＊を生成させること；
４）工程（ｃ）がＨＯＡｃの中にトルエンを添加して結晶型Ｄを生成させること；
５）工程（ｄ）が結晶型ＡをＤＭＡの蒸気と相互作用させて結晶型Ｅを生成させること；
６）工程（ｅ）が結晶型Ａを酢酸の蒸気と相互作用させて結晶型Ｆを生成させること；
７）工程（ｄ）が結晶型ＡをＤＶＳ中で脱着／収着させて結晶型Ｇを生成させること；
８）工程（ｄ）が結晶型Ｅを８０℃に加熱して結晶型Ｈを生成させること；
９）工程（ｄ）が結晶型Ｅを１５０℃に加熱して結晶型Ｉを生成させること；
１０）工程（ｄ）が結晶型Ａを１５０℃に加熱して結晶型Ｊを生成させること；
１１）工程（ｅ）が結晶型ＡをＭｅＯＨの蒸気と相互作用させて結晶型Ｋを生成させること；及び
１２）工程（ｄ）が結晶型Ｋを１５０℃に加熱して結晶型Ｌを生成させること、
から選択される。
いくつかの実施態様において、本発明は、還流温度より低い温度で、例えば約８０℃で化合物Ａをｉ−ＰｒＯＨとＨ２Ｏとの混合溶媒中で混合すること；又は還流温度より低い温度で、例えば約７０℃で化合物Ａをｉ−ＰｒＯＨとＨ２Ｏとの混合溶媒中で混合すること；又は還流温度より低い温度で、例えば約５０℃で化合物Ａをｉ−ＰｒＯＨとＨ２Ｏとの混合溶媒中で混合することを含む、結晶型Ｃ（すなわち、化合物Ａセスキ水和物）を調製する方法を提供する。ここで、ｉ−ＰｒＯＨとＨ２Ｏとの混合溶媒中、ｉ−ＰｒＯＨの量はｉ-ＰｒＯＨと水の全体積の４０体積％より大きく、好ましくは６０体積％より大きく、より好ましくは９０体積％より大きい。いくつかの好ましい実施態様において、上記の混合溶媒はｉ-ＰｒＯＨで置き換えられる。他の実施態様において、方法はさらに、室温まで冷却した後、得られた混合物に結晶の種を添加し、次いで混合物を一定時間、例えば１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、１週間又は２週間、放置することを含む。
本発明の他の目的は、式Ｉ、式ＩＩ及び式ＩＩＩの化合物（化合物Ａセスキ水和物−結晶型Ｃ）を調製するための大規模に実現可能な合成方法を提供することである。
他の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の実施態様のいずれかの式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩの化合物、及び薬学上許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
１つの実施態様において、医薬組成物は経口投与に適している。
他の実施態様において、医薬組成物は錠剤又はカプセル剤の形態である。
他の実施態様において、錠剤又はカプセル剤の単位投与量は１〜１６０ｍｇである。
他の実施態様において、医薬組成物中の化合物の重量百分率は１〜９９％である。
他の側面において、本発明は、治療上有効な量の本明細書に記載の実施態様のいずれかの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの化合物、又は式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの化合物を含有する医薬組成物を、患者に投与することを含む、患者の疾患若しくは病気を治療又は予防する方法を提供する。
１つの実施態様において、疾患又は病気は、脳腫瘍、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、リンパ腫、又は甲状腺腫瘍及びこれらの合併症からなる群から選択される癌である。
他の実施態様において、疾患が、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２変異の乳癌、卵巣癌及びこれらの合併症からなる群から選択される。
他の実施態様において、化合物の投与量は５〜３２０ｍｇ／日であり、投与頻度は１〜３回／日である。
他の実施態様において、化合物の投与量は５〜２４０ｍｇ／日であり、投与頻度は１〜３回／日である。
他の実施態様において、化合物の投与量は１０〜２００ｍｇ／日であり、投与頻度は２回／日である。
他の実施態様において、化合物は、結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬからなる群から選択される結晶型の（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの遊離塩基又はその溶媒和物若しくは水和物である。
他の実施態様において、本発明は、ＢＲＣＡ１／２変異活性又は他のＨＲ欠損に関連する疾患又は病気の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載の実施態様のいずれかの式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩの化合物の使用を提供する。
好ましい実施態様において、疾患は癌である。
本発明のこれらの側面及び他の側面は、以下の図面、詳細な説明及び請求の範囲を考慮して、より良く理解されるであろう。
化合物Ａの絶対構造を示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶の単位格子を示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶の水素結合を示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶のシミュレーションされたＸＲＰＤパターン及び実験によるＸＲＰＤパターンを示す。 化合物Ａの結晶型Ａ（イソプロパノール／水からの再結晶で得られた）のＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＢのＸ線回折パターンを示す。 実施例１で大規模にイソプロパノール／水からの再結晶で調製された、化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＸ線回折パターンを示す。 実施例５で実験室規模で調製された、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊のＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＤのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＥのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＦのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＧのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＨのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＩのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＪのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＫのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａの結晶型ＬのＸ線回折パターンを示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＤＶＳスペクトルを示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＴＧＡスペクトルを示す。 化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＤＳＣスペクトルを示す。
１つの側面において、本発明は、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶を提供する。ＩＰＡ／水から室温で蒸気拡散によって成長した単結晶から集めた回折データのセットを用いて、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の構造が単結晶であることを決定した。結晶データ及び構造緻密化を表１に示す。
Figure 0006940039
ＩＰＡ／水から室温で蒸気拡散によって成長した単結晶から集めた回折データのセットを用いて、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の構造を首尾よく決定した。結晶データ及び詳細な構造を表１に示す。化合物Ａの絶対構造を図１に示す。その結果、セスキ水和物の単結晶が得られたことが示された。Ｃ４（Ｒ）の立体配置が決定された。化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶の単位格子を図２に示す。化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊＊の単結晶の水素結合を図３に示す。ジグザグの鎖が水素結合Ｎ１１--Ｈ１１…Ｎ５、Ｎ７--Ｈ７…Ｏ４、及びＮ１５--Ｈ１５…Ｏ２を介して形成されている。これらのジグザグ鎖は、（Ｎ２--Ｈ２…Ｏ６、Ｏ６--Ｈ６Ａ…Ｎ９、Ｏ９-Ｈ９Ａ…Ｎ１とＮ６--Ｈ６…Ｏ９）及び（Ｏ８--Ｈ８Ｂ…Ｏ５、Ｎ１０--Ｈ１０…Ｏ７、Ｎ１４--Ｈ１４…Ｏ８、Ｏ５--Ｈ５Ｂ…Ｏ１、Ｏ７--Ｈ７Ａ…Ｎ８、Ｏ７--Ｈ７Ｂ…Ｏ５、Ｏ８--Ｈ８Ａ…Ｏ３とＯ１０--Ｈ１０Ｂ…Ｏ３）の間の水素結合で結合され、三次元構造を形成する。単結晶構造から計算された理論上のＸＲＰＤパターンと実験的なＸＲＰＤパターンとは、非常によく似ており、それらは図４に示される。
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ａを提供する。図５に示すように、結晶型ＡのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図５では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｂを提供する。図６に示すように、結晶型ＢのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図６では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、実施例１に記載の方法で大規模で調製される化合物Ａ（セスキ水和物）の結晶型Ｃを提供する。図７Ａに示すように、結晶型ＣのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図７では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
さらに他の実施態様において、本発明は、実施例５に記載の方法で実験室レベルの規模で調製される化合物Ａ（セスキ水和物）の結晶型Ｃ＊を提供する。図７Ｂに示すように、結晶型Ｃ＊のＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図７では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃは、約５０μｍの平均粒子径（Ｄ９０）を有するかなり安定な結晶型である。結晶型Ｃは、臨床に使用するための医薬品に容易に製剤化することができる。化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃと化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ＊は、実質的に同一位置のピークを有するが、図７Ａ及び７Ｂに示すように、その相対強度は異なっている。
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｄを提供する。図８に示すように、結晶型ＤのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図８では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｅを提供する。図９に示すように、結晶型ＥのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図９では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｆを提供する。図１０に示すように、結晶型ＦのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１０では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｇを提供する。図１１に示すように、結晶型ＧのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１１では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｈを提供する。図１２に示すように、結晶型ＨのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１２では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｉを提供する。図１３に示すように、結晶型ＩのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１３では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｊを提供する。図１４に示すように、結晶型ＪのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１４では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｋを提供する。図１５に示すように、結晶型ＫのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１５では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
他の実施態様において、本発明は、化合物Ａの結晶型Ｌを提供する。図１６に示すように、結晶型ＬのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には以下のピーク回折角を有する。なお、「間隔」は図１６では「ｄ値」として示される。
Figure 0006940039
上記の結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬについては、主なピーク（すなわち、最も特徴的、顕著、独特及び／又は再現可能なピーク）のみがまとめられている。追加のピークが一般的な方法による回折スペクトルから得られうる。上記の主なピークは誤差（与えられた最後の小数位の±２、又は記載された値の±０．２）の範囲内で再現することができる。
ＴＧＡにおける重量減少（重量％）に基づいて、化合物Ａの結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬは、無水物、水和物及び溶媒和物と推測される。
Figure 0006940039
いずれのサンプルも、分解前に融解吸熱は観察されなかった。
結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬの相互変換を表１５に示す（結晶型Ａを多形スクリーニング研究の出発物質として使用した）。
Figure 0006940039
４つの水和物（結晶型Ａ、Ｃ、Ｃ＊及びＧ）のうち、結晶型Ｃは、ＡＰＩとして化合物Ａの製造過程で最も実用的で安定な結晶型であることが見出されている。非常に高温で水和物又は水和物／溶媒和物を加熱すると、水又は溶媒が失われ、無水物が生成する。しかし、この高温での加熱は様々な結晶型の相互変換を研究するために用いており、化合物Ａの製造には実用的ではないかもしれない。
他の側面において、本発明は、実質的に純粋な化合物Ａの結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｃ＊＊＊、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬを提供する。すなわち、各々の結晶型は、化合物Ａの特定の１つの実質的に純粋な結晶型であり、化合物Ａの他の結晶型を実質的に含まない。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ａを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｂを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｃを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｄを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｆを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｇを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｈを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｉを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｊを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｋを提供する。１つの実施態様において、本発明は、十分な純度、例えば９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％又はそれ以上の純度の結晶型Ｌを提供する。
他の側面において、本発明は、式Ｉ、式ＩＩ及び式ＩＩＩの化合物を調製する方法を提供する。
１つの実施態様として、本発明は、スキーム１に示される手順に従って調製又は精製される化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃを提供する。本明細書に開示される新規な合成方法及び結晶化／再結晶化プロセスは、先に報告されたプロセスに関連する多くの問題、例えば（＋）−ジ−ｐ−メチルベンゾイル−Ｄ−酒石酸等のキラル酸とのジアステレオマー塩の形成及び再結晶を介した化合物Ａの遊離塩基の光学純度の改善を解決し、既存の方法よりも多くの有利な点を提供する。とりわけ、本明細書に記載された方法は、高品質で良好な収率で化合物Ａセスキ水和物を再現性よく、商業規模で製造するために特に適している。
スキーム１：化合物Ａの大規模合成プロセス
Figure 0006940039
スキーム１に示されるように、本出願は、以下の工程を含む、化合物Ａの遊離塩基を調製するための大規模プロセスを提供する。
Figure 0006940039
 〔式中、Ｒ１及びＲ２は、独立してＣ１−６アルキル又はハロＣ１−６アルキルから選択される。
ＬＧは、Ｔｓ等の脱離基である。〕
スキーム２：化合物Ａセスキ水和物（結晶型Ｃ）の合成プロセス
Figure 0006940039
スキーム２に示されるように、本出願は、以下の工程を含む、化合物Ａセスキ水和物の結晶型を調製する大規模プロセスを提供する。
ｉ．アルカリの存在下、適当な溶媒（例えば、イソプロピルアルコール等のアルコール）中で化合物Ａの遊離塩基を分割剤（例えば、（＋）−ジ−ｐ−メチルベンゾイル−Ｄ−酒石酸等のキラルな酸）と反応させて化合物Ａの粗製物２を得る工程、及び
ｉｉ．ｉ−ＰｒＯＨ及び水等の混合溶媒中で一定時間及び一定温度で化合物Ａの粗製物２を再結晶させて化合物Ａの結晶型を得る工程。
化合物Ａの結晶型は、以下の一般的な方法によって調製することができる。化合物Ａセスキ水和物のの結晶型Ｃを完全に溶解するまで溶媒と共に加熱する。濾過、冷却、結晶化、濾過及び乾燥の後、対応する異なる結晶型が得られる。下記の実施例３に、化合物Ａの結晶型Ａを調製する結晶化プロセスの例が記載されている。上記の結晶化は、単一の溶媒、有機溶媒の混合物、又は水と有機溶媒の混合物中で行うことができる。結晶化に適した有機溶媒は、低級アルキルアルコール、ケトン、エーテル、エステル、ハロゲン化炭化水素、アルカン、ハロゲン化ベンゼン、脂肪族ニトリル及び他の芳香族溶媒から選択することができるが、これらに限定されない。好ましい溶媒として、例えば、イソプロパノール、酢酸エチル、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル及びこれらの混合物が含まれる。
本明細書における用語「低級アルキルアルコール」として、直鎖又は分枝鎖のＣ１〜Ｃ８、好ましくはＣ１〜Ｃ６、より好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキルアルコールが含まれる。特定の例として、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「約」という用語は、他に示されない限り、数（例えば、温度、ｐＨ、体積等）が±１０％以内、好ましくは±５％以内で変化し得ることを示す。
本明細書における溶媒和物は、溶媒和によって形成される化合物として、例えば溶媒分子と溶質の分子又はイオンとの組み合わせとして定義される。既知の溶媒分子には、水、アルコール及び他の極性有機溶媒が含まれる。アルコールには、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール及びｔ−ブタノールが含まれる。アルコールには、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）等の重合アルコールも含まれる。好ましい溶媒は、典型的には水である。水との溶媒和によって形成される溶媒和物は、時には水和物と呼ばれる。
本発明の結晶型の結晶化は、少なくとも１つの溶媒を含む適切な溶媒系中で、溶媒の蒸発、冷却及び／又は反溶媒（化合物Ａセスキ水和物を溶解することができない溶媒；本明細書に記載されているものを含むがこれに限定されない）の添加によって、溶媒系中で過飽和を達成することで行うこともできる。
結晶化は、本発明に記載の種結晶を用いて、又は用いずに行うことができる。
本明細書に開示される個々の結晶型は、結晶化プロセスの特別な熱力学的及び平衡的特性に依存する特定の条件下で発現された。従って、当業者は、形成された結晶が結晶化プロセスの動力学的及び熱力学的特性の結果であることを知るであろう。特定の条件（例えば、溶媒、温度、圧力及び化合物の濃度）の下では、特定の結晶型は、他の結晶型よりも安定であり、又は実際には他のいずれの結晶型よりも安定である。しかし、比較的低い熱力学的安定性を有する特定の結晶は、有利な動力学的安定性を有することがある。時間、不純物の分布、攪拌、種結晶の有無などの動力学以外の他の要因も、結晶型に影響を及ぼし得る。
他の側面において、本発明は、有効量の化合物Ａ、特に化合物Ａセスキ水和物、さらに上記の結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬのいずれかと、薬学上許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。活性化合物は、医薬組成物の１〜９９重量％、好ましくは１〜７０重量％、より好ましくは１〜５０重量％、最も好ましくは５〜４０重量％である。
医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤等の形態で経口的に、又は無菌溶液、懸濁液若しくは乳剤等の形態の持続放出注射で、又はペースト、クリーム若しくは軟膏等の局所治療形態で、又は坐剤等の直腸形態で投与することができる。医薬組成物は、正確な投薬用途に適した単位投薬形態であってもよい。また、医薬組成物は、他の活性成分を含んでもよい。
好適な医薬担体として、水、種々の有機溶媒及び種々の不活性希釈剤又は充填剤が含まれる。必要であれば、医薬組成物は、様々な添加物、例えば、スパイス、接着剤及び賦形剤を含有してもよい。経口投与のためには、錠剤及びカプセル剤は、クエン酸等の様々な賦形剤、デンプン、アルギン酸及びいくつかのケイ酸塩等の様々な崩壊剤、並びにスクロース、ゼラチン及びアラビアゴム等の様々な接着剤を含むことができる。さらに、ステアリン酸マグネシウムを含む潤滑剤及びタルク充填剤は、錠剤の製造に一般的に使用されている。同じ種類の固体成分は、軟質及び硬質ゼラチンカプセルを製剤するために使用することもできる。水性懸濁液を経口投与のために必要とされる場合、活性化合物は、様々な甘味料又は着香剤、顔料又は染料の組み合わせと混合することができる。必要に応じて、種々の乳化剤を使用することができ、又は懸濁液を生成することができる。水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン又はこれらの組み合わせ等の希釈剤を用いることができる。
上記の医薬組成物は、好ましくは経口で投与される。
上記の医薬組成物は、好ましくはカプセル剤又は錠剤の形態である。
他の側面において、本発明は、ＰＡＲＰ１及びＰＡＲＰ２の阻害に応答性がある癌の治療に有用である医薬の製造における、本発明の化合物（すなわち、化合物Ａセスキ水和物及び上記の結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬのいずれか）の使用を提供する。
１つの実施態様において、本発明は、ほ乳類の膵臓炎、腎臓疾患、癌、血管新生又は血管新生関連疾患の治療又は予防に有用である医薬の製造における、本発明の化合物（すなわち、化合物Ａセスキ水和物及び上記の結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬのいずれか）の使用を提供する。
本発明の化合物Ａセスキ水和物及び他の遊離塩基の結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬは、腫瘍血管新生、慢性炎症性疾患、例えば関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、皮膚疾患、例えば乾癬及び強皮症、糖尿病誘発性皮膚疾患、糖尿病性網膜症、早期網膜症、加齢性変性症、血管腫、神経膠腫、カポジ内部腫瘍（Kaposi internal tumor）、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌を含む肺癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌、結腸癌及び皮膚癌及びこれらの合併症から選択されるが、これらに限定されない疾患を治療又は予防するために用いられる。本明細書に記載される哺乳動物の中で、ヒトが好ましい。
上記の治療方法で治療される疾患は、好ましくは、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２変異乳癌、卵巣癌及びそれらの合併症等のＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２変異腫瘍から選択される。
上記の方法は、任意の化学療法（例えば、ＴＭＺ及びドセタキセル）、生物学的療法、又は放射線療法と組み合わせて適用することができる。
投与における活性成分又は化合物の投与量は、治療される患者の個々の必要性、投与経路、疾患又は病気の重症度、投与スケジュール、並びに指定された医師の評価及び判断によって決定される。しかし、活性化合物に基づいて、有効投薬量の好ましい範囲は、１回又は別々の用量で、約０．０１〜３２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。
本発明の他の側面は、臨床適用のための化合物Ａの結晶型を提供することである。特に、本発明は、癌患者のための以下の治療選択肢を有する化合物Ａの結晶型を用いる臨床的治療に関する。結晶型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ＊、Ｃ＊＊、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬからなる群から選択される化合物Ａの結晶型の投与量は１〜３２０ｍｇ／日であり、投与頻度は１〜３回／日とすることができ、好ましい投与量は５〜２４０ｍｇ／日であり、投与頻度は１〜３回／日であり、より好ましい投与量は１０〜２００ｍｇ／日であり、投与頻度は２回／日である。
以下の合成方法、特定の実施例及び有効性の試験は、本発明の特定の側面をさらに説明する。しかし、それらは決して本発明の範囲を限定又は制限してはならない。
以下の実施例は例示的なものであり、使用される数値（例えば、量、温度等）に関する正確性を保証する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差は、当業者の知識の範囲内で考慮されるべきである。他に指示がない限り、温度は摂氏である。試薬は、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar又はTCI等の市販供給元から購入し、特に断らない限り、さらなる精製を行わずに使用した。
他に指示がない限り、以下に示す反応は、窒素若しくはアルゴンの陽圧下、又は無水溶媒中の乾燥管を用いて実施した。反応フラスコには、シリンジを介して基質及び試薬を導入するためのゴム隔膜を取り付けた。ガラス製品はオーブン乾燥及び／又は加熱乾燥した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚで動作するVarianの機器で記録した。
無色板状結晶からのＸ線強度データは、１７３（２）Ｋで、Bruker APEX-II CCD回折計（ＣｕＫα放射線、λ＝１．５４１７８Å）を用いて測定した。偏光顕微鏡写真は、室温で測定した。
ＴＧＡは、TA Instruments Q500 TGAを用いて行った。温度は、ニッケルを用いて較正し、重量はTA供給標準重量を使用して、シュウ酸カルシウム１水和物の脱水及び分解に対して検証した。
ＤＳＣは、TA instruments Q2000 DSCを用いて、パージガスとしてＮ２を使用し、皿を圧着して２５℃から所望の温度まで１０℃／分の昇温速度で昇温して測定した。
以下の実施例では、以下の略語を用いることがある。
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＣＮ アセトニトリル
Ａｑ 水性
ブライン 飽和塩化ナトリウム水溶液
Ｂｎ ベンジル
ＢｎＢｒ ベンジルブロマイド
ＣＨ２Ｃｌ２ ジクロロメタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄｐｐｆ １，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＩＥＡ又はＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
Ｅｔ２Ｏ又はエーテル ジエチルエーテル
ｇ グラム
ｈ又はｈｒ 時間
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＨＣｌ 塩酸
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ ２−プロパノール
ｉ−ＰｒＯＨ イソプロピルアルコール
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ｍｍｏｌ ミリモル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ｍｉｎ 分
ｍｓ又はＭＳ 質量スペクトル
Ｎａ２ＳＯ４ 硫酸ナトリウム
ＰＥ 石油エーテル
ＰＰＡ ポリリン酸
Ｒｔ 保持時間
Ｒｔ又はｒｔ 室温
ＴＢＡＦ テトラブチルアンモニウムフルオライド
ＴＢＳＣｌ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＣｌ トリメチルシリルクロライド
μＬ マイクロリットル
実施例１
化合物Ａの遊離塩基及び化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの大規模な調製
工程１：化合物２の合成
Figure 0006940039
ブロモ酢酸ｔ−ブチル（５１．７ｋｇ）を無水アセトニトリル（７２ｋｇ）に溶解させた。温度を６５〜７５℃に上げ、次いでメチルピロリン（２２ｋｇ）を添加した。反応が完了した後、反応混合物を濃縮し、ＴＨＦを添加して濃縮することによって残留アセトニトリルを除去した。ＧＣがアセトニトリルの完全な除去を示した後、さらにＴＨＦを加えて撹拌した。得られた固体を濾過し、回収した。４４．１ｋｇのオフホワイト色の固体の化合物２を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz，DMSO-d6）δ4.91（s，2H），4.15（m，2H），3.29（m，2H），2.46（s，3H），2.14（m，2H），1.46（s，9H）ppm
工程２：化合物３の合成
Figure 0006940039
トリメチルシリルアセチレン（１２．４ｋｇ）の冷（−６０℃）ＴＨＦ溶液にｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液（４３．４ｋｇ）を添加した。ｎ−ブチルリチウム溶液の添加が完了した後、得られた混合物をさらに１〜２時間撹拌し、溶液のすべてを−６０℃に冷却した化合物２（３１ｋｇ）のＴＨＦ中の懸濁液に移した。移送が完了した後、得られた混合物を室温に温め、１時間撹拌した。反応を水でクエンチし、石油で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して２５．１ｋｇの化合物３を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz，DMSO-d6）δ3.34（d，J=16.0Hz，1H），3.15（m，1H），2.78（d，J=16.0Hz，1H），2.27（m，1H），1.93（m，1H），1.68（m，3H），1.41（s，9H），1.24（s，3H），0.13（s，9H）ppm
工程３：化合物４の合成
Figure 0006940039
７０．１ｋｇの化合物３の冷（０〜５℃）ＴＨＦ溶液にテトラブチルアンモニウムフルオリド（１３．３ｋｇ）のＴＨＦ溶液を添加した。脱シリル化が完了した後、反応を水でクエンチし、石油（２９０ｋｇ）で抽出し、有機層を濃縮し、シリカゲルのパッドに通した。濾液を濃縮して４８ｋｇの化合物４を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz，DMSO-d6）δ3.36（d，J=16.0Hz，1H），3.15（m，1H），2.82（d，J=16.0Hz，1H），2.28（m，1H），1.97（m，1H），1.70（m，3H），1.41（s，9H），1.26（s，3H）ppm
工程４：化合物５の合成
Figure 0006940039
化合物４（４８ｋｇ）のＴＨＦ溶液を５０〜６０℃に加温した。上記溶液に（−）−ジ−ｐ−メチルベンゾイル−Ｌ−酒石酸（６９．６ｋｇ）のＴＨＦ溶液を添加した。得られた混合物を５０〜６０℃で１〜２時間撹拌し、次いで徐々に０〜１０℃に冷却した。得られた塩の固体を濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルに再懸濁し、５０〜６０℃で１時間加熱した。混合物を徐々に０〜５℃に冷却した。得られた固体を濾過して１３．１ｋｇのオフホワイト色の固体を得た。固体を水酸化ナトリウム水溶液で処理し、石油で抽出し、濃縮して１３．１ｋｇの化合物５（ｅｅ≧９６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz，DMSO-d6）δ3.36（d，J=16.0Hz，1H），3.15（m，1H），2.82（d，J=16.0Hz，1H），2.29（m，1H），1.97（m，1H），1.70（m，3H），1.41（s，9H），1.26（s，3H）ppm
工程５：化合物６の合成
Figure 0006940039
中間体Ｂ（１４ｋｇ）、ビス（トリフェニル）パラジウムジクロリド（０．７ｋｇ）、ＣｕＩ（０．４２ｋｇ）及びテトラメチルグアニジン（１１．５ｋｇ）をＤＭＦ（４８．１ｋｇ）に溶解した。得られた溶液を撹拌し、脱気し、次いで窒素下で加熱した。ＤＭＦ（１６ｋｇ）中の化合物５（９．２４ｋｇ）の溶液を滴下した。カップリング後、有機層を濃縮し、残渣を水（１４５ｋｇ）及びメチルｔ−ブチルエーテル（１０４ｋｇ）と共に攪拌し、混合物すべてをセライトのパッドに通し、分液した。有機層を、水（１６５ｋｇ）及びブライン（１００ｋｇ）中のチオ尿素（１４ｋｇ）の溶液で洗浄し、濃縮した。残渣をｎ−ヘプタン（１２０ｋｇ）及び酢酸エチル（２８ｋｇ）の混合物に溶解した。この溶液を木炭（１．４ｋｇ）と混合し、４０〜５０℃で１〜２時間加熱し、シリカゲルのパッドを通して濾過した。濾液を濃縮して、化合物６の固体（１４．８９ｋｇ）及び濾液（１３ｋｇのヘプタン溶液，１．２４ｋｇの化合物６を含む）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz、DMSO-d6）δ7.85（d，J=9.6Hz，1H），7.55（m，3H），7.32（m，2H），3.87（s，3H），3.37（d，J=16.0Hz，1H），3.22（m，1H），2.94（d，J=16.0Hz，1H），2.60（m，1H），2.48（m，1H），2.29（s，3H），2.26（m，1H），1.82（m，2H），1.49（s，3H），1.43（s，9H）ppm
工程６：化合物７の合成
Figure 0006940039
内温を２５℃未満に維持しながら、化合物６の上記ヘプタン溶液を低温のトリフルオロメタンスルホン酸（６６．１ｋｇ）に添加した。次いで、固体の化合物６（１４．８７ｋｇ）をバッチ式で添加した。化合物６の添加が完了した後、反応混合物を２５〜３０℃に加温し、反応が完了するまで撹拌した。混合物のすべてを、水（２４０ｋｇ）中の酢酸ナトリウム（１２３．５ｋｇ）の溶液に注いだ。固体の炭酸カリウム（４６．１ｋｇ）を加えて溶液のｐＨを７〜８に調整した。混合物をジクロロメタン（５０９ｋｇ）で抽出し、濃縮した。残渣をｎ−ヘプタン（４１ｋｇ）と共に混合し、再び濃縮して沈殿物を得、これを濾過し、ｎ−ヘプタン（８ｋｇ）で洗浄し、乾燥させた。８．７８ｋｇの化合物７を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz、DMSO-d6）δ12.30（s，1H），7.35（dd，J=9.2，1.6Hz，1H），7.08（dd，J=9.2，1.6Hz，1H），3.79（s，1H），3.68（d，J=17.2Hz，1H），3.21（d，J=17.2Hz，1H），3.06（m，1H），2.68（m，1H），1.96（m，1H），1.74（m，1H），1.49（s，3H）ppm
工程７：化合物Ａ粗製物１の合成
Figure 0006940039
化合物７（８．７６ｋｇ）をメタノール（６９ｋｇ）に溶解し、内部を２５℃未満に冷却した。内温を２５℃未満に維持しながら、酢酸（９．３ｋｇ）及びヒドラジン水和物（７．４ｋｇ，８５％）を添加した。脱気し、窒素で再充填し（３回繰り返した）、反応混合物を５５〜６０℃で４時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を水（２９ｋｇ）と共に混合した。有機層を濃縮し、水（４０ｋｇ）中の炭酸カリウム（１２．５ｋｇ）を添加した。得られた固体を濾過し、水（１８．３ｋｇ）で洗浄した。固体を水（１１０ｋｇ）でスラリー化し、遠心分離し、乾燥し、エタノール（９．４ｋｇ）でスラリー化し、遠心分離し、濾過し、エタノールで洗浄し、真空乾燥して化合物Ａ粗製物１（７．９１ｋｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（600MHz，DMSO-d6）δ12.0（s，1H），10.2（s，1H），7.31（dd，1H，J=9.6，2.0Hz），7.19（dd，1H，J=9.6，2.0Hz），3.77（d，1H，J=16.4Hz），3.34（d，1H，J=16.4Hz），2.97-3.02（m，1H），2.54-2.58（m，1H），2.35-2.40（m，1H），1.90-1.94（m，1H），1.73-1.75（m，1H），1.47（s，3H），1.43-1.45（m，1H）ppm
ＭＳ（ESI）m/e [M+1]+ 299
工程８：化合物Ａ粗製物２の合成
Figure 0006940039
窒素保護下で、化合物Ａ（粗製物１）（７．８８ｋｇ）をイソプロパノール（４２２ｋｇ）と共に撹拌し、固形物が完全に消失するまで７０〜８０℃で１〜２時間加熱した。イソプロパノール（８４．４ｋｇ）中の（＋）−ジ−ｐ−メチルベンゾイル−Ｄ−酒石酸（１０．２５ｋｇ）の溶液を添加した。混合物を１４〜１６時間撹拌し、濾過し、イソプロパノール（１６ｋｇ）で洗浄し、乾燥させた。得られた塩を水（１１８ｋｇ）中の炭酸カリウム（６．１５ｋｇ）の撹拌した溶液に加えた。沈殿物を遠心分離し、濾過し、水（１８ｋｇ）で洗浄した。固体を水（１１０ｋｇ）でスラリー化し、遠心分離し、乾燥させた。固体をＴＨＦ（７５ｋｇ）に溶解し、活性炭（０．８ｋｇ）を添加した。混合物を脱気し、窒素で再保護し、撹拌し、４０〜４５℃で１〜２時間加熱し、冷却し、セライトを通して濾過し、濃縮して固体を得、これをさらにエタノール（６．５ｋｇ）でスラリー化し、濾過して、５．６ｋｇの化合物Ａ粗製物２を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz，DMSO-d6）δ12.0（s，1H），10.2（s，1H），7.31（dd，1H，J=9.6，2.0Hz），7.19（dd，1H，J=9.6，2.0Hz），3.77（d，1H，J=16.4Hz），3.34（d，1H，J=16.4Hz），2.97-3.02（m，1H），2.54-2.58（m，1H），2.35-2.40（m，1H），1.90-1.94（m，1H），1.73-1.75（m，1H），1.47（s，3H），1.43-1.45（m，1H）ppm
ＭＳ（ESI）m/e [M+1]+ 299
工程９：化合物Ａセスキ水和物の合成
Figure 0006940039
化合物Ａ粗製物２（５．３ｋｇ）をイソプロパノール（４１．６ｋｇ）及び水（１５．９ｋｇ）の溶液と混合した。混合物を脱気し、窒素下で再保護し、次いで６０℃に加熱し、固体が完全に溶解するまで２〜４時間撹拌した。温度を７０〜８０℃に上げ、水（１４３ｋｇ）を添加した。得られた混合物を内温７０〜８０℃に加熱し、次いで加熱を停止し、穏やかに１６時間撹拌した。析出物を濾過し、水（１９ｋｇ）で洗浄し、水（２１ｋｇ）で２時間スラリー化した。得られた固体を濾過し、水（２０ｋｇ）で洗浄した。濾過した固体を４５℃未満の温度で２４〜３６時間乾燥させた。Ｄ９０＝５１．５１μｍ、Ｄ５０＝１８．６２μｍ、Ｄ１０＝７．６３μｍのサイズの化合物Ａセスキ水和物（４．２２ｋｇ）を得た。このＰＳＤの範囲は、製剤開発にほぼ理想的である。
粉末Ｘ線回折パターン法を用いて、結晶型Ｃの構造を特徴付けした（参照，図７Ａ）。化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１７に示す。化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの１３Ｃ-ＮＭＲスペクトルを図１８に示す。化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＤＶＳスペクトルを図１９に示す。化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＴＧＡスペクトルを図２０に示す。ここで、０．５水分子が５０℃で失われ、他の１．０水分子が１００℃で失われ、結晶型中の水のモル数が１．５であることが確かめられた。化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＤＳＣスペクトルを図２１に示す。
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの定量的元素分析を表１６に示す。Ｃ、ＨとＮの測定値と計算値の絶対差は０．３％未満であり、その分子式Ｃ１６Ｈ１５ＦＮ４Ｏ・１．５Ｈ２Ｏに一致する。分析はデュプリケイトで行った。
Figure 0006940039
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの製造に使用される全ての溶媒の残留レベルを臨床バッチ（03035-20131201）で試験した。ＩＣＨ標準を十分に下回って制御されていた。
Figure 0006940039
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの含水量は８．６％（ＫＦ法）であることが分かり、この数値はその分子式Ｃ１６Ｈ１５ＦＮ４Ｏ・１．５Ｈ２Ｏの水分含量の理論値（図２０のＴＧＡ図に示されるように８．３％）と一致する。
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの水溶性は非常に低い（約０．０４ｍｇ／ｍＬ）が、胃液（ＳＧＦ）への溶解度はかなり高い（約４．５ｍｇ／ｍＬ）。この劇的な溶解度の差があるため、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃは医薬物質（ＡＰＩ）の良好な形態である。化合物ＡのＡＰＩの再結晶及びスラリーは、ＡＰＩ製造のための好ましい溶媒系である水−アルコール溶液中で容易に実施することができる。ＳＧＦ中の高い溶解度によって、化合物Ａセスキ水和物は、胃で迅速に溶解され吸収される。
スキーム３：中間体Ｂの調製
Figure 0006940039
工程１’：化合物９の合成
Figure 0006940039
市販の化合物８（５０ｋｇ）を濃硫酸（３４９．５ｋｇ）に溶解し、撹拌した。内温を３５〜４３℃に制御しながら、濃硝酸（９５％，２４．９ｋｇ）と濃硫酸（５０．０ｋｇ）の混合物を添加した。反応混合物を氷水に注いだ。得られた懸濁液を遠心分離し、固体を回収し、水（２４５ｋｇ）でスラリー化し、遠心分離し、空気流を用いて４５℃で乾燥させて、４８．５ｋｇの化合物９を得た。
工程２’：化合物１０の合成
Figure 0006940039
化合物９（４８．５ｋｇ）をメタノール（１２１．５ｋｇ）に溶解し、塩化チオニル（４９．５ｋｇ）を加えた。エステル化が完了した後、反応混合物を０〜５℃に２〜１２時間冷却した。沈殿物を遠心分離し、濾過し、メタノールで洗浄し、水でスラリー化し、遠心分離し、再度濾過し、乾燥させて、２６．４ｋｇの化合物１０を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（600MHz，DMSO-d6）δ8.31（dd，J=8.0，2.8Hz，1H），7.98（dd，J=8.0，2.8Hz，1H），3.91（s，3H）ppm
工程３’：化合物１１の合成
Figure 0006940039
化合物１０をエタノール（１０６ｋｇ）と水（１３２ｋｇ）の混合物に溶解させた。塩化アンモニウム（２６．４ｋｇ）を加え、次に鉄粉末（２６．４ｋｇ）をバッチ式に添加した。混合物を７５〜８５℃で３時間撹拌し、室温に冷却し、酢酸エチル（２３６ｋｇ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３水溶液（２３０ｋｇ）で洗浄し、次いで硫酸塩水溶液で洗浄し、濃縮して、２４ｋｇの化合物１１を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（600MHz，DMSO-d6）δ6.73（dd，J=8.0，2.8Hz，1H），6.63（dd，J=8.0，2.8Hz，1H），5.92（s，2H），3.82（s，3H）ppm
工程４'：中間体Ｂの合成
Figure 0006940039
化合物１１（２４．６ｋｇ）を塩化メチレン（２４０ｋｇ）とピリジン（２４．３ｋｇ）の混合物に溶解させ、３０分間撹拌した。トルエンスルホニルクロライド（１８．５ｋｇ）を添加した。混合物を撹拌し、３８〜４５℃で２０〜２２時間加熱した。水（１８７ｋｇ）を添加し、撹拌し、分液した。有機層を濃塩酸（４９ｋｇ）及び水（４９ｋｇ）で洗浄し、濃縮し、石油を添加した。形成された大量の沈殿物を、濾過し、乾燥させて、粗中間体Ｂを得た。粗生成物をトルエン（３２ｋｇ）に溶解し、すべての沈殿物が完全に溶解するまで６０〜６５℃で加熱した。溶液を２０分間撹拌し、５〜１５℃に冷却し、静置した。懸濁液を遠心分離し、分離した。得られた固体をトルエン（２４．６ｋｇ）と石油（３７ｋｇ）の混合物でスラリー化し、濾過し、石油で洗浄し、乾燥させて、中間体Ｂを良好な品質で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（600MHz，DMSO-d6）δ10.27（s，1H），7.69（m，2H），7.45（m，3H），7.18（dd，J=9.6，3.2Hz，1H）ppm
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの長期安定性試験によって、２５℃／６０％ＲＨで１２ヶ月まで保存した場合（アッセイｗ／ｗ：Ｔ０＝９９．１％及びＴ１２＝９９．０％）に、及び４０℃／７５％ＲＨ条件で１２ヶ月まで保存した場合（アッセイｗ／ｗ：Ｔ０＝９９．０％及びＴ１２＝９８．９％）に顕著な化学的純度の変化が生じないことが示された。加えて、２５℃／６０％ＲＨで１２ヶ月まで、４０℃／７５％ＲＨで１２ヶ月まで保存した場合、結晶型及び光学純度の変化は観察されなかった。
溶解度試験によって、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃは水にほとんど溶けなかった（０．０４ｍｇ／ｍＬ）が、ＳＧＦ（胃液）に非常によく溶解し、溶解度は４．５ｍｇ／ｍＬであった。
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃはわずかに吸湿性であることが判明した。
実施例２
化合物Ａの単結晶型Ｃ ＊＊ の調製
単結晶成長スクリーニングを、溶媒、温度及び再結晶法を変化させることで、９４の異なる条件下で行った。そのスクリーニングから、室温でのＩＰＡ／水からの蒸気拡散によって構造決定に適した単結晶が得られた。化合物Ａの結晶構造は、単結晶から集められた一組の回折データを用いて首尾よく決定された。
実施例３
化合物Ａの結晶型Ａの調製
ｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液中で化合物Ａの遊離塩基を再結晶することで、化合物Ａの結晶型Ａを得た。
実施例１と同様の手順で、すなわちｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏから再結晶化する一方、真空中で乾燥して部分的に脱水が起こることで、結晶型Ａを製造した。
［手順］化合物Ａ（２３ｇ，７７．２ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（２４０ｍｌ／３６０ｍｌ）の溶媒に懸濁し、加熱還流（約８６℃）し、すべての固体が溶解するまで還流下で約３．０時間撹拌した。混合物を攪拌しながら６５℃まで徐々に冷却（約１℃／分）し、結晶の種を加えた（約２０ｍｇ，９９．１％ｅｅ）。室温まで冷却を続け、室温で静置した（約１６時間）。混合物を濾過し、水（８０ｍＬ×２）で洗浄した。固体を４０℃で２時間真空乾燥して、結晶性結晶として表題の生成物（１８ｇ）を得た。粉末Ｘ線回折パターン法を用いて、結晶型Ａの構造を特徴付けた（参照，図５）。その結果、結晶型Ａは水和物であることが示された。ＴＧＡの結果、下記の表１４に示すように、１５０℃までに４．７重量％の重量減少が示された。ＤＳＣの結果は、２８５．０℃（開始温度）に融解吸熱を示した。
実施例４
化合物Ａの結晶型Ｂの調製
室温のＭＴＢＥ中の化合物Ａの遊離塩基の結晶型Ａのスラリーから、化合物Ａの遊離塩基の結晶型Ｂのサンプルを得た。
［手順］１５．１ｍｇの結晶型Ａの固体を１．５ｍＬのバイアルに秤量し、０．３ｍＬのＭＴＢＥをバイアルに加えて懸濁液を得た。混合物を室温で８００ｒｐｍの速度で２日間磁気的に撹拌して結晶型Ｂを得た。粉末Ｘ線回折パターン法を用いて、結晶型Ｂの構造を特徴付けた（参照，図６）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに６．０重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８３．５℃（開始温度）で分解する前に、３つのオーバーラップした吸熱を示した。
実施例５
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃ ＊ の製造のための代替的手順
実験室規模で２−メチルテトラヒドロフラン溶液と水との間の蒸気拡散によって、結晶型Ｃ＊を得た。実施例１で大規模で調製された結晶型Ｃと区別するために、実施例５の実験室規模で調製された結晶型を結晶型Ｃ＊と称する（結晶型Ｃ＊は時には実験室規模の結晶型Ｃとも称される。また、結晶型Ｃは、大規模の結晶型Ｃと称されることもある）。
１８．９ｍｇの結晶型Ａの固体を３ｍＬのガラスバイアルに秤量し、０．４ｍＬの２−メチルテトラヒドロフランを加えて透明な溶液を得た。３ｍＬのバイアルを、３ｍＬの水を入れた２０ｍＬのガラスバイアルに密封した。この系を室温で２日間保持し、蒸気を溶液と相互作用させて結晶型Ｃ＊を得た。粉末Ｘ線回折パターン法を使用して、結晶型の構造を特徴付けた。これは図７Ｂと一致する。この実験室規模のＴＧＡ結果は、１５０℃までに８．９重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８１．９℃で分解する前に、２つの吸熱と１つの発熱を示した。
実施例６
化合物Ａの結晶型Ｄの調製
化合物Ａの結晶型Ａの酢酸溶液に反溶媒のトルエンを添加することによって、化合物Ａの結晶型Ｄのサンプルを得た。
［手順］１６．３ｍｇの結晶型Ａの固体を２０ｍＬのガラスバイアルに秤量した。０．２ｍＬの酢酸をバイアルに加えて透明な溶液を得た。室温で撹拌した後、濁りが観察された。２ｍＬのトルエンを段階的に溶液に添加して、より多くの沈殿を誘発させ、結晶型Ｄを得た。粉末Ｘ線回折パターン法を使用して、結晶型Ｄの構造を特徴づけた（参照，図８）。ＴＧＡの結果は、１６０℃までに３４．５重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２６９．５℃で分解する前に３つのオーバーラップした吸熱を示した。
実施例７
化合物Ａの結晶型Ｅの調製
化合物Ａの遊離塩基の結晶型Ａの固体とＤＭＡ蒸気との間の蒸気拡散によって、化合物Ａの結晶型Ｅのサンプルを調製した。
［手順］１２．２ｍｇの結晶型Ａの固体を３ｍＬのガラスバイアル中に秤量した。３ｍＬのバイアルを、２ｍＬのＤＭＡを含む２０ｍＬガラスバイアルに密封した。この系を室温で７日間保持し、蒸気を固体と相互作用させて結晶型Ｅを得た。粉末Ｘ線回折パターン法を使用して、結晶型Ｅの構造を特徴付けた（参照，図９）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに３８．３重量％（結晶水分子を含む）の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２７７．１℃（開始温度）で分解する前に２つの吸熱を示した。
実施例８
化合物Ａの結晶型Ｆの調製
化合物Ａの遊離塩基の結晶型Ａの固体と酢酸蒸気との間の蒸気拡散によって、化合物Ａの結晶型Ｆのサンプルを調製した。
［手順］１１．０ｍｇの結晶型Ａの固体を３ｍＬのガラスバイアル中に秤量した。３ｍＬのバイアルを、２ｍＬの酢酸を含む２０ｍＬガラスバイアルに密封した。この系を室温で７日間保持し、蒸気を固体と相互作用させて結晶型Ｆを得た。粉末Ｘ線回折パターン法を使用して、結晶型Ｆの構造を特徴付けた（参照，図１０）。ＴＧＡの結果は、１６０℃までに３４．５重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、分解する前に４つのオーバーラップした吸熱を示した。
実施例９
化合物Ａの結晶型Ｇの調製
２５℃におけるＤＶＳ（動的蒸気収着）試験の間、化合物Ａの結晶型Ａの湿度誘起相転移によって、化合物Ａの結晶型Ｇを調製した。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｇの構造を特徴付けた（参照，図１１）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに６．５重量％の二段階の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８４．９℃（開始温度）で分解する前に３つのオーバーラップした吸熱を示した。
実施例１０
化合物Ａの結晶型Ｈの調製
化合物Ａの結晶型Ｅを８０℃に加熱し、窒素保護下で室温に冷却することで、化合物Ａの結晶型Ｈのサンプルを調製した。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｈの構造を特徴付けた（参照，図１２）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに２４．８重量％の二段階の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２７７．９℃（開始温度）で分解する前に２つのオーバーラップした吸熱を示した。
実施例１１
化合物Ａの結晶型Ｉの調製
化合物Ａの結晶型Ｅを１５０℃に加熱し、窒素保護下で室温に冷却することで、化合物Ａの結晶型Ｉのサンプルを得た。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｉの構造を特徴付けた（参照，図１３）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに１.８重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２７７．０℃（開始温度）で分解発熱を示した。
実施例１２
化合物Ａの結晶型Ｊの調製
化合物Ａの結晶型Ａを１５０℃に加熱し、窒素保護下で室温に冷却することで、化合物Ａの結晶型Ｊのサンプルを得た。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｊの構造を特徴付けた（参照，図１４）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに１．１重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８５．１℃（開始温度）で分解発熱を示した。
実施例１３
化合物Ａの結晶型Ｋの調製
化合物Ａの結晶型ＡのＭｅＯＨ溶液を室温でゆっくりと蒸発させることで、化合物Ａの結晶型Ｋのサンプルを得た。
［手順］１８．３ｍｇの結晶型Ａの固体を３ｍＬのガラスバイアルに秤量し、１．８ｍＬのＭｅＯＨをバイアルに加えて透明な溶液を得た。この溶液を室温で蒸発させて沈殿を誘発して結晶型Ｋを得た。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｋの構造を特徴付けた（参照，図１５）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに１２．８重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８４．２℃（開始温度）で分解する前に吸熱及び発熱を示した。
実施例１４
化合物Ａの結晶型Ｌの調製
化合物Ａの結晶型Ｋを１５０℃に加熱し、窒素保護下で室温に冷却することで、化合物Ａの結晶型Ｌのサンプルを得た。粉末Ｘ線回折パターン法をを使用して、結晶型Ｌの構造を特徴付けた（参照，図１６）。ＴＧＡの結果は、１５０℃までに１．８重量％の重量減少を示した。ＤＳＣの結果は、２８１．７℃（開始温度）で分解する前に吸熱を示した。
有効性の試験
試験１：化合物Ａセスキ水和物（試験した結晶型Ｃ）によるポリＡＤＰリボシル化（ＰＡＲ化）酵素の阻害及び選択性
ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＴＮＫＳ１及びＴＮＫＳ２のポリＡＤＰリボシル化（ＰＡＲ化）活性の阻害における化合物Ａセスキ水和物の生化学的効力を、市販のＰＡＲＰ１／２化学発光アッセイキット（BPS Bioscience Inc.）を用いて測定した。バキュロウイルス感染Sf9細胞からＧＳＴ標識酵素を発現させ、精製した（酵素構築物については表１８参照）。ＰＡＲＰ１及びＰＡＲＰ２の酵素はアッセイキット由来であり、ＴＮＫＳ１及びＴＮＫＳ２の酵素は実験室で製造した。製造者の指示に従ってアッセイを行った。簡潔には、Ｈ２Ａ及びＨ２Ｂタンパク質をプレートの表面上に固定化し、次いで化合物の連続希釈物及び標的酵素と共に０．５時間インキュベートした。次に、ビオチン化ＮＡＤ及びＤＮＡ（ＴＮＫＳ１又はＴＮＫＳ２にはＤＮＡは必要ではない）をウェルに添加して反応を開始させた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＨＲＰ基質を添加した後、ビオチン化ＰＡＲ化産物を化学発光によって測定した。Graphpad Prismソフトウェアを用いて用量応答％阻害データを４パラメータロジスティックモデルに適合させて、化合物Ａセスキ水和物のＩＣ５０を得た。
表１８は、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＴＮＫＳ１及びＴＮＫＳ２の酵素に対する化合物Ａセスキ水和物のＩＣ５０を要約する。表１８に示すように、化合物Ａセスキ水和物は、ＰＡＲＰ１及びＰＡＲＰ２の触媒活性をそれぞれ１．３及び０．９２ｎＭのＩＣ５０で、強力に阻害する。ＰＡＲＰ１又はＰＡＲＰ２よりもＴＮＫＳ１及びＴＮＫＳ２のほうが、化合物Ａセスキ水和物の阻害は１００倍以上弱い。
Figure 0006940039
試験２：細胞内標的阻害
ＨｅＬａ細胞は国立生物科学研究所（北京）から贈与され、ウシ胎児血清（１０％ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持され、３７℃のインキュベーター中で９５％湿度及び５％ＣＯ２で保たれた。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とインキュベートすると、細胞内ＰＡＲＰ活性が誘導され、内因性ＰＡＲレベルが上昇した。アッセイは以下のように行った。
透明底部及び黒色壁を有する９６ウェルプレートに、細胞を５０００細胞／ウェル（１００μＬ）の密度でプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４時間インキュベートし、次いで特定濃度の試験化合物（典型的には０．０１ｎＭ〜１０μＭ）と共にインキュベートした。翌日、ＰＢＳ中のＨ２Ｏ２溶液（最終濃度２００μＭ）を加え、プレートを３７℃で５分間保った。次いで、プレート反転によって培地を静かに除去し、細胞を、２０分間−２０℃の氷冷ＭｅＯＨで固定した。定着液を除去し、ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、検出緩衝液（５０μＬ／ウェル，ＰＢＳ，Tween（０．１％）及びＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含む）、一次ＰＡＲｍＡｂ（Alexis ALX-804-220, 1：2000）、二次抗マウスAlexa Fluor 488抗体（Molecular Probes A11029,1：2000）、及び核色素ＤＡＰＩ（Molecular Probes D3571，１５０ｎＭ）を添加し、暗所で４℃で一晩インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、ＰＡＲポリマーレベルをArrayScan VTI（ThermoFisher）で推定した。増加するＰＡＲＰ阻害剤濃度の存在下での残留酵素活性に基づいて、パーセント阻害を測定した。XLfitソフトウェアを用いて用量依存性データを４パラメータロジスティックモデルに適合させて、ＩＣ５０を得た。
これらの条件下で、化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃは、０．２４ｎＭのＩＣ５０で細胞内ＰＡＲ形成を阻害し、それぞれ２．６６ｎＭ及び０．４７ｎＭの細胞ＰＡＲ形成ＩＣ５０であるベリパリブ及びオラパリブよりも強力であった。
Figure 0006940039
試験３：癌細胞の殺傷の合成致死性
ＢＲＣＡ遺伝子変異体又は他の相同組換え欠損ではないMDA-MB-231細胞を、胎児ウシ血清（１０％ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＢＲＣＡ１欠損細胞株MDA-MB-436を、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。２つの細胞株の両方を３７℃のインキュベーター内で９５％湿度及び５％ＣＯ２に保った。
９６ウェルプレートの１ウェルあたり播種した腫瘍細胞の数を、各細胞株について最適化して、７日間の処置期間にわたって対数増殖を確実にした。細胞を１６時間付着させた後、特異的濃度の試験化合物で処理した。化合物への７日間の暴露の後、化合物の増殖阻害活性をCellTiter-Glo発光細胞生存アッセイ（Promega）を用いて測定した。PHERAstar FSリーダー（BMG Labtech）を用いて、発光シグナルを測定した。細胞生存率を、模擬処置対照と比較して表した。XLfitソフトウェアを用いて用量依存性データを４パラメータロジスティックモデルに適合させて、増殖阻害のＥＣ５０値を計算した。
これらの条件下で、ＢＲＣＡ遺伝子が野生型であるMDA-MB-231は、約９μＭのＥＣ５０で化合物Ａに対して比較的耐性であった。対照的に、ＢＲＣＡ１欠損である腫瘍細胞株（MDA-MB-436）は、化合物Ａに非常に感受性があった。化合物Ａは、試験した腫瘍細胞において、ベリパリブよりも強力であり、オラパリブと同様であることが示された。
Figure 0006940039
試験５：化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃのインビボ薬理
皮下ヒトMDA-MB-436（ＢＲＣＡ１変異体）乳癌を担持するＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスにおいて、ＰＡＲＰに対する化合物Ａのインビボ薬力学活性（ＰＤ）を評価した。さらに、この異種移植モデルにおいて、血漿及び腫瘍組織における化合物Ａ濃度（ＰＫ，薬物動態）とＰＡＲ化（ＰＤ，薬力学）に対するその効果との関係を調べた。化合物Ａの経口投与は、マウスにおけるMDA-MB-436乳癌異種移植片におけるＰＡＲ化の時間依存性及び用量依存性阻害をもたらした。腫瘍組織におけるＰＡＲ化の阻害は、化合物Ａの腫瘍薬物濃度と良好に相関する。ＰＡＲ化の強力な阻害が、０．３４ｍｇ／ｋｇ以上の化合物Ａの単回経口投与の４時間後に観察された。５．４５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａは、MDA-MB-436腫瘍組織において強力で持続的なＰＡＲ化阻害を誘導した。０．１７〜１０．９ｍｇ／ｋｇの化合物Ａの単回経口投与後４時間で、MDA-MB-436異種移植片におけるＰＡＲレベルの用量依存的阻害が誘導された。５．４５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで、急速で強力なＰＡＲレベルが誘導された。ＰＡＲ化阻害は、処置後０．５時間で９８％であった。この阻害は、最初の１２時間を通して高レベル（＞８０％）のままであったが、２４時間後に５３％に戻った。これらのデータは、マウス異種移植モデルの有効性研究における１日２回投与を支持する。用量滴定及び時間経過研究の両方から、少なくとも８０％のＰＡＲ化阻害を達成するためには、腫瘍組織中の化合物Ａ濃度が０．５μｍｏｌ／ｋｇ以上である必要があることが示唆された。
化合物ＡとＤＮＡアルキル化剤であるテモゾロミド（ＴＭＺ）の併用効果を評価するために、H209 SCLC異種移植モデルで化合物Ａのインビボ有効性が探索された。ＴＭＺ単剤はこのモデルではかなり有効であった。１サイクルの処置で、すべての動物に腫瘍が生じなかった。しかし、第２サイクル中に、迅速に耐性が生じた。化合物Ａ及びＴＭＺの組み合わせは、さらなる毒性なしに耐性を有意に遅延させた。複数のサイクルの後、腫瘍は組み合わせ治療に対して感受性を維持していた。化合物ＡがＴＭＺ耐性を克服することができるかどうかを調べるために、H209腫瘍をインビボでＴＭＺの複数のサイクルで処理することで、ＴＭＺ耐性（ＴＲ）H209腫瘍を生成した。誘導されたH209-TR株は、この異種移植マウスモデルにおいて、化合物ＡとＴＭＺとの組み合わせに対して感受性を維持していた。化合物Ａは顕著な脳浸透を有する。それによって、脳腫瘍又は脳転移を有する腫瘍を治療する際にＴＭＺと組み合わせることが魅力的になる。確立された頭蓋内H2O9異種移植片を有するマウスを用いて、脳におけるSCLCに対する化合物Ａ及びＴＭＺの組み合わせの活性をさらに調べた。この頭蓋内モデルにおいて、化合物Ａの添加は、ＴＭＺ単剤と比較して動物の生存期間を有意に延長した。
試験６：化合物Ａセスキ水和物（結晶型Ｃ）の毒物学
化合物Ａの非臨床毒性プロファイルは、ラット及びイヌの両方における、２８日間までの単回及び反復投与試験で特徴付けられた。副作用には体重減少又は体重増加と食物消費、ＷＢＣ、ＮＥＵＴ、ＬＹＭＰ、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ及びＡＰＴＴの減少、ＰＬＴの増加が含まれた。骨髄は主要な標的臓器であると考えられ、組織病理学的変化の重症度は最小から顕著までの範囲であった。毒性は用量依存性であり、全身曝露と相関し、２８日間の回復期の後に可逆性であった。化合物Ａは、ＩＣ５０＝２５．９７μＭでｈＥＲＧ電流に明らかな影響を示さなかった。Ａｍｅｓアッセイでは変異原性は認められなかった。要約すると、入手可能な毒物学的データは、後期の及び進行した癌患者についての第Ｉ相試験における化合物Ａの臨床開発を支持するのに十分である。毒性は、臨床的に監視及び管理することができた。
試験７：化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃの薬物動態
薬物動態試験に用いた種は、ラット及びイヌであった。両方の種で、化合物Ａは優れた経口生物学的利用能（＞４０％）を有していた。経口投与後、排泄半減期はラットで３．１〜５．０時間の範囲であり、イヌで１．５〜２．５時間の範囲であった。クリアランスは、ラット（８．６７〜１５．２ｍＬ／分／ｋｇ）及びイヌ（１８．３〜１８．５ｍＬ／分／ｋｇ）の両方で中等度であった。ラット及びイヌの定常状態の分布容積は、それぞれ２．４Ｌ／ｋｇ及び１．９Ｌ／ｋｇであった。両方の種で複数の経口投与後の化合物Ａの蓄積はなかった。
試験８：化合物Ａセスキ水和物の結晶型ＣのＡＤＭＥ
化合物Ａの血漿タンパク質結合（ＰＰＢ）は、ヒト、サル、イヌ、ラット及びマウスの血漿でそれぞれ９５．７％、８８．９％、７９．０％、８４．９％及び８５．０％であった。ラットの経口投与後、化合物Ａは検査したすべての臓器で検出された。薬物濃度は投与後０．２５〜１時間で最大に達し、投与後２４時間でピーク濃度の１０％未満に減少した。
化合物Ａはヒト、イヌ、ラット及びマウスの肝臓ミクロソームでゆっくりと代謝されたが、サルの肝ミクロソームでは迅速に代謝され、合計５種の代謝産物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５）が同定された。経口投与後のラットの糞便、血漿、尿及び胆汁中には、６種の代謝物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ５、Ｍ６及びＭ７が観察された。化合物Ａは、主に糞便中に排泄された。糞便中の化合物Ａの累積排泄量は経口投与後１５〜２０％（４８時間まで）であった。化合物Ａの１％未満がラットの尿及び胆汁中に排泄された。
ＣＹＰ３Ａは、化合物Ａの代謝の原因となる主要なＣＹＰアイソフォームであるが、ＣＹＰ２Ｃ８は、化合物Ａの代謝にあまり寄与しなかった。化合物ＡはＣＹＰ２Ｃ９（ＩＣ５０＝６．４８μＭ）の中等度の阻害剤であるが、他のＣＹＰアイソザイムのＩＣ５０はすべて１０μＭより大きかった。化合物Ａは、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ３Ａの誘導物質ではない。
試験９：臨床試験
化合物Ａセスキ水和物の結晶型Ｃを用いて調製されたカプセルを用いて、２．５、５、１０、２０、４０、８０及び１２０ｍｇの１日２回で投与された２５人の被験者について第Ｉ相臨床安全性試験を完了した。その結果、２．５〜１２０ｍｇの１日２回投与は安全であり、耐容性が良好であることが示された。化合物Ａの治療で、ＢＲＣＡ１／２変異卵巣癌患者において部分的又は完全な応答が得られた。これらの予備的データによって、化合物Ａセスキ水和物（結晶型Ｃ）がＢＲＣＡ１／２変異体又はＨＲ欠損癌の治療に有効であることが実証された。
特定の実施態様の前述の実施例及び説明は、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではなく、例示として捉えられるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、上述した特徴の多くの改変及び組み合わせを利用することができる。このような全ての改変は、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (9)

  1. 式ＩＩＩに示される（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物の結晶であって、
    Figure 0006940039
     前記結晶が、５．３±０．２°、６．３±０．２°、６．５±０．２°、６．９±０．２°、８．７±０．２°、１０．６±０．２°、１１．１±０．２°、１１．６±０．２°、１２．６±０．２°、１３．１±０．２°、１３．７±０．２°、１４．４±０．２°、１４．８±０．２°、１５．１±０．２°、１５．９±０．２°、１６．２±０．２°、１７．３±０．２°、１８．０±０．２°、１８．７±０．２°、１９．０±０．２°、１９．４±０．２°、２０．２±０．２°、２０．６±０．２°、２１．０±０．２°、２１．２±０．２°、２１．５±０．２°、２２．３±０．２°、２２．７±０．２°、２３．４±０．２°、２３．８±０．２°、２４．３±０．２°、２４．７±０．２°、２５．３±０．２°、２５．７±０．２°、２６．１±０．２°、２６．４±０．２°及び２７．４±０．２°からなる群から独立して選択される４、５、６、７、８、９又はそれ以上の２θ値を有する回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる、Ｃ型結晶である、結晶。
  2. 以下の工程を含む、請求項１に記載の（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物のＣ型結晶を調製する方法：
    ｉ．アルカリの存在下、適当な溶媒中で（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの遊離塩基を分割剤と反応させて（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの粗製物２を得る工程、及び
    ｉｉ．混合溶媒中で一定時間及び一定温度で粗製物２を再結晶させて（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物のＣ型結晶を得る工程であって、前記混合溶媒がｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ ２ Ｏである工程。
  3. 以下の手順のいずれか１つを含む、請求項１に記載の（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物のＣ型結晶を調製する方法：
    （ａ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オンの遊離塩基又は水和物を、溶媒又は溶媒混合物に溶解させて溶液又は懸濁液を生成させ、目的の結晶型の（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物を沈殿させる手順；及び
    （ｂ）（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン 水和物を、溶媒又は溶媒混合物に溶解又は懸濁させ、反溶媒を用いて目的の結晶型の（Ｒ）−２−フルオロ−１０ａ−メチル−７，８，９，１０，１０ａ，１１−ヘキサヒドロ−５，６，７ａ，１１−テトラアザシクロヘプタ［ｄｅｆ］シクロペンタ［ａ］フルオレン−４（５Ｈ）−オン セスキ水和物を沈殿させる手順であり、
    前記溶媒又は溶媒混合物がｉ−ＰｒＯＨ／Ｈ ２ Ｏである方法。
  4. 手順（ａ）又は（ｂ）が、加熱、非溶解不純物の濾別、溶媒の蒸留、反溶媒又は反溶媒混合物の添加、結晶の種の添加、沈殿誘導剤の添加、冷却、沈殿、結晶生成物を回収するための濾過から独立して選択される１以上の手順をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 遊離塩基が、単離され精製された遊離塩基、単離されたが未精製の遊離塩基、又は遊離塩基を含有する反応粗製物である手順（ａ）を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 治療上有効な量の請求項１に記載の結晶及び薬学上許容される担体を含有する医薬組成物。
  7. 患者の疾患若しくは病気を治療又は予防するための請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 疾患又は病気が、脳腫瘍、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、リンパ腫、又は甲状腺腫瘍及びこれらの合併症からなる群から選択される癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 疾患が、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２変異の乳癌、卵巣癌及びこれらの合併症からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
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