JP6944046B2

JP6944046B2 - しわ改善活性を示すペプチド及びその用途

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Publication number: JP6944046B2
Application number: JP2020512447A
Authority: JP
Inventors: ヨンジチョン、; ウンミキム、; ウンジイ、
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2038-07-03
Also published as: US12109296B2; KR101943081B1; EP4349360A3; EP3677590A4; WO2019045248A3; BR112020004088A2; EP3677590A2; US20230285263A1; EP4349361A2; EP3677590B1; US20230285264A1; US11672749B2; CN117186180B; CN111148751B; CN117186175B; EP4349359A2; CN117186175A; WO2019045248A2; CN111148751A; CN117186179B

Description

本発明は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド、前記ペプチドを含む皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物、前記ペプチドを利用した皮膚疾患の予防方法または治療方法、及び前記ペプチドの皮膚疾患の予防用途、治療用途または状態改善用途に関する。

人間の皮膚は、絶えず変化を経ており、そのうち最も代表的なものが、老化による皮膚の機能低下、及び視覚的な美しさの減退である。皮膚の老化は、大きく見て、遺伝的要素による内因性老化と、太陽光線などの外部環境的要素による外因性老化とに区分される。

老化は、皮膚のしわを形成させ、代表的なしわ形成の因子として、活性酸素、紫外線、及びコラーゲンの生合成減退などを挙げることができる。皮膚の内因性老化の場合、人為的な調節が不可能であるが、外因性老化の場合、活性酸素除去、線維芽細胞の増殖、及びコラーゲンの生合成促進などを介して、老化を予防、治療または遅延させることができる。

本発明者らは生物学的に有効な活性を有する優秀なペプチドを開発すべく努力した結果、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列を含むペプチドが、皮膚しわ改善に有用に利用されるということを究明することにより、本発明の完成に至った。

本発明の目的は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドを提供することである。

本発明の他の目的は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドを利用した皮膚疾患の予防方法または治療方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドの皮膚状態改善用途に係わるものである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドの皮膚疾患の予防用途または治療用途に係わるものである。

本発明は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド、前記ペプチドを含む皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物、前記ペプチドを利用した皮膚疾患の予防方法または治療方法、及び前記ペプチドの皮膚疾患の予防用途、治療用途または状態改善用途を提供する。

本発明は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド、前記ペプチドを含む皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物、前記ペプチドを利用した皮膚疾患の予防方法または治療方法、及び前記ペプチドの皮膚疾患の予防用途、治療用途または状態改善用途に係わる効果がある。

本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号３のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号３のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞の増殖促進評価結果を示すグラフである。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞でのＭＡＰＫ（ＡＫＴ除去）のリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞でのＭＡＰＫ（ＡＫＴ除去）のリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号３のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞でのＭＡＰＫ及びＡＫＴのリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの、線維芽細胞でのＭＡＰＫ及びＡＫＴのリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞でのＭＡＰＫ（ＡＫＴ除去）のリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、角質形成細胞でのＭＡＰＫ（ＡＫＴ除去）のリン酸化レベル測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号３のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、ＡＱＰ３（Aquaporin ３）ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、ＳＩＲＴ１ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、ＡＱＰ３（Aquaporin ３）ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、フィブロネクチン発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、エラスチン発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、コラーゲン１ａ発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、フィブロネクチン発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、エラスチン発現量測定結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの、プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号３のアミノ酸配列によってなるペプチドの、プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの、プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ結果を示す写真である。本発明の実施例による配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、ＨＡＥＬＩＳＡ結果を示す写真である。

本発明は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド、前記ペプチドを含む皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物、前記ペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物、前記ペプチドを利用した皮膚疾患の予防方法または治療方法、及び前記ペプチドの皮膚疾患の予防用途、治療用途または状態改善用途に係わるものである。

皮膚しわ部位の代表的特徴は、真皮を構成する細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ：extracellular matrix protein）であるコラーゲン（collagen）、エラスチン（elastin）、フィブロネクチン（fibronectin）のレベル（level）阻害である。

皮膚しわ改善効果を示すためには、真皮を構成する主要細胞である線維芽細胞の増殖促進及び活性促進によるＥＣＭ分子発現増大効能を示さなければならず、本ペプチドの効能確認のために、ＭＴＴアッセイ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴのリン酸化レベルテスト（細胞増殖と係わる主要信号伝達物質（signaling molecules）であり、リン酸化形態が活性形態である）、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンの発現テスト（ＲＴ−ＰＣＲを利用したｍＲＮＡレベル確認、及びＥＬＩＳＡを介するタンパク質レベル確認）を進め、それらに係わる肯定的な効果を確認した。

また、表皮構成細胞である角質細胞の増殖促進、及びＨＡ、ＡＱＰ３、ＳＩＲＴ１の発現増大効果を観察することにより、障壁強化による外部刺激阻害効果も、本ペプチドが有していることを確認した。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明の一様態は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドに係わるものである。

前記ペプチドは、アミノ酸配列の一部部位を選定し、その活性を増大させるために、Ｎ−末端及び／またはＣ−末端の変形が誘導されたものでもありうる。そのようなＮ−末端及び／またはＣ−末端の変形を介して、本発明のペプチドの安定性を顕著に向上させることができ、例えば、ペプチドの生体内投与時、半減期を増大させることができる。

前記Ｎ−末端変形は、ペプチドのＮ−末端に、アセチル基（acetyl group）、フルオレニルメトキシカルボニル基（fluoreonylmethoxycarbonyl group）、ホルミル基（formyl group）、パルミトイル基（palmitoyl group）、ミリスチル基（myristyl group）、ステアリル基（stearyl group）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）からなる群から選択された保護基が結合したものでもありうる。

前記Ｃ−末端変形は、ペプチドのＣ−末端に、ヒドロキシ基（hydroxyl group：−ＯＨ）、アミノ基（amino group：−ＮＨ_２）、アジド（azide：−ＮＨＮＨ_２）などが結合したものでもありうるが、それらに限定されるものではない。

前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から、本発明のペプチドを保護する作用を行う。

本発明の他の一様態は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む、皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物に係わるものである。

前記皮膚疾患は、乾癬、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性皮膚炎及び皮膚乾燥症でもありうるが、それらに限定されるものではない。

前記薬学的組成物は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドの薬学的有効量を含むものでもありうる。

また、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を追加して含むものでもありうる。

前記薬学的に許容される担体は、製剤時に一般的に利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。適する薬学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)に詳細に記載されている。

本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などを追加して含んでもよいが、それらに限定されるものではない。

前記薬学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与することができ、非経口投与である場合には、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することができるが、それらに限定されるものではない。

前記薬学的組成物の投与量は、１日当たり、０．０００１ないし１，０００μｇ、０．００１ないし１，０００μｇ、０．０１ないし１，０００μｇ、０．１ないし１，０００μｇ、または１．０ないし１，０００μｇでもありうるが、それらに限定されるものではなく、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によっても多様に処方される。

前記薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野で当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に封入させても製造される。

前記剤形は、オイル内または水性媒質内の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、あるいはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり得、分散剤及び／または安定化剤を追加して含んでもよい。

本発明のさらに他の一様態は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用食品組成物に係わるものである。

前記皮膚状態改善は、しわ改善、皮膚再生、皮膚弾力改善、皮膚老化抑制、傷再生、にきび改善、皮膚再生または皮膚美白でもありうるが、それらに限定されるものではない。

前記食品は、各種食品、飲料、食品添加剤などでもありうる。

前記食品組成物に含有された有効成分としてのペプチドの含量は、食品形態、所望用途などに応じて適宜、特別な制限がなく、例えば、全体食品重量の０．０１ないし１５重量％で加えることができ、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準に、０．０２ないし１０ｇ、好ましくは、０．３ないし１ｇの比率で加えることができる。

前記食品が飲料である場合には、指定された比率で、必須成分として前記ペプチドを含む以外に、液体成分には特別な制限がなく、通常飲料のように、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでもよい。

前記天然炭水化物は、例えば、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド；例えば、マルトース、スクロースのようなジサッカライド；例えば、デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライドのような一般的な糖であり得；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。

前述のもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般的に、約１ないし２０ｇ、好ましくは、約５ないし１２ｇである。

前述のもの以外に、本発明の食品組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。

それ以外に、本発明の食品組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでもよい。そのような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。そのような添加剤の比率は、あまり重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり、０ないし約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。

本発明のさらに他の様態は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上を含む皮膚状態改善用化粧品組成物に係わるものである。

前記化粧品組成物は、（ａ）前述の本発明のペプチドの化粧品学的有効量（cosmetically effective amount）、及び／または（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含むものでもありうるが、それらに限定されるものではない。

本明細書において、用語「化粧品学的有効量」は、前述の本発明の組成物の皮膚状態改善効能を達成するのに十分な量を意味する。

前記化粧品組成物は、当業界で一般的に製造されるいかなる剤形にも製造され得、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどにも剤形化されうるが、それらに限定されるものではない。さらに詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形にも製造されうる。

本発明の化粧品の剤形が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用されうる。

本発明の化粧品の剤形が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが利用され得、特に、スプレーである場合には、追加でクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。

本発明の化粧品の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され得、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の化粧品の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤；エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤；微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガールまたはトラガントなどが利用されうる。

本発明の化粧品の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用されうる。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド及び担体成分以外に、化粧品組成物に一般的に利用される成分を含み得、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような一般的な補助剤を含んでもよい。

本発明の用語「皮膚状態改善」とは、皮膚の内在的要因または外因的要因によって誘発される皮膚の損傷を、治療、軽減、緩和させる過程、またはその効果などを包括的に意味し、例えば、皮膚で生じる炎症の緩和、改善などの効果を示すとも解釈されうるが、それらに限定されるものではない。

本発明のさらに他の様態は、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドの皮膚状態改善用途に係わるものである。

本発明のさらに他の様態は、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドの、皮膚疾患の予防用途または治療用途に係わるものである。

前記配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドは、すでに説明したところと同一である。

本明細書の用語「ペプチド」は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界において公知である化学的合成方法、特に、固相合成技術（solid-phase synthesis techniques；Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)）または液状合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によっても製造されうる。

本明細書の用語「安定性」は、インビボ安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味しうる。

本明細書において、用語「薬学的有効量」は、前述のペプチドの効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。

以下、本発明について下記実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がそれら実施例によって限定されるものではない。

合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロリドレジン（ＣＴＣ resin：chloro trityl chloride resin、Nova biochem ＣａｔＮｏ．０１−６４−００２１）７０ｇを反応容器に入れ、塩化メチレン（ＭＣ）４９０ｍｌを加えて３分間撹拌した。その後、溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４９０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、さらに溶媒を除去した。その後、反応器に、７００ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、スイス）２００mmole及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００mmoleを入れた後、撹拌して十分に溶解させ、１時間撹拌しながら反応させた。その後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡと（２：１）をジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶かし、１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。その後、溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を４９０ｍｌ入れ、３分間撹拌した後、さらに溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（piperidine）／ＤＭＦ）７００ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、さらに１０分間反応を維持させた後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄し、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＣＴＣレジンを製造した。

新たな反応器に７００ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、スイス）２００mmole、ＨｏＢｔ２００mmole及びＨＢＴｕ２００mmoleを入れた後、撹拌して十分に溶解させた。反応器に、４００mmole ＤＩＥＡを分画で２回に分けて入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶解させたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取り、カイザーテスト（ニンヒドリンテスト）を利用し、反応程度を点検した。脱保護溶液で、前述のように同一に、２回脱保護反応を行わせ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＣＴＣレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、さらに１回カイザーテストを行った後、前述のところと同一に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの順に連鎖反応を行わせた。Ｆｍｏｃ−保護基を、脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、十分に洗浄して除去した。ペブチジルレジンを、ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥させた後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧し、完全に乾燥させた後、脱漏溶液［トリフルオロ化酢酸（trifluroacetic acid）８１．５％、蒸溜水５．０％、チオアニソール（thioanisole）５．０％、フェノール（phenol）５．０％、エタンジチオール（ＥＤＴ）２．５％、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）１．０％］１，９００ｍｌを入れた後、常温で振盪し、２時間反応を維持した。フィルタリングを行ってレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。合わせられた母液２，０９０ｍｌは、冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥させ、精製前の配列番号１からなるペプチド７９．８ｇを合成した（収率：９７．０％）。分子量測定器を利用して分子量を測定するとき、分子量８２２．９（理論値：８２２．９）を得ることができた。

配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドも、前述のような方法で合成を進めた。

実施例１．線維芽細胞の増殖促進評価
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、５ｘ１０^３細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％血清添加培地（serum-containing media）に替えた後、陽性対照群１００ｎＭｂＦＧＦ、及び配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭまたは５０μＭで処理し、３日間培養し、４ｍｇ／ｍｌＭＴＴソリューション（solution）処理を行い、４時間反応させた。その後、生成されたホルマザンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理を介して溶出させた後、マイクロプレートリーダ（microplate reader）を使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定し、その結果を図１ないし図４、及び表２に示した。

図１ないし図４、及び表２から確認することができるように、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列によってなるペプチドの線維芽細胞増殖促進効能が確認された。

実施例２．角質形成細胞の増殖促進評価
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴを、３ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％血清添加培地に替えた後、陽性対照群１０ｎＭＥＧＦ、及び配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭまたは５０μＭで処理し、３日間培養し、４ｍｇ／ｍｌＭＴＴソリューション処理を行い、４時間反応させた。その後、生成されたホルマザンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理を介して溶出させた後、マイクロプレートリーダを使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定し、その結果を、図５ないし図８、及び表３に示した。

実施例３．ＭＡＰＫ及びＡＫＴのリン酸化レベル測定
３−１．線維芽細胞
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、５ｘ１０^３細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％ＦＢＳ含有培地（ＦＢＳ−containing media）に替えた後、陽性対照群１００ｎＭｂＦＧＦ、及び配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭまたは５０μＭで処理し、３０分培養して細胞を回収し、細胞溶解物（cell lysate）を準備した。その後、Ｐ−ＭＡＰＫ（ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｐ３８）抗体、ｐ−Ａｋｔ抗体またはＡｃｔｉｎ抗体（Santa Cruz Biotechnology、米国）を利用してウェスタンブロッティングを行い、リン酸化様相を比較し、その結果を、図９ないし図１２に示した。

図９ないし図１２から確認することができるように、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドは、線維芽細胞の増殖に係わる信号伝達因子であるＭＡＰＫ（ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫ）及びＡＫＴの活性化を介して、増殖を促進する効能を示すということが確認された。

３−２．角質形成細胞
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴを、３ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％ＦＢＳ含有培地に替えた後、陽性対照群１０ｎＭＥＧＦ、及び配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭまたは５０μＭで処理し、３０分培養して細胞を回収して細胞溶解物を準備した。その後、Ｐ−ＭＡＰＫ（ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｐ３８）抗体、ｐ−Ａｋｔ抗体（Santa Cruz Biotechnology、米国）を利用してウェスタンブロッティングを行い、リン酸化様相を比較し、その結果を図１３及び図１４に示した。

図１３及び図１４から確認することができるように、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドは、ヒト角質形成細胞増殖に係わる信号伝達因子であるＥＲＫ及びｐ３８の活性化を介して、増殖を促進する効能を示すということが確認された。

実施例４．コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンのＲＴ−ＰＣＲ
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、５ｘ１０^３細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％ＦＢＳ含有培地に替えて４時間培養した後、陽性対照群１００ｎＭＩＧＦ−１、及び配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭまたは５０μＭで処理し、２４時間培養して細胞を回収し、ＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Intron、韓国）を利用してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）、及び下記表４のコラーゲン１ａ（collagen １ａ）、フィブロネクチン（fibronectin）、エラスチン（elastin）、ＧＡＰＤＨそれぞれのプライマーを利用して、ＰＣＲを進めた。その後、５％アガロースゲルに泳動させ、各ペプチド処理条件での前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較し、その結果を図１５ないし図１８に示した。

図１５ないし図１８から確認することができるように、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドは、線維芽細胞活性促進を介して、ＥＣＭ構成成分であるコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンのｍＲＮＡ発現増大効果を示すということが確認された。

実施例５．ＡＱＰ３（Aquaporin ３）及びＳＩＲＴ１ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴを、３ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％ＦＢＳ含有培地に替え、４時間培養した後、陽性対照群１００ｎＭＥＧＦ、及びそれぞれ配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチド１０μＭ、５０μＭで処理し、２４時間培養して細胞を回収し、ＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Intron、韓国）を利用してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（Intron、韓国）、及び下記表５のＡＱＰ３、ＳＩＲＴ１、ＧＡＰＤＨそれぞれのプライマーを利用してＰＣＲを進めた。その後、５％アガロースゲルに泳動させ、各ペプチド処理条件での前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較し、その結果を、図１９ないし図２１に示した。

図１９ないし図２１から確認することができるように、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドは、角質細胞活性促進を介して、皮膚障壁強化と係わるタンパク質であるＡＱＰ３の発現を増加させるということが確認された。

実施例６．コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンの発現量測定
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、５ｘ１０^３細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、無血清培地（serum-free media）に替えた後、陽性対照群１００ｎＭｂＦＧＦ、及び配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドで処理し、２４時間培養し、４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で３０分間固定した。その後、３回の洗浄後、０．５％Triton Ｘ−１００下で１５分間反応させ、さらに３回洗浄した。その後、３％ＢＳＡ（bovine serum albumin）下で１時間ブロッキング（blocking）し、コラーゲン１ａ、フィブロネクチン及びエラスチンに対する一次抗体（１：１００）を４℃で一晩反応させた。その後、二次抗体（１：５００）を室温で２時間反応させた後、ＤＡＰＩ染色法（ＤＡＰＩ staining）で染色し、蛍光顕微鏡（fluorescent microscope）で観察し、その結果を、図２２ないし図２７に示した。

図２２ないし図２７から確認することができるように、配列番号１または２のアミノ酸配列によってなるペプチドは、線維芽細胞活性促進を介して、ＥＣＭ構成成分であるコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンタンパク質の発現増大効果を示すということが確認された。

実施例７．プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、５ｘ１０^３細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。その後、０．０５％ＦＢＳ含有培地に替えて４時間培養した後、陽性対照群１００ｎＭＩＧＦ−１、及び配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドで処理を行い、７２時間培養し、培地を回収する。プロコラーゲン１ａＥＬＩＳＡ kit（ＵＳ Biological Life Science、米国）を利用して培地内含量を測定し、その結果を、図２８ないし図３１、及び表６に示した。

図２８ないし図３１、及び表６から確認することができるように、配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列によってなるペプチドで処理すると、線維芽細胞において、プロコラーゲン１αタンパク質発現が増大するということが確認された。

実施例９．ＨＡＥＬＩＳＡ
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴを、３ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。０．０５％ＦＢＳ含有培地に替えて４時間培養した後、陽性対照群１００ｎＭＩＧＦ−１、及び配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドで処理を行い、７２時間培養して培地を回収する。ＨＡＥＬＩＳＡキット（Ｅｃｈｅｌｏｎ、米国）を利用して培地内含量を測定し、その結果を、図３２及び表７に示した。

図３２及び表７から確認することができるように、配列番号２のアミノ酸配列によってなるペプチドは、角質細胞活性促進を介して、皮膚障壁補強と係わるタンパク質であるＨＡ発現を増大させるということが確認された。

Claims

配列番号１，２，３または４のアミノ酸配列からなる、皮膚状態改善活性を有するペプチドであって、前記皮膚状態改善は、しわ改善、皮膚再生、皮膚弾力改善、皮膚老化抑制、傷再生、にきび改善、または皮膚美白である、ペプチド。
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む皮膚状態改善用化粧品組成物であって、前記皮膚状態改善は、しわ改善、皮膚再生、皮膚弾力改善、皮膚老化抑制、傷再生、にきび改善、または皮膚美白である、化粧品組成物。
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む、皮膚疾患の予防用または治療用の薬学的組成物であって、前記皮膚疾患は、乾癬、アトピー性皮膚炎、非アレルギー性皮膚炎または皮膚乾燥症である、薬学的組成物。
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群のうちから選択された１種以上のペプチドを含む皮膚状態改善用食品組成物であって、前記皮膚状態改善は、しわ改善、皮膚再生、皮膚弾力改善、皮膚老化抑制、傷再生、にきび改善、または皮膚美白である、食品組成物。