JP6983907B2 - 奇形腫の形成が抑制された多分化能性幹細胞由来の神経前駆体球の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、多分化能性幹細胞から奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球の製造方法に関する。

多分化能性幹細胞は、未分化状態を維持しながら、無限に増殖することができ、一定の環境と条件で特定の機能と形態に分化することができる細胞である。ヒト多分化能性幹細胞は、適宜の培養条件で無限増殖（自己複製；ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、個体をなす様々な種類の細胞に分化することができる。したがって、個体の生成、分化及び成長についての基礎知識の理解と個体の損傷又は疾病の治療のための治療剤の開発など、さまざまな側面から、これを対象とした研究が行われている。

多分化能性幹細胞の一つである胚性幹細胞も同様に細胞分裂が停止された分化した細胞とは異なり、自己複製して、自分と同じ細胞を無限に生成することができ、さまざまな環境や刺激によって、我々の体のすべての機能細胞に分化することができる多分化能を有している。したがって、細胞または臓器が損傷されると、胚性幹細胞を、その特定の細胞に分化させて使用することができるので、胚性幹細胞を用いた治療法は、いくつかの難治性疾患の根本的な治療方法として浮上している。

ヒト誘導多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もまた多分化能性幹細胞の一種として、分化が終了した細胞を遺伝子組み換えや細胞外因子を用いたリプログラミング過程を通じて多分化能を有するように逆分化した細胞を指す。ｉＰＳＣも同様に、胚性幹細胞と同様に自己複製することができ、身体のすべてのタイプの細胞に分化することができる。今日まで誘導多分化能性幹細胞は、遺伝子の発現と分化能において、多分化能性幹細胞である胚性幹細胞とほぼ同一の性質を示す。

神経前駆細胞を含むヒト多分化能性幹細胞から分化された特定の分化細胞は、特定の分化細胞で発現される、それぞれの固有の表面マーカー（ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ）を用いて、フローサイトメトリー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）、または磁性を用いた分離法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）で分離することができる。しかし、ＭＡＣＳの場合、回収率が高くなく、かつ純度が比較的低く、場合によっては磁性物質による変形をもたらすことができる。また、ＦＡＣＳの場合、レーザによって細胞が損傷し得る欠点を有する。また、多分化能性幹細胞由来の分化細胞を分離しようとするとき、ＭＡＣＳ及びＦＡＣＳの両方、未分化された多分化能性幹細胞が混在する可能性があるため、１００％の純度で分化された細胞のみを分離することは、技術的な限界がある。したがって、多分化能性幹細胞を用いて開発された細胞治療剤で、奇形腫が形成される可能性を排除することができない。したがって、分化した細胞には影響を与えずに、かつ奇形腫が発生する危険性をもたらす未分化多分化能性細胞を分化された細胞群から選択的に除去する技術の開発が多分化能性幹細胞由来の細胞治療剤の臨床化及び商業化に不可欠に要求されている。

また、逆選択分離方法（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）でヒト多分化能性幹細胞の転写因子であるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ−２などの細胞表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４などの抗体が分化細胞群から多分化能性幹細胞を分離及び除去することに用いられている。しかし、前記因子またはマーカーはほとんどが炭水化物エピトープを有するか、或いはその機能がヒト多分化能性幹細胞の自己複製や多分化能の維持に不可欠ではないと報告されており、未分化多分化能性幹細胞のみを正確に選択的に分離すると保証することができない。また、遺伝子操作により特定の時期の未分化細胞を自然死させる方法などもあるが、このような遺伝子操作方法は、効率が悪く、安全性が検証されなかった欠点がある。

ここに、本発明者等は、多分化能性幹細胞由来の神経前駆細胞の製造において、奇形腫が形成されることを抑制できる方法を見出すために研究していたところ、本発明の奇形腫抑制方法が培養過程において、未分化の多分化能性幹細胞を自然に除去し、奇形腫が発生する可能性を遮断することを確認することによって本発明を完成した。

本発明の目的は、奇形腫の形成が抑制された多分化能性幹細胞由来の神経前駆体球の製造方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、神経前駆体球を単一細胞化する段階と、前記単一細胞化された神経前駆細胞を自発的に再凝集させる段階と、及び前記再凝集された神経前駆体球を回収する段階と、を含む奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球の製造方法を提供する。
また、本発明は、前記の方法で製造された神経前駆体球を提供する。
さらに、本発明は、前記の神経前駆体球を分化させる段階と、を含む、神経細胞の分化方法を提供する。

本発明に係る神経前駆体球の製造方法は、製造された神経前駆細胞の純度を向上させ、奇形腫の形成を抑制するだけでなく、細胞の生存率及び回収率を増加させる。

本発明に係る神経前駆体球の製造方法（Ｂ）と従来の方法（Ａ）とを比較した図である。 神経前駆体球の神経細胞への分化能を神経細胞マーカーの発現有無により確認した図である。 神経前駆体球から神経前駆細胞のマーカーの発現有無を免疫染色で確認した図である。 神経前駆体球を一般的な方法である酵素を処理して単一細胞化した細胞（Ａ）及び切片化した後、付着培養し、酵素処理した細胞の（Ｂ）の生存率を確認したグラフである。 神経前駆体球が単一細胞化した後、自発的に凝集する間、シャーレに現れる凝集物の性状及び大きさの変化を示す図である。 未分化の多分化能性幹細胞マーカー（Ａ）及び神経前駆細胞マーカー（Ｂ）の発現を、胚神経前駆体球（ＳＮＭ）及び再凝集された神経前駆体球（Ｒｅｆｏｒｍ）からフローサイトメトリー分析により確認したグラフである。 再凝集された神経前駆体球から未分化マーカー及び神経前駆細胞マーカーの発現有無をＲＴ−ＰＣＲで確認した図である。 再凝集された神経前駆体球の分化能が維持されるか否かを免疫組織学的染色で確認した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、１）神経前駆体球を単一細胞化する段階と、２）前記の段階１）の単一細胞化された神経前駆体球を再凝集させる段階と、及び３）前記の段階２）の再凝集された神経前駆体球を回収する段階と、を含む奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球の製造方法を提供する。本発明に係る製造方法は、図１のＢに、従来の製造方法は、図１のＡに簡略に示した。
本明細書にて用いられる用語、「神経前駆体球」とは、ヒト胚性幹細胞または誘導多分化能性幹細胞のような多分化能性幹細胞から作られた神経前駆細胞または神経組織から分離された神経前駆細胞が球状に凝集されたものを意味する。

前記の製造方法において、細胞の培養用培地としては、Ｎ−２添加剤、ｂＦＧＦまたはこれらの混合物が添加された培地を用いることができる。

本明細書にて用いられる用語、「Ｎ−２添加剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」は、Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ’ｓ Ｎ−１ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎに基づいて化学的に定義された無血清サプリメントとして、末梢神経系と中枢神経系の一次培養分裂後、神経細胞及び神経芽細胞腫の成長と発現のためにｂＦＧＦ及びＥＧＦなどの成長因子が補充された培養用培地に一緒に添加して用いることができる。

前記Ｎ−２添加剤は、神経前駆細胞の培養用培地の総体積に対して０．５〜２．０％（ｖ／ｖ）、より具体的には、１．０〜１．５％（ｖ／ｖ）で添加されることができる。前記Ｎ−２添加剤の添加量が０．５％（ｖ／ｖ）未満であれば、細胞の成長効率が低下することができ、２．０％（ｖ／ｖ）を超えると、過剰な栄養による増殖により、細胞培養の維持に問題が生じ得る。本発明の一実施例によれば、前記Ｎ−２添加剤の添加量は、神経前駆細胞の培養用培地の総体積に対して１％（ｖ／ｖ）であることができる。

本明細書にて用いられる用語、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、通常の繊維芽細胞及び確立された細胞株の両方に対する強力な分裂刺激因子を意味する。前記ｂＦＧＦは細胞の移動、新たな血管の形成、神経細胞の維持、内分泌機能の調節、特定の細胞性タンパク質の発現、細胞外基質の生産及び細胞の生存の促進などの機能を有することができる。

前記ｂＦＧＦは、神経前駆細胞の培養用培地の総質量に対し、０．０００２〜０．００１％（ｗ／ｖ）、より具体的には、０．０００６〜０．０００８％（ｗ／ｖ）で添加されることができる。前記ｂＦＧＦの添加量が０．０００２％（ｗ／ｖ）未満であれば、細胞の成長及び分裂の効率が低下することがあり、０．００１％（ｗ／ｖ）を超えると、過剰な増殖により細胞の培養に問題が生じることがある。本発明の一実施例によれば、前記ｂＦＧＦの添加量は、神経前駆細胞の培養用培地の総質量に対して、０．０００６３％（ｗ／ｖ）であってもよい。

前記の段階１）及び段階３）の培養は、基質がコーティングされたシャーレで実行することができる。該基質は、ラミニン、Ｌ−オルチニン、マートリゲル及びＣｅＬＬｓｔａｒｔからなる群から選択されるいずれか一つ以上であってもよい。本発明の一実施例において、前記基質は、マートリゲルであっても良い。

神経前駆体球を再凝集させるためには、神経前駆体球同士の凝集力が、神経前駆体球がシャーレに付着しようとする力より強くなければならない。したがって、段階１）及び３）とは違って、段階２）では、基質がコーティングされていないシャーレを使用することにより、神経前駆体球同士の凝集を誘導することができる。前記の段階１）の単一細胞化は、微細切片ツールを用いて、神経前駆体球を切片化することを含むことができる。このとき、細胞分離酵素を使用して切片化する場合には、細胞の損傷が多く回収率が少ないので、物理的な方法を使用することができる。切片化のためのツールとしては、解剖顕微鏡下で、直径５００μｍ以下の凝集物を切ることができるツールであれば、すべて使用が可能であり、具体的には、ガラスパスツールピペットを細く引き伸したもの、直径１００μｍ以下の金属線及びマイクロメートル（μｍ）の大きさの孔を有する金属網目などを使用することができる。本発明の一実施例によれば、前記切片化は、ガラスパスツールピペットを細く引き伸したものを利用して行うことができる。

また、前記切片化された神経前駆球は、細胞分離用酵素として、トリプシン−ＥＤＴＡ、ｄｉｓｐａｓｅ、アクターゼ及びコラゲナーゼなどのように通常の技術分野においてよく知られている酵素を利用して単一化することができる。本発明の一実施例によれば、アクターゼを使用することができる。

前記の段階２）の培養は、基質がコーティングされていないシャーレで行うことができる。また、基質がコーティングされているシャーレで培養すると、固定された神経前駆細胞が神経細胞に分化することができる。しかし、基質がコーティングされていないシャーレを使用すると、神経細胞への分化が起こらない、かつ神経前駆細胞の自発的な移動が可能となり、神経前駆細胞同士の再凝集が可能となる。

前記の段階３）の再凝集された神経前駆体球は、直径１０〜８０μｍ、具体的には、２０〜６０μｍの大きさであってもよい。本発明の一実施例によれば、前記神経前駆体球は、直径２０〜５０μｍの大きさであってもよい。前記再凝集された神経前駆体球は、その直径が約１０〜８０μｍのとき、ピベッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）でシャーレの底から剥がして継代することができる。このとき、継代は、４８時間の間隔で培養培地を交換し、浮遊培養されるものであってもよい。

神経前駆体球を底から剥がす際、凝集されずに底に残っている神経前駆細胞まで一緒に剥離することができる。一方、底に沈まずに浮遊した神経前駆細胞は、培地を交換する際に一緒に除去することができる。神経前駆体球は、シャーレと、または神経前駆体同士、継続して付着する性質がある。したがって、再凝集された神経前駆体球を６〜１２時間の間隔でシャーレの底から剥がす過程が繰り返されることができる。これにより、神経前駆体球間の過剰な結合を事前に防止することができる。浮遊培養中、新たに形成された神経前駆体球は、球状に形態を形成しながら増殖するが、目的に合った大きさの場合、回収して使用することができる。

本発明の具体的な実施例において、本発明者等は、本発明の神経前駆体球が神経前駆細胞マーカーだけでなく、神経細胞に分化したとき、神経細胞マーカーが発現されることが確認された（図２及び３を参照）。また、神経前駆体球を切片化した後、単一細胞化させたとき、神経前駆体球が細胞の生存率及び回収率が大幅に増加し（図４参照）、再凝集された神経前駆体球から未分化多分化能性幹細胞マーカーは、ほとんど発現されなかった。一方、再凝集された神経前駆体球から神経前駆細胞マーカーが強く発現することが確認された（図６参照）。また、再凝集された神経前駆体球からは未分化マーカーは発現されなかったが、神経前駆細胞マーカーが発現することが確認された（図７参照）。また、付着培養された神経前駆体球から神経細胞マーカーが発現することを免疫組織学的染色で確認した（図８参照）。

したがって、本発明の神経前駆体球の製造方法は、奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球を製造することに有用に利用することができる。

また、本発明は、本発明の方法で製造された神経前駆体球を提供する。
前記神経前駆体球は、上述したような製造方法によって製造することができる。具体的には、前記の方法は、１）神経前駆体球を単一細胞化する段階と、２）前記の段階１）の単一細胞化された神経前駆体球を再凝集させる段階と、及び３）前記の段階２）の再凝集された神経前駆体球を回収する段階と、を含むことができる。

前記製造方法において、細胞の培養用培地としては、Ｎ−２添加剤、ｂＦＧＦまたはこれらの混合物が添加された培地を使用することができる。前記Ｎ−２添加剤は、神経前駆細胞の培養用培地の総体積に対して、０．５〜２．０％（ｖ／ｖ）、より具体的には、１．０〜１．５％（ｖ／ｖ）で添加することができる。本発明の一実施例によれば、前記Ｎ−２添加剤の添加量は、神経前駆細胞の培養用培地の総体積に対して、１％（ｖ／ｖ）であってもよい。また、前記ｂＦＧＦは、神経前駆細胞の培養用培地の総質量に対して、０．０００２〜０．００１％（ｗ／ｖ）、より具体的には、０．０００６〜０．０００８％（ｗ／ｖ）添加することができる。本発明の一実施例によれば、前記ｂＦＧＦの添加量は、神経前駆細胞の培養用培地の総質量に対して、０．０００６３％（ｗ／ｖ）であることができる。

前記の段階１）及び段階３）の培養は、基質がコーティングされたシャーレで行うことができ、前記基質は、ラミニン、Ｌ−オルチニン、マートリゲル及びＣｅＬＬｓｔａｒｔからなる群から選択されるいずれか一つ以上とすることができる。本発明の一実施例において、前記基質は、マートリゲルとすることができる。

前記の段階２）においては、基質がコーティングされていないシャーレを使用することにより、神経前駆体球同士の凝集を誘導することができる。基質がコーティングされていないシャーレを使用すると、神経細胞への分化が起こらず、かつ神経前駆細胞の自発的な移動が可能であり、神経前駆細胞同士の再凝集が可能となる。また、前記の段階１）の単一細胞化は、微細切片ツールを用いて、神経前駆体球を切片化することを含むことができる。このとき、細胞分離酵素を用いて切片化した場合には、細胞の損傷が多く回収率が低いので、物理的な方法を用いることができる。切片化のためのツールとしては、解剖顕微鏡下で、直径５００μｍ以下の凝集物を切ることができるツールであれば、すべての使用が可能であり、具体的には、ガラスパスツールピペットを細く引き伸ばしたもの、直径１００μｍ以下の金属線及びマイクロメートル（μｍ）サイズの孔を有する金属網目などを使用することができる。本発明の一実施例によれば、前記切片化は、ガラスパスツールピペットを細く引き伸ばしたものを用いて行うことができる。

また、前記切片化された神経前駆体球は、細胞分離用酵素として、トリプシン−ＥＤＴＡ、ｄｉｓｐａｓｅ、アクターゼ及びコラゲナーゼなどのように通常の技術分野においてよく知られている酵素を利用して単一化することができる。本発明の一実施例によれば、アクターゼを使用することができる。併せて、前記の段階３）の再凝集された神経前駆体球は、直径１０〜８０μｍ、具体的には、２０〜６０μｍの大きさであってもよい。本発明の一実施例によれば、前記神経前駆体球は、直径２０〜５０μｍの大きさであってもよい。

本発明の具体的な実施例において、本発明者等は、神経前駆体球を単一細胞化し、単一細胞化された神経前駆体球を基質がコーティングされていない培地で培養することにより、奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球を製造した。

また、前記製造された神経前駆体球が神経前駆細胞のマーカーだけでなく、神経細胞に分化されたとき、神経細胞マーカーを発現することを確認した（図２及び３を参照）。また、切片化した神経前駆体球を単一細胞化したとき、神経前駆体球の細胞生存率及び回収率が増加し（図４参照）、再凝集された神経前駆体球から未分化多分化能性幹細胞マーカーは、ほとんど発現されなかった。一方、再凝集された神経前駆体球から神経前駆細胞マーカーは、強く発現することが確認された（図６参照）。また、再凝集された神経前駆体球から未分化マーカーは発現されず、神経前駆細胞マーカーが発現することが確認された（図７参照）。

さらに、本発明は、前記の神経前駆体球を分化させることを含む神経細胞の分化方法を提供する。
前記神経前駆体球は、上述したような特徴を含むことができる。また、前記の分化において、ｂＦＧＦの代わりに添加されるＢ２７は、全分化用培地の１〜３％（ｖ／ｖ）、より具体的には、１．５％〜２．５％（ｖ／ｖ）の量で添加されることができる。前記Ｂ２７の添加量が１％（ｖ／ｖ）未満であれば、細胞の分化効率が低下することができ、３％（ｖ／ｖ）を超えると、過剰な分化及び増殖により細胞培養の維持に問題が生じることがある。本発明の一実施例によれば、前記Ｂ２７の添加量は、２％（ｖ／ｖ）であってもよい。

前記の神経前駆体球は、直径４００〜６００μｍで継代することができる。前記神経前駆体球の直径が４００μｍ未満で継代された場合、神経前駆体球の増殖が遅延することができ、６００μｍ以上で継代された場合には、栄養の供給が円滑でなくなり、神経前駆体球の中の細胞が死滅することもある。本発明の一実施例によれば、前記再凝集された神経前駆体球の直径が５００μｍになると、これを再び切片化して継代培養し、又は冷凍保存することができる。

本発明の具体的な一実施例において、本発明者等は、再凝集された神経前駆体球を神経細胞の分化条件に合わせて、神経分化した基質がコーティングされているシャーレとｂＦＧＦを除去し、Ｂ２７を添加した培地を用いて、神経細胞に分化させた。前記分化した細胞から神経細胞マーカーが発現することを免疫組織学的染色で確認した（図８参照）。

以下、本発明を下記の実施例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容がこれらによって限定されるものではない。

＜実施例１＞神経前駆細胞の培養準備
本発明に係る多分化能性幹細胞から形成された神経前駆体球の切片から神経前駆体球の再形成過程を通して神経前駆細胞のみを純粋に分離した。

＜１−１＞神経前駆細胞を培養するための培地の製造
まず、神経前駆細胞の基礎培地は、４９０ｍｌのＤＭＥＭ（Ｆ１２）に５ｍｌの０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）と５ｍｌの２ｍＭ Ｐ／Ｓ（ｐｅｎｉｃillｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加して製造した。製造された培地をよく混ぜた後、０．２２μｍのポアサイズを有するフィルタを用いて、真空ポンプで濾過し、これを５０ｍｌのチューブに４９ｍｌずつ分注した。前記チューブをパラフィンフィルムで密封し、４℃で保管した。培地の量が１２ｍｌ未満であれば、１５ｍｌチューブに、１２ｍｌ以上であれば、５０ｍｌチューブに入れて保管した。

一方、神経前駆細胞の培養用培地は、４９．５ｍｌの前記製造した基礎培地に０．５ｍｌの１％Ｎ−２添加剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）と０．４ｍｌの８０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を添加して製造した。

＜１−２＞神経前駆細胞を培養するための皿の準備
神経前駆細胞を培養するための皿の大きさは、神経前駆体球の数に応じて決まる。本実施例では、直径３５ｍｍのシャーレ当たり、切片化された１０個の神経前駆体球を用いた（１凝集物／ｃｍ^２）。シャーレは使用する前に、１ｍｌに対し２０倍希釈されたマトリゲルを入れて、１時間以上、常温保管して用いた。

＜実施例２＞神経前駆体球の確認
＜２−１＞神経前駆体球の神経細胞への分化能を確認
まず、実験に用いられる神経前駆体球を免疫染色して、前記細胞が神経細胞への分化能があることを確認した。

神経前駆体球は、ヒト胚性幹細胞株（ＳＮＵｈＥＳ３）及び誘導多分化能性幹細胞株（Ｆ５ ｉＰＳ、Ｙ２−３ ｉＰＳ）から、以下のように製造された。７日間培養して増殖されたヒト胚性幹細胞株（ＳＮＵｈＥＳ３）及び誘導多分化能性幹細胞株（Ｆ５ ｉＰＳ、Ｙ２−３ ｉＰＳ）を２００〜３００個の細胞を有する塊になるように機械的に分割した後、これを再び支持細胞上で、それぞれ培養した。次に、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IV；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を３７℃で４０分間処理し、幹細胞コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を剥がした後、これらを微生物培養用シャーレに入れ、ｂＦＧＦを除去した幹細胞培養培地で７〜２１日間、浮遊培養して 胚様体 （Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ、ＥＢ）を製造した。胚様体の中、包嚢形態の嚢胞性胚様体 （ｃｙｓｔｉｃ ＥＢ）を除去した後、残りの胚様体をマートリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ^(R)； ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）が施されたシャーレに付着した後、１ＸＮ−２添加剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）が添加された幹細胞の培養培地で５日間培養して、神経前駆体球を選択的に製造した。

また、免疫染色実験のために、神経前駆体球をガラスパスツールピペットを細く引き伸ばしたツールを利用して、切片化した後、分化した基質をコーティングされたガラスカバーグラスに付着して培養した。培養用培地は、Ｎ２とＢ２７が添加された神経細胞分化用培地を用いた。２週間培養した後、神経細胞マーカーであるｂｅｔａＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎｅ（ｂIII−ｔｕｂ）と、分化された神経細胞の芽細胞群のドーパミン神経細胞マーカーであるｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）を発現する細胞が観察されることを確認した。試料は、３％のホルマリン溶液に２０分間処理した後、リン酸緩衝液に保管した。抗体を処理する前に、試料は、一日ブロッキング溶液（２％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）で処理し、１次抗体に１２時間、２次抗体に１時間反応させ、ＤＡＰＩを含む蛍光保存用溶液に封印した後、共焦点蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）で観察した。このとき、免疫学的染色のためにｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＴＨ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を１次抗体として使用し、２次抗体としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ −ｍｏｕｓｅ ＩｇＧと、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）を用いた。

その結果、図２に示すように、神経前駆体球から、ドーパミン神経細胞マーカーであるＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）及び神経細胞マーカーであるｂIII−ｔｕｂ（ｂｅｔａ ３ ｔｕｂｕｌｉｎｅ）が発現された（図２）。

＜２−２＞神経前駆体球の神経前駆細胞マーカーの発現を確認
また、前記神経前駆体球が神経前駆細胞マーカーを発現するかどうかを免疫染色で確認した。神経前駆体球は、凍結切片化した後、カバーガラスに付着して免疫染色し、免疫染色方法は、前記実施例＜２−１＞と同様の条件及び方法で行われた。このとき、免疫学的染色のためにｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｍｕｓａｓｈｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｓｏｘ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｎｅｓｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ｐａｘ６ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を１次抗体として使用し、２次抗体としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）を用いて実験を行った。

その結果、図３に示すように、神経前駆体球から神経前駆細胞マーカーであるネスチン、ムサシとＰａｘ６が発現された（図３）。

＜実施例３＞神経前駆体球の製造
＜３−１＞神経前駆体球の切片化（ｓｃｈｉｚｏｌｙｓｉｓ）
まず、神経前駆体球を１００μｍ^３の体積を超えない大きさに、微細切片ツールを用いて切片化した。具体的には、ガラスパスツールピペット（ｐｉｐｅｔｔｅ）を細く引き伸ばしたものを使用して、神経前駆体球を切片化した。切片化された神経前駆体球は、＜実施例１＞の神経前駆細胞の培養用培地及びマートリゲルコーティングされたシャーレを使用して、３７℃、５％のＣＯ_２の条件で１２時間の間、付着培養した。

＜３−２＞切片化された神経前駆体球の単一細胞化及び細胞生存率を確認
切片化された神経前駆体球の単一細胞化
切片化された神経前駆体球を次のような方法で単一細胞化させた。
まず、＜３−１＞で培養された神経前駆体球の培地を除去し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で軽く洗浄した。ＰＢＳを除去し、０．２ｍｌ／ｃｍ^２のアクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）を添加した後、３７℃、５％のＣＯ_２の条件で４０〜６０分間反応させ、付着された神経前駆体球の切片を、単一細胞化させた。これらを遠心分離して集めた後、アクターゼを除去し、神経前駆細胞の培養用培地で洗浄し、１ｍｌの培養用培地を入れた後、計数した。

単一細胞化の過程の変化に伴う細胞生存率の増加を確認
次に、神経前駆体球を切片化し、単一細胞化させることが、細胞の生存率及び回収率に影響を与えるか確認した。

具体的には、単一細胞化された細胞を１日付着培養し、再び単一細胞化した後、トリパンブルーで染色し、染色された細胞の細胞数及び生存率を自動に細胞計数器で測定した。また、対照群として、切片化した後、付着培養せずに、すぐに酵素処理した細胞群を同じ条件で比較した。

その結果、図４に示すように、神経前駆体球を切片化し付着培養した後、単一細胞化させた神経前駆体球の細胞生存率及び回収率が大幅に増加した。

＜３−３＞単一細胞化された細胞の自発的再凝集誘導
前記＜３−２＞にて単一細胞化された細胞を再び自発的に再凝集させるため、次のように処理した。

まず、単一細胞化された細胞を５．５Ｘ１０^４ｃｅｌｌ／０．２ｍｌ／ｃｍ^２の濃度で、神経前駆細胞の培養用培地で希釈し、これを３７℃、５％のＣＯ^２の条件で２４時間培養した。このとき、神経細胞に分化されず、かつ神経前駆細胞を自発的に再凝集させるため、基質がコーティングされていないシャーレで培養した。２４時間後、最初に凝集物をピベッティングて浮遊させ、以後、細胞凝集物の直径が少なくとも約２０μｍ以上であり、かつ５０μｍを超えないまで、ピベッティングに凝集物をシャーレの底から剥がす方式を利用して、４８時間の間隔で培養用培地を交換し、浮遊培養させた。凝集物を底から剥がすとき凝集されずに底に残っている細胞まで一緒に剥がし、凝集物だけを底に沈めて浮遊させた細胞は、培地を交換しながら一緒に除去した。凝集物は、シャーレや、他の凝集物と付着する特性を維持するため、再凝集された凝集物は、少なくとも１２時間の間隔で、前記のような方法を使用してシャーレまたは凝集物との過度な結合を防止した。

その結果、図５に示すように、細胞が単一細胞化した後、培養時間が経過とともに再凝集して形成される凝集物の性状及び大きさが変化することを確認した。これは、再凝集された神経前駆体球を凝集物の大きさに応じて適切な時期に回収して分化（４日目）、継代培養または冷凍保存（２１日目）などの用途で使用できることを意味する。

＜３−４＞再凝集された神経前駆体球の分化
前記＜３−３＞にて再凝集された神経前駆体球の直径が５０μｍ〜１００μｍになったとき、これを回収して、神経細胞への分化を誘導した。

具体的には、再凝集された分化用神経前駆体球は全て回収して、神経前駆細胞の培養用培地に浮遊した後、２．５〜３倍の面積のシャーレまたは３つの同一の面積のシャーレに移して分化させた。再凝集過程で、直径６ｃｍのシャーレを使用し、再凝集された神経前駆体球を全て回収して、１５ｍｌの培養用培地に浮遊させた後、７５ｃｍ^２のＴ−フラスコに移し分化させた。分化には、＜実施例１＞のようにマトリゲルをコーティングしたプレートを用いた。培養２４時間後、ｂＦＧＦの代わりに２％（ｖ／ｖ）のＢ２７が添加された培地に交換し、神経細胞への分化を誘導した。分化に使用されていない再凝集神経前駆体球は直径５００μｍになると、これを再び切片化して継代培養したり、冷凍保存した。

＜実験例１＞再凝集された神経前駆体球の特性を確認
再凝集された神経前駆体球の細胞が、神経前駆細胞の特性をそのまま維持するのかを確認した。

＜１−１＞フローサイトメトリー分析
まず、アクターゼを処理して、神経前駆体球を単一細胞化させた後、これをＰＢＳで洗浄し、固定液で固定し、免疫染色を行った。未分化細胞の存在有無は、未分化の多分化能性幹細胞としてよく知られているマーカーであるＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−６１タンパク質の染色により確認した。神経前駆細胞の純度は、神経前駆細胞マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ及びＰａｘ６タンパク質を用いて確認した。対照群としては、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）を用い、既存の神経前駆体群（ＳＮＭ）と再形成された神経前駆体球（Ｒｅｆｏｒｍｅｄ ＳＮＭ）を一緒に比較した。

その結果、図６に示すように、胚性幹細胞から主に発現される未分化の多分化能性幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４及びＴｒａ１−６０タンパク質は、再凝集された神経前駆体球からはほとんど発現されなかった（図６Ａ）。一方、再凝集された神経前駆体球を構成するほとんどの細胞から神経前駆細胞マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ及びＰａｘ６タンパク質が発現され、既存のＳＮＭに比べて、神経前駆細胞マーカーを強く発現する細胞のみが、単一細胞群の形態で表示されることを確認した（図６Ｂ）。このような結果は、再凝集された神経前駆体球が未分化細胞の除去だけでなく、同じ分化段階の細胞への純粋な分離が可能であることを意味する。

＜１−２＞ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト胚性幹細胞、胚体、神経前駆体球及び再凝集された神経前駆体球それぞれの遺伝子発現の変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した。遺伝子の発現は、未分化の幹細胞から主に発現されるＯｃｔ４及びナノグ（Ｎａｎｏｇ）、神経前駆細胞から主に発現されるＳｏｘ１、Ｐａｘ６及びネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）は、初期の神経細胞から主に発現されるＮＦ−Ｍをマーカーとして確認した。

具体的には、ヒト胚性幹細胞、胚体、前記＜実施例２＞の神経前駆体球及び前記＜３−３＞の再凝集された神経前駆体球それぞれからＴＲＩｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの逆転写キット（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ； Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｏｃｔ４、ナノグ、Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）及びＮＦ−Ｍのそれぞれのプライマーと、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＨｉＰｉ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ； Ｅｌｐｉｓ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーの塩基配列は下記の表１に示した。

その結果、図７に示すように、再凝集された神経前駆体球では未分化マーカーは発現しておらず、神経前駆細胞マーカーの発現が増加した。

＜１−３＞免疫組織学的染色
再凝集された神経前駆体球の分化能が維持されることを確認するために、免疫組織学的染色を行った。

＜３−３＞の再凝集された神経前駆体球をガラスパスツールピペットを加熱した後、細く引き伸ばして作製されたツールを用いて、切片化した後、前記＜実施例１＞と同じ基質であるマートリゲルがコーティングされたガラスカバーガラスに神経前駆細胞の培養用培地で１日、神経細胞分化用培地で６日間付着培養した。付着培養したガラスカバーグラスは、培養２日目と７日目に回収した。試料は、３％のホルマリン溶液に２０分間処理した後、リン酸緩衝液に保管した。抗体を処理する前に、試料は、一日ブロッキング溶液（２％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）に処理し、１次抗体に１２時間、２次抗体に１時間反応させてＤＡＰＩを含む蛍光保存用溶液に封印した後、共焦点蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）で観察した。このとき、免疫学的染色のためにｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｎｅｓｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＴＨ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＧＡＢＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００、ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を１次抗体として使用し、２次抗体としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （以上１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）を使用した。

その結果、図８に示すように、付着培養後、７日間分化した再凝集された神経前駆体球から、既存の神経前駆細胞と同様に、分化した神経細胞マーカーであるベータIII−チューブリン、ＴＨ及びギャバタンパク質がすべて発現された。したがって、再凝集された神経前駆体球がその分化能を維持していることを確認した。

Claims (12)

1. １）神経前駆体球を切片化する段階と、
   ２）前記切片化された神経前駆体球を、神経前駆細胞の培養用培地を含む培養皿中で付着培養する段階と、
   ３）細胞分離用酵素を添加することにより前記付着培養した神経前駆体球を単一細胞化して、単一細胞を製造する段階と、
   ４）前記段階３）の単一細胞を、基質がコーティングされていない培養皿中で付着培養する段階と、
   ５）前記培養皿の底に付着した凝集物を繰り返し浮遊させて前記単一細胞の自発的な再凝集を誘導する段階と、
   ６）前記段階５）の再凝集された神経前駆体球を回収する段階と、
   を含む奇形腫の形成が抑制された高純度の神経前駆体球の製造方法。
2. 前記神経前駆細胞の培養用培地が、細胞の培養用培地としてＮ−２添加物（登録商標）、ｂＦＧＦまたはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の神経前駆体球の製造方法。
3. 前記Ｎ−２添加剤（登録商標）は、前記培養用培地の総体積に対して０．５〜２．０％（ｖ／ｖ）の量で添加される、請求項２に記載の神経前駆体球の製造方法。
4. 前記ｂＦＧＦは、前記培養用培地の総質量に対して０．０００２〜０．００１％（ｗ／ｖ）の量で添加される、請求項２に記載の神経前駆体球の製造方法。
5. 前記の段階２）が基質がコーティングされた培養皿で行われる、請求項１に記載の神経前駆体球の製造方法。
6. 前記の基質がラミニン、Ｌ−オルチニン、マートリゲル及びＣｅＬＬｓｔａｒｔからなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項５に記載の神経前駆体球の製造方法。
7. 前記の段階５）の再凝集された神経前駆体球が直径１０〜８０μｍの大きさである、請求項１に記載の神経前駆体球の製造方法。
8. 請求項１の方法で製造された、奇形腫の形成が抑制された神経前駆体球。
9. １）神経前駆体球を切片化する段階と、
   ２）前記切片化された神経前駆体球を、神経前駆細胞の培養用培地を含む培養皿中で付着培養する段階と、
   ３）細胞分離用酵素を添加することにより前記付着培養した神経前駆体球を単一細胞化して、単一細胞を製造する段階と、
   ４）前記段階３）の単一細胞を、基質がコーティングされていない培養皿中で付着培養する段階と、
   ５）前記培養皿の底に付着した凝集物を繰り返し浮遊させて前記単一細胞の自発的な再凝集を誘導する段階と、
   ６）前記段階５）の再凝集された神経前駆体球を回収する段階と、
   ７）前記の段階６）の回収した神経前駆体球を神経細胞に分化させる段階と、を含む、神経前駆体球の神経細胞への分化方法。
10. 前記分化がｂＦＧＦを添加することなくＢ２７（登録商標）が添加された培地で行われる請求項９に記載の神経細胞の分化方法。
11. 前記Ｂ２７（登録商標）は、前記培地の総体積に対して１〜３％（ｖ／ｖ）の量で添加される請求項１０に記載の神経細胞の分化方法。
12. 前記神経前駆体球が直径５００μｍ以上で継代される請求項９に記載の神経細胞の分化方法。

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