JP6942309B2

JP6942309B2 - フラビウイルスウイルス様粒子

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Publication number: JP6942309B2
Application number: JP2017513835A
Authority: JP
Inventors: 渉赤畑; 上野　隆司; 隆司上野
Original assignee: VLP Therapeutics Inc
Current assignee: VLP Therapeutics Inc
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2021-09-29
Anticipated expiration: 2035-09-10
Also published as: US10098943B2; TW201612190A; CN106687590B; TWI695842B; AU2015313650A1; CN106687590A; JP2017528139A; BR112017004770A8; MX383330B; MX2017003117A; EP3191589A1; PH12017500450A1; BR112017004770A2; CA2960102C; KR102532832B1; EP3191589A4; AU2015313650B2; WO2016038895A1; SG11201701669PA; KR20170055513A

Description

本願は、1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子と、それを含む組成物またはワクチン、医療における、特にフラビウイルス感染の予防または処置におけるその使用に関する。

フラビウイルスには70を超える様々なウイルスが含まれ、それらの多くは節足動物媒介性であり、蚊またはダニにより伝播される。

フラビウイルスは、フラビウイルス科の1つの属である。この属には、ウエストナイルウイルス(WNV)、デングウイルス(DENV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、黄熱ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、および脳炎または出血性疾患を引き起こし得るいくつかの他のウイルスが含まれる。

デング熱は、フラビウイルスにより引き起こされる蚊媒介性疾患であり、ほとんどの熱帯地域および多くの亜熱帯地域に広がっている。該疾患は、亜型I〜IVを含むデングウイルス1、亜型Asian I、Asian II、Cosmopolitan、AmericanおよびAmerican／Asianを含むデングウイルス2、亜型I〜IVを含むデングウイルス3、亜型I〜IIIを含むデングウイルス4の4つの近縁ウイルスにより引き起こされる。デングウイルスは、世界的な疾患の発症率に関して最も重要なフラビウイルスであるが、該ウイルスに対するワクチンの開発および使用は、これまでのところ、感染による免疫エンハンスメントなどワクチン関連有害事象の理論的リスクや4つのデング血清型全てに対して同時に持続性の防御免疫応答を誘発する必要性などにより妨げられてきた。

有効なデング熱の治療は存在せず、デング熱に対する予防は、現在のところベクターコントロール対策に限られている。それゆえ、デングワクチンは、該疾患の制御において大きな進歩となるであろう。

利用可能な、許可されたデングワクチンはないが、いくつかのワクチン候補が、現在臨床試験で評価されている。WHOは、デング熱の世界的流行の広がりに懸念が募っており、安全かつ有効なワクチンが緊急に必要とされていると指摘している。(http://www.who.int/immunization/research/development/dengue_vaccines/en/) and Vaccine 30 (2012) 4301-4306)

ウイルス様粒子(VLP)は、標準の天然ウイルスの組織および構造を模倣しているが、ウイルスゲノムを欠損しているために非伝染性で、より安全なワクチン候補を産生できる可能性のある、多タンパク質構造である。予防用のVLPベースのワクチンは、現在のところ、世界中でごく少数しか市販されていない: GlaxoSmithKlineによるEngerix（登録商標）(Ｂ型肝炎ウイルス) およびCervarix（登録商標）(ヒトパピローマウイルス)およびMerck and Co., Inc.によるRecombivax HB（登録商標）(Ｂ型肝炎ウイルス)およびGardasil（登録商標）(ヒトパピローマウイルス)はそのいくつかの例である。他のVLPベースのワクチンの候補は、臨床試験が行われているかまたは前臨床評価が行われており、例えば、インフルエンザウイルス、パルボウイルス、ノーウォークウイルスおよび種々のキメラVLPである。前臨床試験が成功しているにも関わらず、未だに小規模の基礎研究に限定されているものが他に多く存在する。大規模のVLP産生の意味は、プロセス制御、モニタリング化および最適化の点で議論されている。主要な上流および下流の技術的課題が特定されており、それに基づいて議論されている。VLPベースのワクチンの、成功した画期的新薬が、臨床試験の最新の結果ならびに治療的または予防的なワクチン接種のいずれかのためのキメラVLPベース技術の近年の発展とともに、端的に表されている。

これまでに、ヒトおよび他の動物に感染する30を超える異なるウイルスに対するVLPベースのワクチンが産生されている。例には、AAV(アデノ随伴ウイルス)、H5N3(トリインフルエンザ)、BFDV(Budgerigar fledgling disease virus)、BTV(ブルータングウイルス)、エボラ、エンテロウイルス71、GHPV(Goose hemorrhagic polyoma virus)、HBV(Ｂ型肝炎ウイルス)、HCV(C型肝炎ウイルス)、HDV(デルタ型肝炎ウイルス)、HEV(E型肝炎ウイルス)、HIV、HPV(ヒトパピローマウイルス)、IBDV(伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス)、インフルエンザA型、インフルエンザA H1N1型、インフルエンザA H3N2型、JCポリオーマウイルス（JC polyomavirus）、Marburg、MS2、IPCV(Indian peanut clump virus)、NDV(ニューカッスル病ウイルス)、No(ノロウイルス)、Nv(ノーウォークウイルス)、PhMV(Physalis mottle virus)、ポリオーマウイルス（Polyomavirus）、PPV(ブタパルボウイルス)、RHDV(ウサギ出血病ウイルス)、ロタウイルス、SARS、SIV(サル免疫不全ウイルス)、SV40(サルウイルス40)、SVDV(ブタ水疱病ウイルス)などが含まれる。(Expert Rev. Vaccines 9(10)、1149-1176、2010)。

Vaccine 30 (2012) 4301-4306 Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010

第一の局面において、本願は、フラビウイルス構造タンパク質のエンベロープ領域が、アミノ酸配列に少なくとも1つの改変を含む、1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。

第二の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子に含有されるフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、それからなる核酸分子を提供する。

第三の局面において、本願は、第一の局面で提供するウイルス様粒子および／または第二の局面で提供する核酸分子を含む、組成物またはワクチンを提供する。

第四の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子および／または本願の第二の局面で提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、抗体または中和抗体を含む抗血清の産生方法を提供する。

第五の局面において、本願は、本願の第三の局面で提供する組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてフラビウイルス感染を処置もしくは予防する方法、または、フラビウイルスに対する免疫応答を誘発および／または増強する方法を提供する。

第六の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子を作製する方法であって：該ウイルス様粒子に含有される少なくとも1つのフラビウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子導入した細胞を培養すること；および細胞培養液からウイルス様粒子を回収することを含む方法を提供する。この局面は、さらに、該ウイルス様粒子に含有される少なくとも1つのフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子を作製するステップを含んでよい。

第七の局面において、本願は、哺乳動物におけるフラビウイルス感染を診断する方法またはキットで用いるための、ウイルス様粒子を提供する。

デングウイルスゲノムの構成およびデングVLPコンストラクトの一例を示す。ウエスタンブロッティングにより測定した、上清中のエンベロープタンパク質を示す。2型デングウイルスprMおよびエンベロープタンパク質を含むウイルス構造タンパク質、または、2型デングウイルスprM、並びに2型デングウイルスエンベロープタンパク質のC末端領域が、相当する1型デングウイルスC末端領域（配列番号8の199aa-676aa）で置換されている、2型デングおよび1型デングのキメラを含むウイルス構造タンパク質、または、1つのアミノ酸改変(F108A、配列番号10の289aa)が導入されているキメラエンベロープ領域を含有するウイルス構造タンパク質の発現ベクターと、1型デングウイルスカプシドタンパク質の発現ベクターとを、293F細胞に遺伝子導入した。デングエンベロープタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを、培養上清に対して行った。ウエスタンブロッティングの結果を示す。1型デングウイルスprMおよび改変を有するか、または有さないエンベロープを含むウイルス構造タンパク質(野生型、F108A、K203N、K246M、F108A+K246MまたはF108A+K203N)の発現ベクターを、1型デングカプシドタンパク質の発現ベクターと共に、293F細胞に遺伝子導入した。デングエンベロープタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを、培養上清に対して行った。ウエスタンブロッティングの結果を示す。1型デングウイルスprMおよび改変を有するか、または有さないエンベロープを含むウイルス構造タンパク質(野生型、F108A、K203NまたはF108A+K203N)の発現ベクターを、293F細胞に遺伝子導入した。デングエンベロープタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを、培養上清に対して行った。ネガティブ染色したVLP(F108A+K203N)の電子顕微鏡（EM）による可視化を示す。

(1)1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子
第一の局面において、本願は、天然起源の構造からエンベロープ領域の少なくとも1つのアミノ酸が改変された、1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。

フラビウイルスは、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎、およびC型肝炎ウイルス(HCV)であってよい。好ましいフラビウイルスはデングウイルスである。デングウイルスは、亜型I〜IVを含むデングウイルス1、亜型Asian I、Asian II、Cosmopolitan、AmericanおよびAmerican/Asianを含むデングウイルス2、亜型I〜IVを含むデングウイルス3、および亜型I〜IIIを含むデングウイルス4であってよい。明細書および特許請求の範囲において、「フラビウイルス構造タンパク質またはその断片」という語は、対象の免疫システムにより認識され得る、および／または、対象の細胞性免疫応答を刺激する、および／または、対象の抗体産生を刺激する、フラビウイルス由来の任意のペプチドベースの配列を指す。

図1で示したように、デングウイルス構造タンパク質は、カプシドタンパク質、膜タンパク質前駆体、およびエンベロープタンパク質からなる。この態様において、VLPは、これらの構造タンパク質の少なくとも1つを含み、好ましくは、膜タンパク質前駆体(prM)、およびエンベロープタンパク質を含む。デングウイルス構造タンパク質はさらに、開始コドンに相当するアミノ酸およびprM配列のアミノ末端に対するシグナル配列を含んでよい。

少なくとも1つのアミノ酸改変を含む領域は、好ましくはアミノ酸位置182およびアミノ酸位置676の間、より好ましくはアミノ酸位置271およびアミノ酸位置302の間、特にアミノ酸位置280およびアミノ酸位置291の間、とりわけ開始コドンMおよび配列番号17のシグナルペプチドを含み、続いてデングウイルス1 (WestPac strain, GenBank Accsession No: U88535)のprMおよびエンベロープ領域を含む、配列番号21のタンパク質の289であってよく、あるいは、フラビウイルスまたはその断片の、開始コドンM、prMに続くシグナルペプチド、およびエンベロープ領域を含むタンパク質のアミノ酸配列が配列番号21で表されるアミノ酸配列とアラインメントされた場合には、上記で同定した位置で規定された位置の間であってよい。

1型デングウイルスアミノ酸配列のエンベロープ領域は、配列番号20により表される。従って、少なくとも1つのアミノ酸改変を含む領域は、この配列にあってよく、好ましくは配列番号20のタンパク質のアミノ酸位置90およびアミノ酸位置121の間、特にアミノ酸位置99およびアミノ酸位置110の間、具体的には108にあってよく、あるいは、フラビウイルスまたはその断片のエンベロープのアミノ酸配列が配列番号20とアラインメントされた場合には、上記で同定した位置で規定された位置の間であってよい。

本明細書で用いる場合、開示された配列、例えば配列表に記載された配列のヌクレオチドまたはアミノ酸位置に「相当する位置」または、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、開示された配列のヌクレオチドまたはアミノ酸位置に「相当する」という記述は、標準的なアラインメントアルゴリズムを用いて同一性を最大化させるように、開示された配列とのアラインメントで同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列のアラインメントにより、当業者は相当する残基を同定し得る。

1〜4型デングウイルスなどの様々なフラビウイルスのウイルス構造タンパク質が同定され、GenBankデータベースなどの様々な公共データベースで利用可能である。例えば、1型デングウイルス(WestPac株):アクセッション番号 U88535、2型デングウイルス(S1 ワクチン株): アクセッション番号M19197、3型デングウイルス(株Singapore 8120/95): アクセッション番号 AY766104および4型デングウイルス(株ThD4_0476_97): アクセッション番号 Y618988である。本願に従い、デングウイルスなどのフラビウイルスのエンベロープタンパク質は、データベースから取得され、配列番号20のアミノ酸位置90およびアミノ酸位置121に相当する位置の間の位置、例えば配列番号20のアミノ位置108に相当する位置を同定するために、配列番号20とアラインメントされてよい。

エンベロープ領域に少なくとも1つのアミノ酸改変を含むことを除いて、ウイルス様粒子に含有されるフラビウイルス構造タンパク質は、天然起源のウイルス構造タンパク質またはその修飾タンパク質であってよい。態様の一において、該修飾タンパク質は、prMおよびエンベロープタンパク質を含む天然起源のウイルス構造タンパク質に、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、該修飾タンパク質は、prMおよびエンベロープタンパク質を含む天然起源のウイルス構造タンパク質に対し、最大で10％のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加された変異体であってよい。配列同一性は、慣用される方法により決定されてよい。

本願に従い、上述の1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質またはそのフラグメントは、粒子状の構造に自発的に集合する限り、用いられてよい。例えば、デングウイルスのprMおよびエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を発現する真核細胞を培養する場合、該タンパク質は該細胞により産生され、集合してVLPを形成し、該VLPは細胞培養上清から回収され得る。

本願は、VLP、VLPをコードするベクター、抗原に特異的に結合する抗体（並びにアプタマーおよびペプチドを含む抗体様分子）を、フラビウイルス感染の予防または処置における（単独での、または組み合わせでの）それらの使用とともに提供することにより、1つ以上の上述の必要性に対処するものである。

本明細書中で用いる、「抗体」という語は、エピトープまたは抗原決定基に結合できる分子を指す。該語は、抗体全体およびその抗原結合断片、例えば一本鎖抗体に及ぶ。該抗体は、ヒト抗原結合性抗体断片を含み、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、およびVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片が挙げられるが、これらに限定するものではない。該抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物由来であってよい。好ましくは、該抗体は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ等、または他の適当な動物、例えばニワトリ由来であってよい。本明細書中で、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または例えば米国特許第5,939,598号明細書（本開示は、全体が参照により本明細書中に包含される）に記載されているように、1つ以上の免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内在性の免疫グロブリンを発現しない動物由来の抗体を含む。

フラビウイルス構造タンパク質は、天然起源のタンパク質、または天然起源のタンパク質の修飾タンパク質、または天然起源のタンパク質の断片、または修飾ペプチドであってよい。該修飾タンパク質は、天然起源のウイルス構造タンパク質の断片であってよい。

態様の一において、フラビウイルス構造タンパク質由来の修飾タンパク質は、天然起源のタンパク質と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、フラビウイルス由来の修飾タンパク質は、フラビウイルス由来の天然起源のウイルス構造タンパク質に基づき、最大で10％のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加された変異体である。

態様の一において、本願は、配列番号2、4、8、10、14および16のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。

これらの配列はそれぞれ、以下の領域を含有するタンパク質を表す：開始コドン: M(1aa)、シグナル配列(2-15aa)、pr配列(16-106aa)、M配列(107-181aa)、およびエンベロープ領域(182-676aa)。態様の一において、配列番号2、4、8、10、14および16のprM領域およびエンベロープ領域を有するウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子、すなわち、これらのタンパク質の位置16から位置676のアミノ酸配列を含むウイルス様粒子が提供されてよい。

該修飾フラビウイルス構造タンパク質は、配列番号2、4、8、10、14および16のいずれかで表されるアミノ酸配列、または、これらの配列のうちの1つの位置16から位置676のアミノ酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有してよい。また、該修飾フラビウイルス構造タンパク質は、配列番号2、4、8、10、14および16のいずれかで表されるアミノ酸配列、または、これらの配列のいずれか1つの位置16から位置676のアミノ酸配列を有するフラビウイルス構造タンパク質に基づき、最大で10％のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加された変異体であってよい。

(2)ヌクレオチドおよびベクター
第二の局面において、本願は、本発明の第一の局面で提供するウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、それからなる核酸分子を提供する。

態様の一において、本願は、上述のウイルス様粒子を提供するフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

態様の一において、本願は、上述の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子に操作可能に結合している発現制御配列を含んでよい、発現ベクターを提供する。

発現制御配列の例としては、プロモーター、例えばCMVプロモーター、ファージラムダPLプロモーター、大腸菌のlac、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスのLTRのプロモーターが挙げられるが、これらに限定するものではない。

態様の一において、本願は、配列番号1、3、7、9、13および15のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、フラビウイルス構造タンパク質の発現ベクターを提供する。

態様の一において、本願は、配列番号1、3、7、9、13および15のいずれかで表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子から修飾された核酸分子を提供する。該修飾された核酸分子は、配列番号1、3、7、9、13および15のいずれかで表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のヌクレオチド配列同一性を有してよい。また、該修飾された核酸分子は、配列番号1、3、7、9、13および15のいずれかで表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に基づき、最大で10％のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加された変異体であってよい。

(3)組成物またはワクチン
第三の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を含む、組成物またはワクチンを提供する。

態様の一において、本願は、上述のフラビウイルスウイルス様粒子または上述の核酸分子を含む組成物を提供する。

該組成物は、さらに、薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントの例としては、Ribi solution（Sigma Adjuvant system、Sigma-Aldrich）が挙げられるが、これに限定するものではない。

本願の医薬組成物は、本発明の目的に反しない限り、単一の有効成分または2つ以上の有効成分の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、ケモカインを含むサイトカイン、サイトカインの抗体、例えば抗TNF抗体(例えばインフリキシマブ、アダリムマブ)、抗VEGF抗体(例えばベバシズマブおよびラニビズマブ)、サイトカイン受容体拮抗薬、例えば抗HER2抗体(例えばトラスツズマブ)、抗EGF受容体抗体(例えばセツキシマブ)、抗VEGFアプタマー(例えばペガプタニブ)および免疫調節剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス、ウベニメクスを組み合わせ治療に用いてよい。

複数の有効成分の組み合わせにおいて、それぞれの成分の含量は、その治療効果および安全性によって適宜増減してよい。

本明細書中で、「組み合わせ」という語は、2つ以上の有効成分を単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与するか、またはこれらの有効成分を別々の実体で同時にまたは時間に特定の制限なく連続的に患者に投与することを指し、ここで、該投与は、体内において、好ましくは同時に、かかる2つの成分の治療上有効なレベルをもたらす。

態様の一において、該組成物はDNAワクチンを含むワクチン組成物である。態様の一において、本発明の提供するDNAワクチンは、オリゴヌクレオチドを含有するCpGを含む。

(4)抗体の産生方法
第四の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、フラビウイルスに対する抗体およびフラビウイルスに対する中和抗体を含有する抗血清の産生方法を提供する。

この局面で産生する抗体は、哺乳動物に同抗体を投与することによる、哺乳動物内でのフラビウイルス原因病原体に対する受動免疫に用いられてよく、その結果、哺乳動物をフラビウイルス感染から予防するか、あるいは、哺乳動物においてフラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置してよい。

本願の第四の局面で産生する抗体は、慣用される技術を用いてヒト化されてよい。従って、態様の一において、本発明の第四の局面で提供する方法はさらに、非ヒト哺乳動物産生抗体をヒト化するステップを含む。この局面で提供する抗体またはヒト化抗体は、フラビウイルス感染からヒト対象を予防するため、あるいは、該対象においてフラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置するために用いられてよい。

この局面に従い産生した抗体は、該患者由来の免疫細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞のサブポピュレーションを試験管内で選択した後、該患者に再び投与するのに用いてもよい。

抗血清は、慣用される方法により獲得し得る。血液サンプルを、免疫化された非ヒト動物から取得し、該血液を処理して抗血清、すなわち、血液の抗体含有液体成分を獲得する。非ヒト哺乳動物は、好ましくは、ラット、マウス、ハムスター、ブタ、ウサギ、ウマ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラマ、および非ヒト霊長類（例えばチンパンジー）からなる群から選択される。

(5)対象においてフラビウイルス感染により引き起こされる疾患を処置するか、あるいは、フラビウイルス感染から対象を予防する方法。
第五の局面において、第一の局面で提供するウイルス様粒子、第二の局面で提供するヌクレオチド分子、または第三の局面で提供する組成物が投与される対象において、デング熱などのフラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置する方法が提供される。先に挙げたVLP、ヌクレオチド分子、または組成物を対象に投与することにより、フラビウイルスに対する免疫応答が増強され得、従って、フラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状は効果的に処置され得る。本局面において、該VLP、ヌクレオチド分子、または組成物は、患者に対し、罹患臓器に局所的に、あるいは、全身的に投与されてよい。

フラビウイルス感染またはフラビウイルス感染により引き起こされる疾患から対象を予防する方法は、第一の局面のウイルス様粒子、第二の局面で提供するヌクレオチド分子、または、第三の局面の組成物を、該対象に投与することを含む。

本願に従い、該ウイルス様粒子はまた、免疫療法にも適用可能である。該VLPは、患者由来の細胞またはヒト細胞株に生体外適用して、次いで該細胞を該患者に投与してもよい。

(6)ウイルス様粒子の作製方法
第六の局面において、本願は、本発明の第一の局面で提供するウイルス様粒子を作製する方法であって：ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞を培養すること；および細胞培養液からウイルス様粒子を回収することを含む方法を提供する。

様々な宿主−ベクター系が、該ウイルス様粒子の発現に用いられ得る。真核細胞は、本願の第四の局面が提供する方法に用いられ得る。真核細胞の例としては、昆虫細胞(例えばsf9細胞、H5細胞)、酵母細胞(例えば出芽酵母（S. cerevisiae）)および哺乳動物細胞(例えばCHO細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293F細胞)が挙げられるが、これらに限定するものではない。本願の第二の局面が提供する方法に用いられるベクターには、発現されるウイルス様粒子をコードする核酸分子が含まれる。細胞は、慣用される方法（例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション）を用いて、該ベクターにより遺伝子導入されてよい。当業者は、用いる細胞に応じて、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬および酪酸ナトリウムなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害薬を含む培地を選択し得る。遺伝子導入後、ウイルス様粒子が、細胞中および／または培養上清中に産生され得る。ウイルス様粒子は、培養上清から回収され、超遠心分離法を用いて精製されてよい。

本願のウイルス様粒子は複製せず、それゆえに、非常に安全なプロファイルを有する。

(7)フラビウイルス感染を診断するキットまたは方法
第七の局面において、本願は、哺乳動物におけるフラビウイルス感染を診断する方法またはキットで用いるための、ウイルス様粒子を提供する。該ウイルス様粒子を用いることにより、フラビウイルスに特異的な抗体を検出可能な酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)診断キットが作製され得る。

本願は、次の実施例を参照して詳細に記載されるが、本発明の範囲を限定することを意図してはいない。

［実施例１］
1〜2型デングウイルスのタンパク質または断片を含む、ウイルス様粒子の作製
1型および2型デングウイルス構造タンパク質を、野生型ウイルス構造タンパク質として用いた。ウイルス構造タンパク質のエンベロープ領域に、少なくとも1つの改変を導入した。つまり、1型デングウイルスエンベロープタンパク質(配列番号20)の位置108のアミノ酸PheをAlaに改変し(F108A)、1型デングウイルスエンベロープタンパク質の位置203のアミノ酸LysをAsnに改変し(K203N)（エンベロープ領域：配列番号4の172-676aa）、位置246のアミノ酸AsnをMetに改変した(K246M)。本実施例において、エンベロープ領域は配列番号2の172-676aaに相当し、配列番号20の位置108は配列番号2の位置289に相当し、配列番号20の位置203は配列番号2の位置384に相当し、配列番号20の位置246は配列番号2の位置427に相当する。本実施例において、エンベロープ領域の変異は、エンベロープ領域から始まる数字を用いて表現される。

該ウイルス構造タンパク質を哺乳動物細胞で発現するために、各20μgのDENV2 prM E 発現ベクターおよびDENV2カプシド発現ベクターを混合し、293F細胞に遺伝子導入した。より高産生をもたらすために、カプシドベクターをR85AおよびK86Aに変異させた（配列番号11および12）。DENV2 prM Eをより多く発現するために、C末端DENV2 エンベロープ領域(199aa-676aa)を、相当するDENV1 エンベロープ領域に置換して、キメラタンパク質を形成した（配列番号7および8）。VLPを安定化させるために、エンベロープ融合ペプチド領域を変異させた(F108A)（配列番号9および10）。

遺伝子導入の4日後に、遺伝子導入細胞培養液の上清を回収し、1次抗体としてエンベロープタンパク質に特異的に結合するデングウイルス(9.F.10) モノクローナル抗体(sc-70959, Santa Cruz Biotechnology)を用い、2次抗体としてウサギ抗マウスIgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotechnology)を用いて、Env発現をウエスタンブロッティングにより調べた。結果を図2に示す。

図2から示されるように、DENV2 prMならびに1つの改変(F108A)を有する2型および1型デングウイルスエンベロープタンパク質のキメラにより遺伝子導入した細胞は、より高いタンパク質量を産生した。上清中のこれらのタンパク質は、自発的に集合して粒子を形成した。

該VLPを発現するために、各20μgのDENV1 prM E 発現ベクターおよびDENV1カプシド発現ベクターを混合し、293F細胞に遺伝子導入した。より高産生をもたらすために、カプシドベクターをK85AおよびK86Aに変異させた（配列番号5および6）。該VLPを安定化させるために、エンベロープ融合ペプチド領域(F108A)(配列番号1および2)、または、塩基性アミノ酸(K203N)(配列番号3および4)もしくは(K246M)を変異させた。さらに、2つのアミノ酸(F108A+K246M、配列番号:13および14)並びに(F108A+K203N、配列番号15および16)もまた変異させた。遺伝子導入の4日後に、遺伝子導入細胞の上清を回収し、1次抗体としてデングウイルス(9.F.10)モノクローナル抗体(sc-70959, Santa Cruz Biotechnology)を用い、2次抗体としてウサギ抗マウスIgG-HRP(sc-358920, Santa Cruz Biotechnology)を用いて、Env発現をウエスタンブロッティングにより調べた。結果を図3に示す。

図3が示すように、DENV prMおよび少なくとも1つの改変を有するエンベロープタンパク質により遺伝子導入した細胞は、より高いタンパク質量を産生した。上清中のこれらのタンパク質は、自発的に集合して粒子を形成した。

［実施例２］
デングウイルス構造タンパク質prMおよびエンベロープを含むウイルス様粒子の調製。
実施例1で用いた、prMおよび修飾エンベロープタンパク質F108A、K203N、またはK203N+F108A(それぞれ配列番号1、3、15)を含有するデングウイルス構造タンパク質の発現ベクターを用いた。実施例1と同じ方法で、20μgのベクターを293F細胞に遺伝子導入して培養した。遺伝子導入細胞の上清を、遺伝子導入の4日後に回収した。ウエスタンブロットを行い、一次抗体としてモノクローナル抗体(9.F. 10, Santa Cruz Biotech)を用い、二次抗体としてウサギ抗マウスIgG-HRP結合抗体を用いて、DENV VLPを検出した。結果は図4に示す。図4が示すように、DENV1-prMおよび少なくとも1つの改変を有するエンベロープタンパク質により遺伝子導入した細胞は、より高いエンベロープタンパク質量を産生した。

該上清を0.45μmフィルターを用いて濾過し、ウイルス様粒子を得た。該ウイルス様粒子は、TFFカラムを用いて濃縮し、QXLカラム（GE Healthcare）を用いて精製し、精製ウイルス様粒子を得た。精製したVLPを、4％ホルムアルデヒドのPBS溶液に保管（filed）した。ネガティブ染色したVLPの電子顕微鏡（EM）による可視化を行った。簡単に言うと、1.0μlのサンプルを炭素被覆したFormvar膜の銅グリッド上に置き、VLPが付着できるようにした。その後、2μlの1% PTA溶液を該グリッドに添加し、該グリッドを電子顕微鏡により調べた。結果を図5に示す。上清中に、ウイルス様粒子が観察された。

［実施例３］
デングウイルスに対する抗体
実施例2で得られた精製VLP(K203N+F108A)をDEN1 VLPと名付け、本実施例で用いた。精製ウイルス様粒子を、さらに、スピンカラム(分子量カットオフ:100kDa)を用いて濃縮し、免疫化のためのウイルス様粒子を作製した。その後、4匹のマウスを、0週目および4週目に、アルミニウムアジュバント(アルハイドロゲル2%, Sergeant Aduvants)を含有するPBS中の30μgのDEN1 VLPを用いて、筋肉内注射により2回免疫化した。

免疫化したマウス由来の血清の、デングウイルス特異的IgGの力価を、ELISAシステムにより決定した。DENV-1、DENV-2、DENV-3、およびDENV-4ウイルスのそれぞれに対する中和抗体について、血清をアッセイした。
以下のデング血清型1〜4を用いた：
DENV-1、Philippine-99St12A株
DENV-2、Philippine-00St22A株
DENV-3、Philippine-SLMC50株
DENV-4、Philippine-SLMC318株
JEV-JaOAr S-982株

免疫化したマウスの血清中の抗DENV中和抗体を、前述の1.25 x 10⁸ FFUのベロ適用DV（Vero-adapted DV）1〜4型を用いたベロ細胞に対するフォーカス低減中和試験（focus reduction neutralization test (FRNT)）により検出した。エンドポイント力価を、FFUの数を少なくとも50％減らす、試験した最高血清希釈度として計算した(FRNT₅₀)。96ウェルプレートの、100％コンフルエンスのベロ細胞を用いた。

一次抗体として、自家の（In house）抗デングウサギIgGを用い、二次抗体として抗ウサギIgG-HRPO結合体(102-PD)を用いた。結果を、以下の表に要約した。

表1に示したように、DENV1 VLPは、1、2、3および4型デングウイルスに対し、優れた中和作用を示した。デング弱毒生ワクチンにより得られた中和抗体のFRNT 50の値は約1000であるという事実(Tsai et al., Journal of Virology, 2015 89: 7348-7362.)を考慮すると、DENV1 VLPの免疫原性は非常強く、弱毒生ワクチンよりも、デングウイルスに対する約10倍高い中和抗体が提供された。

［実施例４］
デングウイルス様粒子を含む医薬組成物の作製
実施例1に従い、デングウイルス様粒子を作製した。ワクチン組成物である医薬組成物を調製するために、作製した80μgの各粒子を、1mlのリン酸スクロース溶液、pH7.2、エンドトキシン不含有（Teknova, SP buffer）と混合した。

［実施例５]
デングウイルス2〜4型由来ウイルス様粒子の作製
エンベロープ領域のアミノ酸位置108（配列番号22−24の289aaに相当）がFからAに置換され、エンベロープタンパク質のC末端領域(478-676aaまたは476-674aa)が1型デングウイルスエンベロープタンパク質に相当する配列(配列番号22の478-676aa)で置換されている、2〜4型デングウイルスのprMおよびエンベロープタンパク質の発現ベクターを作製する。該ベクターにより発現されたタンパク質は、配列番号22−24で表されるタンパク質である。ウイルス様粒子は、実施例1と同じ方法で得られる。

Claims

配列番号２、４、８、１０、１４、１６、２３および２４のいずれかで表されるアミノ酸配列の、アミノ酸位置１６からＣ末端までのアミノ酸配列を含むタンパク質であるフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、４、８、１０、１４または１６のアミノ酸配列の、アミノ酸位置１６からＣ末端までのアミノ酸配列を含む、請求項１記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、１０、１４、１６、２３または２４のアミノ酸配列の、アミノ酸位置１６からＣ末端までのアミノ酸配列を含む、請求項１記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、１０、１４、または１６のアミノ酸配列の、アミノ酸位置１６からＣ末端までのアミノ酸配列を含む、請求項３記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、４、８、１０、１４、１６、２３および２４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、４、８、１０、１４および１６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項５記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、４、８、１０、１４、１６、２３および２４のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載のウイルス様粒子。
該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号２、４、８、１０、１４、および１６のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項７記載のウイルス様粒子。
請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子に含有されるフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
配列番号１、３、７、９、１３および１５のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
請求項９または１０に記載の核酸分子を含むベクターであって、該核酸分子に操作可能に結合している発現制御配列を含んでよい、ベクター。
（ａ）請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子、および／または請求項９−１１のいずれか記載の核酸分子；および
（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物。
請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子を含む、ワクチン組成物。
請求項９−１１のいずれか記載の核酸分子を含む、ＤＮＡワクチン組成物。
請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子および／または請求項９−１１のいずれか記載の核酸分子を、非ヒト哺乳動物に接触させることを含む、抗体の産生方法。
フラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置または予防するための、請求項１２−１４のいずれかに記載の組成物。
請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子に含有される少なくとも１つのフラビウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を用いて遺伝子導入した細胞を培養すること；および細胞培養液からウイルス様粒子を回収することを含む、請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子を作製する方法。
請求項１−８のいずれか記載のウイルス様粒子を含む、哺乳動物におけるフラビウイルス感染の診断のためのキット。