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JP6978835B2 - プローブ試薬および該プローブ試薬を用いたｆｉｓｈ - Google Patents
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Description

本発明は、染色体上の遺伝子に結合（ハイブリダイズ）する反応性部位を有する核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子とを有するＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）用のプローブ試薬、およびこれを用いたＦＩＳＨに関する。
生体認識分子（ヌクレオチド・抗体・ビオチンなど）を有する「蛍光色素を集積したナノ粒子(50-300 nm)」が、従来知られている（例えば、特許文献１、［００３５］段落）。しかしながら、遺伝子検査の課題解決に関する記載はない。
従来、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）用のプローブ試薬としては、ＢＡＣ(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンと呼ばれる核酸配列に低分子色素が複数結合したＢＡＣプローブが用いられている（例えば、特許文献２、[００６４]）。ＢＡＣプローブ作成の際、低分子色素の結合方法としてはNick Translation反応が知られており、原理的にはＢＡＣクローンの核酸配列数の1/4の部位に低分子色素の結合が可能である。しかしながら、実際の反応では1/8程度の部位に低分子色素を結合するのが限界であったため、従来のＢＡＣプローブを用いるＦＩＳＨ法による遺伝子検査では、更なる感度向上は見込めなかった。
上記のとおり、強い蛍光シグナルを得るためには多数の低分子色素を結合する必要があるが、例えば５０００ｂｐ程度の短いＤＮＡ配列を有するＢＡＣクローンでは必要十分な数の低分子色素を結合することができず、それゆえ８万〜１００万ｂｐの長大なＤＮＡ配列を有するＢＡＣクローンから作成したプローブ試薬が用いられていた（特許文献３）。しかしながら、このような長いＢＡＣクローンは大腸菌内で複製した後に抽出するため、エラーが生じやすい、長短が揃わない、不純物が混入する等の精密性の問題があり、複製された後抽出された長いＢＡＣクローンを用いて作成したプローブ試薬でハイブリダイズすると、特定の遺伝子以外の塩基配列にも非特異的に吸着する場合があった。
国際公開パンフレットＷＯ２０１２／０２９３４２号 特開２００９−１００７３７号公報 特開２０１０−２５９３３６号公報
本発明者らは、染色体マッピング等で行われるＦＩＳＨで、（上述の）従来のＢＡＣプローブに用いられている核酸分子を用いた場合に、低分子蛍光色素の核酸分子への結合割合（標識率）には限界があり、標識の蛍光を検出する際に輝度が足りずに目的の遺伝子を検出できないケースがあるという上記問題に着目した。
また、発明者らは、ＢＡＣプローブを用いたFISHでは非特異的吸着による誤検出が起きてしまうという上記問題に着目した。
また、たとえば塩基数５０００以下の範囲、特に塩基数４０００以下の短い核酸分子や塩基数５００以下の短い核酸分子を有するＦＩＳＨ用のプローブを用意して、特定遺伝子の５０００塩基配列領域に対してハイブリダイゼーションを実施した場合に、蛍光輝度が足りずに目的の遺伝子を検出できないケースがある。
すなわち、本発明は、従来のＢＡＣプローブの標識率と同等以下のＢＡＣプローブ、またはＢＡＣプローブと比べてより短く且つ標識率が同等以下のプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）でありながら、従来のＢＡＣプローブ以上の輝度を達成することを目的とする（課題１）。
さらに、別の側面としての本発明は、
従来のＢＡＣプローブと比べて、短く且つ同等以下の標識率のプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）でありながら、従来のＢＡＣプローブと同等以上の輝度を達成しつつ、且つ、ＦＩＳＨでのハイブリダイゼーションに悪影響が及びにくい上記プローブを得ることを目的とする（課題２）。
高い標識率達成が困難なＢＡＣクローンの場合には有効であるとともに、検出対象とする核酸配列によっては短いＢＡＣクローンしか選択肢のない場合にも有効である。
また、別の側面としての本発明は、従来の長大なＢＡＣクローンから作成されたＢＡＣプローブを用いた場合に発生しがちな、非特異的吸着を抑制しつつ、ＦＩＳＨ法によって安定的に強い蛍光シグナルを得ることができるプローブ試薬の提供、および該プローブ試薬を用いたＦＩＳＨ法の提供を目的とする（課題３）。
本発明者らは、所定のＢＡＣプローブに蛍光体を集積したナノ粒子（以下、蛍光体集積ナノ粒子という）を結合させることで、上記課題１を解決できることを見出した。なお、ここでの「結合」には、共有結合以外にも生体分子間の結合（例；ストレプトアビジン−ビオチン間の結合）等も含まれる。
さらに、本発明者らは、ＢＡＣプローブと比べて短いプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）の末端および／または末端以外の１〜５０か所に蛍光体集積ナノ粒子を所定の方法で結合させたときに上記課題２，３が解決できることを見出した。
さらに、本発明者らは、この蛍光シグナルを得る際に、標識率の少ないＢＡＣプローブ、またはＢＡＣプローブと比べて短く且つ同等以下の標識率のプローブを用いてＦＩＳＨのハイブリダイゼーション処理を行った後、ハイブリダイズした各核酸分子に対して複数の蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子で蛍光染色することで、蛍光体の褪色を防止することができ、本発明のより好ましい実施形態とすることができることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬である。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、塩基数４０００以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法により結合して得られるインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキットは、染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基配列を有し第１の生体分子が連結された核酸分子と、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキットである。このとき、第１の生体分子と第２の生体分子は直接的に結合可能であってもよく、第3の分子・物質を介して間接的に結合可能であってもよい。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキットは、染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基数５０００以下の配列を有し末端または該末端以外の１〜５０か所に第１の生体分子が連結された上記核酸分子と、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキットである。このとき、第１の生体分子と第２の生体分子は直接的に結合可能であってもよく、第3の分子・物質を介して間接的に結合可能であってもよい。
さらに、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨは、上記のプローブ試薬またはキットを用いるＦＩＳＨである。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨは、ＢＡＣプローブの核酸配列を有し第１の生体分子が複数連結された核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するＦＩＳＨである。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したＦＩＳＨは、ＢＡＣプローブの配列を有し第１の生体分子が末端または該末端以外の１〜５０か所に連結された塩基数５０００以下の核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するＦＩＳＨである。
さらに、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した化合物は、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬の調製に用いられる化合物であって、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子の基質とが化学結合した化合物である。
上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子１モルに対して、蛍光ナノ粒子（例；半導体ナノ粒子など）を２００００モル以上結合したことを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬である。
本発明に係るプローブ試薬は、ＢＡＣプローブまたはＢＡＣプローブと比べて短いプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）に由来する所定の核酸分子に、複数の蛍光体を集積して発光輝度を高めた蛍光体集積ナノ粒子を結合させた構成である。そのため、標識率が低くても染色体の特定領域を染色するＦＩＳＨを行った際に特定の遺伝子の検出精度を高めることができるとともに、共焦点顕微鏡での観察に十分な強度の蛍光シグナルを得ることができ、蛍光顕微鏡で観察した場合にも組織切片の異なる深度に位置する輝点を同時に、同一視野で検出することが可能となる。また、ＦＩＳＨを行った組織切片のスライドについて、輝点の検出が可能な状態でより長く維持することが可能となる。
図１は、本発明に係るプローブ試薬の一例について製造過程を示した図である。 図１Ａは、本発明に係るプローブ試薬の別の一例について製造過程を示した図である。 図２は、図１のプローブ試薬を用いたＦＩＳＨの過程を示した図である。 図３は、ＦＩＳＨのハイブリダイゼーション後に染色体上の特定領域に結合した核酸分子を蛍光集積体ナノ粒子により蛍光標識する場合の本発明に係る別のＦＩＳＨの過程を示した図である。
以下、本発明に係るプローブ試薬、およびこれを用いたＦＩＳＨについて説明する。
《蛍光体集積ナノ粒子を有するＦＩＳＨ用のプローブ試薬》
本発明に係るＦＩＳＨのプローブ試薬は、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子、所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
［核酸分子］
核酸分子は、染色体上の特定領域の一部または全部を含む配列（プローブ配列）を有する核酸分子である。核酸にはＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ−ＲＮＡなど）等の天然に存在する核酸やＰＮＡ、ＬＮＡ（又はＢＮＡ:Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸が含まれる。したがって、核酸分子は、染色体上の核酸配列と相補鎖を形成できるものであれば制限がない。核酸分子は、天然の核酸、人工核酸、または天然の核酸と人工の核酸とが連結した核酸の分子であってもよい。
プローブ配列としては、ＨＥＲ２等のバイオマーカー遺伝子の検出に関連する染色体上の核酸配列の全部または一部が好適に用いられる。バイオマーカーとしては、診断用バイオマーカー、疾患段階を判断するバイオマーカー、疾患予後バイオマーカー、および治療処置に対する反応を見る目的のモニター用バイオマーカー等がある。例えば、癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴなどが挙げられる。さらに、癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１−ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）、ＰＤ−Ｌ１、ＢＭＩ１、ＬＧＲ５、ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３） が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２ （ｏｒ Ｋｉ−ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６ ＩＮＫ４Ａ、ｃ−ＥＲＢＢ−２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。
プローブ配列としては、検出する染色体上の特定領域にあるユニークな配列を含むように設計することが好ましい。また、染色体上の特定の遺伝子のコピー数をＦＩＳＨで検出する場合、スプライシング前のイントロンを含むゲノム配列を考慮してプローブ配列を設計する必要がある。検出対象の遺伝子を含むゲノム配列の入手方法としては、公開されている遺伝子のデータベースDDBJ （DNA Data Bank of Japan）に対して、生物名、遺伝子名、染色体の番号等を検索単語として用いて検索したり、例えば「Cancer cell lines BACS」等を検索単語として検索することにより入手することができる。ここで、がん（原）遺伝子のコピー数をＦＩＳＨで検出する場合、がん（原）遺伝子の配列を含む「Cancer cell lines BACS」のＢＡＣクローンライブラリーの配列が好適である。
プローブ配列については、通常の構造遺伝子を検出する場合、ｉｎｄｅｌ, ＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ）、マイクロサテライト等の、コピー数が多型となっている遺伝子配列部分を含めないことが好ましい。ヒト（２ｎ＝４６）の細胞において、一つの細胞（核）あたりの通常の遺伝子のコピー数は１〜２であるため、蛍光体の輝点の数から推定されるコピー数が３以上の場合は当該遺伝子が増幅する染色体の異常が起きており、逆にそのコピー数が０の場合は当該遺伝子が欠損する染色体の異常が起きていると判断することができる。上述したような多型の遺伝子の配列をプローブ配列に含めると、蛍光体の輝点の数が目的とする特定の遺伝子のコピー数と一致しなくなり、上述したようなコピー数の検出に支障をきたす。
また、例えば後述するように核酸分子中の特定の塩基（例えばチミン（Ｔ））を、ビオチン標識されたヌクレオチド（上記例の場合、例えばＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ）にニックトランスレーションにより置換し、置換部位のビオチンにストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させる場合、核酸分子中の特定の塩基の数（上記例ではチミン（Ｔ））がＦＩＳＨを行った際の輝点数や発光の強さに影響することとなるため、輝点の数や発光の強さを考慮しつつ核酸分子中の特定の塩基を決めてプローブ配列を設計することとしてもよい。上記とは別の態様で核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を結合する場合（例えば核酸分子の５'末端にのみ蛍光体集積ナノ粒子を結合させるような場合）には、プローブ配列中の特定の塩基の数を考慮する必要はない。
核酸分子の入手方法については、核酸分子の塩基数が数十塩基であれば、プローブ配列を含む核酸分子の配列のデータを提出してフナコシ等の核酸合成受託サービスに依頼して核酸分子を入手することが好ましい。一方、核酸分子の塩基数が多い場合（例えば１０００塩基を超える場合）は上記のように合成することも可能であるが時間がかかるため、塩基配列のシークエンスを行って正しく核酸分子が形成されているか確認することを前提に例えば以下のようにして行ってもよい。なお、このようにさまざまな手法で設計・作成されたプローブは、核酸配列がＤＮＡであればＤＮＡプローブ、核酸配列がＲＮＡであればＲＮＡプローブと、一般的に呼ばれている。
１つ目の方法としては、検出対象の生物のゲノムＤＮＡに含まれるプローブ配列部分を挟みこむようにプライマーを設計および合成し、このプライマーのセットを用いてゲノムＤＮＡ（または、上記のＢＡＣクローンライブラリー等のゲノムライブラリー）に対して複製精度の高いｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法を行う。次に、ＰＣＲの反応溶液を電気泳動により分離し、目的の核酸分子の長さに相当するバンドを切り出して核酸精製キット（ＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ等のキット）を用いて溶出することにより、目的の核酸分子を入手することができる。
別の方法としては、核酸分子の配列を含むプラスミド（ＢＡＣプラスミド等）を大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）等）に形質転換して培養（増幅）し、集菌して核酸抽出を行い、核酸分子にあたる部分を所定の制限酵素で切り出して上述のように電気泳動および核酸精製をすることで入手することができる。
また、上述した核酸分子の入手方法とは異なり、ＰＮＡ、ＬＮＡ（又はＢＮＡ:Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を利用して、プローブとして使用可能な配列を有するプローブ（核酸分子）を人工的に合成することによって核酸分子を入手することもできる。
［蛍光体集積ナノ粒子］
蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光体を集積したものである。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、１粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標識する輝点の輝度を高めることができる。
［蛍光体］
本明細書において「蛍光体」とは、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
また、本発明にいう「蛍光体」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。このような蛍光体は、有機蛍光体（蛍光色素）および無機蛍光体に大別することができる。
〔有機蛍光体〕
蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，４'，５'，７，７'−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，７，７'−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４'，５'−ジクロロ−２'，７'−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
〔無機蛍光体〕
蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。量子ドットは、市販されているものでもよい。
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
［蛍光体集積ナノ粒子の製造方法］
蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる（当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する）製造方法を用いることができる。
蛍光体集積ナノ粒子の粒子径は、蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、好適に蛍光観察する観点から、前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。
製造した蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径の測定は、当該分野で知られた方法により行うことができ，例えば、ガス吸着法、光散乱法、X線小角散乱法（ＳＡＸＳ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）あるいは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して平均粒子径を計測する方法等により測定できる。ＴＥＭを用いる場合、粒子径分布が広い場合には、視野内に入った粒子が全粒子を代表しているか否かに注意を払う必要がある。吸着法は、Ｎ2吸着等によりＢＥＴ表面積を評価するものである。
<有機蛍光体の場合>
有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂（熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂）を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、蛍光体を添加し、当該（共）重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
上記の熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。上記の熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、キシレン等の有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、色素樹脂に内包させた色素の溶出を抑制することができる点で好ましい。
例えば、有機の蛍光色素（蛍光体）を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
一方で、有機蛍光体をシリカからなる母体の内部または表面に固定化したシリカナノ粒子を製造することもできる。そのような製造方法としては、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカナノ粒子の合成方法を参考にすることができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
<無機蛍光体の場合>
無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
また、上記とは異なる蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、シリカナノ粒子をシランカップリング剤で処理して末端をアミノ化し、カルボキシル基末端を有する蛍光体としての半導体ナノ粒子をシリカビーズの表面にアミド結合により結合することで集積し、蛍光体集積ナノ粒子とする方法も挙げられる。
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル−ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス状の粒子を形成し、蛍光体集積ナノ粒子とする例が挙げられる。
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在化で、アミノ基末端の半導体ナノ粒子と、カルボキシル基末端の半導体ナノ粒子を混合し、半導体ナノ粒子間をアミド結合で介して結合することで半導体ナノ粒子を集積し、蛍光体集積ナノ粒子を製造する例が挙げられる。
さらに、無機蛍光体を樹脂からなる母体の内部または表面に固定化した集積体を製造することもできる。たとえば、量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
［核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合］
核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合は、ＦＩＳＨに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子の結合は、核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
＜直接結合する方法＞
直接結合する方法の例としては、核酸分子の５'末端のリボースＣ５位に結合したリン酸の水酸基または核酸分子の３'末端のリボースのＣ１位に結合した水酸基を公知のチオール基導入試薬によりチオール基（ＳＨ基）に置換し、マレイミドで標識された蛍光体集積ナノ粒子を反応させて、両者を結合する方法が挙げられる。
前者の５'末端における結合は、具体的には例えば以下のように行われる。まず、核酸分子に対してＳＨ−ＧＴＰとＴｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとを加え、３７℃で３０分インキュベートすることで核酸分子の５'末端にチオール基を導入する。さらに、この核酸分子の溶液に対して、マレイミドで標識された蛍光体集積ナノ粒子を加えて６５℃で３０分インキュベートすることで、チオール基とマレイミド基とのカップリングを介して、核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子とを連結させる。この結合には、例えばベクターラボラトリーズ社製「５'ＥｎｄＴａｇ（出願商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」のキットを用いて、そのプロトコールに従って好適に行うことができる。
後者の３'末端における結合も、５'末端における結合と同様の反応機序により行われ、ベクターラボラトリーズ社製「３' ＥｎｄＴａｇ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」のキットを用いて好適に行うことができる。
別の例としては、ニックトランスレーションまたは末端修飾により、ＤＮＡにアルキン修飾して得られたアルキニル基を有する核酸分子と、アジド基（Ｎ3）を有する蛍光体集積ナノ粒子とを銅塩存在下でアジド−アルキン付加環化反応により結合させる方法（いわゆるクリックケミストリーを用いる方法）が例示できる。この場合、蛍光体集積ナノ粒子のアジド化は、公知のアジド化試薬（ジアゾ基転移試薬）を用いて行うことができる。核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合は、ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社製の「Ａｌｋｙｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ５'−ｔｅｒｍｉｎａｌ」を用いて、プロトコール（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、"Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｃｌｉｃｋ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＤＮＡ"、[online]、[検索年月２０１４年１月１３日]、インターネット、〈ＵＲＬ; http://www.lumiprobe.com/protocols/click-chemistry-dna-labeling〉）に従って好適に行うことができる。
また、別の方法として、ｄＵＴＰと蛍光体集積ナノ粒子とを直接結合させる方法がある。この方法として、例えば、まずルミプローブ社製「Ａｍｉｎｏ−１１−ｄＵＴＰ」を、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）と混合してチオール基付加処理を行った後、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、Ｔｈｉｏｌ−１１−ｄＵＴＰ溶液を得る。次に、末端にマレイミド基が付いた上記蛍光体集積ナノ粒子とＴｈｉｏｌ−１１−ｄＵＴＰ溶液とを、ＥＤＴＡをＰＢＳ中で混合して反応させることで、ｄＵＴＰが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得ることができる。そして、これをニックトランスレーション法で核酸分子に取り込ませることで、核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を直接結合させることができる。
＜間接結合する方法＞
間接的に結合する方法は、生体分子（第１，２の生体分子）同士の結合を介して核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる方法である。生体分子同士の結合として、例えば第１の生体分子としてのストレプトアビジンと第２の生体分子としてのビオチンの結合を用いる場合、上記の間接的な結合は、例えば以下のようにしてビオチン標識された核酸分子と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子とを調製し、両者を結合させることで達成される。
第１の生体分子（ビオチン等）で標識された核酸分子の調製方法としては、以下の方法が挙げられる。
（１）ニックトランスレーション法
核酸分子の特定の塩基（例えばチミン（Ｔ））を第１の生体分子（ビオチン等）で標識されたヌクレオチド（例えばＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ）にニックトランスレーションにより置換し、この核酸分子のビオチンに対して、（ストレプト）アビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させる方法を例示できる。
この場合のニックトランスレーションは、常法（例えば、「細胞工学別冊・実験プロトコールシリーズ ＦＩＳＨ実験プロトコール」、第２部、第２章、松原謙一他監修、秀潤社、１９９４等）に従って、ビオチン標識されたヌクレオチド（ベーリンガー社製「ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ」等）を用いて行うことができる。
また、上記とは別の方法として、核酸分子の末端（５’末端または３’末端）に第１の生体分子（ビオチン等）を導入する以下（２−１）〜（２−２）の方法を例示することができる。
（２）５’末端標識法または３’末端標識法
（２−１）ＰＣＲ法を利用する方法
鋳型からＰＣＲ法によりプロ―ブ（核酸分子）を調製する際に、ＰＣＲ法で使用するプライマーとして、５’末端または３’末端の部分にビオチン−ｄＮＴＰ（Ｎはアデニンン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），チミン（Ｔ），ウラシル（Ｕ）のいずれかである）を有するプライマーを使用することにより、５’末端または３’末端が第１の生体分子（例；ビオチン）標識されたプローブ（核酸分子）を調製することができ、このプローブに第２の生体分子（例；アビジン）を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ（核酸分子）と蛍光体集積ナノ粒子を１：１で結合させることができる。上記鋳型としては、ＢＡＣクローンのものでもよいし、ヒト等のゲノムＤＮＡを使用することもできる。
（２−２）リンカーを利用する方法
キット等により核酸分子の５’末端あるいは３’末端に第１結合基（例；チオール基）を導入し、この第１結合基と結合可能な第２結合基（例；マレイミド基）を有する分子であって第１の生体分子（例；ビオチン等）を有する分子を結合反応させることにより、核酸分子の５’末端または３’末端を第１の生体分子で標識することができる。この核酸分子に第２の生体分子（例；アビジン）を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ（核酸分子）と蛍光体集積ナノ粒子を結合させることができる。
また、上記分子の例としては、一端部にマレイミド基、他端にビオチンを有する親水性高分子（例；ＰＥＧ等）のリンカーを挙げることができる。該リンカーを核酸分子の５’末端のチオール基に結合させた後、リンカーの他端部にあるビオチンに対してストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで核酸分子に間接的に蛍光体集積ナノ粒子を結合させることができる。
上記キットの例としては「５’ＥｎｄＴａｇ（出願商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」のキットが挙げられる。
上記リンカーとしては、例えば、Biotin PEG Maleimide（Nanocs社 ）の、cord PG2-BNML-10k, PG2-BNML-5k, PG2-BNML3k, PG2-BNML-2k, PG2-BNML-1k等を使用することができる。
（３）末端以外への標識法
上記（２−１）ＰＣＲ法を利用する方法に準じて、ＰＣＲ法で使用するプライマーとして末端未標識プライマーを使用し、作成されたプローブ（核酸分子）に対して、「PlatinumBright Nucleic Acid Labeling Kit」（製品番号GLK-007，フナコシ社製）を反応することで、複数のビオチン標識をすることも可能である。
一方、第２の生体分子（ストレプトアビジン等）で修飾した蛍光体集積ナノ粒子の調製は、例えば、以下のようにして行うことができる。蛍光体集積ナノ粒子と第２の生体分子とにそれぞれ官能基を導入する試薬により官能基を導入し、官能基同士の結合を介して第２の生体分子と蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる。この官能基同士の間にリンカーを介在させてもよい。官能基の組み合わせの例としては、ＮＨＳエステル基−アミノ基、チオール基−マレイミド基の組み合わせ等を例示することができる。リンカーとしては、ＥＭＣＳ（Ｎ−［エプシロン−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ］ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（サーモサイエンティフィック社製）等のリンカーを例示することができる。
＜核酸分子と複数の蛍光体との結合＞
核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を複数結合させることにより、本発明に係る別のプローブ試薬を得る場合、この結合については、例えば上述したようにニックトランスレーションにより、核酸分子に含まれる複数の特定の塩基（例えばチミン（Ｔ））を第１の生体分子（ビオチン等）で標識し、このビオチンに対して第２の生体分子（ストレプトアビジン等）で標識された蛍光体（例えばストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子）を結合させることで行うことができる。
＜核酸分子に対する蛍光体の標識率＞
核酸分子に対する蛍光体の標識率は、（核酸分子に結合した蛍光体の分子数／該核酸分子１分子が有する全塩基数）×１００（％）で表される。
この標識率は、ＦＩＳＨにおける蛍光顕微鏡観察で蛍光シグナルがサチレーションせずに輝点観察できる範囲であれば特に限定されないが、この標識率は、好ましくは１３．３３％以下であり、より好ましくは０．４６〜１３．３３％である。このうち、標識率が０．４６％以下となる場合の例として、核酸分子の末端に１つの蛍光体集積ナノ粒子が結合した例が挙げられ、この場合が最も低い標識率となるが、このように１つの蛍光体集積ナノ粒子を用いて核酸分子を蛍光標識する場合、核酸分子が本来有していない蛍光体集積ナノ粒子の使用を極力低減させて前記核酸分子の反応性を高める観点からは好ましいといえる。
ここで、特異性の非常に高いストレプトアビジン−ビオチンの結合を介して、核酸分子と蛍光体とを結合させる場合、具体的には、例えば、核酸分子の全塩基のうちの一部の塩基をビオチン標識する一方で、蛍光体をストレプトアビジンで標識し、該ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して核酸分子を蛍光体で標識する場合、核酸分子が有する全てのビオチンにストレプトアビジンが高い特異性でもって結合することから、後述する「ビオチン標識率」は前記核酸分子に対する蛍光体の標識率と同一となる。なお、本願におけるビオチン標識率の高低について、便宜的に、ビオチン標識率が８％を超える場合に高いビオチン標識率といい、８％下回る場合を低いビオチン標識率という。
ビオチン標識率の確認は、例えば、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行うことで確認することができる。
＜蛍光体集積ナノ粒子の結合モル比＞
前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子との結合のモル比は、ＦＩＳＨにおける蛍光顕微鏡観察で蛍光シグナルがサチレーションせずに輝点観察できる範囲であれば特に限定されないが、前記核酸分子：前記蛍光体集積ナノ粒子の好ましいモル比は、１：１〜１：５０００、より好ましくは１：１〜１：２０００、より好ましくは１：１〜１：５５０、さらに好ましくは１：１〜１：１００、さらに好ましくは１：１〜１：４０である。核酸分子１分子あたりに少なくとも１個の蛍光体集積ナノ粒子が必要であり、また十分な輝度の蛍光シグナルを観察できるようにするためには核酸分子１分子あたりに１００個の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合していれば十分である。なお、核酸分子１分子あたりに複数の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合した場合でも、それらは１つの輝点として観察され、検出対象とする遺伝子１コピーが存在するものと判別することができる。
前記核酸分子：前記蛍光体集積ナノ粒子（モル比）＝１：１のプローブ試薬は、例えば、上述したように核酸分子の５'末端もしくは３'末端に蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで作成することができる。
前記核酸分子：前記蛍光体集積ナノ粒子（モル比）＝１：２のプローブ試薬は、上述したように核酸分子の５'末端および３'末端に蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで作成することができる。
前記核酸分子：前記蛍光体集積ナノ粒子（モル比）が１：３〜１：５０００（例；１：３〜１：５５０）の範囲のプローブ試薬は、核酸分子の塩基配列中にあるグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）の数を計測し、そのうちのある塩基（例えばチミン（Ｔ））が３〜５０００個（上記例の場合では，３〜５５０個）存在する場合に、その第１の生体分子（ビオチン等）が結合したヌクレオチド基質（上記例ではＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ）を含めて核酸分子をニックトランスレーションすることで、３〜５０００個（上記例の場合は、３〜５５０個）の第１の生体分子（ビオチン等）を有する核酸分子を形成し、この第１の生体分子（ビオチン等）に対して第２の生体分子（ストレプトアビジン等）を有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで行うことができる。
また、第１の生体分子が結合したヌクレオチド基質の代わりに、蛍光体集積ナノ粒子とコンジュゲートしたヌクレオチド基質を用いたニックトランスレーションを行うことでも、上記と同様に前記核酸分子：前記蛍光体集積ナノ粒子（モル比）＝１：３〜１：５０００（上記例の場合では１：５５０）のプローブ試薬を調製することができる。
ここで、ニックトランスレーション時の基質濃度を変更することで、第１の生体分子（ビオチン等）等で標識される核酸分子中の特定の塩基の数を調節することができる。具体的に、例えば、核酸分子中にチミン（Ｔ）が３００個あるとした場合、このうち１００個程度をＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰで置換したい場合には、ニックトランスレーションで用いるヌクレオチド基質に含めるｄＵＴＰとＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰの比率を適宜調節することで上記置換の割合を調節して行うことができる。
ビオチン標識するためのヌクレオチド基質としては、以下のものを例示することができる。
核酸分子中のアデニン（ＡＴＰ）を置換してビオチン標識する場合は、上記ヌクレオチド基質として、Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＡＴＰ 、Ｂｉｏｔｉｎ−１４−ｄＡＴＰ 、Ｂｉｏ−７−ｄＡＴＰ （Ｂｉｏｔｉｎ−７−２'−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５'−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＢＩＯＴＩＮ-Ｎ６−ＡＴＰ等を使用することができる。
核酸分子中のシトシン（ＣＴＰ）を置換してビオチン標識する場合は、上記ヌクレオチド基質として、Ｂｉｏｔｉｎ−１４−ｄＣＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＣＴＰ等を使用することができる。核酸分子中のチミン（ＴＴＰ）を置換してビオチン標識する場合は、上記ヌクレオチド基質として、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｈａ−ｄＵＴＰ等を使用することができる。グアニンを置換する場合には、上記ヌクレオチド基質として、Ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＧＴＰ等を使用することができる。
合成したプローブ試薬の核酸分子：蛍光体集積ナノ粒子のモル比の確認は、例えば、合成したプローブ試薬をゲル濾過カラムに供して分子量分画を行い、各フラクション溶液に対して蛍光体集積ナノ粒子を励起する波長の光を照射して蛍光を発する画分、すなわち蛍光集積体ナノ粒子が存在する画分を特定するとともに、各フラクション溶液の吸光度（ＯＤ＝２６０）を測定して核酸分子が存在する画分を特定し、蛍光集積体ナノ粒子および核酸分子の双方が存在する画分が、前記プローブ試薬のモル比が１：３〜１：１００である場合に理論的にとりうる分子量範囲の分画位置であるか否かを判断して確認することができる。ここで、所望のモル比でないＤＮＡプローブが含まれていた場合にこれを除くためには、分子量分画の所望のＤＮＡプローブの画分のみを回収すればよい。
また、上記とは別の方法により、合成したプローブ試薬の核酸分子：蛍光体集積ナノ粒子のモル比を算出することができる。具体的には、核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合をストレプトアビジンビオチンの結合を利用して行う場合、上述したように、ＨＡＢＡ−アビジン法で核酸分子のビオチン標識率を算出し、１：[核酸分子の全塩基数×ビオチン標識率（％）／１００％]の式により算出することができる。
《半導体ナノ粒子を含むＩＳＨ用のプローブ試薬》
本発明に係る別のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子１モルに対して、半導体ナノ粒子を２００００モル以上結合したことを特徴とする。
半導体ナノ粒子は、上述した蛍光体集積ナノ粒子と比べて、粒子１分子の粒径サイズが小さく１粒子の発光輝度が低いため、蛍光体集積ナノ粒子とは異なり、核酸分子１モルに対して半導体ナノ粒子を少なくとも２００００モル以上結合させたものをＦＩＳＨプローブとして使用することで、ＦＩＳＨを行った際に共焦点顕微鏡だけでなく蛍光顕微鏡であっても輝点を観察することができる。
また、半導体ナノ粒子は、上述したように蛍光体集積ナノ粒子と比べて粒子１分子の粒径サイズが小さいため、該半導体ナノ粒子と核酸分子とを上記結合のモル比の範囲で結合させて得られるプローブを用いてＦＩＳＨを行った際に、ターゲットの核酸分子（例；組織切片中のＨＥＲ２遺伝子）と該プローブとのハイブリダイゼーションに与える悪影響を低く抑えることができるという利点がある。
なお、核酸分子１モルに対する結合させる半導体ナノ粒子のモル数が２００００モル未満の場合でも（例えば１００００モル以上〜２００００モル未満でも）、上記と同様に蛍光顕微鏡により輝点を観察できる可能性がある。
［核酸分子］
上記核酸分子としては、蛍光体集積ナノ粒子を有するプローブ試薬について前述した際に説明した核酸分子を使用することができるのでその説明を省略する。
［半導体ナノ粒子］
上記半導体ナノ粒子としては、例えば、前述した量子ドットを使用することができ、具体的には「Qdot（登録商標）」（インビトロジェン社製）等を使用することができる。
（平均粒子径）
上記半導体ナノ粒子の粒子径は、上記結合モル比の範囲で核酸分子と結合したプローブ試薬でＦＩＳＨを行った際に蛍光顕微鏡で蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、プローブの核酸分子と検出対象であるターゲットの遺伝子（例；組織切片中のＨＥＲ２遺伝子等）とのハイブリダイゼーションに悪影響を及ぼさないようにする観点から、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径より小径の４０ｎｍ未満のものであることが好ましく、１０〜２０ｎｍの半導体粒子がより好ましい。
［核酸分子と半導体ナノ粒子との結合］
核酸分子と半導体ナノ粒子との結合は、ＦＩＳＨに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と半導体ナノ粒子の結合は、核酸分子に半導体ナノ粒子を上記モル比範囲で直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
＜直接結合する方法＞
直接結合する方法の例としては、例えば、第１の結合基（例；マレイミド等）を有する核酸の基質を用いて核酸分子に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第１結合基を導入し、第１結合基に結合可能な第２結合基（例；チオール基等）を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。マレイミド基を有する核酸基質（マレイミド−ｄＮＴＰｓ）は、例えば、日本（株）遺伝子研究所等により受託合成を依頼して購入したものを用いることができる。
＜間接結合する方法＞
直接結合する方法の例としては、例えば、第１生体分子（例；ビオチン等）を有する核酸の基質（例；上述したｄＵＴＰ−ビオチン等）を用いて、核酸分子（特に核酸の塩基数２万以上のもの）に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第１生体分子を導入し、第１生体分子に結合可能な第２生体分子（例；ストレプトアビジン等）を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。このとき、第１の生体分子と第２の生体分子は直接的に結合可能であってもよく、第３の分子・物質を介して結合可能であってもよい。
＜半導体ナノ粒子との結合モル比＞
前記核酸分子と前記半導体ナノ粒子との結合のモル比は、前記核酸分子１モルに対して、少なくとも、前記半導体ナノ粒子を２００００モル以上結合させることにより、半導体ナノ粒子を有するＦＩＳＨ用のプローブ試薬を用いてＦＩＳＨを行った際に蛍光顕微鏡でも十分な輝点を観察できる程度の輝度を確保することができる。
［ＦＩＳＨ］
〔染色方法〕
以下、ＦＩＳＨについて述べる。ＦＩＳＨは特に限定されず、公知の方法を用いることができる。以下の記載は、本発明における実施形態の一例である。
＜検体スライドの調製＞
検体スライドは、例えばがんが疑われる被験者（ヒト、イヌ、ネコ等）の組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で調製することができる。まず、被験者の組織を、ホルマリン等を用いて固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製する。続いて、上記組織試料を３〜４μｍの切片にし、スライドガラス上に載置したものを検体スライドとする（図２、３参照）。
＜脱パラフィン処理＞
キシレンまたはその他の脱パラフィン剤を入れた容器に検体スライド上の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する（図２、３参照）。このときの温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に該切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に該切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
＜検体スライドの前処理＞
ＢＡＣプローブまたはＢＡＣプローブと比べて短いプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）をハイブリダイゼーション反応する前に、加熱処理、酸処理、酵素処理、活性剤による処理など、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにするための前処理を施すことが知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さ・スライド調整条件などにより、最適条件が異なるので、適宜手順を決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もありうる。
まず、公知の方法にならい、ＦＩＳＨを行う細胞組織の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５分以上３０分以下で行うことができる。
また、蛋白質を除去する試薬での処理は一般的に、酵素または塩酸を含んでなる試薬が用いられ、例えば以下のような手順で、細胞膜および核膜のタンパク質を除去する処理を行う。
まず、検体スライドを塩酸（０．２ｍоｌ／Ｌ程度）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｉｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）に浸漬して洗浄する。次に、前処理液（例えば１Ｎ ＮａＳＣＮ）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、これと同じ操作を２回繰り返す。
蛋白質を除去する試薬として酵素を用いる場合には、細胞膜および核膜のタンパク質、特にコラーゲンを分解するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをプロテアーゼ溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
酵素としては、プロテナーゼ、ペプシン、プロテナーゼＫ等がしばしば使用される。典型的な酸処理は０．０２−０．２Ｎ ＨＣｌでなされ、続いて高温（例えば、７０℃）で洗浄される。脱タンパク質の効率をどうするかは、ハイブリダイゼーション、すなわち、目的とする染色体との反応を最高にするプロテナーゼ濃度と分解時間との組合せを検討した上で、形態学的詳細(morphological detail)が損なわれないような条件設定で行われる。なお、最適の条件は組織型及び固定方法により異なる。また、プロテナーゼ処理後の付加的固定は有用である。
＜固定処理＞
上記の酵素処理の後など必要であれば前処理の各ステップで、検体スライドを固定するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをホルマリン溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
＜ＤＮＡ変性処理＞
上記の固定処理の後、切片上に存在するＤＮＡを変性する（二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡにする）ため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドを変性溶液（ホルムアミド／ＳＳＣ溶液等）に７２℃程度で所定の時間、浸漬する。その後、検体スライドを取り出し、ホルムアミドを除去するため、濃度を徐々に高めた数段階のエタノール（例えば７０％エタノール水溶液、８０％エタノール水溶液および１００％エタノール）に浸漬する。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
＜プローブ試薬を用いたハイブリダイゼーション処理＞
上述したプローブ試薬を用いて、公知のＦＩＳＨ（例えば「アジレントＦＩＳＨ Ｇｅｎｅｒａｌ ＰｕｒｐｏｓｅＲｅａｇｅｎｔｓプロトコル」や、「臨床ＦＩＳＨプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等）と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる（図２、３参照）。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡ相補鎖の結合過程、または形成された２本鎖の分子を意味する。
ここで、第１の生体分子（ビオチン等）を有する核酸分子を染色体上の特定の核酸配列にハイブリダイゼーションさせた後に、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応系に加えて、反応系内で蛍光標識するようにしてもよい（図３参照）。
ハイブリダイゼーションの条件設定については、プローブ配列のＧＣ含有率、ハイブリダイゼーションの反応系に存在する１価の陽イオンの濃度（Ｍ）、および該反応系のホルムアミド濃度（％）により、核酸分子が染色体上の配列に結合する際の結合の精度が変化する。そのため、下式（１）および（２）を参考にＦＩＳＨにおけるハイブリダイゼーション条件（Ｔｍ値）を調節し、結合の精度を調節することができる。
１価の陽イオン濃度（Ｍ）が０．１〜０．４Ｍである場合、プローブ配列のＴｍ値（≒核酸分子のＴｍ値）は、「Ｔｍ＝１６．６ｌоｇＭ＋０．４１×（ＧＣ）＋８１．５−０．７２×（％ホルムアミド）」・・・（１）により決定される。
１価の陽イオン濃度（Ｍ）が０．４Ｍを超える場合、プローブ配列のＴｍ値（≒核酸分子のＴｍ値）は、「Ｔｍ＝８１．５＋０．４１×（ＧＣ）−０．７２（％ホルムアミド）・・・（２）」により決定される。
また、条件設定の際には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの一般的な条件を記述するＬｅｉｔｃｈ ａｔ ａｌ. Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ, Ｏｘｆｏｒｄ ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｈａｎｄｂｏｏｋｓ Ｖ ２ （１９９４）を参照することができる。一般に、高ストリンジェンシー条件を採用すればバックグラウンドシグナルを低減させることができるが、同時に感度も低下する。
＜核染色処理＞
ハイブリダイゼーション処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするための核染色処理を行う。核染色試薬としてはＤＡＰＩが一般的であるが、これ以外にもＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などのビスベンズイミド誘導体やその他の核染色試薬を用いてもよい。例えば、核染色試薬としてＤＡＰＩを用いる場合は、次のような手順で核染色を行うことができる。まず、ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドを脱イオン水、リン酸液緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で順次洗浄する。次いで、ＤＡＰＩ染色試薬（２μｇ／ＰＢＳ）に一定時間浸漬する。
＜封入処理＞
ＦＩＳＨによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、ＰＢＳで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下し、カバーガラスを被せ、乾燥させる封入処理を行う。以上の処理により作製された封入済みの検体スライドが、病理診断等を行うためのプレパラートとなる。
［観察］
染色した上記切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、広視野の顕微鏡画像から蛍光の輝点の数又は発光輝度を計測する。用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、市販の画像解析ソフト、例えば、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトＧ−Ｃｏｕｎｔを用いて行うことができる。なお、顕微鏡を使用した画像解析自体は周知であり、例えば、特開平９−１９７２９０に開示される手法を用いることができる。顕微鏡画像の視野は、３ｍｍ2以上であることが好ましく、３０ｍｍ2以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ2以上であることがさらに好ましい。顕微鏡画像から計測された輝点数、及び／又は発光輝度に基づいて、目的とする特定の遺伝子のコピー数を評価する。具体的には、例えば、コピー数が１〜２つであれば正常であり、３つ以上であれば異常（増殖）が生じていると評価することができる。
以下、本発明に係るプローブ試薬、およびこれを用いたＦＩＳＨの作用、効果について説明する。
（1）本発明に係るプローブ試薬によれば、核酸分子（例；ＢＡＣプローブ、またはＢＡＣプローブと比べてより短く且つ標識率が同等以下のプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ））に対し、蛍光体を集積して発光輝度を高めた蛍光体集積ナノ粒子を結合させ標識した構成であるので、標識率が従来のＢＡＣプローブと同等以下のものであっても、従来の標識率の高いＢＡＣプローブ以上に発光輝度を高めることができ、組織切片のより深層に位置する輝点をも同時に検出することが可能となる。また、ＦＩＳＨを行った組織切片のスライドについて、輝点の検出が可能な状態でより長く維持することが可能となる。
（2）前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であれば、ＦＩＳＨを行った際に好適に輝点観察ができる。また、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径を４０ｎｍ以上３００ｎｍの範囲で調節すれば、好適に輝点の発光輝度を調整することができる。
（3，4）前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子または前記蛍光体とがモル比１：１〜１：５０００（特に１：１〜１：４０）で結合しているものであれば、核酸分子を標識している蛍光体集積ナノ粒子がハイブリダイゼーションに与える影響を抑制し、ＦＩＳＨを行った際に好適に輝点観察ができる。また、このモル比により輝点の発光輝度を大きく調整することができる。ここで、前記モル比と蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径の各調整により、輝点の発光輝度を所望の発光輝度に調整しやすくなる。
（5,6）さらに、塩基数５０００以下、特に塩基数４０００以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法により結合して得られるインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬であれば、ニックトランスレーション法により核酸分子全体を標識したときよりも標識率が低い（核酸分子の一方または両方の末端にのみ蛍光体集積ナノ粒子が結合する）ため、塩基数の比較的少ない核酸分子を標識している蛍光体集積ナノ粒子がハイブリダイゼーションに与える影響を極力小さくしたプローブを作製することができ、従来のＢＡＣプローブと同等以上に発光輝度を高めることができる。
なお、ビオチン標識した核酸基質を用いるニックトランスレーション法により核酸分子をビオチン標識する際に、ビオチン標識した核酸基質の使用量を調節することで標識率を下げることができるので、このような方法で上記標識率が低い核酸分子を得るようにしてもよい。
（7）核酸分子に対する蛍光体の標識率（％）が１３．３３％以下である上記プローブ試薬であれば、（5,6）と同様の観点から、好適にＦＩＳＨを行うことができる。
（8，9）前記蛍光体集積ナノ粒子が樹脂を用いて形成した粒子であれば、樹脂粒子を合成する際に、モノマーを重合しながら蛍光体を取り込むことによって蛍光体を集積しやすい上に、樹脂粒子を合成する際の樹脂粒子の重合条件（重合溶液に含める蛍光体やモノマーの濃度、重合温度等）により、樹脂粒子の平均粒子や樹脂粒子からの発光輝度を調整することができる。ここで、前記樹脂粒子がメラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を用いて形成された粒子であれば、樹脂粒子から蛍光体が溶出しにくくなり、蛍光体集積ナノ粒子の退光を抑制することができる。この結果、検体スライドの輝点の退光を抑制することができる。
（10，11）ここで、第１，２の生体分子が相互に特異的に結合可能である分子同士、例えばストレプトアビジンとビオチンであれば、前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子または前記蛍光体との結合が非常に特異的な結合によりなされるので、ハイブリダイゼーション処理後の蛍光染色を好適に行うことができる。
（12）前記核酸分子の塩基に蛍光体集積ナノ粒子が直接結合している上記プローブ試薬であれば、第１，第２生体分子を使用しないため、ＦＩＳＨ法で染色する細胞組織自体が内因性の第１，２生体分子を有していても、これらにプローブ試薬が結合することがない。
（13,15-17）染色体上の特定領域の配列と相補的な標識率の少ない（塩基数１５００００未満，特に塩基数４０００以下の）ＢＡＣプローブ、またはＢＡＣプローブと比べてより短く且つ標識率が同等以下のプローブ（例；ＢＡＣクローン由来のプローブ）の配列を有し第１の生体分子が連結された核酸分子と、第１の生体分子と特異的に結合可能な第２の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキットによれば、第１の生体分子が連結した前記核酸分子をプローブとしてＦＩＳＨにおけるハイブリダイゼーション処理を行った後、観察までの任意の時点で、第２の生体分子が連結した前記蛍光体集積ナノ粒子または前記蛍光体をハイブリダイゼーションの反応系に加えて染色体を蛍光染色することができる。この結果、ハイブリダイゼーション処理中に蛍光体を極力退色しにくい環境で保管しておき、観察の直前に添加することもできるので、輝点の発光輝度の低下を極力抑えることが可能となる。また、前記蛍光体集積ナノ粒子または前記蛍光体が核酸分子に結合していないＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションを行うので、ハイブリダイゼーションの最適条件が変化しにくいという利点もある。
（14,18）ここで、核酸分子の一方もしくは両方の末端および／または該末端以外の１〜５０か所に第１生体分子が標識されていれば、核酸分子全体に第１生体分子が結合している場合よりも上記ハイブリダイゼーションへの影響を小さくすることができる。
（19）所定の核酸配列の核酸分子１モルに対して、蛍光ナノ粒子（例；半導体ナノ粒子、量子ドット（Ｑ−ｄоｔ等）を２００００モル以上結合したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬であれば、該プローブ試薬を使用してＦＩＳＨを行った際に蛍光顕微鏡でも輝点を観察が可能となる。
［実施例１］
〔ビオチン標識率１３．３％のＢＡＣプローブの調製〕
ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．２００６；４５（１）５９の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。ＧＳＰ社から購入したＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（約１５０ｋｂｐ）１μｇ（５μＬ）に対して、ニックトランスレーション用のキット（製品名「ＧＳＰ−ニックトランスレーションキット」Ｋ−０１５、ＧＳＰ社製）のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、ＨＥＲ２のＤＮＡクローン（核酸分子）のｄＴＴＰをビオチン標識ｄＵＴＰで置換した。
〔ニックトランスレーションによる標準的なビオチン標識方法〕
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・１０×ＮｉｃｋＢｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．２]、ＭｇＳＯ4、ＤＴＴ）・・・２．５μＬ
・ＢＳＡ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ）・・・１．５μＬ
・ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ）・・・５μＬ
・ｄＴＴＰ・・・０．５μＬ、
・Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）・・・１．５μＬ
・純水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）・・・３μＬ
・上記ＨＥＲ２−ＤＮＡクローン約１５０ｋｂｐ １μｇの水溶液・・・５μＬ
・ＤＮＡ ＰоｌｙｍｅｒａｓｅＩ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．５]、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ｇｌｙｃｅｒоｌ）・・・１μＬ
・ＤＮａｓｅＩ・・・５μＬ
次に、１５℃で４時間反応させ、７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。反応後の遠心チューブに２５μＬの蒸留水を添加した。ビオチン標識済みのＢＡＣプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたＢＡＣプローブの溶液を得た。
〔蛍光粒子Ｑ−ｄоｔと、ビオチン標識率１３．３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製〕
上記ニックトランスレーションによりビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ（５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ）を得た。
また、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２００００であった。
〔ＤＮＡプローブの確認〕
このＤＮＡプローブの確認は、０．５％のＴＢＥを含む２％アガロースゲルで０．５％の変性バッファーＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のＤＮＡを、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によりカウンター染色した。そして、Ｑ−ｄоｔとＤＮＡの移動パターンを、「ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ ＦＸ Ｓｙｓｔｅｍ」(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)を使用して、以下のように決定した。
すなわち、泳動したゲルに存在するＱ−ｄоｔについては、波長５３２ｎｍの緑色レーザー光の励起光と波長６４０ｎｍバンドパスのエミッションフィルターを用いて確認した。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色したＤＮＡについては、波長４８８ｎｍの青色レーザー光の励起光と波長５３０ｎｍ緑色バンドパスのエミッションフィルターを用いて確認した。
〔ＤＮＡプローブの保存〕
上述のように得られたＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション緩衝液（２５％脱イオン化したホルムアミド、２×ＳＳＣ、２００ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト溶液、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に終濃度１〜５ｎｇ／μＬとなるように希釈した。必要に応じて、Ｓ３００サイズのスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により遊離のリガンド（遊離しているストレプトアビジン、ビオチン、およびｄＡＴＰの基質）を除去した。直ぐに使用しない場合、ＤＮＡプローブを−２０℃で冷凍保存した。
〔ＦＩＳＨ〕
ＦＩＳＨによりＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定した。ＦＩＳＨは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのＤＮＡの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびＤＡＰＩ染色処理をこの順で行うことで実施した。
〔脱パラフィン処理〕
ＨＥＲ２陽性染色対照標本の検体スライド（パソロジー研究所社製「ＨＥＲ２−ＦＩＳＨコントロールスライド Ｃｏｄｅ ＰＳ−０９００６」）を、以下の（１）〜（４）の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。（１）ヘモディー（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ）に常温で１０分間浸漬する。（２）検体スライドを新しいＨｅｍｏ−Ｄｅに常温１０分間浸漬する。同じ操作を３回繰り返す。（３）検体スライドを１００％エタノールで常温で５分間浸漬し、２回洗浄し、脱水処理を行う。（４）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。
〔検体スライドの前処理〕
ＤＮＡプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の（１）〜（６）の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。（１）検体スライドを０．２ｍоｌ／Ｌ ＨＣｌで室温、２０分間処理する。（２）検体スライドを精製水に３分間浸漬する。（３）検体スライドを洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｉｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）に３分間浸漬する。（４）検体スライドを８０℃の前処理溶液(１Ｎ ＮａＳＣＮ)に３０分間浸漬する。（５）検体スライドを精製水に１分間浸漬する。（６）検体スライドを洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ）に５分間浸漬し、この浸漬操作を２回繰り返す。
〔酵素処理〕
前処理を行った検体スライドに対して、以下の（１）〜（４）の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。（１）前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。（２）検体スライドを３７℃に加温したプロテアーゼ溶液に１０〜６０分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、２５ｍｇ プロテアーゼ（２５００−３０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）［ペプシン］／１Ｍ ＮａＣｌ［ｐＨ２．０］５０ｍＬで３７℃、６０分間）で処理することが望ましい。（３）検体スライドを洗浄緩衝液に５分間浸漬する。この操作を２回繰り返す。（４）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で２〜５分間乾燥させる。
〔検体の固定〕
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（３）の処理を行った。（１）検体スライドを１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製「４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号１６３−２０１４５）に常温で１０分間浸漬する。（２）検体スライドを洗浄緩衝液に５分間浸漬する。これと同じ操作を２回繰り返す。（３）検体スライドを風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマー上で２〜５分間乾燥させる。
〔プローブの準備〕
冷凍保存しておいたＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ）の溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。
〔検体スライドのＤＮＡの変性〕
検体スライド上のＤＮＡの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（８）の処理を行った。（１）検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱（気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの）を３７℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。（２）変性溶液（７０％ ホルムアミド／ＳＳＣ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム］）のｐＨが常温でｐＨ７．０〜８．０であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で加温する（７２±１℃の温浴槽に少なくとも３０分間置く）。（３）ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。（４）検体スライドを７２±１℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのＤＮＡを変性する。（５）ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の７０％エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを１分間浸漬する。（６）検体スライドを７０％エタノールから取り出し、８５％エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を１分間浸漬する。１００％エタノールで同じ操作を２回繰り返す。（７）ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。（８）検体スライドをドライヤーで風乾または４５〜５０℃のスライドウォーマーで２〜５分間乾燥させる。
〔ハイブリダイゼーション〕
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（３）の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したＤＮＡプローブ１０μＬ（１０〜５０ｎｇ）を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。（１）検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記ＤＮＡプローブを１０μＬ添加し、すぐに、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。（２）ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。（３）前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして３７℃のインキュベータで１４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行う。
〔スライドグラスの洗浄〕
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の（１）〜（６）の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。（１）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０）をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が７２℃±１℃になるまで温浴槽で予備加熱をする（７２℃±１℃の温浴槽に少なくとも３０分間置く）。（２）ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。（３）ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。（４）検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。（５）溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、７２±１℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に２分間浸す。ここで、７３℃を超える温度や処理時間として２分を超えないようにするのが望ましい。（６）コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下（締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等）で風乾する。
〔ＤＡＰＩ染色〕
ＤＡＰＩ染色は以下のように行った。まず、１０μＬのＤＡＰＩ対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにＤＡＰＩ染色（２μｇ／ｍＬＰＢＳ）を２５℃、１０分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。ＤＡＰＩ （４'，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−Ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ, Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｄ１３０６）を使用した。
〔観察〕
＜明視野観察＞
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡（カールツァイス社製「Ｉｍａｇｅｒ」）を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
＜共焦点蛍光顕微鏡観察＞
上記作製しＦＩＳＨを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（カールツァイスマイクロスコピー ＧｍｂＨ社製）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡプローブのＱ−ｄоｔを励起し、Ｑ−ｄоｔからの蛍光を測定波長６５５ｎｍで検出して、蛍光の測定、蛍光画像（蛍光静止画像）および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を３．６μｍ、３．１５μｍ、および２．７μｍと変更してそれぞれ撮像を行った。
＜蛍光顕微鏡観察＞
蛍光顕微鏡観察は、上述のようにＦＩＳＨを行った切片を、蛍光顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｍｅｒａ：ＭＲｍモノクロ・冷却機能付、対物レンズ×６０油浸）を用いて、蛍光顕微鏡観察（６００倍）を行い、蛍光の測定、蛍光画像（蛍光静止画像）および輝点数の計測を行った。
なお、Ｑ−ｄоｔには、Ｑ−ｄоｔ特有の現象であるブリンキング（明滅）が起こるために、蛍光顕微鏡観察で撮像したある瞬間（例えば１／６０秒）にすべてのＱ−ｄоｔが蛍光を発しているとは限らない。蛍光測定の仕方により蛍光強度が変わってしまうと、本来であれば共焦点顕微鏡を用いない蛍光顕微鏡のみで測定される蛍光が測定されない場合も起こりうる。１粒子のＱ−ｄоｔであれば、２０秒間の照射時間においてｏｆｆ−ｓｔａｔｅ（滅状態）は約４秒になる。そこで、上述のように励起光を照射した後に２００〜４００ミリ秒の分解能で１００枚の連続した蛍光静止画像を６９０ｎｍ〜７３０ｎｍのバンドパスフィルタを用いて取得し、蛍光動画像（２００〜４００ｍｓ／ｆｒａｍｅ×１００枚）を得たのち、蛍光動画像の全タイムラインを通して輝点数を計測した。この計測方法は、共焦点ユニットを用いた顕微鏡観察においても同様に行った。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、検体スライドの断面に対する深さ方向にピントを合わせていくことで、深い位置の輝点が確認された。
［参考例１］
〔ビオチン標識率１３．３％のＢＡＣプローブの調製〕
上述した実施例１と同様の手順で、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜蛍光色素とビオチン標識率１３．３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ＦＩＴＣ修飾ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１ｍｇフナコシ ＳＡ−５００１）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｂ）を得た。
＜ＤＮＡプローブの確認＞
このＤＮＡプローブの確認は、０．５％のＴＢＥを含む２％アガロースゲルで０．５％の変性バッファーＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のＤＮＡを、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によりカウンター染色した。そして、ＤＮＡの移動パターンを、「ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ ＦＸ Ｓｙｓｔｅｍ」(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)を使用して、以下のように決定した。
すなわち、泳動したゲルに存在するＦＩＴＣについては、波長４８８ｎｍのレーザー光の励起光と波長５３０ｎｍバンドパスのエミッションフィルターを用いて確認した。
また、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、ＦＩＴＣのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２００００であった。
〔その他の観察等〕
＜ＦＩＳＨ＞
実施例１と同様にＦＩＳＨを行った。
＜明視野観察＞
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡（カールツァイス社製「Ｉｍａｇｅｒ」）を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
＜共焦点蛍光顕微鏡観察＞
上記作製しＦＩＳＨを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（カールツァイスマイクロスコピー ＧｍｂＨ社製）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡプローブのＦＩＴＣを４８８ｎｍで励起し、ＦＩＴＣからの蛍光を測定波長５３０ｎｍで検出して、蛍光の測定、蛍光画像（蛍光静止画像）および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を５．９５μｍ、４．９５μｍ、および４．５μｍと変更してそれぞれ撮像を行った。
＜蛍光顕微鏡観察＞
蛍光顕微鏡観察は、実施例１と同様に行った。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において輝点が確認された。
［比較例１］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜蛍光粒子とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ/２５０μＬ)、ストレプトアビジンで表面が標識された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｃ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
［比較例２］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜蛍光色素とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ＦＩＴＣ修飾ストレプトアビジン（フナコシ社製「Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１ｍｇ、ＳＡ−５００１）」）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｄ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認におけるＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、ＦＩＴＣのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
［実施例２］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識でｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素３．４ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬとをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍＬを、４８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍＬの水、１．４ｍＬの２８％アンモニア水と３時間混合した。上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行なった。これらの操作により、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径５０ｎｍであった。
得られた蛍光体集積ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光体集積ナノ粒子を得た。
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合しＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素を内包した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（５０ｎｍ、シリカ粒子）とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、上記ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｅ）を得た。
〔その他の観察等］
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
［実施例３］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識でｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）２０．３ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．８１ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた蛍光体集積ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機（久保田商事株式会社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径２８０ｎｍであった。
得られた蛍光体集積ナノ粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）２μＬを加え、８時間反応させることにより、樹脂粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有したリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて、得られた蛍光体集積ナノ粒子の濃度を３ｎＭに調整した。濃度調整した蛍光体集積ナノ粒子の分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）12（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅоｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔeｒ、サーモサイエンティフィック社製）を混合し、２０℃１時間反応させて、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。
この混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による上記洗浄を３回行った。
（ストレプトアビジンの調製）
一方、ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）とＮ−スクシミジル Ｓアセチルチオ酢酸（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ、略称：ＳＡＴＡ）を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
（樹脂粒子とストレプトアビジンの結合）
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳ中で混合後、室温で１時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ＝０．６５μｍの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（２８０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ（核酸分子）２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｆ）を得た。
〔その他の観察等］
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
［実施例４］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識でｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
２８％アンモニア水の使用量を１．４ｍＬから２．６ｍＬに変更したこと以外は、実施例２と同様にして、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径３２０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（３２０ｎｍ、シリカ粒子）とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ（核酸分子）２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｇ）を得た。
〔その他の観察等］
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、上記ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
［参考例２］
〔ビオチン標識率９．６２％のＢＡＣプローブの調製〕
ＧＳＰ社から購入したＢＡＣプローブとしてのＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（ＣＥＮ１７ｑ１１．２／５２０ｋｂ、塩基数約５２０ｋｂｐ）１μｇ（５μＬ）に対して、ニックトランスレーション用のキット（製品名「ＧＳＰ−ニックトランスレーションキット」Ｋ−０１５、ＧＳＰ社製）のプロトコールに従い、ニックトランスレーション法により、実施例１と同様にＢＡＣプローブ（核酸分子）のｄＴＴＰをビオチン標識した。
＜蛍光色素とビオチン標識率９．６２％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ＦＩＴＣ修飾ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１ｍｇフナコシ ＳＡ−５００１））を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｈ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、ＦＩＴＣのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５００００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることで、深い位置の輝点が観察された。
［参考例３］
〔ビオチン標識率０．９６％のＢＡＣプローブの調製〕
ＧＳＰ社から購入したＢＡＣプローブとしてのＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（ＣＥＮ１７ｑ１１．２／５２０ｋｂ、塩基数約５２０ｋｂｐ）１μｇ（５μＬ）に対して、ニックトランスレーション用のキット（製品名「ＧＳＰ−ニックトランスレーションキット」Ｋ−０１５、ＧＳＰ社製）のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、ＢＡＣプローブ（核酸分子）のｄＴＴＰをビオチン標識した。
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識で、ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたＢＡＣプローブの溶液を得た。
＜蛍光色素とビオチン標識率０．９６％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブの調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ＦＩＴＣ修飾ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１ｍｇフナコシ ＳＡ−５００１））を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｉ）を得た。
〔その他の観察等］
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、ＦＩＴＣのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
［実施例５］
〔ビオチン標識率０．９６％のＢＡＣプローブの調製〕
ＧＳＰ社から購入したＢＡＣプローブとしてのＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（ＣＥＮ１７ｑ１１．２／５２０ｋｂ、塩基数約５２０ｋｂｐ）１μｇ（５μＬ）に対して、ニックトランスレーション用のキット（製品名「ＧＳＰ−ニックトランスレーションキット」Ｋ−０１５、ＧＳＰ社製）のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、ＢＡＣプローブ（核酸分子）のｄＴＴＰをビオチン標識した。
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識で、ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は実施例１と同様に、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたＢＡＣプローブの溶液を得た。
＜蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
実施例３の蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製で、ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を、１４．４ｍｇから５．２５ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．６５ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は同様にして蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。作製した粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。
得られた蛍光体集積ナノ粒子０．１ｍｇを用いて、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。また、洗浄等は実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／樹脂粒子とストレプトアビジンの結合＞
ストレプトアビジンの調製および樹脂粒子とストレプトアビジンの結合は、実施例３と同様に行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｊ）を得た。
〔その他の観察等］
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
《総合結果・考察》
Figure 0006978835
 表１に示したように、公知例、実施例１，参考例１では、高いビオチン標識率（１３．３３％）のプローブ試薬を用いているため、光学顕微鏡でも輝点を観察できたが、比較例１、比較例２では、低いビオチン標識率（１．３３％）のプローブ試薬を用いているため、共焦点顕微鏡では輝点観察できたものの、光学顕微鏡では輝点を観察できなかった。
これに対して、実施例２、実施例３のプローブ試薬によれば、低いビオチン標識率（１．３３％）であっても、共焦点顕微鏡だけでなく光学顕微鏡でも輝点を観察することができた。これは、蛍光体集積ナノ粒子１つの輝度が高いために、実施例２、実施例３は輝点を観察できたと考えられる。
なお、表１〜５の「標識体」とは、核酸分子と結合可能な蛍光体の分子（例えば、核酸分子がビオチン標識されているものであれば、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子）を意味する。
［比較例３］
〔ビオチン標識率１．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。
＜蛍光粒子とビオチン標識率１．３３％の上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ/２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｋ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２０００であった。
＜結果考察＞
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
［比較例４］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプライマー（フォワード：５'−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡ−３'、リバース：５'−ＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣ−３'）を作製した。
次に、上記プライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＴＲＧ細胞から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として逆転写反応することにより、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。なお、上記ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、「横浜医学，５６，１１１−１１９（２００５）」の方法ＩＶに記載のように、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒоｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＴＲＧ細胞から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡである。
得られたｃＤＮＡ１μｇを用いて、実施例１と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜蛍光粒子とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識した上記ｃＤＮＡ２５μＬ(終濃度１μｇ／２５０μＬ）、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ（５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）含む溶液を調製混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用の塩基数３００ｂｐのＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｌ）を得た。
＜ＤＮＡプローブの確認＞
このＤＮＡプローブの確認は、実施例１で０．５％のＴＢＥを含む２％アガロースゲルの代わりに０．５％のＴＢＥを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたこと以外は実施例１と同様にＤＮＡプローブの確認を行った。
〔その他の観察等〕
ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。この際に、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、それぞれ培養細胞ＭＣＦ７の染色像について輝点数を計測した。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
また、このときの輝点の計測は、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０（カールツァイスマイクロスコピー ＧｍｂＨ社製）に対物レンズ×６０（油侵）で撮影した画像そのもの（１６００ピクセル×１２００ピクセル）に含まれる細胞について行った。なお、培養細胞ＭＣＦ７は、ＨＥＲ２低発現として知られている細胞で、正常細胞とほぼ同等であり、したがって、ひとつの核に２つ輝点が見えるのが普通である。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２０個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
［実施例６］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプライマー（フォワード：５'−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡ−３'、リバース：５'−ＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣ−３'）を作製した。
次に、上記プライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＴＲＧ細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。なお、total RNAの抽出は比較例４と同様に行った。
得られたｃＤＮＡ１μｇを用いて、実施例１と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから５．２５ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（４０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジン修飾の蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｍ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、実施例６に係るプローブ試薬によれば、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例７］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様にして、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。このｃＤＮＡ１μｇを、実施例１でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡ溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１５８ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｎ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１９個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が２個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例７に係るプローブ試薬によれば、実施例２よりやや大径の平均粒子径１５８ｎｍであるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例８］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様にして、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００ｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。このｃＤＮＡ１μｇを、実施例１でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径２８０ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（２８０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｏ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。
なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例８に係るプローブ試薬によれば、実施例６，実施例７より大径の平均粒子径２８０ｎｍであるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例９］
〔ビオチン標識率１３．３３％のプローブの調製〕
実施例６と同様にして、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。このｃＤＮＡ１μｇを、実施例１でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから２１．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．８６ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径３２０ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（３２０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｐ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４３個、輝点数２の細胞が７個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４４個、輝点数２の細胞が６個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例９に係るプローブ試薬によれば、実施例６，実施例７および実施例７より大径の平均粒子径３２０ｎｍであるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例１０］
〔ビオチン標識率１．６７％のプローブの調製〕
実施例６と同様にして、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
このｃＤＮＡ１μｇを用いて、実施例１でのニックトランスレーションで、ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は実施例１と同様に、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識されたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
２８％アンモニア水の使用量を１．４ｍＬから２．０ｍＬに変更したこと以外は、実施例２と同様にＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１６０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１６０ｎｍ、シリカ粒子）とビオチン標識率１．６７％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｑ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１９個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が２個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２０個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１０に係るプローブ試薬によれば、ｃＤＮＡ：ビオチン（ｃＤＮＡ：蛍光体集積ナノ粒子）の結合モル比が非常に小さい１：５であるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例１１］
〔ビオチン標識率１．６７％のプローブの調製〕
実施例６と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
このｃＤＮＡ１μｇを用いて、実施例１でのニックトランスレーションで、ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は実施例１と同様に、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識されたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
２８％アンモニア水の使用量を１．４ｍＬから２．６ｍＬに変更したこと以外は、実施例２と同様にＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径３２０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（３２０ｎｍ、シリカ粒子）とビオチン標識率１．６７％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識した上記ｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｒ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４０個、輝点数２の細胞が１０個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４４個、輝点数２の細胞が６個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１１に係るプローブ試薬によれば、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができる。
［実施例１２］
〔ビオチン標識率０．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
比較例３と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有するＢＡＣクローンを用いて、ＮｉｃｋＴｒａｎｓｒａｔｉｏｎ反応を実施して、ＢＡＣプローブを作成した。ただし、比較例３と異なり、Ｂｉｏｔｉｎ−ｄ−ＵＴＰは添加せずに調製した。得られたＢＡＣクローン由来のＤＮＡ（核酸分子）に対して、以下のビオチン標識を行った。
＜５'末端のビオチン標識＞
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５'ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のようにＢＡＣクローン由来のＤＮＡの５'末端をビオチン標識した。
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・上記ＤＮＡ２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「Ｂｉｏｔｉｎ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（カタログ番号ＳＰ−１５０１）」を３１２μＬのＤＭＳＯに溶解させたものを、インキュベートした反応溶液に添加して混合した。この混合液を６５℃で３０分間（又は、室温で２時間）インキュベートした。
次に、インキュベートした混合液に対してヌクレアーゼフリーの水７０μＬと、平衡化したフェノール１００μＬを添加してボルテックスに数秒かけて混合した。上澄みの水の層を新しい遠心チューブに移した。この３Ｍの酢酸ナトリウムを５μＬと、９５％エタノールを２７０μＬ添加して混合した。これを１３０００×ｇで３０分間遠心し、生じた沈殿を７０％のエタノールでリンスして、さらに１３０００×ｇで３分間遠心した。沈殿を乾燥してＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に溶解させ、５'末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識されたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
２８％アンモニア水の使用量を１．４ｍＬから２．０ｍＬに変更したこと以外は、実施例２と同様にＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１６０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１６０ｎｍ、シリカ粒子）が上記ＤＮＡの５'末端に結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５'末端をビオチン標識したＢＡＣクローン由来のＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｓ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５０であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１９個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が２個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２５個、輝点数２の細胞が２４個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１２に係るプローブ試薬によれば、ＢＡＣクローン由来の上記ＤＮＡとビオチン（ＤＮＡ：蛍光体集積ナノ粒子）の結合モル比が１：５０であるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察において、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［比較例５］
〔ビオチン標識率６．６７Ｅ−３％のＢＡＣプローブの調製〕
実施例１と同じＧＳＰ社から購入したＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（約１５０ｋｂｐ）について実施例１２と同様に５'末端をビオチン標識した。
＜蛍光粒子と上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識したＢＡＣプローブ２５μＬ(濃度１μｇ/２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａｄ１）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：１であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１２個、輝点数２の細胞が１３個、輝点数３の細胞が１５個、輝点数４の細胞は１０個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
［比較例６］
〔ビオチン標識率０．３３％のプローブの調製〕
比較例４と同様にＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した後、実施例１２と同様に前記ｃＤＮＡの５'末端をビオチン標識した。
＜蛍光粒子と上記ＢＡＣプローブとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識したｃＤＮＡのプローブ２５μＬ(濃度１μｇ/２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径１５ｎｍのＱｄｏｔ（登録商標、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａｄ２）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例１と同様に行った。なお、ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Ｑ−ｄоｔのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＢＡＣプローブのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：１であった。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２７個、輝点数３の細胞が２個、輝点数４の細胞は０個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
［実施例１３］
〔ビオチン標識率６．６７Ｅ−３％のＢＡＣプローブの調製〕
実施例１と同じＧＳＰ社から購入したＨＥＲ２−ＤＮＡクローン（約１５０ｋｂｐ）について実施例１２と同様に５'末端をビオチン標識した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子を）の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
さらに、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ＨＥＲ−２ＤＮＡクローンとの直接結合（５'末端標識）＞
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５'ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の５'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・上記核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５'末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたＤＮＡ（プローブ試薬Ａｄ３）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、１：１であった。また、検体スライドとしてＨＥＲ２陽性染色対照標本の検体スライド（パソロジー研究所社製「ＨＥＲ２−ＦＩＳＨコントロールスライド Ｃｏｄｅ ＰＳ−０９００６」）を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２６個、輝点数３の細胞が９個、輝点数４の細胞は４個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
[実施例１４]
〔ビオチン標識率０．３３％のプローブの調製〕
比較例６でビオチン標識した塩基数３００の核酸分子を用いたこと以外は、実施例１３と同様にして蛍光体集積ナノ粒子で標識されたＤＮＡ（プローブ試薬Ａｄ４）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、１：１であった。また、検体スライドとしてＨＥＲ２陽性染色対照標本の検体スライド（パソロジー研究所社製「ＨＥＲ２−ＦＩＳＨコントロールスライド Ｃｏｄｅ ＰＳ−０９００６」）を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１９個、輝点数２の細胞が２８個、輝点数３の細胞が２個、輝点数４の細胞は１個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
Figure 0006978835
［実施例１５］
〔ビオチン標識率０．３３％の短鎖長のＤＮＡプローブの調製〕
実施例１０と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡ２μｇを、実施例１２と同様にして、５’末端がビオチンで標識されたｃＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識されたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の作製＞
２８％アンモニア水の使用量を１．４ｍＬから２．６ｍＬに変更したこと以外は、実施例２と同様にＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径３２０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いた蛍光体集積ナノ粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包シリカナノ粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（３２０ｎｍ、シリカ粒子）が核酸分子の５’末端に結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｔ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４０個、輝点数２の細胞が１０個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が４４個、輝点数２の細胞が６個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１５に係るプローブ試薬によれば、ＤＮＡと蛍光体集積ナノ粒子の結合モル比が１：１であり、平均粒子径３２０ｍと実施例１２より大径であるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察において、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。しかし、非特異的な検出が多くみられた。
［実施例１６］
〔ビオチン標識率５％の短鎖長のＤＮＡプローブの調製〕
プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（ＵＲＬ：http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）で、ヒト第１７番目の染色体の特定の領域（第３７８４４４００番目〜第３７８８５１０７番目）を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第37844479番目〜第37844696番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてＨＥＲ−２遺伝子関連の配列（５’−ＡＣＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧ−３’）の塩基数２０のＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したＤＮＡ４μｇを用いて、実施例１２と同様に、５’末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから５．２５ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（４０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率５％の上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識した上記ＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｕ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共え点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が１８個、輝点数２の細胞が３１個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２０個、輝点数２の細胞が３０個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１６に係るプローブ試薬によれば、２０塩基という非常に短い核酸分子であり、かつ、ＤＮＡ：ビオチン（ＤＮＡ：蛍光体集積ナノ粒子）の結合モル比が１：１であり輝点が検出できないと予測される条件であるのにもかかわらず、驚くべきことに、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例１７］
〔ビオチン標識率５％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例１６と同様に塩基数２０のＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを用いて、実施例１２と同様に、５’末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
スルホローダミン１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．６５ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジンで標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合＞
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１５８ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率５％の上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識した上記ＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｖ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２０個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が１個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２９個、輝点数２の細胞が２１個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１７に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例１６より大径であるが、実施例１６と同様、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
［実施例１８］
〔ビオチン標識率５％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例１６と同様に塩基数２０のＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
《５’末端のビオチン標識》
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを用いて、実施例１２と同様に、５’末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
《ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製》
実施例７と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径２８０ｎｍであった。また、実施例７と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例７と同様に行った。
（ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合）
一方、実施例７と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
《蛍光体集積ナノ粒子（２８０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率５％の上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製》
上述のように５’末端をビオチン標識した上記ＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｗ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２１個、輝点数２の細胞が２９個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数１の細胞が２０個、輝点数２の細胞が３０個、輝点数３の細胞が０個、輝点数４の細胞は０個であった。
すなわち、本実施例１８に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例１６，１７より大径であるが、実施例１６等と同様に、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
Figure 0006978835
［参考例４］
参考例１で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ１週間後、１か月後、２か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞（培養細胞ＳＫＢＲ３）の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核５０個に含まれる輝点数を計測し、核１個当たりの輝点数の平均値として算出したものである。
＜結果考察＞
染色後の平均輝点数は、染色直後では１８個、染色から１週間後では１５個、染色から１か月後では８個、染色から２箇月後では２個であった。すなわち、参考例１に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった（表４参照）。
［参考例５］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＢＡＣプローブの調製〕
上述した実施例１と同様の手順で、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識された塩基数１５万のＢＡＣプローブ（核酸分子）の溶液を得た。購入したストレプトアビジン化ＴＸＲ（フナコシ社製「Streptavidin, Texas Red Conjugate（製品番号SA-5006）」）を１．０μＬ(５０ｎｍｏｌ／５０μＬ)含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｘ）を得た。
＜ＤＮＡプローブの確認＞
このＤＮＡプローブの確認は、０．５％のＴＢＥを含む２％アガロースゲルで０．５％の変性バッファーＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のＤＮＡを、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によりカウンター染色した。そして、ＤＮＡの移動パターンを、「ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ ＦＸ Ｓｙｓｔｅｍ」(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)を使用して、以下のように決定した。
すなわち、泳動したゲルに存在するＴＸＲについては、波長５９０ｎｍのレーザー光の励起光と波長６１５ｎｍバンドパスのエミッションフィルターを用いて確認した。また、上記ＢＡＣプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、ＴＸＲのストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：２００００であった。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察で、輝点を観察することができた。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２０個、染色から１週間後では１５個、染色から１か月後では９個、染色から２箇月後では３個であった。
すなわち、参考例５に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった（表４参照）。
［実施例１９］
〔ビオチン標識率１．６７％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様にして、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。このｃＤＮＡに対して、蛍光体集積ナノ粒子を以下の方法で作製した上で直接結合させた。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから５．２５ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ｃＤＮＡとの直接結合＞
ルミプローブ社製「Ａｍｉｎｏ−１１−ｄＵＴＰ」１μＬと、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）とを混合してチオール基付加処理として５℃で１時間インキュベートして反応を行った後、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なＴｈｉｏｌ−１１−ｄＵＴＰ溶液を得た。
次に、末端にマレイミド基が付いた上記蛍光体集積ナノ粒子とＴｈｉｏｌ−１１−ｄＵＴＰ溶液とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、５℃で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去し、蛍光体集積ナノ粒子としてのｄＵＴＰ結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包メラミン樹脂粒子溶液１．０μＬを得た。
＜ニックトランスレーションによる標識方法＞
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・１０×ＮｉｃｋＢｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．２]、ＭｇＳＯ4、ＤＴＴ）
・・・２．５μＬ、
・ＢＳＡ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ）・・・１．５μＬ
・ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ）・・・５μＬ
・ｄＴＴＰ・・・１．５μＬ、
・ｄＵＴＰ結合Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素内包メラミン樹脂粒子・・０．２μＬ
・純水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）・・・３μＬ
・上記ｃＤＮＡ１μｇの水溶液・・・５μＬ
・ＤＮＡ ＰоｌｙｍｅｒａｓｅＩ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７．５]、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ｇｌｙｃｅｒоｌ）・・・１μＬ
・ＤＮａｓｅＩ・・・５μＬ
次に、１５℃で４時間反応させ、７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。反応後の遠心チューブに２５μＬの蒸留水を添加した。ビオチン標識済みのＢＡＣプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子と結合したｃＤＮＡ（プローブ試薬Ｙ）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、ｃＤＮＡと蛍光体集積ナノ粒子との結合モル比については、ＨＡＢＡ−アビジン法で確認することはできず、評価系がないが、実施例１０と同じ材料と反応条件で実施していることから１：５であると推定される。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２６個、染色から１週間後では２７個、染色から１か月後では２４個、染色から２箇月後では２４個であった。すなわち、実施例１９に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２０］
実施例８で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
染色後の平均輝点数は、染色直後では２５個、染色から１週間後では２５個、染色から１か月後では２６個、染色から２箇月後では２４個であった。すなわち、実施例２０に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２１］
実施例９で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
染色後の平均輝点数は、染色直後では１１個、染色から１週間後では１１個、染色から１か月後では１１個、染色から２箇月後では１０個であった。すなわち、実施例２１に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２２］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜ニックトランスレーションによるビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡ１μｇを、実施例１と同様にしてニックトランスレーションを行い、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＦＩＴＣ（コードＰ７６０１２ タカラバイオ社製）４．１ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．１５ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた蛍光体集積ナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機（久保田商事株式会社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られた蛍光体集積ナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径３５ｎｍであった。
得られた蛍光体集積ナノ粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）２μＬを加え、８時間反応させることにより、蛍光体集積ナノ粒子の樹脂粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有したリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて、得られた蛍光体集積ナノ粒子の濃度を３ｎＭに調整した。濃度調整した蛍光体集積ナノ粒子の分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）12（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅоｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔeｒ、サーモサイエンティフィック社製）を混合し、２０℃１時間反応させて、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。
この混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による上記洗浄を３回行った。
＜ストレプトアビジンの調製＞
一方、ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）とＮ−スクシミジル Ｓアセチルチオ酢酸（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ、略称：ＳＡＴＡ）を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
＜蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンの結合＞
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳ中で混合後、室温で１時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ＝０．６５μｍの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（３５ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｚ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ１週間後、１か月後、２か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞（培養細胞ＳＫＢＲ３）の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核５０個に含まれる輝点数を計測し、核１個当たりの輝点数の平均値として算出して得たものである。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では１５個、染色から１週間後では１６個、染色から１か月後では１５個、染色から２箇月後では１３個であった。すなわち、実施例２２に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２３］
〔ビオチン標識率１３．３３％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜ニックトランスレーションによるビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡのｃＤＮＡ１μｇを、実施例１と同様に、ニックトランスレーション法によりビオチン標識した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＦＩＴＣ（コードＰ７６０１２ タカラバイオ社製）の使用量を５．２５ｍｇ、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．２１ｇに変更したことを除いて、実施例２２と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２２と同様にストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ色素内包メラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（平均粒子径４０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識した上記ｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ１）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。
なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２６個、染色から１週間後では２５個、染色から１か月後では２６個、染色から２箇月後では２５個であった。
すなわち、実施例２３に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表３）。
［実施例２４］
〔ビオチン標識率１．６７％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
実施例１のニックトランスレーションによるビオチン標識で、ｄＴＴＰの使用量を０．５μＬから１．５μＬに変更し、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（製品番号１０９３０７０、Ｒｏｃｈｅ社製、５０ｎｍｏｌ／５０μＬ）の使用量を１．５μＬから０．２μＬに変更したこと以外は実施例１と同様に最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＦＩＴＣ（コード Ｐ７６０１２ タカラバイオ社製）の使用量を１４．４ｍｇ、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．６５ｇに変更したことを除いて、実施例２２と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２２と同様にストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ色素内包メラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（平均粒子径１５８ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１．６７％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識した上記ｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ２）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：５であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
（結果考察）
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２７個、染色から１週間後では２４個、染色から１か月後では２５個、染色から２箇月後では２５個であった。
すなわち、実施例２４に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表３参照）。
［実施例２５］
〔ビオチン標識率１３．３３％の短鎖長のＤＮＡプローブの調製〕
実施例６と同様に、ＨＥＲ２遺伝子関連の配列を有する塩基数３００のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
上記のように調製したｃＤＮＡ１μｇを、実施例１と同様に、ニックトランスレーション法によりビオチン標識した。最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたｃＤＮＡ溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＦＩＴＣ（コード Ｐ７６０１２ タカラバイオ社製）の使用量を２０．３ｍｇ、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇに変更したことを除いて、実施例２２と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径２８０ｎｍであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例２２と同様にマレイミド基が付いた蛍光色素内包粒子を得る一方で、実施例２２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２２と同様にストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ色素内包メラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（２８０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率１３．３３％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のようにビオチン標識した上記ｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ３）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
＜結果考察＞
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２４個、染色から１週間後では２４個、染色から１か月後では２２個、染色から２箇月後では２１個であった。すなわち、実施例２５に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表３参照）。
［実施例２６］
〔ビオチン標識率０．５％のＤＮＡプローブの調製〕
Ｂｉｅｎｋｏ Ｍ＿Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１３に記載の方法で、塩基数２００のＨＥＲ２−ＤＮＡクローンを作成した。すなわちデータベース検索によりＨＥＲ２選択的な配列を見つけ出し、Ｆｏｒｗｏｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＣＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧ−３’）およびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａａｇｔａｇａｇｇｃａｇｇｇａｇａｇｃｃ−３’）から塩基数２００のcＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡ２μｇを、実施例１２と同様にして処理することで、５’末端がビオチンで標識されたｃＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
（ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合）
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１５８ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率０．５％の上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識したｃＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ４）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
（結果考察）共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２７個、染色から１週間後では２７個、染色から１か月後では２５個、染色から２箇月後では２５個であった。すなわち、実施例２６に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２７］
〔ビオチン標識率５％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例１６と同様に塩基数２０のＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを、実施例１２と同様に、５’末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
（ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合）
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１５８ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率５％の上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上述のように５’末端をビオチン標識した上記ＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ５）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２６個、染色から１週間後では２５個、染色から１か月後では２６個、染色から２箇月後では２６個であった。すなわち、実施例２７に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった（表４参照）。
［実施例２８］
〔ビオチン標識率０．５％のＤＮＡプローブの調製〕
実施例２６と同様に、塩基数２００のcＤＮＡ（核酸分子）を作成した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
（粒子の調製）
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ｃＤＮＡの直接結合（５’末端標識）＞
上記のように調製したｃＤＮＡの核酸分子２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５’ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の５’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・ｃＤＮＡの核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたｃＤＮＡ（プローブ試薬Ａ６）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２４個、染色から１週間後では２４個、染色から１か月後では２４個、染色から２箇月後では２２個であった。すなわち、実施例２８に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった。
［実施例２９］
実施例２８で作成した５’末端がビオチン標識されたｃＤＮＡ（蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンと結合する前もの）を用いて、ＦＩＳＨにおいて、実施例１と同様にハイブリダイゼーションを行い、さらに、同実施例１２で作成したストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子５０μｇを反応系に加えて、ハイブリダイゼーション後の反応系内の上記ｃＤＮＡを蛍光標識した。それ以外は、実施例１２と同様にＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜色素退行評価＞
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例４と同様に色素退行評価を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では２６個、染色から１週間後では２５個、染色から１か月後では２４個、染色から２箇月後では２５個であった。すなわち、ハイブリダイゼーション後に蛍光体集積ナノ粒子を反応系に添加して、ハイブリダイゼーション後の反応系内で蛍光標識する方法をとっても、染色することが可能であり、また、同様に色素退行の防止効果が得られた（表４参照）。
Figure 0006978835
［実施例３０］
検体スライドとしてＨＥＲ陽性染色対照標本の検体スライド（パソロジー研究所社製「ＨＥＲ２−ＦＩＳＨコントロールスライド Ｃｏｄｅ ＰＳ−０９００６」）の代わりに、健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用い、実施例２４で得られたプローブ試薬でもって実施例２４と同様にＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜結果考察＞
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＨＥＲ２遺伝子が適正に検出された。
［実施例３１］
〔ビオチン標識率８．４６％のＤＮＡプローブ調製〕
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプライマーＡ（５'−ＴＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧ−３'）と、プライマーＢ（５'−ＴＣＧＣＡＣＴＴＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＧ−３'）を作製した（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６：１４３９−１４４４参照）。
次に、上記プライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＨＴ−２９細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、ＥＧＦＲ遺伝子関連の配列を有する塩基数４７３のｃＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
得られたｃＤＮＡ１μｇを用いて、実施例１と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度１μｇ／２５０μＬのビオチン標識されたＤＮＡの溶液を得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＦＩＴＣ（コード Ｐ７６０１２ タカラバイオ社製）の使用量を５．２５ｍｇ、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．２１ｇに変更したことを除いて、実施例２２と同様に蛍光色素ＦＩＴＣを内包したポリメラミン粒子を作製した。得られたポリメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたポリメラミン粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径４０ｎｍであった。
得られたポリメラミン粒子から実施例２と同様にマレイミド基が付いたポリメラミン粒子を得る一方で、実施例２と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例２と同様にストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ色素内包メラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（４０ｎｍ、メラミン粒子）とビオチン標識率８，４６％の上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上記のようにビオチン標識したＤＮＡ２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＥＧＦＲ検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ７）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。
なお、ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、１：４０であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜結果考察＞
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＥＧＦＲ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３２］
〔ビオチン標識率０．２１％のＤＮＡプローブ調製〕
ＥＧＦＲ遺伝子関連の配列を有する塩基数４７３のｃＤＮＡ（核酸分子）を実施例３１と同様に調製し、実施例３１と同様にＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎを実施した。ただし、Ｂｉｏｔｉｎ−ｄ−ＵＴＰは添加しないでＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎを行い、得られたＤＮＡに対して実施例１２と同様に５’末端をビオチン化した。
《ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製》
（粒子の調製）
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子を）の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
さらに、実施例１と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例１と同様に行った。
《蛍光体集積ナノ粒子と上記ＤＮＡとの直接結合》（５’末端標識）》
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５’ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の５’末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・ｃＤＮＡの核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたＤＮＡ（プローブ試薬Ａ８）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例２０と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、１：１であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３１と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果考察）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＥＧＦＲ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３３］
〔標識率０．５％のＤＮＡプローブの調製〕
遺伝子データベース「e！EnsemblASIA」（http://asia.ensembl.org/index.html）の検索で得られたＥＧＦＲの遺伝子配列番号（Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313）を、プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（ＵＲＬ：http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）で入力・検索して、Ｂｉｅｎｋｏ Ｍ＿Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１３に記載の方法に従いＥＧＦＲのプライマーペアを６１０組、見出した。
ＥＧＦＲ選択的な配列の中から、Ｆｏｒｗｏｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣ−３’）および Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＡＴＧＣＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡ−３’）のプライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＨＴ−２９細胞から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として逆転写反応することにより、ＥＧＦＲ遺伝子関連の配列を有する塩基数４７３ｂｐのcＤＮＡ（核酸分子）を作成した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例７と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子を）の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
さらに、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ｃＤＮＡとの直接結合》（５’末端標識）＞
上記のように調製したｃＤＮＡの核酸分子２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５’ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の５’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・ｃＤＮＡの核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたｃＤＮＡ（プローブ試薬Ａ８）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例４と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、約１：１であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＥＧＦＲ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３４］
＜ビオチン標識率５％のＤＮＡプローブの調製＞
プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（ＵＲＬ：http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）で、ヒト第７番目の染色体の特定の領域（第５５０８６７１４番目〜第５５３２４３１３番目）を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第５５０９１６７１番目〜第５５０９１８８０番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてＨＥＲ−２遺伝子関連の配列（５’−ＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧ−３’）の塩基数２０のＤＮＡ（核酸分子）を調製した。
上記のように調製したＤＮＡ４μｇを、実施例１２と同様にして、５’末端がビオチンで標識されたＤＮＡを得た。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例７と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
（ストレプトアビジンの調製／粒子とストレプトアビジンの結合）
一方、実施例３と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子（１５８ｎｍ、メラミン粒子）と上記ＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上記のようにビオチン標識したＤＮＡ溶液２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＥＧＦＲ検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ９）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例４と同様に行った。
なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＥＧＦＲ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３５］
〔標識率０．５％のＤＮＡプローブの調製〕
遺伝子データベース「e！EnsemblASIA」（http://asia.ensembl.org/index.html）の検索で得られたＲＥＴの遺伝子配列番号（Chromosome 10: 43584007- 43585055）を、プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）に入力・検索して、Ｂｉｅｎｋｏ Ｍ＿Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１３に記載の方法に従いＲＥＴのプライマーペアを１４６組、見出した。
検索して得られたＲＥＴ選択的な配列の組み合わせの中から、Ｆｏｒｗｏｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＧＣＴＴＧＧ−３’）および Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧ−３’）のプライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＨＴ−２９細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、ＲＥＴ遺伝子関連の配列を有する塩基数１０４８のcＤＮＡ（核酸分子）を作成した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡ４０μｇを、実施例１２と同様にして、５’末端がビオチンで標識されたｃＤＮＡを得た。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ｃＤＮＡとが結合したＤＮＡプローブ調製＞
上記のようにビオチン標識したｃＤＮＡの溶液２５μＬ(濃度１μｇ／２５０μＬ)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で３０分間結合反応を行い、ＲＥＴ検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ１０）を得た。
＜その他の観察等＞
なお、上記ｃＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ｃＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＲＥＴ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３６］
〔標識率０．４９％のＤＮＡプローブの調製〕
遺伝子データベース「e！EnsemblASIA」（http://asia.ensembl.org/index.html）の検索で得られたＭＥＴの遺伝子配列番号（Chromosome 7: 116,312,444-116,438,440）を、プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）に入力して、Ｂｉｅｎｋｏ Ｍ＿Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１３に記載の方法に従いｍｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ＭＥＴ（ＭＥＴ）のプライマーのペアを２９５組、見出した。
ＭＥＴに選択的な配列の中から、Ｆｏｒｗｏｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡ−３’）および Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴ−３’）のプライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＨＴ−２９細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、ＭＥＴ遺伝子関連の配列を有する塩基数２０５のｃＤＮＡ（核酸分子）を作成した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例３と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子との直接結合》（５’末端標識）＞
上記のように調製したｃＤＮＡの核酸分子２μｇから、実施例３４と同様にして得られた5'末端チオリン酸プローブと、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液とを反応して、５’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・ｃＤＮＡの核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
そのプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたｃＤＮＡ（プローブ試薬Ａ１１）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例４と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、ｃＤＮＡと蛍光体集積ナノ粒子との結合モル比については、5'末端にのみ標識されたので、約１：１であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＭＥＴ遺伝子が適正に検出された。
［実施例３７］
＜標識率０．４６％のＤＮＡプローブの調製＞
遺伝子データベース「e！EnsemblASIA」（http://asia.ensembl.org/index.html）の検索で得られたFＧＦＲ２の遺伝子配列番号（Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313）を、プローブ検索サイト「ＨＤ−ＦＩＳＨ」（http://www.hdfish.eu/Find#probes.php）に入力して、Ｂｉｅｎｋｏ Ｍ＿Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１３に記載の方法に従いＦＧＦＲ２のプライマーペアを２８０組、見出した。
ＦＧＦＲ２選択的な配列の中から、フォワードプライマー（５’−ＡＴＧＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣ−３’）および リバースプライマー（５’−ＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧ−３’）のプライマーのセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、および一般的な市販のＰＣＲ試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、ＨＴ−２９細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、ＭＥＴ遺伝子関連の配列を有する塩基数２１７のｃＤＮＡを作成した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
実施例７と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径２８０ｎｍであった。
また、実施例３と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例３と同様に行った。
＜５’末端のビオチン標識＞
上記のように調製したｃＤＮＡの核酸分子２μｇを、実施例１２と同様にして、５’末端がビオチンで標識された核酸分子を得た後、ＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ａ１２）を得た。
＜その他の観察等＞
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例３と同様に行った。なお、ＤＮＡプローブの確認において、ＨＡＢＡ−アビジン法を用いて確認したところ、約１：１であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３０と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＦＧＦＲ２遺伝子が適正に検出された
［実施例３８］
〔ビオチン標識率０．２１％のＤＮＡプローブ調製〕
ＥＧＦＲ遺伝子関連の配列を有する塩基数４７３のｃＤＮＡ（核酸分子）を実施例３１と同様に調製し、実施例３１と同様にＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎを実施した。ただし、Ｂｉｏｔｉｎ−ｄ−ＵＴＰは添加しないでＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎを行い、得られたＤＮＡに対して実施例１２と同様に５'末端をビオチン化した。
＜ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製＞
ＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）の使用量を２０．３ｍｇから１４．４ｍｇに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．８１ｇから０．２１ｇに変更したこと以外は、実施例７と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子（蛍光体集積ナノ粒子を）の作製を行った。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒子径１５８ｎｍであった。
さらに、実施例７と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例７と同様に行った。
＜蛍光体集積ナノ粒子と上記ＤＮＡとの直接結合》（５'末端標識）＞
上記のように調製したＤＮＡ２μｇを、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の「５'ＥｎｄＴａｇ（ＴＭ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、（カタログＮｏ．ＭＢ−９００１）」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の５'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・ｃＤＮＡの核酸分子２μｇ（／超純水８μＬ）
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・1μＬ
・アルカリフォスファターゼ・・・１μＬ
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。
・Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ・・・２μＬ
・ＡＴＰγＳ・・・１μＬ
・Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ・・・２μＬ
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、５'末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム（ＧＥヘルスケア社製「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎ」、製品番号「＃２７−５１２０−０１」）により精製した。
この溶液に対して、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を約５．５６μＬ、１００％エタノールを１５０μＬ添加し、−２０℃で１時間以上静置した。４℃で１６０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を形成した。さらに、７０％エタノールを５００μＬ添加して、４℃、１６０００ｒｐｍで１分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に５〜１０μＬの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたＤＮＡ（プローブ試薬Ａ８）の溶液（最終濃度１μｇ／２５０μＬ）を得た。
〔その他の観察等〕
ＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例３１と同様に行った。
なお、ＤＮＡプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、１：１であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ（ＵＳＢｉｏｍａｘ社製「ＦＤＡ ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ」製品番号ＦＤＡ９９９ｂ）を用いた。実施例３１と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
＜結果考察＞
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数２個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもＥＧＦＲ遺伝子が適正に検出された。
Figure 0006978835
［実施例３８］
実施例３で作製したプローブ試薬ＦのＦＩＳＨにおける終濃度を５μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３と同様にＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７７であった（表６）。
［実施例３９］
実施例３で作製したプローブ試薬ＦのＦＩＳＨにおける終濃度を１μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３と同様にＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７４であった（表６）。
［実施例４０］
実施例３で作製したプローブ試薬ＦのＦＩＳＨにおける終濃度を０．２μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３と同様にＤＮＡプローブの確認、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は６２であった（表６）。
［実施例４１］
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'-biotin-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3')とreverseプライマー(5'-aagtagaggcagggagagcc-3')とを用いて上記文献に従ってＰＣＲを行い、塩基数２１７のＤＮＡ断片を回収した。
上記ＰＣＲに得られた５’末端がビオチン標識されたＤＮＡ断片に対して、実施例１７で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン１０１内包メラミン樹脂粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を実施例１７と同様に結合させることにより、５’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｘ）を得た。
＜その他の観察等＞
比較例４と同様に上記ＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｘ）の確認を行い、作製したプローブ試薬ＸのＦＩＳＨにおける終濃度を１．０μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３８と同様に、ＦＩＳＨ、ＤＮＡプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７８であった（表６）。
［実施例４２］
実施例４１で作製したプローブ試薬ＸのＦＩＳＨにおける終濃度を０．２μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４１と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７７であった（表６）。
［実施例４３］
実施例４１で作製したプローブ試薬ＸのＦＩＳＨにおける終濃度を０．０４μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４１と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７８であった（表６）。
［実施例４４］
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'biotin-TGCTTCCaaccttggttttt)とreverseプライマー(TGCAAGTGCaatacctgctc)を用いて上記文献に従ってＰＣＲを行い、塩基数３３４７のＤＮＡ断片を回収した。
上記ＰＣＲに得られた５’末端がビオチン標識されたＤＮＡ断片に対して、実施例１７で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン１０１内包メラミン樹脂粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を実施例１７と同様に結合させることにより、５’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｙ）を得た。
＜その他の観察等＞
実施例１と同様に上記ＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｙ）の確認を行い、作製したプローブ試薬ＹのＦＩＳＨにおける終濃度を１．０μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３８と同様に、ＦＩＳＨ、ＤＮＡプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は８０であった（表６）。
［実施例４５］
実施例４４で作製したプローブ試薬ＹのＦＩＳＨにおける終濃度を０．２μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４４と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７７であった（表６）。
［実施例４６］
実施例４６で作製したプローブ試薬ＹのＦＩＳＨにおける終濃度を０．０４μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４４と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７９であった（表６）。
［実施例４７］
実施例１６と同様にして製造することにより、塩基数２０のＤＮＡ断片を得た後、ＤＮＡ断片の５’を実施例１６と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、５’末端がビオチン標識されたＤＮＡ断片に対して、実施例１７で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン１０１内包メラミン樹脂粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を実施例１７と同様に結合させることにより、５’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｚ）を得た。
＜その他の観察等＞
比較例４と同様に上記ＤＮＡプローブ（プローブ試薬Ｚ）の確認を行い、作製したプローブ試薬Ｚ−１のＦＩＳＨにおける終濃度を１．０μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３８と同様に、ＦＩＳＨ、ＤＮＡプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７３であった（表６）。
［実施例４８］
実施例４７で作製したプローブ試薬ＺのＦＩＳＨにおける終濃度を０．２μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４７と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７３であった（表６）。
［実施例４９］
実施例４７で作製したプローブ試薬ＺのＦＩＳＨにおける終濃度を０．０４μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例４７と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は７３であった（表６）。
［実施例５０］
実施例１６と同様にして製造することにより、塩基数２０のＤＮＡ断片を得た後、ＤＮＡ断片の５’を実施例１６と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、５’末端がビオチン標識されたＤＮＡ断片に対して、実施例１７で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン１０１内包メラミン樹脂粒子（蛍光体集積ナノ粒子）を実施例１７と同様に結合させることにより、５’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したＨＥＲ−２検出用のＤＮＡプローブ（プローブ試薬ＺＺ）を得た。
＜その他の観察等＞
実施例２７と同様に上記ＤＮＡプローブ（プローブ試薬ＺＺ）の確認を行い、作製したプローブ試薬ＺＺ−１のＦＩＳＨにおける終濃度を１．０μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例３８と同様に、ＦＩＳＨ、ＤＮＡプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記ＤＮＡとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにＨＡＢＡを結合させた状態で、該ＨＡＢＡを上記ＤＮＡのビオチンで置換させるＨＡＢＡ−アビジン法を使用して行った結果、約１：１であった。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は６２であった（表６）。
［実施例５１］
実施例５０で作製したプローブ試薬ＺＺのＦＩＳＨにおける終濃度を０．２μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例５０と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は６０であった（表６）。
［実施例５２］
実施例５０で作製したプローブ試薬ＺＺのＦＩＳＨにおける終濃度を０．０４μｇ／μＬにしたこと以外は、実施例５０と同様に、ＤＮＡプローブの保存、ＦＩＳＨ、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
（結果）
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は４８であった（表６）。
Figure 0006978835
以上、本発明について実施の形態おび実施例に基づき詳細に説明してきたが、本発明は特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限り設計変更は許容される。

Claims (10)

  1. 塩基数５０００以下の所定の核酸配列を有する核酸分子１分子に、複数の蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子が複数結合した、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬であって、前記蛍光体集積ナノ粒子が、樹脂を母材とする樹脂粒子である、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
  2. 前記核酸分子中の特定の塩基に前記蛍光体集積ナノ粒子が直接結合している、請求項１に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
  3. 前記核酸分子中の特定の塩基に前記蛍光体集積ナノ粒子が共有結合を介して直接結合している、請求項２に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
  4. 前記核酸分子中における末端以外の特定の塩基に前記蛍光体集積ナノ粒子が間接的に結合している、請求項１に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
  5. ニックトランスレーションにより、前記核酸分子に含まれる複数の特定の塩基に前記蛍光体集積ナノ粒子が複数結合した、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
  6. 染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基配列を有し、前記塩基配列が塩基数５０００以下である核酸分子であって、当該塩基配列の末端以外の１〜５０ヵ所に第１の生体分子が連結された核酸分子と、
    前記第１の生体分子と特異的に結合可能な、第２の生体分子が連結された樹脂を母材とする樹脂粒子である蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有する、ＦＩＳＨ用のプローブ試薬のキット。
  7. 前記第１の生体分子がビオチンであり、前記第２の生体分子がストレプトアビジンである、請求項６に記載のキット。
  8. 前記第１の生体分子がストレプトアビジンであり、前記第２の生体分子がビオチンである、請求項６に記載のキット。
  9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬または請求項６〜８のいずれか一項に記載のキットを用いるＦＩＳＨ法。
  10. 塩基数５０００以下の所定の核酸配列の核酸分子１モルに対して、蛍光体集積ナノ粒子が２００００モル以上結合していることを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬であって、
    前記蛍光体集積ナノ粒子が樹脂を母材とする樹脂粒子である、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。

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