JP6978562B2 - 試料観察装置及び試料観察方法 - Google Patents

Description

本開示は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。

細胞などの３次元立体構造を持つ試料の内部を観察する手法の一つとして、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscopy）が知られている。例えば特許文献１に記載の断層像観察装置は、ＳＰＩＭの基本的な原理を開示したものであり、面状光を試料に照射し、試料の内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料内部の観察画像データを取得する。

面状光を用いた他の試料観察装置としては、例えば特許文献２に記載のＳＰＩＭ顕微鏡が挙げられる。この従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、試料の配置面に対して一定の傾斜角をもって面状光を照射し、面状光の照射面に対して直交する観察軸を有する観察光学系によって試料からの観察光を撮像する。

特開昭６２−１８０２４１号公報 特開２０１４−２０２９６７号公報

上述した特許文献２に記載の試料観察装置では、観察光学系のフォーカス面の全面に面状光を照射することで、１回の撮像によって観察軸方向の断層面の画像を取得し得る。したがって、試料の３次元情報を取得するためには、観察軸方向に試料を走査し、観察軸方向の複数断層面の画像を取得する必要があった。このような従来の試料観察装置では、全ての断層面の画像を取得するまでに、画像を取得する断層面の選択（試料の走査及び停止）と画像取得とを繰り返す必要があった。また、観察対象が存在する領域が撮像領域よりも広い場合には、観察軸方向の断面画像を取得する動作に加え、観察軸方向とは異なる方向へステージを移動して撮像視野を選択する動作などが必要となっていた。このため、観察画像データを得るまでに時間を要することが課題となっていた。

本開示は、上記課題の解決のためになされたものであり、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。

本開示の一側面に係る試料観察装置は、試料に面状光を照射する照射光学系と、面状光の照射面に対して試料を走査する走査部と、照射面に対して傾斜する観察軸を有し、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、結像光学系によって結像された観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得部と、画像取得部によって生成された複数の部分画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備える。

この試料観察装置では、面状光の照射面に対して試料が走査され、また、面状光の照射面に対し、結像光学系の観察軸が傾斜している。このため、画像取得部では、面状光の光軸方向における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成部では、複数の部分画像データに基づいて、試料の観察画像データを生成できる。この試料観察装置では、視野選択動作が不要となり、試料の走査と画像取得とを同時進行することが可能となるため、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。

また、試料は、面状光の入力面を有する試料容器によって保持され、照射光学系による面状光の光軸は、試料容器の入力面に対して直交するように配置されていてもよい。この場合、試料容器によって複数の試料を一度に走査することが可能となる。また、面状光の光軸を試料容器の入力面に対して直交させることで、画像取得部で取得した部分画像データの位置補正などが不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。

また、走査部は、照射光学系による面状光の光軸に対して直交する方向に試料を走査してもよい。この場合、画像取得部で取得した部分画像データの位置補正などの画像処理が不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。

また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、１０°〜８０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を十分に確保できる。

また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、２０°〜７０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を一層十分に確保できる。また、観察軸の角度変化量に対する視野の変化を抑えることができ、視野の安定度を確保できる。

また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、３０°〜６５°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度及び視野の安定度を一層好適に確保できる。

また、画像取得部は、二次元撮像装置を含んで構成され、二次元撮像装置から出力されたデータから観察光の光像の一部に対応する画像データを部分画像データとして抽出してもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。

また、画像取得部は、観察光による光像の一部を撮像し、部分画像データを出力するラインセンサを含んでいてもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。

また、画像取得部は、観察光による光像の一部を通過させるスリットと、スリットを通過した光像を検出する光検出器とを含み、光検出器から出力されたデータに基づいて部分画像データを生成してもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。

また、画像生成部は、複数の部分画像データに基づいて、面状光の光軸に直交する面における試料の観察画像データを生成してもよい。これにより、バックグラウンドの影響を抑えた試料の断面画像を観察画像として得ることができる。

また、試料観察装置は、観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えていてもよい。画像生成部によって生成された観察画像データを解析部で解析するため、解析のスループットも向上させることができる。

また、本発明の一側面に係る試料観察方法は、試料に面状光を照射する照射ステップと、面状光の照射面に対して試料を走査する走査ステップと、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、結像光学系によって結像された観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得ステップと、複数の部分画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成ステップと、を備える。

この試料観察方法では、面状光の照射面に対して試料が走査され、また、面状光の照射面に対して観察軸が傾斜している結像光学系を用いる。このため、画像取得ステップでは、面状光の光軸方向における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成ステップでは、複数の部分画像データに基づいて、試料の観察画像データを生成できる。この試料観察方法では、視野選択動作が不要となり、試料の走査と画像取得とを同時進行することが可能となるため、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。

この試料観察装置及び試料観察方法によれば、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。

試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。 試料の近傍を示す要部拡大図である。 画像取得部の一例を示す図である。 試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。 画像生成部による観察画像データの生成の一例を示す図である。 比較例における画像取得の様子を示す図である。 実施例における画像取得の様子を示す図である。 試料観察装置における視野の算出例を示す図である。 観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。 結像光学系の変形例を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本開示の一側面に係る試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
［試料観察装置の構成］

図１は、試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。この試料観察装置１は、面状光Ｌ２を試料Ｓに照射し、試料Ｓの内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料Ｓ内部の観察画像データを取得する装置である。この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。試料観察装置１は、図１に示すように、光源２と、照射光学系３と、走査部４と、結像光学系５と、画像取得部６と、コンピュータ７とを備えて構成されている。

観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織、臓器、動物或いは植物自体、植物の細胞、組織などが挙げられる。また、試料Ｓは、溶液、ゲル、或いは試料Ｓとは屈折率の異なる物質に含まれていてもよい。

光源２は、試料Ｓに照射される光Ｌ１を出力する光源である。光源２としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源が挙げられる。また、光源２は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３に導光される。

照射光学系３は、光源２から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する光学系である。以下の説明では、照射光学系３の光軸Ｐ１を面状光Ｌ２の光軸という場合もある。照射光学系３は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源２に対して光学的に結合されている。照射光学系３は、対物レンズを含んで構成されていてもよい。照射光学系３によって形成された面状光Ｌ２は、試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２が照射された試料Ｓでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒにおいて観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３は、例えば面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、或いは面状光Ｌ２の拡散反射光である。

試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、後述するＺ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。したがって、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。

走査部４は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。本実施形態では、走査部４は、試料Ｓを保持する試料容器１１を移動させる移動ステージ１２によって構成されている。試料容器１１は、例えばマイクロプレート、スライドガラス、シャーレ等である。本実施形態では、マイクロプレートを例示する。試料容器１１は、図２に示すように、試料Ｓが配置される複数のウェル１３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部１４と、本体部１４の一面側においてウェル１３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材１５とを有している。

ウェル１３内への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル１３内が水などの媒体で充填されていてもよい。透明部材１５は、ウェル１３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面１５ａを有している。透明部材１５の材質は、面状光Ｌ２に対する透明性を有する部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。試料容器１１は、入力面１５ａが面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交するように移動ステージ１２に対して配置されている。なお、ウェル１３の他端側は、外部に開放された状態となっている。試料容器１１は、移動ステージ１２に対して固定されていてもよい。

移動ステージ１２は、図１に示すように、コンピュータ７からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器１１を走査する。本実施形態では、移動ステージ１２は、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器１１を走査する。以下の説明では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージ１２による試料容器１１の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。

結像光学系５は、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する光学系である。結像光学系５は、図２に示すように、例えば対物レンズ１６及び結像レンズ等を含んで構成されている。結像光学系５の光軸は、観察光Ｌ３の観察軸Ｐ２となっている。この結像光学系５の観察軸Ｐ２は、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、１０°〜８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°〜７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°〜６５°であることが更に好ましい。

画像取得部６は、図１に示すように、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する装置である。画像取得部６は、例えば観察光Ｌ３による光像を撮像する撮像装置を含んで構成されている。撮像装置としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系５による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ７に出力する。

観察光Ｌ３による光像の部分画像データの取得方法については、種々の態様を採り得る。例えば図３（Ａ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の撮像面においてサブアレイを設定してもよい。この場合、サブアレイに含まれる画素列２１ａのみを読み出すことができるので、観察光Ｌ３による光像の一部を撮像して部分画像データを取得できる。また、図３（Ｂ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出して部分画像データを取得してもよい。

さらに、図３（Ｃ）に示すように、エリアイメージセンサ２１に代えてラインセンサ２２を用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分画像データを取得してもよい。図３（Ｄ）に示すように、観察光Ｌ３の一部のみを透過させるスリット２３をエリアイメージセンサ（光検出器）２１の前面に配置し、スリット２３に対応する画素列２１ａの画像データを部分画像データとして取得してもよい。スリット２３を用いる場合、エリアイメージセンサ２１に代えて光電子増倍管などのポイントセンサ（光検出器）を用いてもよい。

コンピュータ７は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ７としては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ７は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源２及び移動ステージ１２の動作を制御するコントローラ、試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８、及び観察画像データを解析する解析部１０として機能する（図１参照）。

コントローラとしてのコンピュータ７は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源２、移動ステージ１２、及び画像取得部６を同期させて駆動する。この場合、コンピュータ７は、移動ステージ１２による試料Ｓの移動中、光源２が光Ｌ１を連続的に出力するように光源２を制御してもよく、画像取得部６による撮像に合わせて光源２による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系３が光シャッタ（不図示）を備えている場合、コンピュータ７は、当該光シャッタの制御によって試料Ｓへの面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。

また、画像生成部８としてのコンピュータ７は、画像取得部６によって生成された複数の部分画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、画像取得部６から出力された複数の部分画像データに基づいて、例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１に直交する面（ＸＹ面）における試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した観察画像データの格納、モニタ等への表示等を実行する。

解析部１０としてのコンピュータ７は、画像生成部８によって生成された観察画像データに基づいて解析を実行し、解析結果を生成する。解析部１０は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した解析結果の格納、モニタ等への表示等を実行する。なお、画像生成部によって生成された観察画像データのモニタ等への表示は行わず、解析部１０によって生成された解析結果のみをモニタ等に表示してもよい。
［試料観察方法］

図４は、試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。同図に示すように、この試料観察方法は、照射ステップ（ステップＳ０１）、走査ステップ（ステップＳ０２）、結像ステップ（ステップＳ０３）、画像取得ステップ（ステップＳ０４）、画像生成ステップ（ステップＳ０５）、及び解析ステップ（ステップＳ０６）を備えている。

照射ステップＳ０１では、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて光源２が駆動し、光源２から光Ｌ１が出力される。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料Ｓに照射される。

走査ステップＳ０２では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて、光源２の駆動と同期して移動ステージ１２が駆動する。これにより、試料容器１１がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル１３内の試料Ｓが走査される。

結像ステップＳ０３では、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系５を用い、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を画像取得部６の結像面に対して結像する。画像取得ステップＳ０４では、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する。部分画像データは、画像取得部６から画像生成部８に順次出力される。

画像生成ステップＳ０５では、複数の部分画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。本実施形態では、図１及び図２に示したように、試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面であり、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、画像生成部８には、図５（Ａ）に示すように、部分画像データであるＸＺ断面画像データ３１をＹ軸方向に複数取得することによって、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、複数のＸＺ断面画像を用いてデータが再構築され、例えば図５（Ｂ）に示すように、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ断面画像が、バックグラウンドを抑えた観察画像３２として生成される。

解析ステップＳ０６では、解析部１０によって観察画像データを解析し、解析結果を生成する。例えば創薬スクリーニングでは、試料容器１１に試料Ｓ及び試薬を入れ、観察画像データを取得する。そして、解析部１０は、観察画像データに基づいて試薬を評価し、評価データを解析結果として生成する。
［作用効果］

比較例に係る試料観察装置１００は、図６（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して直交する観察軸Ｐ２を有している。この試料観察装置１００では、観察光学系のフォーカス面の全面に面状光Ｌ２を照射することで、１回の撮像によって試料Ｓにおける観察軸Ｐ２方向に直交する断層面の画像を取得し得る。したがって、試料Ｓの３次元情報を取得するためには、観察軸Ｐ２方向に試料Ｓを走査し、観察軸Ｐ２方向に直交する複数の断層面の画像を取得する必要があった。このような比較例に係る試料観察装置１００では、図６（Ｂ）に示すように、全ての断層面の画像を取得するまでに、画像を取得する断層面の選択（試料Ｓの走査及び停止）と画像取得とを繰り返す必要があった。また、観察対象が存在する領域が撮像よりも広い場合には、観察軸Ｐ２方向の断面画像を取得する動作に加え、観察軸方向とは異なる方向へステージを移動することにより撮像視野を選択する動作などが必要となっていた。

これに対し、実施例に係る試料観察装置１では、図７（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査しながら画像取得部６によって画像取得を行い、また、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対し、結像光学系５の観察軸Ｐ２が傾斜している。このため、画像取得部６では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向（Ｚ軸方向）における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成部８では、複数の部分画像データに基づいて、試料Ｓの観察画像データ３２を生成できる。

この試料観察装置１では、図７（Ｂ）に示すように、試料Ｓを走査させながら画像取得を順次行うことが可能となる。比較例に係る試料観察装置１００の動作では、移動ステージ１２の駆動及び停止の際の度に、慣性の影響等により時間的なロスが生じる。一方、試料観察装置１では、移動ステージ１２の駆動及び停止の回数を削減し、試料Ｓの走査動作と画像取得とを同時進行することで、観察画像データ３２を得るまでのスループットの向上が図られる。

また、試料観察装置１では、図２に示したように、試料Ｓが面状光Ｌ２の入力面１５ａを有する試料容器１１によって保持され、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１が試料容器１１の入力面１５ａに対して直交するように配置されている。さらに、試料観察装置１では、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１（Ｚ軸方向）に対して直交する方向（Ｙ軸方向）に走査部４が試料Ｓを走査する。これにより、画像取得部６で取得した部分画像データの位置補正などの画像処理が不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。

また、試料観察装置１では、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対する結像光学系５の観察軸Ｐ２の傾斜角度θが１０°〜８０°、好ましくは、２０°〜７０°、より好ましくは３０°〜６５°となっている。以下、この点について考察する。

図８は、試料観察装置における視野の算出例を示す図である。同図に示す例では、結像光学系が屈折率ｎ１の媒質Ａ中に位置し、面状光の照射面が屈折率ｎ２の媒質Ｂ中に位置している。結像光学系における視野をＶ、照射面をＶ’、照射面に対する観察軸の傾斜角度をθ、媒質Ａ，Ｂの境界面での屈折角をθ’、視野Ｖの傾斜角度θにおける媒質Ａと媒質Ｂの界面での距離をＬとした場合、以下の式（１）〜（３）が成り立つ。
［数１］

Ｌ＝Ｖ／ｃｏｓθ …（１）
［数２］

ｓｉｎθ’＝（ｎ１／ｎ２）ｓｉｎθ …（２）
［数３］

Ｖ’＝Ｌ／ｔａｎθ’ …（３）

図９は、観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の相対値Ｖ’／Ｖとしている。そして、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときのＶ’／Ｖの値を傾斜角度θに対してプロットしたものである。Ｖ’／Ｖの値が小さいほど試料の深さ方向の解像度（以下、「Ｚ方向解像度」と称す）が高く、大きいほどＺ方向解像度が低いことを示している。

図９に示す結果から、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが等しい場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が反比例していることが分かる。また、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが異なる場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が放物線を描くことが分かる。この結果から、試料の配置空間の屈折率、結像光学系の配置空間の屈折率、及び観察軸の傾斜角度θによってＺ方向解像度をコントロールできることが分かる。そして、傾斜角度θが１０°〜８０°の範囲では、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲に比べて良好なＺ方向解像度が得られることが分かる。

また、図９に示す結果から、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、屈折率ｎ１と屈折率ｎ２との差が大きくなるにつれて小さく傾向があることが分かる。屈折率ｎ２が１．１〜２．０の範囲では、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、約４７°〜約５７°の範囲となる。例えば屈折率ｎ２が１．３３（水）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ５２°と見積もられる。また、例えば屈折率ｎ２が１．５３（ガラス）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ４８°と見積もられる。

図１０は、観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の安定度としている。安定度は、傾斜角度θでのＶ’／Ｖに対する傾斜角度θ＋１でのＶ’／Ｖと傾斜角度θ−１でのＶ’／Ｖとの差分値の割合で表され、下記式（４）に基づいて算出される。安定度が０％に近い程、傾斜角度の変化に対する視野の変化が小さく、視野が安定していると評価できる。この図１０では、図９と同様に、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときの安定度がプロットされている。
［数４］

安定度（％）＝（（Ｖ’／Ｖ）_θ＋１−（Ｖ’／Ｖ）_θ−１）／（Ｖ’／Ｖ）_θ …（４）

図１０に示す結果から、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲では、安定度が±２０％を超えており、視野のコントロールが困難であることが分かる。一方、傾斜角度θが１０°〜８０°の範囲では、安定度が±２０％以下となり、視野のコントロールが可能となる。さらに、傾斜角度θが２０°〜７０°の範囲では、安定度が±１０％以下となり、視野のコントロールが容易となる。

図１１は、観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、左側の縦軸を視野の相対値、右側の縦軸を透過率としている。この図１１では、試料容器における試料の保持状態を考慮し、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．５３（ガラス）、媒質Ｃの屈折率ｎ３を１．３３（水）とし、透過率の値は、媒質Ｂ，Ｃの界面及び媒質Ａ，Ｂの界面の透過率の積としている。図１１には、Ｐ波の透過率、Ｓ波の透過率、及びこれらの平均値の角度依存性がプロットされている。また、図１１には、媒質Ｃにおける視野の相対値が併せてプロットされている。

図１１に示す結果から、観察軸の傾斜角度θを変化させることで、試料から結像光学系に至る観察光の透過率が可変となることが分かる。傾斜角度θが８０°以下の範囲では、少なくとも５０％以上の透過率が得られることが分かる。また、傾斜角度θが７０°以下の範囲では、少なくとも６０％以上の透過率が得られ、傾斜角度θが６５°以下の範囲では、少なくとも７５％以上の透過率が得られることが分かる。

以上の結果から、試料のＺ方向解像度が要求される場合には、例えば視野の相対値であるＶ’／Ｖの値が３以下であり、安定度が５％未満、かつ観察光の透過率（Ｐ波及びＳ波の平均値）が７５％以上となるように、傾斜角度θを３０°〜６５°の範囲から選択することが好適である。また、試料のＺ方向解像度が要求されない場合には、傾斜角度θを１０°〜８０°の範囲から適宜選択すればよく、１画素当たりの視野の範囲を確保する観点から、１０°〜３０°若しくは６５°〜８０°の範囲から選択することが好適である。

本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と試料容器１１の入力面１５ａとは、必ずしも直交していなくてもよく、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と走査部４による試料Ｓの走査方向とは、必ずしも直交していなくてもよい。

また、例えば上記実施形態では、試料容器１１においてウェル１３の一端側を塞ぐように透明部材１５が設けられており、透明部材１５の入力面１５ａから面状光Ｌ２を入力させているが、ウェル１３の他端側から面状光Ｌ２を入力させる構成としてもよい。この場合、屈折率が異なる媒質の界面の数が少なくなり、観察光Ｌ３の屈折回数を減らすことが可能となる。さらに、試料容器１１に代えて、ゲル等の固形物に試料Ｓを保持してもよく、フローサイトメーターのように、透明容器内に水等の流体を流して試料Ｓを移動させるようにしてもよい。

また、結像光学系５及び画像取得部６を複数対配置してもよい。この場合、観察範囲を拡大できるほか、複数の異なる波長の観察光Ｌ３を観察することが可能となる。また、結像光学系５に対して複数の画像取得部６を配置してもよく、複数の結像光学系５に対して画像取得部６を配置してもよい。複数の画像取得部６は、異なる種類の光検出器あるいは撮像装置を組み合わせてもよい。光源２は、波長の異なる光を出力する複数の光源によって構成されてもよい。この場合、波長の異なる励起光を試料Ｓに照射することができる。

また、非点収差の緩和のため、結像光学系５にプリズムを配置してもよい。この場合、例えば図１２に示すように、対物レンズ１６の後段側（対物レンズ１６と画像取得部６との間）にプリズム４１を配置してもよい。デフォーカス対策のため、観察軸Ｐ２に対して画像取得部６における撮像装置の撮像面を傾斜させてもよい。この他、例えば結像光学系５と画像取得部６との間にダイクロイックミラー或いはプリズムを配置して観察光Ｌ３の波長分離を行う構成としてもよい。

１…試料観察装置、３…照射光学系、４…走査部、５…結像光学系、６…画像取得部、８…画像生成部、１０…解析部、１１…試料容器、１５ａ…入力面、２１…エリアイメージセンサ（撮像装置）、２２…ラインセンサ、２３…スリット、３１…部分画像データ、３２…観察画像データ、Ｌ２…面状光、Ｌ３…観察光、Ｐ２…観察軸、Ｒ…照射面、Ｓ…試料、θ…傾斜角度。

Claims (12)

1. 試料に面状光を照射する照射光学系と、
   前記面状光の照射面に対して前記試料を一定速度で走査する走査部と、
   前記照射面に対して傾斜する観察軸を有し、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、
   前記走査部による前記試料の走査中に、前記結像光学系によって結像された前記観察光による光像の画像データを複数回取得し、前記試料の３次元情報を取得する画像取得部と、を備え、
   前記面状光の照射面は、前記走査部による前記試料の走査方向と直交している試料観察装置。
2. 前記試料の３次元情報に基づいて、前記試料の断面画像データを生成する画像生成部をさらに備える請求項１記載の試料観察装置。
3. 前記画像取得部は、エリアイメージセンサを有し、前記エリアイメージセンサの撮像面にサブアレイを設定し、前記サブアレイに含まれる画素列のみを取得することで前記画像データを取得する請求項１又は２記載の試料観察装置。
4. 前記画像取得部は、エリアイメージセンサを有し、前記エリアイメージセンサでの撮像によって得られた２次元画像の一部を抽出して前記画像データを取得する請求項１又は２記載の試料観察装置。
5. 前記画像取得部は、ラインセンサを有し、前記ラインセンサでの撮像によって前記画像データを取得する請求項１又は２記載の試料観察装置。
6. 前記試料の３次元情報を解析し、解析結果を生成する解析部を更に備える請求項１〜５のいずれか一項記載の試料観察装置。
7. 試料に面状光を照射する照射ステップと、
   前記面状光の照射面に対して前記試料を一定速度で走査する走査ステップと、
   前記照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、
   前記走査ステップによる前記試料の走査中に、前記結像光学系によって結像された前記観察光による光像の画像データを複数回取得し、前記試料の３次元情報を取得する画像取得ステップと、を備え、
   前記面状光の照射面は、前記走査ステップにおける前記試料の走査方向と直交している試料観察方法。
8. 前記試料の３次元情報に基づいて、前記試料の断面画像データを生成する画像生成ステップをさらに備える請求項７記載の試料観察方法。
9. 前記画像取得ステップでは、エリアイメージセンサを用い、前記エリアイメージセンサの撮像面にサブアレイを設定し、前記サブアレイに含まれる画素列のみを取得することで前記画像データを取得する請求項７又は８記載の試料観察方法。
10. 前記画像取得ステップでは、エリアイメージセンサを用い、前記エリアイメージセンサでの撮像によって得られた２次元画像の一部を抽出して前記画像データを取得する請求項７又は８記載の試料観察方法。
11. 前記画像取得ステップでは、ラインセンサを用い、前記ラインセンサでの撮像によって前記画像データを取得する請求項７又は８記載の試料観察方法。
12. 前記試料の３次元情報を解析し、解析結果を出力する解析ステップをさらに備える請求項７〜１１のいずれか一項記載の試料観察方法。

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