JP6949964B2

JP6949964B2 - 皮膚の審美性の診断方法

Info

Publication number: JP6949964B2
Application number: JP2019534129A
Authority: JP
Inventors: サンドラ・カナニ; ヴィルジニー・ピフォー; オードゥ・フシェ; マルク・ドノヴァン
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: JP2021166536A; FR3061305A1; JP2020501587A; US12326456B2; US20200072851A1; WO2018115517A1; EP3559671A1; ES2974622T3; EP3559671B1; FR3061305B1; EP3559671C0

Description

本発明は、皮膚の審美性を診断する方法に関する。

皮膚の審美性は、そのコンパートメント全て(表皮、真皮-表皮接合部、真皮、真皮-皮下接合部及び皮下接合部)の機能的及び構造的変化並びに劣化によって引き起こされる様々な種類の損傷を受けて、劣化し得る。多くの代謝機能が細胞レベルで影響を受ける可能性がある。表皮は薄くなり、ケラチノサイトはヒアルロン酸、プロテオグリカンの更新及び修復、合成に関するその能力を失い、真皮-表皮接合部の質及び接着性が低下し、これによって、皮膚組織がより薄く且つより脆弱になり、表皮はより薄くなり、そして真皮-表皮接合部がその陥入を失う。同じことが真皮レベルでも当てはまり、そこでは、線維芽細胞によるその組織化でのタンパク質又は基本マトリックス分子(コラーゲン、特にプロテオグリカン)の合成がより少なくなっている。皮下組織も影響を受ける。こういった全ての事象によって、皮膚全体が強度を減じ、皮膚全体の張りが低下し、弾力性が低下し、脆弱性が高まり、そして皮膚全体は正しいレベルの保湿を保持することが困難となる。皮膚はまた、その輝きを失う可能性もあり、荒れ、しわ及び黒子の出現をもたらすそのマイクロレリーフへの変成が存在し、その全てが「不調」又は疲労の徴候である。更に、様々な二次的要因、例えば、汚染等の環境による攻撃、タバコ等の外因性の要因、体重の変化、妊娠、肥満状態、蜂巣炎に続いて起こる、皮下組織の組織化及び密度における変動の結果によって、又は例えば皮膚線条、瘢痕から生じる細胞外マトリックスの構成成分の崩壊によって、あらゆる皮膚特性への変化は一段と悪化する可能性がある。

国際特許出願公開第2011/126249号国際特許出願公開第2015/009085号

上記から、皮膚の審美性に対する劣化を軽減及び/又は遅延させることができるように、特に皮膚の審美的特性の劣化に関する徴候がまだ目に見えていない場合に、それら徴候を検出するために使用することができるバイオマーカーを見いだすことの重要性が容易に理解される。具体的には、所定の対象にとって適切な方法で答えることができるように、これらの徴候のうちの1つ又は複数に特異的なバイオマーカーに対する重要なニーズが存在する。本発明の目的はこのニーズに応じることである。

出願人は、驚くべきことに、フィラグリン2(FLG2)をコードする遺伝子の発現が、皮膚のレベルで、皮膚の審美性、特に皮膚の光沢、荒れたきめ及びたるみと、相関していることを発見した。

フィラグリン2(FLG2)は、イファプソリアシン(ifapsoriasin)(IFPS)の名称でも知られており、S100タンパク質ファミリーのメンバーである。これは、2391個のアミノ酸からなる250kDaのタンパク質であり、ヒスチジンとグルタミンに富んでいる。FLG2はそのメッセンジャーRNA(mRNA)で、皮膚、胸腺、胃、精巣及び胎盤において発現する。FLG2は、ヒト皮膚の顆粒層において及び基底角質層において発現する。

したがって、その態様の第1によれば、本発明は、対象における皮膚の審美性に対する劣化を、優先的にはインビトロで診断する方法であって、以下:
a)前記対象由来の皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び
b)任意選択で、工程a)で測定されたFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに基づいて、前記対象の皮膚が、劣化した審美性を提示しているかどうか判定する工程
を含む、前記方法に関する。

本発明はまた、対象における審美性が劣化している皮膚の美容トリートメントの方法であって、以下:
a)前記対象由来の皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程;
b)工程a)から、前記対象の皮膚が、劣化した審美性を提示しているかどうか推論する工程;
c)工程b)において皮膚が劣化した審美性を提示していると認定される場合、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化粧用組成物で前記皮膚を処置する工程
を含む、前記方法に関する。

「皮膚の審美性の劣化」とは、その美的外観を劣化させ、且つ初期段階では必ずしも目に見えるとは限らない皮膚への任意の変化を意味し、特に、皮膚の、好ましくは顔面の皮膚の、特に頬及び/又は額の、光沢の低下及び/又は荒れたきめの出現及び/又はたるみの増加を、意味する。

本明細書で使用する「皮膚に光沢があること」とは、良好な明るさを有する皮膚、及び/又はくすんでいない皮膚、及び/又は輝きのある顔色を指す。

FLG2は、アミノ酸配列が知られているタンパク質であり、特にNCBI登録コード:NP_001014364.1(2015年12月11日版)の配列に相応する。FLG2をコードするmRNA配列も当業者に知られており、特に、NCBI登録コード:NM_001014342.2(2015年12月11日版)でアクセス可能である。

用語「FLG2をコードする遺伝子の発現レベル」とは、FLG2をコードする遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)の発現レベル及び/又はFLG2タンパク質の発現レベルを表す。

好ましくは、FLG2タンパク質の発現レベルを、例えば、このタンパク質に特異的な、抗体、好ましくはモノクローナル、Fabフラグメント、scFv又はナノボディ等のFLG2タンパク質の特異的リガンドを使用して測定する。次いで、発現レベルは、例えばELISA試験を用いて、好ましくは、FLG2タンパク質に特異的な捕捉抗体及びやはりFLG2タンパク質に特異的な検出抗体を使用するサンドイッチELISA試験を用いる等の、当業者に知られている任意の方法を用いて測定してよい。具体的には、FLG2タンパク質の発現レベルの測定は、国際特許出願公開第2011/126249号に記載のもの等の、マイクロ流体チップといった小型化システムを使用して行うことができ、このチップはFLG2タンパク質に対する特異的リガンドを含有する。続いて、FLG2タンパク質が前記リガンドと結合したかどうか判定するために、且つ皮膚試料中のFLG2の存在及び量の点で結論を下すために、適切な読み取り機を用いることによってチップを分析することができる。

好ましくは、FLG2をコードする遺伝子のmRNAの発現レベルを、FLG2をコードする遺伝子のmRNAの、そして、FLG2をコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズする相補的ヌクレオチド配列若しくは、FLG2をコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズするそのフラグメント(この配列又はこのフラグメントは、5〜50ヌクレオチド、優先的には10〜20ヌクレオチドを含む)を使用し、又は、前記配列若しくは前記フラグメントを含む、10〜60ヌクレオチド、優先的には15〜30ヌクレオチドの一対のプライマー若しくはプローブを使用して、測定する。次いで、発現レベルは、当業者に知られている任意の手段によって、例えば定量的PCRを用いることによって測定してよい。

本発明の範囲内で、当業者によく知られている用語「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」とは、適切な条件下、特にストリンジェントな条件下での核酸配列と特定のヌクレオチド配列との結合を指す。

用語「ストリンジェントな条件」とは、本明細書で使用される場合、規定のレベルの相補性を有する核酸間に結合対を生じるのに適しているが、前記規定のレベルよりも低い相補性を有する、結合している核酸間での対の形成に適していない条件に相応する。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件に左右される。この条件は、当業者に知られている方法に従って変更し得る。一般に、高ストリンジェンシー条件は、融点(Tm)よりもおよそ5℃低いハイブリダイゼーション温度であり、好ましくは、完全に塩基対対合したストランドのTmに近いハイブリダイゼーション温度である。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野でよく知られている。

高ストリンジェンシー条件には、一般に、5×SSC/5×Denhardtの溶液/1.0%SDS溶液中でおよそ50℃〜およそ68℃の温度でのハイブリダイゼーションを行うこと、及びおよそ60℃からおよそ68℃の間の温度で0.2×SSC/0.1%SDS溶液中で洗浄することが含まれる。

好ましい一実施形態によれば、本発明による方法で使用される対象の皮膚試料は、好ましくは非侵襲的に、対象の皮膚で、優先的には対象の顔面で、特に対象の頬で採取された試料である。好ましくは、皮膚試料は角質層から得られる。好ましくは、皮膚試料は病変のない領域から採取される。

角質層は表皮の最外層であり、皮膚表面を構成する。これは死んだ細胞から本質的に構成されている。

一実施形態によれば、本発明による方法は、対象から皮膚試料を採取する工程を含む。この工程は、非侵襲的に行われるのが好ましく、特に局所麻酔薬を必要としない。好ましい一実施形態によれば、試料を採取する工程は、皮膚表面を擦ることによって、又はD-squame(登録商標)ディスク等の接着面を使用することによって行われる。

用語「対象」とは、好ましくは20から90歳まで、優先的には35から80歳まで、45から80歳まで、更により優先的には60から80歳までのヒトを表す。好ましくは、対象は女性である。好ましくは、対象は皮膚科学的病変及び/又は皮膚科学的病状に罹患していない。

一実施形態によれば、光沢に関して、基準値は、FLG2が140から190ng/mlの間である。

一実施形態によれば、荒れたきめに関して、基準値は、FLG2が122から166ng/mlの間である。

一実施形態によれば、たるみに関して、基準値は、FLG2が82から112ng/mlの間である。

特定の一実施形態では、工程(b)は、得られたFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを少なくとも1つの基準値と比較した後に実施される。一実施形態では、基準値は、定義された集団、例えば、定義された年齢層の集団及び/又は定義されたスキンタイプを有する集団(白人、アジア人等)におけるFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの平均値によって決定することができる。特定の一実施形態では、基準値は、60から80歳までの女性におけるFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの平均値によって決定される。別の実施形態では、基準値は、ROC分析によって決定された最適の閾値である。具体的には、その基準は、考慮される皮膚の審美性の劣化の徴候によって異なることができる。本発明によれば、基準値は、複数の試料、好ましくは50、100、200、300又は500超の試料によって決定してよい。一実施形態では、2つの基準値が使用される。次いで、これらの値によって、定義された集団、例えば、定義された年齢層の集団及び/又は定義されたスキンタイプを有する集団(白人、アジア人等、又は脂性の傾向がある皮膚、乾燥皮膚等)におけるFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの平均値まわりの範囲を決定することができる。特定の一実施形態では、基準値は、30から80歳までの女性における、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルの平均値プラス又はマイナスFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの標準偏差によって決定される。別の実施形態では、基準値は、ROC分析によって決定された最適の閾値である。

用語「比較」とは、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが、特に1つだけの基準値が存在する場合、基準値と本質的に同一であるか又は異なるか判定することを指す。好ましくは、観察された差が統計的に有意である場合、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルは基準値とは異なるとみなされる。差が統計的に有意ではない場合、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルと基準値とは本質的に同一である。

この比較に基づいて、皮膚が劣化した審美性を提示しているかどうか判定することが可能である。典型的には、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが基準値よりも有意に高い場合及び/又は低い場合、皮膚は劣化した審美性を提示しているとみなされ、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが基準値と本質的に同一である場合、皮膚は劣化した審美性を提示しているとはみなされない。

具体的には、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルがこの徴候に関する基準値よりも有意に低い場合、皮膚は、特に荒れたきめの出現等の劣化した審美性を提示しているとみなされ、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが基準値と本質的に同一である場合、皮膚は、特に荒れたきめの出現等の劣化した審美性を提示しているとみなされない。

具体的には、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルがそれぞれそれらの徴候についての基準値よりも有意に高い場合、皮膚は、特に光沢の低下又はたるみの増加等の劣化した審美性を提示しているとみなされ、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが基準値と本質的に同一である場合、皮膚は、特に光沢の低下又はたるみの増加等の劣化した審美性を提示しているとみなされない。

用語「比較」とはまた、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが本質的に2つの基準値により定義される範囲の内側にあるか外側にあるかどうか判定することも指す。好ましくは、範囲外であることに加えて、測定された発現レベルと最も近い基準値との間の観察された差が統計的に有意である場合、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルは範囲外であるとみなされる。差が統計的に有意ではない場合、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルは値の範囲内にあるとみなされる。

この比較に基づいて、皮膚が劣化した審美性を提示しているかどうか判定することが可能である。典型的には、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが、本質的に2つの基準値により定義される範囲外である場合、皮膚は劣化した審美性を提示しているとみなされ、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが、本質的に2つの基準値により定義される範囲内である場合、皮膚は劣化した審美性を提示しているとはみなされない。

用語「皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化粧用組成物」とは、皮膚の、光沢の低下、荒れたきめの出現及びたるみの増加等の、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した、当業者に知られている任意の化粧用組成物を表す。

本発明はまた、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物を特定する方法であって、以下:
a)前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程;
b)前記発現レベルを、前記化合物に曝露されていない前記皮膚の試料中の発現レベルと比較する工程;
c)候補化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの変動が検出される場合、前記候補化合物を、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物として特定する工程
を含む、前記方法に関する。

好ましい一実施形態によれば、候補化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの上昇が検出される場合、前記候補化合物は、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに、特に荒れたきめの出現を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物として特定される。

好ましい別の実施形態によれば、候補化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの上昇が検出される場合、前記候補化合物は、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに、特に皮膚の、光沢の低下及び/又はたるみの増加を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物として特定される。

好ましい一実施形態によれば、本発明による皮膚の審美性の劣化の進行を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物を特定する方法において使用される皮膚試料は、皮膚細胞培養物、表皮培養物、再構成した皮膚全体、ヒト皮膚外植片、又は上で定義の対象由来の皮膚試料である。

優先的には、本発明による方法は、試料を処理して、FLG2をコードする遺伝子の発現レベルの測定を準備する工程を含む。例えば、処理済み試料とは可溶性タンパク質抽出物である。具体的には、皮膚試料がD-squame(登録商標)ディスク等の接着面を使用して得られた場合、可溶性タンパク質抽出物は、国際特許出願公開第2015/009085号に記載されているもの等のタンパク質抽出システムを使用して入手してもよいが、これは、D-squame試料を最少量の抽出緩衝液と接触させて、それによって可溶性タンパク質抽出物を入手するのに適している。

本発明はまた、
a)皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現を測定するための手段、及び
b)使用説明書
を含むキットにも関する。

用語「FLG2をコードする遺伝子の発現を測定するための手段」とは、FLG2タンパク質の特異的リガンド、例えば、このタンパク質に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル、Fabフラグメント、scFv若しくはナノボディを表し、又は、国際特許出願公開第2011/126249号に記載のもの等のマイクロ流体チップを表すが、このチップはFLG2タンパク質に対する特異的リガンドを含有する。或いは、この手段とは、FLG2をコードする遺伝子のmRNAの、そして、FLG2をコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズする相補的ヌクレオチド配列若しくは、FLG2をコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズするそのフラグメント(この配列又はこのフラグメントは、5〜50ヌクレオチド、好ましくは10〜20ヌクレオチドを含む)を表し、又は、前記配列若しくは前記フラグメントを含む、10〜60ヌクレオチド、優先的には15〜30ヌクレオチドの一対のプライマー若しくはプローブを表す。

一実施形態によれば、本発明によるキットはまた、FLG2をコードする遺伝子の発現に関する標準範囲も含む。

好ましくは、FLG2をコードする遺伝子の発現を測定するための手段は、FLG2の少なくとも1つの特異的リガンド、特にFLG2タンパク質に特異的な一対の捕捉抗体及び検出抗体である。

一実施形態によれば、本発明によるキットはまた、D-squame(登録商標)ディスク等の皮膚試料を採取するための手段も含む。

本発明はまた、皮膚の審美性の劣化の進行を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物を特定するための、本発明によるキットの使用にも関する。

本発明を以下の実施例によって例示する。

36〜75歳の女性376人の頬に関して、光沢の低下、荒れ、及びたるみについて評価した。FLG2をコードする遺伝子のタンパク質発現レベルもまた、D-squame(登録商標)試料を用いることによってこれらの女性の頬に関して評価したが、この場合、チップ上で行われたELISA試験を使用して可溶性タンパク質抽出物を分析した。

得られた結果の単変量統計解析によれば、皮膚の審美性の劣化とFLG2の発現との間の相関関係が示されている。具体的には、Table 1(表1)においてたるみについて及び光沢について定義された閾値を超えると、皮膚は、それぞれ、たるんだ皮膚に向かって進展するか又はその光沢を失う可能性が高い。Table 1(表1)において荒さについて定義された閾値を下回ると、皮膚は荒れた皮膚に向かって進展する可能性が高い。

Claims

対象における皮膚の審美性の劣化を検出する方法であって、前記対象由来の皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、
皮膚の審美性の劣化が、光沢の低下及び/又は荒れたきめの出現及び/又はたるみの増加を含み、前記対象が、皮膚科学的病変及び/又は皮膚科学的病状に罹患していない、方法。
対象における審美性が劣化している皮膚の非治療的美容トリートメントの方法であって、以下:
a)前記対象由来の皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程;
b)工程a)で得られたFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを少なくとも1つの基準値と比較し、前記対象の皮膚が、劣化した審美性を提示しているかどうか決定する工程;
c)工程b)において皮膚が劣化した審美性を提示していると認定される場合、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化粧用組成物で前記皮膚を処置する工程
を含み、
皮膚の審美性の劣化が、光沢の低下及び/又は荒れたきめの出現及び/又はたるみの増加を含み、前記対象が、皮膚科学的病変及び/又は皮膚科学的病状に罹患していない、方法。
皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物を特定する方法であって、以下:
a)候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程;
b)工程a)で測定された前記発現レベルを、前記化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルと比較する工程;
c)候補化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの上昇が検出される場合、前記候補化合物を、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物として特定する工程
を含み、
皮膚の審美性の劣化が、荒れたきめの出現を含む、方法。
皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物を特定する方法であって、以下:
a)候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程;
b)工程a)で測定された前記発現レベルを、前記化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルと比較する工程;
c)候補化合物に曝露されていない皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露された皮膚試料中のFLG2をコードする遺伝子の発現レベルの低下が検出される場合、前記候補化合物を、皮膚の審美性の劣化を軽減及び/又は遅延させるのに適した化合物として特定する工程
を含み、
皮膚の審美性の劣化は、光沢の低下及び/又はたるみの増加を含む、方法。
前記皮膚試料が、皮膚細胞培養物、表皮培養物、再構成した皮膚全体、ヒト皮膚外植片、又は対象由来の皮膚試料である、請求項3から4のいずれか一項に記載の方法。
皮膚試料が、D-squame(登録商標)ディスクを使用して採取される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
FLG2をコードする遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子のmRNAの発現レベルによって、又は前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することによって、決定される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。