JP6963019B2 - 免疫調節剤及び陽イオン性リポソームを含む免疫増強用組成物及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規な構造の免疫調節剤を含む免疫増強用組成物に関し、より詳細には、毒性を減少させたリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）類似体及び陽イオン性リポソームを含む免疫増強用組成物及びその用途に関する。

リポソームは、生体適合性に優れており、製法が簡便なことから水溶性及び脂溶性薬物を運搬できる長所があり、体内での副作用が少ない薬物伝達体として活発に研究されている。既存のリポソームは、系自体が物理化学的に不安定であり、水溶液中に分散させて保管する時に凝集、融合、リン脂質の加水分解、酸化、及び封入薬物の漏れなどをもたらす短所があった。したがって、リポソームを長期間保管するとき、リポソーム自体の安定性を確保しなければならないという短所がある。このような短所を補完するために、リポソームの物理−化学的不安定性を克服するための方法として、リポソームを微細粉末化して保存することによって安定性を向上させる研究が盛んに進行されている。しかし、リポソームを微細粉末化するためには凍結乾燥過程を行うが、その過程にリポソームを単独で適用すると、安定性及び均質性が阻害して物理化学的特性が変形され、薬物伝達体としての機能の他にも免疫活性の効果が低下し、毒性が発生することにつながる。そこで、凍結乾燥過程でリポソームの変形を防止するために凍結防止剤などを添加してリポソームの長所を極大化しながら、生産及び保管、運送に有利な組成物に関する研究が行われている。

リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）は、グラム陰性バクテリアの外膜の主要成分であり、様々な免疫細胞の活性化を促進させ、特に先天性免疫反応を触発させる。ＬＰＳは、先天性免疫細胞によるサイトカイン分泌、 抗原提示細胞上の補助刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現及び抗原提示の誘導によって抗原提示細胞を活性化させ、これは先天性免疫反応と適応免疫反応を連結する（Ａｋｉｒａ Ｓ，Ｕｅｍａｔｓｕ Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｏ，Ｃｅｌｌ１２４：７８３−８０１（２００６）；Ｓｃｈｎａｒｅ Ｍ，Ｂａｒｔｏｎ ＧＭ，Ｈｏｌｔ ＡＣ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，Ａｋｉｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：９４７−９５０（２００１））。

ＬＰＳは両親媒性ドメイン（脂質Ａ）、コアオリゴサッカライド（ｃｏｒｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＯＳ）及びＯ−抗原（Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ或いはＯ−ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の３個のドメインで構成されている。脂質Ａは、ＬＰＳの内毒素活性を担当し、様々な類型の免疫細胞のＴＬＲ４（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）信号伝達によって免疫促進効果を示すと知られている（Ｒａｅｔｚ ＣＲ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ Ｃ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７１：６３５−７００（２００２））。減少された毒性を示す脂質Ａ誘導体が、ヒトワクチン免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）開発にターゲットとされてきた。ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）はサルモネラミネソタＲ型菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ｒｏｕｇｈ ｓｔｒａｉｎ）から分離されたＬＰＳの非毒性誘導体である。また、アルミニウム塩とＭＰＬの組合せは、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）とＨＰＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ワクチン用の免疫補助剤として承認されている。

ＬＰＳの場合、１９５０年代から坑癌効果が知られたが、ナノグラム（ｎｇ）レベルの汚染でも敗血症による死亡を招き得る毒性から使用し難いという不具合があった。このため、ＬＰＳの弱毒化の試みは続いており、特にポリサッカライドチェーンの除去又は脂質Ａの脱アシル化によって毒性を減少させることに成功した（Ｋａｔｚ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ１７；２７４（５１）：３６５７９−８４、 １９９９）。特に、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得た脂質Ａのリン酸化から得たＭＰＬの場合、ＬＰＳの毒性を除去した免疫抗癌剤として開発されたが、その効果はわずかであると知られている。

本発明者らは、既存のＬＰＳの使用時に問題とされた毒性を減少させながらも、優れた免疫促進活性を示し得るＬＰＳ類似体を開発し、リポソームの物理化学的不安定性を克服するために努力した結果、ヒトの腸で発掘した大腸菌菌株からＯ−抗原部位を持たないＬＯＳを分離精製し脱アシル化させて、毒性が減少した新規な構造の免疫調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）を発見し、また前記免疫調節剤と陽イオン性リポソームを含むワクチン組成物は優れた免疫促進相乗効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤；及び、（ｂ）陽イオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を含む免疫増強用組成物を提供することにある。

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）

本発明の他の目的は、（ａ）抗原；及び、（ｂ）前記免疫増強用組成物を有効成分として含むワクチン組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；及び、（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した後、前記（ａ）段階の溶液を混合して免疫増強用組成物を形成する段階を含む免疫増強用組成物の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）してリポソームを形成する段階；及び、（ｅ）前記（ｄ）段階のリポソームに（ａ）段階溶液及び抗原を添加した後、再び凍結乾燥する段階を含むワクチン組成物の製造方法を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤；及び、（ｂ）陽イオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を含む免疫増強用組成物を提供する。

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）

本発明はまた、（ａ）抗原；及び、（ｂ）前記免疫増強用組成物を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。

本発明はまた、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；及び、（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した後、前記（ａ）段階の溶液を混合して免疫増強用組成物を形成する段階を含む免疫増強用組成物の製造方法を提供する。

本発明はまた、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）してリポソームを形成する段階；及び、（ｅ）前記（ｄ）段階のリポソームに（ａ）段階の溶液及び抗原を添加した後、再び凍結乾燥する段階を含むワクチン組成物の製造方法を提供する。

また、本発明は、前記免疫反応調節剤を患者に処理することを特徴とする、免疫疾患の予防方法及び予防するための用途を提供する。

図１Ａは、抽出されたＬＯＳを電気泳動及びシルバー染色によって確認した結果であり、図１Ｂは、ＬＯＳをアルカリ処理した時に Ｏ-アシル鎖除された脂質Ａが分解されることによって抽出されたＬＯＳを基準に、免疫反応調節剤（ＥＧ−ＩＭ）の大きさが小さくなることを確認した結果である。Ｍはマーカーを表し、レーン１は脱アシル化前の抽出されたＬＯＳ（脱アシル化前ＬＯＳ）、レーン２は免疫反応調節剤（ＥＧ−ＩＭ）を表す。 図２は、本発明の免疫反応調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）の構造を示す。Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。 図３は、脂質溶解段階におけるリポソームサイズ分布度を示すグラフである。 図４は、糖脂質をリポソームと単純混合した段階におけるリポソームサイズ分布度を示すグラフである。 図５は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞増殖効果を示すグラフである。 図６は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭのＴＮＦ−ａ分泌の誘導効果を示すグラフである。 図７は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの細胞毒性緩和効果を示すグラフである。 図８は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンの形成が静電気的引力によることを証明する結果である。ＬＰはリポソーム、Ｓは上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）、Ｐは沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を表す。 図９は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞リクルーティング（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）効果を示すグラフである。 図１０は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンの取り込み（ｕｐｔａｋｅ）効果をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した結果を示す。 図１１は、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）による取り込み効果（ｕｐｔａｋｅ ｅｆｆｅｃｔ）を示すグラフである。図１１（Ａ）は、ｄＬＮで蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な細胞を分析したものであり、図１１（Ｂ）は、筋肉組織で蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な細胞を分析したものであり、図１１（Ｃ）は、ｄＬＮで蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な単球を測定したものであり、図１１（Ｄ）は、筋肉組織で蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な単球を測定したものである。 図１２は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンのデポ（ｄｅｐｏｔ）効果を示すものである。 図１３は、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むジカウイルスワクチンのジカウイルス抗原の特異−抗体力価を測定したものである。 図１４（Ａ）は、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む日本脳炎ワクチンのＪＥＶ特異−抗体力価を測定したものであり、図１４（Ｂ）は、日本脳炎ワクチン投与後ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を測定したものである。 図１５（Ａ）は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む結核ワクチンのＴＢ特異−抗体力価を測定したものであり、図１５（Ｂ）は、結核ワクチン投与後ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を測定したものであり、図１５（Ｃ）は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む結核ワクチンのバクテリア殺菌効果を分析したものである。 図１６（Ａ）は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む百日咳ワクチンのＴＢ特異−抗体力価を測定したものであり、図１６（Ｂ）は、百日咳ワクチンによるＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を分析したものである。 図１７（Ａ）は、百日咳ワクチン投与後ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を測定したものであり、白色グラフは脾臓細胞、黒色グラフは肺細胞における結果を示す。図１７（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ、百日咳ワクチン投与時に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７の誘導能を示すものである。 図１８は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチン投与時にＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を測定したものである。 図１９は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンに脂質成分を追加した場合、相乗効果を分析したものである。図１９はコレステロールを追加している。 図２０は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンに脂質成分を追加した場合、相乗効果を分析したものである。図２０はスクアレンを追加している。 図２１は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンに脂質成分を追加した場合、相乗効果を分析したものである。図２１はトリカプリンを追加している。 図２２は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンにサポニン系免疫補助剤成分を追加した場合、相乗効果を分析したものである。 図２３は、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンの最終剤形による免疫原性分析を示すものである。図２３（Ａ）はＩＬ−５、図２３（Ｂ）、（Ｃ）はＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を示すものである。ＮＰ−ＡはＤＤＡ／ＤＯＰＣ、ＮＰ−ＢはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ、ＮＰ−ＣはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ／スクアレン、ＮＰ−ＤはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ／トリカプリンを表し、＋は単純混合剤形を、／は混合後凍結乾燥剤形を表す。

別に定義しない限り、本明細書で使う全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使う命名法及び以下に記述する実験方法は、当該技術分野によく知られており、通常使用されるものである。

本発明の一実施例では、ＤＭＰＣとＤＯＴＡＰが混合された脂質混合溶液に免疫反応調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）溶液を混合して、ＥＧ−ＩＭが含まれた脂質混合溶液を製造した後、再水和過程によってリポソームＥＧ−ＩＭ（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ）を製造し、マウス大食細胞株を用いてｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞増殖及び細胞毒性緩和効果を確認した。

したがって、本発明は、一観点において、（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）；及び、（ｂ）陽イオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を含む免疫増強用組成物に関する。

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）

本発明は、他の観点において、前記免疫増強用組成物の製造方法に関し、下記の段階によって免疫増強用組成物が製造され得る。
（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；及び、（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した後、前記（ａ）段階の溶液を混合して免疫増強用組成物を形成する段階。

本発明の免疫反応調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）は、化学式１で表すことができる。

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）

本明細書で使う用語“ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）”は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の変形体であり、天然ＬＰＳよりも短い糖鎖を有し、分子量が小さいものを意味する。脱アシル化前ＬＯＳは、好ましくは、分子量が３，０００〜１０，０００Ｄａであり、より好ましくは３０００〜４０００Ｄａである。用語“脱アシル化ＬＯＳ”とは、このようなＬＯＳにおいて脂質Ａのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去され、ＬＯＳと対比して毒性が大きく減少したものを意味する。脂質Ａのグルコサミンに脂肪酸は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合によって結合している。本発明の脱アシル化ＬＯＳは、脂質Ａの脱アシル化によって、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去されたものを指す。

前記ＥＧ−ＩＭは、様々な方法で製造できるが、本発明者らの先行特許である大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；及び、ＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって製造することができる。例えば、ＬＰＳに強塩基（例えば、０．２Ｎ ＮａＯＨ）を処理し、脱アシル化して脂質Ａから一部の脂肪酸を除去して脱毒素化する。

本発明によれば、前記ＥＧ−ＩＭは、２〜６個のホスフェートを含むことができ、好ましくは３〜４個のホスフェート基を含むことができるが、これに制限されるものではない。また、上記の化学式１においてホスフェート基の個数及び位置は、下記の表１の例示の通りでよい。

前記ホスフェートは、化学式１のＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、ＥＦ、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦ、ＤＥＦ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＤＥＦ、 ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、 ＢＤＥＦ、ＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＥＦ及びＡＢＣＤＥＦから構成される群から選ばれる位置に結合し得る。

本発明によれば、上記の化学式１において糖は、ヘキソース、ヘキソサミン、Ｎ−アセチルヘキソサミン、ヘプトース及びＫｄｏ（２−ケト−３−デオキシ−オクトネート）から構成される群から選ばれる。

本明細書で使う用語、“ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）”は、１分子中に６個の炭素原子を含有した単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を意味し、例えば、ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノ−ス、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、及びデオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）があり、これらに限定されるものではない。

本発明によれば、前記ヘキソースはアルドヘキソースであり、一特定例において前記アルドヘキソースはグルコース又はガラクトースである。

本明細書で使う用語、“ヘプトース（ｈｅｐｔｏｓｅ）”は、１分子中に７個の炭素原子を含有した単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を意味し、官能基（アルデヒド基及びケトン基）の位置によって、アルドヘプトース（ポジション１）及びケトヘプトース（ポジション２）に区分できる。前記アルドヘプトースは、例えば、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースがあり、これに限定されるものではない。前記ケトヘプトースは、例えば、セドヘプツロース及びマンノヘプツロースがあり、これに限定されるものではない。
本発明によれば、ヘキソサミンはグルコサミン、ガラクトサミンまたはマンノサミンであり、そして特定の例では、ヘキソサミンはグルコサミンである。

本発明によれば、前記Ｎ−アセチルヘキソサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はＮ−アセチルマンノサミンであり、一特定例において、前記Ｎ−アセチルヘキソサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミンである。

本発明のＥＧ−ＩＭは、野生型ＬＰＳよりも少ない個数の糖を有するが、本発明によれば、前記ＥＧ−ＩＭは５〜７個の糖を含むことができ、一特定例においてＥＧ−ＩＭの糖数は６〜７個であるが、これに制限されるものではない。

本発明のＥＧ−ＩＭは、Ｏ−連結された（Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ）脂肪酸を有しない。

本発明のＥＧ−ＩＭは、脂質Ａから脂肪酸（例えば、Ｃ１４脂肪酸）が除去され（脱アシル化）、毒性が顕著に減少した特徴を有する。脂肪酸は、脂質Ａのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合によって結合している。本発明でいう脱アシル化は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去されることを意味する。

前記脱アシル化は、ＬＯＳにアルカリを処理して実施でき、前記アルカリは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）_２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）_２、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）_２を含み、より好ましくはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）_２、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＬｉＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）_２であり、さらに好ましくはＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）_２であり、最も好ましくはＮａＯＨである。

本発明によれば、本発明のＥＧ−ＩＭは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から由来したものであり、前記大腸菌は大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）である。前記菌株は２０１５年１１月１９日付に韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰで寄託された。

本発明のＥＧ−ＩＭは、免疫促進効能が従来の免疫補助剤に対比して優れているだけでなく、毒性も減少しており、本発明のワクチン組成物に非常に適している。本発明のＥＧ−ＩＭは、ＬＰＳの毒性を除去するためにＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化から得たＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）よりも毒性が少ない。

本発明において陽イオン性リポソームは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール］（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ］，ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリエチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０−１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１８：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１２：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、Ｎ１−［２−（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［オレイルオキシ］−ベンズアミド（Ｎ１−［２−（１Ｓ）−１−［（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］−４−［ｄｉ（３−ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−３，４−ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＭＶＬ５）、１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＤＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＤＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロパン−１−アンモニウム（Ｎ−（４−ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，３−ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ−１−ａｍｉｎｉｕｍ，ＤＯＢＡＱ）、１，２−ステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＴＡＰ）、及びＮ４−コレステリル−スペルミン（Ｎ４−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−Ｓｐｅｒｍｉｎｅ，ＧＬ６７）から構成される群から選ばれる陽性脂質である。前記陽イオン性リポソームは、単独で使用するか、又は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３− ホスホリルコリン （１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＬＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から構成される群から選ばれる中性脂質と混合して使用することができる。本発明の一実施例では主に、ＤＯＴＡＰ及びＤＭＰＣを混合（ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ）、ＤＤＡ及びＤＯＰＣを混合（ＤＤＡ：ＤＯＰＣ）、ＤＤＡ及びＤＭＰＣを混合（ＤＤＡ：ＤＭＰＣ）して使用している。

本明細書で使う用語、“免疫増強”は、初期免疫反応を誘導したり、抗原に対する既存の免疫反応を測定可能な程度に増加させることを指す。

本発明の他の実施例では、ＤＭＰＣとＤＯＴＡＰが混合された脂質混合溶液にＥＧ−ＩＭ溶液を混合してＥＧ−ＩＭが含まれた脂質混合溶液を製造した後、再水和過程によってｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを製造し、抗原を添加してワクチンを製造し、また、該ワクチンの免疫効能を確認するために、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭに、それぞれ、組換えジカウイルスエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質、日本脳炎ウイルス抗原、組換え結核抗原であるＡｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、ＨｓｐＸ、精製百日咳ワクチン（ａＰ）抗原、組換え帯状疱疹（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＶＺＶ）ｇＥ抗原を混合して製造されたワクチンを、マウスに投与して抗体力価を測定し、サイトカインを分析した。その結果、それぞれのワクチンは抗体性免疫及び／又は細胞性免疫効能に優れていることを確認した。

したがって、本発明は、さらに他の観点において、抗原及び前記免疫増強用組成物を有効成分として含むワクチン組成物に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記ワクチン組成物の製造方法に関し、下記の段階によってワクチン組成物を製造することができる。
（ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；

（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
（ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；
（ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）してリポソームを形成する段階；及び、
（ｅ）前記（ｄ）段階のリポソームに（ａ）段階溶液及び抗原を添加した後、再び凍結乾燥させる段階。

本明細書で使う用語、“抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）”は、受容者の免疫反応を誘導する物質である。したがって、本発明では、このような免疫反応誘導効能を示す物質を、制限なく使用することができる。

本発明の前記抗原は、ペプチド、蛋白質、核酸、糖（ｓｕｇａｒ）、病原体、弱毒化された病原体、不活性化された病原体、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞又は細胞断片でよい。

本発明において前記抗原は、ジカウイルスの抗原、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）の抗原、結核菌抗原、百日咳抗原、水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＢ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ Ｂ）の抗原、ＭＥＲＳウイルスの抗原、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗原、炭疽菌の抗原、ＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の抗原、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の抗原、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の抗原、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の抗原、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の抗原、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の抗原、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）の抗原、マラリアの抗原、デングウイルスの抗原、ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原、重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ ｆｅｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ；ＳＦＴＳ Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）の抗原、サーズコロナウイルス（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、エボラウイルスの抗原、肺炎球菌の抗原でよい。本発明の一実施例では、ジカウイルスの抗原、日本脳炎ウイルスの抗原、結核菌抗原、百日咳抗原、水痘・帯状疱疹ウイルスの抗原を用いて本発明の免疫原性増強効果を確認した。

本発明の前記水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）の抗原は、水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）のｇＢ（ｇｐＩＩ）、ｇＣ（ｇｐＶ）、ｇＥ（ｇｐＩ）、ｇＨ（ｇｐＩＩＩ）、ｇＩ（ｇｐＩＶ）、ｇＫ及びｇＬ（ｇｐＶＩ）抗原から構成された群から選ばれる一つ以上であり得る。

本発明のワクチンは、疾病の予防用又は治療用に使うことができ、前記ワクチンは、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、コンジュゲートワクチン、組換えワクチン、単価ワクチン、多価ワクチン又は混合ワクチンの形態でよい。

また、本発明のワクチンは、ジカワクチン、日本脳炎ワクチン、結核ワクチン、百日咳ワクチン、帯状疱疹ワクチン、水痘ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ Ｂ）ワクチン、ＭＥＲＳワクチン、緑膿菌ワクチン、癌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＡＶワクチン、ＨＢＶワクチン、ＨＣＶワクチン、ＨＩＶワクチン、脳髄膜炎ワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、多剤耐性菌ワクチン、腸球菌ワクチン、葡萄球菌ワクチン、肺炎桿菌ワクチン、アシネトバクターワクチン、エンテロバクターワクチン、ヘリコバクターワクチン、マラリアワクチン、デング熱ワクチン、ツツガムシワクチン、重症熱性血小板減少症候群ワクチン、サースワクチン、エボラワクチン、インフルエンザワクチン、肺炎球菌ワクチンであってもよい。

前記癌ワクチンは、これらによって制限されるものではないが、線維肉腫、膀胱癌、脳下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、上咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆嚢癌、陰茎癌、尿管癌、腎細胞癌、前立腺癌、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、白血病、小児癌、皮膚癌、卵巣癌及び子宮頸癌に対するワクチンから構成される群から選ぶことができる。。

本発明に係るワクチンは、単純混合剤形又は凍結乾燥剤形でよい。

本発明に係るワクチンは、前述した抗原、化学式１で表示される免疫反応調節剤及び陽イオン性リポソームを一つの容器に含むことができ（ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅワクチン）、このような特徴から、すぐに使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態で製造され得る。好ましくは、水痘・帯状疱疹ウイルスワクチン、すなわち、帯状疱疹ワクチン又は水痘ワクチンをすぐに使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態で製造することができる。

また、本発明のワクチンは、当業界で容認される脂質の成分をさらに含むことができ、本発明の一実施例では、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）又はトリカプリン（Ｔｒｉｃａｐｒｉｎ）をさらに含むワクチンを製造し、免疫原性相乗効果を確認した（図１９〜図２１）。

また、本発明のワクチンは、当業界で容認される免疫補助剤としてサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１などをさらに含むことができ、本発明の一実施例では、サポニン由来物質であるＱｕｉｌＡを含むワクチンを製造し、免疫原性相乗効果を確認した（図２２）。

本発明のワクチン組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができ、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明のワクチン組成物は、それらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘未剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明のワクチン組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉内注入、腹腔注入、経皮投与などで投与できる。

本発明のワクチン組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排せつ速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方できる。

本発明のワクチン組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造したり、又は多用量容器内に入れて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。

以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとっては明らかであろう。

製造例：免疫反応調節物質（ＥＧ−ＩＭ）の製造
１．乾燥菌体の製造
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を３７℃ ＴＳＢ（Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ，Ｄｉｆｃｏ）３０ｇ／Ｌ培地で２０時間８０ｒｐｍ以下で振盪培養し、遠心分離機を用いて菌体を回収した。回収した菌体にエタノールを混ぜて遠心分離し、沈殿物を得た。その後、得られた沈殿物にアセトンを添加して十分に混ぜた後、遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物にエチルエーテルを添加してよく混ぜた後、遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を６０℃乾燥オーブンで乾燥させ、乾燥菌体を製造した。

２．ＬＯＳ抽出
乾燥菌体の重量を測定した後、重量１ｇ当たり７．５ｍＬのＰＣＰ（フェノール、クロロホルム、ペトロリウムエーテル）抽出混合液を添加し、菌体菌からＬＯＳを分離した。この方法で分離して得たＬＯＳ抽出物は、回転蒸発器を用いて高温で有機溶媒を除去した。残っている抽出液は高温で遠心分離して沈殿物を得、沈殿物にエチルエーテルを添加して沈殿物を洗浄した。次に、精製水を入れて沈殿物を生成した。生成された沈殿物は遠心分離して上清液と分離し、沈殿物はエタノールで洗浄して回収した。高温乾燥オーブンで沈殿物を十分に乾燥させ、精製水で沈殿物を溶解させてＬＯＳを抽出した。

３．ＬＯＳの毒性除去
ＬＯＳ抽出物の含有量を確認した後、３ｍｇ／ｍＬ濃度にし、０．２Ｎ ＮａＯＨと１：１ボリュームで混ぜる。６０℃恒温水槽で１２０分間反応させながら、１０分ごとに５秒間ｖｏｒｔｅｘミキサーを用いて混ぜた。その後、初期０．２Ｎ ＮａＯＨ量の約１／５程度の１Ｎ酢酸を添加した。その後、エタノール沈殿法を用いて免疫反応調節物質であるＥＧ−ＩＭを得た。

４．ＬＯＳ及びＥＧ−ＩＭの定量及び確認
ＬＯＳ及びＥＧ−ＩＭの含有量は、２−チオバルビツール酸（２−Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いたＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトン酸）定量法で測定し、濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きさによって分離し、シルバー染色によって確認し、図１に示した。図１のＡは、抽出されたＬＯＳを電気泳動及びシルバー染色によって確認した結果であり、図１のＢは、ＬＯＳをアルカリ処理した時、脂質Ａが分解されることによって抽出されたＬＯＳを基準に、ＥＧ−ＩＭの大きさが小さくなることを確認した結果である。Ｍはマーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ(R) Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＣ５９５２）を表し、レーン１は、脱アシル化前の抽出されたＬＯＳ（脱アシル化前ＬＯＳ）、レーン２は、脱アシル化されたＬＯＳであるＥＧ−ＩＭを表す。

実施例１：免疫反応調節物質（ＥＧ−ＩＭ）の構造分析
精製した試料は、精製水で適度に希釈した。Ｃ１８逆相カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ３００ Ｃ１８ １．７ｕｍ ２．１×１５０ｍｍ）を機器（Ｗａｔｅｒ社のＵＰＬＣ）に装着した後、移動相Ａ（５０ｍＭぎ酸アンモニウムｐＨ４．５）と移動相Ｂ（１００％アセトニトリル）を用いて３５〜９５％濃度勾配を与えて試料を分離した。ＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析は、質量分析機（ＶＥＬＯＳ ＰＲＯ、Ｔｈｅｒｍｏ社）を利用した。１００〜３０００ｍ／ｚ範囲の分子を分析し、ＭＳ分析の後、確認された５０〜２０００ｍ／ｚ範囲の分子を再び分析した。２３７２ｍ／ｚ分子量を持つ分子が主として（ｍａｊｏｒｌｙ）確認され、それぞれのピーク（ｐｅａｋ）を分析した構造模式図は、図２に示した。

製造例２：ＥＧ−ＩＭを含むリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ）の製造
１．ＥＧ−ＩＭ溶液及びＭＰＬ溶液の製造
（１）ＥＧ−ＩＭを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン溶液の製造
１ｍｇ／ｍＬのＥＧ−ＩＭを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン溶液を製造し、−２０℃に保管した。

（２）ＥＧ−ＩＭを含む１０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液の製造
１ｍｇ／ｍＬのＥＧ−ＩＭを含む１０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を製造した。

（３）ＭＰＬを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン溶液の製造
ＭＰＬ ５ｍｇが入っているバイアルに０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン５ｍＬを入れ、強くボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、１０分間超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）し、均質化したＭＰＬ溶液を製造した。製造した溶液は、１ｍｇ／ｍＬずつシリコンチューブに小分し、−２０℃に保管した。

２．ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの製造
（１）リピド（ｌｉｐｉｄ）溶解及び糖脂質を混合した試料の製造
Ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを溶媒にして１ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ又はＤＯＴＡＰ溶液を作り、ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘした。製造されたＤＭＰＣ溶液１ｍＬとＤＯＴＡＰ溶液１ｍＬをバイアルに分注し、ＤＭＰＣとＤＯＴＡＰが１：１（ｖ／ｖ）で混合された脂質混合溶液を製造した。

脂質混合溶液にＥＧ−ＩＭを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンを混合して、６ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％のＥＧ−ＩＭが含まれた脂質混合溶液を製造し、ＭＰＬを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンを混合して、６ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％のＭＰＬが含まれた脂質混合溶液を製造した。その後、脂質混合溶液が入っているバイアルを−７０℃ディープフリーザーで１時間予備凍結させた後１２時間以上凍結乾燥させ、脂質混合物ケーキを製造した。

（２）再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）過程によるリポソームの製造
脂質混合物ケーキのうち、単純脂質混合バイアルとＥＧ−ＩＭ又はＭＰＬが含まれた脂質混合バイアルに１０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を１ｍＬずつ加え、ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘしてリポソームを製造した。

（３）糖脂質をリポソームと単純混合した試料の製造
ＥＧ−ＩＭを含む１０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液とリポソーム溶液を容量別に混合し、リポソームとＥＧ−ＩＭ６ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％を単純混合した試料を製造した。

ＭＰＬを含む０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン溶液とリポソーム溶液を容量別に混合し、リポソームとＭＰＬ６ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％を単純混合した試料を製造した。

実施例２：ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの物成分析
１．リポソームサイズの分析
（１）リポソームサイズ変化率の分析
脂質溶解段階の試料及び製造例２−（３）の糖脂質をリポソームと単純混合した試料をそれぞれ１ｍＬずつキュベットに入れた後、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）装備（Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＺＳＰ ｎａｎｏ）を用いて流体力学的サイズ（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｚｅ）を測定した（表２）。

その結果、ＭＰＬは、リポソームと単純混合する場合、サイズが非常に大きくなる傾向が観察された。一方、ＥＧ−ＩＭは、高含量／単純混合の製造時にややサイズが増加するが、１μｍ以下であり、含有量及び製造方法がサイズ変化に影響を及ぼさなかった。このため、ＥＧ−ＩＭを含むリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ）は、製造後にサイズ変化率が少なく、よって、封入型、吸着型などの様々な形態で製造可能であり、３００〜６００ｎｍ（＜１ｕｍ）のナノサイズにも製造可能なものと判断される。

（２）リポソームサイズ均質度の分析
脂質溶解段階の試料及び製造例２−（３）の糖脂質をリポソームと単純混合した試料をそれぞれ１ｍＬずつキュベットに入れた後、動的光散乱装備（Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＺＳＰ ｎａｎｏ）を用いて流体力学的サイズ及び分布度を導出した（表３、図３及び図４）。図３には、脂質溶解段階でのリポソームサイズ分布度を示し、図４には、糖脂質をリポソームと単純混合した段階でのリポソームサイズ分布度を示す。

その結果、ＭＰＬの場合は、濃度に依存的に分散度が大きくなる傾向が観察された。一方、ＥＧ−ＩＭの場合は、含有量に関係なく分散度が均一に維持された。

脂質溶解段階に糖脂質を含ませると、糖脂質が封入された形態のリポソームが形成される（図３）。ＭＰＬの場合は、製造されたリポソームのサイズ分布が均一でなく、ＭＰＬ自体のミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）が形成されることが確認できる（図３の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ））。一方、ＥＧ−ＩＭの場合は、製造されたリポソームが均質に製造され、単一のピークを形成することが確認できる（図３の（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ））。したがって、ＥＧ−ＩＭは、封入された形態のリポソームを均一に製造できることを確認した。

リポソームと糖脂質を単純混合すれば、糖脂質がリポソーム表面に吸着された形態のリポソームが形成される（図４）。ＭＰＬの場合は、製造されたリポソームのサイズ分布が均一でなく（表３）、ＭＰＬ自体のミセルが形成されることが確認できる（図４の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ））。一方、ＥＧ−ＩＭの場合は、製造されたリポソームが均質に製造され、単一のピークを形成することが確認できる（図４の（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ））。したがって、ＥＧ−ＩＭの場合は、吸着された形態のリポソームも均一に製造できることを確認した。

２．リポソーム表面電荷の分析
脂質溶解段階の試料及び製造例２−（３）の糖脂質をリポソームと単純混合した試料を１ｍＬずつそれぞれ表面電荷（ゼータ電位）測定用キュベットにローディングした後、動的光散乱装備（Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＺＳＰ ｎａｎｏ）を用いて表面電荷を測定した（表４）。

その結果、ＥＧ−ＩＭでは、含有量に関係なく表面電荷が５５ｍＶレベルと均一に維持された。一方、ＭＰＬでは、６ｍｏｌ％と高含量を混合する場合、表面電荷が急に減少した。

実施例３：ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭメカニズムの分析
１．ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞増殖及び細胞毒性緩和
（１）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞増殖効果
マウス大食細胞株Ｊ７７４Ａ．１細胞にＥＧ−ＩＭ（０．０２５、０．０５、０．１、０．５、又は１．０μｇ／ｍｌ）と様々な組成のリポソーム（陽イオン性脂質として１．２５、２．５、５、又は２５５０μｇ／ｍｌ）を単独又は混合して処理した。細胞に試験物質を処理して２４時間後、ＣＣＫ−８溶液を細胞に処理し、１時間反応させた。反応が終了した後、細胞培養液を収集して４５０ｎｍで吸光度を測定し、培養液処理群（陰性対照群）の吸光度を１００％基準にし、各試験群の細胞生存性（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を導出した。

ＮＰはリポソーム単独処理群、ＮＰ＋ＥＧ−ＩＭはＥＧ−ＩＭと液状リポソームの単純混合物、ＮＰ／ＥＧ−ＩＭは、リポソームとＥＧ−ＩＭを混合した後に凍結乾燥させた剤形である。

ＮＰ−ＡはＤＤＡ：ＤＯＰＣリポソーム、ＮＰ−ＢはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣリポソーム、ＮＰ−ＣはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：スクアレンリポソーム、ＮＰ−ＤはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：トリカプリンリポソームを表す。

その結果、様々な組成の陽イオン性リポソームにＥＧ−ＩＭを混合した場合、免疫細胞の増殖が増加したことが確認できる（図５）。

（２）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭのＴＮＦ−ａ分泌効果
マウス大食細胞株Ｊ７７４Ａ．１細胞にＥＧ−ＩＭ（０．０２５、０．０５、０．１、０．５、又は１．０μｇ／ｍｌ）と様々な組成のリポソーム（陽イオン性脂質として１．２５、２．５、５、２５、又は５０μｇ／ｍｌ）を単独又は混合して処理した。試験物質を細胞に処理して２４時間培養した後、細胞培養培地中のＴＮＦ−αサイトカイン分泌レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。

ＮＰはリポソーム単独処理群、ＮＰ＋ＥＧ−ＩＭはＥＧ−ＩＭと液状リポソームの単純混合物、ＮＰ／ＥＧ−ＩＭはリポソームとＥＧ−ＩＭを混合した後に凍結乾燥させた剤形である。

ＮＰ−ＡはＤＤＡ：ＤＯＰＣリポソーム、ＮＰ−ＢはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣリポソーム、ＮＰ−ＣはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：スクアレンリポソーム、ＮＰ−ＤはＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：トリカプリンリポソームを表す。

その結果、様々な組成の陽イオン性リポソームにＥＧ−ＩＭを混合した場合、ＴＮＦ−ａ分泌活性が誘導されたことが確認できる（図６）。

（３）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの細胞毒性緩和効果
一般に、陽イオン性リポソームは細胞毒性を起こすものと知られている。そこで、製造されたｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの場合、ＥＧ−ＩＭによる陽イオン性リポソームの細胞毒性が緩和される効果を示すかどうか確認した。ヒト線維亜細胞ＭＲＣ−５細胞を用いたＥＧ−ＩＭを含むリポソームの細胞毒性を測定した。ＤＤＡ：ＤＭＰＣで構成された陽イオン性リポソームにコレステロールの有無と均質化方法の差異、免疫刺激物質ＥＧ−ＩＭの有無による製造リポソームの細胞毒性を評価し、またＭＲＣ−５細胞に各物質を濃度別に処理して刺激した後、ＭＴＴアッセイによって細胞毒性を評価した。

ＡはＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを含んでいないリポソーム、Ｂはコレステロールを含んでいるリポソーム、１は押し出し機（ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用いてリポソーム均質化した群であり、２は超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いてリポソーム均質化した群である。

その結果、ＤＤＡ：ＤＭＰＣ濃度依存的に現れる細胞毒性がＥＧ−ＩＭ混合によって緩和されたことが確認できる（図７）。

２．ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンの形成メカニズム：静電気的引力による吸着
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭワクチンの形成メカニズムが静電気的引力による吸着であるかを確認するために、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ；ＬＰ）、組換えＶＺＶ ｇＥ蛋白質、ＥＧ−ＩＭを混合した後、超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ、１ｈｒ）した。その後、上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；Ｓ）と沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）を分離し、沈殿物は、上清液と同一ボリュームのＰＢＳを入れて超音波で破砕し、完全に懸濁させた。同一ボリュームの試料を電気泳動した後、シルバー染色（ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。

その結果、組換えＶＺＶ ｇＥ蛋白質だけを超遠心分離した場合は、上清液から組換えｇＥ蛋白質が検出されるが、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭワクチン（ＬＰ：ｇＥ：ＥＧ−ＩＭ混合物）は、沈殿物から組換えｇＥ蛋白質が検出された（図８）。これは、リポソームと組換えｇＥ蛋白質が吸着され、沈殿物から観察されたものと判断される。

３．ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンの免疫効果
（１）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫細胞リクルーティング（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）効果
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉投与経路で投与し、投与後３時間、２４時間後に注射部位筋肉組織から細胞を分離した。分離された細胞の免疫細胞を特性評価（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）するために、ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ Ａｂ（ＦＩＴＣ）、ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ Ａｂ（ＦＩＴＣ）、ａｎｔｉ− Ｌｙ６Ｃ Ａｂ（ＰＥ）、ａｎｔｉ−Ｌｙ６Ｇ Ａｂ（ＰＥ）、ａｎｔｉ−Ｆ４／８０ Ａｂ（ＰＥ）、ａｎｔｉ−ＭＨＣＩＩ Ａｂ（ＰＥ）、ａｎｔｉ−ＣＤ３ Ａｂ（ＰＥ）を用いて細胞を免疫染色し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭによってＣＤ１１ｂ＋免疫細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、ＤＣｓ、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓの注射部位移動が増加したことが確認できる（図９）。このことから、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭによって免疫細胞リクルーティングが開始され、これは、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭによる先天免疫反応誘導及び免疫細胞によるｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの取り込み（ｕｐｔａｋｅ）が増加する可能性がある、ということを示す。

（２）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンの取り込み効果
ｇＥ蛋白質を蛍光物質（Ａｌｅｘａ６４７）で標示した後、樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）に処理し、蛍光が検出されるＤＣをフローサイトメトリーで分析した。

その結果、ｇＥ蛋白質単独又はＥＧ−ＩＭ単独で使用した場合には、蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ＤＣが観察されなかったが、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭをアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）として用いた場合には、蛍光ＤＣが検出された（図１０）。このことから、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンがＤＣの抗原取り込み効率を増加させることが確認できる。

また、組換えＶＺＶ ｇＥ蛋白質を蛍光物質（Ａｌｅｘａ６４７）で標示した後、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭと混合してワクチンを製造した。製造されたワクチンをマウス大腿部三角筋に投与し、投与後４時間、２４時間後にｄＬＮ（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）と筋肉組織を用いて免疫細胞の表面マーカー蛍光染色法を実施し、フローサイトメトリーで分析して図１１に示した。図１１の（Ａ）は、ｄＬＮで蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な細胞を分析したものであり、図１１（Ｂ）は、筋肉組織で蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な細胞を分析したものであり、図１１（Ｃ）は、ｄＬＮで蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を測定したものであり、図１１（Ｄ）は筋肉組織で蛍光標示されたｇＥ蛋白質特異的な単球を測定したものである。

その結果、組換えＶＺＶ ｇＥ蛋白質単独又はＥＧ−ＩＭ単独で使用した場合と対比して、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭをアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）として用いた場合は、ｄＬＮと筋肉組織に細胞がリクルーティング（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）され、単球によるワクチンの取り込みが活発に誘導された（図１１）。

（３）ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンのデポ効果
ｇＥ蛋白質を蛍光物質（Ａｌｅｘａ６４７）で標示した後、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭと混合してワクチンを製造した。製造されたワクチンをマウス大腿部三角筋に投与し、投与後３０分、２４時間後にｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージ撮影（Ａ）をし、マウスのリンパノードを分離して蛍光を測定した（Ｂ）。

その結果、ｇＥ蛋白質（抗原）だけを投与した場合も、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチン（ＶＡＣ）を投与した場合も、２４時間までは注射部位で蛍光が検出された。各リンパノードで蛍光を分析した結果、膝窩筋と腰椎から比較的高い強度で蛍光が検出された。抗原だけを投与した場合は、２４時間後に蛍光強度が半減したが、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンを投与した場合は、蛍光感度が半減しなかった（図１２）。このことから、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むワクチンがデポ効果（ｄｅｐｏｔ ｅｆｆｅｃｔ）を増進させたことが分かる。

実施例４：ジカワクチンに対するｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性の分析
ジカワクチンからｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性増強効果を確認するために、組換えジカウイルスエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、組換えジカウイルスエンベロープ糖蛋白質、様々な免疫補助剤としてミョウバン（アルミニウムヒドロキシ；Ｂｒｅｎｎｔａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＧ−ＩＭ、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを混合し、筋肉投与経路で２週間隔で２回投与した。投与容量は、組換えジカウイルスエンベロープ糖蛋白質２μｇ／マウス、ミョウバン２５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ ０．５μｇ／マウス、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ ２５μｇ／マウスである。最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離した。分離された脾臓細胞を抗原５μｇ／ｍＬで刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養培地中のＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、ミョウバン単独又はリポソーム単独を用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γ分泌を増進させた（図１３）。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含むジカワクチンは細胞性免疫誘導能に優れることを確認した。

実施例５：日本脳炎ワクチンに対するｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性の分析
日本脳炎ワクチンからｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性増強効果を確認するために、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）抗原を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に不活性化ＪＥＶ抗原、免疫補助剤としてＥＧ−ＩＭ、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを混合し、筋肉投与経路で２週間隔で２回投与した。投与容量は、不活性化ＪＥＶ抗原０．５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ ０．５μｇ／マウス、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ ２５μｇ／マウスである。

１．ＪＥＶ抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から４週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集した。免疫後のＪＥＶ抗原の特異−抗体力価を測定するために、エンド−ポイント希釈ＥＬＳＩＡ（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）方法を利用した。ＪＥＶ抗原を１μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６−ウェルプレートにコーティング（４℃、一晩）した後、１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）３００μｌでブロッキングをした（室温、１時間）。ブロッキング後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄し、免疫後に得た血清を１０倍系列希釈し、各希釈血清１００μｌを反応させた（３７℃、２時間）。ＪＥＶ抗原−特異抗体を確認するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，１１５−０３５−００３）、 ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＳＴＡＲ１３２Ｐ）、 ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＳＴＡＲ１３３Ｐ）を反応させた後、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＢＤ Ｂｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ，５５５５５２１４）を添加し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を中止させた。実験結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体力価を測定した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ単独又はリポソーム単独を用いた試験群に比べて、それぞれ、ＪＥＶ抗原−特異ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１ 、ＩｇＧ２ａ抗体の生成が増加した（図１４（Ａ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む本発明の日本脳炎ワクチンは免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。

２．サイトカイン分析
最終投与日から１４週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して組換えＪＥＶ糖蛋白質１μｇ／ｍｌで刺激し、２４時間後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、リポソーム単独を用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γを分泌する細胞数を増進させた（図１４（Ｂ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む日本脳炎ワクチンは細胞性免疫誘導能に優れていることを確認した。

実施例６：結核ワクチンに対するｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性の分析
結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ＴＢ）ワクチンからＬｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性増強効果を確認するために、組換え結核抗原としてＡｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、ＨｓｐＸのそれぞれ又はそれら３種の結核抗原のミクスチャーを使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、組換え結核抗原、免疫補助剤としてＥＧ−ＩＭ、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを混合し、筋肉投与経路で２週間隔で３回投与した。投与容量は、組換え結核抗原５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ ０．５μｇ／マウス、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ ２５０μｇ／マウスである。

１．ＴＢ抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から３週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集した。免疫後血清内ＴＢ抗原の特異−抗体力価を測定するために、エンド−ポイント希釈ＥＬＳＩＡ（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）方法を用いた。実験結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定し、免疫後に回収した血中ＩｇＧ抗体力価を測定した。

その結果、Ａｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、ＨｓｐＸのそれぞれ又はそれら３種結核抗原のミクスチャーを使用した場合、いずれも、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ単独を用いた試験群に比べて、それぞれ、組換えＴＢ抗原−特異ＩｇＧ抗体生成が増加した（図１５（Ａ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む本発明の結核ワクチンは免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。

２．サイトカイン分析
最終投与日から３週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して組換えＴＢ ｇＥ蛋白質１０μｇ／ｍｌで刺激し、２４時間細胞培養した後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、Ａｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、ＨｓｐＸ抗原を使用した場合、いずれも、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、ＥＧ−ＩＭ単独を用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γを分泌する細胞数を増進させた（図１５（Ｂ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む結核ワクチンは細胞性免疫誘導能に優れていることが確認できる。

３．バクテリア殺菌効果分析
免疫化されたマウスの脾臓細胞をＢＣＧ感染の大食細胞（ＢＣＧ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と共同培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。培養７日後、細胞を回収して溶解させた後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ＯＡＤＣ ｉｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｄｉｆｃｏ）を含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１１ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ）に塗抹した。３７℃で４週間培養し、生成された細菌コロニー（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ）数を計数した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、ＥＧ−ＩＭ単独を用いた試験群に比べてＢＣＧ殺菌効果に優れることが確認できた（図１５（Ｃ））。

実施例７：百日咳ワクチンに対するｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性の分析
百日咳ワクチンからＬｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性増強効果を確認するために、精製百日咳ワクチン（ａＰ）抗原を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、精製百日咳ワクチン（ａＰ）抗原、免疫補助剤としてＥＧ−ＩＭ、リポソーム、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを混合し、筋肉投与経路で２週間隔で２回投与した。投与容量は、ａＰ抗原５μｇ／マウス、リポソーム２５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ ０．５μｇ／マウス、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ ２５μｇ／マウスである。

１．ａＰ抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集した。免疫後血清内ａＰ抗原の特異−抗体力価を測定するために、エンド−ポイント希釈ＥＬＳＩＡ（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）方法を用いた。実験結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定し、免疫後に回収した血中ＩｇＧ抗体力価を測定した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ又はリポソームを単独で用いた試験群に比べて、それぞれａＰ抗原−特異ＩｇＧ抗体の生成が増加した（図１６（Ａ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む本発明の百日咳ワクチンは免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。

２．ＣＤ４ Ｔ細胞増殖分析
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、５μｇのａＰ抗原で刺激し、０日、４日、８日細胞培養をした。この後、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を確認した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ又はリポソームを単独で用いた試験群に比べて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖効能に最も優れていることが分かる（図１６（Ｂ））。

３．サイトカイン分析
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓と肺組織を摘出した後、単一細胞として分離してａＰ抗原５μｇ／ｍｌで刺激し、２４時間細胞培養した後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。白色グラフは脾臓細胞、黒色グラフは肺細胞における結果を示す。また、脾臓細胞をａＰ抗原５μｇ／ｍｌで刺激し、７２時間細胞培養した後、ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、ＥＧ−ＩＭ又はリポソーム単独を用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γを分泌する細胞数を増進させた（図１７の（Ａ））。また、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群においてＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７サイトカイン分泌能も優秀だった（図１７の（Ｂ）、（Ｃ））。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む結核ワクチンは細胞性免疫誘導能に優れることが確認できる。

実施例８：帯状疱疹ワクチンに対するｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性の分析
帯状疱疹ワクチンからｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの免疫原性増強効果を確認するために、組換え帯状疱疹（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＶＺＶ）ｇＥ抗原を使用した。６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に弱毒化ＶＺＶを皮下注射経路で投与してプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）モデルを作り、４週後に組換えＶＺＶ ｇＥ抗原、免疫補助剤としてミョウバン、ＥＧ−ＩＭ、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを混合して製造した帯状疱疹ワクチンを、筋肉投与経路で２週間隔で２回投与した。投与容量は、組換えＶＺＶ ｇＥ抗原５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ２又は３μｇ／マウス、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ ５０μｇ／マウスである。対照群として商用ワクチンであるＺｏｓｔａｖａｘ（Ｍｅｒｃｋ、米国）をヒト投与容量の１／１０容量で希釈し、マウスに１回投与した。また、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの構成成分であるリポソームの組成比をＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ＝１：１又はＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ＝１：２に変化させて比較した。

１．サイトカイン分析
最終投与日から４週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離してＺｏｓｔａｖａｘ（弱毒化ウイルス）１０００ＰＦＵ／ｍＬ又はｇＥ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘ ４μｇ／ｍｌで刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。また、脾臓細胞をＺｏｓｔａｖａｘ（弱毒化ウイルス）１０００ＰＦＵ／ｍＬ又はｇＥ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘ４μｇ／ｍｌで刺激し、２４時間後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを用いた試験群は、ＥＧ−ＩＭ単独を用いた試験群に比べてＩＦＮ−γ分泌を増進させ、商用ワクチンのＺｏｓｔａｖａｘに比べてもＩＦＮ−γ分泌を増進させた（図１８）。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭを含む帯状疱疹ワクチンは細胞性免疫誘導能に優れていることを確認した。

２．脂質組成物の追加による相乗効果の分析
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの構成に、追加の脂質組成物としてコレステロール（Ｃｈｏｌ）、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、トリカプリン（Ｔｒｉｃａｐｒｉｎ）を混合し、相乗効果があるかどうか確認した。それぞれのワクチンを２週間隔で２回筋肉注射し、最終投与日から２週又は４週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して組換えＶＺＶ ｇＥ １０μｇ／ｍｌで刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。また、脾臓細胞をｇＥ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘ ４μｇ／ｍｌで刺激し、２４時間細胞培養した後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、コレステロール（図１９）、スクアレン（図２０）、トリカプリン（図２１）をさらに含むｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭにおいてＩＦＮ−γ分泌が増進した。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭに追加の脂質組成物としてコレステロール、スクアレン、トリカプリンを含めた場合のワクチンは、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭ単独で使用する場合に比べて、細胞性免疫誘導能に優れることを確認した。

３．免疫補助剤の追加による相乗効果の分析
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭの構成に、追加の免疫補助剤としてサポニン系物質であるＱｕｉｌＡをさらに混合し、相乗効果があるかどうか確認した。それぞれのワクチンを２週間隔で２回筋肉注射し、最終投与日から４週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して組換えＶＺＶ ｇＥ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘ ４μｇ／ｍｌ又はＺｏｓｔａｖａｘ １０００ ＰＦＵ／ｍＬで刺激し、２４時間細胞培養した後、ＩＦＮ−γサイトカインを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。

その結果、サポニン由来物質Ｑｕｉｌ Ａをさらに含むｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭにおいてＩＦＮ−γ分泌が増進した（図２２）。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭに追加の免疫増強物としてサポニン由来物質を含めた場合のワクチンは、ＥＧ−ＩＭ単独で使用する場合に比べて、細胞性免疫誘導能に優れることを確認した。

４．剤形による相乗効果の分析
帯状疱疹ワクチンの最終剤形による免疫原性の差異を調べるために、単純混合ワクチン（＋）と混合後凍結乾燥ワクチン（／）とに分けて実験した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に各ワクチン組成物を２週間隔で２回、筋肉投与経路で投与した。最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して組換えＶＺＶ ｇＥ抗原５μｇ／ｍｌで刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＬ−５、ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ４８５；ＤＹ４０５）で分析した。

図２３で、ＮＰ−Ａは ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＣ、ＮＰ−ＢはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ、ＮＰ−ＣはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ／スクアレン、ＮＰ−ＤはＤＯＴＡＰ／ＤＭＰＣ／トリカプリンを表し、＋は単純混合剤形を、／は混合後凍結乾燥剤形を表す。

その結果、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭと抗原を凍結乾燥させた剤形において、ＩＦＮ−γ分泌が最も増進したが、ＩＬ−５分泌はほとんど増進しなかった（図２３）。したがって、ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ＥＧ−ＩＭと抗原を凍結乾燥させた剤形は、Ｔｈ１ ｔｙｐｅ細胞性免疫誘導能に優れていることが確認できる。

本発明は、リポソームの物理化学的不安定性を克服し、生産、運送及び保管において有利であり、且つ、安定性を改善し、免疫伝達システムとして利点を有する。また、本発明は、抗原及び免疫反応調節物質と陽イオン性リポソームを全て含むので、免疫反応調節物質を単独で使用する場合に比べて、向上した免疫増強効能を発揮する。

Claims (15)

1. （ａ）化学式１で表示される免疫反応調節剤であって、大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）由来である免疫反応調節剤；及び、
   

   

   （式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
   （ｂ）陽イオン性リポソームを含む免疫増強用組成物。
2. 前記ホスフェートは、化学式１のＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、ＥＦ、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦ、ＤＥＦ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＤＥＦ、 ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、 ＢＤＥＦ、ＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＥＦ及びＡＢＣＤＥＦから構成される群
   から選ばれる位置に結合することを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強用組成物。
3. 前記陽イオン性リポソームは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール］（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ］，ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリエチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０−１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１８：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１２：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、Ｎ１−［２−（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［オレイルオキシ］−ベンズアミド（Ｎ１−［２−（１Ｓ）−１−［（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］−４−［ｄｉ（３−ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−３，４−ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＭＶＬ５）、１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＤＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０
   ＤＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロパン−１−アンモニウム（Ｎ−（４−ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，３−ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ−１−ａｍｉｎｉｕｍ，ＤＯＢＡＱ）、１，２−ステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＴＡＰ）及びＮ４−コレステリル−スペルミン（Ｎ４−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−Ｓｐｅｒｍｉｎｅ，ＧＬ６７）から構成される群から選ばれる陽性脂質であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強用組成物。
4. 前記陽イオン性リポソームは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＬＰＣ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から構成される群から選ばれる中性脂質をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の免疫増強用組成物。
5. （ａ）抗原；及び、
   （ｂ）請求項１の免疫増強用組成物を有効成分として含む、ワクチン組成物。
6. 前記抗原は、ペプチド、蛋白質、核酸、糖（ｓｕｇａｒ）、病原体、弱毒化された病原体、不活性化された病原体、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞及び細胞断片から構成される群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
7. 前記抗原は、ジカウイルスの抗原、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）の抗原、結核菌抗原、百日咳抗原、水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＢ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ Ｂ）の抗原、ＭＥＲＳウイルスの抗原、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗原、炭疽菌の抗原、ＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
   ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の抗原、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の抗原、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の抗原、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の抗原、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の抗原、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の抗原、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）の抗原、マラリアの抗原、デングウイルスの抗原、ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原、重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ ｆｅｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ；ＳＦＴＳ Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）の抗原、サーズコロナウイルス（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、エボラウイルスの抗原及び肺炎球菌の抗原から構成される群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
8. 前記ワクチンは、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、コンジュゲートワクチン、組換えワクチン、単価ワクチン、多価ワクチン又は混合ワクチンの形態であることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
9. 前記ワクチンは、ジカワクチン、日本脳炎ワクチン、結核ワクチン、百日咳ワクチン、帯状疱疹ワクチン、水痘ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ Ｂ）ワクチン、ＭＥＲＳワクチン、緑膿菌ワクチン、癌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＡＶワクチン、ＨＢＶワクチン、ＨＣＶワクチン、ＨＩＶワクチン、脳髄膜炎ワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、多剤耐性菌ワクチン、腸球菌ワクチン、黄色ブドウ球菌ワクチン、肺炎桿菌ワクチン、アシネトバクターワクチン、エンテロバクターワクチン、ヘリコバクターワクチン、マラリアワクチン、デング熱ワクチン、ツツガムシワクチン、重症熱性血小板減少症候群ワクチン、サースワクチン、エボラワクチン、インフルエンザワクチン及び肺炎球菌ワクチンから構成される群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
10. 前記ワクチンは、凍結乾燥した剤形であることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
11. 前記帯状疱疹ワクチンは、すぐに使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態であることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン組成物。
12. 前記ワクチンは、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）又はトリカプリン（Ｔｒｉｃａｐｒｉｎ）をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
13. 前記ワクチンは、サポニン由来物質であるサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）、Ｑｕｉｌ Ａ又はＱＳ２１をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
14. 下記の段階を含む請求項１の免疫増強用組成物の製造方法：
    （ａ）下記の化学式１で表示される免疫反応調節剤であって、大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）由来である免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；
    

    

    （式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
    （ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；
    （ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；及び、
    （ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した後、前記（ａ）段階の溶液を混合して免疫増強用組成物を形成する段階。
15. 下記の段階を含む請求項５のワクチン組成物の製造方法：
    （ａ）下記の化学式１で表示される免疫反応調節剤であって、大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）由来である免疫反応調節剤が含まれた溶液を製造する段階；
    

    

    （式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
    （ｂ）脂質を有機溶媒に溶かして脂質混合溶液を製造する段階；
    （ｃ）前記（ｂ）段階の脂質混合溶液を凍結乾燥させて有機溶媒を除去する段階；
    （ｄ）前記（ｃ）段階で得られた物質を再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）してリポソームを形成する段階；及び、
    （ｅ）前記（ｄ）段階のリポソームに（ａ）段階溶液及び抗原を添加した後、再び凍結乾燥させる段階。

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