JP6960637B2

JP6960637B2 - リンパ行性薬剤投与法で有効な薬剤

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Publication number: JP6960637B2
Application number: JP2018543783A
Authority: JP
Inventors: 哲也小玉; 士朗森; 剛野原
Original assignee: Tohoku University NUC; Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Tohoku University NUC; Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2016-10-05
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: WO2018066278A1; CA3039442C; AU2017340350B9; KR20190064570A; AU2017340350A1; RU2759640C2; BR112019006949A2; EP3524269A4; JPWO2018066278A1; TW201813668A; TWI754666B; EP3524269A1; MX2019003943A; US11559526B2; CA3039442A1; US20230119275A1; RU2019109965A3; RU2019109965A; US20200038400A1; CN110022899A

Description

本発明はリンパ行性薬剤投与法に適する医薬組成物に関する。

がんは日本人の二人に一人が罹患する病気であり、がん患者の死因９割が転移に起因する。乳がんや頭頸部がんをはじめとするがんの多くは、リンパ管を介して所属リンパ節に転移を来す。最初に転移を来すリンパ節はセンチネルリンパ節と呼ばれる。

転移リンパ節の治療には、リンパ節郭清術や放射線治療のほか、静脈に抗がん剤を注射する全身化学療法が一般的であるが、抗がん剤のような低分子は、腫瘍周囲の間質にある毛細血管で容易に再吸収されてしまうために、全身化学療法では必ずしも十分な治療成果を上げることができない。

近年、本発明者らは、ヒトのリンパ節と同等の大きさを有する特殊なマウスを樹立することに成功した。そして、斯かるマウスのリンパ節（腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ））にがん細胞を移入して固有腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に転移させたリンパ節転移モデルにおいて、腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）からドキソルビシンを投与した場合に、がんが発症した固有腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）において、抗がん作用が発揮されることを見出している（非特許文献１）。

Shigeki Kato, Shiro Mori, Tetsuya Kodama、Journal of Cancer 2015, 6(12): 1282-1294.

本発明は、抗がん剤をリンパ節内投与する場合のより好適な医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、斯かる実情に鑑み検討したところ、代謝拮抗剤又は植物アルカロイド系抗がん剤が、リンパ節内投与した場合に少量で優れた抗腫瘍活性を発揮し、リンパ節内投与のための薬剤としてより有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）に係るものである。
（１）代謝拮抗剤及び植物アルカロイド系抗がん剤から選択される１種以上の抗がん剤を有効成分とする、リンパ節内投与されるがんの治療又は予防的治療用医薬組成物。
（２）代謝拮抗剤が５−フルオロウラシル又はその塩である（１）記載の医薬組成物。
（３）植物アルカロイド系抗がん剤がイリノテカン、ＳＮ−３８、ドセタキセル及びそれらの塩から選ばれる１種以上である（１）又は（２）記載の医薬組成物。
（４）投与対象のリンパ節が、治療又は予防的治療を目的とするリンパ節又は当該リンパ節が属するリンパ管ネットワーク上流に位置するリンパ節である（１）〜（３）の何れかに記載の医薬組成物。
（５）単回投与量が、代謝拮抗剤として１ｎｇ〜１００ｍｇ及び／又は植物アルカロイド系抗がん剤として１ｎｇ〜２０ｍｇである（１）〜（４）の何れかに記載の医薬組成物。
（６）粘度が、４０ｍＰａ・ｓ以下である（１）〜（５）の何れかに記載の医薬組成物。
（７）粘度が、１〜１０ｍＰａ・ｓである（１）〜（５）の何れかに記載の医薬組成物。
（８）リンパ節内投与されるがんの治療又は予防的治療用医薬組成物を製造するための、代謝拮抗剤及び植物アルカロイド系抗がん剤から選択される１種以上の抗がん剤の使用。
（９）リンパ節内投与によりがんの治療又は予防的治療を行うための、代謝拮抗剤及び植物アルカロイド系抗がん剤から選択される１種以上の抗がん剤を含む医薬組成物。
（１０）代謝拮抗剤及び植物アルカロイド系抗がん剤から選択される１種以上の抗がん剤を含む医薬組成物を患者にリンパ節内投与する、がんの治療又は予防的治療方法。

本発明のリンパ節内投与のための医薬組成物は、低用量で優れた抗腫瘍効果を発揮する。また、リンパ管ネットワークの上流に位置するリンパ節内に投与することより、下流に位置するリンパ節も治療対象にすることが可能となる。これにより、転移初期段階にあるリンパ節や転移する危険性が高いリンパ節を治療又は予防的治療の対象とすることができる。

固有腋窩リンパ節転移モデルマウスと当該マウスを用いた薬剤投与の図。腫瘍細胞を腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）に移植することで、リンパ管を介して固有腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に腫瘍細胞の転移を誘導する。つぎに副腋窩リンパ節（ＡＡＬＮ）に薬剤を投与することで、リンパ管を介して固有腋窩リンパ節に薬剤を送達させ、転移した腫瘍細胞を治療する。ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ投与後、ｄａｙ９^Ｔ時における固有腋窩リンパ節の病理図写真（ａ：２倍、ｂ：１０倍）。ｂはａの□部分を拡大したものであり、ｃｏｒはリンパ節の皮質を、Ｔは腫瘍を示す。リンパ節皮質表層に腫瘍細胞の残存を認めるが、リンパ節辺縁洞相当部に腫瘍細胞は見られない。ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ投与後、ｄａｙ９^Ｔ時における固有腋窩リンパ節の病理図写真（ａ：２倍、ｂ：１０倍）。ｂはａの□部分を拡大したものであり、Ｔは腫瘍を示す。リンパ節実質および辺縁洞に腫瘍の浸潤・増殖が認められる。ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ投与後、ｄａｙ９^Ｔ時における副腋窩リンパ節の病理図写真（ａ：２倍、ｂ：１０倍）。ｂはａの□部分を拡大したものであり、Ｆは繊維化を示す。リンパ節髄質を中心に広範な壊死と線維化が認められ、変異はリンパ節皮質および輸出リンパ管基部を含めたリンパ節被膜外にも及び、輸出リンパ管の通過障害が示唆される。

本発明の医薬組成物は、代謝拮抗剤及び植物アルカロイド系抗がん剤から選択される１種以上の抗がん剤を含有し、リンパ節内に局所投与されるものである。

代謝拮抗剤としては、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−ＦＵのプロドラッグ（例えばテガフール又はその塩）、カペシタビン又はその塩、ＴＳ−１（Ｓ−１ともいう。テガフールにモジュレーターを併用した配合剤）、カルモフール、ドキシフルリジン等のフッ化ピリミジン系抗がん剤の他、ゲムシタビン、シタラビン、エノシタビン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ヒドロキシカルバミド、ネララビン、ペントスタチンやこれらのプロドラッグ等が挙げられ、生体内で５‐フルオロウラシルを存在させるフッ化ピリミジン系抗がん剤がより好ましく、特に５‐フルオロウラシル又はその塩が好ましい。
ここで、塩としては、薬学的に許容される無機酸（例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、リン酸）又は有機酸（例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸）との塩が挙げられる。

植物アルカロイド系抗がん剤としては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エトポシド、イリノテカン若しくはその活性代謝物又はそれらの塩、ノギテカン、ソブゾキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、パクリタキセル注射剤、エリブリン等が挙げられ、イリノテカン若しくはその代謝物又はそれらの塩が好ましい。イリノテカンの活性代謝物としては、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）が挙げられる。
イリノテカンの塩としては、上述した薬学的に許容される無機酸又は有機酸との塩が挙げられ、好ましくは塩酸塩である。

本発明の医薬組成物の単位投与剤型中の抗がん剤の含有量は、その種類によっても異なるが、１ｎｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍｇである。

本発明の医薬組成物は、リンパ節内に投与することから、リンパ節内に注射可能な剤型であるのが好ましい。注射可能な剤型としては、注射可能な溶液、注射可能な懸濁液、注射可能な乳化液、注射可能なゲル、注射可能な固体形態が挙げられる。
注射可能な固体形態とは、使用時にリンパ節内注射として使用できるように、注射用水、注射用生理食塩水、注射用ブドウ糖液等の溶媒と混合される、凍結乾燥製剤や粉末充填製剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物には、上記抗がん剤の他に、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含むことができる。この場合、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤は、水溶性溶媒若しくは油性溶媒、分散剤、等張化剤、防腐剤、可溶化剤、安定剤等から適宜選択することができる。
ここで、水溶性溶媒としては、例えば蒸留水、生理食塩水、リンゲル液又はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等が挙げられる。油溶性溶媒としては、例えばオリーブ油、ヒマシ油、ごま油、綿実油、トウモロコシ油等の植物油が挙げられる。分散剤としては、例えばｔｗｅｅｎ２０若しくはｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセロール、ソルビンアルコール、グルコース等が挙げられる。可溶化剤としては、例えばサリチル酸ナトリウム、ポロキサマー、酢酸ナトリウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、安息香酸ナトリウム、フェノール等が挙げられる。安定剤としては、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン等のアルブミンが挙げられる。

当該医薬組成物は、本発明の抗がん剤を、公知の製剤技術を用いて調製することができる。例えば、本発明の抗がん剤を、上記の分散剤、等張化剤、防腐剤、可溶化剤、安定剤等と一緒に、水溶性溶媒又は油溶性溶媒に溶解、懸濁又は乳化させることにより調製することができる。

また、本発明の医薬組成物は、腫瘍縮小効果の点から、粘度が４０ｍＰａ・ｓ以下であるのが好ましく、より好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以下である。また０．５ｍＰａ・ｓ以上であるのが好ましく、より好ましくは１ｍＰａ・ｓ以上である。
例えば、好ましくは０．５〜４０ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．５〜３０ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．５〜２０ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．５〜１０ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは１〜１０ｍＰａ・ｓである。

粘度は後述の実施例で示すように、２０℃において振動粘度計（例えば、音叉振動式粘度計＜ＳＶ−１Ａ、エー・アンド・デイ株式会社製＞）を使用して測定することが可能である。

粘度の調整は、一般に注射製剤において、増粘剤として用いられる各種の親水性ポリマーを用いて行うことができる。具体的には、例えば、セルロース、アミロース、ペクチン、ゼラチン、デキストリン、アルギン酸塩等の直鎖状の多糖類；セルロース誘導体（メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含むこれらの塩等）；グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸及びその塩等の非硫酸化グリコサミノグリカン、脱硫酸化ヘパリン、脱硫酸化コンドロイチン硫酸、及び脱硫酸化デルマタン硫酸等）；ガラクトマンナン（グアーガム、フェヌグリークガム、タラガム、ローカストビーンガム、及びイナゴマメガム等）；カルボマー；ポリアクリル酸；ポリカルボフィル；ポリビニルピロリドン；ポリアクリルアミド；ポリビニルアルコール；ポリ酢酸ビニルの誘導体及び混合物が挙げられる他、安定化剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、分散剤、溶剤、溶解剤、溶解補助剤等としても使用可能な、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類を用いることができ、腫瘍縮小効果の点からポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類を用いるのが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート６５、Ｔｗｅｅｎ６５）、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）が好適であり、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンがより好ましい。

斯くして調製された本発明の医薬組成物は、患者のリンパ節内に局所投与される。ここで、投与対象となるリンパ節は、治療又は予防的治療を目的とするリンパ節（標的リンパ節）自体であってもよく、又は当該リンパ節が属するリンパ管ネットワーク上流に位置するリンパ節であってもよい。具体的には、例えば、腫瘍細胞が原発巣から移動して最初に転移を発症するセンチネルリンパ節や、センチネルリンパ節の下流に位置するリンパ節(二次リンパ節)、原発巣周囲の所属リンパ節の上流に位置するリンパ節、所属リンパ節が属するリンパ管ネットワークの上流に位置するリンパ節等が挙げられる。
ここで、標的リンパ節は、がんを有しているか否かは問われない。例えば、リンパ節郭清する前に、郭清域内のリンパ節（上流側リンパ節）に本発明の医薬組成物を投与し、リンパ管ネットワークを介して郭清域外のリンパ節（下流側リンパ節）に抗がん剤を送達させて、郭清を実施することにより、下流側リンパ節の予防的治療が可能である。

本発明の医薬組成物のリンパ節への投与は、リンパ節内に本発明の医薬組成物が注入できればその手法は限定されず、患者の皮膚を切開して露わになったリンパ節に注入投与してもよいし、患者の皮膚の上からリンパ節の位置として見当をつけた部位に注射投与してもよい。

後記実施例に示すように、５−フルオロウラシル、イリノテカン及びドセタキセルは、リンパ節内投与することにより、少量の投与でドキソルビシンに比べて優れた抗腫瘍効果を奏する。がん細胞株に対する細胞増殖阻害活性（ＧＩ_５０値）は、ドキソルビシンが、５−フルオロウラシル及びイリノテカンと比較して遥かに強く、ドセタキセルと同程度であることが知られていることから（比較例参照）、５−フルオロウラシル、イリノテカン又はドセタキセルのリンパ節内投与により得られた抗腫瘍効果は従来の知見からは全く予測することができない。
また、当該抗腫瘍効果は、予防又は治療目的のリンパ節よりも上流に位置するリンパ節内投与により発揮される。よって、本発明の医薬組成物は、転移初期段階にあるリンパ節や転移する危険性が高いリンパ節を治療又は予防的治療の対象とすることができ、再発防止等において特に有用である。
なお、本明細書において、「治療」とは、がんを有する対象の治療（即時治療）のことを指し、その状態、またはその状態によって生じる1つ若しくは複数の症状を、改善、軽減又は消失させることを意味する。「予防的治療」とは、がんになるリスクはあるが、現時点ではその状態や症状を有しない対象の治療を意味する。

本発明の医薬組成物を投与することにより治療できる悪性腫瘍の種類としては、本発明の抗がん剤に感受性を示すものであれば特に制限はなく、例えば頭頸部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、咽頭癌、食道癌、腎癌、卵巣癌等が挙げられる。特に結腸癌、直腸癌、乳癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、膵臓癌、及び胆のう・胆管癌に対して高い効果が期待できる。

本発明の医薬組成物のヒトへの投与頻度及び投与量は、適宜調整又は変更することができるが、投与間隔としては、例えば１〜４２日に１回、好ましくは１〜２８日に１回、より好ましくは１〜２１日に１回が挙げられる。
単回投与量は、代謝拮抗剤として、１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１００ｎｇ〜１ｍｇであり、従来の全身投与に用いる量の１／１０^９〜１／３程度である。また、植物アルカロイド系抗がん剤として、１ｎｇ〜２０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１００ｎｇ〜１ｍｇであり、従来の全身投与に用いる量の１／１０^７〜２／３程度である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１５−ＦＵのリンパ節内投与による抗腫瘍活性
１．材料
（ａ）使用動物
既報（J Immunol Methods 2013;389(1-2):69-78 doi 10.1016/j.jim.2013.01.004.）の方法に従って、リンパ節腫脹モデルマウスＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒ／ｌｐｒ（ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒ）を作製した。以下の実施例では、１５〜１８週齢の当該モデルマウスを雄・雌合計５匹使用した。

（ｂ）腫瘍細胞
既報（PLoS One 2013;8(2):e55797 doi 10.1371/journal.pone.0055797）の方法に従って、マウス線維芽細胞由来のＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を作製した。ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は、ＭＲＬ／ＭｐＴｎ−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスの線維芽細胞由来の腫瘍細胞であるＭＲＬ／Ｎ１細胞にｐＥＧＦＰＬｕｃプラスミドをトランスフェクションしたものであり、ルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光遺伝子を恒常的に発現している。以下の実施例では、当該細胞を、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−Ｐ．Ｓ．溶液１％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ製）、Ｇ４１８を０．５％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いて培養して、使用した。

（ｃ）被験薬
５−ＦＵは、５−ＦＵ注２５０ｍｇ（協和発酵キリン製）を使用した。マウスの体重あたり、０μｇ／ｇ、０．１μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、１０μｇ／ｇとなるように生理食塩水を用いて濃度調整した。

２．方法
（ａ）固有腋窩リンパ節転移モデルマウスの作製
−８０℃保存の腫瘍細胞を融解させた後、通算２回継代したＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した。その後、マトリゲル（Ｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｍａｔｒｉｘ，Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．製）と混合して３．３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した後に、マウスの腸骨下リンパ節に６０μＬを接種した（図１）。腫瘍細胞を接種した日をｄａｙ０とした。

（ｂ）ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞増殖評価
生体発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ，ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて、腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節の腫瘍細胞の増殖率を測定した。測定日は腫瘍細胞接種後０，６，９日目（ｄａｙ０，ｄａｙ６，ｄａｙ９）に行った。１５ｍｇ／ｍＬに調整したルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ製）２００μＬをマウスの腹腔に注射し、１０分後にＩＶＩＳを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。

（ｃ）副腋窩リンパ節からの薬剤投与
腫瘍細胞接種後ｄａｙ６のマウスのうち、固有腋窩リンパ節でのルシフェラーゼ活性が１．０×１０^６ｐｈｏｔｏｓ／ｓｅｃ以上であるマウスに対して、シリンジポンプ（ＫＤＳ１００，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ製）を用いて、副腋窩リンパ節へ１０μＬ／ｍｉｎの速度で５−ＦＵを１２０μＬ投与した（図１）。

（ｄ）抗腫瘍活性の評価
ｄａｙ６及びｄａｙ９のルシフェラーゼ活性を下記〔式１〕により標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。その後、下記〔式２〕により標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比を算出した。得られた活性比について、下記〔式３〕により、０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比を１００とした時の、５−ＦＵの各濃度投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比を計算した。

〔式１〕
標準化したｄａｙ６又はｄａｙ９のルシフェラーゼ活性＝（（ｄａｙ６又はｄａｙ９のルシフェラーゼ活性）／（ｄａｙ０のルシフェラーゼ活性））

〔式２〕
標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比＝（（標準化したｄａｙ９のルシフェラーゼ活性）／（標準化したｄａｙ６のルシフェラーゼ活性））

〔式３〕
０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比を１００とした時の、５−ＦＵの各濃度投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比＝（（５−ＦＵの各濃度投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比）／（０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ９とｄａｙ６のルシフェラーゼ活性比）×１００）

３．結果
結果を表１に示す。

５−ＦＵの投与により、ルシフェラーゼ活性比は大幅に低下しており、腫瘍が縮小していること、また、ごく少量の投与（０．１μｇ／ｇ）においても９０％以上の腫瘍縮小効果があることが確認された。５−ＦＵは、リンパ節の上流である副腋窩リンパ節から投与しており、抗腫瘍活性は下流の固有腋窩リンパ節で確認されている。このことから、少量の５−ＦＵをリンパ節、特に上流のリンパ節に投与することは、がんの治療、再発防止、転移防止等において有用であり、特に下流のリンパ節の治療、再発防止等に効果が高いことが示唆された。また、ごく少量でも抗腫瘍活性を有するため、本方法は、副作用が少なく、安全性が高いことが示唆された。

実施例２イリノテカン塩酸塩（ＣＰＴ−１１）のリンパ節内投与による抗腫瘍活性
１．材料
使用動物、使用細胞は、実施例１と同様のものを使用した。
被験薬として、ＣＰＴ−１１は、イリノテカン塩酸塩（ヤクルト本社製）を使用した。マウスの体重あたり、０μｇ／ｇ、０．５μｇ／ｇ、５μｇ／ｇとなるようにイリノテカン塩酸塩を生理食塩水にて溶解させ、濃度を調整した。

２．方法
副腋窩リンパ節へ投与する被験薬をＣＰＴ−１１に変更した以外はすべて実施例１と同様の方法で行った。

３．結果
結果を表２に示す。

ＣＰＴ−１１の投与により、ルシフェラーゼ活性比は大幅に低下しており、腫瘍が縮小していること、また、ごく少量の投与（０．５μｇ／ｇ）においても９０％以上の腫瘍縮小効果があることが確認された。ＣＰＴ−１１は、リンパ節の上流である副腋窩リンパ節から投与しており、抗腫瘍活性は下流の固有腋窩リンパ節で確認されている。このことから、少量のＣＰＴ−１１をリンパ節、特に上流のリンパ節に投与することは、がんの治療、再発防止等において有用であり、特に下流のリンパ節の治療、再発防止等に効果が高いことが示唆された。また、ごく少量でも抗腫瘍活性を有するため、本方法は、副作用が少なく、安全性が高いことが示唆された。

実施例３ドセタキセルのリンパ節内投与による抗腫瘍活性
１．材料
（ａ）使用動物
使用動物は、実施例１と同様のものを使用した。

（ｂ）腫瘍細胞
既報（J Immunol Methods 2013 Mar 29;389(1-2):69-78. doi: 10.1016/j.jim.2013.01.004.）の方法に従って、マウス乳がん細胞由来のＦＭ３Ａ−Ｌｕｃを作製した。ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞は、ＦＭ３Ａ細胞に電気穿孔法を用いてｐＧＬ４．５１を遺伝子導入して得られた細胞であり、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現している。以下の実施例では、当該細胞を、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−Ｐ．Ｓ．溶液１％（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ製）、Ｇ４１８を０．５％含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて培養して、使用した。

（ｃ）被験薬
ドセタキセルは、タキソテール点滴静注用８０ｍｇ（サノフィ製）を使用した。タキソテール点滴静注用８０ｍｇ２ｍＬを１３％エタノール６ｍＬに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのＳｔｏｃｋ溶液を調製し、その後、マウスの体重あたり、０μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、１０μｇ／ｇとなるようにＳｔｏｃｋ溶液を滅菌水にて溶解させ、濃度を調整した。

２．方法
（ａ）固有腋窩リンパ節転移モデルマウスの作製
−８０℃保存の腫瘍細胞を融解させた後、通算２回継代したＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した。その後、マトリゲル（Ｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｍａｔｒｉｘ，Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．製）と混合して３．３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した後に、マウスの腸骨下リンパ節に６０μＬを接種した（図１）。腫瘍細胞を接種した日をｄａｙ０とした。

（ｂ）ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞増殖評価
生体発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ，ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて、腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節の腫瘍細胞の増殖率を測定した。測定日は腫瘍細胞接種後０，７，１４，１７，２０，２３，２６，２９日目に行った。１５ｍｇ／ｍＬに調整したルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ製）２００μＬをマウスの腹腔に注射し、１０分後にＩＶＩＳを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。

（ｃ）副腋窩リンパ節からの薬剤投与
固有腋窩リンパ節でのルシフェラーゼ活性が１．０×１０^６ｐｈｏｔｏｓ／ｓｅｃ以上であることが確認されたマウスに対して、確認された翌日に、シリンジポンプ（ＫＤＳ１００，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ製）を用いて、副腋窩リンパ節へ１０μＬ／ｍｉｎの速度でドセタキセルを１２０μＬ投与した（図１）。

（ｄ）抗腫瘍活性の評価
ドセタキセル投与日をｄａｙ０^Ｔと定義し、ｄａｙ３^Ｔ（ドセタキセル投与後３日目）およびｄａｙ６^Ｔ（ドセタキセル投与後６日目）のルシフェラーゼ活性を下記〔式４〕により標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。その後、下記〔式５〕により標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔ（固有腋窩リンパ節でのルシフェラーゼ活性が１．０×１０^６ｐｈｏｔｏｓ／ｓｅｃ以上であることが確認された日であり、ドセタキセル投与の前日）のルシフェラーゼ活性比を算出した。得られた活性比について、下記〔式６〕により、０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比を１００とした時の、ドセタキセルの各濃度投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比を計算した。

〔式４〕
標準化したｄａｙ３^Ｔ、ｄａｙ６^Ｔ又はｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性＝（（ｄａｙ３^Ｔ、ｄａｙ６^Ｔ又はｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性）／（ｄａｙ０のルシフェラーゼ活性））

〔式５〕
標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１のルシフェラーゼ活性比＝（（標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔのルシフェラーゼ活性）／（標準化したｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性））

〔式６〕
０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比を１００とした時の、ドセタキセルの各濃度投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比＝（（ドセタキセルの各濃度投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比）／（０μｇ／ｇ投与における標準化したｄａｙ３^Ｔ又はｄａｙ６^Ｔとｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性比）×１００）

３．結果
結果を表３に示す。

ドセタキセルの投与により、ルシフェラーゼ活性比は大幅に低下しており、腫瘍が縮小していること、また、少量の投与（１μｇ／ｇ）においても治療後６日目において９０％以上の腫瘍縮小効果があることが確認された。ドセタキセルは、リンパ節の上流である副腋窩リンパ節から投与しており、抗腫瘍活性は下流の固有腋窩リンパ節で確認されている。このことから、少量のドセタキセルをリンパ節、特に上流のリンパ節に投与することは、がんの治療、再発防止、転移防止等において有用であり、特に下流のリンパ節の治療、再発防止等に効果が高いことが示唆された。また、ごく少量でも抗腫瘍活性を有するため、本方法は、副作用が少なく、安全性が高いことが示唆された。

実施例４ドセタキセルの粘度を変化させた際のリンパ節内投与による抗腫瘍活性
１．材料
使用動物は、実施例１と同様のものを使用した。
使用細胞は、実施例４と同様のものを使用した。
ドセタキセルは、タキソテール点滴静注用８０ｍｇ（サノフィ製）を使用した。タキソテール点滴静注用８０ｍｇ２ｍＬを１３％エタノール６ｍＬに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのＳｔｏｃｋ溶液を調製した。その後、ドセタキセルの濃度がマウスの体重あたり１μｇ／ｇとなるように、表４の配合比でＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＣを調製した。

２．方法
（ａ）固有腋窩リンパ節転移モデルマウスの作製、（ｂ）ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞増殖評価、（ｃ）副腋窩リンパ節からの薬剤投与は、実施例４と同様の方法で行った。
（ｄ）抗腫瘍活性の評価
ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、Ｂ又はＣについて、投与日をｄａｙ０^Ｔと定義し、ｄａｙ−１^Ｔ（固有腋窩リンパ節でのルシフェラーゼ活性が１．０×１０^６ｐｈｏｔｏｓ／ｓｅｃ以上であることが確認された日であり、ドセタキセル投与の前日）に対するｄａｙ９^Ｔのルシフェラーゼ活性を下記〔式７〕により計算した。

〔式７〕
ｄａｙ−１^Ｔに対するｄａｙ９^Ｔのルシフェラーゼ活性＝（（ｄａｙ９^Ｔのルシフェラーゼ活性）／（ｄａｙ−１^Ｔのルシフェラーゼ活性））

（ｅ）粘度の測定
音叉振動式粘度計（ＳＶ−１Ａ：粘度測定域：０．３〜１０，０００ｍＰａ・ｓ、ＳＶ−１Ｈ：粘度測定域：０．３〜１，０００ｍＰａ・ｓ、エー・アンド・デイ株式会社製）を用いて、日本薬局方粘度測定法に準じて、ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＣの粘度を測定した。
（ｆ）病理図写真の撮影
ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ又はＳｏｌｕｔｉｏｎＣ投与後のｄａｙ９Ｔ時に、倒立顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス社製）を用いて明視野観察法にて固有腋窩リンパ節および副腋窩リンパ節の病理図写真を撮影した。撮影倍率は、２倍及び１０倍にて行った。

３．結果
（ａ）粘度とルシフェラーゼ活性の関係
結果を表５に示す。

式７により計算したルシフェラーゼ活性は、ｄａｙ−１^Ｔに対するｄａｙ９^Ｔのルシフェラーゼ活性であるため、数値が小さいほどｄａｙ９^Ｔ時の腫瘍が縮小していることを示している。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＢのルシフェラーゼ活性は低く、腫瘍縮小効果が高いことが示された。一方、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣは、腫瘍縮小効果がほとんど確認されなかった。このことから、ドセタキセルのリンパ節投与において腫瘍縮小効果を示すためには、粘度が４０ｍＰａ・ｓ以下、特に１〜１０ｍＰａ・ｓであることがよいと考えられる。

（ｂ）ｄａｙ９^Ｔ時におけるＳｏｌｕｔｉｏｎＢ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＣの病理図写真
ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ又はＳｏｌｕｔｉｏｎＣを投与後、ｄａｙ９^Ｔ時における固有腋窩リンパ節の病理図写真を図２および図３に示す。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＢでは、リンパ節皮質表層に腫瘍細胞の残存を認めるが、リンパ節辺縁洞相当部に腫瘍細胞は見られなかった。一方、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣでは、リンパ節実質および辺縁洞に腫瘍の浸潤・増殖が認められた。これより、粘度による腫瘍縮小効果は、固有腋窩リンパ節の病理図写真からも確認することができた。
なお、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣの投与部位である副腋窩リンパ節の病理図写真を同様の方法で撮影したところ、リンパ節髄質を中心に広範な壊死と線維化が認められ、変異はリンパ節皮質および輸出リンパ管基部を含めたリンパ節被膜外にも及び、輸出リンパ管の通過障害が示唆された（図４）。これは、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣが高粘度であるため、上流である副腋窩リンパ節に投与した際に、下流のリンパ節に流れずに副腋窩リンパ節に留まったためと考えられる。このため、ドセタキセルに限らず、同じ植物アルカロイド系抗がん剤であるＣＰＴ−１１やＳＮ−３８、代謝拮抗剤である５−ＦＵにおいても、リンパ節投与を行う場合には、薬剤の粘度を４０ｍＰａ・ｓ以下とする必要があると考えられる。

比較例ドキソルビシンのリンパ節内の投与による抗腫瘍活性
１．材料
使用動物、使用細胞は、実施例１と同様のものを使用した。
被験薬として、ドキソルビシンは、ドキソルビシン塩酸塩（Ｗａｋｏ製）を使用した。マウスの体重あたり、０μｇ／ｇ、０．１μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、１０μｇ／ｇとなるように生理食塩水を用いて濃度調整した。

２．方法
副腋窩リンパ節へ投与する被験薬をドキソルビシンに変更した以外はすべて実施例１と同様の方法で行った。

３．結果
結果を表６に示す。ドキソルビシンの抗腫瘍活性と、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びドセタキセルの抗腫瘍活性を比較するために、実施例１〜３の結果を併せて表６に示した。

ドキソルビシンの投与により、ルシフェラーゼ活性比は低下したが、腫瘍の縮小率は、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びドセタキセルと比較して小さかった。特にドキソルビシンでは１０μｇ／ｇで腫瘍の縮小率が２５％程度であり、最も結果のよい１μｇ／ｇにおいても腫瘍の縮小率が６０％未満であるが、５−ＦＵ及びＣＰＴ−１１では１μｇ／ｇ未満の投与量においても腫瘍の縮小率が９０％以上を示し、ドセタキセルでは１０μｇ／ｇの投与で８０％以上の腫瘍縮小率を示した。これにより、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びドセタキセルの効果は、ドキソルビシンと比較して高いことが示唆された。

がん細胞株に対する細胞増殖阻害活性（ＧＩ_５０値）は、表７に示すとおり、ドキソルビシンが、５−ＦＵ及びＣＰＴ−１１と比較して、約１０〜１０００倍近く強いことが知られている（NIH DTP database(https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/cancerscreeningdata/index.jsp)に記載されている各細胞株に対するＧＩ_５０値を平均して算出）。また、ドセタキセルについては、ドキソルビシンとほぼ同程度であることが知られている。

表７のとおり、従来、ドキソルビシンの効果は、５−ＦＵ及びＣＰＴ−１１に比較して高く、ドセタキセルと同程度であると考えられたが、リンパ節投与の場合には、表６に示すとおり、ドキソルビシンの投与よりも、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びドセタキセルの抗腫瘍活性が高いことが示されたことから、これら薬剤は、リンパ節投与に特に適していることが明らかになった。

本発明の医薬組成物によれば、郭清前にリンパ節に抗がん剤を投与して、投与したリンパ節より下流のリンパ節にも抗がん剤を流し込むことができ、標的のリンパ節で抗がん作用を発揮するだけでなく、微小ながんが転移している可能性がある他のリンパ節にも抗がん剤を流し込むことができ、微小ながんを殺すことで、再発を防止することができる。
また、手術で郭清できない領域のリンパ節にがんがある場合、外科的手術での治癒は不可能であるが、本発明の医薬組成物を用いることで、上流のリンパ節から抗がん剤を流して郭清できない領域のリンパ節の治療を行うことが可能である。さらに、本発明の医薬組成物においては、使用する抗がん剤の量は、従来の全身投与に用いる量よりも少ないため、副作用も少なく、安全性が高い。

Claims

イリノテカン、ＳＮ−３８、ドセタキセル及びそれらの塩から選ばれる１種以上の植物アルカロイド系抗がん剤を有効成分とする、リンパ節内投与されるがんの治療又は予防的治療用医薬組成物。
投与対象のリンパ節が、治療又は予防的治療を目的とするリンパ節又は当該リンパ節が属するリンパ管ネットワーク上流に位置するリンパ節である請求項１記載の医薬組成物。
単回投与量が、植物アルカロイド系抗がん剤として１ｎｇ〜２０ｍｇである請求項１又は２記載の医薬組成物。
粘度が、４０ｍＰａ・ｓ以下である請求項１〜３の何れか１項記載の医薬組成物。
粘度が、１〜１０ｍＰａ・ｓである請求項１〜３の何れか１項記載の医薬組成物。
リンパ節内投与されるがんの治療又は予防的治療用医薬組成物を製造するための、イリノテカン、ＳＮ−３８、ドセタキセル及びそれらの塩から選ばれる１種以上の植物アルカロイド系抗がん剤の使用。
リンパ節内投与によりがんの治療又は予防的治療を行うための、イリノテカン、ＳＮ−３８、ドセタキセル及びそれらの塩から選ばれる１種以上の植物アルカロイド系抗がん剤を含む医薬組成物。