JP6942466B2 - 抗原特異的ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本願は免疫細胞療法に関する。本願は特に、所望の抗原特異性を示すT細胞受容体遺伝子を多能性幹細胞へ導入することによって免疫細胞療法に用い得る細胞を誘導する方法に関する。

個々のT細胞は異なる特異性のT細胞受容体（TCR）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のT細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の特異性を示すT細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、in vitroで何代も継代培養するうちに、がん細胞を殺す活性が低下するという問題もあった。

T細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、TCR刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したT細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。

今まで提案されているT細胞移植による免疫細胞療法について簡単に説明する。
Ａ． 初期化技術を用いたクローニング法
自家移植を目的としたT細胞のクローニングの問題を解決する技術が提案されている。初期化の技術を用いて特異的TCR遺伝子の構造を有する幹細胞としてクローニングする方法である。具体的には核移植、iPS細胞化などによりT細胞から多能性幹細胞を作製する方法であり、特許出願もされている（WO2008/038579、WO2011/096482）。また、かかる方法についての論文は2010年、2013年に発表されている。
1) Watarai H, A Rybouchkin, N Hongo, Y Nagata, S Sakata, E Sekine, N Dashtsoodol, T Tashiro, S-I Fujii, K Shimizu, K Mori, K. Masuda, H Kawamoto, H Koseki, and M Taniguchi. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Vα14-Jα18 TCRα gene. Blood115:230-237, 2010.
2) Vizcardo R, Masuda K, Yamada D, Ikawa T, Shimizu K, Fujii S-I, Koseki H, Kawamoto H. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPS cells derived from mature CD8+ T cells. Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013.
3) Nishimura T et al., Cell Stem Cell.12: 114-126. 2013.

かかる方法は、患者本人のT細胞からＥＳ細胞あるいはiPS細胞を作製して増幅し、T細胞を再生して患者に戻す自家移植を前提としている。しかし、かかる方法には少なくとも以下の３つの問題がある。Ａ１）iPS細胞を患者ごとに作製する必要があり、事前に準備しておくことができない、Ａ２）iPS細胞を個別作製するため、その効果や安全性およびiPS細胞の質という点で作製の都度ばらつきが生じる、Ａ３）T-iPS細胞から誘導されたT細胞ががん化する可能性がある。

Ｂ． TCR遺伝子導入T細胞療法
抗原特異的T細胞受容体（TCR）遺伝子を単離し、その遺伝子を患者の正常T細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体に戻す(自家移植)という遺伝子治療の臨床試験が各地で行われている（Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006）。この方法では患者の正常T細胞がもともと発現しているTCRを例えばsiRNAなどで発現を抑制し（Okamoto S et al, Cancer Res 69:9003, 2009）、特定のTCRのみが発現したT細胞を自家移植する。例えば、WT1抗原特異的T細胞受容体（TCR）遺伝子が単離されていて、ＷＴ１を発現するがんに対する遺伝子治療が行われている。

Ｂの方法においても、治療に使うT細胞は患者本人のT細胞からを作製することを前提としている。Ｂの方法には下記の３つの問題があるＢ１）遺伝子治療なので、患者T細胞ががん化する可能性がある。Ｂ２）移植するT細胞の内因性TCRの抑制は完全ではなく、想定外の反応性が出現する危険性がある。Ｂ３）患者ごとの処置になるので事前準備ができない。

Ｃ． ドナーリンパ球輸注療法
白血病などの血液系の腫瘍に対して行われる骨髄移植は、免疫細胞療法としての側面をもつ。すなわち、移植されたドナーの骨髄細胞の中に含まれるT細胞がレシピエントの白血病細胞を攻撃することが期待されている。効果を高めるためにドナーのT細胞だけを後に追加して投与する、ドナーリンパ球輸注法も知られている。また近年、所望の抗原に対するクローンとして増幅させたT細胞を輸注するという方法が報告された（Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013）。

治療に使うT細胞は他人であるドナー由来の細胞とはいえ、骨髄移植を受けた後のレシピエントの造血系はドナーと同じになっており、効果を高めるためのドナーT細胞の追加投与部分については本質的には自家移植の一種とみなされる。本方法は、事前の骨髄移植を必須とするものであり、患者は生涯にわたり免疫抑制剤の投与を受けなければならない。

Ｄ． 臍帯血中のリンパ球の他人への利用
臍帯血移植後に免疫力が低下した患者にウイルス感染症が発症することがある。そのようなケースを対象に移植に用いたドナー臍帯血ではなく他の臍帯血中のウイルス特異的ＣＴＬを輸注するという方法が提案されている（Blood, 116: 5045, 2010）。類似の発想で、HLAがある程度一致しているが完全には一致しないようなCTLを移植するというアイデアの特許出願が出されている(WO2011/021503）。しかしながら、臍帯血は多数のT細胞クローン、すなわち多種類のTCRを有する細胞の集団であり、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こす危険性を回避できない。

上記のように、T細胞を用いる免疫細胞療法は種々提案されているが、Ｄを除いていずれも自家移植、または自家移植とみなされるような条件下でのT細胞の移植である。T細胞の他家移植は免疫細胞療法の常識に反するものである。例えば血液系の悪性腫瘍（白血病など）では、造血幹細胞を移植する骨髄移植が行われるが、ドナーの骨髄がレシピエントによって拒絶されないように、通常はレシピエントと一致したHLA型のドナーから移植される。しかしながら他人間においては、HLA以外の多くのタンパク分子においてアミノ酸配列が不一致であり、ドナーT細胞はこれらの不一致を攻撃対象と認識し得る。その結果、移植したドナーT細胞の一部がレシピエントの体の細胞を攻撃する反応であるいわゆる移植片対宿主反応が生じ、レシピエントを死に至らしめ得ることが報告されている（Ito et al Lancet, 331: 413, 1988）。

頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するひとをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中である（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）。しかしながら、上記の通りT細胞移植においては、HLA型が完全に一致していたとしても移植片対宿主反応の恐れがあり、HLAが一致していない場合、この移植片対宿主反応がさらに強く起こることからiPSストック事業はT細胞を用いた免疫細胞療法に適用することはできないと考えられている。

WO2008/038579 WO2011/096482 WO2011/021503

Watarai et al., Blood 115:230-237, 2010. Vizcardo et al., Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013. Nishimura T et al., Cell Stem Cell.12: 114-226. 2013. Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006 Okamoto S et al, Cancer Res 69:9003, 2009 Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013 Blood, 116: 5045, 2010 Ito et al Lancet, 331: 413, 1988 CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012) Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006） Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011) Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006 Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 Blood 111:1318（2008） Nature Immunology 11: 585（2010） 上記先行技術文献は引用により本願明細書の一部を構成する。

本願は、より効率的で有効かつ安全な免疫療法を提供することを目的とする。

本願は所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは成熟T細胞を誘導し、当該Ｔ前駆細胞あるいは成熟T細胞を多能性幹細胞が由来するドナーと一定以上HLA型が共通する患者に他家移植することを含む免疫細胞療法を提供する。

本願の方法において、所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞は、多能性幹細胞へ所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子を導入することによって得ることができる。

本願の方法によって得られる免疫細胞療法に用いられるT細胞は、単一の抗原特異性を有するT細胞であることから移植片対宿主反応を起こす心配がなく、自家移植のみならず他家移植に用いることができる。本願の方法はT細胞の他家移植は禁忌であるとの常識から全く予測できない方法である。

本願により、従来の技術認識における問題を予想外にも解決することができ、下記のごとき効果が得られる：
１）移植用T細胞を患者ごとに作製する必要がなく事前準備ができる、
２）事前に移植細胞の安全性および品質を確認した上での処理をすることができる、
３）たとえHLAが一致していたとしてもマイナー抗原は一致しない他家移植であり、一定の期間の後には患者の免疫反応によって拒絶され、移入した細胞ががん化する恐れがない。

さらに、本願の移植用T細胞は所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子（TCR遺伝子）を多能性幹細胞に導入する工程を含む方法にて得られることから、下記の効果が得られる：
１）効果並びに安全性が保障されたTCRの遺伝子を導入することにより、得られる移植用T細胞の品質が保証される。
２）TCR遺伝子挿入箇所を同定し、安全なクローンを確定して用いることができ、移植細胞のがん化の問題を予め回避できる。
３）多能性幹細胞へTCR遺伝子挿入して得られる多能性幹細胞をT細胞へ分化させる場合、分化過程で導入TCRが先に発現することから細胞が元々もっている（以下内因性と表記）TCRが再構成されず、想定外の反応が出現することがほとんどない。

実施例１で使用したpTA2ベクター 実施例１で使用したレンチウイルスベクター 実施例１でTCR-iPS細胞から導入したWT1-TCRを有する成熟T細胞が誘導されたことを示す。 実施例２でHLA-A0201拘束性WT1特異的TCR遺伝子が導入されたiPS細胞が得られたことを示す。 実施例２でHLA-A0201拘束性WT1特異的TCR遺伝子が導入されたiPS細胞のクローニングできたことを示す。 実施例３でWT1特異的TCR遺伝子をiPS細胞に導入することが出来たことを示す。 実施例４でWT1特異的TCR遺伝子をiPS細胞に導入することが出来たことを示す。

本明細書ならびに請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。特定のHLAを有するヒト由来の細胞を用いて、治療法の細胞バンクを製造することを考慮すると、iPS細胞を用いるのが好ましい。以下TCRを導入したiPS細胞をTCR-iPS細胞という。

iPS細胞としては、いずれの部位の体細胞から誘導されたものであってもよい

体細胞からiPS細胞を誘導する方法は公知であり、体細胞にヤマナカ因子を導入してiPS細胞を得ることができる（Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）, Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)) 。iPS細胞を誘導する際に用いる因子はヤマナカ因子に限らず、当業者に公知のいずれの因子、手段を用いてもよい。

所望の抗原特異性を示すT細胞受容体遺伝子として、背景技術でＢとして記載したTCR遺伝子導入T細胞療法において既に臨床上使用され、安全性が確認されているものが複数存在する。例えば、ＷＴ１抗原に特異的なTCR遺伝子が知られている。TCR遺伝子としてはこれら公知の遺伝子を用いても良いし、今後解明されるTCR遺伝子を用いてもよい。またＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異性を有するＴ細胞をがん患者や感染症患者から単離または誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。本願においては、遺伝子導入箇所を同定し、安全なクローンを確定して用いることができることから、癌化の危険性を回避することができる。

本願の方法においては、iPS細胞にTCR遺伝子を導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。

上記のようにベクターを用いてTCR遺伝子を挿入する場合は、ゲノム上のTCR遺伝子と異なる部位に入ることになるが、他の様態において、「入れ替え」によりTCR遺伝子座に入れることもできる。ベクターを用いてTCR遺伝子を挿入する場合は、T細胞以外の体細胞に由来するiPS細胞の方が望ましいが、「入れ替え」の場合は、T細胞由来iPS細胞を用いる方が望ましい。例えばゲノム編集技術等を用いて、すでに再構成されたTCRα鎖とTCRβ鎖遺伝子をそれぞれ所望のTCRα鎖とTCRβ鎖遺伝子に入れ替えることができる。この方法を用いる利点は、１）導入TCRの発現の時期や発現レベルが、本来のTCRに近い状態にできるので質が高いT細胞を作製できる、２）ゲノムを傷つけないですむ、ということである。

iPS細胞にTCR遺伝子を導入して得られる、TCR-iPS細胞を、T前駆細胞または成熟T細胞へと分化誘導する。T細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 に記載の方法が挙げられる。

本明細書ならびに請求の範囲において「T前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択/負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。T細胞の分化についてはBlood 111:1318（2008）, Nature Immunology 11: 585（2010）に説明されている。

TCR-iPSから誘導されるT前駆細胞または成熟T細胞は、内因性のTCRが再構成されることなく、導入されたTCRが発現する。よって、免疫細胞療法において想定外の攻撃が生じることなく、安全な治療を行うことができる。

別な様態において、iPS細胞段階においてRag1遺伝子あるいはRag2遺伝子を欠失させることにより、内因性のTCRの再構成が完全に起こらない様にして、より安全性を高めることもできる。Rag1遺伝子とRag2遺伝子については、どちらか一方を欠失させるだけでよい。また、内因性のTCRの発現を抑制するSiRNAを同時に導入する方法も可能である。

本願の免疫細胞療法は、当該特定のTCRが特異的に結合する抗原を発現するがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫が関与する疾患の治療に用いることができる。本願の方法においては誘導されたT細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やPBSに懸濁して、多能性幹細胞の由来するドナーと一定以上HLAが合致する患者の治療に用いる。ドナーと患者とのHLA型は、完全に一致する場合、ドナーがHLAハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のHLAハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。

例えばＨＬＡハプロタイプホモのドナー由来のｉＰＳ細胞群が、ドナーのＨＬＡ情報にひも付けて保存されているｉＰＳ細胞バンクから、治療対象者のＨＬＡの少なくとも一方が同一である細胞を選択して用いることができる。

投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。

T細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対照とした免疫細胞療法への応用が可能である。例えば、ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現しており、ｉＰＳ細胞にＷＴ１抗原特異的なＴＣＲを導入してＴＣＲ−ｉＰＳを作成し、かかるＴＣＲ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＷＴ１遺伝子を発現するこれら種々の癌の免疫細胞療法への応用が可能である。

今まで提案されている種々のiPS細胞から分化誘導させたT細胞以外の細胞や組織を移植する治療法では、当該細胞が一生涯生着し続けることが期待されている。従って、他家移植を前提とするiPS細胞ストック事業においてiPS細胞から分化誘導される細胞を移植する際には、患者は免疫抑制剤を飲み続ける必要がある。この点は、自家iPS細胞と比して不利な点である。しかるに、本願におけるTCR-iPS由来T細胞の場合、一定期間後に拒絶される。すなわちHLAが一致する場合であっても、マイナー組織適合抗原が一致しないのでいずれは拒絶される。この点で、iPS細胞を用いた他家移植とは全く異なり予想外の優れた効果が示される。

さらに、本願の方法では、患者毎の処置が不要であり、予め所望のTCRを導入したiPS細胞もしくは当該iPS細胞からT前駆細胞または成熟T細胞を再生したものをストックしておけば良い。よって、治療までの時間が短縮できるだけでなく、移植する前に移植細胞の品質の確認ができるというメリットもある。

例えば本願によって、がん抗原をターゲットとするT細胞製剤が提供される。がんに対するTCR遺伝子治療ですでに安全性や有効性が確認されているTCRを例えばHLAハプロタイプホモiPS細胞に導入し、バンク化して保存しておく。HLAハプロタイプをヘテロで有する人がそのTCRの認識対象である抗原を発現するがんに罹った場合、バンク化したTCR-iPS細胞から作製したT細胞を、その患者に投与（他家移植）することができる。あらかじめT前駆細胞やT細胞にしておいて凍結保存しておけば、より迅速に投与できる。

本願で例示した以外に、例えば愛媛大学の安川正貴らによってTAK-1細胞からクローニングされたWT1抗原特異的TCR（Blood,95:286,2000; Blood,118:1495, 2011） を用いることができる。iPS細胞としては、京都大学iPS細胞研究所が進めているiPSストック事業で作製されたものを用いることができる。日本で最頻のHLAハプロタイプホモのiPS細胞としては、理研BRCに寄託されているHPS0077細胞を用いることもできる。

以下、本願発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

クラスI拘束性ＷＴ１抗原特異的ＴＣＲを導入したｉＰＳ細胞の作製
導入する対象の細胞としては京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて作製されたLMP2-T-iPS細胞（クローンLMP2＃１）を用いた。
導入したHLA-A2402拘束性を有するWT1 TCRは，大阪大学医学系研究科免疫造血制御学研究室（日本国大阪府吹田市）でクローニングされたB10を用いた（Anticancer Research 32(12); 5201-5209, 2012）. このＴＣＲはHLA-A2402拘束性にペプチドCMTWNQMNL(配列番号４)を認識する。

1) RACE（rapid amplification of cDNA ends）法によるWT1特異的TCRのクローニング
クローンとなるように増幅したWT1特異的CTLもしくはWT1-T-iPS細胞から誘導されたCTLからRNAを調整する。SMARTer RACE cDNA増幅キット（クロンテック社）を用いて完全長cDNAを得，これを鋳型とした。 TCRα鎖の3’側からのプライマー（CACAGGCTGTCTTACAATCTTGCAGATC（配列番号１））もしくはTCRβ鎖の3’側からのプライマー2種(CTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCA(配列番号２)またはTGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA(配列番号３))を用い，PCR反応によってWT1-TCRの二本鎖cDNAを得た。得られた二本鎖cDNAをpTA2ベクター（東洋紡社、図１）に組み込み，細胞株に導入することでWT1 TCRの特異性などの検定を行った。

2) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルスベクターの作製
独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 細胞運命情報解析技術開発サブチーム（日本国茨城県つくば市）より提供されたCS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクター(図２)を用い，GatewayシステムによりWT1-TCRを導入したCS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRを作製した。

3) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルス上清の作製
CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRをX-treamGENE9（ロシュ社）を用いてパッケージング細胞LentiX-293Tに導入した。翌日に培地交換を行い，2日目にレンチウィルスを含む培養上清を回収し，レンチウィルス上清として用いた。

4) WT1-TCR transduced-T-iPS細胞の樹立
LMP2-T-iPS細胞をTrypLE Select (ライフテクノロジーズ社)を用いて完全な単一細胞とする。遠心後，ペレットをレンチウィルス上清で懸濁し，32℃,3000rpmで1時間遠心し，LMP2-T-iPS細胞に感染させることでWT1-TCRをLMP2-T-iPS細胞に導入した。
感染後，iPS細胞用培地に懸濁し，フィーダー細胞上に播種した。WT1-TCRが導入されたLMP2-T-iPS（WT1-TCR/LMP2-T-iPS）細胞はベクターに含まれるVenusタンパク質の発現によって蛍光顕微鏡下で選択された。

C. WT1-TCR/LMP2-T-iPS細胞コロニーのピックアップ
1.2週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2. 200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3. 各クローンを個別に樹立した。

3) iPS細胞からT細胞への分化誘導
各培地の組成を下記に示す。

*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。

*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび 100μg/mLとした。

*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび0μg/mLとした。

A. OP9細胞の準備
0.1% ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ，37℃で30分以上静置する。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし，1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え，全量が20mlとなるようにした。

B. iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し，新しいmedium Aに交換する。またヒトiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し，新しいmedium Aを10ml加える。EZ-passageローラーでヒトiPS細胞を切る。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ，目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
ヒトiPS細胞1クローンあたり3枚以上のディッシュを用い，継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。

Day 1 (培地交換)
ヒトiPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し，培地を新しいmedium A 20mlに交換した。

Day 5 (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。

Day 9 (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。

Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上への移しかえる)
培地を吸引し，HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca) 溶液10mlを加え，37℃で45分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し，PBS(-)10mlで洗い流した。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え，37℃で20分培養した。培養後，細胞が膜状に剥がれてくるのでピペッティングにより物理的に細かくした(接着細胞同士を離すため)。ここに新しいmedium Aを20ml加え，さらに37℃で45分間培養する。培養後、浮遊細胞を含む上清を，100μmのメッシュを通して回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合，元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。

得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体，抗CD43抗体を用いてFACS解析した。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できると，造血前駆細胞が誘導されているとした。

C. 血球前駆細胞からのT細胞分化誘導
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において，CD34lowCD43+細胞分画の細胞のソーティングは行わない。この分画をソーティングした場合，得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから，ソーティングしなかった場合に比べてT細胞への分化誘導効率が落ちることがある。

培養期間中に分化段階を確認するためにFACS解析を行うが，全ての期間において培養中に死細胞が多くみられる。そのためFACS解析時にはPI (Propidium Iodide)，7-AADなどを用い，死細胞除去したうえで解析を行うことが望ましい。

Day 16 (細胞の継代)
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させる。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。

Day 23 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始める。
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収する。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。

Day 30 (細胞の継代):
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させる。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。

Day 37 (細胞の継代):
OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させる。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。

Day 44: （CD4+CD8+T細胞の確認、CD8 SP細胞の誘導開始)
T細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗CD4抗体，抗CD8抗体を用いてFACS解析した。CD4+CD8+T細胞の生成が確認された。
ここで抗CD3/28抗体をhuIL-2と供に加える．24穴プレートに新たにOP9/DLL1細胞を用意しておき，CD4+CD8+T細胞を含んだT細胞を3x105個/穴となるように播種した．ここに抗CD3抗体（50ng/ml），抗CD28抗体（2ng/ml）, huIL-2 (200U/ml)を添加した．

Day 50: （CD4-CD8+細胞が現れる）
抗CD3抗体による刺激後6日目には，成熟CD8SP細胞が生成した．生成した細胞をWT1-テトラマーと抗CD3抗体で染色した（図３）。導入したWT1-TCRを発現するT細胞が生成しているのが確認された。

HLA-A0201拘束性ＷＴ１抗原特異的ＴＣＲを導入したHLAハプロタイプホモｉＰＳ細胞の作製
導入する対象の細胞として京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて健常人末梢血単球より作製されたHLAハプロタイプホモ型iPS細胞を用いた。
このiPS細胞のHLA型はHLA-A*33:03; B*44:03; C*140:3; DRB1*1302
のホモ接合型である。
導入したHLA-A0201拘束性を有するWT1特異的TCR遺伝子は，大阪大学医学系研究科免疫造血制御学研究室（日本国大阪府吹田市）でクローニングされたOpt3E2を用いた.このTCRが認識するペプチド配列はRMFPNAPYL(配列番号５)である。

ベクターの作製法、iPS細胞への遺伝子導入方法は、実施例１に準じた。

１． 遺伝子導入後のiPS細胞を単個細胞懸濁液とし、フローサイトメトリーで解析した。効率よくHLA-A0201拘束性WT1特異的TCR遺伝子が導入されていることが確認された。(図４)
２． 遺伝子導入後のiPS細胞をディッシュに播種し、クローナルなコロニーとして培養した。図５は培養1週間後のコロニーを示しており、遺伝子が導入されたコロニーは蛍光色素陽性コロニーとして写っている。すなわち、HLA-A0201拘束性WT1特異的TCR遺伝子が導入されたiPS細胞のクローニングできたことを示している。この後、この陽性コロニーをピックアップして分離した。

クラスII拘束性ＷＴ１抗原特異的ＴＣＲを導入したHLAハプロタイプホモｉＰＳ細胞の作製
導入する対象の細胞としては実施例2と同じく京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて健常人末梢血単球より作製されたHLAハプロタイプホモ型iPS細胞を用いた。
導入したWT1特異的TCR遺伝子は，大阪大学医学系研究科免疫造血制御学研究室（日本国大阪府吹田市）でクローニングされたたクラスII拘束性WT1特異的TCR遺伝子、Clone KとClone 10を用いた。CloneKはHLA-DRB1*0405拘束性、Clone10はHLA-DPB1*0501拘束性で、認識するペプチド配列はWT1-332(KRYFKLSHLQMHSRKH(配列番号６))である（Microbiol Immunol 52: 591-600, 2008）。

ベクターの作製法、iPS細胞への遺伝子導入方法は、実施例１に準じた。

１. 遺伝子導入後のiPS細胞を単個細胞懸濁液とし、フローサイトメトリーで解析した。結果を図６に示す。Clone10とCloneKともにWT1特異的TCR遺伝子がiPS細胞に導入されていることが確認された。

クラスI拘束性ＷＴ１抗原特異的ＴＣＲを導入したHLAハプロタイプホモｉＰＳ細胞の作製
導入する対象の細胞としては実施例2と同じく京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて健常人末梢血単球より作製されたHLAハプロタイプホモ型iPS細胞を用いた。
導入したWT1特異的TCR遺伝子は，京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にてClonn#9とClone#3-3からクローニングされたクラスI拘束性WT1特異的TCR遺伝子である。

ベクターの作製法、iPS細胞への遺伝子導入方法は、実施例１に準じた。

２. 遺伝子導入後のiPS細胞を単個細胞懸濁液とし、フローサイトメトリーで解析した。結果を図７に示す。Clonn#9とClone#3-3ともにWT1特異的TCR遺伝子がiPS細胞に導入されていることが確認された。

Claims (10)

1. （１）ヒト多能性幹細胞を提供する工程、
   （２）工程（１）のヒト多能性幹細胞へ、所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体遺伝子を導入して、所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体を有する多能性幹細胞を得る工程、および
   （３）工程（２）の多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する工程
   を含む、多能性幹細胞から免疫細胞療法用成熟Ｔ細胞をイン・ビトロで誘導する方法。
2. 多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１記載の方法。
3. ｉＰＳ細胞が、免疫療法対象者のＨＬＡの何れか一方のハプロタイプをホモで有しているハプロタイプホモ接合型のＨＬＡを有しているヒトから得られたiPS細胞である、請求項２記載の免疫療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
4. 免疫細胞療法が、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなど、免疫が関与する疾患を治療するためのものである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
5. 免疫細胞療法が、がんを治療するためのものである、請求項４に記載の方法。
6. がんがＷＴ１遺伝子を発現するがんである、請求項５に記載の方法。
7. 所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子が、ＷＴ１特異的Ｔ細胞受容体遺伝子である請求項１〜6何れかに記載の方法。
8. 所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子が、HLA-A2402拘束性であり、ペプチドCMTWNQMNLを認識するＷＴ１抗原特異的ＴＣＲである請求項７記載の方法。
9. 所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子が、HLA-A0201拘束性であり、ペプチドRMFPNAPYLを認識するＷＴ１抗原特異的ＴＣＲである請求項７記載の方法。
10. 所望の抗原特異性T細胞受容体遺伝子が、HLA-DRB1*0405拘束性またはHLA-DPB1*0501拘束性であり、ペプチドKRYFKLSHLQMHSRKHを認識するＷＴ１抗原特異的ＴＣＲである請求項７記載の方法。

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