JP6986083B2 - レンズレス撮像によるサンプル内の粒子の計数方法 - Google Patents

Description

本発明は、レンズレス撮像装置を用いて、サンプル内に配置された粒子、特に血球を計数するための光学的方法である。

血液学の分野では、赤血球や白血球などの血球の計数は日常的な手順である。分析研究所には、信頼できるヘモグラムを作成できる自動機械が装備されている。このような機械によって行われる原理は、インピーダンスの変化又は光線の拡散に基づくサイトメトリー測定である。ただし、このような機械は一般に高価であり、その使用は研究室に限定されたままである。

血液学以外では、サンプル内の対象粒子の識別及び計数は一般的に行われている。

国際公開第２００８／０９０３３０号には、レンズレス撮像によって、細胞を含むサンプルの観察を可能にする装置が記載されている。サンプルと画像センサの間に光学拡大レンズを設けずに、サンプルは光源と画像センサの間に配置される。そのため、画像センサは、サンプルによって送られた光波の画像を収集する。ホログラムとも呼ばれるこの画像は、光源から発せられサンプルから送られる光波と、光源から発せられた光波のサンプルによる回折から生じる回折波との干渉パターンから形成される。これらの干渉パターンは、通常、一連の同心円状のリングによって形成される。これらは回折パターンとも呼ばれる。そのため、観察範囲が顕微鏡よりも明らかに大きな画像が得られる。サンプル内の細胞の濃度が十分に低い場合、各細胞は干渉パターンに関連付けられ、これらを計数することにより、サンプル内に存在する細胞を計数できる。しかしながら、濃度が増加した場合、ホログラムによる細胞の計数は信頼できない。

画像センサによって取得されたホログラムは、サンプルを通過して画像センサに向かって伝播する光波の吸収又は位相シフト値など、サンプルの光学特性を推定するために、ホログラフィック再構成アルゴリズムによって処理され得る。このタイプのアルゴリズムは、ホログラフィック再構成の分野でよく知られている。ホログラフィック再構成アルゴリズムの一例は、Ryleらの論文「生物学的標本のデジタルインラインホログラフィ」（Proc．SPIE Vol．6311（2006））に記載されている。しかしながら、そのようなアルゴリズムでは、再構成画像において、「ツイン画像」として知られる再構成ノイズが出現する虞がある。したがって、それらのアプリケーションでは、何らかの予防措置を必要とする。米国特許出願公開第２０１２／０２１８３７９号には、サンプルの複素画像（この画像は振幅及び位相に関する情報を含む）の再構成を可能にする方法が記載されている。米国特許出願公開第２０１２／０１４８１４１号では、米国特許出願公開第２０１２／０２１８３７９号に記載された方法を適用し、精子の複素画像を再構成し、精子の可動性を特徴付けている。国際公開第２０１６／１５１２４９号では、レンズレス撮像を適用し、細胞を含むサンプルを分析している。

サンプル観察のための代替方法は、ホログラフィー顕微鏡法である。例えば米国特許出願公開第２０１３／０３０８１３５号に記載されている。また、国際公開第２０１５／１９５６４２号では、血液粒子に適用され、特に赤血球又は白血球の体積の推定について記載されている。ホログラフィック顕微鏡法は、実装が比較的複雑である。米国特許出願公開第２００８／０１６０５６６号では、標準的な光学装置を用いて画像を形成し、予め着色試薬で標識された白血球の体積を決定するための単純な代替案が提案されている。上述の３つの文献に記載された方法では、小さな観察野であることが共通している。

発明者らは、レンズレス撮像によって可能になった広い観察領域を利用することにより、サンプル内の対象粒子を計数するための単純で安価な代替案を提案する。血液サンプルに適用される場合、本発明は、血液中の細胞の計数に現在利用可能な血液学機械の代替物を提供し得る。本発明は、特に粒子の濃度が高く、場合によってはマイクロリットルあたり数十万個の粒子に達するサンプルに適している。

本発明の１つの目的は、サンプル内に配置された粒子、特に血球の計数方法である。
当該方法は、
ａ）前記サンプルに向かって伝播する入射光波を発する光源を用いて、前記サンプルを照明するステップと、
ｂ）当該照明の影響下で、暴露波として知られている光波に曝される画像センサを用いて、前記光源と前記画像センサの間に配置された前記サンプルの画像であって、検出面に形成され、前記光波を表す画像を取得するステップと、を含む。

さらに、
ｃ）ステップｂ）中に取得した前記画像に基づいて、伝播演算子を適用して、前記検出面の反対側に延びる再構成面に沿って、前記暴露波の複素式を計算するステップと、
ｄ）前記再構成面に沿った前記複素式の絶対値又は位相の分布を表す再構成画像として知られる画像を形成するステップと、
ｅ）互いに離間し、全て又は一部が少なくとも１つの対象粒子に関連付けられた関心領域を含むセグメンテーション画像を取得するために、ステップｄ）中に形成された前記画像のセグメンテーションを行うステップと、
ｆ）関心領域のサイズを決定すると共に、
当該関心領域に単一の対象粒子が含まれるクラスと、当該関心領域に１より大きい整数の対象粒子が含まれるクラスとの少なくとも１つによるサイズの関数として当該関心領域を分類するステップと、
ｇ）ステップｆ）中に分類された対象粒子を計数するステップと、を含んでもよい。

分類することによって、選択した関心領域を単純に計数するよりも、より正確に対象粒子を定量化できる。

ステップｆ）において、分類の前に、
各関心領域の少なくとも１つの形態学的基準を決定し、
前記形態学的基準の関数として関心領域（ＲＯＩ）を選択し、
選択された関心領域を分類してもよい。

形態学的基準が、特に、各関心領域の直径、サイズ、又は形状因子の中から選択されてもよい。いくつかの形態学的基準を組み合わせてもよい。

ステップｆ）が、所定数の対象粒子を表す基準サイズ及び／又は基準形状を考慮することを含み、前記基準サイズの関数として分類してもよい。

ステップｆ）は、
ｆｉ）所定の対象粒子の数に対応する第１の基準サイズの関数として実行される関心領域を分類するサブステップ（第１の分類）と、
ｆｉｉ）前記第１の分類の後、サブステップｆｉ）中に分類された関心領域に基づいて、事前に定義された数の対象粒子を含むとして、第２の基準サイズを決定するサブステップと、
ｆｉｉｉ）サブステップｆｉｉ）で決定された第２の基準サイズ（Ｓｒｅｆ−２）の関数として実行される、関心領域を分類するサブステップ（第２の分類）と、を含んでもよい。

ステップｆ）において、分類の前に、
いくつかの関心領域の信号ノイズ比を計算し、
例えば閾値との比較に基づいて、各関心領域に対して計算された前記信号ノイズ比の関数としての関心領域を選択し、
選択された関心領域を分類してもよい。

対象粒子の形状を修正して球形にするために、ステップｂ）の前にサンプルを球状化試薬と混合してもよい。

ステップｃ）は、
ｃｉ）前記画像センサによって取得された前記画像に基づいて、前記検出面内の前記サンプルの初期画像を定義するサブステップと、
ｃｉｉ）サブステップｃｉ）中に定義された前記サンプルの初期画像、又は前の反復の結果である前記検出面での前記サンプルの画像に対し、伝播演算子を適用することにより、再構成面における前記サンプルの複素画像を決定するサブステップと、
ｃｉｉｉ）サブステップｃｉｉ）で決定された前記複素画像に基づいて、当該複素画像に影響する再構成ノイズに依存するノイズ指標を計算するサブステップと、
ｃｉｖ）前記画像のピクセルの位相値に従って、サブステップｃｉｉｉ）中に計算された前記指標の変化の関数として、前記位相値を調整することによって、前記検出面における前記サンプルの画像を更新するサブステップと、
ｃｖ）前記検出面及び前記再構成面における前記サンプルの複素画像を取得するために、収束基準に達するまでサブステップｃｉｉ）〜ｃｉｖ）を繰り返すサブステップと、を含んでもよい。

好ましくは、前記サンプルと前記画像センサとの間に画像形成光学素子又は拡大光学素子が配置されていない。

対象粒子は血球でもよい。
一実施形態によれば、ステップｄ）中において、
前記対象粒子は赤血球又は白血球であり、前記再構成画像は、前記再構成面に沿った複素式の絶対値の分布を表しているか、
前記対象粒子は血小板であり、前記再構成画像は、前記再構成面に沿った複素式の位相の分布を表している。

この方法は、添付の特許請求の範囲に記載された特徴を含んでもよい。

本発明の他の１つの目的は、サンプル内に配置された対象粒子を計数するための装置である。
当該装置は、
サンプルに向かって伝搬する入射光波を放射できる光源と、
サンプルを光源と画像センサとの間に保持するように設計された支持体と、
画像センサによって取得されたサンプルの画像を受け取り、本願に記載の方法のステップｃ）〜ｇ）を実行するように設計されたプロセッサと、を含む。

他の利点及び特徴は、非限定的な例として与えられ、以下に列挙される図に表される本発明の特定の実施形態の以下の説明からより明らかになるであろう。

本発明の実施を可能にする装置例を示している。 本発明の実施を可能にする別の装置例を示している。

図２Ａは、本発明による方法の主要なステップを示すフローチャートである。図２Ｂは、赤血球を含むサンプルの振幅画像として知られる再構成画像を示している。図２Ｃは、セグメンテーション後の図２Ｂの画像を示し、画像内に分布するいくつかの関心領域を示している。図２Ｄは、各関心領域の分類後の図２Ｃの画像を示している。図２Ｅは、関心領域ごとに決定された信号ノイズ比のヒストグラムを表している。

図３Ａ及び３Ｂは、信号ノイズ比の値の関数としての閾値処理の前後の関心領域をそれぞれ示している。図３Ｃと３Ｄは、それぞれ画像３Ａと３Ｂの信号ノイズ比のヒストグラムである。

図３Ｅは、特定の実施形態の主要なステップを示している。

図４Ａは、再構成面で再構成画像として知られるサンプルの複素画像の取得を可能にする方法の主要なステップを示している。図４Ｂは、図４Ａに関連して説明したステップを示している。

図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、本発明を実施し、それぞれ青、緑及び赤のスペクトル帯域で発光する発光ダイオードを使用することにより、参照方法を用いて実行される計数の関数として、赤血球の計数を表す曲線である。

図５Ｄは、本発明を実施し、レーザー光源を使用することにより、参照方法を用いて実行される計数の関数として、赤血球の計数を表す曲線である。

図６Ａは、いわゆる再構成された振幅画像を示しており、サンプルには白血球が含まれている。図６Ｂは、セグメンテーション後の図６Ａの画像を示している。図６Ｃは、いわゆる再構成された振幅画像を示しており、サンプルには白血球が含まれている。図６Ｄは、セグメンテーション後の図６Ｃの画像を示している。

図７Ａは、ガラスビーズを含むサンプルと呼ばれる、再構成された振幅画像を示している。図７Ｂは、セグメンテーション後の図７Ａの画像を示している。

図８Ａ及び８Ｂは、赤血球に対応する関心領域の信号ノイズ比の分布を表すヒストグラムである。

図１Ａは、本発明による装置の一例を示している。光源１１は、伝搬軸Ｚに沿ってサンプル１０に向かって伝搬する、入射光波として知られる光波１２を放射できる。光波は、スペクトル帯域Δλで放射される。

サンプル１０は、粒子を含むサンプルであり、その中には、計数する対象粒子１０ａがある。粒子とは、例えば細胞、特に血球を意味するが、微生物、ウイルス、胞子、又はマイクロビーズであってもよく、通常生物学的応用、又は微細藻類でさえ使用される場合がある。それらは、水相に分散した油滴などの、液体媒体１０ｍに不溶性の液滴でもある。好ましくは、粒子１０ａは、１００μｍ未満、好ましくは５０μｍ又は２０μｍ未満の直径を有するか、そのような直径の円に内接する。好ましくは、粒子は、５００ｎｍ又は１μｍより大きい直径を有するか、そのような直径の円に内接する。

図１Ａに表される例では、サンプルは、対象粒子１０ａが浸される媒体１０ｍを含む。この例の粒子１０ａは、血液細胞、例えば赤血球（赤血球）又は白血球（白血球）である。粒子が浸される媒体１０ｍは、特に、希釈された血漿などの液体であってもよい。

この例のサンプル１０は、流体チャンバ１５に含まれている。流体チャンバ１５は、例えば、厚さｅ＝１００μｍのCountess（登録商標）タイプの流体チャンバである。伝播軸Ｚに沿ったサンプル１０の厚さｅは、典型的には１０μｍ〜１ｃｍの間で変化し、好ましくは２０〜５００μｍの間である。サンプル１０は、サンプルの平面として知られる平面Ｐ_１０に沿って延び、好ましくは伝播軸Ｚに垂直である。それは、画像センサ１６から離れた支持体１０ｓ上に維持される。

光源１１とサンプル１０との間の距離Ｄは、好ましくは１ｃｍより大きい。これは、２〜３０ｃｍであることが好ましい。有利なことに、サンプルから見た光源は点状であると考えられる。これは、その直径（又はその対角線）が、サンプルと光源間の距離の１０分の１未満、好ましくは１００分の１未満であることを意味する。光源１１は、図１Ａに示されるような発光ダイオードであってもよい。それは、絞り１８すなわち空間フィルターに関連付けられてもよい。絞りの開口部は通常、５μｍ〜１ｍｍ、好ましくは５０〜５００μｍである。この例では、絞りはThorlabs社製Ｐ１５０Ｓであり、その直径は１５０μｍである。絞りは、光ファイバに置き換えてもよく、その第１の端部は光源１１の反対側に配置され、その第２の端部はサンプル１０に面して配置される。

この装置は、光源１１と絞り１８との間に配置された拡散板１７を含んでもよい。そのような拡散板の使用により、絞り１８の開口に対する光源１１の中心合わせの制約を克服できる。このような拡散板の機能は、光源によって生成された光ビームを角度αの円錐に沿って分配することである。好ましくは、拡散角αは１０〜８０°の間で変化する。拡散板を設けることによって、装置において、絞りに対する光源の偏心が許容され易くなり、サンプルの照明が均一化される。特にレーザー光源の場合、光源が十分に点状である場合、絞りは必要ない。

光源１１は、レーザーダイオードなどのレーザー光源であってもよい。この場合、空間フィルター１８又は拡散板１７と関連付けることは役に立たない。このような構成を図１Ｂに示す。

好ましくは、入射光波１２のスペクトル放射帯域Δλは、１００ｎｍ未満の幅を有する。スペクトル帯域幅とは、そのスペクトル帯域の中間高さでの幅を意味する。

サンプル１０は、光源１１と前述の画像センサ１６との間に配置される。画像センサ１６は、サンプルの拡張面Ｐ_１０と平行又は実質的に平行に伸びることが好ましい。実質的に平行という用語は、２つの要素が厳密に平行ではない可能性があることを意味し、２０°又は１０°未満の数度の角度公差が許可される。画像センサ１６は、検出面Ｐ_０に沿って画像Ｉ_０を形成できる。示した例では、ＣＣＤタイプ又はＣＭＯＳのピクセルアレイを含む画像センサである。検出面Ｐ_０は、好ましくは、入射光波１２の伝播軸Ｚに垂直に延びる。サンプル１０と画像センサ１６のピクセルアレイとの間の距離ｄは、有利には５０μｍ〜２ｃｍ、好ましくは１００μｍ〜２ｍｍである。

なお、画像センサ１６とサンプル１０との間に拡大光学素子などの画像形成光学素子は存在しない。これは、画像センサ１６の各ピクセルの領域に集束マイクロレンズが存在する可能性を排除するものではなく、画像センサ１６は取得した画像の拡大機能を有していない。

入射光波１２の影響下で、サンプル内に存在する粒子は回折波１３を生成し、検出面Ｐ_０の領域で、サンプルが透過する入射光波１２の一部１２’と干渉する可能性がある。さらに、サンプルは入射光波１２の一部を吸収してもよい。したがって、サンプル１０によって送られ、画像センサ１６が曝される暴露波として知られる光波１４は、以下を含むことができる。
・サンプルの各粒子による入射光波１２の回折から生じる成分１３。
・サンプルによる入射光波１２の透過から生じるコンポーネント１２’。

これらのコンポーネントは、検出面に干渉を生じる。したがって、画像センサ１６によって取得された画像Ｉ_０は、干渉パターン（又は回折パターン）を含み、各干渉パターンは、サンプル１０の粒子１０ａによって生成される。

マイクロプロセッサなどのプロセッサ２０は、画像センサ１６によって取得された各画像Ｉ_０を処理するように設計されている。特に、プロセッサは、この説明で説明する画像処理及び計算操作を実行するための一連の命令が記憶されているプログラム可能なメモリ２２に接続されたマイクロプロセッサである。プロセッサは、画像センサ１６によって取得された画像又はプロセッサ２０によって計算された画像の表示を可能にするスクリーン２４に結合されてもよい。

従来技術に関連して述べたように、ホログラムとしても知られる画像センサ１６で取得された画像Ｉ_０は、観察されるサンプルの十分に正確な式を得ることができない。暴露波１４を表す量を計算するために、画像センサによって取得された各画像に伝播演算子ｈを適用できる。ホログラフィック再構成として知られるそのような手順は、検出面Ｐ_０に平行な再構成面、特にサンプルの拡張面Ｐ_１０において、光波１４の絶対値（modulus）又は位相の画像の再構成を可能にする。このために、画像センサ１６によって取得された画像Ｉ_０と伝播演算子ｈとの畳み込み積を作成する。次に、空間座標（ｘ，ｙ，ｚ）の全てのポイントで、特に画像センサの反対側に延びる再構成面に沿って、光波１４の複素式Ａを計算できる。再構成面は、画像センサ１６から、特にサンプルの平面Ｐ_１０から距離｜ｚ｜に位置する再構成面Ｐ_ｚであってもよい。

＊はコンボリューションから生成された演算子を示す。

この説明の残りの部分では、座標（ｘ，ｙ）は、伝播軸Ｚに垂直な平面内の半径方向の位置を示す。座標ｚは、伝播軸Ｚに沿った座標を示す。

複素式Ａは、その偏角と絶対値がそれぞれ画像センサ１６が曝される光波１４の位相と強度を表す複素量である。画像Ｉ_０と伝播演算子ｈとの畳み込み積により、検出面Ｐ_０の座標ｚに及ぶ、再構成面Ｐ_ｚにおける複素式Ａの空間分布を表す複素画像Ａ_ｚが得られる。この例では、検出面Ｐ_０の方程式はｚ＝０である。複素画像Ａ_ｚは、再構成面Ｐ_ｚのサンプルの複素画像に対応する。同様に、暴露波１４の光学特性の２次元空間分布を表す。伝播演算子ｈは、画像センサ１６と画像センサ１６からの距離｜ｚ｜に位置する座標点（ｘ，ｙ，ｚ）との間の光の伝播を記述する。したがって、再構成の距離として知られるこの距離｜ｚ｜で、暴露波１４の絶対値Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）及び／又は位相φ（ｘ，ｙ，ｚ）を決定できる。

演算子ａｂｓとａｒｇは、それぞれ絶対値と偏角を表している。

換言すると、空間座標（ｘ，ｙ，ｚ）の全ての点での暴露波１４の複素式Ａは、次のようになる。

検出面Ｐ_０の反対側に延びる表面に、複素式Ａの絶対値又は位相の分布をそれぞれ表す画像Ｍ_ｚ及びφ_ｚを形成することが可能である。そのような表面は、特に検出面Ｐ_０から距離｜ｚ｜に位置する平面Ｐ_ｚであってもよい。平面Ｐ_ｚでは、Ｍ_ｚ＝ａｂｓ（Ａ_ｚ）及びφ_ｚ＝ａｒｇ（Ａ_ｚ）が成立する。前述の表面は必ずしも平面ではないが、検出面に実質的に平行に延びてもよく、検出面に平行な平面Ｐ_ｚであることが好ましい。説明の残りの部分では、複素画像Ａ_ｚの絶対値及び／又は位相から取得した画像を「再構成画像」と呼び、Ｉ_ｚで示す。

本発明者らは、図２Ａ〜２Ｅを参照して説明する手順により、サンプル内に存在する粒子１０ａを計数する方法を開発した。この手順の主な手順は次の通りである。

ステップ１００：サンプルの照明。
このステップ中、サンプルは光源１１によって照らされる。

ステップ１１０：画像センサ１６によるサンプル１０の画像Ｉ_０の取得。
この画像はホログラムを形成する。図１Ａ又は１Ｂに示すように、レンズレス構成の興味深い特徴の１つは、広い観察野であり、大量のサンプルを同時に処理できる。観察野はセンサのサイズに依存するが、センサとサンプルとの間隔を設けるため、センサの検出面よりわずかに小さくなる。観察野は一般に１０ｍｍ^２さらには２０ｍｍ^２より大きい。

ステップ１２０：再構成面Ｐ_ｚにおける複素画像Ａ_ｚの計算。
複素画像は、画像センサ１６が曝される暴露波１４の位相と振幅に関する情報を運ぶ。再構成面は、サンプルの拡張面Ｐ_１０である。ステップ１２０は、取得された画像Ｉ_０から生じる画像に前述の伝播演算子ｈを適用することにより実行され得る。ただし、取得した画像に伝播演算子を適用すると、多くの場合、ツイン画像として知られる実質的な再構成ノイズを含む複素画像Ａ_ｚが生成され得る。再構成ノイズを制限して、使用可能な複素画像を取得するために、反復アルゴリズムを実行できる。これらのアルゴリズムの１つを、図４Ａ及び４Ｂを参照して以下に説明する。

複素画像Ａ_Ｚから、再構成面Ｐ_Ｚ内の暴露波１４の絶対値Ｍ_ｚ及び／又は位相φ_ｚに基づいて再構成画像Ｉ_Ｚを得ることができる。画像センサ１６に関する再構成距離は、画像センサ１６に関するサンプル１０の位置を知って演繹的に決定されるか、又はデジタルフォーカシングアルゴリズムに基づいて決定される。最適な再構成距離は、再構成画像Ｉ_Ｚが最も明確になる距離である。デジタルフォーカシングアルゴリズムは、当業者に知られている。

図２Ｂは、図４Ａ及び４Ｂに関連して説明されたステップを実施する方法によって得られた複素画像Ａ_ｚの絶対値Ｍ_ｚに基づく再構成画像Ｉ_ｚの一部の例である。この図では、コントラストが逆になっている。計数する対象粒子１０ａは赤血球である。それらは、再構成画像において分散され、互いに分離された関心領域ＲＯＩの形で表示される。サンプルと実験条件については、実験試行に関連して以下でより正確に説明する。

ステップ１３０：セグメンテーション。
ステップ１２０中に形成された画像は、粒子に対応する関心領域ＲＯＩを分離するためにセグメンテーションにかけられる。画像のセグメンテーションとは、例えば強度の関数として、ピクセルを再グループ化するための画像の分割を意味する。画像セグメンテーションの結果、セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊が生成される。この画像では、互いに離間した関心領域ＲＯＩが区切られる。各関心領域は、以下に説明するように、粒子又は粒子のクラスターに対応する。セグメント化の異なる方法は、当業者に知られている。例えば、画像のヒストグラムから強度閾値の値を決定することからなる大津閾値処理を適用できる。この閾値は、２つのクラス（関心領域を表すピクセルのクラスと画像の背景を表すピクセルのクラス）に従ってピクセルの最適な分離を可能にする。図２Ｃは、大津アルゴリズムに従って閾値処理を適用することにより、図２Ｂの画像を分割した結果を示している。得られた画像は２値化され、画像の背景を表すピクセルは暗く（最小グレーレベル）、各関心領域ＲＯＩを表すピクセルは明るい（最大グレーレベル）。

この例では、このステップで得られたセグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊は、暴露波１４の複素振幅Ａ_ｚの絶対値の画像Ｍ_ｚのセグメンテーションから生じる。変形例として、このステップで得られる画像は、暴露波の位相の画像φ_ｚの分割から得られる。セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊は、同様に、絶対値の画像Ｍ_ｚのそれぞれのセグメンテーションの後に現れる関心領域と、暴露波の位相の画像φ_ｚとを組み合わせてもよい。

セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊に表示される関心領域の単純な計数による対象粒子の計数は、対象粒子の量に関して１桁の大きさを提供する。しかし、発明者は、そのような計数がかなり不正確な結果をもたらすことを発見した。実際、特定の関心領域は、数えたい粒子とは異なる粒子に対応している。さらに、特定の関心領域は、クラスターを形成するいくつかの対象粒子を集める。これは、特定の対象粒子が互いに近く、同じ関心領域にマージされるという事実によるものである。図１Ａ及び１Ｂでは、２つの粒子を含むクラスター１０ａ_２と３つの粒子を含むクラスター１０ａ_３が描かれている。これらのエラーの原因は、以下で説明する手順で処理される。

ステップ１４０：選択。
このステップ中、前のステップでモルフォロジーに応じて、つまり面積、形状、サイズなどの形態学的基準に応じて決定された関心領域の選択が行われる。これにより、計数したい対象粒子に対応する関心領域を選択できる。

このステップは、対象粒子を代表する関心領域を選択するために、前述の形態学的基準の関数としての各関心領域のフィルタリングを含んでもよい。例えば、対象粒子が赤血球の場合、フィルタリングにより、直径が１００μｍ未満か、そのような直径の円に内接する関心領域を選択できる。これにより、赤血球のクラスターを保持しながら、大きな塵埃や痕跡を考慮しなくてよい。

対象粒子間の凝集の影響を考慮するために、選択された関心領域の分類は、例えば単一の対象粒子（シングルレット）に対応する関心領域を表す基準面積などの基準サイズＳ_ｒｅｆに特に基づいて、その面積及び／又は形状の関数として行われ得る。基準面積は、例えば各関心領域ＲＯＩの面積の平均又は中央値を計算し、関心領域の大部分が単一粒子に対応すると仮定することにより、セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊から事前に決定又は取得できる。次に、各関心領域のサイズは、各関心領域に多数の粒子が割り当てられる関数として、基準サイズＳ_ｒｅｆと比較される。サイズとは、直径、面積、又は別の特徴的な寸法を意味する。
例えば、図２Ｄに関連して、
・関心領域のサイズが基準サイズＳ_ｒｅｆの０．５〜１．５倍の場合、ＲＯＩ_１と付された関心領域のように、関心領域はシングルレットに対応する単一の対象粒子を表す。図２Ｄでは、シングレットは白い点で表されている。
・関心領域のサイズが基準サイズＳ_ｒｅｆの１．５〜２．５倍の場合、関心領域は２つの対象粒子を表すと見なされる。図２Ｄでは、ダブレットに対応するこのような関心領域ＲＯＩ_２は、白い楕円形の輪郭で表されている。
・関心領域のサイズが基準サイズＳ_ｒｅｆの２．５〜３．５倍の場合、関心領域は３つの粒子を表すと見なされる。図２Ｄでは、このような関心領域ＲＯＩ_３は白い枠で表されている。

表記ＲＯＩ_ｎは、分類ステップの後、ｎ個の粒子を含むと見なされる関心領域に対応する。ｎは厳密に正の整数である。

代替的又は補足的な方法では、分類の前に、各関心領域の形状の関数として、選択を行ってもよい。例えば、関心領域ごとに最大直径と最小直径を決定する。最大直径と最小直径の比率により、対象となる関心領域の形状因子を定量化できる。この選択により、形状が球形であると見なせない関心領域を識別できる。これらの関心領域は、対象粒子の代表とは見なされず、計数では考慮されない。したがって、選択は、各関心領域の形状と、検出された対象粒子又は対象粒子のクラスターを表す形状との比較を伴い得る。

セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊に存在する関心領域ごとに、信号ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を確立できる。このような信号ノイズ比は、関心領域の中心に位置する中心ピクセルと呼ばれるピクセル（例えば９個の中心ピクセル）の平均値と、関心領域のない再構成画像に対応する画像の背景に対して計算された標準偏差との比を生成することによって計算できる。図２Ｅは、図２Ｃ及び２Ｄに示すサンプルで特定されたさまざまな関心領域について計算された信号ノイズ比の値のヒストグラムである。関心領域の大部分は４を超える信号ノイズ比を持っている。これは、検出が信頼でき、関心領域の選択での信頼度も高く、よって計数も信頼できることを意味する。ステップ１４０は、同様に、それらの信号ノイズ比の関数としての関心領域のフィルタリングを含み得る。実際、特定の閾値を下回ると、信号ノイズ比が低すぎて、関心領域が１つの粒子に対応していると効果的に判断できないと考えられる。図３Ａ及び３Ｂは、１．５に等しい信号ノイズ比の閾値に基づいた関心領域のフィルタリングの例を示している。図３Ａ及び３Ｂに示された関心領域の信号ノイズ比のヒストグラム（図３Ｃ及び３Ｄ）に見られるように、図３Ａの太い円で囲まれた信号ノイズ比が低い関心領域を閾値処理により除去できる。信号ノイズ比が低い関心領域は、図３Ｂには表示されていない。この例では、信号ノイズ比に基づく関心領域のフィルタリングはシングレットに限定されている。図３Ａ及び３Ｂでは、図２Ｄと同様に、ダブレットは楕円形の輪郭で囲まれ、トリプレットは正方形の輪郭で囲まれている。

一実施形態によれば、ステップ１４０は、図３Ｅに示される以下の連続した操作を伴い得る。
・ステップ１４１：対象粒子を表す直径範囲（赤血球の場合は３〜１２μｍなど）、及び形状基準に従って、各関心領域ＲＯＩをフィルタリングする。
・ステップ１４２：このフィルタリングから生じる関心領域の平均サイズを計算する。この平均サイズは第１の基準サイズＳ_{ｒｅｆ−１}を構成する。
・ステップ１４３：整数ｎ個の粒子を各関心領域ＲＯＩ_ｎに割り当てるために、第１の基準サイズＳ_{ｒｅｆ−１}に基づいてセグメンテーション画像の各関心領域ＲＯＩを分類する。
・ステップ１４４：シングレットとみなされる各関心領域ＲＯＩ_１の信号ノイズ比を計算する。
・ステップ１４５：閾値よりも大きい十分な信号ノイズ比を有するシングレットの平均サイズＲＯＩ_１を計算する。閾値はおそらく１．５に等しく、この平均サイズは第２の基準サイズＳ_{ｒｅｆ−２}を構成する。
・ステップ１４６：ステップ１４５から得られた第２の基準サイズＳ_{ｒｅｆ−２}に基づいて、セグメンテーション画像の各関心領域ＲＯＩを分類する。
・ステップ１４７：分類中に決定された多数の粒子ｎを各関心領域ＲＯＩに割り当てる。

このアルゴリズムにより、関心領域の分類の基礎として使用される基準サイズを漸進的に調整できる。これにより、より正確に分類できる。

したがって、ステップ１４０は、対象粒子を表す関心領域を選択すること、及び／又は対象粒子を表すと考えられる各関心領域に多数の粒子を割り当てることを可能にする。

ステップ１５０：計数。
このステップ中、ステップ１４０中に選択された関心領域、すなわち粒子の代表であると考えられる領域を、それらの各々におそらく割り当てられた多くの粒子を考慮して計数する。

上述のステップ１２０は、伝播演算子と画像センサにより取得された画像との間の畳み込みを生成することにより実現され得る。ただし、このような演算子を適用すると、重大な再構成ノイズが発生し得る。再構成ノイズを制限することにより再構成を最適化するために、ステップ１２０は、２０１６年３月２３日に出願された仏国特許出願第１６５２５００号に記載されたようなアルゴリズムによって実行されてもよい。図４Ａ及び４Ｂを参照して、このアルゴリズムの主要なステップを説明する。それは反復アルゴリズムを含み、以下で説明されるステップ１２１〜１２５が繰り返され、ｋは反復のランクを指定する。この方法は、検出面での複素振幅Ａ_０＝Ａ_ｚ＝０の推定値を段階的に取得するために、検出面Ｐ_０で暴露波１４の位相を決定するように設計されている。各反復ｋ中に、Ａ_０ ^ｋ−１として示される前の反復中に取得された検出面の複素画像は、再構成面Ｐ_ｚで伝播され、再構成面Ｐ_ｚで複素画像Ａ_ｚ ^ｋを形成する。各反復は、検出面Ｐ_０の複素画像Ａ_０ ^ｋの位相φ_０ ^ｋを、複素画像Ａ_ｚ ^ｋから決定されたノイズ基準ε^ｋの関数として調整することから成る。

ステップ１２１：検出面の再構成面への伝播。

このステップ中、検出面Ｐ_０で形成された画像が利用できる。最初の反復中に、画像センサによって取得された画像Ｉ_０から初期画像Ａ_０ ^ｋ＝０が決定される。初期画像Ａ_０ ^ｋ＝０の絶対値Ｍ_０ ^ｋ＝０は、画像センサによって取得された画像Ｉ_０に平方根演算子を適用することで取得できる。この場合、Ｍ_０ ^ｋ＝０＝√Ｉ_０である。０などの任意の値が、初期画像の位相φ_０ ^ｋ＝０に割り当てられる。次の反復中、検出面の画像は、前の反復で得られた複素画像Ａ_０ ^ｋ−１である。検出面Ｐ_０で形成された画像は、再構成面Ｐ_ｚでサンプル１０を表す複素画像Ａ_ｚ ^ｋを取得するために、前述の伝播演算子ｈの適用により、再構成面Ｐ_ｚで伝播される。伝播は、画像Ａ_０ ^ｋ−１と伝播演算子ｈ_−ｚの畳み込みによって実現される。

インデックス「−ｚ」は、伝播が伝播軸Ｚとは反対の方向に実現されるという事実を表す。レトロプロパゲーションについて述べる。

ステップ１２２：いくつかのピクセルでの指標の計算。

このステップ中に、複素画像Ａ_ｚ ^ｋの複数のピクセル（ｘ，ｙ）の各ピクセルに関連付けられた量ε^ｋ（ｘ，ｙ）を計算する。この量は、計算対象のピクセル（ｘ，ｙ）での画像Ａ_ｚ ^ｋの値Ａ_ｚ ^ｋ（ｘ，ｙ）又はその絶対値に依存する。同様に、このピクセルの画像の次元微分、例えばこの画像の次元微分の絶対値に依存する場合がある。この例では、各ピクセルに関連付けられている量ε^ｋ（ｘ，ｙ）は、各ピクセルの画像Ａ_ｚ ^ｋと値１の差の絶対値である。このような量は、次式で得られる。

ステップ１２３：画像Ａ_ｚ ^ｋに関連付けられたノイズ指標の確立。

ステップ１２２中、複素画像Ａ_ｚ ^ｋのいくつかのピクセルにおける量ε^ｋ（ｘ，ｙ）を計算する。これらの量はベクトルΕ^ｋを形成でき、その項は各ピクセル（ｘ，ｙ）に関連付けられた量ε^ｋ（ｘ，ｙ）である。ステップ１２３では、ベクトルΕ^ｋのノルムからノイズ指標として知られる指標を計算する。複素画像Ａ_ｚ ^ｋから計算された量ε^ｋ（ｘ，ｙ）は、複素画像Ａ_ｚ ^ｋの各ピクセル（ｘ，ｙ）で、複素画像Ａ_ｒｅｆ ^ｋに関連付けられたノイズ指標ε^ｋを構成するために合計される。

すなわち、

このステップの重要な側面は、次の反復中、ノイズ指標ε^ｋ＋１がノイズ指標ε^ｋより小さい再構成画像Ａ_ｚ ^ｋ＋１を取得しつつ、検出面Ｐ_０で、サンプル平面内の画像Ａ_０ ^ｋの各ピクセルの位相値φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）を決定することである。

最初の反復中に利用可能な情報は、暴露波１４の強度に関するもののみであり、その位相に関するものではない。したがって、再構成面Ｐ_ｚ内の第１の再構成画像Ａ_ｚ ^ｋ＝１は、検出面Ｐ_０内の光波１４の位相に関する情報がないために、実質的な再構成ノイズを割り当てられる。その結果、指標ε^ｋ＝１は上昇する。後続の反復中に、アルゴリズムは検出面Ｐ_０で位相φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）の漸進的調整を実行し、指標ε^ｋを漸進的に最小化する。

検出面の画像Ａ_０ ^ｋは、その強度と位相の両方の観点から、検出面Ｐ_０の光波１４を表している。ステップ１２０〜１２５は、画像Ａ_０ ^ｋの各ピクセルの位相φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）の値を反復的に確立し、再構成面Ｐ_ｚでの画像Ａ_０ ^ｋ−１の伝播によって得られた画像Ａ_ｚ ^ｋのために取得された指標ε^ｋを最小化するように設計されている。

最小化アルゴリズムは、勾配降下アルゴリズムでも共役勾配降下アルゴリズムでもよく、後者については以下で説明する。

ステップ１２４：検出面における位相の値の調整。

ステップ１２４は、次の反復ｋ＋１中、再構成面Ｐ_ｚにおける複素画像Ａ_０ ^ｋの伝播から生じる指標ε^ｋ＋１を最小化するように、複素画像Ａ_０ ^ｋの各ピクセルの位相φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）の値を決定するように設計されている。このため、位相ベクトルφ_０ ^ｋが確立される。各項は、複素画像Ａ_０ ^ｋのピクセル（ｘ，ｙ）の位相φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）である。このベクトルの次元は（Ｎ_ｐｉｘ，１）である。ここで、Ｎ_ｐｉｘは考慮されるピクセル数を示す。このベクトルは、次の更新式により、各反復中に更新される。

ここで、
・α^ｋは整数で、「ステップ」として示され、距離を表す。
・ｐ^ｋは次元（Ｎ_ｐｉｘ，１）の方向ベクトルで、各項ｐ（ｘ，ｙ）は指標ε^ｋの勾配∇ε^ｋの方向を形成する。

この方程式は、次のようにベクトル形式で表現できる。

また、次のように示される。

ここで、
・∇ε^ｋは次元（Ｎ_ｐｉｘ，１）の勾配ベクトルで、その各項は問題の未知数（すなわちベクトルφ_０ ^ｋの項）の自由度のそれぞれの関数として指標ε^ｋの変化を表す。
・ｐ^ｋ−１は、前の反復中に確立された方向ベクトルである。
・β^ｋは、方向ベクトルｐ^ｋ−１に適用されるスケール係数である。

勾配ベクトル∇εの各項は、次の通りである。

ここで、Ｉｍは虚数演算子を表し、ｒ’は検出面の座標（ｘ，ｙ）を表す。

スケール係数β^ｋは、次のように表現できる。

ステップα^ｋは、反復に応じて、例えば、最初の反復中の０．０３と最後の反復中の０．０００５との間で変化し得る。

更新式により、ベクトルφ_０ ^ｋの調整が可能になり、複素画像Ａ_０ ^ｋの各ピクセルの位相φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ）が繰り返し更新される。検出面における複素画像Ａ_０ ^ｋは、各ピクセルに関連付けられたこれらの新しい位相値によって更新される。

ステップ１２５：アルゴリズムの反復又は終了。

収束基準が達成されていない場合、ステップ１２５において、ステップ１２４で更新された複素画像Ａ_０ ^ｋに基づいて、ステップ１２１〜１２５の新しい反復によりアルゴリズムを繰り返す。収束基準は、所定の反復回数Ｋ、又は指標の勾配∇ε^ｋの最小値、又は２つの連続する位相ベクトルφ_０ ^ｋ−１、φ_０ ^ｋの間で無視できると考えられる差である。収束基準が達成されると、検出面Ｐ_０内のサンプルの複素画像について正しいと考えられる推定値が得られる。

ステップ１２６：再構成面での複素画像の取得。

最後の反復の終わりに、この方法は、再構成面における複素画像Ａ_ｚ＝Ａ_ｚ ^ｋを取得するために、再構成面Ｐ_ｚの最後の反復から生じる複素画像Ａ_０ ^ｋの伝播を伴う。

実験的試験

最初の一連の試験の過程で、赤血球を計数するために、前述の方法が希釈血液サンプルで使用された。図５Ａ〜５Ｄは、自動血液学機械ABX Pentra 120 DXによって生成された値の関数としての方法によって得られた結果を示している。実験条件は次の通りである。
・サンプル１０：厚さ１００μｍのCountess（登録商標）流体チャンバに含まれる希釈血液であって、検査された容量は３ｍｍ^３、又は３μｌである。
・光源１１：発光ダイオードCree MC-E Color、スペクトル帯域Δλが、４５０〜４６５ｎｍ、５２０〜５３５ｎｍ、６３０〜６４０ｎｍでそれぞれ発光する３つの発光ダイオードで構成される。この例では、各照明中に単一のダイオードがアクティブになる。また、図１Ｂに示される実施形態によれば、４０５ｎｍの波長で放射するレーザーダイオードが使用された。
・画像センサ：CMOS IDS μEyeモノクロセンサ、３８４０×２７４８ピクセル、各ピクセルのサイズは１辺１．６７μｍ、検出面は約３０ｍｍ^２
・光源１１とサンプル１０の間の距離Ｄ：光源１１が発光ダイオードの場合は８ｃｍ、光源がレーザーダイオードの場合は１５ｃｍ
・サンプル１０と画像センサ１６間の距離ｄ：１５００μｍ
・流体室１５の厚さｅ：１００μｍ
・光源１１が発光ダイオードである場合の空間フィルター１８の開口の直径：１５０μｍ

この最初の一連の試験では、ヒトの血液を球状化試薬で希釈し、赤血球の表面張力を変更して球状化させた。当業者によく知られた方法で、血液の濃度と赤血球数の計数との間の再較正を行うため、基準機を用いて予備較正を行った。この再較正では、希釈係数、チャンバの厚さ、及び画像センサに曝されたサンプルの表面が考慮される。

サンプル調製のプロトコルは次の通りである。
・球状化試薬で１／６００に希釈。
・１０μｌの希釈血液のサンプルを採取し、画像センサの反対側に配置された流体チャンバに注入する。

各サンプルは、参照方法として使用されたABX Pentra DX 120によって計数された。

８０個のサンプルが測定された。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ及び図５Ｄは、それぞれ、基準測定値（横軸）の関数として本発明を実施することによって得られた結果（縦軸）を示している。光源は、以下である。
・４５０〜４６５ｎｍのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・５２０〜５３５ｎｍのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・６３０〜６４０ｎｍのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・レーザーダイオード

これらの各数値に対して線形回帰が確立され、各回帰式はそれぞれ次の通りである。
・ｙ＝１．０１７ｘ−０．０４（ｒ^２＝０．９８）
・ｙ＝１．０１９ｘ−０．０７（ｒ^２＝０．９８）
・ｙ＝１．０１７ｘ−０．０７（ｒ^２＝０．９８）
・ｙ＝１．０２７ｘ−０．１１（ｒ^２＝０．９８）

係数ｒ^２は、Passing-Bablokタイプの各線形回帰に関連する決定係数である。

２回目の試行では、溶解試薬を加えて赤血球を溶解した後、ヒトの血液サンプル内の白血球を計数した。画像のセグメント化は、最大エントロピー基準に基づく閾値処理に基づいて行われた。白血球の密度を考慮するために、使用された希釈係数は１０だった。図６Ａは、サンプルの拡張面である再構成面Ｐ_ｚの複素画像の絶対値の画像を表している。図６Ｂは、２つの白血球で構成されるクラスターのセグメンテーション、２値化、及び検出後の図６Ａの画像を表している。これらは白いリングで囲まれている。シングレットとダブレットとの識別により、関心領域の単純な計数と比較して、白血球をより正確に定量化できる。図６Ｃ及び６Ｄは、それぞれ異なるサンプルである図６Ａ及び６Ｂに対応している。前述のように、取得はレーザータイプの光源を使用して行われた。

この方法は、直径５μｍのガラスビーズを使用して、３回目の一連の試行中に同様にテストされた。これらは、Bangs Laboratoriesの参照ビーズSS06Nであり、PBSタイプの生理食塩水バッファーで１／２０００に希釈した。前述のように、取得はレーザータイプの光源を使用して行われた。２つのビーズを含むクラスターの検出が観察される。図７Ａは、サンプルの拡張面である再構成面Ｐ_ｚの複素画像の絶対値の画像を表している。図７Ｂは、２つのビーズを含むクラスターのセグメンテーション、２値化、及び検出後の図７Ａの画像を表しており、これらのクラスターは白い輪郭で囲まれている。

赤血球の場合、本発明者らは、計数対象の粒子の検出表面あたりの表面密度が２０００個／ｍｍ^２未満であることが好ましいと考えている。これを超えると、粒子が近すぎ、各関心領域の信号ノイズ比が低下する。したがって、問題のさまざまな場合について、最大表面密度を推定し、サンプルに適用する希釈を調整することが有利である。

意図する用途の１つは、赤血球、白血球、又は血小板などの血球の計数である。本発明者らは、白血球又は赤血球の場合、ステップ１２０中に、再構成画像Ｉ_ｚが再構成面Ｐ_ｚにおける複素振幅Ａ_ｚの絶対値を表すことが好ましいことを発見した。セルに対応する関心領域のエッジの定義は、より明確である。一方、対象粒子が血小板である場合、再構成画像Ｉ_ｚが再構成面Ｐ_ｚにおける複素振幅Ａ_ｚの位相を表すことが望ましいようである。図８Ａ及び８Ｂは、再構成された複素画像の絶対値又は位相にそれぞれ基づいた、赤血球に対応する関心領域の信号ノイズ比のヒストグラムを表す。検討された赤血球の数は、それぞれ１２１６６及び１２８８８であった。位相画像（平均１３．９）に基づく場合よりも、絶対値の画像（平均１８．６）に基づく場合の方が高い信号ノイズ比が観察される。これらの試験では、赤血球は青いスペクトル帯域で照らされた。

本発明者らは実験的試験を実施した。これらの試験後、本発明者らは以下に示す変形例を定義した。各変形例は、全体又は一部を前述の手順と組み合わせることができる。

第１の変形例によれば、前述のようにステップ１００、１１０、及び１２０を実行する。ステップ１２０の過程において、考慮される再構成距離は、前述のように、デジタルフォーカシングアルゴリズムを実行することにより決定される集束距離（focusing distance）に対応する。ステップ１２０は、デジタルフォーカシングの有効性の基準の決定も含む。このため、ステップ１１０で取得された画像は、ｐ個のゾーンに仮想的に分割され、ｐは厳密に正の整数である。通常、ｐは９などの１〜１００の間である。各ゾーンで集束距離ｄ_ｐを取得するために、デジタルフォーカシングアルゴリズムが各ゾーンに適用される。次に、集束距離のばらつき指標δ（ｄ_ｐ）を決定する。
・ばらつき指標δ（ｄ_ｐ）が所定の最大ばらつき指標δ_ｍａｘを超える場合、デジタルフォーカシングは無効になる。この場合、集束距離は、以前に分析されたｋ個のサンプルの記憶された集束距離ｄ_ｋに基づいて確立された平均集束距離ｄ_ｍｅａｎに等しいと考えられる。例えば、平均集束距離ｄ_ｍｅａｎは、最後に分析されたｋ個のサンプルを考慮した移動平均によって計算され得る。ｋは、例えば２〜１００の間の整数である。ｄ_ｍｅａｎは、最後に分析されたｋ個の各サンプルの集束距離ｄ_ｋの中央値でもよい。
・ばらつき指標δ（ｄ_ｐ）が最大ばらつき指標δ_ｍａｘより小さい場合、集束距離は、各ゾーンでそれぞれ取得された集束距離ｄ_ｐの平均ｄ_ｐ ⁻（又は中央値）と見なされる。

ばらつき指標δ（ｄ_ｐ）は、最小集束距離ｄ_{ｐ−ｍｉｎ}と最大集束距離ｄ_{ｐ−ｍａｘ}との差、すなわちδ（ｄ_ｐ）＝ｄ_{ｐ−ｍａｘ}−ｄ_{ｐ−ｍｉｎ}であり得る。また、ばらつき指標δ（ｄ_ｐ）は、集束距離ｄ_ｐの標準偏差又は分散を含んでもよい。

さらに、取得された画像を分割する各ゾーンでは、フォーカシング下限ｄ_ｉｎｆとフォーカシング上限ｄ_ｓｕｐを考慮することにより、デジタルフォーカシングアルゴリズムが確立される。デジタルフォーカシングアルゴリズムを各ゾーンに適用した後、少なくとも１つのゾーンについて、決定された集束距離が下限ｄ_ｉｎｆ以下、又は上限ｄ_ｓｕｐ以上である場合、集束距離は上記の平均（又は中央値）集束距離ｄ_ｍｅａｎに等しいと見なされる。実際、フォーカシングアルゴリズムがｄ_ｉｎｆ以下又はｄ_ｓｕｐ以上の集束距離ｄ_ｐを少なくとも１つ提供する場合、集束距離にエラーがある可能性がある。したがって、集束距離は、より確からしいと考えられる距離ｄ_ｍｅａｎに置き換えられる。

第２の変形例によれば、ステップ１３０の過程で、セグメンテーションは大津閾値処理によって行われる。そのようにして得られたセグメンテーション閾値の値は、再構成画像の位相画像又は絶対値の画像、又はこれらの組み合わせのいずれであっても、再構成画像Ｉ_ｚのヒストグラムのモードと比較される。ヒストグラムのモードは、再構成された画像のヒストグラムの最大値に対応するピクセルの強度のレベルに対応する。大津閾値処理によって決定されたセグメンテーション閾値がヒストグラムのモードの９０％より大きい場合、適用されるセグメンテーション閾値は、ヒストグラムのモードの特定のパーセンテージ、例えば、８０〜８５％の間に設定される。実際、大津閾値がヒストグラムのモードに近い場合、ノイズのゾーンは１つ以上の関心領域であると見なされるため、再構成画像のセグメンテーションは一般に満足できるものではない。これらの条件では、ヒストグラムのモードの８０〜８５％の間にセグメンテーション閾値を課すという事実により、この落とし穴を回避できる。

第３の変形例によれば、ステップ１３０中にセグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊の品質Ｑの基準を決定する。品質の基準がセグメンテーション画像の品質の低下を示している場合、この方法は中断される。

品質Ｑの基準は、ステップ１３０の過程で実行されたセグメンテーションから生じる関心領域の全体の面積に対応し得る。したがって、前述のようにステップ１００、１１０、１２０、１３０を実行する。ステップ１３０の過程で、セグメンテーションにより決定された関心領域の総面積Ａを決定する。セグメンテーションは、例えば、大津閾値処理の適用により実行される。
次に、
・総面積Ａが定義済みの最大面積Ａ_ｍａｘを超える場合、ステップ１１０で取得した画像は無効になる。
・総面積Ａが最大面積Ａ_ｍａｘより小さいが近い場合、セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊の信号ノイズ比ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊）に基づいて、補助基準Ｑ’を計算する。最大面積に近いということは、Ａ_ｍａｘは、最大面積と最大面積の８０％又は９０％などの最大面積Ａ_ｍａｘの割合との間を意味する。

最大面積Ａ_ｍａｘは、実験的試行に基づいて当業者によって決定され得る。セグメンテーション画像の信号ノイズ比ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊）は、ステップ１３０でセグメント化された異なる関心領域ＲＯＩの強度Ｉ_ＲＯＩのレベルに対応し、関心領域外のノイズＮ_ｏｕｔの推定によって正規化される。強度Ｉ_ＲＯＩのレベルは、異なる関心領域ＲＯＩにおける強度の平均値μ又は中央値ｍｅｄによって推定され得る。関心領域外のノイズＮ_ｏｕｔは、関心領域ＲＯＩ外のセグメント化画像Ｉ_ｚ ^＊の標準偏差σによって推定される。
したがって、

次に、そのように定義された信号ノイズ比は、所定の信号ノイズ比閾値ＳＮＲ_ｍｉｎと比較される。信号ノイズ比ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊）がこの閾値より大きい場合、セグメンテーション画像は有効であると見なされる。そうでない場合、セグメンテーション画像は無効になる。

そのような実施形態によれば、ステップ１３０の後、セグメンテーション画像Ｉ_ｚ ^＊に関する少なくとも１つの品質Ｑの基準を決定する。品質の基準は、ステップ１３０の過程でセグメント化された全ての関心領域の面積Ａと所定の最大面積Ａ_ｍａｘとの間の比較に対応し得る。比較の関数として、セグメンテーション画像は有効化又は無効化される。セグメント化された全ての関心領域の面積Ａが、最大面積Ａ_ｍａｘより小さく、最大面積Ａ_ｍａｘに近い場合、品質Ｑ’の補助的な基準が決定される。前に定義したように、セグメンテーション画像の信号ノイズ比ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊）と最小信号ノイズ比ＳＮＲ_ｍｉｎとの比較が含まれ得る。この比較の関数として、セグメンテーション画像は有効化又は無効化される。

この変形例は、赤血球である３０５個のサンプルに適用された。空の画像、粒子の数が少なすぎる又は多すぎる画像、又は取得中に発生した問題に起因する画像など、特定のケースに対応する画像を無効化できた。

以下に説明する第４の変形例は、特に血液を含むサンプルに関するものである。実験的試行の過程で、発明者は、一般に、対象粒子が赤血球である場合、ステップ１４０で、Ｎタイプの関心領域ＲＯＩ_ｎと１の区別を提供することが望ましいと考えた。Ｎは一般に３〜５の整数である。ステップ１４０に関連して説明したように、表記ＲＯＩ_ｎは、ｎ個の粒子を含む関心領域ＲＯＩに対応することが想起されるであろう。整数Ｎは、同じ関心領域内の許容可能な赤血球の最大数に対応する。Ｎ＝５の場合、シングレット（ｎ＝１）、ダブレット（ｎ＝２）、トリプレット（ｎ＝３）、クワドラプレット（ｎ＝４）及びクイントプレット（ｎ＝５）に対応する５種類の関心領域を区別する。サイズが上限閾値Ｓ_ｍａｘを超える関心領域は、赤血球のクラスターに対応しないと考えられる。したがって、ステップ１４０は、最大サイズＳ_ｍａｘを考慮に入れ、そのサイズが最大サイズＳ_ｍａｘよりも大きい場合の関心領域の拒否を含む。最大サイズＳ_ｍａｘは、関心領域ＲＯＩ_ｎ＝Ｎに対応するサイズより大きいサイズである。最大サイズＳ_ｍａｘはパラメーター化可能であり、例えば使用する流体チャンバなどの実験条件によって異なる。サイズが最大サイズＳ_ｍａｘを超える関心領域は拒否される。分析されたサンプルに凝集素を欠く血液が含まれている場合、拒否された関心領域の数は１０未満であることが分かっている。拒否された関心領域の数は、以下を比較することで決定できる。
・セグメンテーションステップ１３０の終了時の関心領域の数。
・選択ステップ１４０の終了時の関心領域の数。

拒否された関心領域の数が事前定義された許容レベルＬ_ｍａｘ以下、例えば１０以下である場合、対象粒子の数が有効化される。許容レベルＬ_ｍａｘは、実験的学習段階の過程で、当業者によって調整され得る。拒否された関心領域の数が許容レベルＬ_ｍａｘを超えると、対象粒子の計数が無効になり、この無効が報告される。そのような状況は、例えば、冷たい凝集素を含む血液に対応し得る。これにより、血液には赤血球の多くのクラスターが含まれ、赤血球の最大許容数Ｎよりも多くの赤血球がある。そのような場合、発明者は、拒否された関心領域の数が数十、又は数百に達し得ることを観察した。拒否された関心領域の数を考えると、赤血球の数は非常に過小評価されている。

冷たい凝集素を含む血液を含む６サンプルの実験的試験の過程で、Ｎ＝５を考慮して、発明者らは、３２５、３７９、４９０、５０８、３２７、４２３にそれぞれ等しい多数の拒否された関心領域を測定した。許容レベルＬ_ｍａｘを超える拒否された関心領域の数を考えると、赤血球の数は無効になった。

そのような実施形態によれば、ステップ１３０の後、画像のセグメンテーションから生じる関心領域の数を決定する。次に、ステップ１４０には以下が含まれる。
・そのサイズを超えると拒否される関心領域の最大サイズＳ_ｍａｘを考慮する。
・拒否された関心領域の数を決定する。
・対象粒子の計数が有効化又は無効化される関数として、許容レベルＬ_ｍａｘを考慮し、拒否された関心領域の数と許容レベルとを比較する。

許容レベルＬ_ｍａｘは、実験的試行の過程で当業者によって定義される。

本発明は、血液中の対象粒子の計数に使用できるが、尿、唾液、精子などの他の体液にも使用できる。また、細菌又は細菌コロニーなどの微生物の定量にも使用できる。生物学又はヘルスケアを含む用途を超えて、本発明は、例えば農業又は工業用流体の検査などの工業分野におけるサンプルの検査又は環境モニタリングに使用され得る。

Claims (20)

1. サンプル（１０）内に配置された対象粒子（１０ａ）の計数方法であって、
   ａ）前記サンプル（１０）に向かって伝播する入射光波（１２）を発する光源（１１）を用いて、前記サンプル（１０）を照明するステップと、
   ｂ）当該照明の影響下で、暴露波として知られている光波（１４）に曝される画像センサ（１６）を用いて、前記光源（１１）と前記画像センサ（１６）の間に配置された前記サンプル（１０）の画像であって、検出面（Ｐ_０）に形成され、前記光波（１４）を表す画像（Ｉ_０）を取得するステップと、を含み、
   さらに、
   ｃ）ステップｂ）中に取得した前記画像（Ｉ_０）に基づいて、伝播演算子（ｈ）を適用して、前記検出面（Ｐ_０）の反対側に延びる再構成面（Ｐ_ｚ）に沿って、前記暴露波（１４）の複素式（Ａ_ｚ）を計算するステップと、
   ｄ）前記再構成面に沿った前記複素式の絶対値又は位相の分布を表す再構成画像として知られる画像（Ｉ_ｚ、Ｍ_ｚ、φ_ｚ）を形成するステップと、
   ｅ）互いに離間し、全て又は一部が少なくとも１つの対象粒子に関連付けられた関心領域（ＲＯＩ）を含むセグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）を取得するために、ステップｄ）中に形成された前記画像のセグメンテーションを行うステップと、
   ｆ）関心領域のサイズを決定すると共に、
   当該関心領域に単一の対象粒子が含まれるクラスと、当該関心領域に１より大きい整数の対象粒子が含まれるクラスとの少なくとも１つによるサイズの関数として当該関心領域を分類するステップと、
   ｇ）ステップｆ）中に分類された前記関心領域に基づいて対象粒子を計数するステップと、を含むことを特徴とする、
   方法。
2. ステップｆ）において、分類の前に、
   各関心領域の少なくとも１つの形態学的基準を決定し、
   前記形態学的基準の関数として関心領域（ＲＯＩ）を選択し、
   選択された関心領域を分類する、
   請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つの形態学的基準が、各関心領域の直径、サイズ、又は形状因子の中から選択される、
   請求項２に記載の方法。
4. ステップｆ）が、所定数の対象粒子を表す基準サイズ（Ｓ_ｒｅｆ）を考慮することを含み、前記基準サイズの関数として分類する、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップｆ）は、
   ｆｉ）所定の対象粒子の数に対応する第１の基準サイズ（Ｓ_{ｒｅｆ−１}）の関数として実行される関心領域を分類するサブステップ（第１の分類）と、
   ｆｉｉ）前記第１の分類の後、サブステップｆｉ）中に分類された関心領域に基づいて、事前に定義された数の対象粒子を含むとして、第２の基準サイズ（Ｓ_{ｒｅｆ−２}）を決定するサブステップと、
   ｆｉｉｉ）サブステップｆｉｉ）で決定された第２の基準サイズ（Ｓ_{ｒｅｆ−２}）の関数として実行される、関心領域を分類するサブステップ（第２の分類）と、を含む、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップｆ）において、分類の前に、
   いくつかの関心領域（ＲＯＩ）の信号ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を計算し、
   各関心領域に対して計算された前記信号ノイズ比（Ｓ／Ｎ）の関数としての関心領域（ＲＯＩ）を選択し、
   選択された関心領域を分類する、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 対象粒子（１０ａ）の形状を修正して球形にするために、ステップｂ）の前にサンプルを球状化試薬と混合する、
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップｃ）は、
   ｃｉ）前記画像センサによって取得された前記画像（Ｉ_０）に基づいて、前記検出面内の前記サンプルの初期画像（Ａ_０ ^ｋ＝０）を定義するサブステップと、
   ｃｉｉ）サブステップｃｉ）中に定義された前記サンプルの初期画像（Ａ_０ ^ｋ＝１）、又は前の反復（ｋ−１）の結果である前記検出面での前記サンプルの画像（Ａ_０ ^ｋ−１）に対し、伝播演算子を適用することにより、再構成面（Ｐ_ｚ）における前記サンプルの複素画像（Ａ_ｚ ^ｋ）を決定するサブステップと、
   ｃｉｉｉ）サブステップｃｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａ_ｚ ^ｋ）に基づいて、当該複素画像（Ａ_ｚ ^ｋ）に影響する再構成ノイズに依存するノイズ指標（ε^ｋ）を計算するサブステップと、
   ｃｉｖ）前記画像のピクセルの位相値（φ_０ ^ｋ（ｘ，ｙ））に従って、サブステップｃｉｉｉ）中に計算された前記指標の変化の関数として、前記位相値を調整することによって、前記検出面（Ｐ_０）における前記サンプルの画像（Ａ_０ ^ｋ）を更新するサブステップと、
   ｃｖ）前記検出面（Ｐ_０）及び前記再構成面（Ｐ_ｚ）における前記サンプル（１０）の複素画像を取得するために、収束基準に達するまでサブステップｃｉｉ）〜ｃｉｖ）を繰り返すサブステップと、を含む、
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記サンプル（１０）と前記画像センサ（１６）との間に画像形成光学素子が配置されていない、
   請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 対象粒子が血球である、
    請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ステップｄ）中において、
    前記対象粒子（１０ａ）は赤血球又は白血球であり、前記再構成画像は、前記再構成面（Ｐ_ｚ）に沿った複素式（Ａ_ｚ）の絶対値の分布を表しているか、
    前記対象粒子（１０ａ）は血小板であり、前記再構成画像は、前記再構成面（Ｐ_ｚ）に沿った複素式（Ａ_ｚ）の位相の分布を表している、
    請求項１０に記載の方法。
12. ステップｃ）が、前記再構成面（Ｐ_ｚ）が延びる再構成の距離に対応する集束距離を決定するために、デジタルフォーカシングアルゴリズムを適用することを含む、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ステップｃ）中に、ステップｂ）中に取得された画像が、互いに異なるゾーンに分割され、デジタルフォーカシングアルゴリズムが各ゾーンに適用され、それぞれのために集束距離（ｄ_ｐ）を取得し、
    さらに、ステップｃ）において、
    最大ばらつき指標（δ_ｍａｘ）を考慮に入れ、
    得られた集束距離（ｄ_ｐ）のばらつきを表すばらつき指標（δ（ｄ_ｐ））を計算し、
    計算されたばらつき指標（δ（ｄ_ｐ））と前記最大ばらつき指標（δ_ｍａｘ）とを比較し、
    比較の関数として、
    各ゾーンで得られた集束距離（ｄ_ｐ）の平均又は中央値（ｄ_ｐ ⁻）を計算し、ステップｃ）中に使用される前記集束距離を形成するか、
    又は、ステップｃ）中に使用される前記集束距離（ｄ_ｍｅａｎ）を確立するために、記憶された集束距離を考慮する、
    請求項１２に記載の方法。
14. 前記ばらつき指標（δ（ｄ_ｐ））は、最大集束距離（ｄ_{ｐ−ｍａｘ}）と最小集束距離（ｄ_{ｐ−ｍｉｎ}）との差、又は得られた集束距離（ｄ_ｐ）の分散又は標準偏差である、
    請求項１３に記載の方法。
15. ステップｃ）中に、ステップｂ）中に取得された画像が、互いに異なるゾーンに分割され、デジタルフォーカシングアルゴリズムが各ゾーンに適用され、それぞれのために集束距離（ｄ_ｐ）を取得し、
    さらに、ステップｃ）において、
    フォーカシング下限（ｄ_ｉｎｆ）を考慮に入れ、
    フォーカシング上限（ｄ_ｓｕｐ）を考慮に入れ、
    各集束距離（ｄ_ｐ）と前記フォーカシング下限（ｄ_ｉｎｆ）及び前記フォーカシング上限（ｄ_ｓｕｐ）とを比較し、
    比較の関数として、
    前記集束距離が前記フォーカシング下限（ｄ_ｉｎｆ）と前記フォーカシング上限（ｄ_ｓｕｐ）との間にある場合、各ゾーンで得られた集束距離（ｄ_ｐ）の平均又は中央値（ｄ_ｐ ⁻）を計算し、ステップｃ）で使用される集束距離を形成し、
    前記集束距離（ｄ_ｐ）が前記フォーカシング下限（ｄ_ｉｎｆ）以下又は前記フォーカシング上限（ｄ_ｓｕｐ）以上の場合、ステップｃ）中に使用される前記集束距離（ｄ_ｍｅａｎ）を確立するために、記憶された集束距離を考慮する、
    請求項１２に記載の方法。
16. ステップｅ）において、
    前記再構成画像の最大ピクセル数の強度に対応する前記再構成画像（Ｉ_ｚ，Ｍ_ｚ，φ_ｚ）のヒストグラムのモードを決定し、
    再構成画像のセグメンテーションが行われるセグメンテーション閾値を取得するために、大津閾値処理を実行し、
    前記セグメンテーション閾値が前記ヒストグラムのモードの９０％を超える場合、セグメンテーション閾値は前記ヒストグラムのモードの８０〜８５％のパーセンテージに設定されるように、前記ヒストグラムのモードとセグメンテーション閾値とを比較する、
    請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ステップｅ）において、
    所定の最大面積（Ａ_ｍａｘ）を考慮に入れ、
    前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）の全ての関心領域（ＲＯＩ）の面積（Ａ）を決定し、
    全ての関心領域の面積（Ａ）と最大面積（Ａ_ｍａｘ）とを比較し、
    前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）の比較、拒否又は検証の関数として、
    前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）の品質（Ｑ）の基準の決定する、
    請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）が有効化され、関心領域の面積（Ａ）が最大面積（Ａ_ｍａｘ）の近くに位置する場合、
    所定の最小信号ノイズ比（ＳＮＲ_ｍｉｎ）を考慮し、
    前記関心領域（ＲＯＩ）における平均強度又は中央値強度（Ｉ_ＲＯＩ）と前記関心領域外における前記セグメンテーション画像のノイズレベル（Ｎ_ｏｕｔ）との比の形式で、前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）の信号ノイズ比（ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊））を計算し、
    前記セグメンテーション画像の前記信号ノイズ比（ＳＮＲ（Ｉ_ｚ ^＊））と前記最小信号ノイズ比（ＳＮＲ_ｍｉｎ）とを比較し、
    前記セグメンテーション画像（Ｉ_ｚ ^＊）の比較、拒否又は検証の関数として、
    品質の補助的な基準（Ｑ’）を決定する、
    請求項１７に記載の方法。
19. ステップｆ）中に、サイズが所定の最大サイズ（Ｓ_ｍａｘ）を超える関心領域が拒否され、
    ステップｆ）中に拒否された関心領域の数を決定し、
    所定の許容レベル（Ｌ_ｍａｘ）を考慮に入れ、
    ステップｆ）中に拒否された関心領域の数と、ステップｇ）で実行された対象粒子の計数が有効化又は無効化される関数としての許容レベル（Ｌ_ｍａｘ）とを比較する、
    請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. サンプル（１０）内に配置された対象粒子（１０ａ）を計数するための装置であって、
    サンプル（１０）に向かって伝搬する入射光波（１２）を放射できる光源（１１）と、
    サンプル（１０）を光源（１１）と画像センサ（１６）との間に保持するように設計された支持体（１０ｓ）と、
    画像センサ（１６）によって取得されたサンプルの画像を受け取り、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法のステップｃ）〜ｇ）を実行するように設計されたプロセッサ（２０）と、を含む、
    装置。

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