JP6962514B2 - 酵母由来組換えヒトｇｍ−ｃｓｆに特異的に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

本発明は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。

肺胞蛋白症（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｖｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓ；ＰＡＰ）とは、サーファクタント（９０％のリン脂質と１０％のタンパク質とによって構成された生体界面活性剤）の生成又は分解過程に障害があり、そのことが原因で肺胞腔内、又は終末細気管支内にサーファクタントが集積する稀な疾患である。ＰＡＰ（以下、括弧内は、推定される出現頻度）は、自己免疫性ＰＡＰ（約９０％）、続発性ＰＡＰ（約９％）、先天性ＰＡＰ（約１％以下）、未分類ＰＡＰ（極めて稀）に分類される。

ＰＡＰ患者の中でも、多くを占める自己免疫性ＰＡＰでは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）に対する中和自己抗体が存在し、肺胞マクロファージ、好中球の機能障害が病態に関与する。ＧＭ−ＣＳＦとは、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞又は血管内皮細胞により産生される糖タンパク質であり、顆粒球又はマクロファージの前駆細胞に作用し、それらの増殖と分化とを促進するものである。
健常者の肺では、肺胞の呼吸上皮を構成する細胞の１種であるＩＩ型肺胞上皮細胞から放出されるＧＭ−ＣＳＦが未熟な肺胞マクロファージのＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合する。このＧＭ−ＣＳＦと受容体との結合によるシグナルの伝達により、血球系転写因子であるＰＵ．１が発現して肺胞マクロファージの終末分化が起こり、成熟マクロファージとなる。成熟マクロファージは、サーファクタントを取り込み、分解することにより肺胞の恒常性を保つ。一方、自己免疫性ＰＡＰ患者の肺では、ＩＩ型肺胞上皮細胞から放出されるＧＭ−ＣＳＦは肺胞内に豊富にある抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体により中和され、ＧＭ−ＣＳＦが未熟な肺胞マクロファージの受容体に結合するのを防ぐ。そのために、肺胞マクロファージの終末分化は起こらず、サーファクタントの分解が障害される。

自己免疫性ＰＡＰの症状としては、例えば、労作時呼吸困難、咳、喀痰、体重減少、発熱等が挙げられるが、約３０％の患者は無症状である。画像所見の割に症状が比較的軽微であることが自己免疫性ＰＡＰの特徴である。自己免疫性ＰＡＰの５年生存率は９６％、１０年生存率は８８％であるが、患者はこの間繰り返し全肺洗浄等の治療を要する場合が多い。

自己免疫性ＰＡＰの治療方法としては、洗浄療法（全肺洗浄）、試験的治療法としてＧＭ−ＣＳＦの吸入療法、ＧＭ−ＣＳＦの皮下注射（例えば、非特許文献１参照。）等が挙げられる。

吸入又は皮下注射による投与で用いられるＧＭ−ＣＳＦは、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦであって、Ｎ末端から２３番目のアルギニンがロイシンに置き換えられているが、機能は維持されており、ジェンザイム社よりリウカイン（登録商標）という商品名で販売されている。

一方で、ＧＭ−ＣＳＦは様々な疾病状態を導く原因となることが知られている。
ＧＭ−ＣＳＦによって引き起こされる疾病は多岐に渡るが、代表的なものとしては、（１） 喘息、アトピー、花粉症等のアレルギー疾患、（２）移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）、（３）関節リウマチ等の自己免疫疾患、等が挙げられる。例えば、アレルギー個体の肺や、慢性関節リウマチ患者の関節においては過剰発現したヒトＧＭ−ＣＳＦが検出され、アレルギー個体の皮膚からはヒトＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡが過剰に検出されている。また、アトピー性皮膚炎の炎症惹起細胞である単球がＧＭ−ＣＳＦの産生により寿命が延長しているとの報告がある。その他、ＧＭ−ＣＳＦは白血病細胞の増殖を刺激することが示されており、白血病の原因因子とも考えられている。

これらの報告から、ヒトＧＭ−ＣＳＦが原因となって引き起こされる様々な病気を治療するために、過剰発現したヒトＧＭ−ＣＳＦに対して強い親和性及び中和能をもち、且つ拒絶反応を示さない抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体（抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を含む。）を投与することが提案されている（例えば、特許文献１、２及び非特許文献２参照。）。

特開２０００−１９８７９９号公報 特開２００７−１１６９４７号公報

Mani S. Kavuru et al., "Exogenous Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Administration for Pulmonary Alveolar Proteinosis", Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol.161, pp1143-1148, 2000. K. Uchida et al., "Granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor autoantibodies and myeloid cell immune functions in healthy subjects", Blood, vol.113, no.11, 2009.

自己免疫性ＰＡＰ患者に対する酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの吸入療法又は皮下注射による治療法において、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの最高血中濃度及び半減期を算出するために、患者の体内で産生されたヒトＧＭ−ＣＳＦと吸入で体内に入った酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦとを、区別して測定する方法が求められている。
特許文献１、２及び非特許文献２に記載の抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体では、患者の体内で産生されたヒトＧＭ−ＣＳＦと、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦとは、いずれもヒトＧＭ−ＣＳＦであるため、区別して検出することができない。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。

本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る抗酵母由来組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する。

上記態様に係る抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有してもよい。

本発明の第２態様に係る酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４であるハイブリドーマである。

本発明の第３態様に係る酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法は、上記第２態様に係るハイブリドーマを培養する工程と、前記ハイブリドーマから生産された抗体を単離する工程と、を備える方法である。

本発明の第４態様に係る酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキットは、上記第１態様に係る抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを含むものである。

上記態様に係る検出キットは、さらに、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を含んでもよい。

本発明の第５態様に係る酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するための方法は、前記血液試料と、上記第１態様に係る抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントとを接触させて、抗原抗体反応を行う１次抗原抗体反応工程を備える方法である。

上記態様に係る検出方法は、さらに、前記１次抗原抗体反応工程の後に、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を接触させて、抗原抗体反応を行う２次抗原抗体反応工程を備えてもよい。

上記態様によれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に検出することができる。また、上記態様に係る検出キットによれば、健常体を対象とする薬物動態試験において、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの正確な血中濃度を測定することができ、最高血中濃度及び半減期を算出することができる。さらに、自己免疫性ＰＡＰ患者を対象とする医師主導治験において、正確なトラフ値（薬物を反復投与したときの定常状態における最低血中薬物濃度）を測定することができ、患者の全身クリアランス（薬物を体外に排泄する能力）を推定することができる。

試験例１におけるＮｏ．１〜４の合成ペプチド及び全長の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｏ．５）（別名：サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を固相化した各ウェルを示す模式図である。 （Ａ）試験例１における反応停止液を添加直後のＮｏ．１〜４の合成ペプチド及び全長の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｏ．５）（別名：サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を固相化した各ウェルの発色の様子を示す画像である。（Ｂ）試験例１におけるＮｏ．１〜５の合成ペプチドを固相化した各ウェルでの４５０ｎｍの吸光度を測定した結果を示すグラフである。 試験例２における変性した酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、未変性の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、大腸菌由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞産生組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及びウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）を固相化した各ウェルでの４５０ｎｍの吸光度を測定した結果を示すグラフである。 試験例４における５０ｍｇの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを吸入投与した健常カニクイザルでの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの血中濃度の経時変化を示すグラフである。

≪モノクローナル抗体≫
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する、抗酵母由来組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基に特異的に結合することにより、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に検出することができる。さらに、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントを用いることで、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの濃度を正確に測定することができる。

本明細書において、「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）」とは、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞又は血管内皮細胞により産生される糖タンパク質であり、顆粒球又はマクロファージの前駆細胞に作用し、それらの増殖と分化を促進するものを意味する。
本実施形態における酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号７）は、Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基がアルギニンからロイシンに置換している。本発明者らは、このロイシン２３残基に特異的に結合するモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成するに至った。
尚、本明細書において、Ｎ末端からＸ番目のアミノ酸を「アミノ酸Ｘ残基」という。例えば、Ｎ末端から２３番目のアミノ酸がロイシンの場合には「ロイシン２３残基」という。

本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な特異性を持つ抗体を意味する。また、本明細書において、モノクローナル抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。
本明細書において、モノクローナル抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。

本明細書において、「特異的結合」とは、抗体が標的タンパク質（抗原）にのみ結合することを意味し、例えば試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ等）における抗体の抗原のエピトープへの結合等により定量することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体−抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の結合親和性（ＫＤ）は、１０^−８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０^−１３ｍｏｌ／Ｌ以上１０^−９ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、中でも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本明細書において、「ＣＤＲ」はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎを意味する。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基に特異的に結合することにより、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に認識するものである。従って、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基の特異的認識能を保持していれば、前記（ａ）〜（ｆ）の配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
ここで、欠失、置換又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜３個が好ましく、１〜２個がより好ましく、１個がさらに好ましい。

本明細書中において「置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等で分類することができる。
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントにおける１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、従来の抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体等）よりも高いことが好ましい。

更に、発現精製が容易であることから、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
具体的には、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましい。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。

ハイブリドーマ法としては、例えば、ケーラー及びミルスタインにより開発された方法（例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256:495,1975. 参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原（例えば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、そのロイシン２３残基を含むペプチド断片、又はこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを移植した哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。

組換えＤＮＡ法としては、例えば上記本実施形態の抗体又は抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態の抗体を組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、「P. J. Delves, Antibody Production : Essential Techniques, 1997 WILEY」、「P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS」、「Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. 192 : 767-775 (1990)」参照）。
本実施形態の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基に特異的に結合できるものであれば、上述したようなアミノ酸配列変異体であってもかわない。
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。また、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、「PNAS, 102 : 8466-8471 (2005)」、「Protein Engineering, Design&Selection, 21 : 485-493 (2008)」、国際公開第２００２／０５１８７０号、「J. Biol. Chem., 280 : 24880-24887 (2005)」、「Protein Engineering, Design&Selection, 21 : 345-351 (2008)」参照）。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメント（上述のアミノ酸配列変異体等も含む）の抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法等により評価することができる。

≪ハイブリドーマ≫
一実施形態において、本発明は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマであって、前記ハイブリドーマが受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４である、ハイブリドーマを提供する。

本実施形態のハイブリドーマによれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、本実施形態のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含む抗体である。

本実施形態におけるハイブリドーマは、上述の≪モノクローナル抗体≫にて例示されたハイブリドーマ法を用いて、製造することができる。
具体的には、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、そのロイシン２３残基を含むペプチド断片、又はこれらを発現する細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水等で適当量に希釈及び懸濁し、通常のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を適量混合し、乳化し、それをマウスに４〜２１日毎に計２〜１０回皮下又は腹腔内投与する。また、抗原免疫時に適当な担体を使用してもよい。マウスの血清中の抗体レベルが免疫により上昇するのを確認した後、最終免疫を行い、その面系の２〜５日後に免疫した動物の脾臓又はリンパ節を採取する。続いて、採取された細胞をマウスミエローマ細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生マウスハイブリドーマ細胞を作製する。

細胞融合は、公知の方法で行うことができる。例えば、免疫した動物から採取した抗体産生細胞（脾臓、リンパ節等の細胞）とミエローマ細胞とを培養液中で１：１〜１０：１程度の割合でよく混合し、ＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のもの）を３７℃に加温し、両細胞にＰＥＧを３０〜６０％（ｗ/ｖ）の濃度で添加し、混合し、両細胞を融合する。ＰＥＧを除去した後、融合細胞を所定濃度で播種する。

マウス由来のミエローマ細胞株としては、例えば、Ｐ３（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８）、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｘ６３．６５３（Ｘ６３Ａｇ８．６５３）、ＳＰ２（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、ＦＯ、ＮＳ−１（ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１）、ＮＳＯ／１、ＦＯＸ−ＮＹ等が、ラット由来のミエローマ細胞株として、例えば、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ等が挙げられる。

次に、例えば、ＨＡＴ選択培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培養液）等で数日〜数週間培養し、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させてハイブリドーマを選択培養する。

次に、選択培養液で生存したハイブリドーマの中から、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニング方法は特に限定されない。例えば、上述の≪モノクローナル抗体≫において、抗原への結合活性の評価方法として例示された方法を用いて、抗原とハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性の有無を調べることにより、目的のハイブリドーマ株を選抜できる。そして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、必要に応じてモノクローニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。

本実施形態のハイブリドーマは、２０１６年３月２２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定化で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４として国内寄託されている。

≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法≫
一実施形態において、本発明は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法であって、上述のハイブリドーマを培養する工程と、前記ハイブリドーマから生産された抗体を単離する工程と、を備える、製造方法を提供する。

本実施形態の製造方法によれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのロイシン２３残基に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、本実施形態の製造方法により得られるモノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含む抗体である。

＜培養工程＞
まず、上述のハイブリドーマを培養する。培地としては、例えば、１０％牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０が一般的であり、その他には、ハイブリドーマ用に開発された培地（例えばＧ．Ｉ．Ｔ．培地（極東科学社製、和光純薬社製等）等が挙げられる。さらに、ハイブリドーマの選択に用いられる培地としては、例えば、ＨＡＴ選択培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培養液）等が挙げられる。培養温度は、例えば、３０℃以上４０℃以下でよく、培養時間は必要なハイブリドーマの数によって、適宜設定できる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養し、その培養上清として得ることにより、又は、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に投与して増殖させ、その腹水として得ることにより、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得することができる。

＜単離工程＞
モノクローナル抗体の単離及び精製は、通常の免疫グロブリンの分離精製法等により、行うことができる。例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ等）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又は活性吸着剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ等）を用いた方法等により、モノクローナル抗体を単離及び精製することができる。

得られたモノクローナル抗体の抗原への結合活性は、上述の≪モノクローナル抗体≫において、抗原への結合活性の評価方法として例示された方法を用いて、評価することができる。

≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫
一実施形態において、本発明は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキットであって、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、検出キットを提供する。

本実施形態の検出キットによれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に検出することができる。また、健常体を対象とする薬物動態試験において、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの正確な血中濃度を測定することができ、最高血中濃度及び半減期を算出することができる。さらに、自己免疫性ＰＡＰ患者を対象とする医師主導治験において、正確なトラフ値を測定することができ、患者の全身クリアランスを推定することができる。

＜標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体＞
本実施形態の検出キットは、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに加えて、さらに、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を含んでいてもよい。標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体としては、上述のモノクローナル抗体の由来動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）に対する抗体であることが好ましい。例えば、上述のハイブリドーマに対する抗体である場合、マウス由来のモノクローム抗体であるため、抗マウス抗体を使用することが好ましい。また、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。

前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を標識する物質としては、例えば、安定同位体、放射性同位体、蛍光物質、酵素、磁性体等が挙げられる、中でも、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦが結合しているか否かを簡便且つ高感度に確かめることができる。

安定同位体としては、例えば^１３Ｃ、^１５Ｎ、^２Ｈ、^１７Ｏ、^１８Ｏが挙げられる。放射性同位体としては、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^１３Ｎ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓが挙げられる。

蛍光物質としては、例えばシアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、その他公知の蛍光色素（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等）等が挙げられる。

酵素としては、例えばアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。標識物質が酵素である場合、酵素基質を使用することが好ましい。酵素基質としては、アルカリフォスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ ｐｈｏｓｐｈａｓｅ；ｐＮＰＰ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）等を用いることができる。また、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）等を用いることができる。

磁性体としては、例えばガドリニウム、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ヨード、鉄、酸化鉄、クロム、マンガン、又はその錯体若しくはキレート錯体等が挙げられる。

＜支持体＞
本実施形態の検出キットにおいて、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは支持体上に固定化された状態であってもよい。

支持体の形態としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップ等が挙げられる。

支持体の材料としては、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン等）、セルロース及びその誘導体（例えば、ニトロセルロース等）等が挙げられる。
支持体への上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの固定方法は、例えば、物理的吸着、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン結合、静電結合、疎水性相互作用等）等が挙げられる。

支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、検出対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン（例えば、対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、脱脂粉乳、カゼイン等が挙げられる。
上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、或いはヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル等）、又は非還元多糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース等）等でコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の上述のモノクローナル抗体を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。

＜その他＞
本実施形態の検出キットは、必要に応じて、反応停止液を更に含んでいてもよい。反応停止液としては、例えば、硫酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。

本実施形態の検出キットは、さらに、緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液としては、緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液は、必要に応じて、ＮａＣｌ、界面活性剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等)及び防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）のうち少なくともいずれか一方を含んでいてもよい。緩衝液の具体例としては、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）、又はＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）等が挙げられる。

本実施形態の検出キットにおいて、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメント及び標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体は、乾燥状態であってもよく、上述の緩衝液に溶解した上であってもよい。中でも、これらの抗体は、保存安定性から、乾燥状態であることが好ましい。

本実施形態の検出キットは、さらに、標準曲線（検量線）作成用の標準溶液、標準溶液希釈剤（例えば、上述の緩衝液等）を含んでいてもよい。
本実施形態の検出キットは、さらに、洗浄液（例えば、上述の緩衝液等）や、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材（例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール等）を含んでいてもよい。

本実施形態の検出キットは、さらに、検出装置を備えていてもよい。検出装置としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。

≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するための方法≫
一実施形態において、本発明は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するための方法であって、前記血液試料と、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントとを接触させて、抗原抗体反応を行う１次抗原抗体反応工程を備える、方法を提供する。

本実施形態の検出方法によれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に検出することができる。また、健常体を対象とする薬物動態試験において、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの正確な血中濃度を測定することができ、最高血中濃度及び半減期を算出することができる。さらに、自己免疫性ＰＡＰ患者を対象とする医師主導治験において、正確なトラフ値を測定することができ、患者の全身クリアランスを推定することができる。

＜１次抗原抗体反応＞
まず、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体から血液試料を採取する。血液中での酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの濃度のピーク時を測定する場合は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの投与から、例えば、１５〜３０分後に血液試料を採取すればよい。

本明細書において、「血液試料」としては、例えば、血液、血清、血漿等が挙げられる。
本明細書において、「健常体」及び「被検体」としては、例えば、ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物等が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。

また、被検体に酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与する方法としては、例えば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含む製剤を静脈内注射する方法、マイクロスプレーを用いて気管内に噴霧投与する方法、又は膜型ネブライザー或いはジェットネブライザーを用いて、経気道的に投与する方法等が挙げられる。

酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含む製剤は、その他の成分として、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含んでいてもよい。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤としては、例えば、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。

また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えば、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質等を挙げることができる。

薬理学上許容される担体又は希釈剤として、さらに具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。

酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含む製剤が注射剤である場合、無菌組成物は、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤（例えば、アルコール（具体的には、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等））、又は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）と併用してもよい。

また、油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、又は酸化防止剤をさらに配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類等）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法等によって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。

酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの投与量は、被検体の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
例えば、マイクロスプレー、膜型ネブライザー又はジェットネブライザーを用いて被検体（ヒト）に吸入させる場合、被検体に対し、１日の投与量として、１ｋｇ体重当たり、例えば１ｎｇ〜５μｇの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの量を投与すればよく、例えば１０ｎｇ〜１μｇの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの量を投与すればよく、例えば５０ｎｇ〜５００ｎｇの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの量を投与すればよい。投与回数としては、１日平均当たり、１回〜数回投与すればよい。

ピーク時の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの血中濃度としては、例えば２００ｐｇ／ｍＬ〜２ｎｇ／ｍＬであればよく、例えば４００ｐｇ／ｍＬ〜１．５ｎｇ／ｍＬであればよく、例えば５００ｐｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬであればよい。

続いて、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントと、被検体から採取した血液試料とを接触させて、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントと、血液試料中の抗原（酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ）とによる１次抗原抗体反応を行う。この抗原抗体反応は、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの抗体価及び血液試料中の抗原（酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ）の量によって、適宜調整することができる。

上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、上述の≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫において例示したものと同様のものが挙げられる。

上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体に、血液試料を滴下し、接触させればよい。また、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を緩衝液等に懸濁し、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を含む溶液と、血液試料とを混合して接触させればよい。使用する緩衝液としては、上述の≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫において例示したものと同様のものが挙げられる。

また、１次抗原抗体反応前に、血液試料中に含まれる酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを変性させる前処理工程を備えていてもよい。酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを変性させることにより、血液試料中に含まれる抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ自己抗体が酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに結合し複合体を形成するのを防ぐ事ができる。変性される方法としては、例えば、変性剤又は界面活性剤存在下において、例えば９０℃以上９５℃以下の温度で、例えば３分以上１０分以下加熱する方法等が挙げられる。使用する変性剤としては、例えば、ジチオトレイトール （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）等が挙げられる。使用する界面活性剤としては、例えば、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）等が挙げられる。

標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを用いることにより、１次抗原抗体反応を検出してもよい。また、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦが上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した際に、センサー等により１次抗原抗体反応を検出してもよい。検出感度及び反応特異性の観点から、続く、２次抗原抗体反応工程を行い、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出することが好ましい。

＜２次抗原抗体反応＞
続いて、血液試料を取り除き、洗浄する。洗浄は、例えば、緩衝液等を用いて行えばよい。使用する緩衝液としては、上述の≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫において例示したものと同様のものが挙げられる。

続いて、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体と、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントとを接触させる。この抗原抗体反応についても、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、使用する標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体の抗体価によって、適宜調整することができる。

使用する標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体としては、上述の≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫において例示したものと同様のものが挙げられる。

標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体は、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、上述の≪酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキット≫において例示したものと同様のものが挙げられる。

上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を含む溶液を滴下し、接触させればよい。また、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を含む溶液と、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を含む溶液とを混合して接触させればよい。

また、２次抗原抗体反応後に、１次抗原抗体反応後と同様に洗浄を行ってもよい。また、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体の標識物質が酵素である場合、酵素基質と接触させる工程、反応停止液を添加して反応を停止させる工程等をさらに備えていてもよい。

続いて、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体を検出することにより、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの有無を判断することができる。さらに、標識された上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントを検出することにより、血液試料中に含まれる酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを定量することができる。検出方法としては、標識物質の種類により、当業者が適宜選択することができる。例えば、蛍光物質で標識した抗ヒト抗体を検出する場合、蛍光スキャナー又は２光子励起スキャナー等により検出することができる。

本実施形態の検出方法は、上述の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、検出機構やサンプル分注機構等の解析に必要な周辺装置と組み合わせることによって、全自動あるいは半自動の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの検出システムとして提供することができる。この検出システムによれば、血液試料中に含まれる酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの有無を全自動あるいは半自動で簡便に判断することができる。さらに、血液試料中に含まれる酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを定量することができ、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの正確な血中濃度を測定することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ハイブリドーマの樹立
以下に示すハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体の作製は、ＩＴＭ社に委託して行った。なお、ＩＴＭ社では、腸骨リンパ節法（特許第４０９８７９６号公報、参照。重井医学研究所からのライセンス許諾により実施。）を用いて、ハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体を行った。

（１）マウスへの免疫
まず、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＧＥＮＺＹＭＥ社製）を、０．１％ジチオトレイトール （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）存在下で９５℃５分間加熱し、変性させた。続いて、この変性させた酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦをマウス尾根部に注射し、免疫した。２００μｇ／注射になるように注射剤を調製し、１回のみ免疫した。

（２）ハイブリドーマの作製
続いて、免疫マウスから脾臓を摘出し、ポリエチレングリコールを用いて、摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ａｇ３．６５３株、ＡＴＣＣ社製）とを融合し、ＨＡＴ培地により選別した。続いて、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体ハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングは、変性した酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを抗原としたＥＬＩＳＡ法で行った。

スクリーニングでポジティブだった株をモノクローニングし、最終的に、複数の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体酸性ハイブリドーマを樹立した。そのうちの１株のハイブリドーマ株について、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦにのみ特異的に結合するモノクローナル抗体を産生することが後述の試験例１及び２を行うことで判明したため、寄託した（ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４）。

続いて、上記寄託したハイブリドーマを培養し、５０％硫酸アンモニウムで沈殿濃縮した免疫グロブリン分画を用いて、ＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥバイオサイエンス社製）に結合させ、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）で溶出し、培養上清から分離して、精製抗体を得た。

以下、ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４から得られた抗体を「４０−１Ｈ抗体」と記載する。

［試験例１］抗体特異性の検討１
（１）ペプチドの固相化
以下の表１に示す酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの部分アミノ酸配列からなるペプチド断片４種（Ｎｏ．１〜４）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼して、合成した。続いて、９６ウェルプレートにＮｏ．１〜４の合成ペプチド及び全長の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｏ．５）（別名：サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）をそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度の溶液に調製し、固相化した（図１参照）。

（２）ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）による検出
続いて、ＰＢＳに溶解した４０−１Ｈ抗体を各ウェルに５０μＬ添加し、室温で４５分間反応させた。続いて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２００μＬで３回洗浄した。続いて、２次抗体として、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。各ウェルに２次抗体５０μＬを添加し、室温で３０分間反応させた。続いて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２００μＬで３回洗浄した。続いて、酵素基質剤としてＴＭＢ （３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）５０μＬを添加し、室温で１５分間反応させた。続いて、反応停止液として０．５Ｍ硫酸５０μＬを添加し、直ちに、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２及び表２に示す。図２（Ａ）は、反応停止液を添加直後の各ウェルの発色の様子を示す画像であり、図２（Ｂ）は各ウェルでの４５０ｎｍの吸光度を測定した結果を示すグラフである。

図２（Ａ）及び（Ｂ）から、Ｎｏ．１及びＮｏ．５において、発色が検出された。また、１．０以上の吸光度が検出されたが、それ以外のウェルではほとんど検出されなかった。Ｎｏ．１及びＮｏ．５において、このことから、４０−１Ｈ抗体はＮｏ．１のペプチド断片に特異的に結合することが推察できた。

［試験例２］抗体特異性の検討２
（１）ペプチドの固相化
実施例１と同様の方法を用いた変性させた酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、未変性の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、大腸菌由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（別名：モルグラモスチム、Ａｍｙｔｏｐ社製）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞産生組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ社製）及びウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）を、公知の方法を用いて調製した。続いて、９６ウェルプレートにこれら５種の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度の溶液に調製し、固相化した。

（２）ＥＬＩＳＡによる検出
試験例１の（２）と同様の方法を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。

図３から、Ｎｏ．１及びＮｏ．２において、吸光度が検出されたが、それ以外のウェルではほとんど検出されなかった。このことから、４０−１Ｈ抗体は酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合することが推察できた。

［試験例３］抗体特異性の検討３
（１）ペプチドの固相化
以下の表２に示す酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの部分アミノ酸配列からなるペプチド断片１３種（Ｎｏ．６、８〜１９）及び大腸菌由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの部分アミノ酸配列からなるペプチド断片（Ｎｏ．７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼して、合成した。続いて、９６ウェルプレートにＮｏ．６〜１９の合成ペプチドをそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度の溶液に調製し、固相化した。

（２）ＥＬＩＳＡによる検出
試験例１の（２）と同様の方法を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を上記表２に示す。ペプチドを固相化されていないウェルにおける吸光度をコントロールとしたとき、コントロールと比較して、吸光度が有意に高いものを「○」とし、吸光度に有意な差が見られなかったものを「×」と判定した。

表２から、４０−１Ｈ抗体が認識する酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列（すなわち、エピトープ）はＮ末端から１０番目から２７番目までの１８アミノ酸残基であった。この１８アミノ酸残基には、Ｎ末端から２３番目のロイシン残基が含まれている。よって、４０−１Ｈ抗体は、Ｎ末端から２３番目のアルギニン残基を有する自然界のＧＭ−ＣＳＦと反応しないことが確かめられた。
また、この１８アミノ酸残基には、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦにおける第１番目のαへリックス全体が含まれることから、４０−１Ｈ抗体はこの三次構造を認識していると推察された。

［試験例４］酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの薬物動態試験
（１）健常カニクイザルへの酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの吸入投与
まず、健常カニクイザルに酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ ５０ｍｇを吸入投与させた。次いで、吸入直後、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、及び２４時間後に採血し、血清を分離した。

（２）ＥＬＩＳＡによる検出
次いで、４０−１Ｈ抗体を捕捉抗体として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識されたマウスモノクローナル抗体（３３−８Ｆ：ＩｇＧ１）（以下、「３３−８Ｆ抗体」と称する場合がある。）で検出する、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、検出を行った。
具体的には、まず（１）で得られた血清をそれぞれＳＤＳ存在下で、９５℃、３０分間加熱変性させた。次いで、加熱変性後の血清と３３−８Ｆ抗体とを混合し、４℃で一晩静置した。次いで、この混合サンプルを４０−１Ｈ抗体を固相化させたマイクロプレートに添加し、室温で１時間孵置した。次いで、マイクロプレートを洗浄後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標） アルカリフォスファターゼ基質（Ｔｒｏｐｉｘ（登録商標） ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標） Ｓａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加えた。次いで、発光を蛍光・発光マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて測定した。結果を図４に示す。図４において、「ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）」は、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを示す。

図４から、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦは吸入直後において血中濃度が急激に上昇し、吸入から１５分後にピークが認められた。その後、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの血中濃度は漸減したが、観察期間中に消失することはなかった。また、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの半減時間は２０．１分であった。
以上のことから、４０−１Ｈ抗体を用いることで、体内に投与された酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを特異的に検出することができるが明らかとなった。

本実施形態の抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合フラグメントによれば、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦのみを特異的に検出することができる。また、本実施形態の検出キットによれば、健常体を対象とする薬物動態試験において、酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの正確な血中濃度を測定することができ、最高血中濃度及び半減期を算出することができる。さらに、自己免疫性ＰＡＰ患者を対象とする医師主導治験において、正確なトラフ値（薬物を反復投与したときの定常状態における最低血中薬物濃度）を測定することができ、患者の全身クリアランス（薬物を体外に排泄する能力）を推定することができる。

Claims (8)

1. 酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマであって、前記ハイブリドーマが受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２２２４であることを特徴とするハイブリドーマ。
2. 酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法であって、
   請求項１に記載のハイブリドーマを培養する工程と、
   前記ハイブリドーマから生産された抗体を単離する工程と、
   を備えることを特徴とする製造方法。
3. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び、
   配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する、抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体。
4. 請求項１に記載のハイブリドーマから産生される、抗体。
5. 酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するためのキットであって、請求項３または４に記載の抗体を含むことを特徴とする検出キット。
6. さらに、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体を含む、請求項５に記載の検出キット。
7. 酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを投与した被検体の血液試料中の酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを検出するための方法であって、
   前記血液試料と、請求項３または４に記載の抗体とを接触させて、抗原抗体反応を行う１次抗原抗体反応工程を備えることを特徴とする方法。
8. さらに、前記１次抗原抗体反応工程の後に、標識された前記抗酵母由来組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体を接触させて、抗原抗体反応を行う２次抗原抗体反応工程を備える、請求項７記載の方法。

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