JP6959369B2 - アンジオポエチン−１またはｖｅｇｆを分泌する幹細胞およびこれを含む心血管疾患の予防または治療用薬学組成物 - Google Patents

Description

血管生成を促進するアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）（Ａｎｇ−１）またはＶＥＧＦ分泌幹細胞、その製造方法および心血管疾患予防または治療用途に関するものである。

細胞治療剤は活発に研究されている分野である。代表的な細胞治療剤の一つが心筋幹細胞である。心筋幹細胞に分化する幹細胞としてｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、造血幹細胞、内皮前駆細胞、筋芽細胞、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌなどが浮上している。このように分化した心筋幹細胞は心血管疾患治療のための細胞治療剤としての有用性が増加しており、その開発技術に対する研究が活発に行われている。

しかし、現在の単純分離培養法によって生産された幹細胞はその治療効能が低いため、治療機能がより強化された高効率の次世代幹細胞開発が必要である。

一例は、Ａｎｇ−１を分泌するＡｎｇ−１分泌幹細胞を提供する。

他の例は、ＶＥＧＦを分泌するＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を含むＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

前記幹細胞は、人間由来幹細胞であってもよい。前記Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞は、Ａｎｇ−１遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が幹細胞ゲノム内に挿入された、例えば、幹細胞のゲノム中のＡＡＶＳ１などのようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）部位に挿入されたものであってもよい。前記幹細胞は間葉系幹細胞であってもよく、例えば、臍帯などに由来する間葉系幹細胞であってもよい。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を含む、血管生成用または血管生成促進用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を血管生成促進を必要とする個体に投与する段階を含む血管生成方法または血管生成促進方法を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を含む、虚血性細胞死阻害用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を虚血性細胞死阻害を必要とする個体に投与する段階を含む虚血性細胞死阻害方法を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を有効性分として含む、心血管疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を心血管疾患の予防または治療を必要とする個体に投与する段階を含む、心血管疾患の予防または治療方法を提供する。

前記心血管疾患は、心血管異常で生じる病気であって、全ての虚血性心血管疾患のうちから選択でき、例えば、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、不整脈などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、幹細胞のゲノムにＡｎｇ−１遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、またはこれら全てを導入させる段階を含む、Ａｎｇ−１、ＶＥＧＦ、またはこれら全てを分泌する幹細胞の製造方法を提供する。前記幹細胞のゲノムにＡｎｇ−１遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子を導入させる段階は、エンドヌクレアーゼ（またはこれを暗号化する核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれを暗号化する核酸分子）によって行われるものであってもよい。前記エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＧＥＮ）であってもよい。

前記エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡは、
（１）エンドヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡが複合体を形成するリボ核タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）形態、または
（２）（ａ）エンドヌクレアーゼタンパク質またはこれを暗号化する核酸分子または前記核酸分子を含む組換えベクターと（ｂ）ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡを暗号化する核酸分子または前記核酸分子を含む組換えベクターの混合物形態
で使用（例えば、投与）できる。

他の例は、前記製造方法によって製造されたＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、前記Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞製作に使用するためのエンドヌクレアーゼ（またはこれを暗号化する核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれを暗号化する核酸分子）の複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを提供する。

本発明者らは虚血性疾患で血管再生を助ける方法を糾明するために研究を繰り返した結果、心筋梗塞または下肢虚血モデルの血管の生成にＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ａｎｇ−１）とＶａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）を分泌する幹細胞を製作し、これを用いて虚血性心血管疾患を予防または治療することができるのを確認した。

一例は、Ａｎｇ−１を分泌するＡｎｇ−１分泌幹細胞を提供する。

他の例は、ＶＥＧＦを分泌するＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を含むＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

前記幹細胞は、人間由来幹細胞であってもよい。前記Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞は、Ａｎｇ−１遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が幹細胞ゲノム内に挿入された、例えば、幹細胞のゲノム中のＡＡＶＳ１などのようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）部位に挿入されたものであってもよい。前記幹細胞は間葉系幹細胞であってもよく、例えば、臍帯などに由来する間葉系幹細胞であってもよい。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を含む、血管生成用または血管生成促進用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を血管生成促進を必要とする個体に投与する段階を含む血管生成方法または血管生成促進方法を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を含む、虚血性細胞死阻害用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を虚血性細胞死阻害を必要とする個体に投与する段階を含む虚血性細胞死阻害方法を提供する。

前記虚血性細胞死は脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、不整脈などのように心血管疾患による血管を通じた血液供給の中断または不足、または免疫学的な原因に起因する心筋または筋肉細胞の細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を意味するものであり得、本発明で提供されるＡｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞によって、このような虚血性細胞死の誘導を効果的に阻害することができ、これを通じて虚血性心血管疾患の予防および／または治療が可能である。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物を有効性分として含む、心血管疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

他の例は、Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞からなる群より選択された１種以上、またはこれらの培養物の薬学的有効量を心血管疾患の予防または治療を必要とする個体に投与する段階を含む、心血管疾患の予防または治療方法を提供する。

前記心血管疾患は、心血管異常で生じる病気であって、全ての虚血性心血管疾患のうちから選択でき、例えば、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、不整脈などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、幹細胞のゲノムにＡｎｇ−１遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、またはこれら全てを導入させる段階を含む、Ａｎｇ−１、ＶＥＧＦ、またはこれら全てを分泌する幹細胞の製造方法を提供する。前記幹細胞のゲノムにＡｎｇ−１遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子を導入させる段階は、エンドヌクレアーゼ（またはこれを暗号化する核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれを暗号化する核酸分子）によって行われるものであってもよい。前記エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＧＥＮ）であってもよい。

前記エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡは、
（１）エンドヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡが複合体を形成するリボ核タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）形態、または
（２）（ａ）エンドヌクレアーゼタンパク質またはこれを暗号化する核酸分子または前記核酸分子を含む組換えベクターと（ｂ）ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡを暗号化する核酸分子または前記核酸分子を含む組換えベクターの混合物形態
で使用（例えば、投与）できる。

他の例は、前記製造方法によって製造されたＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞を提供する。

他の例は、前記Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞製作に使用するためのエンドヌクレアーゼ（またはこれを暗号化する核酸分子）とガイドＲＮＡ（またはこれを暗号化する核酸分子）の複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを提供する。

本明細書で、‘Ａｎｇ−１分泌幹細胞’はＡｎｇ−１遺伝子が導入されてＡｎｇ−１を分泌する幹細胞を意味し、‘ＶＥＧＦ分泌幹細胞’はＶＥＧＦ遺伝子が導入されてＶＥＧＦを分泌する幹細胞を意味し、‘Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞’は前記Ａｎｇ−１分泌幹細胞およびＶＥＧＦ分泌幹細胞の混合物またはＡｎｇ−１遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子が導入されてＡｎｇ−１およびＶＥＧＦを同時に分泌する幹細胞を意味することができる。本明細書で、前記‘Ａｎｇ−１分泌幹細胞’、‘ＶＥＧＦ分泌幹細胞’および‘Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞’を総称して‘Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞’と称することができる。

本明細書で、Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞は血管生成促進（血管生成率増加および／または血管生成因子生産増加など）および／または虚血性細胞死阻害効果を有し、心血管疾患の予防、症状緩和または改善、治療などの効果を有する。前記Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞によって治療可能な心血管疾患は全ての虚血性心血管疾患であり得、例えば、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、脳卒中などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。

前記個体は、虚血性細胞死症状または心血管疾患を患っている人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物または前記哺乳動物から分離された細胞（心筋または心血管細胞）または組織（心臓組織）またはこれらの培養物のうちから選択でき、例えば、虚血性細胞死症状または心血管疾患を患っている人間またはこれから分離された心筋または心血管細胞、心臓組織、またはこれらの培養物のうちから選択できる。

本明細書で提供される有効成分であるＡｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞またはこれを含む薬学組成物は経口投与または非経口投与の多様な投与経路で投与対象に投与でき、投与経路は皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）、腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、骨髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ）、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、リンパ管内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ）、腹膜内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、または病変組織内などから適切に選択できる。例えば、前記有効成分であるＡｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌幹細胞またはこれを含む薬学組成物は個体の病変部位（例えば、心臓（心筋、心血管など）など）に注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、輸血（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）、挿入（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のような、任意の便利な方式で投与されるか、血管投与（静脈投与または動脈投与）、などの投与経路で投与できるが、これに制限されるのではない。

本明細書で提供される薬学組成物は、通常の方法によって剤形化された、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、または懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液、移植用製剤などの非経口用剤形などに剤形化して使用できる。

本発明の幹細胞または薬学組成物使用量は治療対象の年齢、性別、体重によって異にすることができ、何よりも、治療対象個体の状態、治療対象癌の特定のカテゴリーまたは種類、投与経路、使用される治療剤の属性、および前記特定の治療剤に対する感受性などに依存的であることがあり、これを考慮して適切に処方できる。例えば、前記幹細胞の１回投与量（所定の所望する効果を得るための薬学的有効量）は投与対象個体の体重１ｋｇ当り１×１０^３〜１×１０^９個、例えば、１×１０^４〜１×１０^９個、１×１０^４〜１×１０^８個、１×１０^５〜１×１０^７個または１×１０^５〜１×１０^６個の量で投与できるが、これに制限されるのではない。

アンジオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１；Ａｎｇ−１）は、血管生成に重要な役割を果たすタンパク質であって、人間Ａｎｇ−１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１４６．４）などからなる哺乳類由来Ａｎｇ−１のうちから選択された１種以上であってもよい。血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）は、血管生成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に重要な役割を果たすタンパク質であって、人間ＶＥＧＦ（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１７１６２３．１）などからなる哺乳類由来ＶＥＧＦのうちから選択された１種以上であってもよい。

本発明において、幹細胞は哺乳類、例えば、人間由来の幹細胞であってもよい。また、前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を全て包括する意味として使用でき、例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、および前駆細胞らからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記幹細胞は、同種由来の幹細胞および／または自己由来の幹細胞であってもよい。

胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は受精卵に由来する幹細胞であって、全ての組織の細胞に分化できる特性を有する幹細胞である。

前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は幹細胞と同様に特定類型の細胞に分化できる能力を有するが、幹細胞より特異的であり標的化されており、幹細胞とは異なり分裂回数が有限である。前記前駆細胞は中胚葉由来の前駆細胞であってもよいが、これに制限されるのではない。本明細書で、前駆細胞は幹細胞範疇に含まれ、特別な言及がない限り‘幹細胞’は前駆細胞も含む概念として解釈される。

成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は臍帯、臍帯血（へその緒血液）または成人の骨髄、血液、神経などから抽出した幹細胞であって、具体的臓器の細胞に分化する直前の原始細胞を意味する。前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記成体幹細胞は、哺乳類、例えばヒトの成体幹細胞であってもよい。成体幹細胞は、増殖が難しくて容易に分化される傾向が強いが、その代わり様々な種類の成体幹細胞を使用して実際医学で必要とする多様な臓器再生をすることができるだけでなく、移植された後に各臓器の特性に合うように分化できる特性を有していて、難治の病／不治の病の治療に有利に適用できる。

一例で、前記成体幹細胞は、哺乳類由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）、例えばヒトの間葉系幹細胞であってもよい。間葉系幹細胞は中胚葉基質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）とも呼ばれ、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）などのような多様な形態の細胞に分化できる多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）を意味する。中胚葉幹細胞は、胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、成体筋肉（ａｄｕｌｔ ｍｕｓｃｌｅ）、角膜基質（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ）、乳歯の歯髄（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ）などのような非骨髄組織（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ ｔｉｓｓｕｅｓ）に由来する多能性細胞のうちから選択されたものであってもよい。一例で、前記間葉系幹細胞は、哺乳類由来、例えば、ヒトの臍帯間葉系幹細胞であってもよい。

前記遺伝子導入はＡｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ遺伝子が幹細胞のゲノム内に挿入されることを意味することができ、例えば、幹細胞のゲノム中のＡＡＶＳ１などのようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位に挿入されることを意味することができる。セーフハーバー遺伝子はこの部分のＤＮＡが損傷（切断、および／またはヌクレオチドの欠失、置換、または挿入など）されても細胞損傷を誘発しない安全な遺伝子部位を意味するものであって、例えば、ＡＡＶＳ１（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ；例えば、人間染色体１９（１９ｑ１３）に位置するＡＡＶＳ１など）などであってもよいが、これに制限されるのではない。

前記Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、動物細胞のゲノム内への遺伝子導入に通常使用される全ての遺伝子操作技術を通じて行うことができる。一例で、前記遺伝子操作技術は、エンドヌクレアーゼを使用するものであってもよい。前記エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと共に使用されて標的特異的エンドヌクレアーゼ活性を示すことができ、先に説明したようにセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位を標的にするものであってもよい。

前記エンドヌクレアーゼは、幹細胞ゲノムの特定遺伝子の特定位置を切断して、ここに外来遺伝子（Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ遺伝子）が挿入されるようにする役割を果たす。

本明細書に使用されたものとして、前記エンドヌクレアーゼは、遺伝子はさみ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）とも呼ばれ、目的とするゲノムＤＮＡ上の特定位置を認識して切断（単一鎖切断または二重鎖切断）することができる全ての形態のエンドヌクレアーゼをひっくるめて称する。前記エンドヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法で非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記エンドヌクレアーゼは、真核細胞の核内伝達のために通常使用される要素（例えば、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）など）を追加的に含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記エンドヌクレアーゼは精製されたタンパク質形態で使用されるか、これを暗号化するＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含む組換えベクターの形態で使用できる。

前記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ；ＦｏｋＩタンパク質）ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）およびＴＡＬＥ−ヌクレアーゼからなる群より選択された一つ以上であってもよい。一具体例で、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であってもよい。

より具体的に、前記標的特異的エンドヌクレアーゼは、
ゲノム上の特定標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来したＴＡＬフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断ドメインが融合されたＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）；
微生物免疫系であるＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１、など）；
ＡＧＯホモログ（Ａｇｏ ｈｏｍｏｌｏｇ、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）
などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記標的特異的エンドヌクレアーゼは、原核細胞、および／または人間細胞をはじめとする動植物細胞（例えば、真核細胞）のゲノムで特定塩基配列を認識して二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を起こすことができる。前記二重鎖切断はＤＮＡの二重鎖を切断して、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）または粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生成させることができる。ＤＳＢは細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構によって効率的に修復でき、この過程に所望の変異を標的位置に導入することができる。

前記メガヌクレアーゼは、これに制限されるのではないが、自然発生メガヌクレアーゼであってもよく、これらは１５〜４０個の塩基対の切断部位を認識し、これは通常４個のファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリー。例示的なメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。

自然発生メガヌクレアーゼ、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに由来するＤＮＡ結合ドメインを用いて植物、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物細胞およびマウスで位置特異的ゲノム変形が促進されたが、このような接近法はメガヌクレアーゼ標的配列が保存された相同性遺伝子の変形（Ｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）であって、標的配列が導入される事前操作されたゲノムの変形には限界があった。したがって、医学的にも生命工学的にも関連する部位で新規な結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みがあった。また、メガヌクレアーゼに由来する自然発生されたまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインが異種性ヌクレアーゼ（例、ＦｏｋＩ）に由来する切断ドメインに作動可能に連結された。

前記ＺＦＮは、選択された遺伝子、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインの標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質を含む。前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含む人工的な制限酵素であってもよい。ここで、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されたものであってもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６が本明細書参考資料として含まれ得る。自然発生されたジンクフィンガータンパク質と比較して、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは新規な結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計および多様なタイプの選択を含むが、これに限定されない。合理的設計は、例えば三重（または四重）ヌクレオチド配列、および個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの利用を含み、この時、各三重または四重ヌクレオチド配列は特定三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの一つ以上の配列と連合される。

標的配列の選択、融合タンパク質（およびそれを暗号化するポリヌクレオチド）の設計および構成は当業者に公知されており、参考資料として米国特許出願公開２００５／００６４４７４および２００６／０１８８９８７の全文に詳しく説明され、前記公開特許の全文が本発明の参考資料として本明細書に含まれる。また、このような参考文献および当業界の他の文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／または多重フィンガージンクフィンガータンパク質が任意の適切なリンカー配列、例えば５個以上のアミノ酸長さのリンカーを含むリンカーによって共に連結できる。６個以上のアミノ酸長さのリンカー配列の例は米国登録特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；７，１５３，９４９を参照する。ここに説明されたタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。

また、ＺＦＮのようなヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性部分（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含む。周知の通り、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼやエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来できる例示的なエンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。

同様に、切断ハーフドメインは、前記提示されたように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはそれの一部に由来できる。融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、一般に２個の融合タンパク質が切断に必要である。代案として、２個の切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が用いられてもよい。２個の切断ハーフドメインは同一なエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来するものであってもよく、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来するものであってもよい。また、２個の融合タンパク質の標的部位は、２個の融合タンパク質とその各標的部位の結合によって切断ハーフドメインが互いに対して空間的に配向されて位置することによって、切断ハーフドメインが、例えば二量体化によって機能性切断ドメインを形成することができるようにする関係で配置されるのが好ましい。したがって、一実施形態で、３〜８個のヌクレオチドまたは１４〜１８個のヌクレオチドによって標的部位の隣接の縁が分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２個の標的部位の間に介されてもよい（例、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合して（標的部位で）、直ちに結合部位やその近所でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ）は認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドで、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドでＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。したがって、一実施形態で、融合タンパク質は少なくとも１個のＴｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と一つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメイン（操作されてもよく、そうでなくてもよい）を含む。

“ＴＡＬＥＮ”は、ＤＮＡのターゲット領域を認識および切断することができるヌクレアーゼを示す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥドメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を示す。本発明で、“ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ”および“ＴＡＬＥＮ”という用語は互換が可能である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）バクテリアが多様な植物種に感染する時にこれらのタイプＩＩＩ分泌システムを通じて分泌されるタンパク質と知られている。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列と結合してバクテリア感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の多様な数のアミノ酸反復で構成された中心反復ドメインを通じて植物ＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥは、ゲノムエンジニアリングのツールのための新規プラットフォームになり得るとされる。但し、ゲノム編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するために次のように現在まで知られなかった少数の主要媒介変数が定義されなければならない。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン、ｉｉ）一つのターゲット領域を構成する２個の半分−位置の間のスペーサの長さ、およびｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリンカーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）。

本発明のＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ反復モジュールを通じて配列特異的方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを指す。前記ＴＡＬＥドメインは少なくとも一つのＴＡＬＥ反復モジュール、より具体的には１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含むが、これに限定されない。本発明で、“ＴＡＬエフェクタードメイン”および“ＴＡＬＥドメイン”という用語は互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの半分を含むことができる。前記ＴＡＬＥＮに関連して国際公開特許ＷＯ／２０１２／０９３８３３号または米国公開特許２０１３−０２１７１３１号に開示された内容全文が本明細書に参考資料として含まれる。

一例で、前記Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ暗号化遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ）を使用して行うことができる。前記エンドヌクレアーゼは、
（１）ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（またはそのコーディングＤＮＡ、または前記コーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および
（２）標的遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）位置）の標的部位（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子内の連続する１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２個のヌクレオチド長さの核酸部位）と混成化可能な（または相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡ（またはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）
を含むものであってもよい。

前記エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識しヌクレオチド切断活性を有し標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができる全てのヌクレアーゼから選択された１種以上であってもよい。

一具体例で、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９））、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）などのようなタイプＩＩおよび／またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。この場合、前記エンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡを追加的に含む。前記ガイドＲＮＡは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、例えば、オリゴヌクレオチド二重鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。前記エンドヌクレアーゼは、生体（細胞）外でまたは生体（細胞）内伝達後、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸−タンパク質複合体を形成（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形態で作用できる。

Ｃａｓタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。

Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、
ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））；
カンピロバクター属、例えば、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）またはストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質；
フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質
などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記遺伝子の特定位置の切断がＣａｓ９タンパク質によって誘導される場合、前記遺伝子切断は各遺伝子の塩基配列中の由来微生物によるＣａｓ９タンパク質固有のＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列の５’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜３０ｂｐの塩基配列部位でのＰＡＭ配列３ｂｐの前方のヌクレオチドの切断、例えば、単一鎖または二重鎖切断であってもよい。

一例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＧＧ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜３０ｂｐまたは１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２０ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がカンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

他の例で、前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３’（Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）は任意に含むことができる配列を意味する）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

Ｃｐｆ１タンパク質は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新たなＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さくてｔｒａｃｒＲＮＡが必要なく、単一ガイドＲＮＡによって作用できる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を認識しＤＮＡの二重鎖を切断して粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生成する。

例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダツスメタノプラズマ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであってもよく、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであってもよいが、これに制限されるのではない。

エンドヌクレアーゼとしてＣｐｆ１タンパク質が使用される場合、前記ＰＡＭ配列は５’−ＴＴＮ−３’（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、前記切断される塩基配列部位（標的部位）は標的遺伝子内の５’−ＴＴＮ−３’配列の５’末端または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２１ｂｐ〜２３ｂｐの塩基配列部位であってもよい。

前記エンドヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記エンドヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で使用できる。一例で、前記エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）によって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＡＮは、多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させてエンドヌクレアーゼを生産（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコーディングするコドンのうちから前記有機体に発現するに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであってもよい。

本明細書で使用された前記標的特異的ヌクレアーゼは、変異された形態の変異標的特異的ヌクレアーゼであってもよい。前記変異標的特異的ヌクレアーゼはＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味することができ、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼのうちから選択された１種以上であってもよい。このような標的特異的ヌクレアーゼの変異（例えば、アミノ酸置換など）は、少なくともヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こるものであってもよい。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）；配列番号４）である場合、前記変異は、触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；例えば、配列番号４の場合、１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、配列番号４の７６２番目位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群より選択された一つ以上任意の他のアミノ酸で置換された突然変異を含むことができる。この時、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

他の例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するように変異されたものであってもよい。例えば、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の１１３５番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、および１３３７番目位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうちの一つ以上、例えば、３個が全て他のアミノ酸で置換されて、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と異なるＮＧＡ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣのうちから選択された任意の塩基である）を認識するように変異されたものであってもよい。

一例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）中、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、またはＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；または
（３）（１）と（２）残基全て
でアミノ酸置換が起こったものであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、ライシン、前記アミノ酸の公知された全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元の変異位置に有するアミノ酸を除いたアミノ酸のうちから選択されたアミノ酸を意味する。一例で、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、バリン、グルタミン、またはアルギニンであってもよい。

本発明で、用語“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）”は、標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）に混成化可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または細胞）内でＣａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（または標的部位）に導く役割を果たす。

前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列と混成化可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；および
前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位およびヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）
からなる群より選択された１種以上であってもよく、
具体的に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これをＳｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどとも命名する）およびＣａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことができる。より具体的に、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのｈａｉｒｐｉｎ構造、およびＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列を含むことができる。前述の構造は５’から３’の順に順次に存在するものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分および標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、いかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用できる。

例えば、Ｃａｓ９タンパク質は標的遺伝子編集のために二つのガイドＲＮＡ、即ち、標的遺伝子の標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質と相互作用するｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する）を必要とし、これらｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体形態、またはリンカーを通じて連結されて単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）形態で使用できる。一例で、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは少なくとも前記ｃｒＲＮＡの混成化可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ一部または全部と前記Ｃａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９タンパク質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡ一部または全部がヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、ヌクレオチドリンカーがループ構造に該当するものであり得る）。

前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアップストリーム部位、具体的にｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上、例えば、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例で、前記ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むものであってもよく、複合体を形成するＣｐｆ１タンパク質種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

前記ガイドＲＮＡの具体的配列はヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）の種類（即ち、由来微生物）によって適切に選択することができ、これはこの発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に分かる事項である。

一例で、標的特異的ヌクレアーゼとしてストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは次の一般式１で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘ_ｃａｓ９）_ｍ−３’（一般式１）
上記一般式１で、
Ｎ_ｃａｓ９は標的化配列、即ち、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）の配列によって決定される部位（標的部位の標的配列と混成化可能）であり、ｌは前記標的化配列に含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２の整数、例えば２０であってもよく、
前記標的化配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）（配列番号１）を含む部位はｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｘ_ｃａｓ９はｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（即ち、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｍは８〜１２の整数、例えば、１１であってもよく、前記ｍ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、それぞれ独立してＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群より選択できる。

一例で、前記Ｘ_ｃａｓ９はＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）を含むことができるが、これに制限されない。

また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、次の一般式２で表現できる：
５’−（Ｙ_ｃａｓ９）_ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）
上記一般式２で、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）（配列番号３）で表された部位は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｙ_ｃａｓ９は前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｐは６〜２０の整数、例えば、８〜１９の整数であってもよく、前記ｐ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

また、ｓｇＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個ヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分がオリゴヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に該当する）。より具体的に、前記ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分が互いに結合された二重鎖ＲＮＡ分子で、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを通じて連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。

一例で、ｓｇＲＮＡは、次の一般式３で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）
上記一般式３で、（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌは標的化配列であって、先に一般式１で説明したとおりである。

前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは３〜５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであってもよく、前記ヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含むことができる。

前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の５’に隣接して位置する約１７個〜約２３個または約１８個〜約２２個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列と混成化可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

他の例で、エンドヌクレアーゼがＣｐｆ１システムである場合、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は次の一般式４で表現できる：
５’−ｎ１−ｎ２−Ａ−Ｕ−ｎ３−Ｕ−Ｃ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｕ−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−Ｇ−Ｕ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ−（Ｎｃｐｆ１）ｑ−３’（一般式４）。

上記一般式４で、
ｎ１は存在しないか、Ｕ、Ａ、またはＧであり、ｎ２はＡまたはＧであり、ｎ３はＵ、Ａ、またはＣであり、ｎ４は存在しないかＧ、Ｃ、またはＡであり、ｎ５はＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、または存在せず、ｎ６はＵ、ＧまたはＣであり、ｎ７はＵまたはＧであり、
Ｎｃｐｆ１は遺伝子標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列を含むターゲッティング配列であって標的遺伝子の標的配列によって決定され、ｑは含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０の整数であってもよい。前記標的遺伝子の標的配列（ｃｒＲＮＡと混成化する配列）はＰＡＭ配列（５’−ＴＴＮ−３’または５’−ＴＴＴＮ−３’；Ｎは任意のヌクレオチドであって、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの塩基を有するヌクレオチドである）の３’方向に隣接して位置する（例えば、連続する）１５〜３０個の標的遺伝子の標的部位のヌクレオチド配列である。

前記一般式４で、５’末端からカウンティングして６番目から１０番目までの５個のヌクレオチド（５’末端ステム部位）と１５番目（ｎ４が存在する場合、１６番目）から１９番目（ｎ４が存在する場合、２０番目）までの５個ヌクレオチド（３’末端ステム部位）は互いに逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）なように相補的ヌクレオチドからなって二重鎖構造（ステム構造）を形成し、前記５’末端ステム部位と３’末端ステム部位の間の３〜５個ヌクレオチドがループ構造を形成することができる。

前記Ｃｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ（例えば、一般式４で表現される）は、５’末端に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

Ｃｐｆ１由来微生物によって使用可能なＣｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ配列の５’末端部位配列（ターゲッティング配列部位除いた部分）を表１に例示的に記載した：

本明細書で、遺伝子標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列は、遺伝子標的部位のヌクレオチド配列（標的配列）と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味する（以下、特別な言及がない限り、同一な意味として使用され、前記配列相同性は通常の配列比較手段（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して確認できる）。

前記方法で、前記ガイドＲＮＡとＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の細胞内への形質導入は、前記ガイドＲＮＡとＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼを通常の方法（例えば、電気穿孔など）で直接細胞に導入するか、前記ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ分子とＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼを暗号化する遺伝子（またはこれと８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の塩基配列相同性を有する遺伝子）を一つのベクターまたはそれぞれ別個のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）に含まれている状態で細胞に導入するか、ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙを通じて行うことができる。

一例で、前記ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶ））、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）のような陰性鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（例えば、狂犬病および小胞性口炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹およびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）およびピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）のような陽性鎖ＲＮＡウイルス、およびヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１および２、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）−バー（Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、アデノウイルスを含む二重鎖のＤＮＡウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、牛痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）およびカナリア痘瘡（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））などからなる群より選択されたものであってもよい。

前記Ｃａｓ９タンパク質暗号化核酸分子、ガイドＲＮＡ暗号化核酸分子、またはこれらのうちの一つ以上を含むベクターは、それぞれ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、ウィルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）だけでなくＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法など当業界に公知された多様な方法を使用して細胞内に伝達でき、細胞の核内伝達のために、前記Ｃａｓ９タンパク質および／またはガイドＲＮＡは適切な核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を追加的に含むことができる。

本明細書に使用された標的部位の“切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）”は、ポリヌクレオチドのｃｏｖａｌｅｎｔ ｂａｃｋｂｏｎｅの破損（ｂｒｅａｋａｇｅ）を意味する。切断はホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これに制限されず、その他の多様な方法によって行うことができる。単一鎖の切断および二重鎖の切断が全て可能であり、二重鎖の切断は二つの区別される（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）単一鎖の切断の結果として発生できる。二重鎖の切断は、ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｓまたはｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄを生成することができる。

本発明の心筋梗塞または下肢虚血モデルで血管の生成と再生は必須であるが、これを促進できる方法の開発が至急であった。したがって、本発明のＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌幹細胞は、心筋梗塞、下肢虚血などの心血管疾患で血管の再生を助けてその予防および治療に有用に使用することができる。

Ａｎｇ−１分泌臍帯間葉系幹細胞を作るためのベクター構成図および製作後、この細胞からＡｎｇ−１の分泌をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびＥＬＩＳＡで確認した結果である。 ＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞を作るためのベクター構成図および製作後、この細胞らからＶＥＧＦの分泌をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびＥＬＩＳＡで確認した結果である。 Ａｎｇ−１またはＶＥＧＦ分泌細胞製作用ベクターを伝達するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを製作してＪｕｒｋａｔ細胞で移入率の増加などを確認した図である。 Ａｎｇ−１またはＶＥＧＦ分泌細胞製作用ベクターを伝達するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを製作してＪｕｒｋａｔ細胞で移入率の増加などを確認した図である。 下肢虚血モデルにＡＮＧ−１分泌臍帯間葉系幹細胞またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞を処理した場合の下肢損傷程度を確認した観察した結果を示した図である。 Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞の投与時の心筋細胞の生存率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を示す結果である。 Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞の投与時の血管生成程度を示す結果である。 Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞の投与時の主要因子の発現水準を示す結果である。 心筋梗塞モデルにＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞をそれぞれまたは共に処理したラットの心臓の線維化程度、Ｓｃａｒ Ａｒｅａ（％ ｏｆ ＬＶ（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）ａｒｅａ）、Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（ｍｍ）、およびＬＶ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘを示す結果である。 心筋梗塞モデルと心筋梗塞モデルにＡｎｇ−１−ＭＳＣとＶＥＧＦ−ＭＳＣと共に処理したラットの心臓の拍動量の算出をＣＩＮＥ−ｆ−ＭＲＩ技法で生体で観察した様子を示す写真である。 心筋梗塞モデルと心筋梗塞モデルにＡｎｇ−１−ＭＳＣとＶＥＧＦ−ＭＳＣと共に処理したラットの梗塞部位の大きさを示すグラフである。 心筋梗塞モデルにＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞をそれぞれまたは共に処理したラットの心臓の血管生成程度を観察した蛍光写真である。

以下、本発明の実施形態を示す。
（１）ＶＥＧＦ遺伝子が挿入されてＶＥＧＦを分泌するＶＥＧＦ分泌間葉系幹細胞およびＡｎｇ−１遺伝子が挿入されてＡｎｇ−１を分泌するＡｎｇ−１間葉系幹細胞からなる群より選択された１種以上の間葉系幹細胞、または前記間葉系幹細胞の培養物を含む、血管生成用薬学組成物。
（２）ＶＥＧＦ遺伝子が挿入されてＶＥＧＦを分泌するＶＥＧＦ分泌間葉系幹細胞およびＡｎｇ−１遺伝子が挿入されてＡｎｇ−１を分泌するＡｎｇ−１間葉系幹細胞からなる群より選択された１種以上の間葉系幹細胞、または前記間葉系幹細胞の培養物を含む、虚血性細胞死阻害用薬学組成物。
（３）ＶＥＧＦ遺伝子が挿入されてＶＥＧＦを分泌するＶＥＧＦ分泌間葉系幹細胞およびＡｎｇ−１遺伝子が挿入されてＡｎｇ−１を分泌するＡｎｇ−１間葉系幹細胞からなる群より選択された１種以上の間葉系幹細胞、または前記間葉系幹細胞の培養物を含む、心血管疾患の予防または治療用薬学組成物。
（４）前記心血管疾患は、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、または不整脈である、（３）に記載の心血管疾患の予防または治療用薬学組成物。
（５）前記間葉系幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞である、（１）〜（４）のうちのいずれか一に記載の薬学組成物。
（６）前記ＶＥＧＦ遺伝子およびＡｎｇ−１遺伝子は、間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたものである、（１）〜（４）のうちのいずれか一に記載の薬学組成物。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例はひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者において自明である。

実施例１：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを用いたＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ分泌細胞製作
１．１．Ａｎｇ−１分泌細胞製作
ｐＺＤｏｎｏｒ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にＡｎｇ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１４６．４）を挿入して、Ａｎｇ−１発現のための組換えベクターを製作した（図１参照）。また、ＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（（株）ＴｏｏｌＧｅｎ）を準備した（Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質；ＡＡＶＳ１を標的とするｓｇＲＮＡのターゲッティング配列：ｇｕｃａｃｃａａｕｃｃｕｇｕｃｃｃｕａｇ；全体配列は先に記載された一般式３参照）。

前記準備されたＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとＡｎｇ−１の遺伝子を含むｐＺＤｏｎｏｒをヒトの臍帯間葉系幹細胞に共にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。前記臍帯間葉系幹細胞は次の過程で準備した：ヒトの臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）をｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅで処理した後、遠心分離して溶液を除去し、Ｔ２５フラスコに入れて５％ＣＯ_２が供給される３７℃培養器で培養した。７日後、フラスコに付着した細胞に対しては染色体検査を行い、付着しない細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｉｎｇ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｃｅｌｌｓ）に対しては培養液を２０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と４ｎｇ／ｍＬ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒが添加されたｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍで交替してＴ２５フラスコに移して培養を始め、５〜７日後に細胞が底によく付着、増殖しているかを確認した後、細胞が安定的に増殖し始めれば培養液を交替し、その後８０％融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで一週間に二回ずつ培養液を交替して培養した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは細胞遺伝子中のＡＡＶＳ ｓｉｔｅを切断することによって所望の遺伝子（即ち、Ａｎｇ−１遺伝子）を切断部位の間に挿入するようになり、これによってＡｎｇ−１を分泌する臍帯間葉系幹細胞（Ａｎｇ−１−ＭＳＣ）が作られた。前記製作されたＡｎｇ−１−ＭＳＣのＡｎｇ−１分泌有無をウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、および蛍光免疫染色（Ｆｌａｇ）で試験し、その結果を図１に示した。

１．２．ＶＥＧＦ分泌細胞製作
ｐＺＤｏｎｏｒ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にＶＥＧＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１７１６２３．１）を挿入してＶＥＧＦ発現のための組換えベクターを製作して製作した（図２）。また、ＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（（株）ＴｏｏｌＧｅｎ）を準備した（Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質；ＡＡＶＳ１標的とするｓｇＲＮＡのターゲッティング配列：ｇｕｃａｃｃａａｕｃｃｕｇｕｃｃｃｕａｇ；全体配列は先に記載された一般式３参照）。

前記準備されたＡＡＶＳ１を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰとＶＥＧＦの遺伝子を含むｐＺＤｏｎｏｒをヒトの臍帯間葉系幹細胞（実施例１．１参照）に共にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは細胞遺伝子中のＡＡＶＳ ｓｉｔｅを切断することによって所望の遺伝子（即ち、ＶＥＧＦ遺伝子）を切断部位の間に挿入するようになり、これによってＶＥＧＦを分泌する臍帯間葉系幹細胞（ＶＥＧＦ−ＭＳＣ）が作られた。前記製作されたＶＥＧＦ−ＭＳＣのＶＥＧＦ分泌有無をウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、および蛍光免疫染色（Ｆｌａｇ）で試験し、その結果を図２に示した。

前記試験は、次の通り行った：
−ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｔｒｉｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した後、ｏｌｉｇ−ｄＴ ｐｒｉｍｅｒと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は４２℃で１時間行い、９５℃で１０分間反応して酵素活性を停止させた。確認しようとする遺伝子のｐｒｉｍｅｒを製作した後、ＰＣＲを行った（プライマー：Ｆｗｄ：５’−ｃｇｇａａｃｔｃｔｇｃｃｃｔｃｔａａｃｇ−３’；Ｒｅｖ：５’−ｔｇａｇｇａａｇａｇｔｔｃｔｔｇｃａｇｃｔ−３’）。

−Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
分離されたタンパク質溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法で確認した後、一定量のタンパク質溶液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて電気泳動した後、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅでｔｒａｎｓｆｅｒした。１次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１２時間反応させ、反応が終わると１次抗体を洗浄した後、ＨＲＰが結合された２次抗体と常温で１時間反応させた。反応が終わるとＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でタンパク質発現有無を分析した。

−免疫細胞化学−蛍光染色
固定された細胞を４℃で１２時間１次抗体と反応させた後に洗浄し常温で１時間ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧと反応させた。このように染色された細胞はｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅの上に置いた後、Ｚｅｉｓｓ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで観察した。

また、前記準備されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ（ＴｏｏｌＧｅｎ）の遺伝子編集（Ｉｎｄｅｌ：挿入および／または欠失）効率をＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）で試験して、その結果を図３ａおよび３ｂに示した。

（図３ａおよび３ｂで、
ｎｏｎｅ：何もなくｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ進行；
ｓｇＲＮＡ＃１：５’−ＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧ（ＴＧＧ）−３’（ｈＡＡＶＳ１＃１；括弧の中はＰＡＭ配列である）を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のみ処理して進行；
ｓｇＲＮＡ＃２：５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡ（ＧＧＧ）−３’（ｈＡＡＶＳ１＃２；括弧の中はＰＡＭ配列である）を標的とするｓｇＲＮＡのみ処理して進行；
Ｓｐ．ｃａｓ９ ｏｎｌｙ：Ｃａｓ９タンパク質（配列番号４）のみ処理して進行；
ａＲＧＥＮ１：ｈＡＡＶＳ１＃１を標的とするｓｇＲＮＡ＃１とＣａｓ９タンパク質を処理して進行；
ａＲＧＥＮ２：ｈＡＡＶＳ１＃２を標的とするｓｇＲＮＡ＃２とＣａｓ９タンパク質を処理して進行；
ｄＲＧＥＮ１：ｈＡＡＶＳ１＃１を標的とするｓｇＲＮＡ＃１とＣａｓ９タンパク質をコーディングするプラスミドを処理して進行；
ｄＲＧＥＮ２：ｈＡＡＶＳ１＃２を標的とするｓｇＲＮＡ＃２とＣａｓ９タンパク質をコーディングするプラスミドを処理して進行）。

図３ａおよび３ｂで確認されるように、ＲＮＰ形態がプラスミド形態より細胞内伝達効率および遺伝子編集効率が優れるのを確認することができる。

実施例２：心筋細胞保護効果
２．１．人間心筋細胞培養
人間心筋細胞（ＡＴＣＣ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）を５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５％（ｖ／ｖ）ＨＳ（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢが添加されたＤＭＥＭ（培養培地）に懸濁させ、１０ｃｍ培養皿に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１０ｍｌ）でプレートした後、５％ＣＯ２／９５％大気下の培養器で３７℃で維持した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養２〜３週後、ＡＧＥ−アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した後にアポトーシス−関連特性のために使用した。

２．２．細胞生存率（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）測定
前記実施例２．１で準備された人間心筋細胞を９６−ウェル培養プレートにウェル当り２×１０^３細胞で接種した。８０％融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達した後、一次人間心筋細胞にＡＧＥ−アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｎＭを２４時間処理した。その後、Ａｎｇ−１−ＭＳＣ（Ａｎｇ−１分泌臍帯間葉系幹細胞）またはＶＥＧＦ−ＭＳＣ（ＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞）（前記実施例１参照）を処理して２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞生存率をＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］ａｓｓａｙを用いて測定した。黄色ＭＴＴ化合物は生きている細胞によってジメチルスルホキシド（Ｍｅ_２ＳＯ）に溶解される青色ｆｏｒｍａｚｅｎに変換される。０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを各ウェルに添加して２時間培養し、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。培養培地での青色染色強度（吸光度）は９６−ウェルプレートリーダー（ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて５４０ｎｍで測定し、生存細胞の比例量（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ａｍｏｕｎｔ）で示した。

結果は図５ａ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ結果；細胞生存率）および５ｂ（立体光学顕微鏡で観察した結果；血管生成率）に示した（ＧＦＰ：ＧＦＰ−ＭＳＣ、ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−ＭＳＣ、ＡＮＧ１：ＡＮＧ１−ＭＳＣ、ＶＥＧＦ＋ＡＮＧ１：ＶＥＧＦ−ＭＳＣとＡＮＧ１−ＭＳＣの混合物、およびｒｈＶＥＧＦ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍ））。

図５ａおよび５ｂに示されているように、人間心筋細胞にＡＧＥ−アルブミンを処理した場合、細胞生存率が減少し細胞死が誘導されるのを確認した。反面、一次人間心筋細胞にＡＮＧ−１および／またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞を処理した場合、細胞生存率および血管生成率が増加するのを確認した。また、組換えタンパク質であるｒｈＶＥＧＦと比較して、ＶＥＧＦ−ＭＳＣの血管生成効果が顕著に優れるのを確認し、これはＶＥＧＦ−ＭＳＣでの持続的なＶＥＧＦ分泌に起因することを意味するものと言える。

このような結果は、ＡＮＧ−１またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞が心筋細胞死に対して保護効果（心筋細胞死阻害効果）を有するのと、このような効果はＡＮＧ−１またはＶＥＧＦがタンパク質形態で使用される場合より優れるのを示す。

２．３．血管生成因子測定（ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ））
前記実施例２．２で各幹細胞処理された心筋細胞を液体窒素を通じて粉末化した後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｂｃａｍ）でｌｙｓｉｓ行った後、遠心分離してｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔを取って、幹細胞処理された心筋細胞からタンパク質溶液を分離した。ＢＣＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造会社使用説明によって前記タンパク質溶液のタンパク質濃度を確認した後、一定量のタンパク質溶液（Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ量：３０ｕｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて電気泳動した後、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅでｔｒａｎｓｆｅｒした。１次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１２時間反応させ、反応が終わると１次抗体を洗浄した後、ＨＲＰが結合された２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と常温で１時間反応させた。反応が終わるとＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でタンパク質発現有無を分析した。その結果を図５ｃに示した。図５ｃに示されているように、ＡＮＧ−１および／またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞処理時、血管の生成に必須的なＡｋｔとｐ−ＥＲＫ１／２の増加が最も目立った。

実施例３：心筋梗塞モデル心筋細胞死に対するＡｎｇ−１−ＭＳＣまたはＶＥＧＦ−ＭＳＣの保護効果（ｉｎ ｖｉｖｏ実験）
３．１．心筋梗塞動物モデル製作
重量が２５０−３００ｇの白ネズミ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を準備してケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）（５０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（４ｍｇ／ｋｇ）を混合して麻酔した。実験動物の気管に１６ｇａｕｇｅのカテーテル（ｃａｔｈｅｔｅｒ）を挿入して人工呼吸器と連結し、平らな板に横たえてテープで手足と尻尾を固定した後に胸骨の左側で１〜１．５ｃｍ程度皮膚を縦に切開して大胸筋（ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ ｍａｊｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）と小胸筋の間を広げて五番目肋骨間空間を確認し、注意して肋間筋を横に１ｃｍ程度切開した。五番目、六番目肋骨の間に開創器（ｒｅｔｒａｃｔｏｒ）を入れて上下に広げた後、通常白ネズミで胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）が心臓上部を覆って視野を遮るのでａｎｇｌｅ ｈｏｏｋなどを用いて頭側に胸腺を引いた。左心臓動脈（ｌｅｆｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）の形態を観察してどの範囲の血管枝を縛るか決定した後に肺動脈円錐（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｏｎｕｓ）と左心耳（ｌｅｆｔ ａｔｒｉａｌ ａｐｐｅｎｄａｇｅ）の尖った部分が交差する線の２〜３ｍｍの下に位置するＬＡＤ（Ｌｅｆｔ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｒｔｅｒｙ）を６−０ ｓｉｌｋで縛った。広げられた五番目、六番目肋骨を再び集め、切開した肋間筋をＭＡＸＯＮ ４−０ ｆｉｌａｍｅｎｔで縛った後、胸腔に残っている空気を２３ Ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅ注射器で抜いて肺が完全に広がるようにした。皮膚をＭＡＸＯＮ ４−０ ｆｉｌａｍｅｎｔを用いて縫合し、気管挿管したチューブを取り出して咽頭についている粘液を除去した。手術後に鎮痛剤（（Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ０．０２５ｍｇ／ｋｇ）を１２時間ごとに皮膚注射した。

３．２．Ａｎｇ−１−ＭＳＣまたはＶＥＧＦ−ＭＳＣの保護効果
前記準備された心筋梗塞動物モデルに前記実施例のＡｎｇ−１分泌臍帯間葉系幹細胞（Ａｎｇ−１−ＭＳＣ）および／またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞（ＶＥＧＦ−ＭＳＣ）を注入した後（注入量：それぞれ３０ｕｌ、１×１０^６個の細胞含む）、心筋細胞の数をクレシルバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ）で染色した後に顕微鏡で観察した。

前記観察結果を図６に示した。図６の図面方向基準で上部写真は心臓組織の染色写真を示すものであり、左側グラフは梗塞部位を定量化したＳｃａｒ Ａｒｅａ（％ ｏｆ ＬＶ（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）ａｒｅａ）結果を示す結果であって、その数値が低いほど心臓の線維化程度が減少するのを示し、中間のグラフは梗塞部の厚さ（Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍｍ）を示す結果であって、その数値が高いほど心筋梗塞が回復されるのを示し、右側のグラフは心室の拡張の程度（ＬＶ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を示すグラフであって、その数値が低いほど心筋梗塞が回復されるのを示す。図６に示されているように、心筋梗塞の前または後のラットの心臓細胞で、前記Ａｎｇ−１および／またはＶＥＧＦ分泌臍帯間葉系幹細胞を投与した場合に線維化地域（青色）と心筋梗塞領域が減少するのを確認した。また、心筋梗塞治療効果がＭＳＣ＜ＡＮＧ１−ＭＳＣ＜ＶＥＧＦ−ＭＳＣ＜ＡＮＧ１−ＭＳＣ＋ＶＥＧＦ−ＭＳＣ（Ａ＋Ｖ ＭＳＣ）の順に増加するのを確認した。

また、前記心筋梗塞モデルにＡｎｇ−１−ＭＳＣおよびＶＥＧＦ−ＭＳＣを共に処理したラットの心臓の拍動量をＣＩＮＥ−ｆ−ＭＲＩ技法で生体で観察した様子を示す写真を図７ａに示し、図７ｂに梗塞部位の大きさをグラフで示した。図７ａ−７ｂに示されているように、心臓の駆出量（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ）も一般のＭＳＣに比べて顕著に増加した。

実施例４：下肢虚血モデル筋肉細胞死に対するＡｎｇ−１−ＭＳＣまたはＶＥＧＦ−ＭＳＣの保護効果（ｉｎ ｖｉｖｏ実験）
４．１．下肢虚血動物モデル製作（Ｒａｔ ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｄｅｌ）
動物は、ｍａｌｅ Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕマウスを使用した。動物モデル製作時、全ての環境は清潔で滅菌された場所で施行し、Ｎ_２Ｏ：Ｏ_２＝１：１（ｖ：ｖ）、フォラン痲酔剤吸入によって麻酔させて行った。

麻酔後、約２ｃｍほど皮膚を切開後、３−０ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｉｌｋで正確な部位に結紮（ｉｌｉａｃ ａｒｔｅｒｉｅｓあるいはｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓとｉｎｇｕｉｎａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔで５〜６ｍｍ下）した後、Ｓｋｉｎ ｃｌｉｐを用いて皮膚を閉じた。

４．２．下肢筋肉細胞死に対する保護効果
下肢虚血モデルで下肢筋肉細胞死に対するＡｎｇ−１−ＭＳＣまたはＶＥＧＦ−ＭＳＣの保護効果を確認するために、前記準備された下肢虚血モデルの組織にＡｎｇ−１−ＭＳＣ １０^６細胞を注入した後、１週間および２週間経過後にマウスの後足の様子を観察して図４に示した。

図４は、Ａｎｇ−１−ＭＳＣ、ＭＳＣ（陽性対照群）、およびＰＢＳ（陰性対照群）の投与を受けた下肢虚血モデルマウスの後足の様子を示す写真である（Ｓｈａｍ：下肢虚血が誘導されていない正常マウス）。図４に示されているように、ＭＳＣおよびＰＢＳ投与群と比較して、Ａｎｇ−１−ＭＳＣを投与したマウスの下肢筋肉細胞死が緩和されるのを確認することができる。

実施例５．免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）
正常または心筋梗塞ラット（実施例３．１）の心臓組織で免疫組織化学を行った。正常または心筋梗塞ラットの心臓組織を０．１Ｍ 中性リン酸塩緩衝溶液内の４％パラホルムアルデヒドで固定させ、３０％スクロース溶液で一晩冷凍保管した後、低温維持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９００）で１０μｍ切片を準備した。パラフィン包埋組織を１０μｍ厚さの切片に切断し、キシレンで脱パラフィンさせた後、一連の等級エタノールで再水和した。正常ヤギ血清（１０％）を使用して非特異的タンパク質結合を遮断した。組織切片を下記抗体のうちの一つと共に４℃で一晩培養した：ウサギ抗−ａｌｐｈａ−ＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ）、マウス抗−人間アルブミン抗体（１：２００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、ヤギ抗−Ｉｂａ１抗体（１：５００、Ａｂｃａｍ）。前記培養された組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ６３３ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間培養した。二次抗体をＰＢＳで３回洗浄した後、カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してガラススライドの上に設置し、レーザー共焦点蛍光顕微鏡（ＬＳＭ−７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。

前記観察結果を図８に示した。図８で確認されるように、ラットの心臓組織にＡｎｇ−１−ＭＳＣまたはＶＥＧＦ−ＭＳＣをそれぞれまたは共に処理した場合、血管生成を示すａｌｐｈａ−ＳＭＡ因子の染色が最も強く示された。

Claims (6)

1. VEGF分泌間葉系幹細胞及びAng-1分泌間葉系幹細胞、又は前記間葉系幹細胞の培養物を含む、血管生成用薬学組成物であって、
   前記VEGF分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたVEGF遺伝子を含有し、且つ、VEGFを分泌するものであり、且つ、
   前記Ang-1分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたAng-1遺伝子を含有し、且つ、Ang-1を分泌するものである、
   前記薬学組成物。
2. VEGF分泌間葉系幹細胞及びAng-1分泌間葉系幹細胞、又は前記間葉系幹細胞の培養物を含む、虚血性細胞死阻害用薬学組成物であって、
   前記VEGF分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたVEGF遺伝子を含有し、且つ、VEGFを分泌するものであり、且つ、
   前記Ang-1分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたAng-1遺伝子を含有し、且つ、Ang-1を分泌するものである、
   前記薬学組成物。
3. VEGF分泌間葉系幹細胞及びAng-1分泌間葉系幹細胞、又は前記間葉系幹細胞の培養物を含む、心血管疾患の予防又は治療用薬学組成物であって、
   前記VEGF分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたVEGF遺伝子を含有し、且つ、VEGFを分泌するものであり、且つ、
   前記Ang-1分泌間葉系幹細胞は、RNAガイド操作エンドヌクレアーゼタンパク質がガイドRNAと結合して複合体を形成する、リボ核タンパク質を使用して、該間葉系幹細胞のゲノム中のセーフハーバー部位に挿入されたAng-1遺伝子を含有し、且つ、Ang-1を分泌するものである、
   前記薬学組成物。
4. 前記心血管疾患は、心筋梗塞、狭心症、下肢虚血、高血圧、又は不整脈である、請求項３記載の薬学組成物。
5. 前記間葉系幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬学組成物。
6. 前記セーフハーバー部位が、AAVS1(アデノ随伴ウイルス挿入部位1)である、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬学組成物。

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