JP6978492B2 - 二重保護されたプロセレンテラジン基質 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれている、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，７０１号に基づく利益を主張する。

電子提出された資料の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、配列表を含む。２０１７年９月８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＳＦＩＬＥＤ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、２，０７１バイトのサイズである。

本開示は、セレンテラジン類似体、セレンテラジン類似体を作製するための方法、及びルシフェラーゼベースのアッセイにおいてセレンテラジン類似体を使用する方法に関する。

生物発光アッセイは、細胞生理学、特に遺伝子発現に関連するプロセスの調査において広く使用されている。特に、ルシフェラーゼレポーター酵素はこの分野においてかなり有益なツールであり、今日まで、生物発光アッセイにおいて有用であり得る小さく環境に対する感受性がないルシフェラーゼを得るため、集中的なタンパク質工学が行われてきた。細胞全体のバイオセンサ測定、高スループットスクリーニングによる創薬、及びインビボ造影ができるようにし、かつ、生細胞におけるタンパク質間の相互作用、アポトーシス、及び細胞生存率の研究も可能にする、効率的なルシフェラーゼレポーターがいくつか存在する。セレンテラジン及びセレンテラジン類似体を基質として使用するルシフェラーゼは、その明るさ及び細胞全体での適用における許容性のため、最も広く使用されている系のひとつである。

多くの公知のセレンテラジン類似体には、それらのルシフェラーゼ基質としての有効性及びルシフェラーゼベースのアッセイにおける有用性を限定する欠陥がある。こうした欠陥には、細胞毒性、光感受性、熱力学的不安定性、低い水溶解度、及び低い細胞透過性が含まれる。例えば、プロセレンテラジンまたはプロフリマジン（セレンテラジン類似体）に基づくアッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比は、バックグラウンド発光によって限定されることが多い。最も弱いケージ基の加水分解でさえ、バックグラウンドが経時的に増加し、シグナル対バックグラウンドの一時的な減少をもたらし得る。低いシグナル対バックグラウンドの枠は、多くの場合、生死細胞アッセイ、細胞アポトーシス、細菌、真菌、もしくはカビの検出、またはインビトロもしくは細胞内における任意の目的の標的酵素の活性の検出といった、実用的用途を限定する。したがって、改善された特性を有するセレンテラジン類似体及びこの類似体を合成するための方法の必要性が存在する。

一態様では、式（Ｉ）の化合物

（Ｉ）、
またはその互変異性体もしくは塩［式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＡｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³はそれぞれ、Ａｒ¹、Ａｒ²、またはＡｒ³のうちの１つが−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されることを条件として、場合により置換されており、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ^x（ここでＲ^xは、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである）であり、Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、結合及び１〜５０原子のリンカーからなる群から選択され、ここでＬ¹及びＬ²はそれぞれ、場合により置換されており、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、酵素基質基から選択される］
が開示される。

また、本化合物を作製する方法、本化合物を含むキット、及び本化合物をルシフェラーゼベースのアッセイにおいてルシフェラーゼ基質として使用する方法が開示される。

図１は、モノ保護された（ｍｏｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）類似体と比べた、本開示の二重保護された（ｄｕａｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）化合物の発光シグナル出力を示す。 図２は、モノ保護された類似体と比べた、本開示の二重保護された化合物の発光シグナル出力を示す。 図３は、モノ保護された類似体と比べた、本開示の二重保護された化合物の発光シグナル出力を示す。

本明細書では、二重保護されたセレンテラジン類似体が開示される。二重保護されたセレンテラジン類似体は、非発光酵素の基質、及び発光タンパク質のプロ基質であり得る。目的の非発光酵素による作用を受けると、この類似体は、発光タンパク質の基質になり得る。二重保護されたセレンテラジン類似体は、刺胞動物ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）、クラゲルシフェラーゼ（例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａクラゲ由来のエクオリン）、及び十脚類ルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓのルシフェラーゼ複合体）などの種々の海洋生物に見られるルシフェラーゼ及び発光タンパク質を含むがこれらに限定されない、発光をもたらすためにセレンテラジンを利用するタンパク質（「セレンテラジン利用酵素」）の有用なプロ基質であり得る。本開示の化合物は、対応するモノ保護された化合物と比較して、予想外に極めて低いバックグラウンドを呈し得る。概して、二重保護されたプロ基質のバックグラウンドは、モノ保護された基質よりも２〜３桁低く、バックグラウンドシグナルは長期間にわたって非常に安定である。本開示の二重保護されたセレンテラジン類似体により、感受性の著しい改善に起因する新たなアッセイが可能になり、多くの用途で大きな可能性がもたらされる。二重プロセレンテラジンベースのアッセイは、標的酵素／反応種をリアルタイム形式で判定するための非溶解性で均質な生物発光方法である。

１．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、本文書が定義を含めて優先する。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと同様または均等な方法及び材料を本発明の実践または試験において使用してもよい。本明細書において言及される公開文献、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書において開示される材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｃａｎ（できる）」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）（含有する）」という用語、及びそれらの変化形は、本明細書で使用される場合、更なる行為または構造の可能性を排除しない、無制限の移行句、用語、または単語であるよう意図される。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上他の意味を示すことが明らかでない限り、複数の参照対象が含まれる。本開示では、明示的に記述されているか否かを問わず、本明細書において提示される実施形態または要素を「含む」、それら「からなる」、及びそれら「から本質的になる」他の実施形態も想定される。

分量に関連して使用される「約」という修飾語は、記述されている値を含み、文脈により定められる意味を有する（例えば、特定の分量の測定に関連する程度の誤差を少なくとも含む）。「約」という修飾語はまた、２つの終点の絶対値によって定義される範囲を開示するものとみなされるべきである。例えば、「約２〜約４」という表現は、「２〜４」という範囲も開示する。「約」という用語は、示される数のプラスまたはマイナス１０％を指す場合がある。例えば、「約１０％」は、９％〜１１％の範囲を示す場合があり、「約１」は、０．９〜１．１を意味する場合がある。例えば丸めなどの「約」の他の意味は、文脈から明らかになり得る。つまり、例えば「約１」は０．５〜１．４を意味する場合もある。

特定の官能基及び化学用語の定義を以下により詳細に記載する。本開示では、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５^th Ｅｄ．、表紙裏に従って識別され、特定の官能基は概して、この文献に記載の通りに定義される。更に、有機化学の一般原則、ならびに特定の官能性部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５^th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３^rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加されたアルキル基（本明細書で定義される通り）を指す。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を意味する。「低級アルキル」または「Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。「Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル」という用語は、１〜３個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、及びｎ−デシルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素間二重結合を有する炭化水素鎖を意味する。アルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、アルケニル基は、アリール基、例えばフェニルで置換されていてもよい。

本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素間三重結合を有する炭化水素鎖を意味する。アルキニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、アルキニル基は、アリール基、例えばフェニルで置換されていてもよい。

本明細書で使用される「アルコキシアルキル」という用語は、アルキル基（本明細書で定義される通り）を介して親分子部分に付加されたアルコキシ基（本明細書で定義される通り）を指す。

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１〜１０個の炭素原子、例えば２〜５個の炭素原子をもつ直鎖または分枝鎖の炭化水素に由来する二価基を指す。アルキレンの代表例としては、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−、及び−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−が挙げられるが、これらに限定されない。

「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然の両方のアミノ酸を指す。これには、保護された天然及び非天然のアミノ酸も含まれる。

本明細書で使用される「アリール」という用語は、フェニル基、または二環式アリールもしくは三環式アリールの縮合環系を指す。二環式縮合環系の例には、親分子部分に付加され、フェニル基に縮合したフェニル基がある。三環式縮合環系の例には、親分子部分に付加され、２つの他のフェニル基に縮合したフェニル基がある。二環式アリールの代表例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限定されない。三環式アリールの代表例としては、アントラセニルが挙げられるが、これに限定されない。単環式、二環式、及び三環式のアリールは、環に含まれるいずれかの炭素原子を介して親分子部分に結合しており、置換されていなくても置換されていてもよい。

本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、３〜１０個の炭素原子を含有し、ヘテロ原子及び二重結合を含まない、炭素環式環系を指す。シクロアルキルの代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、及びシクロデシルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素間二重結合を含み、好ましくは環あたり５〜１０個の炭素原子を有する、非芳香族の単環式または多環式環系を意味する。例となる単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、またはシクロヘプテニルが挙げられる。

本明細書で使用される「フルオロアルキル」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、または８個の水素原子がフッ素に置き換えられているアルキル基（本明細書で定義される通り）を意味する。フルオロアルキルの代表例としては、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及びトリフルオロプロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「アルコキシフルオロアルキル」という用語は、フルオロアルキル基（本明細書で定義される通り）を介して親分子部分に付加されたアルコキシ基（本明細書で定義される通り）を指す。

本明細書で使用される「酵素基質」という用語は、親分子部分または化合物のうち、酵素修飾を受ける基またはその一部分を指す。酵素基質が酵素によって修飾されるとき、これにより、親分子部分からの、また、存在する場合は酵素基質と親分子部分との間のリンカーからの、酵素基質の切断がもたらされることが好ましい。酵素基質の例としては、限定されるものではないが、ペプチド、アミノ酸、サッカライド（saccharides）、及びホスフェート（phosphates）が挙げられ、これらは全て、親分子部分に直接的に結合していても、または選択された共有結合的修飾によってリンカーを介して結合していてもよい。酵素基質に作用する好適な酵素としては、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ホスファターゼ、カスパーゼ３／７、カスパーゼ６、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ２、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰＩＶ）、カルパイン及びキモトリプシン様プロテアソームプロテアーゼ、トリプシン様プロテアソームプロテアーゼ、カスパーゼ様プロテアソームプロテアーゼ、グランザイムＢ、カテプシンＢ／Ｌ、カテプシンＫ、トロンビン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、ＳＡＲＳプロテアーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＣＹＰ４５０、レダクターゼ、ならびにデヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「フルオロアルコキシ」という用語は、少なくとも１つのフルオロアルキル基（本明細書で定義される通り）が酸素原子を介して親分子部分に付加されていることを意味する。フルオロアルキルオキシの代表例としては、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、及び２，２，２−トリフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＦを意味する。

本明細書で使用される「ハロアルキル」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、または８個の水素原子がハロゲンに置き換えられているアルキル基（本明細書で定義される通り）を意味する。

本明細書で使用される「ハロアルコキシ」という用語は、少なくとも１つのハロアルキル基（本明細書で定義される通り）が酸素原子を介して親分子部分に付加されていることを意味する。

本明細書で使用される「ヘテロアルキル」という用語は、炭素原子のうちの１個以上が、Ｓ、Ｓｉ、Ｏ、Ｐ、及びＮから選択されるヘテロ原子に置き換えられているアルキル基（本明細書で定義される通り）を意味する。ヘテロ原子は酸化されていてもよい。ヘテロアルキルの代表例としては、アルキルエーテル、二級及び三級アルキルアミン、アミド、ならびにアルキルスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、芳香族単環式環または芳香族二環式環系もしくは芳香族三環式環系を指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される、１、２、３、または４個のヘテロ原子）を含む、５員環または６員環である。５員の芳香族単環式環は２つの二重結合を有し、６員の芳香族単環式環は３つの二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基には、単環式シクロアルキル基（本明細書で定義される通り）、単環式アリール基（本明細書で定義される通り）、単環式ヘテロアリール基（本明細書で定義される通り）、または単環式複素環（本明細書で定義される通り）に縮合した、単環式ヘテロアリール環が含まれる。三環式ヘテロアリール基には、単環式シクロアルキル基（本明細書で定義される通り）、単環式アリール基（本明細書で定義される通り）、単環式ヘテロアリール基（本明細書で定義される通り）、または単環式複素環（本明細書で定義される通り）のうちの２つに縮合した、単環式ヘテロアリール環が含まれる。一部の実施形態では、二環式ヘテロアリール基の例には、親分子部分に付加され、単環式シクロアルキル基（本明細書で定義される通り）、単環式アリール基（本明細書で定義される通り）、単環式ヘテロアリール基（本明細書で定義される通り）、または単環式複素環（本明細書で定義される通り）に縮合した、単環式ヘテロアリール環がある。一部の実施形態では、三環式ヘテロアリール基の例には、親分子部分に付加され、単環式シクロアルキル基（本明細書で定義される通り）、単環式アリール基（本明細書で定義される通り）、単環式ヘテロアリール基（本明細書で定義される通り）、または単環式複素環（本明細書で定義される通り）のうちの２つに縮合した、単環式ヘテロアリール環がある。単環式ヘテロアリールの代表例としては、ピリジニル（ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、ピリジン−４−イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、フリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、及び２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの代表例としては、クロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、チエノピロリル、チエノチエニル、イミダゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、イミダゾピリジン、ベンゾオキサジアゾリル、及びベンゾピラゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式のヘテロアリールは、環に含まれるいずれかの炭素原子またはいずれかの窒素原子を介して親分子部分に結合しており、置換されていなくても置換されていてもよい。

本明細書で使用される「複素環」または「複素環式」という用語は、単環式複素環、二環式複素環、または三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、３員環、４員環、５員環、６員環、７員環、または８員環である。３員環または４員環は、０個または１個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む。５員環は、０個または１個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を含む。６員環は、０、１、または２個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を含む。７員環及び８員環は、０、１、２、または３個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を含む。単環式複素環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキサラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２−チアジナニル、１，３−チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式複素環は、フェニル基に縮合した単環式複素環、あるいは単環式シクロアルキルに縮合した単環式複素環、あるいは単環式シクロアルケニルに縮合した単環式複素環、あるいは単環式複素環に縮合した単環式複素環、あるいはスピロ複素環基、あるいは、環の中で隣接していない２個の原子が、１、２、３、もしくは４つの炭素原子のアルキレン架橋、または２、３、もしくは４つの炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されている、架橋した単環式複素環の環系である。二環式複素環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、２，３−ジヒドロイソキノリン、２−アザスピロ［３．３］ヘプタン−２−イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式複素環の例には、フェニル基に縮合した二環式複素環、あるいは単環式シクロアルキルに縮合した二環式複素環、あるいは単環式シクロアルケニルに縮合した二環式複素環、あるいは単環式複素環に縮合した二環式複素環、あるいは、二環式環の中で隣接していない２個の原子が、１、２、３、もしくは４つの炭素原子のアルキレン架橋、または２、３、もしくは４つの炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されている、二環式複素環がある。三環式複素環の例としては、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アダマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン）、及びオキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式の複素環は、環に含まれるいずれかの炭素原子またはいずれかの窒素原子を介して親分子部分に結合しており、置換されていなくても置換されていてもよい。

本明細書で使用される「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を意味する。

一部の事例では、ヒドロカルビル置換基（例えば、アルキルまたはシクロアルキル）の炭素原子数が「Ｃ_x〜Ｃ_y」という接頭辞によって示されており、ここでｘは、置換基内の炭素原子の最小数であり、ｙは最大数である。よって、例えば「Ｃ₁〜Ｃ₃アルキル」は、１〜３個の炭素原子を含むアルキル置換基を指す。

「リンカー」という用語は、基質部分を親分子部分に連結させる１〜５０原子の鎖を指し得る。リンカーは、１個以上のヘテロ原子（例えば、ＮＲ^x1、Ｏ、Ｓ、ＮＯ、ＳＯ、及びＳＯ₂、ここで各事例におけるＲ^x1は、独立して、水素及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される）を含み得る。リンカーは、置換されていてもよい（例えば、オキソ基、アミノ基、アルキル基、ハロゲン、及びニトロ基）。リンカーはアリール基を含み得る。リンカーは、「トレースレス」または「自壊性（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」リンカーであってもよい。「トレースレスリンカー」または「自壊性リンカー」という用語は、リンカーから基質部分が切断されると、セレンテラジンコアからリンカーが自然に切断され、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体が放出されるようなリンカーを指す。

「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、ペプチドは、８０以下のアミノ酸、または３５以下のアミノ酸、または１０以下のアミノ酸を含有し得る。例となるペプチドとしては、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号１）、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号２）、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（配列番号３）、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（配列番号４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号５）、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号６）、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、ｎｏｒＬｅｕ−Ｐｒｏ−ｎｏｒＬｅｕ−Ａｓｐ（配列番号７）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号８）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号９）、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（配列番号１０）、及びＶａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、ｚ−ＶＶＲ（例えばＣｂｚ−ＶＶＲ）、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、及びＧｌｙ−Ｃｉｔが挙げられる。ｚ及びＣｂｚはいずれもベンジルオキシカルバメート基であり得、結合したペプチドのアミン保護基であってもよい。

「サッカライド」という用語は、糖または他の炭水化物、特に単糖を指す。これには、アルファアノマー及びベータアノマーの両方が含まれる。サッカライドは、Ｃ₆ポリヒドロキシ化合物、典型的にはＣ₆ペンタヒドロキシ、そして多くの場合で環状グリカールであり得る。これには、公知の単糖及びその誘導体、ならびに２つ以上のモノサッカライド残基を有するポリサッカライドが含まれる。サッカライドは、ヒドロキシル基の保護基を含み得る。サッカライドのヒドロキシル基は、１つ以上のアセトアミド、ハロ、またはアミノ基に置き換えられていてもよい。更に、炭素原子のうちの１個以上は、例えばケトまたはカルボニル基に酸化されていてもよい。好適なサッカライドとしては、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸、及びノイラミン酸が挙げられる。

「置換される（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」という用語は、１つ以上の非水素置換基で更に置換されてもよい基を指す。例となる置換基は、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、及びアシルである。

本明細書に記載の化合物に関して、それらの基及び置換基は、その選択及び置換により、例えば転位、環化、脱離などによる転換を自然に受けない安定な化合物がもたらされるように、許容される原子及び置換基の価数に従って選択され得る。

本明細書における数値範囲の記述に関しては、その範囲内の各介在値が同じ精度で明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲では、６及び９に加えて７及び８の数が想定され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数が明示的に想定される。

２．化合物
式（Ｉ）の化合物

（Ｉ）、
またはその互変異性体もしくは塩
［式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＡｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³はそれぞれ、Ａｒ¹、Ａｒ²、またはＡｒ³のうちの１つが−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されることを条件として、場合により置換されており、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ^x（ここでＲ^xは、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである）であり、
Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、結合及び１〜５０原子のリンカーからなる群から選択され、ここでＬ¹及びＬ²はそれぞれ、場合により置換されており、
Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、酵素基質基から選択される］
が開示される。

ある特定の実施形態では、Ａｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＡｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、Ａｒ¹、Ａｒ²、またはＡｒ³のうちの１つが−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されることを条件として、ハロゲン、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル、及びアシルからなる群から独立して選択される、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換基で置換されている。

ある特定の実施形態では、Ａｒ¹はフェニルであり、Ａｒ²はフリルまたはフェニルであり、Ａｒ³はフェニルであり、ここでＡｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、Ａｒ¹、Ａｒ²、またはＡｒ³のうちの１つが−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されることを条件として、ハロゲン、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル、及びアシルからなる群から独立して選択される、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換基で置換されている。

ある特定の実施形態では、Ａｒ¹は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されている。ある特定の実施形態では、Ａｒ¹は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ¹は、２位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ¹は、３位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ¹は、４位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。

ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されている。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフラン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、３位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフラン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、４位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフラン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、５位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフラン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、２位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、３位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²は、４位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。

ある特定の実施形態では、Ａｒ²が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されている場合、Ａｒ²はフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ²が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されている場合、Ａｒ²はフリルではない。

ある特定の実施形態では、Ａｒ³は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されている。ある特定の実施形態では、Ａｒ³は、−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ³は、２位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ³は、３位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ³は、４位が−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されたフェニルである。

ある特定の実施形態では、ＸはＯである。ある特定の実施形態では、ＸはＳである。ある特定の実施形態では、ＸはＮＲ^xである。ある特定の実施形態では、ＸはＮＲ^xであり、ここでＲ^xは水素である。ある特定の実施形態では、ＸはＮＲ^xであり、ここでＲ^xはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである。ある特定の実施形態では、ＸはＮＲ^xであり、ここでＲ^xはメチルである。

ある特定の実施形態では、Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、結合、アルキレン、またはアリーレンアルキレンであり、ここで、アルキレンまたはアリーレンアルキレンのアルキレン鎖部分における−ＣＨ₂−部分のうちの１つ以上は、場合により、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＮＲ^x1、Ｏ、Ｓ、ＮＯ、ＳＯ、及びＳＯ₂に置き換えられており、各事例におけるＲ^x1は、独立して、水素及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、アルキレン及びアリーレンアルキレンは、それぞれ独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル、及びアシルからなる群から独立して選択される、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換基で置換されている。

ある特定の実施形態では、Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、

［式中、各事例におけるＲ^x1は、独立して、水素及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、Ｒ^yは、水素、ハロゲン、及びニトロからなる群から選択され、各事例におけるＲ^zは、独立して、水素及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、Ｘ¹は、ＮＲ^x2、Ｏ、及びＳからなる群から選択される（ここでＲ^x2は、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである）］
からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、

からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、Ｌ¹及びＬ²はそれぞれ結合である。

ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、ペプチド、アミノ酸、サッカライド、及びホスフェートからなる群から選択される基に由来する部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、ペプチドに由来する部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、アミノ酸に由来する部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、サッカライドに由来する部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸、ノイラミン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体に由来する部分である。ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、ホスフェート基に由来する部分である。

ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、

［式中、Ｒ^20a及びＲ^20bは、それぞれ独立して、１、２、３、または４つの−ＯＲ³⁰基及び場合により１つのオキソ基で場合により置換されている、水素、ハロゲン、及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、ここで各事例におけるＲ³⁰は、独立して、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ³¹（ここでＲ³¹は、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルである）からなる群から選択され、各事例におけるＲ^21a、Ｒ^21b、Ｒ^22a、Ｒ^22b、Ｒ^23a、及びＲ^23bは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＲ³²、及びＮＲ³³Ｒ³⁴からなる群から選択され、ここで各事例におけるＲ³²〜Ｒ³⁴は、それぞれ独立して、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ³⁵（ここでＲ³⁵は、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである）からなる群から選択され、各事例におけるＲ²⁴は、独立して、水素及びＣ（＝Ｏ）Ｒ³⁶（ここでＲ³⁶は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、−ＯＨ、及び−Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択され、Ｒ²⁵及びＲ²⁶は、それぞれ独立して、水素及びＣ₁〜Ｃ₆アルキルからなる群から選択され、Ｒ²⁷及びＲ²⁸は、それぞれ独立して、

からなる群から選択され、Ｒ^29a及びＲ^29bは、それぞれ独立して、水素であるか、またはＲ^29a及びＲ²⁷は、それらが結合している原子と一緒に５員環を形成することができる］
からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、

からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、

の式を有し、
式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、Ａｒ³、Ｘ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｒ³、及びＲ⁶は、上記に定義した通りである。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、

の式を有し、
式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、Ａｒ³、Ｘ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｒ³、及びＲ⁶は、上記に定義した通りである。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、

の式を有し、
式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、Ａｒ³、Ｘ、Ｌ¹、Ｌ²、Ｒ³、及びＲ⁶は、上記に定義した通りである。

式（Ｉ）の代表的な化合物としては、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ベンジル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール、
４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチル）フェニルリン酸二水素塩（dihydrogen phosphate）、
２−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（３−（３−（（４−（２−（２−アミノアセトアミド）−３−フェニルプロパンアミド）ベンジル）オキシ）−８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェニル）−３−フェニルプロパンアミド、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル）、
（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチルホスフェート、ならびに
それらの塩、及びそれらの互変異性体が挙げられるが、これらに限定されない。

化合物名は、ＣＨＥＭＤＲＡＷ（登録商標）ＵＬＴＲＡ ｖ．１２．０の一部であるＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅの命名アルゴリズムを使用することにより割り当てられる。

化合物は、不斉中心またはキラル中心が存在する立体異性体として存在してもよい。立体異性体は、キラル炭素原子の周りの置換基の構成に応じて「Ｒ」または「Ｓ」である。ここで使用される「Ｒ」及び「Ｓ」という用語は、ＩＵＰＡＣ １９７４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，４５：１３−３０に定義されている構成である。本開示は種々の立体異性体及びそれらの混合物を想定し、これらは本発明の範囲に明確に含まれている。立体異性体には、鏡像異性体及びジアステレオマーならびに鏡像異性体またはジアステレオマーの混合物が含まれる。化合物の各立体異性体は、不斉中心もしくはキラル中心を含む市販の出発材料から合成的に調製してもよいし、またはラセミ混合物の調製後に当業者に周知の分割方法によって調製してもよい。こうした分割方法の例には、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，“Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５^th ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載のように、鏡像異性体の混合物をキラル補助基に結合させ、結果として得られるジアステレオマーの混合物を再結晶またはクロマトグラフィによって分離させ、場合により、光学的に純粋な生成物を補助基から遊離させること、または（２）キラルクロマトグラフィカラムで光学鏡像異性体の混合物を直接分離させること、または（３）分別再結晶法がある。

化合物が互変異性体形態及び幾何異性体を有し得ること、ならびにこれらも本発明の一態様を構成することを理解されたい。

本開示には、１個以上の原子が通常天然に見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられているという事実を除いては式（Ｉ）に挙げたものと同一である、同位体標識化合物も含まれる。本発明の化合物に含めるのに好適な同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素、例えば、限定されるものではないが、それぞれ、²Ｈ、³Ｈ、¹³Ｃ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏ、¹⁷Ｏ、³¹Ｐ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁸Ｆ、及び³⁶Ｃｌである。重水素すなわち²Ｈなど、より重い同位体での置換は、より高い代謝安定性に起因するある特定の治療上の利点、例えばインビボ半減期の増加または投与量要件の低減をもたらし得るため、一部の状況では好ましい場合がある。本化合物は、受容体の分布を判定するための医用画像撮影及びポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究のために、ポジトロン放出同位体を組み込んでもよい。式（Ｉ）の化合物に組み込まれ得る好適なポジトロン放出同位体は、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏ、及び¹⁸Ｆである。式（Ｉ）の同位体標識化合物は概して、当業者に公知の従来技術によって調製されてもよいし、付随する実施例に記載されるものと類似のプロセスにより、非同位体標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して調製されてもよい。

Ａ．化合物の特性
式（Ｉ）の化合物は、発光をもたらすルシフェラーゼの基質であり得る。本化合物は、改善された水溶解度、改善された安定性、改善された細胞透過性、増加した細胞との生体適合性、低減した自己発光、及び／または低減した毒性を有し得る。本開示の化合物は、他のセレンテラジン及びフリマジン類似体（例えば、モノ保護された化合物であるセレンテラジン及びフリマジン類似体）と比較して、予想外に優れたバックグラウンド性能（シグナル／バックグラウンド）を呈し得る。概して、二重保護されたプロ基質のバックグラウンドは、モノ保護された基質よりも２〜３桁低く、バックグラウンドシグナルは長期間（例えば２４時間）にわたって非常に安定である。本開示の二重保護されたセレンテラジン類似体により、感受性の著しい改善に起因する新たなアッセイが可能になり、多くの用途で大きな可能性がもたらされる。

「発光」とは、適切な条件下、例えば、セレンテラジン類似体などの好適な基質の存在下での、ルシフェラーゼの光出力を指す。光出力は、セレンテラジン基質を付加すると開始し得る発光反応の開始時の（しばしば「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と呼ばれる）光出力の瞬間的またはほぼ瞬間的な測定値として測定され得る。種々の実施形態において、発光反応は溶液中で行われる。他の実施形態では、発光反応は、固体支持体上で行われる。溶液は、例えば原核細胞発現系または真核細胞発現系における細胞のライセートを含有し得る。他の実施形態では、無細胞系で発現を行うか、またはルシフェラーゼタンパク質を細胞外培地に分泌させる。したがって後者の場合では、ライセートを生成する必要はない。一部の実施形態では、反応は、発光タンパク質を含む反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェル）に、適切な材料、例えば、セレンテラジン類似体、バッファーなどを注入することによって始まる。更に他の実施形態では、ルシフェラーゼ及び／またはセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）を宿主に導入し、宿主またはその一部分に関して発光の測定を行う。宿主またはその一部分は、生物全体またはその細胞、組織、外植片、もしくは抽出物を含み得る。反応チャンバは、例えばルミノメーターまたは光電子増倍管を使用して光出力を測定することができる計測デバイス内に位置し得る。光出力または発光は、例えば同じ反応チャンバで数秒間、数分間、数時間などにわたり、経時的に測定される場合もある。光出力または発光は、一定時間の平均、シグナルの減衰の半減期、一定期間にわたるシグナルの和、またはピーク出力として報告してもよい。発光は、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）で測定してもよい。

式（Ｉ）の化合物は、セレンテラジン利用酵素が反応したとき、セレンテラジンまたは公知のセレンテラジン類似体、例えばフリマジンに対して、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上のＲＬＵを発生させ得る。

式（Ｉ）の化合物は、セレンテラジン利用酵素が反応したとき、対応するモノ−プロセレンテラジンよりも著しく低いバックグラウンドを有し得る。バックグラウンドは、計器のノイズレベル近くであり得、ある特定の実施形態では、１２〜２４時間にわたって変化しない。バックグラウンドは、式（Ｉ）の化合物を、試料ウェルに存在するある特定の量のセレンテラジン利用酵素と共にインキュベートすることにより、測定することができる。

式（Ｉ）の化合物は、１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、または１５時間にわたって測定して、ＲＬＵ５００以上、１０００以上、５０００以上、１０，０００以上、１５，０００以上、２０，０００以上、５０，０００以上、１００，０００以上、または２００，０００以上のシグナル対バックグラウンド比を有し得る。シグナル対バックグラウンド比は、プロセレンテラジン基質、セレンテラジン利用酵素（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼ）、及び目的の酵素（「標的酵素」）を含有する試料から発生したＲＬＵの、プロセレンテラジン基質及びセレンテラジン利用酵素のみを含有する（標的酵素なし）試料から発生したＲＬＵに対する比を求めることによって鑑定することができる。

式（Ｉ）の化合物は、３０分間から２４時間以上の安定性を呈し得る。

「生体適合性」とは、セレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）に対する細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）の耐性を指す。セレンテラジン類似体の生体適合性は、それが宿主細胞に対してもたらすストレスに関連する。

式（Ｉ）の化合物の生体適合性の向上は、細胞生存率及び／または細胞の増殖速度を測定することによって判定され得る。例えば、セレンテラジン類似体の生体適合性の向上は、天然または公知のセレンテラジンと比較してセレンテラジン類似体に曝露された細胞のルシフェラーゼ発現の非存在下における細胞生存率を測定して、セレンテラジン類似体が細胞に対してどの程度適合性及び／または毒性があるかを判定することによって判定され得る。

特に、生体適合性の向上は、細胞生存率解析（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを使用する）、アポトーシスアッセイ（例えば、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）技術を使用する）、または当技術分野で公知の別の方法を使用して判定され得る。本開示の化合物が細胞生存率またはアポトーシスに及ぼす影響を、天然または公知のセレンテラジン類似体が細胞生存率またはアポトーシスに及ぼす影響と比較してもよい。

生体適合性の向上は、式（Ｉ）の化合物が細胞増殖または遺伝子発現に及ぼす影響を測定することによって判定することもできる。例えば、式（Ｉ）の化合物の生体適合性の向上は、一定期間後の細胞数を測定すること、あるいは、式（Ｉ）の化合物に曝露された細胞の試料中のストレス応答遺伝子の発現を、天然もしくは公知のセレンテラジンに曝露された、またはセレンテラジンに曝露されていない細胞と比較して判定することにより、判定することができる。本開示の化合物が細胞増殖または遺伝子発現に及ぼす影響を、天然または公知のセレンテラジンと比較してもよい。

本開示の化合物の最終的な単離及び精製中に、カルボキシル基と好適な塩基、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、もしくはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、カーボネート、もしくは炭化水素、または有機の一級、二級、もしくは三級アミンなどとの反応により、塩基付加塩が調製され得る。四級アミン塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに由来するものが調製され得る。

Ｂ．合成方法
式（Ｉ）の化合物は、スキーム１〜６に示すように合成することができる。続くスキームの説明で使用されている略語は、Ａｇ₂Ｏは酸化銀、ＡＣＮはアセトニトリル、ＮａＢＨ₄は水素化ホウ素ナトリウム、ＭｅＯＨはメタノール、ＣＢｒ₄は四臭化炭素、Ｐｈ₃Ｐはトリフェニルホスフィン、ＮａＯＭｅはナトリウムメトキシド、ＤＣＭはジクロロメタン、Ｋ₂ＣＯ₃は炭酸カリウム、Ｐｄ（Ｐｈ₃）₄はテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、そしてＤＢＵは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンである。

スキーム１．β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジン（ＷＺ−０２４６）の合成

スキーム１に示されるように、ｐ−フェノールベンズアルデヒドを、Ａｇ₂Ｏの存在下でアセトブロモ−α−Ｄ−グルコースと共役させて、ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンズアルデヒドを８５％の収率で生成した。ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンズアルデヒドをＮａＢＨ₄によって還元して、対応するｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルアルコールを８８％の収率で生成した。このベンジルアルコールをＣＢｒ₄及びＰＰｈ₃と反応させることにより、アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミドに変換した。窒素及び塩基性条件下で、フリマジン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をアセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミドでアルキル化して、所望のＯ−アルキル化生成物であるアセト−β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジンを５７％の収率で生成した。ＮａＯＭｅを含むＤＣＭ及びＭｅＯＨでアセト−β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジンを更に脱保護し、最終的なモノ−β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジン（ＷＺ−０２４６）を得た。

スキーム２．ビス−（β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（ＷＺ−０２６２）の合成

スキーム２は、ビス−（β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（ＷＺ−０２６２）の合成を例示する。４−ヒドロキシルベンゼンピナコールボレートベンズアルデヒドを、Ａｇ₂Ｏの存在下でアセトブロモ−α−Ｄ−グルコースと共役させて、ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンゼンピナコールボレートを４０％の収率で生成した。窒素及び塩基性条件下で、ブロモ−フリマジンをアセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミドでアルキル化して、所望のＯ−アルキル化生成物であるアセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロモ−フリマジンを７５％の収率で生成した。Ｓｕｚｕｋｉ反応により、アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロモ−フリマジンをｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンゼンピナコールボレートと共役させて、ビス（アセト−β−Ｄ−グルコース）フリマジンを５５％の収率で生成した。ＮａＯＭｅを含むＤＣＭ及びＭｅＯＨでビス−（アセト−β−Ｄ−グルコース）−フリマジンを脱保護し、最終的なビス−（β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（ＷＺ−０２６２）を得た。

スキーム３．フリマジンベンジルホスフェート（ＷＺ−０２６３）の合成

スキーム３は、フリマジンベンジルホスフェート（ＷＺ−０２６３）の合成を例示する。５−エチルチオールテトラゾールの存在下でＤＣＭ中のジアリルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイトと４−ヒドロキシベンズアルデヒドを反応させ、ｔ−ＢｕＯＯＨによって更に酸化させて、ｐ−ホルミルベンゼンジアリルホスフェートを８６％の収率で生成した。ｐ−ホルミルベンゼンジアリルホスフェートをＮａＢＨ₄によって還元し、その後、ＣＢｒ₄及びＰＰｈ₃と反応させて、ｐ−ブロモメチルベンゼンジアリルホスフェートを生成した。次に、窒素及び塩基性条件下で、フリマジンをブロモメチルベンゼンジアリルホスフェートでアルキル化して、所望のＯ−アルキル化生成物であるフリマジンベンジルジアリルホスフェートを７５％の収率で生成した。モルホリンの存在下にて、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄を含むＤＣＭでフリマジンベンジルジアリルホスフェートを更に脱保護し、最終的なモノ−フリマジンベンジルホスフェート（ＷＺ−０２６３）を得た。

スキーム４．フリマジンビス−ホスフェート（ＷＺ−０２９１）の合成

スキーム４は、フリマジンビス−ホスフェート（ＷＺ−０２９１）の合成を例示する。窒素及び塩基性条件下で、３−ヒドロキシルフリマジンをブロモメチルベンゼンジアリルホスフェートでアルキル化して、所望のＯ−アルキル化生成物である３−ヒドロキシルフリマジンベンジルジアリルホスフェートを４４％の収率で生成した。５−エチルチオールテトラゾールの存在下でＤＣＭ中のジアリルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイトと３−ヒドロキシルフリマジンベンジルジアリルホスフェートを反応させ、ｔ−ＢｕＯＯＨによって更に酸化させて、フリマジンビス−ジアリルホスフェートを生成した。窒素下で、モルホリンの存在下にて、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄を含むＤＣＭでフリマジンビス−ジアリルホスフェートを更に脱保護し、最終的なフリマジンビス−ホスフェート（ＷＺ−０２９１）を得た。

スキーム５．Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９４）の合成

スキーム５は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９４）の合成を例示する。無水ＴＨＦ中のＮ−メチルモルホリンの存在下で、クロロギ酸イソブチルでＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨを活性化させ、次に４−アミノベンジルアルコールと反応させて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルアルコールを５９％の収率で生成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルアルコールをトリホスゲンでＧｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロライドに変換した。窒素及び塩基性条件下で、フリマジンをＧｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロライドでアルキル化し、所望のＯ−アルキル化生成物であるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジンを生成した。Ｆｍｏｃを標準的なＤＢＵ条件下で除去し、最終的なＧｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９４）を得た。

スキーム６．ビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９９）の合成

スキーム６は、ビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９９）の合成を例示する。窒素及び塩基性条件下で、ブロモ−フリマジンをＧｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロライドでアルキル化し、所望のＯ−アルキル化生成物であるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルブロモ−フリマジンを生成した。次に、Ｓｕｚｕｋｉ反応によりＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルブロモ−フリマジンを３−アミノベンゼンピナコールボレートと共役させて、ビス−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジンを生成した。Ｆｍｏｃを標準的なＤＢＵ条件下で除去し、最終的なビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９９）を得た。

各個別のステップに関する最適な反応条件及び反応時間は、用いられる特定の反応体、及び使用される反応体に存在する置換基に応じて異なり得る。具体的な手順は実施例のセクションで提示する。反応物は、従来の様式で、例えば残渣から溶媒を排除することによりワークアップし、更に、限定されるものではないが、結晶化、蒸留、抽出、研和、及びクロマトグラフィなど、当技術分野で一般的に知られる方法論に従って精製してよい。特記なき限り、出発材料及び試薬は、市販のものであるか、あるいは、当業者が化学文献に記載の方法を使用して市販の材料から調製してもよい。出発材料は、市販のものでなければ、標準的な有機化学技術、公知の構造的に同様の化合物の合成に類似した技術、または上記のスキームもしくは合成例のセクションに記載の手順に類似した技術から選択される手順によって調製してよい。

反応条件、試薬、及び合成経路の順序の適切な操作、反応条件と適合性であり得ない何らかの化学官能基の保護、ならびに方法の反応順序の好適な時点における脱保護を含め、日常的な実験は、本発明の範囲に含まれている。好適な保護基、ならびにそのような好適な保護基を使用して様々な置換基を保護及び脱保護するための方法は、当業者に周知であり、その例は、参照により全体が本明細書に組み込まれている、ＰＧＭ Ｗｕｔｓ及びＴＷ ＧｒｅｅｎｅのＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４^th ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００６）と題するＧｒｅｅｎｅの書籍に見出すことができる。本発明の化合物の合成は、上文及び具体例に記載の合成スキームに記載されるものと類似の方法によって達成することができる。

光学的に活性な形態の本開示の化合物が必要とされる場合、光学的に活性な出発材料（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導によって調製されたもの）を使用して、本明細書に記載の手順のうちの１つを実行すること、または、標準的な手順（例えば、クロマトグラフ分離、再結晶、または酵素的分割）を使用して、化合物もしくは中間体の立体異性体の混合物の分割を行うことにより、これを得ることができる。

同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要とされる場合、純粋な幾何異性体を出発材料として使用して、上記の手順のうちの１つを実行すること、または、クロマトグラフ分離などの標準的な手順を使用して、化合物もしくは中間体の幾何異性体混合物の分割を行うことにより、これを得ることができる。

記載される合成スキーム及び具体例は例示であり、本発明の範囲は添付のクレームにおいて定義されるため、これを限定するものと解釈されるべきではないことは察知され得る。合成方法及び具体例の代替物、改変物、及び均等物は、全てクレームの範囲に含まれている。

３．使用方法及びキット
本開示の化合物は、ルシフェラーゼ基質、例えば、セレンテラジン類似体が使用されてきた方法であればいかなる方法で使用されてもよい。これらは例えば、試料中の１つ以上の分子、例えば酵素、酵素反応の補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、もしくはＯＨラジカル、または１つ以上の条件、例えば酸化還元条件を検出するためにセレンテラジンの類似体を用いる、生物発光方法において使用され得る。試料は、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物）、細胞、細胞ライセート、細胞上清、または細胞の精製画分（例えば、細胞内画分）を含み得る。そのような分子の存在、量、スペクトル分布、放出動態、または比活性が検出または数量化され得る。この分子は、多相溶液（例えば、エマルジョンまたは懸濁液）を含む溶液中、または固体支持体（例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ容器）において検出または数量化され得る。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、目的の分子を数量化するために使用され得る。一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、特定の生化学的活性、例えば、アポトーシスまたは薬物代謝のプローブとして使用され得る。一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物に特定の目的の酵素が作用し得るように、特定の酵素活性に関係付けることができる。一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ルシフェラーゼと組み合わせたとき直接的に発光を支援することはできないが、特定の目的の酵素による触媒処理を通じてセレンテラジン類似体に変換させることができる。一部の実施形態では、この手法は、薬物代謝において使用されるもの、例えば、チトクロムＰ４５０酵素、モノアミンオキシダーゼ、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ならびにアポトーシスにおいて使用されるもの、例えば、カスパーゼなどの酵素に使用され得る。一部の実施形態では、発光を支援するのに必要な他の成分、例えばルシフェラーゼなどの発光タンパク質とプロセレンテラジン類似体を組み合わせて、単一の試薬及び均質なアッセイをもたらすことができる。例えば、試薬を試料に添加すると、プロセレンテラジン類似体がセレンテラジン類似体に変換されるため発光が生じる。種々の実施形態において、プロセレンテラジン類似体からのセレンテラジン類似体の生成に関連し得る他の酵素、小分子、または他の細胞プロセスのために、同様のアッセイが開発され得る。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を使用して、生細胞において、例えばインビボで発光を検出することができる。一部の実施形態では、ルシフェラーゼを細胞内で（レポーターとして、または別様に）発現させてよく、培養下で細胞を透過するセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）で処置した細胞がルシフェラーゼと反応し、発光をもたらす。式（Ｉ）の化合物は、細胞透過性があることに加えて、細胞生存率という点で天然のセレンテラジンと比較可能な生体適合性を示す。一部の実施形態では、培地中の天然セレンテラジンの安定性を増加させることが知られる化学修飾を含む式（Ｉ）の化合物を合成し、よりロバストな生細胞におけるルシフェラーゼベースのレポーターアッセイのために使用することができる。更に他の実施形態では、ルシフェラーゼ及び式（Ｉ）の化合物を含有する試料（細胞、組織、動物などを含む）は、種々の顕微鏡法及び造影技術、例えばインビボ造影を使用してアッセイされ得る。更に他の実施形態では、分泌可能なルシフェラーゼが生細胞レポーター系の一部として細胞内で発現する。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物は、キットの一部として提供され得る。一部の実施形態では、本キットは、１つ以上のルシフェラーゼ（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または両方の形態で）、及び式（Ｉ）のセレンテラジン類似体を、好適な試薬、及び本明細書に開示されるものなどのアッセイを使用者が行えるようにするための説明書と併せて含み得る。本キットは、本明細書に開示されるものなどのバッファーを１つ以上含んでもよい。

実施例１．β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジン（ＷＺ−０２４６）の合成

アセト−β−Ｄ−グルコースベンズアルデヒドの合成。ヒドロキシベンズアルデヒド（２．０ｇ、１６．３８ｍｍｏｌ）、アセトブロモ−α−Ｄ−グルコース（６．７３ｇ、１６．３８ｍｍｏｌ）、及びＡｇ₂Ｏ（７．５９ｇ、３２．７５ｍｍｏｌ）を、Ｎ₂下で５０ｍｌの無水アセトニトリルに懸濁した。この混合物をＲＴで一晩撹拌した。濾過後、固体をＴＨＦで洗浄した。濾液の溶媒を除去し、ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、６．３ｇの所望の生成物を得た。（ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₆Ｈ₄₂Ｎ₅Ｏ₉Ｓ） 計算値 ７２０．８， 観測値 ７２０．５。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ₂Ｃｌ₂）： ９．９７ （ｓ， １Ｈ， ＣＨＯ）， ７．８８ δ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１６ （ｄ， ２Ｈ）， ５．１−５．５ （ｍ， ５Ｈ）， ４．１−４．４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５−３．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．９９−２．０５ （ｍ， １２ Ｈ）。

アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルアルコールの合成。ＣＨ₂Ｃｌ₂及びｉＰｒＯＨ（ｖ／ｖ＝３／１）の混合溶媒６０ｍＬにアセト−β−Ｄ−グルコースベンズアルデヒドを含む０℃の低温溶液に、ＮａＢＨ₄（０．９７ｇ、２５．５５ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。この混合溶液を室温に戻し、２時間撹拌した。１００ｍｌのＤＣＭを添加し、酢酸（２ｍｌ）及び水を添加することにより反応をクエンチした。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、５．１２ｇの所望の生成物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ₂Ｃｌ₂）： ７．３２ δ （ｄ， ２Ｈ）， ６．９９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．１−５．４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１−４．４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５−３．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．９９−２．０５ （ｍ， １２ Ｈ）。

アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミドの合成。アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルアルコール（１．６５ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）及びＣＢｒ₄（１．４５ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液３０ｍｌに、０℃のＴＰＰ（１．１５ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をＲＴで３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、１．５５ｇの所望の生成物を得た。

アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジンの合成。１ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、フリマジン（０．１０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミド（０．１４ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．４０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、０．１１４ｍｇ（５７％）の所望の生成物と、２５％の望まれないＣ−アルキル化生成物とを得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₄₅Ｈ₄₃Ｎ₃Ｏ₁₂） 計算値 ８１７．２８， 観測値 ８１８．５４。

β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジン（ＷＺ−０２４６）の合成。アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルフリマジン（１１４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液２ｍｌに、ＮａＯＭｅ（２５％、１９９ｕｌ）を含む１０ｍｌのＭｅＯＮａを添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳが反応完了を示したとき、２００μｌの酢酸を添加してｐＨを中和した。ほとんどのＤＣＭを除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって残液中の化合物を精製して、所望の生成物を９１％（８３ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₇Ｈ₃₅Ｎ₃Ｏ₈） 計算値 ６４９．２４， 観測値 ６５０．４４。

実施例２．β−Ｄ−グルコースフリマジン（ＷＺ−０２６１）の合成

アセト−β−Ｄ−グルコースフリマジンの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、フリマジン（０．１５ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、アセト−α−Ｄ−グルコースブロミド（０．１９４ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．６５ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、０．１２ｍｇ（４３％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₈Ｈ₃₇Ｎ₃Ｏ₁₁） 計算値 ７１１．２４， 観測値 ７１２．３３。

β−Ｄ−グルコースフリマジン（ＷＺ−０２６１）の合成。アセト−β−Ｄ−グルコースフリマジン（１００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液２ｍｌに、ＮａＯＭｅ（２５％、９９ｕｌ）を含む１０ｍｌのＭｅＯＮａを添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳが反応完了を示したとき、１００μｌの酢酸を添加してｐＨを中和した。ほとんどのＤＣＭを除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって残液中の化合物を精製して、所望の生成物を８５％（６５ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₀Ｈ₂₉Ｎ₃Ｏ₇） 計算値 ５４４．２０， 観測値 ５４５．１８。

実施例３．ビス−（β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（ＷＺ−０２６２）の合成

ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンゼンピナコールボレートの合成。４−ヒドロキシルピナコールボレート（２．０ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）、アセトブロモ−α−Ｄ−グルコース（２．５３ｇ、１０．９１ｍｍｏｌ）、及びＡｇ₂Ｏ（４．４８ｇ、３２．７５ｍｍｏｌ）を、Ｎ₂下で５０ｍｌの無水アセトニトリルに懸濁した。この混合物をＲＴで一晩撹拌した。濾過後、固体をＴＨＦで洗浄した。濾液の溶媒を除去し、ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、収率４０．０％（２．０ｇ）の所望の生成物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ₃）： ７．７６ δ （ｄ， ２Ｈ）， ６．９８ （ｄ， ２Ｈ）， ５．２２−５．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０５−５．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１−４．３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８１−３．９７ （ｍ， １Ｈ）， １．９９−２．０５ （ｍ， １２ Ｈ）， １．３３ （ｓ， １２Ｈ）。

アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロモメチルベンゼン−フリマジンの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、ブロモ−フリマジン（０．１０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、アセト−β−Ｄ−グルコースベンジルブロミド（１５０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．５４ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、１６０ｍｇ（７５．０％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₉Ｈ₃₈Ｎ₃Ｏ₁₂） 計算値 ８１９．１６， 観測値 ８２０．２５， ８２２．２０ （１：１）。

ビス（アセト−β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジンの合成。アセト−β−Ｄ−グルコースブロモ−フリマジン（７０ｍｇ）をジオキサン５ｍｌに溶解させ、Ｎ₂下で１０分間撹拌した。Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（１０ｍｇ）、ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンゼンピナコールボレート（７０．４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、Ｃｓ₂ＣＯ₃（５５．６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、及び水１ｍｌを添加した。この混合物を３０分間にわたり８０℃に加熱した。ＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより反応が完了したことを確認した。２０ｍｌのＤＣＭを添加し、水層を除去し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、５５ｍｇ（５５％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₅₉Ｈ₆₁Ｎ₃Ｏ₂₂） 計算値 １１６３．３７， 観測値 １１６４．７５。

ビス（β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（ＷＺ−０２６２）の合成。ビス（アセト−β−Ｄ−グルコース）ベンジルフリマジン（１００ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶解させ、ＮａＯＭｅ（２５％、１００ｕｌ）を含む１０ｍｌのＭｅＯＨを添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳが反応完了を示したとき、１００μｌの酢酸を添加してｐＨを中和した。ほとんどのＤＣＭを除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって残液中の化合物を精製して、所望の生成物を８４％（６０ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₄₃Ｈ₄₅Ｎ₃Ｏ₁₄） 計算値 ８２７．２９， 観測値 ８２８．２８。

実施例４．ビス−（β−Ｄ−グルコース）フリマジン（ＷＺ−０３０７）の合成

アセト−β−Ｄ−グルコースブロモ−フリマジンの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、ブロモ−フリマジン（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、アセト−β−Ｄ−グルコースブロミド（１１８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．５４ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、８１ｍｇ（７５％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₂Ｈ₃₂ＢｒＮ₃Ｏ₁₁） 計算値 ７１３．１２， 観測値 ７１４．１８， ７１６．１３ （１：１）。

ビス（アセト−β−Ｄ−グルコース）フリマジンの合成。アセト−β−Ｄ−グルコースブロモ−フリマジン（５０ｍｇ）を５ｍｌのジオキサンに溶解させ、Ｎ₂下で１０分間撹拌した。Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（１０ｍｇ）、ｐ−アセト−β−Ｄ−グルコースベンゼンピナコールボレート（７７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ₂ＣＯ₃（４５．６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、及び水１ｍｌを添加した。この混合物を３０分間にわたり８０℃に加熱した。ＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより反応が完了したことを確認した。２０ｍｌのＤＣＭを添加し、水層を除去し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、５５ｍｇ（７４％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₅₂Ｈ₅₅Ｎ₃Ｏ₂₁） 計算値 １０５７．３３， 観測値 １０５８．６２。

ビス（β−Ｄ−グルコース）フリマジン（ＷＺ−０３０７）の合成。ビス（アセト−β−Ｄ−グルコース）フリマジン（１００．０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶解させ、ＮａＯＭｅ（２５％、１００μｌ）を含む１０ｍｌのＭｅＯＨを添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳが反応完了を示したとき、１００μｌの酢酸を添加してｐＨを中和した。ＤＣＭを除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって残液中の化合物を精製して、所望の生成物を８０％（２５ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₆Ｈ₃₉Ｎ₃Ｏ₁₃） 計算値 ７２１．２５， 観測値 ７２２．３５。

実施例５．フリマジンホスフェート（ＷＺ−０２６５）の合成

フリマジンジアリルホスフェートの合成。フリマジン（１５０ｍｇ、０．３９３ｍｍｏｌ）及びジアリルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１０６．１ｍｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液１０ｍｌに、５−エチルチオールテトラゾール（５１．２ｍｇ、０．３９３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＴＬＣは反応が完了したことを示した。ｔ−ＢｕＯＯＨを添加し、結果として生じた混合物をもう１０分間撹拌した。この混合物を３０ｍｌのＤＣＭで希釈し、Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃で１回、水で２回洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、７５％（１６０ｍｇ）の所望の生成物を得た。

フリマジンホスフェート（ＷＺ−０２６５）の合成。１０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中のフリマジンジアリルホスフェート（１６０ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（３４．１４ｍｇ、０．０２９５ｍｍｏｌ）、及びモルホリン（１２８ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、所望の生成物を７３％（１００ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₂₄Ｈ₂₀Ｎ₃Ｏ₅Ｐ） 計算値 ４６１．１２， 観測値 ４６２．０２。

実施例６．フリマジンベンジルホスフェート（ＷＺ−０２６３）の合成

ｐ−ホルミルベンゼンジアリルホスフェートの合成。４−ヒドロキシベンズアルデヒド（５００ｍｇ、４．０９ｍｍｏｌ）及びジアリルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１．０ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液３０ｍｌに、５−エチルチオールテトラゾール（０．２７ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＴＬＣは反応が完了したことを示した。ｔ−ＢｕＯＯＨ（５．０Ｍ、２．４６ｍｌ）を添加し、結果として生じた混合物をもう１０分間撹拌した。この混合物を１００ｍｌのＤＣＭで希釈し、Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃で１回、水で２回洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、８６％（９９４ｍｇ）の所望の生成物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ₂Ｃｌ₂）： ９．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．８２ δ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．８−６．１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２−５．４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．６−４．８ （ｍ， ４Ｈ）。

ｐ−ヒドロキシルメチルベンゼンジアリルホスフェートの合成。ｐ−ホルミルベンゼンジアリルホスフェート（９５０ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）のメタノール溶液３０ｍｌに、ＮａＢＨ₄（０．２５５ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物を３０分間撹拌した。反応を水でクエンチし、ＤＣＭで３回抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、７６％（７３０ｍｇ）の所望の生成物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ₂Ｃｌ₂）： ７．３８ δ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．８３−６．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２−５．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．５−４．７ （ｍ， ６Ｈ）。

ｐ−ブロモメチルベンゼンジアリルホスフェートの合成。ｐ−ヒドロキシルメチルベンゼンジアリルホスフェート（７３０ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ）及びＣＢｒ₄（１．０２ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液３０ｍｌに、０℃のＴＰＰ（０．８１ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をＲＴで３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、収率８１％（７２０ｍｇ）の所望の生成物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ₂Ｃｌ₂）： ７．３８ δ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．８３−６．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２０−５．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．６−４．７ （ｍ， ４Ｈ）， ４．５１ （ｓ， ２Ｈ）。

フリマジンベンジルジアリルホスフェートの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、フリマジン（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ｐ−ブロモメチルベンゼンジアリルホスフェート（９１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．５４ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、８１ｍｇ（７５％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₇Ｈ₃₄Ｎ₃Ｏ₆Ｐ） 計算値 ６４７．２２， 観測値 ６４８．２５。

フリマジンホスフェート（ＷＺ−０２６３）の合成。１０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中のフリマジンベンジルジアリルホスフェート（１２０ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（４３ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、及びモルホリン（１６１ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、所望の生成物を７８％（８２ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₁Ｈ₂₆Ｎ₃Ｏ₆Ｐ） 計算値 ５６７．１６， 観測値 ５６８．１。

実施例７．フリマジンメチルホスフェート（ＷＺ−０３１４）の合成

ジアリルホスフェートの合成。トリアリルホスフェート（１０．０ｇ、４５．８３ｍｍｏｌ）の３０％ ＮａＯＨ溶液５０ｍｌを３０分間加熱還流した。この混合物をＲＴに冷まし、３０ｍｌの濃ＨＣｌで中和した。この混合物をエーテル（３×５０ｍｌ）で３回抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を除去した後、化合物を真空下で乾燥させ、１５％（１．２０ｇ）の収率を得て、この化合物を更に精製せずに次のステップで直接使用した。

クロロメチレンジアリルホスフェートの合成。ジアリルホスフェート、炭酸水素ナトリウム、及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム硫酸水素塩を４０ｍｌの水に溶解させた。２５ｍｌのジクロロメタンを添加し、この混合物を０℃で１０分間激しく撹拌した後、クロロ硫酸クロロメチル（０．６７ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１５ｍｌ）を添加し、室温で一晩連続的に激しく撹拌した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を除去した後、この化合物を更に精製せずに次のステップで直接使用した。

フリマジンメチレンジアリルホスフェートの合成。クロロメチレンジアリルホスフェート（１１４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）及びＫＩ（０．１３ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を含む５ｍｌの無水ＤＭＦを窒素下で３０分間撹拌した。この溶液に、フリマジン（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＫ₂ＣＯ₃（１０９ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、収率２０％（３０ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₁Ｈ₃₀Ｎ₃Ｏ₆Ｐ） 計算値 ５７１．１９， 観測値 ５７３．１６。

フリマジンホスフェート（ＷＺ−０３１４）の合成。１０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中のフリマジンメチレンジアリルホスフェート（３０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（１２．１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、及びモルホリン（４５ｍｇ、０．５２５ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、所望の生成物を３９％（１０ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₂₅Ｈ₂₂Ｎ₃Ｏ₆Ｐ） 計算値 ４９１．１２， 観測値 ４９２．０。

実施例８．フリマジンビス−ホスフェート（ＷＺ−０２９１）の合成

３−ヒドロキシルフリマジンベンジルジアリルホスフェートの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、フリマジン（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、ｐ−ブロモベンジルジアリルホスフェート（９６ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（０．４２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、７３ｍｇ（４４％）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₇Ｈ₃₄Ｎ₃Ｏ₇Ｐ） 計算値 ６６３．２１， 観測値 ６６４．３。

フリマジンベンジルビス−ジアリルホスフェートの合成。３−ヒドロキシルフリマジンベンジルジアリルホスフェート（６５ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）及びジアリルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（４８ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液１０ｍｌに、５−エチルチオールテトラゾール（２５ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０分間撹拌した。ＴＬＣは反応が完了したことを示した。ｔ−ＢｕＯＯＨ（０．１９６ｍｌ、５Ｍ）を添加し、結果として生じた混合物をもう１０分間撹拌した。この混合物を３０ｍｌのＤＣＭで希釈し、Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃で１回、水で２回洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ＤＣＭ／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、６２％（５０ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₄₃Ｈ₄₃Ｎ₃Ｏ₁₀Ｐ₂） 計算値 ８２３．２４， 観測値 ８２４．２９。

フリマジンビス−ホスフェート（ＷＺ−０２９１）の合成。１０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中のフリマジンメチレンジアリルホスフェート（５４ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（１８．９ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、及びモルホリン（５７ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、メタノール及び１０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃを溶離液として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、所望の生成物を５７％（２５ｍｇ）の収率で得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₁Ｈ₂₇Ｎ₃Ｏ₁₀Ｐ₂） 計算値 ６６３．１２， 観測値 ６６４．１。

実施例９．Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９４）の合成

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルアルコールの合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（２．０ｇ、４．５０ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸イソブチル（０．６１４ｇ、４．５０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液に、０℃のＮ−メチルモルホリンを添加した。この混合物を０℃で１時間撹拌してから、アミノベンジルアルコールを添加した。結果として生じた混合物を次にＲＴで１時間撹拌した。固体を濾過によって除去した。濾液から溶媒を除去した後、ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用し、フラッシュカラムで化合物を精製して、５９％（１．４５ｇ）の収率を得た。

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロリドの合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルアルコール（５００ｍｇ、０．９０９ｍｍｏｌ）及びトリホスゲン（９２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液２０ｍｌに、室温のＴＥＡ（２３０ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を２時間撹拌した。ＴＬＣを行って反応が完了したことを確認した。固体を濾過によって除去した後、ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用し、フラッシュカラムで化合物を精製して、５０％（２６０ｍｇ）の収率を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₃₃Ｈ₃₀Ｎ₃Ｏ₄） 計算値 ５６７．１９， 観測値 ５６８．３６。

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジンの合成。５ｍｌの無水ＤＭＦに３０分間窒素をパージした。この溶液に、フリマジン（６０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロリド（８９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、及びＫ₂ＣＯ₃（２４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製した。１０ｍＭ酢酸アンモニウム及びＡＣＮを溶媒として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、収率１０％（１５ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₅₇Ｈ₄₈Ｎ₆Ｏ₆） 計算値 ９１２．３６， 観測値 ９１３．５９。

Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９４）の合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液５ｍｌに、ＤＢＵ（２．５０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１５分間撹拌した。１滴の酢酸を添加することによって反応をクエンチした。溶媒を除去した後、１０ｍＭ酢酸アンモニウム及びＡＣＮを溶媒として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、収率７９％（６ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ−Ｈ］ （Ｃ₄₂Ｈ₃₈Ｎ₆Ｏ₄） 計算値 ６９０．３０， 観測値 ６８９．１９。

実施例１０．ビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９９）の合成

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルブロモフリマジンの合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルクロリド（１７７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及びＫＩ（４３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を含む５ｍｌの無水ＤＭＦを窒素下で３０分間撹拌した。この混合物に、ブロモ−フリマジン（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＫ₂ＣＯ₃（５３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物をＲＴで３０分間にわたり窒素下で撹拌した。この溶液を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、２７％（６５ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₅₁Ｈ₄₃ＢｒＮ₆Ｏ₆） 計算値 ９１４．２４， 観測値 ９１５．４０， ９１７．５８ （１：１）。

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジル３−アミノフリマジンの合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルブロモフリマジン（６５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジオキサンに溶解させ、Ｎ₂下で１０分間撹拌した。Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄（１６．４ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、３−アミノフェニルボレート（３１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）、及びＣｓ₂ＣＯ₃（４６ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）、及び１ｍｌの水を添加した。この混合物を３０分間にわたり８０℃に加熱した。ＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより反応が完了したことを確認した。２０ｍｌのＤＣＭを添加し、水層を除去し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、４６％（３０ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₅₇Ｈ₄₉ＢｒＮ₇Ｏ₆） 計算値 ９２７．３７， 観測値 ９２８．５１。

ビス−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジンの合成。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（１７２ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液１０ｍｌに、ＮＭＰ（６５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を超音波処理して、固体が確実に溶液に入るようにした。０℃でクロロギ酸イソブチル（５３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じた混合物を１時間撹拌した。Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＰｈｅ−３−アミノ−ＦＲＺの溶液を添加し、この混合物を３０分間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィによって化合物を精製して、２３％（１０ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ₈₃Ｈ₇₁Ｎ₉Ｏ₁₀） 計算値 １３５３．５３， 観測値 １３５４．７９。

ビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（ＷＺ−０２９９）の合成。ビス−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミノベンジルフリマジン（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液５ｍｌに、ＤＢＵ（３．４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１５分間撹拌した。１滴の酢酸を添加することによって反応をクエンチした。溶媒を除去した後、１０ｍＭ酢酸アンモニウム及びＡＣＮを溶媒として使用したＨＰＬＣによって化合物を精製して、５９％（４ｍｇ）の所望の生成物を得た。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ−Ｈ］ （Ｃ₅₃Ｈ₅₁Ｎ₉Ｏ₆） 計算値 ９０９．４０， 観測値 ９０８．２３。

上記の手順を使用し、以下の化合物を調製した。

上記の手順を使用し、以下の化合物を調製した。

以下の推定（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）化合物は、それぞれ、化合物ＷＺ−０２４６及びＷＺ−０２９１を合成するために使用したものと同様の手順を使用して調製することができる。

実施例１１．発光特性

グルコシダーゼアッセイ

５０μｌのフリマジンモノ−グルコシドまたはフリマジンビス−グルコシド化合物（１００μＭ）を含むＮａｎｏＧｌｏバッファー及び１ｎｇ／ｍＬのＮａｎｏｌｕｃを含有する５０μｌのＮａｎｏＧｌｏバッファーの溶液に、１１μｌの熱安定性β−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを１単位／ｍｌ／μＭの最終濃度で添加し、光出力を経時的に測定した。プロ基質のバックグラウンドは、β−グルコシダーゼなしの同じ条件下で測定した。

アルカリホスファターゼアッセイ。５０μｌのフリマジンモノ−ホスフェートまたはフリマジンビス−ホスフェート化合物（５０μＭ）の溶液に、１ｎｇ／ｍＬのＮａｎｏｌｕｃを含有する５０μＬのＮａｎｏＧｌｏバッファーを添加し、次に、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを１単位／ｍｌ／μＭの最終濃度で添加し、光出力を経時的に測定した。プロ基質のバックグラウンドは、アルカリホスファターゼを添加しない同じ条件下で測定した。

カテプシンＣアッセイ。フリマジンモノ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ化合物またはフリマジンビス−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ化合物（５０μＭ）が入った、ＤＴＴ ５ｍＭを含有する１：１のＮａｎｏＧｌｏとＮａｎｏｐｕｒｅ水との溶液５０μｌに、１ｎｇ／ｍＬのＮａｎｏｌｕｃバッファーが入った、５ｍＭ ＤＴＴを含有する１：１のＮａｎｏＧｌｏとＮａｎｏｐｕｒｅ水とを５０μＬ添加し、次に、１０μＬのカテプシンＣ（Ｓｉｇｍａ Ｃ８５１１、ウシ脾臓由来）を０．１Ｕ／ウェルの最終濃度で添加した。光出力を経時的に測定した。プロ基質のバックグラウンドは、カテプシンＣを添加しない同じ条件下で測定した。

合成したセレンテラジン類似体（式（Ｉ）の化合物）を、それらのバックグラウンド及びシグナル／バックグラウンド比について評価した。

図１ならびに表１及び２は、ビス保護された（ｂｉｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ＷＺ−０２６２が、計器のノイズに近いバックグラウンドシグナルを有し、対応するモノ保護された類似体であるＷＺ−０２６１及びＷＺ−０２４６と比較して著しく高いシグナル対バックグラウンド比を有することを示す。ＷＺ−０２６２のバックグラウンドは、対応するモノ保護された類似体ＷＺ−０２４６の約２００分の１であった。このデータはまた、これらの類似体のグルコシダーゼに対する反応性が非常に高いこと、及びビス保護された類似体ＷＺ−０２６２が対応するモノ保護された類似体と比べて初期時点において約１００倍高いことを示す。シグナルの急な低下は６−ヒドロキシフリマジンの自己阻害に起因する可能性があるが、このことは、低い変換率では問題にならず、検出限界に影響しない。

表１．バックグラウンドＲＬＵ

表２．シグナル対バックグラウンド

図２ならびに表３及び４は、ビス保護されたＷＺ−０２９１が、対応するモノ保護された類似体ＷＺ−０２６３と比較して低いバックグラウンドを有し、モノ保護された類似体であるＷＺ−０２６３及びＷＺ−０２６５と比較して著しく高いシグナル対バックグラウンド比を有することを示す。

表３．バックグラウンドＲＬＵ

表４．シグナル対バックグラウンド

図３ならびに表５及び６は、ビス保護されたＷＺ−０２９９が、計器のノイズまで下がったバックグラウンドを有し、対応するモノ保護された類似体であるＷＺ−０２９４と比較して著しく高いシグナル対バックグラウンド比を有することを示す。

表５．バックグラウンドＲＬＵ

表６．シグナル対バックグラウンド

前出の詳細な説明及び付随する実施例は単なる例示であり、添付のクレーム及びその均等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する限定として解釈されてはならないことが理解される。

本開示の実施形態に対する種々の変更及び改変は、当業者には明らかになるであろう。そのような変更及び改変は、限定されるものではないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含め、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく行うことができる。

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式（Ｉ）の化合物

（Ｉ）、
またはその互変異性体もしくは塩
［式中、Ａｒ ¹ 、Ａｒ ² 、及びＡｒ ³ は、それぞれ独立して、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＡｒ ¹ 、Ａｒ ² 、及びＡｒ ³ はそれぞれ、Ａｒ ¹ 、Ａｒ ² 、またはＡｒ ³ のうちの１つが−Ｘ−Ｌ ² −Ｒ ⁶ で置換されることを条件として、場合により置換されており、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ ^x （ここでＲ ^x は、水素またはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルである）であり、
Ｌ ¹ 及びＬ ² は、それぞれ独立して、結合及び１〜５０原子のリンカーからなる群から選択され、ここでＬ ¹ 及びＬ ² はそれぞれ、場合により置換されており、
Ｒ ³ 及びＲ ⁶ は、それぞれ独立して、酵素基質基から選択される］。
〔２〕

の式を有する、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕Ａｒ ² はフリルまたはフェニルである、前記〔１〕または前記〔２〕に記載の化合物。
〔４〕ＸはＯである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５〕Ｌ ¹ 及びＬ ² は、それぞれ独立して、結合、アルキレン、またはアリーレンアルキレンであり、
ここで、アルキレンまたはアリーレンアルキレンのアルキレン鎖部分における−ＣＨ ₂ −部分のうちの１つ以上は、場合により、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＮＲ ^x1 、Ｏ、Ｓ、ＮＯ、ＳＯ、及びＳＯ ₂ に置き換えられており、各事例におけるＲ ^x1 は、独立して、水素及びＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択され、
アルキレン及びアリーレンアルキレンは、それぞれ独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル、及びアシルからなる群から独立して選択される、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換基で置換されている、
前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔６〕Ｌ ¹ 及びＬ ² は、それぞれ独立して、

［式中、各事例におけるＲ ^x1 は、独立して、水素及びＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択され、Ｒ ^y は、水素、ハロゲン、及びニトロからなる群から選択され、各事例におけるＲ ^z は、独立して、水素及びＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択され、Ｘ ¹ は、ＮＲ ^x2 、Ｏ、及びＳからなる群から選択される（ここでＲ ^x2 は、水素またはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルである）］
からなる群から選択される、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔７〕Ｌ ¹ 及びＬ ² は、それぞれ独立して、

からなる群から選択される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔８〕Ｌ ¹ 及びＬ ² はそれぞれ結合である、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔９〕Ｒ ³ 及びＲ ⁶ は、それぞれ独立して、ペプチド、アミノ酸、サッカライド、及びホスフェートからなる群から選択される基に由来する部分である、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１０〕Ｒ ³ 及びＲ ⁶ は、それぞれ独立して、

［式中、
Ｒ ^20a 及びＲ ^20b は、それぞれ独立して、１、２、３、または４つの−ＯＲ ³⁰ 基及び場合により１つのオキソ基で場合により置換されている、水素、ハロゲン、及びＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択され、ここで各事例におけるＲ ³⁰ は、独立して、水素、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ ³¹ （ここでＲ ³¹ は、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルである）からなる群から選択され、
各事例におけるＲ ^21a 、Ｒ ^21b 、Ｒ ^22a 、Ｒ ^22b 、Ｒ ^23a 、及びＲ ^23b は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＲ ³² 、及びＮＲ ³³ Ｒ ³⁴ からなる群から選択され、ここで各事例におけるＲ ³² 〜Ｒ ³⁴ は、それぞれ独立して、水素、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ ³⁵ （ここでＲ ³⁵ は、水素またはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルである）からなる群から選択され、
各事例におけるＲ ²⁴ は、独立して、水素及びＣ（＝Ｏ）Ｒ ³⁶ （ここでＲ ³⁶ は、水素、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキル、−ＯＨ、及び−Ｏ−Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択され、
Ｒ ²⁵ 及びＲ ²⁶ は、それぞれ独立して、水素及びＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルからなる群から選択され、
Ｒ ²⁷ 及びＲ ²⁸ は、それぞれ独立して、

からなる群から選択され、
Ｒ ^29a 及びＲ ^29b は、それぞれ独立して、水素であるか、またはＲ ^29a 及びＲ ²⁷ は、それらが結合している原子と一緒に５員環を形成することができる］
からなる群から選択される、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１１〕Ｒ ³ 及びＲ ⁶ は、それぞれ独立して、

からなる群から選択される、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１２〕（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ベンジル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール、
４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチル）フェニルリン酸二水素塩、
２−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（３−（３−（（４−（２−（２−アミノアセトアミド）−３−フェニルプロパンアミド）ベンジル）オキシ）−８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェニル）−３−フェニルプロパンアミド、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル、及び
（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチルホスフェート
からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の化合物、またはそれらの互変異性体もしくは塩。
〔１３〕発光アッセイにおいて３０分間〜２４時間にわたって測定した場合に少なくとも５００相対発光量（ＲＬＵ）のシグナル対バックグラウンド比を呈する、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の化合物であって、前記シグナル対バックグラウンド比は、前記化合物、セレンテラジン利用酵素、及び標的酵素を含有する試料から発生したＲＬＵの、前記化合物及び前記セレンテラジン利用酵素を含有する試料から発生したＲＬＵに対する比を求めることによって判定される、前記化合物。
〔１４〕Ｒ ³ 及びＲ ⁶ はそれぞれ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ホスファターゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ＣＹＰ Ｐ４５０、カスパーゼ３／７、カスパーゼ６、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ２、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰＩＶ）、カルパイン及びキモトリプシン様プロテアソーム、トリプシン様プロテアソーム、カスパーゼ様プロテアソーム、グランザイムＢ、カテプシンＢ／Ｌ、カテプシンＫ、トロンビン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、ならびにＳＡＲＳプロテアーゼからなる群から独立して選択される酵素の酵素基質基である、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１５〕前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
〔１６〕ルシフェラーゼを更に含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１７〕バッファー試薬を更に含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１８〕試料中の発光を検出するための方法であって、
前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の化合物に試料を接触させることと、
セレンテラジンを利用するルシフェラーゼが前記試料中に存在しない場合は、これに前記試料を接触させることと、
発光を検出することと
を含む、前記方法。
〔１９〕前記試料が、生細胞を含有する、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記試料が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを含有する、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２１〕トランスジェニック動物における発光を検出するための方法であって、
前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、
発光を検出することと
を含み、
前記トランスジェニック動物が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現する、前記方法。

Claims (13)

1. 式（Ｉ）の化合物
   

   

   （Ｉ）、
   またはその互変異性体もしくは塩
   ［式中、Ａｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³は、それぞれ独立して、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＡｒ¹、Ａｒ²、及びＡｒ³はそれぞれ独立して、Ａｒ¹、Ａｒ²、またはＡｒ³のうちの１つが−Ｘ−Ｌ²−Ｒ⁶で置換されることを条件として、場合により、ハロゲン、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル、及びアシルからなる群から独立して選択される、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換基で置換されており、
   Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ^x（ここでＲ^xは、水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである）であり、
   Ｌ¹及びＬ²は、それぞれ独立して、
   

   

   からなる群から選択され、
   Ｒ³及びＲ⁶は、それぞれ独立して、
   

   

   からなる群から選択される］。
2. 

   の式を有する、請求項１に記載の化合物。
3. Ａｒ²はフリルまたはフェニルであり、かつ、ＸはＯである、請求項１または請求項２に記載の化合物。
4. Ｌ¹及びＬ²はそれぞれ結合である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. （２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ベンジル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール、
   ４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチル）フェニルリン酸二水素塩、
   ２−（２−アミノアセトアミド）−Ｎ−（３−（３−（（４−（２−（２−アミノアセトアミド）−３−フェニルプロパンアミド）ベンジル）オキシ）−８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェニル）−３−フェニルプロパンアミド、
   （２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−（４−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−３−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−６−イル）フェノキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール、及び
   （（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（３−（ホスホノオキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）メチルホスフェート
   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、またはそれらの互変異性体もしくは塩。
6. 発光アッセイにおいて３０分間〜２４時間にわたって測定した場合に少なくとも５００相対発光量（ＲＬＵ）のシグナル対バックグラウンド比を呈する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物であって、前記シグナル対バックグラウンド比は、前記化合物、セレンテラジン利用酵素、及び標的酵素を含有する試料から発生したＲＬＵの、前記化合物及び前記セレンテラジン利用酵素を含有する試料から発生したＲＬＵに対する比を求めることによって判定される、前記化合物。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
8. ルシフェラーゼを更に含む、請求項７に記載のキット。
9. バッファー試薬を更に含む、請求項７又は８に記載のキット。
10. 試料中の発光を検出するための方法であって、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物に試料を接触させることと、
    セレンテラジンを利用するルシフェラーゼが前記試料中に存在しない場合は、これに前記試料を接触させることと、
    発光を検出することと
    を含む、前記方法。
11. 前記試料が、生細胞を含有する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記試料が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを含有する、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 非ヒトトランスジェニック動物における発光を検出するための方法であって、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物を非ヒトトランスジェニック動物に投与することと、
    発光を検出することと
    を含み、
    前記非ヒトトランスジェニック動物が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現する、前記方法。

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