JP6965254B2 - 神経変性疾患、例えばとりわけ、パーキンソン病およびハンチントン病の治療における、ａａｖ／ｕｐｒ−プラスウイルス、ｕｐｒ−プラス融合たんぱく質、遺伝子治療、およびその使用 - Google Patents

Description

本発明の技術分野
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて、ＸＢＰ１ｓ、リンカーペプチド、およびＡＴＦ６ｆの間の融合たんぱく質を過剰発現する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を介して、特に神経変性疾患の治療において、医学分野に適用され、神経変性問題、好ましくはパーキンソン病およびハンチントン病を回復および改善する。

背景技術およびその記載
ＣＮＳ疾患に関する科学研究は、近年、特に認知および運動疾患に関連する疾患に大きな関心を集めている。神経変性問題に関連する疾患の治療は、現在、症状を軽減するための遺伝子治療アプローチを有していない。

これらの運動および認知疾患の治療のための研究において、ＸＢＰ１およびＡＴＦ６と呼ばれる２つの転写因子が同定されている。これらは、たんぱく質フォールディングおよび凝集プロセスを改善するための生物学的および分子的メカニズムに関与している。主に、新しい融合たんぱく質は、たんぱく質フォールディングを改善することに関与する遺伝子クラスターの転写を活性化することを目的としている。そして、シャペロンのようなたんぱく質フォールディングに関与する特定の遺伝子の転写を再プログラミングすることによって、これらの凝集を減少させる。たんぱく質凝集の現象は、神経変性疾患における共通の特徴であり、選択的神経細胞死の原因である。

今日の既存の薬理療法は、これらの疾患に罹患した患者の症状を軽減することに焦点を当てており、ニューロンの選択的な死を止めることができないため、対症的でしかない。これらは一般的に、脳の正しい機能を保証する基礎的な神経細胞群の死により、変化した神経伝達物質のレベルを調節する薬理療法からなる。このタイプの治療の例として、パーキンソン病患者へのＬ−ドーパおよびその薬理学的誘導体の投与がある。この化合物は、患者のドーパミンレベルを回復することができるが、この疾患を引き起こすドーパミン作動性ニューロンの選択的な死を止めるものではない。現在の提唱されているものは、遺伝子療法を用いた神経細胞の死滅を抑制し、このタイプの病態のための効果的かつ決定的な治療法を提供することに焦点を当てている。

ハンチントン病のような神経運動疾患に関連するその他の病態が存在するが、その処置は限られているか存在していない。この疾患は、ハンチンチンたんぱく質をコードする、ＩＴ１５遺伝子の突然変異によって引き起こされる優性遺伝性神経変性の病態である。突然変異は、線条体領域の中型有刺ニューロン（ＭＳＮ）にたんぱく質凝集体を生成する、たんぱく質のＮ末端におけるポリグルタミンセグメントの拡大をもたらす。これは、神経変性、ならびに随意筋運動調節の進行性消失（舞踏病）、精神症状、および認知症のような疾患に特徴的な症状を誘発する（Atwal、２００７）。

今日まで、合成融合たんぱく質の使用に関する提案は、概して対処されていない。ＸＢＰ１、ｅＩＦ２α、Ｓ５１Ａ、およびＡＴＦ（スプライシングによる欠失後形態）を別々にコードする組換えたんぱく質の形成を指し示す、国際公開第２００４／１１１１９４号および同第２００６／０２８８８９号のような特許公報が存在するが、融合たんぱく質としてではないし、単一の構築物において神経変性疾患の調節の改善を最適化しようとするものでもない。一方、米国特許第２０１３１９７０２３号に提示されているように、細胞恒常性を維持するために必要とされる小胞体（ＥＲ）のフォールディング能力の増加と相関する、ＸＢＰ１の内在的減少を指す個々の文献が存在する。ＸＢＰ１発現のこの個々の負の調節は、国際特許出願第２０１０／００８８６０号にて出願されているように、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における神経保護の発生に関与している。

転写制御因子ＸＢＰ１が関与する小胞体ストレスの測定に関する別の関連特許は、日本国特許第２００７１２９９７０号である。

一般に、この開発は、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性疾患の治療のためのＸＢＰ１ｓ、リンカーペプチド、およびＡＴＦ６ｆに適合する新規のペプチドの合成および生存率を指すが、これらのみに限定されるものではない。

このアプローチに近づく特許のひとつは、組換えウイルスＡＡＶ／ＸＢＰ１Ｓ−ＨＡによって記憶を改善するための遺伝子治療方法を提示する、チリ特許出願第３５９０−２０１４号である。この治療はＸＢＰ１ｓ−ＨＡペプチドを認知機能の改善に近づけるが、疾患の治療には役立たない。他方で、ＸＢＰ１ｓをその構成要素内に有する機能的融合たんぱく質の話はない。

発明の概要
最近の研究は、ＥＲ（小胞体）におけるたんぱく質恒常性の慢性的変化が、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などのたんぱく質フォールディング障害に関連する、事実上すべての神経変性疾患において観察される、横断的病理学的事象であることを示している。

異なる状態では、小胞体の内腔におけるたんぱく質合成およびフォールディングプロセスが妨害され、ミスフォールドしたたんぱく質の異常な蓄積がもたらされる。小胞体ストレスと呼ばれるこの状態は、特定の突然変異体たんぱく質の発現によって、ならびにたんぱく質合成および成熟のプロセスにおける変化によって促進され得る。この現象に応じて、ＵＰＲと呼ばれる統合された細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。ＵＰＲの活性化は、たんぱく質恒常性に全体的な影響を及ぼす遺伝子発現において異なる変化をもたらし、例えば、以下に起因する異常凝集およびたんぱく質ミスフォールディングのレベルを低下させる：
（ｉ）シャペロンおよびフォールダーゼ（foldase）の発現の増加；
（ｉｉ）たんぱく質品質管理の改善；および、
（ｉｉｉ）欠陥たんぱく質の大量除去。

ＵＰＲの第１の目的は、たんぱく質平衡を回復させ、細胞生存率を維持することである。しかしながら、慢性的な小胞体ストレスは、いくつかの神経変性病態において観察される現象である、アポトーシスによる細胞死をもたらす。

第１のＵＰＲ段階は、以下の３つの小胞体「ストレスセンサー」によって媒介される：
（１）ＰＥＲＫ（小胞体キナーゼなどの二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ［ＰＫＲ］）；
（２）ＡＴＦ６（活性化転写因子６）；および、
（３）ＩＲＥ１（イノシトール要求キナーゼ１）。

これらのセンサーの各々は、特定の転写因子を制御することによって、小胞体内腔の折り畳み状態に関する情報を核に伝達するが、ここでＸＢＰ１（Ｘ−Ｂｏｘ結合たんぱく質−１）が目立つ。ＸＢＰ１は、その他のプロセスの中でも、たんぱく質の品質管理、フォールディングに関与する一連の遺伝子を制御する。これらの３つの適応経路は、たんぱく質恒常性および細胞生存を維持しながら、一斉に作用する。ＡＴＦ６およびＸＢＰ１依存性応答とは異なり、ＰＥＲＫセンサーによって媒介されるシグナル伝達もまた、アポトーシス促進効果と関連している。これらの以前の定義は、これらの反応を測定するための新規の動物モデルの設計に加えて、神経変性疾患の治療におけるＵＰＲの影響を定義するためにこのプロジェクトの開発に協力してきた。

以前の証拠によると、ＸＢＰ１機能の増加は、３つの神経変性疾患：ハンチントン病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症の動物モデルにおける神経変性プロセスを遅らせるということが記載されている。一方で、パーキンソン病の前臨床モデルにおいて、ＡＴＦ６転写因子欠損が神経細胞死に対する抵抗性の喪失を引き起こすこともまた決定されている。これらの前例は、有毒なたんぱく質凝集体の形成による神経変性過程における、これらの転写因子の重要性を示している。したがって、UPRplus（商標）は、ＸＢＰ１、ＡＴＦ６、およびリンカーペプチドのようなＵＰＲの２つの活性成分の融合に基づく。

現在、ＵＰＲｐｌｕｓが開発され、ＵＰＲに関連する遺伝子群（クラスター）の特異的転写活性が示されている。ＵＰＲｐｌｕｓは融合たんぱく質であり、潜在的にニューロン中の有毒なたんぱく質凝集物の負荷を軽減するプロセスに関与することができる。

本発明の第１の態様は、中枢神経系におけるＵＰＲｐｌｕｓのニューロン過剰発現を誘発するウイルスを用いた、哺乳類、好ましくはヒトにおける認知プロセスおよび運動プロセスにおける神経変性疾患の治療方法に関する。

本発明の第２の態様は、認知プロセスおよび運動プロセスにおける神経変性疾患を治療する方法を提供する。本方法は、患者または対象の血液脳関門を過ぎて脳内にウイルスを導入する、静脈内、および／または腹腔内、および／または頭蓋内、および／または髄内、および／または鼻腔内、および／または神経内、および／またはあらゆる経路を包含する。ウイルスは、個体あたり１×１０⁶〜１×１０³⁰ウイルス単位の用量範囲でＵＰＲｐｌｕｓのニューロン過剰発現を誘導する。

本発明の第３の態様は、神経変性疾患の治療におけるその使用のための、静脈内、および／または腹腔内、および／または頭蓋内、および／または髄内、および／または鼻腔内、および／または神経内医薬組成物、および／または血液脳関門を通過し、上述で記載されたものと同じ投与量範囲を有し、脳へのＵＰＲｐｌｕｓのニューロン過剰発現を誘導するウイルスを伝導するあらゆる形態と、薬学的に許容可能なビヒクルとの形態である。

本発明の第４の態様は、神経変性疾患の認知および運動能力の治療に有用な薬物を調製するために使用できるため、ＵＰＲｐｌｕｓおよびそのたんぱく質由来化合物のニューロン過剰発現を誘導するウイルスの使用である。

本発明の第５の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表Ｉに記載のヌクレオチド配列またはその変種のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりに、これをコードするかまたは過剰発現する、中枢神経系または断片のあらゆる変異体において、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（チリ農業研究所、ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３５号として寄託された、ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ−プラス５）神経転写因子が過剰発現しているプラスミドで翻訳される。

本発明の第６の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＩに記載のヌクレオチド配列またはその変種のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３４号として寄託されたプラスミドで形質転換され、ここで、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ−プラス４）神経転写因子またはＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変種が、好ましくは中枢神経系において、過剰発現する。

本発明の第７の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＩＩに記載のヌクレオチド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３６号として寄託されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ−プラス６）神経転写因子または、ＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりにこの代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第８の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＶに記載のヌクレオチド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３２号として寄託されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ−プラス２）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第９の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表Ｖに記載のヌクレオチド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３３号として寄託されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ−プラス３）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第１０の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＶＩに記載のヌクレオチド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３１号として寄託されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ−プラス１）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

微生物寄託
プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３２号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３１号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３３号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３５号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３４号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２３６号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、複合体、材料、製造技術、使用、および適用に限定されず、これらは変更してもよいことに留意されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の表現を説明するだけの目的のために使用され、本発明の見方および可能性を制限することを意図するものではないことも、理解されるべきである。

特許請求の範囲および本文を通して表されるような単数形の使用および方法は、明確に単数形であること示す文脈でない限り、複数形を排除しないことに留意されたい。したがって、例えば、「使用または方法」への言及は、１つ以上の使用または方法への言及であり、主題（技術）の知識がある者に周知である均等物が包含される。同様に、別の例として、「１つのステップ」、「１つのステージ」、または「１つのモード」への言及は、１つ以上のステップ、ステージ、またはモードへの言及であり、暗示的および／または結果的に、サブステップ、サブステージ、またはサブモードを包含し得る。

すべての接続詞は、可能な限り、最小限に制限的、かつ最大限に包括的に理解されるべきである。したがって、例えば、接続詞「または（or）」は、その正統的な論理的意味で理解されるべきであり、文脈または本文が明白にこれを必要とするかまたは示さない限り、「または除く」として理解されるべきではない。本明細書に記載の構造、材料、および／または要素は、無限かつ網羅的な列挙を避けるための、機能的等価物への参照として理解されるべきである。

近似または概念化を示すために使用される表現は、文脈が異なる解釈を必要としない限り、本明細書で述べるように理解されるべきである。

本明細書で使用されるすべての名称、ならびに技術的および／または科学的用語は、特に明確な断りのない限り、これらの事項において資格を有する共通の人間によって与えられた、共通の意味を有する。

方法、技術、要素、化合物、および組成物を記載するが、記載されたこれらと同様および／または等価である方法、技術、化合物、および組成物が、実際におよび／または本発明のための試験において、使用されるか、または好ましくともよい。

全ての特許およびその他の刊行物、例えば、本発明に関連して有用であり得るそのような刊行物に記載されている方法論は、説明および／または通知のために相互参照されている。

これらの刊行物は、本特許出願の登録日に先立って、事前の特許情報のためにのみ包含される。

この点に関して、著者および／または発明者が権利を有しないか、もしくはそのような刊行物がそれ以前の刊行物に基づき日付を記入されているか、またはその他のあらゆる理由によって、承認または受諾、拒絶または除外と解釈されることがあってはならない。

本発明は、血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶに基づき、ならびに中枢神経系への遺伝子導入を効率的に媒介することができるアデノ随伴ウイルスに由来するベクターを記載する。

これらのベクターの全身投与はまた、脳および脊髄の両方への効率的な遺伝子供給をもたらす。本発明は、ＵＰＲｐｌｕｓ転写因子プロモーターの近位領域を有するＡＡＶ２ベクターが、脳および脊髄における因子のクラスターにおいて非特異的応答の生成を可能にすることを主張する。特に、異種遺伝子ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆがＣＭＶプロモーターの制御下にある一連の発現カセットを含んでなる、ＡＡＶ２ベクターの局所投与は、神経変性媒介性疾患に罹患している個体における運動および認知能力を改善する。（図１６および１７、ならびに図１７）。

I.一般的な用語および表現の定義
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、および「ＡＡＶ粒子」は、互換性がある。これらは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドたんぱく質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型の全カプシドたんぱく質）、および１つのカプセル化ＡＡＶゲノムポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子がＡＡＶの末端逆位配列に隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子のような天然型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含んでなる場合、典型的には「ＡＡＶ粒子ベクター」または「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。ＡＡＶとは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムはおよそ４．７キロベース長であり、陽性または陰性として数えることができる一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に末端逆位配列（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるＲＥＰおよびＣＡＰ（レプリカーゼおよびカプシド）を含んでなる。ＲＥＰフレームワークは、ＡＡＶのライフサイクルに必要とされるＲＥＰたんぱく質（ＲＥＰ７８、ＲＥＰ６８、ＲＥＰ５２、およびＲＥＰ４０）をコードする、４つの重なり合う遺伝子からなる。ＣＡＰフレームは、相互に作用して正二十面体対称カプシドを形成する、２０個のカプシドたんぱく質配列：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の重なり合うヌクレオチドを含有する。

本明細書で使用する用語「アデノ随伴ＩＲＴウイルス」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、アデノ随伴ウイルスゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する反復逆位末端を指す。ＩＲＴ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。これらの配列の別の特性は、フォークを形成する能力である。この特徴は、第２のＤＮＡ鎖の独立した一次合成を可能にする、自己複製に寄与する。ＩＲＴはまた、宿主細胞ゲノムへの天然ＡＡＶ ＤＮＡの組み込み、および宿主細胞のレスキュー、ならびにＡＡＶ ＤＮＡの効果的なカプセル化と完全なアセンブリの生成の両方に必要であることが判明した。

本発明で使用される用語「ＡＡＶ２」とは、次のウェブサイトにあるＧｅｎＢａｎｋアクセス番号第ＡＦ０４３３０３．１番で定義されるゲノム配列を有する、アデノ随伴ウイルスの血清型２を指す：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF043303.1。

現在、ベクターとして使用できる約１１のヒトＡＡＶ血清型および約１００の霊長類ＡＡＶ血清型が報告されている。各血清型は、安定性、生産性、免疫原性、バイオアベイラビリティ、指向性などに関して、利点および欠点を示す。しかしながら、多くの研究室は、異なる血清型の利点を得るため、またはいくつかの血清型のいくつかのカバーたんぱく質の欠点を避けるために、擬似的な典型的ベクター、すなわち、異なる血清型のカバーたんぱく質を含有する改変ＡＡＶを開発している。例として、２つのウイルス血清型の特徴が混合されているＡＡＶ２／６ウイルスが、本発明において時には使用される。

本発明で使用される用語「ＡＡＶベクター」はまた、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含んでなるベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、それらがＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子（すなわち、ＲＥＰおよびＣＡＰ ＡＡＶたんぱく質）をコードし、発現するベクターで形質移入された宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができ、宿主細胞は、Ｅ４ｏｒｆ６アデノウイルスリーディングフレーム由来のたんぱく質をコードし、発現するベクターで形質移入されている。ＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、またはクローニングもしくは形質移入に使用されるプラスミドなどのその他のベクター）に組み込まれる場合、ＡＡＶベクターは典型的には「プロベクター（pro-vector）」と呼ばれる。プロベクターは、ＡＡＶパッケージング機能、およびＥ４ｏｒｆ６によって提供される必要な補助機能の存在下で、複製およびカプセル化によって「レスキュー」することができる。

ＡＡＶベクターの血清型は、各血清型の指向性を与えられた導入遺伝子を発現する細胞型の特異性を提供する。

本発明において使用される用語「ＵＰＲｐｌｕｓ転写調節領域の特異的結合部位」とは、プロモーターとして働く（すなわち、選択された核酸配列の発現を調節し、プロモーターに作動的に結合する）核酸配列を指し、これは、ニューロンのような特定の組織細胞において選択された核酸配列の発現に影響を及ぼす。神経組織転写の調節エレメントの特異的結合部位は、構成的または誘導的であり得る。

本発明で使用される用語「ＣＡＰ遺伝子」または「ＡＡＶ ＣＡＰ遺伝子」とは、ＣＡＰたんぱく質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用する用語「ＣＡＰたんぱく質」とは、天然ＡＡＶ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のＣＡＰたんぱく質の少なくとも１つの機能活動の活性を有するポリペプチドを指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３たんぱく質の機能活動の例として、カプシド形成を誘導する能力、単鎖ＤＮＡ蓄積を促進する能力、カプシドへのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージング（すなわち、カプセル化）を促進する能力、細胞受容体に結合する能力、および宿主へウイルスを侵入させる能力が挙げられる。

本発明で使用される用語「カプシド」とは、ウイルスゲノムがパッケージングされた構造を指す。カプシドは、ＣＡＰたんぱく質の構造サブユニットを有するオリゴマー構造からなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドたんぱく質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の相互作用によって形成される、正二十面体のカプシドを有する。

本明細書で使用する用語「細胞組成物」とは、本発明の細胞および少なくとも１つのその他の成分を含んでなる、複合型材料を指す。組成物は、単一の製剤として製剤化されてもよく、または各成分の別々の製剤として提供されてもよく、組み合わせ製剤としての併用のために組み合わせてもよい。組成物は、各成分が個々に製剤化され包装される部品キットであってもよい。

本発明において使用される用語「構成的プロモーター（constituent promoter）」とは、細胞の環境および外部条件についてほとんどまたは全く考慮せずに、生物体全体にわたってまたはほとんどの実験段階で、比較的一定のレベルで活性が維持されるプロモーターを指す。

本明細書で使用される用語「発現カセット」とは、標的細胞へ特定の核酸を転写すること可能にする、核酸に特異的な一連の要素と、合成的にまたは組換えによって生成された、核酸の構築を指す。

本明細書で使用される用語「支持機能を提供する遺伝子」とは、ポリペプチドをコードし、複製に依存するＡＡＶ上の機能（すなわち、「支持機能」）を実施する遺伝子を指す。補助機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシングの特異的段階、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ＣＡＰ産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与するこれらの断片を包含する、ＡＡＶ複製に必要な機能を包含する。アクセサリーウイルス機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびワクシニアウイルスのような既知の補助ウイルスのいずれかから得ることができる。補助機能には、ＷＨＶレンチウイルスが包含されるが、これに限定されない。

本明細書に記載されているように、用語「作動的に連結された」とは、目的のポリヌクレオチドに関するプロモーター配列の機能的関係および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼすコード配列に作動的に連結されている）。一般に、作動的に連結されたプロモーターは、目的の配列に隣接している。しかしながら、エンハンサーは、その発現を制御するために目的の配列に隣接する必要はない。

本明細書で使用される用語「局所投与される」とは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、および／または医薬組成物が、特定の部位またはその近くで、対象に投与されることを意味する。

用語「医薬的に許容可能な担体」、「薬学的に許容可能な希釈剤」、「薬学的に許容可能な賦形剤」、または「薬学的に許容可能なビヒクル」は、本明細書において互換性があり、非毒性の固体、半固体、または充填液、希釈剤、もしくはカプセル化材料、またはあらゆる従来型の補助調合物である。薬学的に許容可能な担体は、その用量および濃度で使用され、レシピエントに対して本質的に非毒性であり、製剤中のその他の成分と適合性である。薬学的に許容可能なビヒクルの数および性質は、所望の投与方法に依存する。薬学的に許容可能なビヒクルは公知であり、周知の技工法によって調製することができる。

本明細書で使用する用語「プロモーター」とは、ポリヌクレオチドの配列の上流に位置する１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御する核酸を指し、ＲＮＡポリメラーゼ依存性ＤＮＡ結合部位、転写開始部位、ならびに転写因子結合部位、リプレッサー、および活性化因子たんぱく質結合部位を包含するがこれに限定されないあらゆるその他のＤＮＡ配列、ならびにプロモーターからの転写量を調節するように直接または間接的に作用する技術で知られているあらゆるその他のヌクレオチド配列の存在により、構造的に同定される。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの分化した細胞または組織においてのみ活性化される。

本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをそれぞれ含有する、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子を指す。核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、二本鎖または一本鎖の配列のいずれかの一部を含有していてもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、これらに限定されないが、ポリペプチドをコードする能力を有する核酸配列、および転写後にその様式で処理された細胞または対象の内因性ポリヌクレオチドに部分的または完全に相補的である核酸配列を包含し、内因性ポリヌクレオチド発現をハイブリダイズし、阻害することができるＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を生成する。

本明細書中で使用される場合、用語「架橋またはリンカー」とは、目的の配列の物理的分離を可能にする、連続的または非連続的なポリヌクレオチド配列を指し、目的の配列を物理的に分離し、それらを翻訳および転写できるように適切な様式で配置することを可能にすることができる。

本明細書中の用語「ストリング」とは、連続したヌクレオチドの配列（修飾された天然または非天然のヌクレオチドを含むか、または含まない）を指す。２つ以上の鎖は、別個の分子であるか、もしくは別個の分子の一部であってもよく、または、例えばカップリングによって共有結合的に相互連結されて（例えば、ポリエチレングリコールなどのリンカー）、分子を形成してもよい。鎖の少なくとも１本は、標的ＲＮＡに対して充分に相補的な領域を含有し得る。

アンチセンス鎖に対する相補的領域を含むｄｓＲＮＡ剤の第２鎖は、「センス鎖」と呼ばれる。しかしながら、ｓｉＲＮＡ剤はまた、少なくとも部分的に自己相補的であり、例えば、ヘアピンまたはボタンホールの構造を形成し、二本鎖領域を包含する、単一ＲＮＡ分子から形成することもできる。後者は、以下、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと呼ばれる。そのような場合、用語「鎖」とは、同じＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。

本明細書で使用する用語「組換えウイルスゲノム」とは、少なくとも１つの非発現ポリヌクレオチドカセットが天然のＡＡＶゲノムに挿入されているＡＡＶゲノムを指す。

本明細書で使用される用語「ｒｅｐ遺伝子」または「ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子」とは、Ｒｅｐたんぱく質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用される用語「Ｒｅｐたんぱく質」とは、天然のＡＡＶ ｒｅｐたんぱく質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能活動を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐたんぱく質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能活動」は、たんぱく質の生理学的機能に関連するあらゆる活動であり、ＡＡＶ ＤＮＡ複製の開始点の認識、結合、および切断によるＤＮＡ複製の促進、ならびにＤＮＡのらせん活性を包含する。さらなる機能には、ＡＡＶ転写（またはその他の異種）プロモーターの調節、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組込みが包含される。

本明細書で使用する用語「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーまたはその他の類人猿、およびその他の猿種）、動物（例えば、鳥、魚、家畜、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、哺乳類（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えば、マウス、ラット、サイレンシングされた遺伝子を有するマウス（ノックアウトマウス）、遺伝子を過剰発現するマウス（トランスジェニックマウス）、およびモルモットなどのげっ歯類）を指す。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。「対象」という用語には、胚および胎児が包含される。

本明細書で使用される用語「全身投与される」および「全身投与」とは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物が、非局所形態で対象に投与されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物の全身投与は、対象の全身のいくつかの臓器もしくは組織に到達してもよく、または新たな特定の器官もしくは組織に到達してもよい。例えば、本発明の医薬組成物の静脈内投与は、対象の２つ以上の組織または器官において形質導入をもたらし得る。

本明細書で使用する用語「転写調節エレメント」とは、１つ以上の遺伝子の発現を調節することができる核酸フラグメントを指す。本発明のポリヌクレオチド調節エレメントは、プロモーター、および随意にエンハンサーを包含する。

本明細書で使用される用語「形質導入」という用語は、外来ヌクレオチドの配列を細胞に導入してウイルスベクターにするプロセスを指す。

この文書で使用される用語「形質移入」とは、標的真核細胞へのDNAの導入を指す。

本明細書で使用される用語「ベクター」とは、宿主細胞中の１つ以上の目的のポリヌクレオチドを送達し、随意に発現させることができる構築物を指す。ベクターの例として、これらに限定されないが、ウイルスベクター、ＤＮＡまたは裸のＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＲＮＡまたはＤＮＡ発現ベクター、リポソーム封入ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および例えば細胞を産生するような特定の真核生物が挙げられる。ベクターは安定性であってもよく、自己複製することができる。使用できるベクターの種類に制限はない。ベクターは、増殖に好適であり、いくつかの異種生物に組み込まれたポリヌクレオチド、遺伝子構築物、または発現ベクターを得るのに好適である、クローニングベクターであってもよい。好適なベクターには、原核生物発現ベクター、ファージおよびシャトルベクター、ならびにウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、ならびに、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶのような非ウイルスベクターが包含される。

本明細書において使用される用語「ＵＰＲｐｌｕｓ」とは、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、プロモーター、連結または架橋配列、および同定のためのエピトープからなる配列を指す。

本発明の方法および組成物（例えば、前述の挿入物を有するＡＡＶウイルスの方法および組成物）は、本発明に記載のあらゆる用量および／または製剤、ならびに本発明に記載されるあらゆる投与経路と共に使用することができる。

「認知および運動療法または治療スキル」という用語については、本発明で定義される病態を有する、異なる種および／または対象に対して行われる認知および運動試験を指す。

用語「ｃＤＮＡ」または「相補的ＤＮＡ」とは、ＲＴ−ＰＣＲ合成を形成するために使用されるＲＮＡ配列を完全に補完するＤＮＡ配列を指す。

「標的遺伝子のサイレンシング」という語句は、薬剤と接触していない同様の細胞と比較して、薬剤と接触していない場合の標的遺伝子の特定の産物を含有および／または発現する細胞が、薬剤と接触した場合のそのような遺伝子の産物の少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以下を含有および／または発現するプロセスを指す。この標的遺伝子産物は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、たんぱく質、または調節エレメントであってもよい。

本明細書において使用される用語「相補的」とは、化合物と標的ＲＮＡ分子との間で安定した特異的結合が起こるほど充分な相補性を指す。特異的結合は、特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボ試験もしくは治療的処置の場合の生理学的条件下において、またはインビトロ試験の場合、試験が実施されている条件下において、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに充分な相補性を必要とする。

本明細書において使用される用語「制限部位」とは、前記配列のための特定の制限酵素が結合され切断されるか、または分離される、ヌクレオチド配列を指す。

リガンド
その薬理学的特性を含有するウイルスの特性は、例えば、リガンドの導入によって影響され、調整され得る。さらに、ウイルス剤の薬理学的特性は、リガンドを薬剤製剤およびウイルスに組み込むことによって改善することができる。

リガンドは、ウイルス剤に結合するリガンドなどの多種多様な実体に結合させることができるか、またはコンジュゲートもしくは製剤添加物として使用することができる。例えば、リガンドに結合したモノマーサブユニットのビヒクルを用いて行うことができる。以下の実施例は、リガンドに結合したモノマーサブユニットの文脈で記載されているが、これは好ましいものであり、実体はウイルスの他の場所で結合することができる。

リガンドは、それが包埋されるウイルス剤の分布、方向、または寿命を変化させる。好ましい様式において、リガンドは、前記リガンドが存在しない主と比較して、選択された標的、例えば、例えば、分子、細胞、または細胞型、区画（細胞もしくは器官区画、組織、または身体の領域など）に対してより良好な親和性を提供する。

本発明において、リガンドは、ウイルス中の標的分子の輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を改善し得る。

リガンドは、一般に、例えば個体における分子の吸収を改善するための治療的改変剤、例えば、分布を監視するための診断化合物またはリポーター群、架橋剤、免疫反応に抵抗性を示す画分、および天然または珍しい核酸塩基を含有し得る。

一般例として、親油性分子、脂質、レクチン（例えば、ヘシゲニン（hecigenin）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール（epifriedelanol）由来のリトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン）、合成ポリマー（例えば、１５塩基長のオリゴ乳酸）、および天然ポリマー（例えば、低および中分子量）、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、たんぱく質、たんぱく質結合剤、インテグリン結合分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンならびにペプチド模倣物が挙げられる。その他の例として、上皮細胞または葉酸受容体リガンド、例えばトランスフェリンが挙げられる。

リガンドは、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）などの、天然に存在するか、または組換えもしくは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアスパラギン酸Ｌ−アスパラギン酸、ポリ酸Ｌ−グルタミン酸、マレイン酸のスチレン無水物コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸のポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）のコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファゼンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチドポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポルフィリンなどのカチオン性画分、ポリアミンの第４級塩、またはアルファ−ヘリックスペプチドが挙げられる。

リガンドはまた、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、界面活性たんぱく質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド（ＲＧＤ）、もしくはＲＧＤペプチドの模倣物などの、細胞または組織に対するステアリング剤を含有していてもよい。

リガンドは、たんぱく質、例えば、低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）などの糖たんぱく質もしくはリポたんぱく質、または血清アルブミンなどのアルブミン、またはコリガンドに対して特異的親和性を有する分子などのペプチド、または特定の細胞型に結合する抗体などの抗体であってもよい。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。これらはまた、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースのような非ペプチド種も含み得る。

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格、またはその微小管、微小線維、および/もしくは中間径線維を改変することによって、細胞内のウイルス剤の吸収を増加させることができる薬剤などの物質であってもよい。

ひとつの点では、リガンドは脂質であるか、または脂質ベースの分子である。この脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、アルブミン血清のようなホエーたんぱく質に結合される。

あるいは、ウイルスをパッケージングしてもよい。

注射可能なウイルス溶液の調製は、ＰＢＳ（生理食塩水緩衝液）中に必要なウイルス濃度を希釈することにより実施され、以下のように処方される。

１．以下を有する８００ｍｌの蒸留水にウイルス用量（事前にＰＢＳで１倍に希釈したもの）を溶解する：
８ｇのＮａＣｌ
０．２ｇのＫＣｌ
１．４４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄
０．２４ｇのＫＨ₂ＰＯ₄。
２．ｐＨをＨＣｌで７．４まで調節する。
３．追加の蒸留水Ｈ２Ｏを用いて量を１Ｌに設定する。
４．滅菌および高圧蒸気滅菌。

設計および選択
ＵＰＲｐｌｕｓ分子変種の作成。
本特許の目的の１つは、ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性型のＸＢＰ１、およびＡＴＦ６ｆと呼ばれるＡＴＦ６の活性型の、ヒト配列から構成される組換えＤＮＡの６つの変種を作製することである。ＵＰＲｐｌｕｓ変種は、その設計に２つの変数、すなわち、２つの配列間のＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ分子（ＸＢＰ１ｓ−ＡＴＦ６ｆおよびＡＴＦ６ｆ−ＸＢＰ１ｓ）、ならびに結合ペプチド（リンカーとしても知られる）の順序を含む。使用するリンカーは以下の通りである：
・１９−ＡＡグリシンフレキシブルリンカー（「ＧＦＬ」）；
・２５−ＡＡアルファヘリックスリンカー（「ＡＨＬ４」）；および、
・５０−ＡＡ可動性リンカー（「ＦＬ」）。

これらの３つのタイプの結合部または架橋は、これらの間の相互作用を達成するために、その端部で結合されたたんぱく質間の柔軟性および適切な距離を提供することが示されている。ＸＢＰ１ｓとＡＴＦ６ｆ分子の間のこれらの３つのリンカーの生成および評価は、特異的遺伝子エレメントを結合するのに充分な三次元形状を採用する、活性機能転写因子を生成する可能性を拡大させた。

さらに、これらのキメラたんぱく質の発現をより検出するために、ヘマグルチニンペプチド（ＨＡ）たんぱく質配列（とりわけ、このエピトープに限定されない）を全てのたんぱく質の末端カルボキシル終点に付加した。

利用したクローニング戦略は、ｐＡＡＶ発現ベクターへのその後の連結のための制限部位を包含する新規の合成によって、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および３つの異なるリンカーのＤＮＡ配列を生成した。この発現ベクターは、インビトロでの最も高い神経保護活性を有するＵＰＲｐｌｕｓ変種の選択の前に、ウイルス粒子を生成するために使用された。

新規の合成により、２組の遺伝子配列が得られた。これらは第３末端にＨＡ配列を包含し、リンカーに依存する。種々の制限部位を以下に示す。
第１組 ＸＢＰ１ｓ−リンカー−ＡＴＦ６ｆ
ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ
ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ
ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ−Ｌ４Ｈ４−Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ
第２組 ＡＴＦ６−リンカー−ＸＢＰ１ｓ
ＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ
ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ
ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ

この目的に使用されるｍＲＮＡ配列は、それぞれ表ＶＩＩおよび表ＶＩＩＩ、ＡＴＦ６ｆおよびＸＢＰ１ｓに記載されている。

リンカーまたはブリッジのｍＲＮＡ配列は、ＬＧＦ、Ｌ４Ｈ４、およびＬＦリンカーを示す、表ＩＸに記載されている。

これらの６種のＵＰＲｐｌｕｓ変種の生成に伴い、ＡＡＶに関連するＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆの個別のバージョン（それぞれ表ＸＩおよびＸＩＩ）が産生され、これらの転写因子の個々の発現に関してＵＰＲｐｌｕｓの活性を正確に比較するために、ｐＡＡＶ発現ベクターにクローン化された。

これらの配列の発現は、ＵＰＲｐｌｕｓ変種の同一のプロモーターを使用し、ＨＡペプチドを提示し、これらの要素を含有しなかった転写因子ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆで実施された以前の研究とは異なる。

これらの配列が新規合成によって得られた直後、上記の制限部位を介して、それらをｐＡＡＶ発現ベクターに連結した。生成した組換えＤＮＡの８つのバージョンを配列決定し、配列が正確であり、期待される結果と一致することを確認した。

前述の配列の新規合成およびこれらの配列のｐＡＡＶベクターへの連結は、米国のGENEWIZ社によって行われた。

プラスミドで得られた配列は、図１、２、３、４、５、および６のマップとして見ることができる。

これらのプラスミドを確認するために、得られた配列の制限分析を、ＥｃｏＲ１制限酵素を用いたプラスミドＤＮＡ消化によって行った。

制限酵素アッセイで得られたフラグメントサイズは、図７に示すように、予想通りであった。

治療的使用のための生物医学的範囲の分析によって、この技術の使用がその適用において驚くべき結果を生み出した、神経変性疾患を治療するための効果的で革新的な方法が提供された。

ＵＰＲｐｌｕｓの関与を調査するために、上の段落に記載された６つの組換えＤＮＡ変種が生成された。これらは、ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性型のＸＢＰ１のヒト配列、および異なるリンカーによって連結され、その他の可能性のあるエピトープの中でヘマグルチニン（ＨＡ）のエピトープに連結された、ＡＴＦ６ｆと呼ばれるＡＴＦ６の活性型のヒト配列をコードする。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の開発に関して、目的のポリヌクレオチドに作動的に連結された転写調節エレメントを有する発現カセットを包含する、ウイルス組換えゲノムを含んでなる。ＡＡＶ血清型の種類は、排他的にではなく、目的のポリヌクレオチドが発現される組織選択性の一部を提供する。

本発明によれば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４２種類のあらゆる既知の血清型を包含し、パルボウイルスに由来する。一般に、種々のＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸に関して有意に相同なゲノム配列であり、同一の遺伝的機能、機能的かつ物理的に本質的同一である、ビブリオ細菌、それらの複製および事実上同一のメカニズムを用いる組合せた使用を提供する。

本発明において、特に、ＡＡＶ血清型２を使用した（ＡＡＶ２に関して表Ｘ中に示される、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（（ＡＡＶ２）ＮＣ＿００１４０１．２、（ＡＡＶ６）ＡＦ０２８７０４．１、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）、（ＡＡＶ１０）、（ＡＡＶ１１）、および偽型ＡＡＶにて言及したようなもの）。

ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１ウイルスについては、カプシドたんぱく質が異なるため、完全な配列は入手できない。

本発明によれば、ＡＡＶゲノムは、通常、シス５内のアクチュエータ、逆位３末端反復配列、および発現カセットを含んでなる。ＩＴＲまたはＬＴＲ配列は、１４１塩基対の長さを有する。好ましくは、ＬＴＲの完全な配列が分子内で使用され、配列のわずかな改変のみが許される。本発明の好ましい形態において、ＡＡＶの組換えゲノムは、第５および第３のＡＡＶ ＬＴＲを含んでなる。本発明の別の好ましい形態において、第５および第３のＡＡＶ ＬＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する。本発明の別のより好ましい形態では、ＡＡＶの組換えゲノムは、ＲｅｐおよびＣａｐオープンリーディングフレームを欠いている。

一方で、ＩＴＲはその他のＡＡＶ血清型に由来し得る。

本発明のＡＡＶは、あらゆる血清型由来のカプシドを含んでなる。特に、本発明では、血清型２、６、７、８、９、および１０に由来するカプシドが好ましい。しかしながら、血清型２のＡＡＶカプシドが好ましい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶキャップは、ＡＡＶキャップの１つ、またはそれらのコード核酸の突然変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換）によって生成され得る。いくつかの生産において、ＡＡＶキャップは、前述のＡＡＶキャップの１つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上類似している。

いくつかの実施において、ＡＡＶキャップは、前述のＡＡＶキャップの２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のドメインを含んでなる、キメラである。いくつかの設計において、ＡＡＶキャップは、モノマーＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のモザイクであり、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。いくつかの生産において、ｒＡＡＶの組成物は、上記のＣＡＰＳの２つ以上を含んでなる。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物にて使用するためのＡＡＶ ＣＡＰは、異種配列またはその他の修飾を含有するように設計される。例えば、選択的標的化または免疫回避を与えるペプチドまたはたんぱく質配列は、Ｃａｐたんぱく質上で遺伝子操作され得る。あるいは、または加えて、ｒＡＡＶの表面が、免疫回避を促進し得るポリエチレングリコールなどの特定の化学修飾を示すように、キャップを化学的に修飾することができる。Ｃａｐたんぱく質はまた、誘導された突然変異（例えば、その天然結合受容体を除去するため、または免疫原性エピトープを隠すため）によっても生成され得る。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＧｅｎＢａｎｋから得た、以下：表Ｉ（ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦＧ−ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ）、または表ＩＩ（ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ）、または表ＩＩＩ（ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ−Ｌ４Ｈ４−Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ）、または表ＩＶ（ＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ）、または表Ｖ（ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ）、または表ＶＩ（ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ）から選択することができる、ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦＧ−ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ−Ｌ４Ｈ４−Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ；またはＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ、またはＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩのうち少なくとも１つの配列の、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ−Ｌ４Ｈ４−Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＳｎａＢＩの標的配列の少なくとも１つの付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択された標的配列と８５％相同である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択された標的配列と７０％相同である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される標的配列の機能的等価物である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

転写調節エレメントは、プロモーター、および随意にエンハンサー領域を含むことができる。プロモーターは、好ましくは、とりわけ、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨＹ１、ＧＡＤ３４の中から選択される。エンハンサーは、神経組織に特異的である必要はない。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＣＭＶとしても知られているサイトメガロウイルスに特異的である。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＰＧＫ１としても知られているホスホグリセリン酸キナーゼ１たんぱく質に特異的である。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＣＡＭＫＩＩとしても知られているカルシウムカルモジュリンキナーゼ２に特異的である。

一実施形態において、プロモーターは特異的であり、例えば、Ｔｈｙ１としても知られている。

一実施形態において、プロモーターは特異的であり、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて通常作動するＧＡＤ３４としても知られている、グルタミン酸デカルボキシラーゼ３４に対して特異的である。

別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、転写後調節エレメントも含んでなる。好ましい実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはその機能的変種および断片、ならびにＰＰＴ−ＣＴＳまたは機能的変種および断片そのものである。１つの特定の実施形態において、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥである。

本発明によるＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、「目的のポリヌクレオチド」を含んでなる。好ましい実現において、目的のポリヌクレオチドは、全身作用性たんぱく質をコードする。別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ニューロン内で作用するたんぱく質をコードする。好ましい実施形態において、ニューロン内で作用するたんぱく質は、ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ、またはＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ、またはＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ、またはＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ、またはＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１、またはＡＴＦ６−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１、またはＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓであり、細胞内位置において変動するそれらのアイソザイムのいずれかを包含する。

ＡＡＶベクターパッケージングのサイズ制限は、ＡＡＶ血清型に応じてサイズが変動する、野生型ＡＡＶゲノムのサイズに制限される（すなわち、４０８７〜４７６７）。例えば、天然のＡＡＶ−２は、５３８２のゲノムサイズを有する。実施のいくつかの形態において、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は制限され得、所望のコード配列はウイルスゲノムの４．８キロベースの完全な置換を伴ってもよい。したがって、大型の遺伝子は、場合によっては、標準的な組換えＡＡＶベクターでの使用に適していない可能性がある。平均的な専門家は、限られたコーディング能力を克服する手法において、選択肢が利用可能であることを理解できよう。例えば、２ゲノムＡＡＶ ＩＲＴは、頭〜尾にコンカテマーを形成するようにハイブリダイズし、ベクターの能力をほぼ倍増させることができる。スプライス部位の挿入は、転写後のＩＲＴの除去を可能にする。限定されたクローニング能力を克服するためのその他の選択肢は、主題の専門家には明らかであろう。

次の目的として、これらの変種の発現をヒト細胞株で試験した。この目的を達成するために、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞の形質移入率が低い（３０％）ため、ＳＨＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫由来細胞をＨＥＫ２９３細胞と交換した。ＨＥＫ２９３細胞はヒト腎臓胚細胞系に相当し、ＣａＰＯ₄法によって高い形質移入率（８０％）を示す。

ＨＥＫ２９３細胞を、ＵＰＲｐｌｕｓの６つの変種で形質移入した。対照として、同一の発現ベクターにクローン化されたヒトＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ（それぞれ、表ＸＩおよびＸＩＩ）の個々のバージョンを包含した。また、実験室に存在するＸＢＰ１ｓのマウスＤＮＡ配列に対応する、２つのバージョンの発現も包含されていた。

ＨＥＫ２９３細胞を、ＣａＰＯ₄法を用いてそれぞれの組換えＤＮＡで形質移入し、発現の４８時間後にＲＩＰＡ緩衝液によりたんぱく質抽出し、総たんぱく質の定量を行った。

続いて、抗ＨＡ抗体、抗ＸＢＰ１抗体、および抗ＡＴＦ６抗体を用いて、ウエスタンブロット（ＷＢ）によって異なるたんぱく質を検出した。

ＷＢ分析は、図８に示されるように、抗ＨＡ抗体を有するＵＰＲｐｌｕｓの全ての変種を検出することが可能であったので、これらのたんぱく質が正確に発現されたことを示した。ヘマグルチニン（ＨＡ）のエピトープは、全てのＵＰＲｐｌｕｓ変種の末端Ｃ末端に存在するため、第１の近似として使用した。得られた分子量は、ＵＰＲｐｌｕｓ変種についておよそ１００ｋＤａであり、個々のたんぱく質について約５０ｋＤａであった。

ＵＰＲｐｌｕｓ変異体のウイルス発現においてクローニングされたＸＢＰ１ｓの個々のバージョンについて得られた分子サイズは、同一のアッセイ（図８、レーン８および１１）において既に特徴付けられ決定されているマウスＸＢＰ１ｓバージョンと比較して、差異がない。電気泳動によって得られた分子量は、ＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質および個々のたんぱく質の両方について、予想された分子量よりも多かった（図８参照）。

一方で、ヒトＸＢＰ１ｓの発現は、抗ＸＢＰ１ １４３Ｆ（Biolegend）抗体を用いた全てのＵＰＲｐｌｕｓ変種（レーン１−６、図９）、ならびに個々の変種（レーン８、図９）において検出された。この抗体はＸＢＰ１ｓのヒト型のみを認識するので、マウスＸＢＰ１ｓ配列の発現を検出することはできなかった（レーン９、１１、および１２、図９）。

最後に、図１０に示すように、ＵＰＲｐｌｕｓ変種に存在するＡＴＦ６ｆたんぱく質も抗ＡＴＦ６（ａｂＣａｍ）抗体で検出された。この抗体は、ＡＴＦ６ｆのヒトおよびマウスバージョンの両方を認識した（図１０）。

ＨＥＫ２９３細胞におけるこれらのたんぱく質の細胞内位置を決定するために、間接免疫蛍光アッセイを、ＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質およびそれらの個々のバージョンを発現する細胞に対して行った。ＷＢ分析に用いた上記と同一の抗体を使用した。ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変種で一時的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞、ならびにＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６たんぱく質の個々のバージョンで形質移入された細胞においても、ＸＢＰ１およびＡＴＦ６たんぱく質のエピトープＨＡの発現が検出された（図１１、１２、および１３）。これらの結果から、本発明者らは、６つのＵＰＲｐｌｕｓ変種の細胞内位置が、細胞の核を特異的に染色するＨｏｅｃｈｓｔプローブとの共マーキングにより明らかになった核パターンに相当することを確認した（図１１、１２、および１３）。抗ＨＡ抗体の特異性を決定するために、ＸＢＰ１のマウス配列に対応するｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰプラスミドで一過性に形質移入した細胞を、陰性対照として包含した（図１１Ｂ）。

また、抗ＸＢＰ１抗体は、ＵＰＲｐｌｕｓの全ての変種において、免疫蛍光によってＸＢＰ１たんぱく質を特異的に認識することも判明した。抗ＸＢＰ１抗体の特異性は、ＡＴＦ６を個々に形質移入した細胞上、または非形質移入細胞中に標識がないことによって判定した（図１２Ａ）。このアッセイによって、抗ＸＢＰ１抗体を用いてＸＢＰ１ｓのマウス配列を検出することができた（図１２Ｂ）。

ＡＴＦ６の発現はまた、ＵＰＲｐｌｕｓ変種で形質移入されたＨＥＫ２９３細胞における免疫蛍光によっても確証された。ＡＴＦ６たんぱく質の検出は、陰性対照として使用したＸＢＰ１ｓを個別に形質移入した細胞を除いて、ＵＰＲｐｌｕｓの全てのたんぱく質変種で観察された（図１３）。

形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるこれらのたんぱく質の発現の細胞内局在化に続いて、ルシフェラーゼ活性に結合したレポーターを用いて、プロモーターエレメントの活性を、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓウイルスによって媒介される、折り畳まれていないたんぱく質応答「ＵＰＲ」に対する応答について評価した。

ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ変種の転写活性のこの分析は、好ましくはＡＴＦ６ｆとＸＢＰ１ｓとの間のヘテロダイマーに応答する、「ＵＰＲＥ」と呼ばれるＵＰＲ要素の制御下において、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて行った。この目的のために、ＨＥＫ２９３細胞を、ルシフェラーゼ−ＵＰＲＥレポータープラスミドと共にプラスミドｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ１〜６で同時に形質移入した。さらに、化学発光分子（Promega、Dual-Luciferase（商標）レポーターアッセイシステム）を恒常的に発現する、Ｒｅｎｉｌｌａコードプラスミドを形質移入し、アッセイの内部対照として使用して全てのプラスミドを発現する細胞のパーセンテージを決定した。発現の４８時間後、得られた発光をルミノメーターで測定した。ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ変異体によるＵＰＲに対する応答エレメントの活性化レベルを、ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性化形態のＸＢＰ１ｓ、およびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆと呼ばれる活性型のＡＴＦ６、ならびにおよび両方のプラスミド（ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入に対する、コード化プラスミドの形質移入によって生成されたレベルと比較した。また、実験の陽性対照としては、ＸＢＰ１ｓのマウス配列のバージョンに対応するｐＣＤＮＡ３−ｍＸＢＰ１ｓプラスミドの形質移入が包含された。ｐＣＤＮＡ３空ベクター形質移入はまた、ＸＢＰ１／ＡＴＦ６転写因子のＸＢＰ１／ＡＴＦ６転写活性系のベースライン活性として包含されていた。

図１４は、ＵＰＲｐｌｕｓおよび関連する対照の６つの変異体の転写活性を示す。示した値は、３つの独立した実験の平均を表す。以下の表ＸＩＩＩに示す通り：

最大活性（転写活性の１００％）を、同時形質移入されたＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ変種によって到達された活性化値として決定し、この値に基づいて各実験における各変種の活性を正規化した。

得られた結果は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆの共発現条件と同様に、１〜３の変種の転写活性を示す。これらの変異体は、ＵＰＲＥプロモーター領域に結合し、ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化させることができる。４〜６の変種は、ＡＴＦ６ｆ／ＸＢＰ１ｓ共発現制御に関して約２０％の転写活性レベルを示したので、ＵＰＲＥプロモーター領域に結合することができないか、またはこのキメラたんぱく質を採用する構造がそのＤＮＡ配列へのその結合を変化させるであろう。

さらに、個々の変種はＵＰＲＥプロモーター領域を活性化することができ、ＡＴＦ６ｆはＸＢＰ１ｓたんぱく質よりも高い活性を示すことが判明した。

これらの結果は、「ＡＴＦ６ｆ−ＸＢＰ１ｓ」の混合変種の３つ（１、２、および３として指定された変種）がＵＰＲの活性化特性を維持し、プロジェクトで提案された戦略が実行可能であり、ヘテロダイマーＡＴＦ６ｆ／ＸＢＰ１ｓの転写活性に関連する標的遺伝子を活性化することができる可能性があることを確認した。

この開発における次のステップは、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓの発現によって媒介されるＵＰＲ転写標的の活性化を評価することであった。

ＨＥＫ２９３細胞を用いてこの研究を行い、６つのｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ変種、ならびに個々のｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ変種に対してコード化プラスミドを形質移入した。さらに、これらの実験的試験においてヘテロダイマーによって達成された最大活性化であると考えられる状態である、両方の変種（ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入を包含した。

発現の２４時間後、リアルタイムＰＣＲ技術を用いて、ヘテロダイマーＡＴＦ６ｆ−ＸＢＰ１ｓによって調節される転写標的として記載された遺伝子の群のｍＲＮＡレベルを定量化することにより、ＵＰＲ経路に関連する遺伝子の転写活性化を測定した。

このプロジェクト段階で分析された遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞のＸＢＰ１ｓおよび／またはＡＴＦ６によって示差的に調節される遺伝子を大量配列決定する、最近の研究（Shoulders et al., 2013）に記載された。この研究では、これらのたんぱく質の発現を制御する薬物の添加によって、示差的かつ誘導された方法でＸＢＰ１ｓおよび／またはＡＴＦ６ｆ転写因子を発現することができる、ＨＥＫ２９３細胞が生成された。このシステムは、ドキシサイクリン、薬物トリメトプリム（ＴＭＰ）によるＡＴＦ６ｆ、および両方の薬物とのインキュベーションによる両方のたんぱく質（ヘテロダイマー）を添加することによって、ＸＢＰ１ｓを発現することができる。

これらの転写因子によって示差的に発現される記載された遺伝子は、以下の表ＸＩＶに示されている：

上記の表ＸＩＶは、誘導性ＨＥＫ２９３細胞におけるＸＢＰ１および／またはＡＴＦ６によって調節される遺伝子を示す。

この情報に基づいて、オリゴヌクレオチド配列を生成して、小胞体ストレス（ＥＲ）を誘導する薬物であるツニカマイシンで処理したＨＥＫ細胞における、リアルタイムＰＣＲを用いた表ＸＩＶに示される遺伝子の発現レベルを決定した。

このアッセイにより、これらの遺伝子の増幅効率を試験し、これらの遺伝子が小胞体ストレス条件に応答して活性化されることを確証することができた。

図１５に示すように、遺伝子が効率的に増幅されていることが確認され、小胞体ストレス条件に応答して発現が増加することも確認された。

続いて、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆの６つの変種のそれぞれを個別に形質移入したＨＥＫ２９３細胞から得られた、いくつかの転写ＵＰＲ標的のｍＲＮＡレベルを比較し、両方の変種（ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ）で同時形質移入した。

分析のために選択された遺伝子は、ヘテロダイマーの活性化に関連する遺伝子であった。選択された遺伝子は、ＥＲＡＤ（「小胞体関連たんぱく質分解」）と呼ばれる小胞体プロセスに関連し折り畳まれていないたんぱく質の分解に関連する遺伝子であるＣＲＥＬＤ２、たんぱく質フォールディングプロセスに関連するＨＹＯＵ１、ならびに細胞外マトリックスの形成に関与する分泌酵素である、ＥＲＡＤおよびＳＵＬＦ１に関連するＥＤＥＭ１であった。さらに、ＥＲＡＤプロセスに関与するたんぱく質フォールディングおよびＨＥＲＰＵＤに関連する、ＢＩＰの活性化が判定された。Ｃｒｅｌｄ２、Ｅｄｅｍ１、Ｈｙｏｕ１、およびＳｕｌｆ１のようなヘテロダイマーの発現に関連するメッセンジャーＲＮＡについて、変種１、２、および３は、４、５、および６の変種と比較して、この遺伝子群を活性化することができるということが観察される（図１６）。さらに、ＳＵＬＦ１遺伝子の発現の場合、ＵＰＲｐｌｕｓ３変種は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ変種が共発現される場合に得られる活性よりも大きな活性化を示す。

この結果は、ＵＰＲｐｌｕｓキメラたんぱく質が、折り畳まれていないたんぱく質応答に関連する遺伝子を活性化することができるということを示す。さらに、１、２、および３の変異体によって達成される活性化レベルは、両方のたんぱく質を同時発現することによって得られる活性化レベルと類似するか、またはそれ以上である（図１６）。ＥＲＡＤに関連するシャペロンＢｉｐおよびＨＥＲＰＵＤ遺伝子に関して、ＵＰＲｐｌｕｓの１、２、および３変異体がこれらの遺伝子を優先的に活性化し、これらの転写因子を同時発現する場合と類似の誘導レベルに達することができるということもまた観察された。得られた結果は、３つの独立した実験の平均に対応する。

投与経路
ウイルスの投与経路は、標的ニューロンを感染させるために血液脳関門を通過させる。

本発明においてこの目的を達成するために、２つの投与経路が主に定義されている。

これらの経路の第１経路は経鼻である。一般に、経鼻投与される薬物は、全身循環を介して血流に入ることができ、脳に直接浸透することができるか、または場合によっては両方の経路に従うことができる。しかしながら、これらの経路の各々による薬物の流れを制御する多くの要因は完全には定義されていない。一般に、鼻腔に投与される薬物が移動することができる３つの経路が存在する。これらの経路には、鼻粘膜からの全身循環への直接的な侵入、ニューロンを介する軸索輸送による嗅球への侵入、および脳への直接的な侵入が包含される。異なるタイプのウイルスについて、種々のモデル基質に対するこれらの経路の各々の役割を支持する証拠を、以下に要約する。

この表は本質的に包括的なものではなく、１つ以上の経路に従うことが示されている、異なる種類の溶質を強調するためのものである。

ＣＮＳにおける細胞へのその他の投与経路には、以下が包含される。

眼内の硝子体液などの液体区画への直接注入；脈絡叢、脳室上皮／髄膜に送達するための脳室内もしくはくも膜下腔内（＊＊）の異なる経路を介する、脊椎の髄液中への直接投与、およびそこからこれらの層内に伸展するプロセスを介する近接する脳への直接投与；および一時的浸透圧もしくは薬理学的中断と組み合わせた動脈内注射により血液脳関門または血液腫瘍関門を介するその経路。

用語（＊＊）髄腔内（Intrathecal、intra + theca、「鞘内」）とは、鞘内の解剖学的空間または潜在的な空間、最も一般的には脳のくも膜または脊髄中に生じるか、または導入されるものを指す形容詞である。

投与量計算
Ulusoy et al,.によると、ベクター滴定は、１０¹⁰〜１０¹²ｇｃ／ｍｌの実証された用量で、１ｍｌあたり１０⁹〜１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）の範囲を必要とする。他方で、評価されるベクターのあらゆる希釈倍率においては、１０¹¹ｇｃ／ｍｌの低い中程度の範囲を有さなければならないため、毒性が消失する。

ヒトにおける用量
ヒトにおける用量範囲は、この範囲を異なる年齢群の適用に制限することなく、または年齢もしくは病態による分布の変更量で制限することなく、１０⁹〜１０³⁰ウイルス単位／体重ｋｇの間で見出される。

同一の生物種の正常な（対照）生物および定義された暴露条件下でのストレスにおいて観察されるものとは区別できる標的生物の、形態、機能的能力、成長、発達、または寿命の検出可能な有害な変化を引き起こさない、実験または観察によって見出される物質の、最大濃度または量。

適用法
ｒＡＡＶ２ベクターを、約６０〜８０ミクロンの先端直径を有するガラスキャピラリーを備えた５μＬのHamiltonシリンジを使用して、ＮＳに左右に注入した。適切な濃度のウイルス粒子を含有する２マイクロリットルの緩衝液を、０．４μｌ／分の速度で注入した。注射完了の５分後に針をゆっくりと抜いた。

図１は、７７０１ｂｐを有するｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図２は、７８０９ｂｐを有するｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図３は、７７１９ｂｐを有するＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図４は、７７０１ｂｐを有するＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図５は、７７１９ｂｐを有するｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図６は、７８０９ｂｐを有するｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。 図７は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体の制限試験の写真を示す。プラスミドＤＮＡ消化を、制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて３７℃で２時間行った。 得られた断片を１％アガロースゲルにセットした。２種類の分子量マーカーを使用した。サイズはゲル写真の端に示す： １．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ Ｅｃｏ Ｒ１で消化後の予想されるサイズ： １．３８９５、１９２８、１５３１、３４７、総サイズ：７７０１ ２．３８９５、１９２８、１６３９、３４７、総サイズ：７８０９ ３．３８９５、１９２８、１５４９、３４７、総サイズ：７７１９ ４．４２６２、１９２８、８１８、６９３、総サイズ：７７０１ ５．４２６４、１９２８、９２６、６９３、総サイズ：７８０９ ６．４２６４、１９２８、８３６、６９３、総サイズ：７７１９ ７．３８９５、１９２８、６９３、総サイズ：６５１６ ８．４２６２、１９２８、３４７、総サイズ：６５３７ 図８は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびＨＡエピトープによるそれらの検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞をＵＰＲｐｌｕｓ変異体で一過性に形質移入した。コードするプラスミドを、ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、ＡＴＦ６−ＨＡ、およびＸＢＰ１ｓ／ＧＦＰの対照として用いた。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）の抽出物が包含されていた。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＨＡエピトープを、抗ＨＡカバンス抗体（希釈１：１０００）を用いて検出した。ｍＸＢＰ１−ＨＡを陽性対照として用いた。Ｈｓｐ９０を負荷制御として使用した。 サイズはゲル写真の端に示す： １．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量８３ＫＤａ ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量８７ＫＤａ ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量８２ＫＤａ ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、期待分子量８３ＫＤａ ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、期待分子量８７ＫＤａ ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、期待分子量８２ＫＤａ ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ ９．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１／ＧＦＰ、期待分子量４０ＫＤａ １０．試験せず １１．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ １２．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ 図９は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびその中のＸＢＰ１ｓの検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、ならびにＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、ＡＴＦ６−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ、およびｍＸＢＰ１ｓのためのコード化プラスミドで、一時的に形質移入された。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）の抽出物を対照として使用した。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＸＢＰ１たんぱく質を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗ＸＢＰ１抗体である１４３Ｆ（希釈１：１０００）を用いて検出した。Ｈｓｐ９０を負荷制御として使用した。 ゲルレーンの同定： １．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ９．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１／ＧＦＰ １０．試験せず １１．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ−ＨＡ １２．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ−ＨＡ 図１０は、この図は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびＡＴＦ６の検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、およびＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、ＡＴＦ６−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ、ｍＸＢＰ１ｓのコード化プラスミドで、一過的に形質移入した。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）を対照として使用した。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＡＴＦ６たんぱく質を、抗ＡＴＦ６抗体ａｂＣａｍ（希釈１：２５０）を用いて検出した。マウスＡＴＦ６たんぱく質の発現を陽性対照として用いた。Ｈｓｐ９０を負荷制御として用いた。 ゲルレーンの同定： １．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ ９．ＲＶ ＡＴＦ６ｆ １０．試験せず 図１１は、この図は、ＡおよびＢの２つの群の写真を示し、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を観察することができる。 （Ａ）として同定されたグループは、各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＨＡ抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色、中部パネル）で同時染色した、ＨＥＫ２９３細胞を示す。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。 （Ｂ）として同定されたグループは、ｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰで形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＨＡ抗体（赤色）、ＥＧＦＰ固有蛍光（緑色）、およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）で同時染色した、ＨＥＫ２９３細胞を示す。 各写真の下部のバーは１０μｍに相当する。 図１２は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を示す、２つのグループの写真ＡおよびＢを示す。 （Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＸＢＰ１抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色、中部パネル）で同時染色した。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。 （Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰで形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＸＢＰ１抗体（赤色）、ＥＧＦＰ固有蛍光（緑色）、およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色）で同時染色した。 各写真の下部のバーは２０μｍに相当する。 図１３は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を分析する。 （Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＡＴＦ６抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色、中部パネル）で同時染色した。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。 各写真の下部のバーは２０μｍに相当する。 図１４は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体の転写活性を表す棒グラフを示す。 ＨＥＫ２９３細胞を、３つの異なるプラスミドで一時的に形質移入した： ・ＵＰＲｐｌｕｓ変異体をコードするベクター； ・ルシフェラーゼ発現を制御するＵＰＲＥプロモーター領域を有するベクター；および、 ・内部対照として、ウミシイタケをコードするプラスミド。 使用した陽性対照は、ＡＴＦ６−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、およびＡＴＦ６−ＨＡ／ＸＢＰ１ｓ−ＨＡの同時形質移入のためのコード化プラスミドであった。また、形質移入されたｐＣＤＮＡ３空ベクターを陰性対照として用いた。発現の４８時間後、転写活性をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 ルミネッセンス測定を行い、ウミシイタケ活性で標準化した。 グラフ（上部パネル）は、３つの独立した実験の平均を表し、値は平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。 表（下部パネル）は、各実験条件で得られた各実験値を示す。 図１５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲ標的遺伝子の発現の分析を示す。 ＵＰＲ関連転写標的のｍＲＮＡレベルを、ベースライン条件下でＨＥＫ２９３細胞から得られたｃＤＮＡからのリアルタイムＰＣＲによって分析し、１μｇ／ｍｌのツニカマイシンで８時間処理した。 全ての試料を、構成的に活性なβ−アクチン遺伝子の発現レベルで標準化した。 図１６は、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓで形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲ標的遺伝子の発現の分析を示す。 ＵＰＲ関連転写標的のｍＲＮＡレベルを、６つのｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、ならびに個々の変異体ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ、ならびに両者（ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入についてコード化プラスミドで形質移入した、ＨＥＫ２９３細胞から得られたｃＤＮＡからのリアルタイムＰＣＲによって分析した。 全ての試料を、構成的に活性なβ−アクチン遺伝子の発現レベルで標準化した。 １．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦＧ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、 ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、 ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、 ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＧ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、 ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＬＦＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、 ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、 ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、 ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、 ７＋８．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ＋ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、 ＧＦＰ．ｐＡＡＶ−ＥＧＦＰ。 図１７は、ＵＰＲｐｌｕｓの発現に対するポリＱ７９たんぱく質（適用例）のたんぱく質凝集分析を示す。 （Ａ）Ｎ２Ａ細胞を、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ベクター、およびｐＥＧＦＰ−ポリ−Ｑ７９ベクターで、一過性に同時形質移入した。発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）に、たんぱく質発現をウエスタンブロットによって分析した。ＨＳＰ９０を負荷制御として使用した。 （Ｂ）これらの同一の試料を、発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）のフィルタートラップアッセイによって分析した。 （Ｃ）発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）における、ウエスタンブロットを使用したポリＱ７９たんぱく質のたんぱく質凝集の定量を表すグラフ。３つの独立した実験の平均および標準誤差を示す。 （Ｄ）発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）における、フィルタートラップを使用したポリＱ７９たんぱく質のたんぱく質凝集の定量を表すグラフ。３つの独立した実験の平均および標準誤差を示す。

応用例
パーキンソン病およびハンチントン病は、黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて優先的に、選択的な神経細胞死を引き起こすたんぱく質凝集体の形成に関連する。これらの影響を観察するために、図１７に示すように、ウエスタンブロット試験を行った。

３×１０⁵個のＮ２Ａ細胞を３０ｍｍウェルに播種した。２４時間後、ｐＡＡＶ−ＵＰＲｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ベクターを同時形質移入し、ｐＥＧＦＰ−ポリ−Ｑ７９ベクターをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ法で使用した。０．６μｇの各ベクター＋３．２μｌのエンハンサー、および１００μｌのＥＣ緩衝液を混合した。混合物をボルテックスで１５秒間振とうし、室温で１０分間インキュベートした。８μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Qiagen）を加え、ボルテックスで１０秒間振とうし、室温で１５分間インキュベートした。この溶液を５００μｌのＤＭＥＭ １０％ＳＦＢ培地と混合し、表面全体を覆う滴下培養プレートに添加した。

発現の２４時間後または４８時間後、細胞を、細胞スクレーパーを用いて培養プレートから取り出し、収集し、４℃で５分間、２０００ｒｐｍにて遠心分離した。沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加した、１％Ｔｒｉｔｏｎを有するＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を氷上において５秒間で３回超音波処理し、最後に、ＢＣＡたんぱく質アッセイ（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を用いて各サンプルにおいてたんぱく質濃度を決定した（Zhang et al. 2014）。

２５μｇの全たんぱく質を用いてたんぱく質試料を調製し、４Ｘチャージバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．２Ｍ［ｐＨ６．８］、ＳＤＳ １０％、ブロモフェノールブルー０．０５％およびグリセロール２０％）と混合し、９５℃で５分間加熱した。これらを８％変性剤ゲルに充填した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３８０ｍＭ［ｐＨ８．３］、アクリルアミド−ビス−アクリルアミド８％、ＳＤＳ ０．１％、過硫酸アンモニウム０．１％、およびＴＥＭＥＤ ０．０６％を用いて８％ポリアクリルアミド分離ゲルを調製した。コンプレッサーポリアクリルアミドゲルを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ６０ｍＭ［ｐＨ６．８］、アクリルアミド−ビス−アクリルアミド４％、ＳＤＳ ０．１％、過硫酸アンモニウム０．１％、およびＴＥＭＥＤ ０．０６％を用いて調製した。

電気泳動は、１００Ｖの定電圧でランニングバッファー（Ｔｒｉｓ ２５ｍＭ、グリシン２５０ｍＭ、およびＳＤＳ ０．１％）中で行った。ゲル前面が青色でなくなった場合、電気泳動を停止した。続いて、たんぱく質をトランスファーバッファー（Ｔｒｉｓ ２５ｍＭ、グリシン２５０ｍＭ、およびメタノール２０％）中のＰＶＤＦ膜に、１００Ｖの定電圧で２時間３０分、氷上において移動させた。次いで、膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ミルク）中において室温で１時間、一定の攪拌下でインキュベートした。最後に、膜を次の抗体のいずれかと共にインキュベートし、５％ミルクＰＢＳ ０．０２％Ｔｗｅｅｎで希釈した；抗ＧＦＰ１：１０００（Santa Cruz）または抗ＨＳＰ９０ １：３０００（Santa Cruz）で、４℃にて１６時間、絶えず攪拌しながらインキュベートする。翌日、膜をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５分間３回洗浄し、その後、室温で１時間インキュベートし、関連する二次抗体である、１：３０００（ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％中のミルク５％）に希釈された抗ウサギ−ＨＲＰまたは抗マウス−ＨＲＰ（Invitrogen）を用いて一定に撹拌した。この期間が転動した後、膜をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％で洗浄し、今回は５分間３回洗浄した。最後に、ウエスタンブロッティング基質キット（Pierce）およびChemidoc画像検出システム（Biorad）を用いて、たんぱく質分析を行った。

上記で得られたデータを確認するために、フィルタートラップアッセイを行い、ＰＢＳ−ＳＤＳ ４×緩衝液と混合した２５μｇの全たんぱく質を使用して、これを行った。

これらの試料を、セルロースアセテートフィルターを含有する真空ポンプに連結された９６ウェルプレートに載せた。試料を添加した後、真空により高分子量種のみをフィルターに保持した。続いて、フィルターをブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％ミルク）中において室温で１時間、一定に攪拌しながらインキュベートした。その後、抗ＧＦＰ抗体１：１０００（Santa Cruz）と共にインキュベートし、５％ミルクＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％中において１６時間４℃で一定に攪拌しながら希釈した。翌日、フィルターをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５分間３回洗浄し、その後室温で１時間インキュベートし、１：３０００（ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％中５％ミルク）に希釈した２次抗マウスＨＲＰ抗体（Invitrogen）で一定に撹拌した。

この期間の後、膜をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％で洗浄し、今回は５分間３回洗浄した。最後に、ウエスタンブロッティング基質キット（Pierce）およびChemidoc画像検出システム（Biorad）を用いて、たんぱく質分析を行った。

結論：
ＵＰＲｐｌｕｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質を２４時間発現させると、Ｎ２Ａ細胞におけるポリＱ７９−ＥＧＦＰたんぱく質の凝集率は減少した。ＵＰＲｐｌｕｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質の発現は、それぞれ、ＷＢを用いて決定された凝集率である２３．２％、４７％、および５１．４％にまで減少した。

フィルタートラップ技術を用いて抗凝集効果もまた測定した。この場合、ＵＰＲｐｌｕｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質の発現は、２４時間後に、それぞれ１５．１％、１５％、および３９．１％に低下した。

さらに、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、およびＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質の発現の抗凝集効果を、４８時間後にＷＢを用いて評価した。ポリＱ７９の凝集は、ＵＰＲｐｌｕｓ処理（４７％減少）のみ有意に低下したことが観察された。

さらに、フィルタートラップ技術により、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、およびＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質の発現は、ポリＱ７９−ＧＦＰのたんぱく質凝集を、対照に関して、４８時間後に、それぞれ４８．５％、６５．６％、および２４％まで低下させることが観察された。

材料および方法
アデノ随伴ベクター産生
ＡＡＶウイルス血清型２（ＡＡＶ２／６）粒子は、２９３−ＡＡＶ細胞（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）の形質移入によって産生され、イオジキサノール勾配、続いてカラムアフィニティークロマトグラフィーで精製された。ゲノムが懸濁液中に含有するＡＡＶ粒子の数、ならびにＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるベクターの懸濁液の感染力を、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイによって決定した。

６つの変異体についてのアデノウイルスプラスミド（ｐＡＡＶ）の調製
この標的の開発のために、ＸＢＰ１ｓ配列、ヒトＡＴＦ６ｆ配列、およびそれぞれのリンカーを新規合成し、ＣＭＶプロモーターの下で、トランスジーンを発現するアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳにクローニングした。ＨＡタグ配列（図１７／１７Ａ）は、生成した構築物の全てに包含されているため、形質導入された細胞を同定することができた。空のアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳを対照として使用した。

生成した構築物の発現を確認するために、異なる構築物でＨＥＫ細胞を形質移入し、形質移入の４８時間後に、抗ＨＡ抗体を用いてＷＢによって評価されたたんぱく質の抽出を行った。

図１０に示すように、本発明者らは、ｐＡＡＶ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ（５５ｋＤａ）、ｐＡＡＶ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ（５５ｋＤａ）、およびｐＣＤＮＡ−ｍＸＢＰ１ｓ（５５ｋＤａ）の発現制御と共に、変異体ＵＰＲｐｌｕｓ（１３０ｋＤａ）の予想される分子量を有するバンドを検出した。

リアルタイムＰＣＲ
異なるプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から全ＲＮＡを単離した。ＰＢＳ中でホモジナイズした後、製造者が推奨するＴｒｉｚｏｌ ＲＮＡ抽出プロトコールに従った。ｃＤＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）を用いて合成した。ＳＹＢＲグリーンおよびＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲシステム（Stratagene）を定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ｍＲＮＡの相対定量は対照としてのβ−アクチンを用いた比較閾値サイクル法により計算した。配列のプライマーは、PrimerBankから得た（表ＸＶ）。

ウエスタンブロット
本技術は実験１にて詳述する。

培養
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから入手し、それぞれ１０％または５％ウシ血清、および抗生物質（１００００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ₂で培養した。

アッセイ
フィルタートラップアッセイ：全たんぱく質２５μｇを、酢酸セルロースフィルターを含有する真空ポンプ（Microfiltration Apparatus、bio-rad、http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/protein-blotting-equipment-cells-power-supplies#3）に連結された、９６ウェルプレートに適用する。

試料を添加した後、真空によって高分子量種のみをフィルターに保持した。次いで、フィルターをブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％ミルク）中において、室温で攪拌しながら１時間インキュベートした。次いで、それらを抗ＧＦＰ抗体１：１０００（Santa Cruz）と共にインキュベートし、撹拌しながら４℃で１６時間、５％ミルク／ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％中において希釈した。翌日、フィルターをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５分間３回洗浄し、次いで、１：３０００（５％ミルク／ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０２％）に希釈した二次抗マウスＨＲＰ抗体（Invitrogen）でと共に一定に撹拌しながら、室温で１時間インキュベートした。

Effectene法：この方法は、プラスミドを真核細胞に形質移入する方法からなり、製造者のプロトコール（Qiagen）によって記載され標準化されている。（https://www.qiagen.com/es/shop/assay-technologies/transfection-reagents/effectene-transfection-reagent/）。

このプロトコールは、０．６μｇの各ベクター＋３．２μｌのエンハンサー、および１００μｌのＥＣ緩衝液を混合することからなる。混合物をボルテックスで１０秒間振とうし、室温で１０分間インキュベートする。次いで、８μｌのEffecteneを加え、ボルテックスで１０秒間振とうし、室温で１５分間インキュベートした。この溶液を、５００μｌのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ培地と混合し、表面全体を覆う３０ｍｍ滴下培養プレートに加える。

統計
データは、平均およびＳＥＭとして表される。実験に応じて、結果は、スチューデントのＴ検定、またはマンホイットニー検定、２元配置分散分析、その後、ポストホック検定としてホルム−シダックまたはボンフェローニ、もしくはランク上の１元配置分散分析によるクラスカル・ワリス、続いてポストホック検定としてダン試験またはボンフェローニを用いて、統計的に比較した。

Claims (26)

1. 組換えウイルスゲノムを含んでなり、そのゲノムは、融合たんぱく質をコードする目的のポリヌクレオチドと動作可能に結合する神経組織の特異的転写の調節領域を含んでなる発現カセットを含んでなり、ここで融合たんぱく質は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆを含んでなる、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）。
2. 前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶを含んでなる群から選択される、請求項１に記載のアデノ随伴ベクター。
3. 転写調節領域が、とりわけ、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨＹ１、ＧＡＤ３４を含んでなる群から選択されたプロモーター領域を包含する、請求項１または２に記載のアデノ随伴ベクター。
4. とりわけ、Ｈａ、Ｆｌａｇ、Ｇｆｐ、Ｈｉｓ、およびＭｙｃ群から選択された免疫応答部位に対する翻訳領域を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノ随伴ベクター。
5. 前記発現カセットが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節領域を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ベクター。
6. 融合たんぱく質が、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および架橋またはリンカー配列を含んでなる、請求項１〜５に記載のアデノ随伴ベクター。
7. 架橋配列が、ＬＧＦ、Ｌ４Ｈ４、およびＬＦ配列を含んでなる、請求項６に記載のアデノ随伴ベクター。
8. 目的の前記ポリヌクレオチドが、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、ＸＢＰ１ｓ−ＬＧＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ−ＬＧＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、およびＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡを含んでなる群の中で融合たんぱく質をコードする、請求項１〜６に記載のアデノ随伴ベクター。
9. 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、神経変性に関与する細胞に特異的である、請求項８に記載のアデノ随伴ベクター。
10. 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、パーキンソン病およびハンチントン病に関与する細胞に特異的である、請求項９に記載のアデノ随伴ベクター。
11. 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、優先的には黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて、パーキンソン病に関与する細胞に特異的であり、またハンチントン病に関して、線条体の中型有棘神経細胞（ＭＳＮ）と称されるＧＡＢＡ作動性の神経細胞にも特異的である、請求項１０に記載のアデノ随伴ベクター。
12. 請求項１〜１１に記載のアデノ随伴ベクター、および薬剤的に許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
13. 化合物１ｍｌ当たり１０ ^９ 〜１０ ^１３ 個のゲノムコピー（ＧＣ）の範囲のウイルスの用量を含んでなる、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 神経変性疾患の治療のための薬物の調製に有用である、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
15. パーキンソン病および／またはハンチントン病の治療のための、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに隣接する発現カセットを含んでなり、前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および融合たんぱく質をコードする目的のポリヌクレオチドを含んでなり、ここで融合たんぱく質は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆを含んでなる、ポリヌクレオチド。
17. 前記融合たんぱく質が、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および架橋またはリンカー配列を含んでなる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
18. 前記プロモーター領域が、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨＹ１、およびＧＡＤ３４からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。
19. 免疫応答部位に対する翻訳領域が、Ｈａ、Ｆｌａｇ、Ｇｆｐ、Ｈｉｓ、およびＭｙｃからなる群から選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
20. 前記アデノ随伴ウイルスの血清型が、神経細胞に特異的である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
21. 前記アデノ随伴ウイルスの血清型が、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ２／６偽型ウイルスである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
22. 前記発現カセットがまた、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節エレメントをさらに含んでなる、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
23. 目的のポリヌクレオチドが、ＸＢＰ１ｓ−ＬＧＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ−ＬＦ−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ−Ｌ４Ｈ４−ＡＴＦ６ｆ−ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ−ＬＧＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ−ＬＦ−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡ、およびＡＴＦ６ｆ−Ｌ４Ｈ４−ＸＢＰ１ｓ−ＨＡからなる群から選択される融合たんぱく質をコードし、融合たんぱく質は、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用するものである、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
24. 目的の前記ポリヌクレオチドが、黒質のドーパミン作動性ニューロンに対して全身的に近接してまたは当該ニューロンで作用する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
25. 生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ Ａｇｒｏｐｅｃｕａｒｉａｓ ｄｅ Ｃｈｉｌｅに第ＲＧＭ２２３１号、第ＲＧＭ２２３２号、第ＲＧＭ２２３３号、第ＲＧＭ２２３４号、第ＲＧＭ２２３５号、および第ＲＧＭ２２３６号からなる群から選択される寄託番号の下で寄託されたプラスミドであって、アデノ随伴ウイルスの配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
26. 請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスゲノムを含んでなる、アデノ随伴ウイルス。

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