JP6975466B2 - アミノシランを用いるマイクロ及びナノコンタクトプリンティング：多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面 - Google Patents

Description

本発明はマイクロおよびナノコンタクトプリンティングの領域に関する。特に、アミノシランを用いるマイクロ及びナノコンタクトプリンティング：多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面に関する。

１９８０年代の初頭より、マイクロ流体システムは、疾患診断（W. Su,X. Gao,L.Jiang, and, J.Qin, Journal of Chromatography A, 2015, 1377, 13-26; D. G. Rackus, M. H. Shamsi and A. R. Wheeler, Chemical Society Reviews, 2015, 44, 5320-5340.; M. Karle, S. K. Vashist, R. Zengerle and F. von Stetten, Analytica Chimica Acta, 2016, 929, 1-22.; V. C. Rucker, K. L. Havenstrite, B. A. Simmons, S. M. Sickafoose, A. E. Herr and R. Shediac, Langmuir, 2005, 21, 7621- 7625.)から細胞挙動研究(G. Du, Q. Fang and J. M. den Toonder, Analytica Chimica Acta, 2016, 903, 36-50.; A. Karimi, D. Karig, A. Kumar and A. Ardekani, Lab on a Chip, 2015, 15, 23-42.; N. D. Gallant, J. L. Charest, W. P. King and A. J. Garcia, Journal of nanoscience and nanotechnology, 2007, 7, 803-807.; S. Takayama, J. C. McDonald, E. Ostuni, M. N. Liang, P. J. Kenis, R. F. Ismagilov and G. M. Whitesides, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96, 5545-5548.)に至るまでの応用を伴うバイオアッセイデバイスの小型化に対する需要の高まりを満たすために、複数のバイオセンシング反応を同時に分析するためのより安価で、より簡単で信頼性の高い手段を提供することを目標として有意に進歩してきた(P. Angenendt, J. Glokler, Z. Konthur, H. Lehrach and D. J. Cahill, Analytical chemistry, 2003, 75, 4368-4372.; S. Choi, M. Goryll, L. Y. M. Sin, P. K. Wong and J. Chae, Microfluidics and Nanofluidics, 2011, 10, 231-247.; B. S. Munge, T. Stracensky, K. Gamez, D. DiBiase and J. F. Rusling, Electroanalysis, 2016.; C. K. Tang, A. Vaze, M. Shen and J. F. Rusling, ACS sensors, 2016, 1, 1036-1043.)。利用可能なプラットフォームの中で、表面ベースのマイクロ流体バイオアッセイデバイスは、表面パターニングによる反応部位の正確な制御に主に起因する、これらのシステムによって提供される感度の向上および検出の容易さによって、最前線に立っている(M. Zimmermann, E. Delamarche, M. Wolf and P. Hunziker, Biomedical microdevices, 2005, 7, 99-110.)。特に、これらの技術の性能は、生体分子表面パターニングの質、すなわち、パターン化された生体分子の表面密度、配向、および生物学的機能によって大きく影響される。加えて、デバイスへの表面パターンの操作、取り扱いおよび統合の容易さは、これらのシステムの全体的な影響に効果を与える別の重要な要素である。

マイクロスケールおよびナノスケールで表面上に生体分子をパターン化するための既存の技術には、フォトリソグラフィー（E. E. Hui and S. N. Bhatia, Langmuir, 2007, 23, 4103-4107.)、マイクロ流体ネットワークに閉じ込められた生体分子の吸着(J. L. Garcia-Cordero and S. J. Maerkl, Chemical Communications,2013,49,1264-1266.)及びコロイドリソグラフィー(M.A.Ray, N.Shewmon, S.Bhawalkar, L.Jia, Y.Yang, and E.S. Daniels, Langmuir, 2009, 25, 7265-7270 .)のような物理的パターニングアプローチが含まれる。これらの技術は、高コスト、低スループット、または達成されたパターンの幾何学的および機能的特性に対する制限された制御のいずれかによって苦しめられている。特に、生体分子のナノパターニングは面倒であり、これらのパターン化基板をマイクロ流体デバイスに組み込むことは困難であった。最近の報告は、非共有結合を介してタンパク質をナノパターン上に固定するためにＰＤＭＳマイクロチャネルに封入されたナノパターンを生成する自己集合ベースのコロイドリソグラフィー技術を提案した(A. S. Andersen, W. Zheng, D. S. Sutherland and X. Jiang, Lab on a Chip, 2015, 15, 4524-4532.). 提案された方法は、マイクロ流体チャネル内の複数のタンパク質ナノパターンを成功的に生成することを可能にするが、主な欠点は、ナノパターン化基板を作製するための複雑な製造技術を必要とすること、各使用前に新たな表面を繰り返し製造する必要があること、およびナノパターン上へのタンパク質の非共有結合において、流れにさらされた時に潜在的な脱着を誘発することである。

マイクロおよびナノスケールのフィーチャのパターニングのより簡単で好ましい方法の１つは、マイクロコンタクトプリンティング（μＣＰ）であり、ここでは、化学的または生物学的分子がエラストマーポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）スタンプからより高い表面エネルギーを有する基板上に指定されたパターンで転写される(M. Mrksich and G. M. Whitesides, Trends in biotechnology, 1995, 13, 228-235.; L. Filipponi, P. Livingston, O. Kaspar, V. Tokarova and D. V. Nicolau, Biomedical microdevices, 2016, 18, 1-7.; R. Castagna, A. Bertucci, E. A. Prasetyanto, M. Monticelli, D. V. Conca, M. Massetti, P. P. Sharma, F. DaminM. Chiari, L. De Cola et al., Langmuir, 2016, 32, 3308-3313.)。これらのマイクロコンタクトプリントされた生体分子は、マイクロ流体デバイスにうまく組み込まれているが(R. S. Kane, S. Takayama, E. Ostuni, D. E. Ingber and G. M. Whitesides, Biomaterials, 1999, 20, 2363-2376.; E. B. Chakra, B. Hannes, J. Vieillard, C. D. Mansfield, R. Mazurczyk, A. Bouchard, J. Potempa, S. Krawczyk and M. Cabrera, Sensors and Actuators B: Chemical, 2009, 140, 278-286.)、いくつかの課題が残っている。第１に、パター化された生体分子が水素結合およびファンデルワールス力によって表面上に物理的に吸着されるので（W. Norde, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 61, 1-9.）、それらはマイクロ流体チャネルに存在する流れによって導入される高せん断応力ストレスに耐えることができない。その結果、パターン化された生体分子の徐々の脱着および分解が起こり、デバイス性能の低下および貯蔵寿命の低下につながる。第２に、生体分子の部分的脱水がμＣＰ技術の前提条件であるため、タンパク質変性および生物活性の障害の可能性が高い。

さらに、プリントされたタンパク質の配向に対する制御の欠如は遺憾であり、結合部位の接近不能性によるバイオアッセイにおける準最適な相互作用に関与している可能性がある。最後に、個々のスタンプは一度に１つのインクをパターン化するためにのみ利用できるので、複数の生体分子を持つ基板をパターニングすることは困難で時間がかかることが分かる。

これらの課題を対処するために、予めパターン化した基板を使用して、生体分子を溶液からパターン感受性生体分子に共有結合させた。例えば、Teerapanich等は、最近、ナノ流体チャネル内で抗体を安定かつ共有結合的に固定するパターン化金膜を作製することにより、タンパク質結合動力学のリアルタイムモニタリングを達成した（P. Teerapanich, M. Pugniere, C. Henriquet, Y.-L. Lin, C.-F. Chou and T. Leichle, Biosensors and Bioelectronics, 2016.）。他の研究者は、シラン処理基板へのタンパク質とヌクレオチドの共有結合を利用する、より簡単でより安定した表面パターニング技術を報告している（Y. Wu, T. Buranda, R. L. Metzenberg, L. A. Sklar and G. P. Lopez, Bioconjugate Chemistry, 2006, 17, 359-365.; H. H. Weetall, Applied Biochemistry and Biotechnology, 1993, 41, 157-188）。最近、Lin等は、ロボットマイクロアレイスポッターを用いてナノチャネル内に封入された（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン修飾基板に複数のタンパク質を共有結合的にパターニングする新規な方法を実証した（Y.-L. Lin, Y.-J. Huang, P. Teerapanich, T. Leichle and C.-F. Chou, Biomicrofluidics, 2016, 10, 034114.）。しかしながら、デバイスとの結合に先立って、タンパク質が基板上に沈着されるので、チャネルとパターンとの位置合わせを達成するのが難しい。さらに、タンパク質がアラインメントの前に短時間乾燥されるので、それらが潜在的に分解されるため、長期間の研究での変動制が懸念される。

あるいは、アミン−ＮＨ_２末端シランである（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、を使用して、適切な条件下でシリカ基板との共有シロキサン結合を形成することができる（N. Aissaoui, L. Bergaoui, J. Landoulsi, J.-F. Lambert and S. Boujday, Langmuir, 2011, 28, 656-665.）。トルエンのような無水有機溶媒は、形成された単層の均質性を達成し、ＡＰＴＥＳのガラス基板への共有結合を確実にするために広く使用されている（R. M. Pasternack, S. Rivillon Amy and Y. J. Chabal, Langmuir, 2008, 24, 12963-12971.）。次に、これらの末端アミン基は、適切なリンカーの助けを借りて生体分子を共有結合させるのに役立つ（S. K. Vashist, E. Lam, S. Hrapovic, K. B. Male and J. H. Luong, Chemical reviews, 2014, 114, 11083-11130.）。いくつかの研究は、溶液から生体分子と共有結合したマイクロ流体チャネル内のＡＰＴＥＳ単層のパターンを作製するためのμＣＰの可能性を実証している（T. F. Didar, A. M. Foudeh and M. Tabrizian, Analytical chemistry, 2011, 84, 1012-1018.; G. ArslanM. Ozmen, I. Hatay, I. H. Gubbuk and M. Ersoz, Turkish Journal of Chemistry, 2008, 32, 313-321.）。この方法は、マイクロ流体デバイスにおける多重化を達成するための単純さおよび可能性を提供するが、得られるフィーチャの解像度は、マイクロ流体チャネルの寸法によって制限されるだけでなく、プリンティングプロセスによっても制限される。なぜなら、既存のμＣＰ法は、ＰＤＭＳ基板を潜在的に膨張し、パターン化されたフィーチャの寸法を増加させる可能性のある有機溶剤の使用に依っているからである（J. N. Lee, C. Park and G. M. Whitesides, Analytical Chemistry, 2003, 75, 6544-6554.）。ＰＤＭＳの膨潤の程度は、スタンプのミクロンサイズのフィーチャに大きな影響を与えないが、ナノスケールのＡＰＴＥＳパターンを達成しようと試みる場合では、制限要因であることが判明している。特に、チオールと同様に、小分子であるシランは、長いインキュベーション時間でＰＤＭＳスタンプに拡散することができる（T. E. Balmer, H. Schmid, R. Stutz, E. Delamarche, B. Michel, N. D. Spencer and H. Wolf, Langmuir, 2005, 21, 622-632.）。結果として、プリンティング工程中（数分）、シラン分子は溶剤分子とともにスタンプから拡散しやすくなり、パターン化されたフィーチャの解像度が低下する（Y. Xia and G. M. Whitesides, Annual review of materials science, 52. 1998, 28, 153-184.）。

W. Su, X. Gao, L. Jiang and J. Qin, Journal of Chromatography A, 2015, 1377, 13-26. D. G. Rackus, M. H. Shamsi and A. R. Wheeler, Chemical Society Reviews, 2015, 44, 5320-5340. M. Karle, S. K. Vashist, R. Zengerle and F. von Stetten, Analytica chimica acta, 2016, 929, 1-22. V. C. Rucker, K. L. Havenstrite, B. A. Simmons, S. M. Sickafoose, A. E. Herr and R. Shediac, Langmuir, 2005, 21, 7621-7625. G. Du, Q. Fang and J. M. den Toonder, Analytica chimica acta, 2016, 903, 36-50. A. Karimi, D. Karig, A. Kumar and A. Ardekani, Lab on a Chip, 2015, 15, 23-42. N. D. Gallant, J. L. Charest, W. P. King and A. J. Garcia, Journal of nanoscience and nanotechnology, 2007, 7, 803-807. S. Takayama, J. C. McDonald, E. Ostuni, M. N. Liang, P. J.Kenis, R. F. Ismagilov and G. M. Whitesides, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96, 5545-5548. P. Angenendt, J. Glokler, Z. Konthur, H. Lehrach and D. J. Cahill, Analytical chemistry, 2003, 75, 4368-4372. S. Choi, M. Goryll, L. Y. M. Sin, P. K. Wong and J. Chae, Microfluidics and Nanofluidics, 2011, 10, 231-247. B. S. Munge, T. Stracensky, K. Gamez, D. DiBiase and J. F. Rusling, Electroanalysis, 2016. C. K. Tang, A. Vaze, M. Shen and J. F. Rusling, ACS sensors, 2016, 1, 1036-1043. M. Zimmermann, E. Delamarche, M. Wolf and P. Hunziker, Biomedical microdevices, 2005, 7, 99-110. E. E. Hui and S. N. Bhatia, Langmuir, 2007, 23, 4103-4107. J. L. Garcia-Cordero and S. J. Maerkl, Chemical Communications, 2013, 49, 1264-1266. M. A. Ray, N. Shewmon, S. Bhawalkar, L. Jia, Y. Yang and E. S. Daniels, Langmuir, 2009, 25, 7265-7270. A. S. Andersen, W. Zheng, D. S. Sutherland and X. Jiang, Lab on a Chip, 2015, 15, 4524-4532. M. Mrksich and G. M. Whitesides, Trends in biotechnology, 1995, 13, 228-235. L. Filipponi, P. Livingston, O. Kaspar, V. Tokarova and D. V. Nicolau, Biomedical microdevices, 2016, 18, 1-7. R. Castagna, A. Bertucci, E. A. Prasetyanto, M. Monticelli, D. V. Conca, M. Massetti, P. P. Sharma, F. DaminM. Chiari, L. De Cola et al., Langmuir, 2016, 32, 3308-3313. R. S. Kane, S. Takayama, E. Ostuni, D. E. Ingber and G. M. Whitesides, Biomaterials, 1999, 20, 2363-2376. E. B. Chakra, B. Hannes, J. Vieillard, C. D. Mansfield, R. Mazurczyk, A. Bouchard, J. Potempa, S. Krawczyk and M. Cabrera, Sensors and Actuators B: Chemical, 2009, 140,278-286. W. Norde, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 61, 1-9. P. Teerapanich, M. Pugniere, C. Henriquet, Y.-L. Lin, C.-F. Chou and T. Leichle, Biosensors and Bioelectronics, 2016. Y. Wu, T. Buranda, R. L. Metzenberg, L. A. Sklar and G. P. Lopez, Bioconjugate Chemistry, 2006, 17, 359-365. H. H. Weetall, Applied Biochemistry and Biotechnology, 1993, 41, 157-188. Y.-L. Lin, Y.-J. Huang, P. Teerapanich, T. Leichle and C.-F. Chou, Biomicrofluidics, 2016, 10, 034114. N. Aissaoui, L. Bergaoui, J. Landoulsi, J.-F. Lambert and S. Boujday, Langmuir, 2011, 28, 656-665. R. M. Pasternack, S. Rivillon Amy and Y. J. Chabal, Langmuir, 2008, 24, 12963-12971. S. K. Vashist, E. Lam, S. Hrapovic, K. B. Male and J. H. Luong, Chemical reviews, 2014, 114, 11083-11130. T. F. Didar, A. M. Foudeh and M. Tabrizian, Analytical chemistry, 2011, 84, 1012-1018. G. ArslanM. Ozmen, I. Hatay, I. H. Gubbuk and M. Ersoz, Turkish Journal of Chemistry, 2008, 32, 313-321. J. N. Lee, C. Park and G. M. Whitesides, Analytical Chemistry, 2003, 75, 6544-6554. T. E. Balmer, H. Schmid, R. Stutz, E. Delamarche, B. Michel, N. D. Spencer and H. Wolf, Langmuir, 2005, 21, 622-632. Y. Xia and G. M. Whitesides, Annual review of materials science, 1998, 28, 153-184.

表面ベースのマイクロ流体バイオアッセイデバイスの機能性は、生体分子の表面パターニングの効率および精度によって決定されるため、マイクロおよびナノスケールで表面パターンを作成するための新しい技術に対する需要が高まっている。本発明の目的は、高い再現性でマイクロ流体デバイス内の生体分子の迅速な表面パターニングを達成することである。

この研究では、水性ベースのマイクロコンタクトプリンティング技術を用いてマイクロ流体デバイス内にアミノシランのマイクロパターンおよびナノパターンを作製するための新しい手段を提示する。ＰＤＭＳスタンプへの分子の拡散を最小限に抑えるために、我々はインキ化溶媒として水を使用し、パターン化フィーチャ３６の予め規定された解像度を保存するためにプリンティング工程中のインキュベーション時間および接触時間を短くする。これらのパターンは、その後のバイオアッセイのために、溶液中の複数の生体分子を単一の表面上に結合させるためのビルディングブロッキングとして役立つ。結合した生体分子の機能を検証するために、我々は、インターロイキン６（ＩＬ６）を検出するためのアプタマーベースのイムノアッセイおよびヒトＣ反応性タンパク質（ｈＣＲＰ）の検出のための抗体ベースのイムノアッセイを実施する。我々は、ＡＰＴＥＳパターンの安定性を調査し、少なくとも３ヶ月の貯蔵寿命を有する、予め貯蔵され、すぐに使用できるバイオアッセイデバイスを製造する可能性を実証する。最後に、我々は、マイクロ流体ネットワークおよび液体分配技術の助けを借りて、パターン化されたアレイの異なる領域に異なる生体分子を送達することによって、単一パターン化表面上の多重化能力を検証する。

本発明は下記の通りである。
［１］基板とプローブ分子とを含む生体分子のアレイであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有することを特徴とする、生体分子のアレイ。
［２］基板の非パターン化表面がＰＥＧ−シランでブロッキングされている、［１］に記載の生体分子のアレイ。
［３］ナノフィーチャの直径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍにパターン化されている、［１］に記載の生体分子のアレイ。
［４］プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、［１］に記載の生体分子のアレイ。
［５］プローブ分子が、基板上のシランのナノフィーチャに結合されている［１］に記載の生体分子のアレイ。
［６］基板とプローブ分子とを含むキットであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有するキット。
［７］基板の非パターン化表面がＰＥＧ−シランでブロッキングされている［６］に記載のキット。
［８］ナノフィーチャの直径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍにパターン化されている、［６］に記載のキット。
［９］プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される［６］に記載のキット。
［１０］生体分子のアレイのための基板であって、前記基板の表面が、プローブ分子を接合するためのシランのパターン化ナノフィーチャを有する、生体分子のアレイのための基板。
［１１］基板の非パターン化表面がＰＥＧ−シランでブロッキングされている、［１０］に記載の生体分子のアレイのための基板。
［１２］ナノフィーチャの直径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍにパターン化されている、［１０］に記載の生体分子のアレイのための基板。
［１３］前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物、脂質からなる群から選択される、［１０］に記載の生体分子のアレイのための基板。
［１４］生体分子を多重送信フォーマットでマイクロまたはナノパターニングする方法であって、
・ＰＤＭＳでナノホールを有するシリコンウエハー（Ｓｉ Ｗａｆｅｒ）を覆う；
・ＰＤＭＳをシリコンウエハーから分離する；
・ＰＤＭＳを感光性ポリマーで覆う；
・光感受性ポリマーを光に暴露する；
・ＰＤＭＳから光感受性ポリマーレプリカを分離する；
・シランでインキュベートした平面ＰＤＭＳスタンプにプラズマ活性化した光感受性ポリマーレプリカを接触させる；
・コンタクトエリア内のシランをリフトオフするためにフラットＰＤＭＳを分離する；
・ガラススライド上にシランのナノホールを有するフラットＰＤＭＳをプリントする；
・ガラススライドからフラットＰＤＭＳを分離する；
・パターン化されたシランを水性ＰＥＧシランとインキュベートして、非パターン化さ表面をブロッキングする；その後
・パターン化／ブロッキングされたＡＰＴＥＳシランを所望の生体分子とともにインキュベートする
工程からなる。
［１５］生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］ナノホールの直径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍにパターン化されている、［１４］に記載の方法。

本発明の簡便な水性ベースのマイクロコンタクトプリンティング（μＣＰ）法は、数百ミクロン〜２００ｎｍの範囲のフィーチャサイズを有するマイクロ流体デバイスのガラス基板上に（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の安定したマイクロパターンおよびナノパターンを生成することができる。我々の表面パターニング技術と検出技術を組み合わせることにより、ナノスケールでの高感度のバイオアッセイシステムを近い将来に開発することができる。

パターン化されたマイクロ流体デバイスの作製；（ａ）ＡＰＴＥＳａｑマイクロパターンのためのマイクロコンタクトプリンティング：（ｉ）ＡＰＴＥＳａｑでインキ付けされたＰＤＭＳスタンプは、（ｉｉ）ＡＰＴＥＳａｑマイクロパターンをガラス表面に転写するために、マイクロコンタクトプリンティングによってプラズマ活性化ガラス表面と接触する。（ｉｉｉ）次いで、ＰＤＭＳマイクロ流体デバイスをパターン化ガラス基板に結合させて、（ｉｖ）ＡＰＴＥＳａｑマイクロパターンを封入した密封マイクロ流体デバイスを作製する。（ｂ）ＡＰＴＥＳａｑナノパターンのナノコンタクトプリンティングをリフトオフする：（ｉ）プラズマ活性化ＮＯＡ６３リフトオフスタンプを、ＡＰＴＥＳａｑ−インク付きフラットＰＤＭＳスタンプと接触させた。（ｉｉ）ＡＰＴＥＳａｑパターン化フラットスタンプをプラズマ活性ガラススライド上に５秒間押し付けた。（ｉｉｉ）次いで、マイクロ流体チャネルを不可逆的に結合させ、（ｉｖ）ナノパターンを封入した。 ＡＰＴＥＳａｑパターン化マイクロ流体デバイスにおけるＩｇＧおよびＤＮＡアプタマーのグラフト；（ａ）ビオチン化ＩｇＧを、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応を介してＡＰＴＥＳａｑパターン上にグラフトし、マイクロ流体チャネル内の１００μｍ平方のアレイを明らかにするために蛍光ストレプトアビジン色素で標識した。（ｂ）あるいは、アミン末端ビオチン化アプタマーを、ＢＳ３化学反応を介してパターン化ＡＰＴＥＳａｑに固定化し、続いてストレプトアビジン色素で染色した。点線はマイクロ流体チャネル境界を示し、スケールバーは２００μｍである。図は、パターン内の分子の結合構造を描写する。 ＡＰＴＥＳナノパターンのためのナノコンタクトプリンティングのリフトオフ；（ａ）ＮＯＡ６３リフトオフスタンプの表面上のナノホールを示すＳＥＭ画像。（ｂ）マイクロ流体チャネル内のＡＰＴＥＳａｑナノパターン上にグラフトされた蛍光標識ＩｇＧの共焦点顕微鏡画像。この図は、パターン内の結合構造を示している。（ａ）および（ｂ）のスケールバーは、（ｂ）の挿入図において５μｍおよび５００ｎｍである。 ＡＰＴＥＳａｑパターン化デバイスにおけるアプタマーおよび抗体ベースのイムノアッセイ；（ａ）アプタマーベースのサンドイッチおよび（ｂ）抗体ベースのイムノアッセイを実施し、アプタマー官能化および抗体官能化ＡＰＴＥＳａｑマイクロパターン上のＩＬ６およびｈＣＲＰをマイクロ流体デバイス内でそれぞれ検出した。（ｃ）正規化蛍光強度値のヒストグラムを、４ｎＭのｈＣＲＰの検出対ブランクおよび陰性対照（ＩＬ６）の検出のためにプロットする。（ｄ）正規化蛍光強度値を、ｈＣＲＰの試験した濃度についてプロットする。実線は最良の曲線適合を示し、点線は検出されたｈＣＲＰの最低濃度が４ｎＭである場合の検出限界を示す。スケールバーは（ａ）と（ｃ）では１００μｍ、（ｂ）では２００μｍである。 マイクロ流体デバイスのＡＰＴＥＳａｑパターンは、４℃および室温の両方で９０日間安定である；蛍光標識したＩｇＧは、４℃（（ａ）、（ｂ）および（ｃ））および２５℃（（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ））で、それぞれで保存された６つの異なるＡＰＴＥＳａｑパターン化マイクロ流体デバイスに１日目、１か月目および３か月目にグラフトされた。（ｇ）ヒストグラムは、３つの試験した条件についてＡＰＴＥＳａｑパターンで定量した正規化蛍光強度を示す。スケールバーは１００μｍ。 液体分配ロボットおよびマイクロ流体デバイスを用いたＡＰＴＥＳａｑマイクロパターン上のマルチタンパク質パターニング；（ａ）２つの異なるタンパク質溶液をＡＰＴＥＳａｑパターン化基板の異なる部分に送達する液体分配ロボットを示す概略図。（ｂ）液体分注ロボットを使用して、ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８および５４６標識蛍光抗体を、ＰＥＧ−シラン（水性）でブロッキングされたＡＰＴＥＳａｑアレイの異なる領域に局所的に送達した。（ｃ）１００μｍ幅のＡＰＴＥＳａｑストライプのアレイのマイクロコンタクトプリンティングを、相互に垂直に整列したチャネルアレイを含むマイクロ流体デバイスのボンディングの前に実施した。（ｄ）蛍光標識されたＩｇＧの溶液を交互チャネルに送達する前に、ＰＥＧ−シラン（水性）を用いてブロッキングを行った。洗浄後、２つの蛍光標識されたＩｇＧの交互パターンがマイクロ流体チャネル内でパターン化される。スケールバーは（ｂ）で２ｍｍ、（ｄ）で３００μｍである。 マイクロコンタクトプリンティングとマイクロ流体デバイス用スタンプの概略図。ＡｕｔｏＣＡＤ（ＡｕｔｏＤｅｓｋ，ＵＳＡ）図面によるスタンプデザインのパターニング：（ａ）１００μｍ間隔の１００μｍ幅ストライプ；（ｂ）５０μｍの間隔を有する５０×５０μｍの正方形のアレイ。ＡｕｔｏＣＡＤによるマイクロ流体デバイスの設計：（ｃ）１００μｍ幅および（ｄ）幅２００μｍの単一入口および単一出口を有する単一方向の流れのための平行流路；ならびに（ｅ）交互のチャネルにおける対向する流れ方向のための２つの異なる入口と接続された、２００μｍ幅の平行な流路。 共有結合マイクロコンタクトプリンティングを用いた表面上の生体分子の共有結合パターニング；マイクロ流体チャネルにおける蛍光標識ＩｇＧの従来のマイクロコンタクトプリンティングは、（ａ）フローする前のマイクロメーターのフィーチャ、（ｂ）タンパク質沈着領域の蛍光は、マイクロ流体デバイスのフローおよびタンパク質の分離によって減少する。共有結合マイクロコンタクトプリンティングを用いたタンパク質の共有結合は、（ｃ）流体前のマイクロメーターのフィーチャ、（ｄ）蛍光強度は、高い流速下でも同じままであり、タンパク質は表面に結合したままである。（ｅ）蛍光強度の定量は、タンパク質が共有結合グラフトアプローチを介して流体条件下で表面に結合したままであることを証明する。 直接タンパク質マイクロコンタクトプリンティングと水性ベースのＡＰＴＥＳナノコンタクトプリンティングの比較；（ａ）従来のナノコンタクトプリンティングは、Ricoult等によって以前に示された手順［Ricoult, S.G., et al., Large Dynamic Range Digital Nanodot Gradients of Biomolecules Made by Low−Cost Nanocontact Printing for Cell Haptotaxis. Small, 2013. 9(19): p. 3308-3313.］を用いて、２００ｎｍフィーチャーサイズの蛍光標識免疫グロブリン（ＩｇＧ）（赤）のナノドットを用いてガラス基板を直接パターン化するために行われた。蛍光標識タンパク質のナノパターンを、ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊａｐａｎ）で画像化した。（ｂ）プラズマ活性化ＮＯＡ６３リフトオフスタンプを、ＡＰＴＥＳａｑ−インク付きＰＤＭＳフラットスタンプと接触させた。ＡＰＴＥＳａｑでパターン化されたフラットスタンプを、プラズマ活性ガラススライド上に５秒間押し付けた。次いで、マイクロ流体チャネルを不可逆的に結合させてナノパターンを封入した。蛍光画像は、マイクロ流体チャネル内の２００ｎｍのフィーチャサイズのＡＰＴＥＳａｑナノパターン上にグラフトされた蛍光標識ＩｇＧを明らかにする。これらの画像は、ＡＰＴＥＳａｑのナノコンタクトプリンティング後にＩｇＧグラフティングを経て生成された生体分子のナノパターンが、ＩｇＧの直接ナノコンタクトプリンティングによって作製されたナノパターンと類似していることを示している。スケールバーは（ａ）と（ｂ）の両方で６μｍである。 ヒトＣ反応性タンパク質（ｈＣＲＰ）を検出するための抗体ベースのサンドイッチイムノアッセイ。マイクロチャネル（微小流体チャネル境界は点線で示されている）基板は、ＢＳ３化学反応を介してグラフトされた捕捉抗体を有するＡＰＴＥＳａｑパターンで最初にパターン化される。２ｎＭ〜２１７ｎＭまで変化する濃度のｈＣＲＰを１×ＰＢＳと混合し、マイクロ流体デバイスに流す。捕捉されたｈＣＲＰ分子は、同じ一次抗体およびＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５４６標識蛍光二次抗体からなる二次抗体対を介して検出された。画像中の白い四角は、ｈＣＲＰの濃度に比例した蛍光強度を有する様々な濃度でのｈＣＲＰのポジティブな捕捉および検出を示す。黒い四角は、背景となる非パターン化領域とブロッキング化領域を示す。スケールバーは２００μｍである。

本発明は、マイクロおよびナノコンタクトプリンティングの領域に関する。特に、それは、アミノシランを用いたマイクロおよびナノコンタクトプリンティング：多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面に関する。

この研究では、水性ベースのマイクロコンタクトプリンティング技術を用いてマイクロ流体デバイス内にアミノシランのマイクロパターンおよびナノパターンを作製するための新しい手段を提示する。ＰＤＭＳスタンプへの分子の拡散を最小限に抑えるために、我々はインキ溶剤として水を使用し、プリント工程中のインキュベーション時間および接触時間を短くして、パターン化フィーチャの事前定義された解像度を保存する（H. Li, J. Zhang, X. Zhou, G. Lu, Z. Yin, G. Li, T. Wu, F. Boey, S. S. Venkatraman and H. Zhang, Langmuir, 2009, 26, 5603-5609.）。これらのパターンは、その後のバイオアッセイのために、溶液中の複数の生体分子を単一の表面上に結合させるためのビルディングブロッキングとして役立つ。結合した生体分子の機能を検証するために、我々は、インターロイキン６（ＩＬ６）を検出するためのアプタマーベースのイムノアッセイおよびヒトＣ反応性タンパク質（ｈＣＲＰ）の検出のための抗体ベースのイムノアッセイを実施する。我々は、ＡＰＴＥＳパターンの安定性を調査し、少なくとも３ヶ月の品質保持期限を有する、予め保存され、すぐに使用できるバイオアッセイデバイスを製造する可能性を実証する。最後に、我々は、マイクロ流体ネットワークおよび液体分配技術の助けを借りて、パターン化されたアレイの異なる領域に異なる生体分子を送達することによって、単一パターン化表面上の多重化能力を検証する。

本発明が詳細に記載される前に、本発明は記載された特定の方法、デバイス、溶液、アレイ、キット、基板または装置に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、そのような方法論、装置、溶液、アレイ、キット、基板または装置は当然変化し得るからである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されるべきである。

他に定義されていない限り、または文脈が他に明白に指示しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。

本明細書に言及された全ての刊行物は、参照が引用された特定の材料および方法論を開示および記載する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるものではない。

定義
用語「生体分子」は、ヌクレオチド、ペプチド、抗体、炭水化物および脂質を含むがこれに限定されない生物に存在する任意の化学的または生化学的構造を指すために本明細書で使用される。

「アレイ」という用語は、本明細書ではタンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質マイクロアレイを指すために使用される。特定のタンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質を固体表面に固定化してアレイを形成することができる。

用語「結合」は、本明細書では、分子が互いに非常に近接している安定な会合をもたらす２つの分子間の互いに引き合う相互作用を指すために使用される。分子結合は、以下のタイプ：非共有、可逆的共有および不可逆的共有結合に分類することができる。分子結合に関与し得る分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質を含む。他の分子と安定な複合体を形成するポリペプチドはしばしば受容体と呼ばれ、その結合パートナーはリガンドと呼ばれる。ポリヌクレオチドもまた、それら自身または他のもの、例えばＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体と安定な複合体を形成することもできる。

「ペプチド」という用語は、本明細書では、天然の供給源から単離されたか、組換え技術によって産生されたか、または化学的に合成されたかにかかわらず、タンパク質、タンパク質の断片、およびペプチドを指すために使用される。

用語「核酸」は、本明細書では、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含み得る。この用語は分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ならびに、三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。それはまた、ポリヌクレオチドの例えば、アルキル化、および／またはキャッピングによって修飾された形態ならびに非修飾形態を含む。

「プローブ」という用語は、本明細書では、対応する標的に結合することができる核酸配列を含む、上記定義の核酸を含む構造を指すために使用される。プローブの核酸領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／または合成ヌクレオチド類似体から構成され得る。「プローブ」はまた、本明細書では、対応する標的に結合することができるタンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物および脂質を含む構造を指すために使用される。

「ナノフィーチャ」という用語は、本明細書では、沈着物のサイズが１０００ｎｍよりも小さく、構造体がナノドット、ナノポストおよびナノアイランドのように予め定義されている生体分子またはシランの所定の材料の予め定義された沈着物を指すために使用される。

本明細書において「シラン」とは、シラン化合物、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、トリエトキシシリプロピル無水コハク酸（ＴＥＳＰＳＡ）、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）、トリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−パーフルオロオクチル）シラン、トリクロロシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシランなどが挙げられるが、これらに限定されない。アミン、カルボキシレートまたはチオール基で末端化された３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）およびシランが好ましい。

本明細書において「多重化」または「多重化バイオアッセイ」とは、複数の標的分子の存在が、一つ以上の捕捉プローブコンジュゲートを使用することによって同時にアッセイされることができ、それぞれが少なくとも１つの異なる検出特性、例えば、蛍光特性（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（最大ピークの半分の高さでの全幅）、または蛍光寿命）を有する一つの測定法または他の分析法を指し示す。

本明細書に記載される本発明の態様および実施態様は、態様および実施態様「からなる」および／または「から本質的になる」ことを含むことが理解される。

本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と併せて以下の明細書から明らかになるであろう。

ハイスループット法で、マイクロアレイ技術は、同時に数万の分子相互作用の評価を可能にする。マイクロアレイは生物学、医学、創薬に大きな影響を与えてきた。ＤＮＡマイクロアレイベースのアッセイは、遺伝子発現分析、すなわち突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、および短いタンデムリピート（ＳＴＲ）のための遺伝子型決定のための応用を含み、広く使用されている。プロテオミクスの分野では、ポリペプチドと化学マイクロアレイが２つの重要なツールとして出現している。コンビナトリアルライブラリーの一形態であるケミカルマイクロアレイも、リード識別、ならびにこれらのリードの最適化に使用することができる。生物テロリズムのこの時代には、環境中の多数の生物学的または化学的因子を検出することができるマイクロアレイの開発が法執行機関にとって大きな関心を集めている。

本発明のいくつかの実施態様によれば、アッセイ方法、基板、アレイ、分子相互作用の分析用キットが提供される。本発明技術は、マイクロアレイベースのアッセイの特異性および感度を向上させる一方で、遺伝子アッセイを実施するコストを低減する。

方法
１．本発明のパターニングおよび製造手順
１−１．ソフトリソグラフィー
スタンプおよびマイクロ流体デバイスは、ＡｕｔｏＣＡＤ（ＡｕｔｏＤｅｓｋ， ＵＳＡ）で設計できる。スタンプの設計は、（ｉ）１００μｍの間隔を有する１００μｍ幅のストライプ（図１ａ（ｉ）に概略）、および（ｉｉ）５０μｍで分離された５０ｘ５０μｍ平方のアレイ（図６ａ−ｂ）からなるが、これに限定されない。マイクロ流体デバイスの３つの異なる設計はＡｕｔｏＣＡＤにおいて設計された：（ｉ）１００μｍ幅および（ｉｉ）単一方向の流れのために２００μｍ幅の単一入口を備えた平行流路および（ｉｉｉ）交互チャンネルの反対の流れ方向のために、２つの異なった入口を備えた２００μｍ幅の平行流路。より詳細な回路図を図７に示す。デバイスおよびスタンプ用のマスターを製造するために、シリコンウエハー（例：直径４インチ、Ｅ＆Ｍ Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を、フォトレジストの感光性ポリマーの７５μｍの層（ｍｒ−ＤＷＬ ４０ ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ；Ｍｉｃｒｏｒｅｓｉｓｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でコーティングした。フォト感受性ポリマーの層の厚さはフォトレジストによって定義され、７００ｎｍ〜２００μｍに変化でき、フィーチャはＤＬ１０００マスクレスライター（ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊａｐａｎ）のようなデバイスを用いるフォトリトグラフィーによってパターン化され、ｍｒ−Ｄｅｖ ６００デベロッパー（Ｍｉｃｒｏｒｅｓｉｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のようなデベロッパーを用いて現像した。しっかりとベーキングおよび洗浄した後、ウエハーはデシケーター中、気相でトリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−パーフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊａｐａｎ）のようなシランに暴露することにより、抗付着層でコーティングした。脱気して気泡を除去した後、１０：１のポリ−（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）（ＤＯＷ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｊａｐａｎ）をウエハー上に注ぎ、プレポリマーを６０℃で１５〜４８時間、好ましくは２４時間硬化させることにより、Ｓｉ−ウエハー上に存在するパターンの逆コピーを有するマイクロ流体デバイスおよびスタンプを得た。リフト−オフナノコンタクトプリンティング工程のために、フラットＰＤＭＳスタンプが、ブランクＳｉ−ウエハー上に上記の混合物を重合することによって製造された。

１−２．マイクロ流体デバイスにおけるマイクロコンタクトプリンティング（μＣＰ）
図１ａの模式図に示すように、パターン化されたスタンプは、プラズマ活性化カバースリップ下で、１〜３分間、１重量％水性ＡＰＴＥＳ（ＡＰＴＥＳａｑ）の１０μＬでインク付され得る。我々は、ＡＰＴＥＳに代えて、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＤＴＣＳ）、トリエトキシシリプロピル無水コハク酸（ＴＥＳＰＳＡ）、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）などを使うことができる。スタンプはミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｊａｐａｎ）で１０秒間すすいだ後、Ｎ_２ガスの強いパルスで急速乾燥する。次に、インク付きＰＤＭＳスタンプを、プラズマ活性化（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ，ＵＳＡ）ガラススライドと５秒間接触させる。調製されたプラズマ活性化ＰＤＭＳマイクロ流体デバイスは、プリント基板に垂直に結合される。次いで、この組立てられたデバイスをホットプレート上で８５℃で５分間加熱してＡＰＴＥＳａｑの共有反応を確実にすると同時に、マイクロ流体デバイスを基板に不可逆的に結合する。基板は、ガラス、シリコンまたはプラスチック、好ましくはガラスまたはプラスチック、より好ましくはガラスで作ることができる。

１−３．ナノパターンリフト−オフスタンプ
ナノパターン化（ナノフィーチャーは１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜８００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍでパターン化される）ＰＤＭＳレプリカは、Ｒｉｃｏｕｌｔ等によって以前に記述されたプロトコールを用いて製造される（S.G. Ricoult, M. Pla-Roca, R. Safavieh, G. MLopez-Ayon, P. Grutter, T. E. Kennedy and D. Juncker, Small, 2013, 9, 3308-3313）。簡潔には、Ｃｌｅｗｉｎ Ｐｒｏ ４．０（（Ｗｉｅｗｅｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｈｅｎｇｅｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、正方形アレイ（長さ２００ｎｍ、幅２００ｎｍ、間隔２μｍ）からなるナノパターンを最初に作成する。４インチシリコンウエハーをＰＭＭＡレジストでコーティングし、ドットアレイを電子ビームリソグラフィー（ＶＢ６ ＵＨＲ ＥＷＦ，Ｖｉｓｔｅｃ）によってパターン化し、Ｓｉへの１００ｎｍ反応性イオンエッチング（Ｓｙｓｔｅｍ１００ ＩＣＰ３８０，Ｐｌａｓｍａｌａｂ）へと続く。洗浄後、デシケーター中の蒸気相中でペルフルオロオクチルトリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に暴露することにより、ウエハーを抗接着剤層で被覆する。先のセクションで記述したように、パターン化されたウエハー上でＰＤＭＳを硬化させた後に、Ｓｉウエハーの逆ポリマーコピーが得られ、ナノピラーが形成される。ＰＤＭＳマスター（図３а）の逆コピーを有するナノホールからなるリフト−オフスタンプは、ＰＤＭＳスタンプ上のＮｏｒｌａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ６３（ノアランド・プロダクツ社、ノーラン・プロダクツ社、ニュージャージー州クランベリー）を、Ｕｖｉｔｒｏｎ ６００Ｗ ＵＶＡ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｍｐ（３１０−４００ｎｍ；１００％強度）（Ｕｖｉｔｒｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＭＡ）中で、６００ＷのＵＶ光で４０秒間硬化させることによって最終的に得られる。

１−４．リフト−オフナノコンタクトプリンティング
フラットＰＤＭＳスタンプを、上記のようなＡＰＴＥＳａｑ液（図１ｂ）のような１％シランを用いて１〜３分間インク付けする。シラン溶液の濃度は、０．５％〜５％とすることができる。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０秒間すすいだ後、インク付けスタンプをＮ_２気流下で短時間乾燥させ、直ちにプラズマ活性化感光性ポリマー（例えばＮＯＡ６３）のリフト−オフスタンプで５秒間接触させる。ＰＤＭＳは感光性ポリマー（例えばＮＯＡ６３）リフトオフ−スタンプから分離され、接触領域のＡＰＴＥＳаｑはＮＯＡ６３リフトオ−フスタンプに転写され、残りのＡＰＴＥＳаｑ分子はＰＤＭＳスタンプを５秒間プラズマ活性化ガラス面にプリンティングすることによって最終基板に転写される。

２．パターン化デバイス内でのＡＰＴＥＳａｑ−生体分子グラフティング
ＡＰＴＥＳａｑパターニングおよびデバイスアセンブリの後、デバイス内の非パターニング領域を、２重量％のＰＥＧ−シラン（水性）の溶液をデバイスに流すことによって、３０分間ブロッキングした。水性ＰＥＧ−シラン（水性）の濃度は、１％〜５％であり得る。タンパク質に１０倍モル過剰のＥＤＣ（２μＭ）およびＭＨＳ（５μＭ）でＥＤＣ−ＭＨＳ化学反応を用いることにより、蛍光標識された免疫グロブリンまたは目的タンパク質を１０μｇ／ｍｌでＡＰＴＥＳａｑパターン化表面上に共有結合的にグラフトした（図２ａ＆ｂ）。１００μＭのＢＳ３水溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中）を装置中のパターン上に流し、ＡＰＴＥＳａｑ上の利用可能な末端アミン（−ＮＨ_２）基との反応を可能にするＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）化学反応を用いて、ＤＮＡアプタマーをグラフトし、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および５０ｍＭのグリシン水溶液中のアプタマー溶液（１０μｇ／ｍｌ）によって処理して未反応のＢＳ３を消失させた。反応の各段階の後に、未反応成分を洗浄緩衝液（１ｘＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。

３．イメージングと分析
ＮＯＡ６３リフト−オフスタンプを、二次電子を検出するＥＴＤ検出器を使用して、３．５スポットサイズで５ｋＶでＱｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ走査電子顕微鏡（ＦＥＩ，Ｊａｐａｎ）を使用して画像化した。蛍光標識されたタンパク質のマイクロパターンおよびナノパターンを、Ｔｉ−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）およびＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊａｐａｎ）で画像化した。全ての画像は、各実験において一定の露光時間、この実験で示された全ての画像について１から１０秒まで変化してキャプチャーされた。平均蛍光強度測定は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）で画像解析を行うことによって得られた。画像は、ＩｍａｇｅＪの線形改変を介してコントラストを高めるために定量後に処理した。

アレイ
マイクロアレイは、分子生物学および医学において広く使用されている多重化技術であ
る。マイクロアレイは、微細−ポイント化ピンを用いたプリンティング、予め作製したマスクを用いたフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィー、インクジェットプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、またはマイクロ電極アレイ上の電気化学を含む様々な技術を用いて製造することができる。標準的なマイクロアレイでは、プローブ分子は、ガラス、シリコン、プラスチック、ヒドロゲル、アガロース、ニトロセルロースおよびナイロンを含む支持材料の固体表面に表面工学によって付着される。

本明細書に記載されるシステムは、同じ標的生体分子を検出する２つ以上のプローブを含み得る。例えば、システムがマイクロアレイであるいくつかの実施形態では、プローブは、マイクロアレイ上の複数の（例えば、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の）コピーに存在し得る。いくつかの実施形態では、システムは、同じ標的生体分子を検出する異なるプローブを含む。例えば、これらのプローブは、標的生体分子の異なる（重複するまたは重複しない）領域に結合し得る。

標的生体分子のレベルを決定することができる任意のプローブを使用することができる。いくつかの実施形態では、プローブは、オリゴヌクレオチド（核酸）、ペプチド、抗体、炭水化物または脂質であり得る。標的生体分子の検出のためには、特定の配列または構造の変化が受諾されうる事が理解される。いくつかの実施形態では、プローブは、標的生体分子を検出するための部分及び別の部分を含む。このような他の部分は、例えば、生体分子を基板に付着させるために使用され得る。いくつかの実施態様において、他の部分は、相補的構造部分と基板の表面との間の距離を増加させるための非特異的配列または非特異的構造を含む。

本発明は、基板とプローブ分子とを含む生体分子のアレイを提供し、基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有する。基板の非パターン化表面は、好ましくはＰＥＧ−シランでブロッキングされる。さらに、ナノフィーチャの直径は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜８００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍにパターン化される。プローブ分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される。プローブ分子は、基板上のシランのナノフィーチャに結合される。方法のセクションは、本発明のアレイの詳細について参照することができる。

本発明のアレイに基づくアッセイは、多重フォーマットで実施することができる。対応する異なる標的ポリヌクレオチドからの増幅産物をアッセイするために同時に使用することができて、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上の異なる捕捉プローブを使用する多重法が提供される。本明細書で教示されるような多重化が可能な方法は、より小さな試料からより多くの情報を得ることを可能にする。より小さな標本のための必要性は、侵襲性の低い技法が必要とされるため、集団内の多数の個体からサンプルを採取して新しいアッセイを検証するか、単にデータを取得する研究者の能力を増大させる。

キット
本発明は、基板とプローブ分子とを含むキットを提供し、基板の表面は、シランのパターン化されたナノフィーチャを有する。基板の非パターン化表面は、好ましくはＰＥＧ−シランでブロッキングされる。さらに、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜８００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍである。プローブ分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される。方法のセクションは、本発明のキットの詳細について参照することができる。

基板
本発明は、生体分子のアレイのための基板を提供し、基板の表面は、プローブ分子を接合するためのシランのパターン化されたナノフィーチャを有する。基板は、ガラス、シリコンまたはプラスチック、好ましくはガラスまたはプラスチック、より好ましくはガラスで作ることができる。基板の非パターン化表面は、好ましくはＰＥＧ−シランでブロッキングされる。さらに、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜８００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍである。プローブ分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される。方法のセクションは、本発明の基板の詳細について参照することができる。

マイクロ流体デバイス内の生体分子のグラフティングのためのＡＰＴＥＳａｑマイクロパターン
分子電荷にかかわらずマイクロ流体デバイス内の生体分子のパターニングを容易にするために、表面と生体分子との間に共有結合を形成するために、密閉マイクロ流体デバイス（図１ａの概略図）に水性ＡＰＴＥＳ（ＡＰＴＥＳａｑ）をプリントするためのマイクロコンタクトプリンティングプロセスが開発された。ここでは、ＡＰＴＥＳａｑは、ＰＤＭＳスタンプを用いてプラズマ活性化ガラススライド上にプリントされ（図１ａ（ｉ）〜（ｉｉ））、水平マイクロ流体チャンネル内に垂直プリントを包含するために、プラズマ活性化マイクロ流体装置に結合させた。組み立てられたデバイスを８５℃で５分間加熱して、ＡＰＴＥＳ中の反応性シラノールとガラス基板上のヒドロキシル（−ＯＨ）基との間の共有結合性シロキサン結合の形成を促進した（J. A. Howarter and J. P. Youngblood, Langmuir, 2006, 22,11142-11147.)。次いで、デバイス内の非パターン化領域を、２％ＰＥＧ−シランの溶液をデバイスに流すことによって３０分間ブロッキングした。ＰＥＧ−シランは、非生物付着剤として作用するだけでなく、パターン化基板上へのＡＰＴＥＳａｑの拡散も防止する。次いで所望の生体分子と適切なリンカーの混合物を装置のパターン化チャネルに流し、ＡＰＴＥＳａｑへの反応および共有結合を可能にした。

図２ａおよびｂは、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応を介したビオチン化免疫グロブリン（ＩｇＧ）、及びＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、−ＮＨ_２対−ＮＨ_２リンカーを使ったアミン（−ＮＨ_２）終結ビオチン化アプタマーの、それぞれのＡＰＴＥＳパターン上へのグラフティングを示す。次いで、これらのパターン化されたビオチン化分子を、蛍光ストレプトアビジン色素で標識して、マイクロ流体チャネル内の赤色の四角形として、成功した共有結合を明らかにした。さらに、マイクロ流体チャネルの高せん断応力下での生体分子パターンの完全性は、補足図８に示すように確認された。以前に記載された方法（G. ArslanM. Ozmen, I. Hatay, I. H. Gubbuk and M. Ersoz, Turkish Journal of Chemistry, 2008, 32, 313-321.）において、シランをトルエンでインク付けした場合、ＰＤＭＳの膨潤の可能性が高く、その後にフィーチャーの大きさが変化する。

さらに、スタンプ内にシラン−トルエン貯留層が形成され、長い接触時間の間ガラス表面にプリントされるとスタンプから拡散し、最終的に解像度の低下を招く。私たちのプロトコールでは、インキング溶剤として水を使用することで、シラン貯留層の形成確率とスタンプの膨潤を制限するだけでなく、数分間のインキングとプリント時間を組み合わせてコンタクト時のリークを低減する。したがって、所望のパターニング寸法は、印刷プロセス中および印刷プロセス後に維持される。これらの結果は、タンパク質だけでなく、ＤＮＡアプタマー、炭水化物、および脂質などの他の生体分子を、その後のバイオアッセイ用途のために基板上に効果的に結合するこの技術とガラスベースのマイクロ流体デバイスとの互換性を示す。

マイクロ流体デバイス内で生体分子をグラフトするためのアミノシランナノパターン
生体分子を共有結合的にパターン化するためのＡＰＴＥＳのマイクロパターンを首尾よく作製することに加えて、我々は、生体分子を共有結合的にグラフトするために、マイクロ流体チャネル内にＡＰＴＥＳａｑのナノパターンを作製するための簡便なリフト−オフナノコンタクトプリンティング法を実証する。以前のプロトコール（S. G. Ricoult, M. Pla-Roca, R. Safavieh, G. MLopez-Ayon,P. Grutter, T. E. Kennedy and D. Juncker, Small, 2013, 9,3308-3313）に従って、ナノホールを有するウエハーを複製する使い捨てエポキシリフト−オフスタンプ（図３ａ）を、ＰＤＭＳ中間レプリカを介した二重複製プロセスによって得た。

次いで、フラットＰＤＭＳスタンプをＡＰＴＥＳａｑ溶液でインク付けし、すすぎ、乾燥させた後、プラズマ活性化リフト−オフスタンプに５秒間押し付けた（図１ｂ（ｉ））。残りのＡＰＴＥＳａｑナノパターンを有するフラットＰＤＭＳスタンプを次に、プラズマ活性化ガラススライドに５秒間押し付けた（図１ｂ（ｉｉ））。フラットＰＤＭＳスタンプを利用してＡＰＴＥＳのナノスケールフィーチャーをパターン化することにより、ナノピラーのＰＤＭＳスタンプを使用する際の共通の障害である、ナノピラーの崩壊およびその後のフィーチャーの汚れのリスクを低減する。最後に、プリントされた基板上にプラズマ活性化マイクロ流体装置を結合し、プリント直後に８５℃で加熱し（図１ｂ（ｉｉｉ）〜（ｉｖ））、非特異的吸着を減少させるためにＰＥＧ−シランでブロッキングした。続いて、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応を介してパターン化ＡＰＴＥＳａｑに蛍光標識されたＩｇＧをグラフトし、タンパク質の２００ｎｍナノドットを明らかにした（図３ｂ）。

いくつかの先行研究は、単一分子の検出を達成するために生体分子ナノパターンを作製するという増大する要求を満たすためにナノコンタクトプリンティングの可能性を報告している（B. R. Takulapalli, M. E. Morrison, J. Gu and P. Zhang, Nanotechnology,2011, 22, 285302.; H.-W. Li, B. V. Muir, G. Fichet and W. T. Huck, Langmuir, 2003, 19, 1963-1965.; J. Gu, X. Xiao, B. R. Takulapalli, M. E. Morrison, P. Zhang and F. Zenhausern, Journal of Vacuum Science & Technology B, 2008, 26, 1860-1865.）。しかし、その後のマイクロ流体バイオアッセイのためにマイクロデバイスにこれらのパターンを組み込んだ報告はほとんどない（A. S. Andersen, W. Zheng, D. S. Sutherland and X. Jiang, Lab on a Chip, 2015, 15, 4524-4532.）。さらに、パターニングプロセスにおける物理吸着は、流れによって導入された高せん断応力の存在のために生体分子が表面から剥離し易いという欠点を有することが判明している。私たちの新しいプロトコールは、これら全ての課題に取り組んでいる：ガラス基板上にＡＰＴＥＳａｑをリフトオフするナノコンタクトプリンティングを使用することにより、２００ｎｍの解像度でタンパク質のナノパターンを共有結合させることをマイクロ流体デバイスに容易に組み込むことができる。さらに、これらのタンパク質ナノパターンは、Ricoult等によって以前に記述された直接ナノコンタクトプリンティングアプローチと同じ効率で造られた( S. G. Ricoult, M. Pla-Roca, R. Safavieh, G. MLopez-Ayon,P. Grutter, T. E. Kennedy and D. Juncker, Small, 2013, 9,3308-3313.)。詳細は図９を参照。

アプタマーベースおよび抗体ベースのイムノアッセイ
インターロイキン−６（ＩＬ６）（J. S. Yudkin, M. Kumari, S. E. Humphries and V. Mohamed-Ali, Atherosclerosis, 2000, 148, 209-214.; A. G. Vos, N. S. Idris, R.
E. Barth, K. Klipstein-Grobusch and D. E. Grobbee, PloS one, 2016, 11, e0147484.）およびヒトＣ−反応性タンパク質（ｈＣＲＰ）（I. Kushner, Science, 2002, 297, 520-521.; P. M. Ridker, Circulation, 2003, 107, 363-369.）は、組織の炎症または感染から生じる神経系、心血管系および他の病態生理学的状態の最も重要なバイオマーカーである。これらのバイオマーカーの定量的検出は、これらの疾患の早期診断および治療に非常に役立っている。これらの疾患を正確に診断するためには、これらのバイオマーカーの微量を確実に検出するために、高感度アッセイおよびバイオセンシング技術が必要とされている（S. K. Vashist, A. Venkatesh, E. M. Schneider, C. Beaudoin, P. B. Luppa and J. H. Luong, Biotechnology advances, 2016,34, 272-290. ; A. Qureshi, Y. Gurbuz and J. H. Niazi, Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 171, 62-76.）。したがって、ＡＰＴＥＳаｑ−マイクロパターン化マイク流体デバイスの感度および生体機能性を試験するために、アプタマーまたは抗体のいずれかの助けを借りて、ＩＬ６およびｈＣＲＰを定性的および定量的に検出するためのサンドイッチベースのイムノアッセイを行った。

アプタマーベースのイムノアッセイでは、ＩＬ６に特異的な−ＮＨ_２終結アプタマーを、ブロッキング後にＢＳ３化学を介してＡＰＴＥＳａｑマイクロパターン上にグラフトした。続いて、４７０ｎＭのＩＬ６が、相補的なビオチン化検出アプタマーおよびストレプトアビジン色素の助けを借りて検出された（図４ａ参照）。ｈＣＲＰを検出するための抗体ベースのサンドイッチイムノアッセイを実施するために、ｈＣＲＰに対する抗体の捕捉を、ＢＳ３化学反応を介してＡＰＴＥＳａｑパターンにグラフトした。これらの抗体は、同一の捕捉抗体および相補的なＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５４６標識蛍光二次抗体からなる検出抗体対によって検出された場合、２１７ｎＭのｈＣＲＰを捕捉するよう機能した（図４ｂの詳細図を参照）。ｈＣＲＰの五量体構造を考えると、同じ捕捉抗体が１０μｇ／ｍｌの濃度で検出抗体として使用された。

これらのパターン化デバイスの感度をさらにフィーチャ付けるために、我々は抗体ベースのサンドイッチイムノアッセイに焦点を当てた。ＰＢＳ中に混合された２ｎＭから２１７ｎＭの様々な濃度のｈＣＲＰを、ＢＳ３化学反応を介してＡＰＴＥＳａｑにグラフトされたｈＣＲＰに対する捕捉抗体でパターン化されたマイクロチャネルに流した。４〜２００ｎＭのｈＣＲＰ濃度の範囲が、検出抗体対を介して首尾よく検出され、蛍光顕微鏡によって定性的に分析された（詳細はＳＩ文書の図Ｓ４ａ〜ｅに示されている）。

ｈＣＲＰの定量的検出を評価するために、正規化された蛍光強度が、各条件のために、パターン化された領域の平均ピクセル強度（赤色）と非パターン化領域（黒色）の平均ピクセル強度との比を測定して計算され、各画像においてそれぞれ９つのパターン化された四角形で３つ以上の画像を平均した。ブランク反応は、非特異的吸着を説明するために検出抗体対をグラフト化捕捉抗体上に流すことによって行った。図４ｃのヒストグラムは、４．４ｎＭのｈＣＲＰの最も低い検出可能濃度対ブランク反応および陰性対照（すなわち、抗ｈＣＲＰ移植マイクロチャネルを通って流れるＩＬ６）の陽性検出についてプロットした正規化蛍光強度を示す。高レベルの非特異的吸着は、捕捉抗体および検出抗体の両方と同じ一次抗体の使用によって引き起こされる可能性がある。

図４ｄは、検出されたｈＣＲＰの各濃度について捕捉された正規化蛍光強度値（黒い四角で）を示し、一方、実線はＲ２値が０．９２２である最良線形曲線適合である（B. Nix and D. Wild, The immunoassay handbook, 2001, 2,198-210.)。結果は、これらのパターン化されたデバイスにおけるｈＣＲＰの最も低い検出可能な濃度は、以下の式に由来する１．６７相対蛍光単位（ＲＦＵ）であると計算された検出限界によって推定された時に４ｎＭであったことを示している（D. A. Armbruster and T. Pry, Clin Biochem Rev, 2008, 29, S49-52.）：ＬｏＢ ＝ Ｍｅａｎｂｌａｎｋ ＋ １．６４５（ＳＤｂｌａｎｋ），（１）ＬｏＤ ＝ ＬｏＢ ＋ １．６４５（ＳＤｌｃｓ）（２）ここでＬｏＢ、ＳＤ、ＬｏＤおよびｌｃｓは、それぞれ、ブランクの限界、偏差の標準、検出の限界および最低濃度の試料である。

臨床的に有意なレベルのＩＬ６およびｈＣＲＰの首尾良い検出は、これらのパターン化デバイスの生物学的機能を実証する。これらのデバイスの感度は、標識なしの検出システムと結合した、より特異的なアプタマーまたは抗体の組み合わせにより、将来的に著しく改善され得る。

アミノシランパターンの安定性
ＡＰＴＥＳａｑパターンの安定性を評価するために、マイクロ流体デバイス基板を、１００μｍの間隔で間隔を置いた１００μｍのストライプでマイクロ流体チャネルに垂直なマイクロコンタクトプリンティングによってＡＰＴＥＳａｑで予めパターン化した。３０種類のパターン化およびシール化デバイスは、無真空下で室温（２５℃）または４℃で３か月間、ＰＥＧ−シランを用いてブロッキングした後、プラスチック容器に保存された。試験条件当たり３つのデバイスをフィーチャ付けて、蛍光標識ＩｇＧ（免疫グロブリン）のＡＰＴＥＳａｑパターンへのグラフト効率を決定した。

図５ａ〜ｆに示される四角形の蛍光バンドは、ＩｇＧの成功したグラフト化を示す。グラフト化の効率を定量化するために、蛍光性の四角は、シグナルおよびパターン化されていない領域をバックグラウンドとして考慮した。正規化された蛍光強度値は、以前に記載されたのと同じ分析方法を用いてＩｍａｇｅＪによって定量化され、各試験条件（条件当たり３つのデバイス）についてプロットされた（図５ｇ）。図５は、ＡＰＴＥＳａｑが４℃または２５℃のいずれかで保存された時３ヶ月間安定であり、イムノアッセイの前に生体分子をグラフトして、パターン化された生体分子の保存から生じる生体分解への懸念を排除するために使用できることを示す。

最初にマイクロコンタクトプリントしたＡＰＴＥＳａｑパターンは、図５ａおよびｄに示すように、既に不均一性レベルが低いことに注目することは重要である。これは、印刷プロセスの前にスタンプにインク付けした時に凝集物を形成する水中で反応性の高いＡＰＴＥＳａｑ分子のオリゴマー化に起因すると考えられる（G. C. Allen, F. Sorbello, C. Altavilla, A. Castorina and E. Ciliberto,Thin Solid Films, 2005, 483, 306-311.; E. T. Vandenberg, L. Bertilsson, B. Liedberg, K. Uvdal, R. Erlandsson,H. Elwing and I. Lundstrom, Journal of Colloid andInterface Science, 1991, 147, 103-118.）。これは、インキング工程の前に新鮮な水性ＡＰＴＥＳａｑ溶液を調製し、インキング時間を短縮し、インク付けされたスタンプがプリントされる前に水ですすがれる工程を排除することにより、低減することができる。さらに、３ヶ月間保存されたデバイス上の蛍光標識ＩｇＧの存在がＡＰＴＥＳａｑ（図５ｃおよびｆ）の存在を示しているが、ＡＰＴＥＳａｑの緩やかな分解が時間と共に見られる。以前の文献（P. M. S. John and H. Craighead, Applied physics letters, 1996, 68, 1022-1024.）で明らかにされているように、この劣化は、（ｉ）実験を行っている間に存在する高湿度による、ＡＰＴＥＳａｑの水分による分解（N. A. Lapin and Y. J. Chabal, The Journal of Physical ChemistryB, 2009, 113, 8776-8783.）（ｉｉ）ＡＰＴＥＳａｑの徐々に起こる自己−ＮＨ_２触媒加水分解および共有結合性シロキサンの除去（J. A. Howarter and J. P. Youngblood, Langmuir, 2006, 22,11142-11147.)、または（ｉｉｉ）ガラス基板へのＡＰＴＥＳａｑの不完全共有結合（R. M. Pasternack, S. Rivillon Amy and Y. J. Chabal, Langmuir,2008, 24, 12963-12971）のいずれかにより起こり得た。

酵素に非感受性のアミノシランをプリンティングし、続いてバイオアッセイの時に生体分子を捕捉することによって、我々は、次の有利点を強調する：１）バイオアッセイを実施する前に、パターン化基板を数ヵ月にわたり保存することができる、２）生体分子は溶液に運ばれるので外部のストレスに伴った変質によって影響を受ける可能性が低い、および３）相互作用部位は、シランおよび生体分子を正確に設計し、それによって生体分子の配向を制御することによって正確に操作することができる。保存時の基板上のＡＰＴＥＳａｑパターンの化学的生存性をさらに調べ、改善するためのさらなる実験が行われており、それらは将来報告されるであろう。

アミノシランでパターン化された基板上での多重化
マイクロコンタクトプリンティングの一スタンプ−一インク特性を克服するために、ＡＰＴＥＳａｑパターンを使用して、異なる局所的に送られた生体分子を捕捉し、共有結合的にグラフトさせる。単一の表面上に複数の生体分子をパターニングする能力を視覚的に実証するために、ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８および５４６標識蛍光抗体の２つの異なる溶液を、液体送達の２つの様式によってパターン化基板上に送達した。最初に、ＡＰＴＥＳａｑの四角形のアレイ（５０ｘ５０μｍ）を、マイクロコンタクトプリンティングによりプラズマ活性ガラススライド上にパターン化し、２％ＰＥＧ−シランａｑでブロッキングした。次に、液体分配ロボット（Ｍｕｓａｓｈｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊａｐａｎ）を用いて、２つのタンパク質溶液（図６ａ）を含むマイクロリットル容積の液滴を送達し、パターン化された表面上に複数の生体分子からなるマイクロアレイを達成した（図６ｂ）。

あるいは、チャネルアレイを有するマイクロ流体デバイス（図６ｃ）を、マイクロ流体チャネルの方向に垂直に整列した１００μｍ幅のＡＰＴＥＳａｑストライプのアレイ上に結合させた。ＰＥＧ−シラン（水性）でブロッキングした後、ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化蛍光標識抗体の２つの溶液をチャネルに供給し、チャネル内のＡＰＴＥＳａｑパターンに共有結合的にグラフトした（図６ｄ）。

マイクロコンタクトプリンティングによるマルチパターン化を達成する上での主な障害の１つは、基板上にパターン化濃度勾配を作成するために、スタンプ上にマイクロ流体回路または勾配ジェネレータを含む複雑なスタンプを製作する必要性であった。これとは対照的に、この研究で導入されたマイクロ流体力学とカップリングしたアミノシランプリンティングアプローチは、単一のデバイス内で共有結合を介して提示される複数の生体分子からなる大きくて安定したアレイの作成を容易にする。マイクロ流体デバイスまたは液体分配プラットフォームで利用可能な局所送達を利用することにより、単一のアレイ内で複数のタンパク質のパターンを容易に達成することができる。さらに、ナノ流体デバイスおよびピコリットル液滴を送達する液体分配ロボットの出現により、密集したナノアレイが近い将来に達成されることは間違いない。

マイクロ流体チャネル内に生体分子パターンを作製するために、我々は、数百ミクロンから２００ｎｍまでのフィーチャサイズを有する所望の平面上にアミノ末端シランをパターン化するためのマイクロおよびナノコンタクトプリンティング法を導入した。このプロトコールには、いくつかの重要な利点がある。第１に、ＰＤＭＳとの相溶性により、水をインク溶媒として使用してＡＰＴＥＳをガラス基板上にパターン化することができる。次に、マイクロ流体チャネルは、（ｉ）揮発性シランの拡散を制限すると共に（ｉｉ）生物付着を抑制するために、ブロッキング溶液を送達する。マイクロおよびナノパターンは、これらのデバイス内でその後のイムノアッセイ用途のために、制御された向きでタンパク質およびＤＮＡのような異なる生体分子をグラフトすることができる。さらに、ＡＰＴＥＳａｑパターンは、プリンティング後少なくとも３ヶ月間、表面に生体分子を共有結合させる能力を維持し、室温または４℃での保存条件の間で有意な差はなく、それによって保存可能性を実証する。使用前に予めパターン化された基板上に生体分子をグラフトすることにより、生物分解のリスクを最小限に抑えながらグラフトされた生体分子の官能基を大幅に維持することができ、さらに操作プロトコールも簡略化されている。

マイクロコンタクトプリントされたアミノシランパターン上で行われたＤＮＡベースのイムノアッセイおよび抗体ベースのイムノアッセイを成功させることにより、これらのプリント領域の生体機能を実証し、バイオアッセイ用途の分野におけるこの技術の全体的な可能性を示した。この技術の多重化の可能性を実証するために、マイクロ流体デバイスまたは液体分配プラットフォームで利用可能な局所送達を用いて、単一のアレイ内でマルチタンパク質パターニングを達成した。

パターン化された表面の用途は広範であるが、実験室から市販の製品へのそれらの展開は、パターンをマイクロ流体デバイスに制御しながら統合する能力が限られているために妨げられていた。商品化に適した統合されたバイオアッセイの開発のために、この簡便なパターニング技術が、近い将来にこれらのパターン化基板の実験室から市販の製品への展開を促進するのに役立つ可能性がある。

試薬および材料
（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）および２−メトキシ（ポリエチレンオキシ）６−９プロピルトリクロロシラン（ＰＥＧ−シラン）は、Ｎａｃａｌａｉ（Ｊａｐａｎ）から購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ＢＳ３架橋剤、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、グリシン、およびストレプトアビジン ＤｙＬｉｇｈｔＴＭ ５５０重合体をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｊａｐａｎ）から購入した。ビオチン−ＳＰ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウス抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｓ（ＵＳＡ）から購入した。インターロイキン６（ＩＬ６）に特異的なビオチン化アプタマーは、ＢａｓｅＰａｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）から入手した。組換えヒトＩＬ６（ＰＨＣ００６６）はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。マウス抗Ｃ反応性タンパク質抗体［Ｃ５］ ａｂ８２７９（Ａｂｃａｍ，Ｊａｐａｎ）および組換えヒトＣ反応性タンパク質（ｈＣＲＰ）をＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（Ｊａｐａｎ）から得た。 Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８結合ニワトリ抗ヤギ、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５４６結合ウサギ抗マウスおよびヤギ抗ニワトリ免疫グロブリン（ＩｇＧ）はＡｂｃａｍ（Ｊａｐａｎ）から購入した。

簡便な水性ベースのマイクロコンタクトプリンティング（μＣＰ）法の本発明は、数百ミクロン〜２００ｎｍの範囲のフィーチャサイズを有するマイクロ流体デバイスのガラス基板上に（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の安定したマイクロパターンおよびナノパターンを生成することができる（初めて）。我々の表面パターニング技術とセンシング技術を組み合わせることにより、ナノスケールでの高感度のバイオアッセイシステムを近い将来に開発することができる。

Claims (3)

1. 生体分子を複数フォーマットでマイクロまたはナノパターン化する方法であって、
   ・ＰＤＭＳでナノホールを有するシリコンウエハー（Ｓｉウエハー）を覆う；
   ・ＰＤＭＳをＳｉウエハーから分離する；
   ・ＰＤＭＳを感光性ポリマーで覆う；
   ・光感受性ポリマーを光に暴露する；
   ・ＰＤＭＳから光感受性ポリマーレプリカを分離する；
   ・ＡＰＴＥＳでインキュベートした平面ＰＤＭＳスタンプにプラズマ活性化した光感受性ポリマーレプリカを接触させる；
   ・光感受性ポリマーレプリカを分離して接触領域内のＡＰＴＥＳをリフト−オフし、非接触領域内のＡＰＴＥＳを残した平面ＰＤＭＳスタンプを得る；
   ・ガラススライド上にＡＰＴＥＳのナノパターンを有する平面ＰＤＭＳをプリントする；
   ・ガラススライドから平面ＰＤＭＳを分離する；
   ・パターン化ＡＰＴＥＳを有するガラススライドを水性ＰＥＧシランとインキュベートして、非パターン化表面をブロッキングする；その後
   ・ＡＰＴＥＳパターン化／ＰＥＧブロッキング化ガラススライドを所望の生体分子とともにインキュベートする
   工程を有することを特徴とする方法。
2. 生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から
   選択される、請求項１に記載の方法。
3. ナノホールの直径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍにパターン化される、請求項１又は２に記載の方法。

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