JP6986286B2 - 海洋生物ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Description

本発明はＤＮＡポリメラーゼに関する。本発明は特に、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種由来のＤＮＡポリメラーゼに基づくＤＮＡポリメラーゼに関する。

微生物同定の標準法では依然として、原因病原体を培養し、次いで表現型を分化させるが、この過程の実施および解析には数日を要することが多く、この遅れが感染症の罹病率および死亡率に大きな影響を及ぼすことがある。さらに、多くの微生物は培地で増殖することができず、このため、既存の培養方法では検出されない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は多くの方法で分子遺伝学および分子診断の分野に革命をもたらした。ＰＣＲ技術で主力となっているのが、加熱および冷却の周期的事象とともに鎖の分離、プライマーのアニーリングおよび伸長を生じさせ、標的ＤＮＡ配列を増幅させる耐熱性の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである。現在、ＰＣＲ技術は生物医学および生命科学の研究のほか分子診断にも広く用いられている。

病院外の患者のコミュニティでの疾患診断を可能にする医療ツールまたは医療装置としてポイントオブケア（ＰＯＣ）診断が記載されている。理想的な診断検査法は、「ＡＳＳＵＲＥＤ」基準、すなわち、手頃であり、高感度であり、特異的であり、利用しやすく、迅速かつ確実で、設備を必要とせず、必要とする者に対して実施されるという基準を満たすものであるべきである。ＰＣＲ技術には大きな可能性が秘められているものの、依然としていくつか制約があり、加熱と冷却の工程を繰り返す高精度な電動温度サイクリング設備の使用およびその設備を稼働させる熟練者が必要であるアニーリング工程での誤ったプライミングよる非特異的増幅が問題となっており、また、ＰＣＲが「粗」試料中の阻害化合物の影響を受けやすいということもある。さらに、ＰＣＲ装置が大型の設計であることから、ＰＣＲはＰＯＣ技術プラットフォームに取り込むには不完全な解決法であり、ＰＣＲベースの方法をＰＯＣ診断の主要なテクノロジードライバーとして採用するのは困難なものとなっている。

最近、ＰＣＲをベースとしない方法または等温増幅法が注目を集めつつある。これらの方法では、一定（中程度）の温度で核酸増幅が起こり、高精度の温度サイクルおよび制御も高温で安定な酵素も不要である。等温増幅法は、ＰＣＲと同等の解析感度および特異性を有し、ＰＣＲよりも阻害化合物に対する耐性が高く、短時間で結果が得られ、使用も容易であることが報告されている。このような特徴があることから、等温増幅法はＰＯＣ分子診断プラットフォームを開発し、「ＡＳＳＵＲＥＤ」基準を満たすことを目的とする者に極めて望ましいものである。この１０年間に、核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）の等温増幅に関する方法が多数公開されている（Ｇｉｌｌ，Ｐ．およびＡ．Ｇｈａｅｍｉ（２００８）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２７（３）：２２４−２４３；Ｃｒａｗ，Ｐ．およびＷ．Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ（２０１２）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １２（１４）：２４６９−２４８６；ｄｅ Ｐａｚ，Ｈ．Ｄ．ら（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ １４（７）：８２７−８４３；Ｙａｎ，Ｌ．ら（２０１４）Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ １０（５）：９７０−１００３で概説されている）。その方法のいくつかでは、反応設定に使用するＤＮＡポリメラーゼに固有の鎖置換活性によって成否が左右される。鎖置換という用語は、ポリメラーゼが合成時に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を表す。

診断以外の目的とする分野にも、ＤＮＡポリメラーゼにより可能になった等温増幅技術により利益がもたらされる。この点に関して、ゲノム研究には、特にＤＮＡが少量しか存在しない場合および／または単一の細胞を用いる方法に全ゲノム増幅（多置換増幅）が重要なものとなっている。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシング技術および２０１３年にＭａらが公開した次世代シーケンシングのための等温増幅法（Ｍａ，Ｚ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（３５）：１４３２０−１４３２３）の例があるように、次世代シーケンシング法でも、市販のもの、概念実証段階にあるものを問わず、鎖置換ポリメラーゼが重要なものとなっている。

しかし、様々な等温技術に現在用いられているポリメラーゼ酵素のツールボックスはごく限られている。様々な等温法には通常、３０〜６５℃の反応温度が必要であり、この温度は主として、反応に使用するポリメラーゼの機能範囲によって決まる。

例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼは、比較的狭い温度範囲でのみ有用なレベルのポリメラーゼ活性を示し、低温ないし中温（例えば、２５℃）では比較的活性が低い。当該技術分野で必要とされるのは、広範囲の温度、特に低温ないし中温で、好ましくはそれより高い温度でも有用なレベルのポリメラーゼ活性および優れた安定性を示すＤＮＡポリメラーゼである。このようなポリメラーゼは、室温またはその付近の温度を含めた広範囲の温度で実施する等温増幅反応に有用であると思われる。本発明者らは、これらの基準を驚くほど満たすサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種由来のＤＮＡポリメラーゼを同定した。サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種は低温に適応しており、そのＤＮＡポリメラーゼＩは低温で活性を示す。しかし、他の海洋生物のＤＮＡポリメラーゼとは異なり、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩは、２０〜２５℃超で急速に不活化することはなく、このため、広範囲の温度で極めて有用なＤＮＡポリメラーゼである。さらに、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩは、全般的に他の海洋生物のポリメラーゼよりはるかに活性が高い。

したがって、本発明は、第一の態様では、単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。

配列番号１のＤＮＡポリメラーゼは、ノルウェー北部で単離された海洋細菌であるサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種（本明細書ではＰＢ、ＰｂまたはＰｂＩとも呼ぶ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列に基づくものである。ただし、配列番号１には、野生型サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩ配列中に存在する５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインがない。好ましい実施形態では、５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性が増幅混合物中のプライマーおよび／または産物を分解し得ることから通常好ましくないものであるため、ＤＮＡポリメラーゼ酵素に５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインが存在しない。

いくつかの実施形態では、本発明は、単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列よりなるか、または配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列よりなる。

好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％、例えば少なくとも９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と比較して単一または複数のアミノ酸変化（付加、置換、挿入または欠失）を有するアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）。このような配列は、好ましくは、変化したアミノ酸を最大５個、例えば１個のみ、２個、３個、４個または５個、好ましくは１個、２個または３個、より好ましくは１個または２個含み得る。置換は保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸によるものであり得る。好ましくは、前記変化は保存的アミノ酸置換である。

好ましくは、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは配列番号１のアミノ酸配列よりなる。
一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは配列番号３のアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）。本発明は、配列番号３の変異体およびフラグメントも提供する。本明細書に記載される配列番号１の変異体およびフラグメントのタイプは、配列番号３の変異体およびフラグメントに準用される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼの酵素的に活性なフラグメントも提供される。酵素的に活性なフラグメントとは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するフラグメントのことである。酵素的に活性なフラグメントは、長さが少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも４７５アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも５２５アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも５６０アミノ酸、少なくとも５７０アミノ酸または少なくとも５７５アミノ酸であり得る。好ましいフラグメントは、長さが少なくとも５２５アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも５６０アミノ酸、少なくとも５７０アミノ酸または少なくとも５７５アミノ酸である。フラグメントは、配列番号１の対応する部分と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば、少なくとも９８％、９９％または９９．５％）または１００％同一である。

所与のＤＮＡポリメラーゼには一般に、最大ポリメラーゼ活性が観察される温度がある。多くのＤＮＡポリメラーゼでは、温度が最大活性の観察される温度から逸脱する（例えば、低下または上昇する）と一般に、ごくわずかな温度の逸脱であってもポリメラーゼ活性の著明な低下がみられ、このことは、多くのポリメラーゼが極めて狭い温度範囲で実施する応用での使用にのみ適することを意味する。

本発明者らは、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩが、低温ないし中温を含めた広範囲の温度で、最大ポリメラーゼ活性が観察される温度でのＤＮＡポリメラーゼ活性と比較して相当なＤＮＡポリメラーゼ活性を示す点で有利であることを明らかにした。換言すれば、本発明者らは、このサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩが、多くのＤＮＡポリメラーゼとは異なり、最大活性が観察される温度と大幅に異なる温度で、その最大ポリメラーゼ活性の有用な割合を示すことを明らかにした。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、広範囲の温度にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の相当な割合を示す。
好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼがその最大活性を示す温度は約３７℃〜４２℃、好ましくは３７℃〜４０℃（例えば、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃）である。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の相当な割合を示す。
本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも３０％を示す。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、１０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも４０％を示す。
本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、１５℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも５０％を示す。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、２０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも６０％を示す。
本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、３０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％または少なくとも９０％）を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼが最大活性を示す温度から最大約１０℃（例えば１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、９℃または１０℃）逸脱（上昇または低下）した温度で、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約３０％を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼが最大活性を示す温度から最大約５℃（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃）逸脱（上昇または低下）した温度で、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約６０％を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼが最大活性を示す温度より最大約３５℃〜４０℃低い（例えば、４０℃、３０℃、２０℃、１０℃または５℃低い）温度で、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約３０％を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼが最大活性を示す温度より最大約１２℃〜約１５℃低い（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１２℃または１５℃低い）温度で、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約６０％を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼが最大活性を示す温度より最大約５℃〜約１０℃低い（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃低い）温度で、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約７０％（好ましくは、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）を示す。

ＤＮＡポリメラーゼ活性を解析するのに適したアッセイは当該技術分野で公知である。したがって、このようなアッセイを用い、ポリメラーゼがその最大活性を示す温度で示されるＤＮＡポリメラーゼ活性と比較した所与の温度でのＤＮＡポリメラーゼ活性を求めることができる。上記のＤＮＡポリメラーゼ活性は、単一ヌクレオチド組込みアッセイを用いて評価し得る。例示的な単一ヌクレオチド組込みアッセイでは、１９ヌクレオチドからなり５’末端がフルオロフォアで標識されたプライマーを４０ヌクレオチドからなる鋳型ＤＮＡ鎖とアニールさせ；反応設定中、存在する唯一のｄＮＴＰはｄＡＴＰであり、このため、ポリメラーゼはプライマーを５’−３’方向に２０位で１ヌクレオチド分のみ伸長させることができ（鋳型鎖上の対応する（相補的な）位置にはＴが１つ存在するため）；それに続く変性ポリアクリルアミドゲル（例えば、１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）およびフルオロフォア標識オリゴヌクレオチドのスキャンによる解析では、１９オリゴヌクレオチドからなるプライマーおよびヌクレオチドアデニンの分だけ伸長し、したがって２０オリゴヌクレオチドからなるプライマーがみられ；伸長プライマー（強度１）および未伸長プライマー（強度０）を表すバンドの濃度測定により酵素活性（すなわち、ポリメラーゼ活性）を求め；組込み［％］＝強度１／（強度０＋強度１）×１００により相対組込み率を算出する。

このように、（ｉ）１９ヌクレオチドからなり、５’末端がフルオロフォアで標識されたプライマーを準備する段階、（ｉｉ）前記プライマーを４０ヌクレオチドからなる鋳型ＤＮＡ鎖とアニールさせてプライマー−鋳型複合体を形成させる段階、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端の２０位に組み込まれる唯一のｄＮＴＰ（前記ｄＮＴＰはアニールする鋳型ＤＮＡ鎖上の関連するヌクレオチドに相補的なものである）の存在下、前記アニールしたプライマー−鋳型複合体を関連する温度（すなわち、検討する温度）でＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする段階および（ｉｖ）未伸長プライマー（１９ヌクレオチド）に対する伸長プライマー（２０ヌクレオチド）の量を求め、未伸長プライマーに対する伸長プライマーの量がポリメラーゼ活性のレベルに対応する（すなわち、伸長プライマーの量が多いほどポリメラーゼ活性が高いことを表す）段階を有するアッセイでＤＮＡポリメラーゼ活性を評価し得る。

好ましいプライマーおよび鋳型鎖については実施例に記載する。
特に好ましい単一ヌクレオチド組込みアッセイについては、本明細書の実施例の節に記載する。したがって、好ましい実施形態では、相対ＤＮＡポリメラーゼ活性は、実施例の節に記載される単一ヌクレオチド組込みアッセイにより評価されるものである。

本発明者らは驚くべきことに、このサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のＤＮＡポリメラーゼＩが、通常の海洋環境よりも大幅に高い温度を含めた広範囲の温度で、他の多くのＤＮＡポリメラーゼと比較して、特にアリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）などの他の海洋生物由来のＤＮＡポリメラーゼと比較して優れた安定性（温度安定性）を示すことも明らかにした。これに関連して、「安定な」ＤＮＡポリメラーゼは、そのＤＮＡポリメラーゼが広範囲の温度に曝露された後もポリメラーゼ活性をほとんど失わないことを意味する。別の観点から言えば、優れた「安定性」は、ＤＮＡポリメラーゼが広範囲の温度に曝露された後も相当なポリメラーゼ活性を保持する（すなわち、相当な残存活性を有する）ことを意味する。

したがって、本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に広範囲の温度でインキュベート（プレインキュベート）した後も、その最大ポリメラーゼ活性の相当な割合を保持する。これに関連して、最大ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイの開始前に氷上（約０℃）でＤＮＡポリメラーゼのインキュベーション（プレインキュベーション）を実施したときに観察されるポリメラーゼ活性であり得る。

好ましくは、インキュベーション（プレインキュベーション）は約１５分間（１５分間が好ましい）にわたるものである。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に、インキュベーション（プレインキュベーション）の温度に関係なく、前記インキュベーション後にＤＮＡポリメラーゼを氷上で（例えば、約５分間）冷却する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に、０℃〜４０℃（例えば、０℃〜１５℃、０℃〜２０℃、０℃〜２５℃または０℃〜３７℃）の温度範囲の任意の温度でＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした後も、その最大活性の少なくとも４０％を示す。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に、０℃〜３７℃（例えば、０℃〜１５℃、０℃〜２０℃、０℃〜２５℃、０℃〜３０℃または０℃〜３５℃）の温度範囲の任意の温度でＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした後も、その最大活性の少なくとも６０％（好ましくは、少なくとも７０％または少なくとも８０％）を示す。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に、０℃〜３０℃（例えば、０℃〜１５℃、０℃〜２０℃または０℃〜２５℃）の温度範囲の任意の温度でＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした後も、その最大活性の少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％）を示す。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ（例えば、単一ヌクレオチド伸長反応）の開始前に３７℃で１５分間インキュベートした後も、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイの開始前に、氷上（０℃）で１５分間のインキュベーションを実施した場合に観察されるポリメラーゼ活性の少なくとも６０％（好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％）を示す、すなわち、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％の「残存」活性がみられる。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ（例えば、単一ヌクレオチド伸長反応）の開始前に３０℃で１５分間インキュベートした後も、ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイの開始前に、氷上（０℃）で１５分間のインキュベーションを実施した場合に観察されるポリメラーゼ活性の最小７０％（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％）を示す、すなわち、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の「残存」活性がみられる。

ＤＮＡポリメラーゼの温度安定性を解析するのに適した実験は当該技術分野で公知であり、そのいずれも用い得る。ＤＮＡポリメラーゼの温度安定性は、ポリメラーゼ活性を求めるアッセイを実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼを被験温度（例えば、０℃（例えば氷上）、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃または４５℃）で一定時間（例えば、５分〜２５分、好ましくは約１５分）の間インキュベートすることにより評価し得る。好ましくは、ポリメラーゼ活性を求めるアッセイを実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼを被験温度（例えば、０℃（例えば氷上）、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃または４５℃）で１５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼを氷上で（例えば、５分間）冷却することによりＤＮＡポリメラーゼ安定性を評価し得る。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、好ましくは、単一ヌクレオチド組込みアッセイ、好ましくは本明細書の他の箇所に記載される単一ヌクレオチド組込みアッセイを用いて評価し得る。特に好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、実施例の節に記載する単一ヌクレオチド組込みアッセイにより評価されるものである。

本発明の特に好ましいＤＮＡポリメラーゼは、広範囲の温度にわたって優れた安定性および優れた活性を有する。
本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの融解温度（Ｔｍ）の解析により評価される広範囲にわたるｐＨ安定性プロファイル（ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５）を有する。本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、６．０〜８．５の範囲のｐＨで約４２℃〜４５℃、好ましくは約４３℃〜４４℃の融解温度を有する。融解温度（Ｔｍ）はｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ実験により求め得る（Ｅｒｉｃｓｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００６，３５７，２８９−２９８）。特に好ましいアッセイを実施例の節に記載する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、いくつかの市販のＤＮＡポリメラーゼより高いＤＮＡポリメラーゼ活性（比活性）を有する。
本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、約２５℃（２５℃が好ましい）の温度でいくつかの市販のＤＮＡポリメラーゼより高いＤＮＡポリメラーゼ活性（比活性）を有する。

ＤＮＡポリメラーゼ活性（比活性）は、任意の適切なアッセイを用いて解析することが可能であり、当業者であれば適切なアッセイを容易に選択することができる。本明細書で論じられるＤＮＡポリメラーゼ活性は、等温増幅アッセイを用いて評価し得る。本明細書で論じられるＤＮＡポリメラーゼ活性は、等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。例示的な分子ビーコンアッセイでは、分子ビーコン鋳型は、ＧＣリッチなステム領域により連結されたループ領域を含み；分子ビーコン鋳型は、近接するため消光する２つのフルオルフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）を有し；分子ビーコン鋳型とアニールしたプライマーがＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩ）により伸長すると、ステムが開き、前に消光したフルオロフォアの蛍光の回復により、２つのフルオロフォア間の距離の増大が測定される。

このように、（ｉ）ＧＣリッチなステム領域により連結されたループ領域を含み、互いに近接していることにより消光する２つのフルオルフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）を含む鋳型ＤＮＡ分子（分子ビーコン鋳型）を準備する段階、（ｉｉ）プライマーを前記鋳型ＤＮＡ分子とアニールさせる段階、（ｉｉｉ）前記鋳型−プライマー複合体をＤＮＡポリメラーゼと（例えば、約２５℃、好ましくは２５℃で）インキュベートする段階および（ｉｖ）前に消光したフルオロフォアの蛍光の回復を測定し、前記蛍光がＤＮＡポリメラーゼ活性を表す段階を有するアッセイでＤＮＡポリメラーゼ活性を評価し得る。

好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、約２５℃（２５℃が好ましい）で実施する等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。

好ましい分子ビーコン鋳型およびプライマーについては実施例に記載する。
好ましいＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイは、本明細書の実施例の節に記載され、等温分子ビーコンアッセイである、ポリメラーゼ活性アッセイである。したがって、好ましい実施形態では、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（本明細書ではＫＦとも呼ぶ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書ではＢｓｔとも呼ぶ）および／または市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ２．０の変異体より高いポリメラーゼ活性（比活性）を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、（例えば、２５℃で実施する）等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％または少なくとも１５０％高いポリメラーゼ活性（比活性）を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、（例えば、２５℃で実施する）等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％高いポリメラーゼ活性（比活性）を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、（例えば、２５℃で実施する）等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０）の変異体より少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％高いポリメラーゼ活性（比活性）を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、（例えば、２５℃で実施する）等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、特に約２５℃（２５℃が好ましい）の温度で、他の海洋生物のポリメラーゼ（例えば、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼ）より高いＤＮＡポリメラーゼ活性（比活性）を有する。本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼより少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％高いポリメラーゼ活性（比活性）を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、（例えば、２５℃で実施する）等温分子ビーコンアッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載されるポリメラーゼ活性アッセイによりＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイにより２５℃で解析したとき、好ましくは、本明細書の実施例の節に記載されるＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイにより解析したとき、少なくとも２００，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）、少なくとも２５０，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）または少なくとも３００，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）のＤＮＡポリメラーゼ活性（比活性）を有する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは高い鎖置換活性を有する。多くの等温増幅法では反応設定に使用するＤＮＡポリメラーゼに固有の鎖置換活性によって成否が左右されるため、これは重要な特性である。「鎖置換」という用語は、ポリメラーゼが合成時に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を表す。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、約２５℃（好ましくは２５℃）の温度で他の市販のＤＮＡポリメラーゼより高い鎖置換活性を有する。
ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を評価するのに適したアッセイは当該技術分野で公知であり、当業者であれば適切なアッセイを容易に選択することができる。例示的な鎖置換活性アッセイでは、「コールド」プライマーおよび３’末端をフルオロフォア（例えば、ＴＡＭＲＡ）で標識したレポーター鎖を、アニールしたプライマーの３’末端とアニールしたレポーター鎖の５’末端との間にヌクレオチドギャップが１つ生じるように、５’末端に消光剤（例えば、ＢＨＱ２）を有する（したがって、消光剤が近接していることによりフルオロフォアが消光する）鋳型鎖とアニールさせ；ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性が生じると、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチド（レポーター鎖）が鋳型鎖から移動し、その結果、フルオロフォアと消光剤が近接した状態ではなくなり、蛍光の増大を測定することが可能になる。

鎖置換活性は、（ｉ）５’末端に消光剤（蛍光消光剤）を有する鋳型ＤＮＡ分子を準備する段階、（ｉｉ）アニールしたプライマーの３’末端とアニールしたレポーター鎖の５’末端との間にヌクレオチドギャップが１つ生じるように、前記鋳型ＤＮＡ分子をコールドプライマー（すなわち、非蛍光オリゴヌクレオチド）および３’末端をフルオロフォアで標識したレポーター鎖（レポーターオリゴヌクレオチド）とアニールさせ、互いに近接していることにより消光剤がフルオロフォアを消光させる段階、（ｉｉｉ）前記鋳型コールドプライマー−レポーター鎖複合体をＤＮＡポリメラーゼと（例えば、約２５℃、好ましくは２５℃で）インキュベートする段階および（ｉｖ）前に消光したフルオロフォアの蛍光を測定し、前記蛍光が鎖置換活性を表す段階を有するアッセイで評価し得る。

好ましい実施形態では、２５℃で実施するアッセイで鎖置換を評価する。
好ましいプライマー、レポーター鎖および鋳型鎖を実施例に記載する。
好ましい実施形態では、実施例の節に記載される鎖置換活性アッセイにより鎖置換活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％または少なくとも２０００％高い鎖置換活性を有する。好ましくは、鎖置換活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。鎖置換活性は、本明細書に記載される（例えば、２５℃で実施する）鎖置換アッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載される鎖置換アッセイにより鎖置換活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００、少なくとも６００％または少なくとも７００％高い鎖置換活性を有する。好ましくは、鎖置換活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。鎖置換活性は、本明細書に記載される（例えば、２５℃で実施する）鎖置換アッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載される鎖置換アッセイにより鎖置換活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０）の変異体より少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも４００％高い鎖置換活性を有する。好ましくは、鎖置換活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。鎖置換活性は、本明細書に記載される（例えば、２５℃で実施する）鎖置換アッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載される鎖置換アッセイにより鎖置換活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、他の海洋生物のポリメラーゼ（例えば、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼ）より高い鎖置換活性を有する。本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、約２５℃（２５℃が好ましい）の温度で他の海洋生物のＤＮＡポリメラーゼより高い鎖置換活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも５００％高い鎖置換を有する。好ましくは、鎖置換活性は約２５℃（２５℃が好ましい）で評価されるものである。鎖置換活性は、本明細書に記載される（例えば、２５℃で実施する）鎖置換アッセイを用いて評価し得る。より好ましくは、実施例の節に記載される鎖置換アッセイにより鎖置換活性を評価する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載される鎖置換活性アッセイにより、好ましくは本明細書の実施例の節の鎖置換活性アッセイにより２５℃で解析したとき、少なくとも２０，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）、少なくとも２５，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）または少なくとも３０，０００ｍＲＦＵ／（分・μｇ）の鎖置換活性を有する。

本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼは高い処理能力を有する。ＤＮＡポリメラーゼと関連する「処理能力」とは、ＤＮＡポリメラーゼが合成（ヌクレオチド組込み）時に解離するまでＤＮＡ鋳型鎖との結合を維持する能力のことであり、したがって、所与のポリメラーゼの処理能力が増大するとＤＮＡ合成全体の効率が増大し得る。換言すれば、処理能力は、鋳型鎖との結合事象当たりにＤＮＡポリメラーゼにより付加される平均ヌクレオチド数の尺度となる。より長いＤＮＡを合成する必要がある場合、処理能力の高いＤＮＡポリメラーゼが特に重要なものとなり得る。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔｐｏｌＩ、Ｂｓｔ２．０）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書ではＢＳＵとも呼ぶ）より高い処理能力を有する。好ましい実施形態では、より高い処理能力は大幅に高いものである。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔｐｏｌＩ、Ｂｓｔ２．０）および／またはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書ではＢＳＵとも呼ぶ）より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１５００％または少なくとも２０００％高い処理能力を有する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、市販のＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔｐｏｌＩ、Ｂｓｔ２．０）より少なくとも５０００％、少なくとも１０，０００％、少なくとも１５，０００％、少なくとも２０，０００％、少なくとも２５，０００％または少なくとも３０，０００％高い処理能力を有する。

本発明のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書ではＢＳＵとも呼ぶ）より少なくとも１０００％、少なくとも１５００％または少なくとも２０００％高い処理能力を有する。

処理能力を解析するのに適したアッセイは当該技術分野で周知である。適切で特に好ましい処理能力アッセイについては本明細書の実施例の節に記載する。
本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼは、様々な塩（ＮａＣｌ）濃度にわたって有用なレベルのポリメラーゼ活性を有する。換言すれば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、広範囲の塩濃度にわたって、最大ポリメラーゼ活性が観察される塩濃度で観察されるＤＮＡポリメラーゼ活性の相当な割合を示す。ＤＮＡポリメラーゼ活性を求めるのに適したアッセイについては本明細書の他の箇所に記載する。ＤＮＡポリメラーゼ活性を求めるのに好ましいアッセイは、例えば本明細書に記載される、好ましくは実施例の節に記載される等温分子ビーコンアッセイである。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼがその最大活性を示すＮａＣｌ濃度は約６５ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭまたは９０ｍＭ）である。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約０ｍＭ〜２１０ｍＭ ＮａＣｌの濃度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の相当な割合（例えば、少なくとも３０％）を示す。

いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約２０ｍＭ〜１５０ｍＭ ＮａＣｌの濃度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも６０％を示す。
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約６０ｍＭ〜１２０ｍＭ ＮａＣｌの濃度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９０％または少なくとも９５％）を示す。

好ましくは、適切な対照レベルと比較したとき、上記の能力および特性が、測定可能レベルまたは有意レベルで、より好ましくは統計的に有意なレベルで観察される。適切な有意レベルについては本明細書の他の箇所で論じる。より好ましくは、先行技術のＤＮＡポリメラーゼで観察される能力と比較したとき、上記の能力および特性のうち１つまたは複数のものが、測定可能に優れている、またはより好ましくは有意に優れているレベルで観察される。

別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）か、または配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）、単離ＤＮＡポリメラーゼを提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼドメインがない（例えば、配列番号５のアミノ酸配列の一部または全部がない）。本発明のその他の態様の他の特徴および特性は、本発明のこの態様に準用される。

さらに別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）か、または配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む（またはこれよりなる）、単離ＤＮＡポリメラーゼを提供し、前記ＤＮＡポリメラーゼは、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼではない。本発明のその他の態様の他の特徴および特性は、本発明のこの態様に準用される。

さらなる態様では、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む分子（例えば、タンパク質）を提供する。
本願全体を通して使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、のちに上限または除外が具体的に記載される場合を除き、それらが、言及される成分または段階のうちの「少なくとも１つもの」、「少なくとも第一のもの」、「１つまたは複数のもの」または「複数のもの」を意味するという意味で使用される。実施可能な組合せの限界およびパラメータについては、任意の単一薬剤の量と同じく、本開示を踏まえれば当業者に明らかになるであろう。

本明細書で定義される本発明のＤＮＡポリメラーゼもしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子またはこれと実質的に相同な核酸分子が本発明のさらなる態様を構成する。好ましい核酸分子は、配列番号１のサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種ＤＮＡポリメラーゼＩの配列またはそれと実質的に相同な配列をコードする核酸である。好ましい核酸分子は、配列番号２で記載されるヌクレオチド配列を含む（またはこれよりなる）ものであるか、またはそれと実質的に相同な配列である。任意選択で、配列番号２の最後の３つのヌクレオチドが省かれ得る。本発明の核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％または７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を有する配列を含む。したがって、本発明の核酸配列は、配列番号２の配列に対する単一または複数の塩基変化（付加、置換、挿入または欠失）を含む。

特に好ましい核酸分子は、配列番号２で記載されるヌクレオチド配列を含む。
また別の好ましい核酸分子は、配列番号２で記載されるヌクレオチド配列よりなる。
本発明は、本明細書に記載される核酸分子の変性型、例えば、配列番号２を含む（またはこれよりなる）核酸分子の変性型であるヌクレオチド配列を含む（またはこれよりなる）核酸分子にも及ぶ。

本発明の核酸分子は、好ましくは「単離」または「精製」されたものである。
相同性（例えば、配列同一性）は、任意の都合のよい方法により評価し得る。しかし、配列間の相同性（例えば、同一性）の大きさを求めるには、配列のマルチプルアライメントを作成するコンピュータプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：４６７３−４６８０，１９９４）が有用である。必要に応じて、Ｃｌｕｓｔａｌ ＷアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ ６２スコア行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）ならびにギャップ開始ペナルティ１０およびギャップ伸長ペナルティ０．１とともに用いて、一方の配列の全長の少なくとも５０％がアライメントに含まれる最上位のマッチを２配列間で得ることができる。配列を整列させるのに使用し得る他の方法として、２配列間で最上位のマッチが得られ、２配列間で一致するアミノ酸の数が求められるようＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアライメント法（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０）がある。２つのアミノ酸配列間の百分率同一性を算出するその他の方法が当該技術分野で一般に認められており、例えば、ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎにより記載されているもの（ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３，１９８８）およびＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載されているものがこれに含まれる。

このような計算には一般にコンピュータプログラムを用いる。この目的には、配列のペアを比較し整列させるＡＬＩＧＮ（ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８，１９９０）およびギャップＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮまたはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｈａｅｂｅｒｌｉ，Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４）などのプログラムも有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のＤａｌｉサーバは構造に基づくタンパク質配列のアライメントを提供している（Ｈｏｌｍ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０：４７８−４８０，１９９５；Ｈｏｌｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３：１２３−３８，１９９３；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：３１６−９，１９９８）。

基準点を設けることにより、ＡＬＩＧＮプログラムに初期パラメータ（例えば、インターネット上のＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバ（ＩＧＨ、モンペリエ、フランス）で利用可能である）を用いて、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性、配列同一性などを有する本発明による配列を決定し得る。

本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えるアミノ酸置換のことである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。

本発明のＤＮＡポリメラーゼは遺伝的にコードされたアミノ酸を含むが、１つまたは複数の非遺伝的にコードされたアミノ酸も含み得る。
本明細書に記載される本発明のＤＮＡポリメラーゼの変異体または酵素的に活性なフラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することに加え、好ましくは本明細書に記載される他の特性を１つまたは複数、より好ましくは本明細書に記載される他の特性をすべて有する。

本明細書で核酸の分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド、例えばＤＮＡポリメラーゼに関連して使用される「単離（された）」または「精製（された）」という用語は、単離された形態である、精製された形態である、または実質的にその天然の環境を含まない、例えば、（実際にそれが天然に存在する場合）生物体から単離された形態または精製された形態である上記の分子を指すか、あるいは技術的工程により作製された上記の分子を指し、例えば、組換え分子および合成により作製した分子がこれに含まれる。

したがって、ＤＮＡポリメラーゼなどのタンパク質またはポリペプチド分子に関連して使用される場合、「単離（された）」または「精製（された）」という用語は通常、由来源に由来する細胞物質も他のタンパク質も実質的に含まないタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、このような単離タンパク質または精製タンパク質は、組換え技術により作製する場合は培地を、また化学的に合成する場合は化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。

考え得る発現ベクターとしては、ベクターが使用する宿主細胞と適合性がある限り、特に限定されないがコスミドまたはプラスミドが挙げられる。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適したもの」であり、このことは、その発現ベクターが、本発明の核酸分子と、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択され、核酸分子と作動可能に連結された制御配列とを含むことを意味する。作動可能に連結されたとは、核酸がその発現が可能なように制御配列と連結されていることを意味するものとする。

したがって、本発明は、一態様では、本発明の核酸分子またはそのフラグメントと、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列とを含む、発現ベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を提供する。

適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な入手源に由来するものであり得、当該技術分野で周知である。適切な制御配列の選択は、のちに論じるように、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターによっては、それ以外の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写誘導能を与える配列などを発現ベクターに組み込み得る。

本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子も含み得る。
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現増大；組換えタンパク質の溶解度増大；およびアフィニティー精製でリガンドとしての役割を果たすことによる標的組換えタンパク質精製の促進（例えば、精製および／または同定を可能にするのに適した「タグ」、例えばＨｉｓタグまたはｍｙｃタグが存在し得る）をもたらす融合部分をコードする遺伝子も含み得る。

組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換宿主細胞を作製することができる。「〜で形質転換した」、「〜をトランスフェクトした」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当該技術分野で公知の多数の可能な技術のうちの１つにより細胞に核酸（例えば、ベクター）を導入することを包含するものとする。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするのに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）およびその他の実験用テキストにみることができる。

適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核細胞が挙げられる。好ましくは、本発明のタンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞で発現させ得る。

組換え技術による融合により、タンパク質などの他の分子（例えば、エピトープタグ）とコンジュゲートした本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端（側）融合タンパク質を調製し得る。

さらなる態様は、本発明の１つまたは複数の発現構築物または発現ベクターを含む宿主細胞またはウイルスを提供する。また、本発明の核酸分子のうち１つまたは複数のものを含む宿主細胞またはウイルスも提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼを発現することが可能な宿主細胞またはウイルスはさらなる態様を構成する。好ましい宿主細胞としては、Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社）が挙げられる。

必要に応じて、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、天然源から単離したもの、例えばサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の抽出物から単離したもの、または組換えにより宿主細胞に産生させ、そこから単離し精製したものであり得る。したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、組換え酵素、特に単離組換え酵素であり得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼが天然にみられる生物体と同じ生物体ではない、またはそのような生物体に由来するものではない宿主細胞、すなわち異種宿主細胞で組換え技術により産生される。

組換えＤＮＡ技術を用いて本発明のＤＮＡポリメラーゼを作製し得る。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼの産生に無細胞発現系を用いることができる。あるいは、１度に１アミノ酸ずつ段階的伸長によりＤＮＡポリメラーゼが生成するよう化学合成を用いて本発明のＤＮＡポリメラーゼを作製し得る。このような化学合成技術（例えば、固相合成）はタンパク質化学で周知である。

本発明のさらなる態様は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを作製する方法であって、本発明の宿主細胞を培養する段階を含む方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされるＤＮＡポリメラーゼまたはタンパク質の発現に適した条件下で、本発明の組換え発現ベクターのうち１つもしくは複数のものまたは本発明の核酸分子のうち１つもしくは複数のものを含む宿主細胞を培養する段階；および任意選択で、（ｉｉ）宿主細胞または増殖培地／上清からＤＮＡポリメラーゼまたはタンパク質を単離または採取する段階を含む。このような作製方法は、ＤＮＡポリメラーゼもしくはタンパク質産物を精製し、かつ／またはＤＮＡポリメラーゼもしくは産物を少なくとも１つの追加の成分、例えば許容される緩衝剤もしくは担体などを含む組成物に調製する段階も含み得る。

当該技術分野で公知であり、文献に広く記載されているタンパク質の精製技術のいずれかまたはその任意の組合せを用いて、ＤＮＡポリメラーゼを宿主細胞／培地から分離または単離し得る。このような技術としては、例えば、沈殿、限外ろ過、透析、様々なクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離などを挙げ得る。上で論じたように、単離、可溶化および／または精製もしくは同定を補助するため、アミノ酸モチーフまたはその他のタンパク質もしくは非タンパク質タグ、例えばポリヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ₆タグ）を有するよう本発明のＤＮＡポリメラーゼを修飾し得る。

本発明のＤＮＡポリメラーゼの好ましい作製方法については、本明細書の実施例の節に記載する。
別の態様では、本発明は、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）重合への本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。したがって、１つまたは複数のヌクレオチドにより核酸（ＤＮＡ）鎖を伸長させるのに本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。

別の態様では、本発明は、核酸（ＤＮＡ）増幅反応またはシーケンシング反応への本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、例えば本明細書に記載するような、分子ビーコンアッセイ、鎖置換アッセイまたは単一ヌクレオチド組込みアッセイへの本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。

好ましくは、本発明の使用および方法では、一定温度で、すなわち温度サイクリングを用いずに、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用する。したがって、等温反応で本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用するのが特に好ましい。等温増幅反応で本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用するのが特に好ましい。等温反応は一定温度で実施するものである。多数の等温増幅技術が当該技術分野で公知であり、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）および交差プライミング増幅（ＣＰＡ）がこれに含まれる。

別の態様では、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いるヌクレオチド重合の方法を提供する。好ましくは、前記方法は、本発明のＤＮＡポリメラーゼと、鋳型核酸分子と、鋳型核酸分子の一部分とアニールすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーと、１つまたは複数の種のヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸、ｄＮＴＰＳ）とを含む反応混合物を準備することと、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型核酸分子とアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１つまたは複数のヌクレオチドを重合させることにより前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で前記反応混合物をインキュベートすることとを含む。適切な条件は当該技術分野で周知である。好ましくは、一定温度を用い、好ましい温度については本明細書の他の箇所に記載する。任意選択で、（例えば、ゲル電気泳動により）ポリヌクレオチド産物の生成を検出する。

別の態様では、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸（ＤＮＡ）を増幅する方法を提供する。前記方法は通常、本発明のＤＮＡポリメラーゼと、鋳型核酸分子と、鋳型核酸分子酸分子の一部分とアニールすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）（例えば、２つ以上のプライマー、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのプライマー）と、ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸、ｄＮＴＰＳ）とを含む反応混合物を準備することと、オリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）が鋳型核酸分子とアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１つまたは複数のヌクレオチドを重合させることにより前記オリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）を伸長させてポリヌクレオチドを生成する条件下で前記反応混合物をインキュベートすることとを含む。適切な条件は当該技術分野で周知である。好ましい核酸増幅の方法は等温増幅法である。本発明の等温増幅法は一定温度で実施し、好ましい温度については本明細書の他の箇所に記載する。任意選択で、（例えば、ゲル電気泳動により）ポリヌクレオチド産物の生成を検出する。

例示的な等温増幅法としては、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）および交差プライミング増幅（ＣＰＡ）が挙げられる。

好ましくは、本発明の方法および使用に用いる一定温度は、低温ないし中温、例えば、０℃〜約４２℃、好ましくは、約１０℃〜約４０℃、約２０℃〜約４０℃、約２５℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃、約３５℃〜約４０℃または約３７℃〜約４０℃である。いくつかの実施形態では、一定温度は、約１０℃〜約１５℃であるか、または約１０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態では、一定温度は約１０℃〜約３０℃である。いくつかの実施形態では、一定温度は約２０℃〜約３０℃である。いくつかの実施形態では、一定温度は約１０℃〜約２５℃である。いくつかの実施形態では、一定温度は約２０℃〜約２５℃である。約２５℃の一定温度が好ましい。いくつかの実施形態では、一定温度は２５℃である。

反応中に温度を修正するいかなる積極的手段も講じない、例えば温度サイクリングを実施しない場合、温度は一定であると見なされ得る。それでもなお、「一定」温度には方法の実施中に最大約５℃、通常、最大３℃または２℃の温度変動が許容され得る。

本発明のＤＮＡポリメラーゼをポイントオブケア分子診断プラットフォームに使用し得る。
本発明のＤＮＡポリメラーゼを全ゲノム増幅に使用し得る。

本発明のＤＮＡポリメラーゼを次世代シーケンシング法に使用し得る。（「第一世代」の方法であるサンガージデオキシヌクレオチド法に関連して）いわゆる「次世代」または「第二世代」シーケンシング法が普及しつつある。これらの新たな技術は、例えば、並列シーケンシング反応、例えば大量並列シーケンシング反応を用いる結果としての、または時間のかからない段階を経ることによるハイスループットを特徴とする。各種のハイスループットシーケンシング法は、単一分子シーケンシングをもたらし、パイロシーケンシング、可逆的ターミネーターシーケンシング、ライゲーションによる切断プローブシーケンシング、ライゲーションによる非切断プローブシーケンシング、ＤＮＡナノボールおよびリアルタイム単一分子シーケンシングなどの技術を用いるものである。

本発明のＤＮＡポリメラーゼの酵素的に活性なフラグメントを用いる使用および方法も提供され、本明細書で本発明のＤＮＡポリメラーゼに言及する場合、文脈上そうでないことが明らかでない限り、本発明のＤＮＡポリメラーゼはそのような活性フラグメントを包含する。

本発明の使用および方法は通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物も提供する。このような組成物は、好ましくは緩衝剤を含む。任意選択で、本発明の組成物は、核酸増幅反応（例えば、等温増幅反応）を実施するのに必要な試薬、例えば、鋳型ＤＮＡのある領域とアニールして増幅され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）のうち１つまたは複数のものをさらに含む。組成物は通常、水性であり、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどの標準的な緩衝剤で緩衝されている。

本発明は、１つもしくは複数の本発明のＤＮＡポリメラーゼ、１つもしくは複数の本発明の組成物、１つもしくは複数の本発明の核酸分子、１つもしくは複数の本発明の発現ベクターまたは１つもしくは複数の本発明の宿主細胞もしくはウイルスを含むキットをさらに含む。好ましくは、前記キットは、本明細書に記載される方法および使用、例えば、等温増幅反応などの核酸増幅法に使用するためのものである。好ましくは、前記キットは、例えば核酸増幅のためのキット構成要素を使用するための指示書を含む。

本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびにその配列識別番号（配列番号）
ヌクレオチド配列はいずれも、この技術分野の慣例に従い５’から３’の方向で本明細書に記載する。

配列番号１−サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種から単離された短縮ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列。
配列番号１
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配列番号２−配列番号１のサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種ＤＮＡポリメラーゼＩの配列をコードする核酸配列
配列番号２
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配列番号３−サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種から単離された完全長ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列。
配列番号３
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配列番号４−配列番号３のサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種ＤＮＡポリメラーゼＩの配列をコードする核酸配列。
配列番号４
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配列番号５−サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種から単離されたＤＮＡポリメラーゼＩの５’−３’エキソヌクレアーゼ機能ドメインを含む配列。
配列番号５
ＭＹＬＳＴＥＫＩＬＬＬＤＧＮＳＬＡＹＲＡＦＦＡＬＰＬＬＴＮＥＨＧＩＨＴＮＡＶＹＧＦＴＭＭＬＱＫＩＭＤＥＥＮＰＴＨＭＬＶＡＦＤＡＧＫＴＴＦＲＨＳＴＦＧＤＹＫＧＧＲＱＫＴＰＰＥＬＳＥＱＦＰＹＩＲＫＬＩＤＡＹＧＩＫＲＹＥＬＥＭＹＥＡＤＤＩＩＧＴＬＳＫＲＡＤＥＫＧＱＱＶＶＩＶＳＧＤＫＤＬＴＱＬＡＴＤＫＴＴＶＹＩＴＲＫＧＩＴＤＩＥＫＹＴＰＥＨＶＱＥＫＹＧＬＴＰＬＱＩＩＤＭＫＧＬＭＧＤＡＳＤＮＩＰＧＶＰＧＶＧＥＫＴＡＩＫＬＬＫＥＨＧＳＶＥＤＬＹＫＡＬＤＴＶＳＧＶＫＬＫＥＫＬＩＡＮＥＥＱＡＩＭＳＫＡＬＡＴＩＥＴＡＡＰＩＱＩＳＩＤＤＬＳＹＴＧＰＮＭＥＥＶＩＥＶＷＫＥＬＡＦＫＴＬＬＥＫＳＤＹＩＳＥＥＳＥＴ
配列番号６−本明細書に記載される実験に使用したアリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）の短縮ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列。
配列番号６
ＶＤＲＳＫＹＥＴＩＦＴＫＥＡＦＳＡＷＬＥＫＶＮＮＡＥＶＴＡＦＤＴＥＴＤＳＬＤＹＭＶＡＮＬＩＧＬＳＦＳＶＥＥＧＥＡＡＹＶＰ
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ＷＤＥＡＨ
ＰＢ ＤＮＡポリメラーゼとの比較に使用する市販の酵素、すなわち、ＫＦ、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、ＢＳＵ、Ｔ４およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼはいずれも、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入する。

これより、以下の図面を参照しながら非限定的な実施例により本発明を説明する。

組換えにより作製したサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種（ＰＢ）由来の海洋生物ポリメラーゼの２５℃（比活性）でのポリメラーゼ活性を他のポリメラーゼと比較したものを示す図である。商業的に既知のポリメラーゼは、ＫＦ（クレノーフラグメント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｂｓｔ（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂｓｔ ２．０（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））およびＢＳＵ（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））である。 鎖置換活性アッセイの設定の概要を示す図である。Ｆ＝フルオロフォア。Ｑ＝消光剤。 組換えにより作製したサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種（ＰＢ）由来の海洋生物ポリメラーゼの２５℃（比活性）での鎖置換活性を他のポリメラーゼと比較したものを示す図である。商業的に既知のポリメラーゼは、ＫＦ（クレノーフラグメント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｂｓｔ（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂｓｔ ２．０（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））およびＢＳＵ（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））である。 ＰＢポリメラーゼおよび他のポリメラーゼの様々なＮａＣｌ濃度でのポリメラーゼ活性を示す図である。商業的に既知のポリメラーゼは、ＫＦ（クレノーフラグメント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｂｓｔ（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂｓｔ ２．０（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））およびＢＳＵ（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））である。 ＰＢポリメラーゼのポリメラーゼ活性に対する温度の影響を示す図である。 ＫＦと比較したＰＢポリメラーゼの安定性に対する温度の影響を示す図である。ＫＦはクレノーフラグメント（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））である。 様々なｐＨでのＰＢポリメラーゼＩの融解温度（Ｔｍ（℃））解析を示す図である。 市販の好熱性ＢｓｔｐｏｌＩ（Ｂｓｔ２．０）、中温性ＢｓｕおよびＰＢ ｐｏｌＩ（ＰｂＩ）の間の処理能力（Ｐｒの印を付けたレーン）の比較を示す図である。Ｔ７は既知の高処理能力酵素であり、高処理能力の陽性対照として用いられている。Ｐの印を付けたレーンはポリメラーゼ活性を表し、Ｐｒは処理能力を表す。処理能力は、酵素が鋳型鎖から解離すればＤＮＡポリメラーゼの標識基質との再結合で競合し、ゲル上に見られる最終産物収量（＋８０ヌクレオチド組込み）が少なくなる非標識ＤＮＡトラップのインキュベーションに基づいて解析される。

（実施例）
クローン化、遺伝子発現およびタンパク質精製
配列番号１のＰＢポリメラーゼの作製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩおよびその短縮された「大きいフラグメント」（ＰＤＢ １Ｌ３Ｓ）の構造に関する知見に基づき、発現構築物中の不要な５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインが除去されている、すなわち、ＰＢポリメラーゼのＰＣＲ産物に不要なエキソヌクレアーゼドメインがなくなるよう順方向プライマーが設計されている。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種由来のＤＮＡポリメラーゼＩをコードする遺伝子をベクターｐＥＴ１５１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化した。ポリメラーゼ連鎖反応の開始物質をサイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種のゲノムＤＮＡとした。遺伝子は順方向プライマー（５’−ＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＴ−３’（配列番号７））および逆方向プライマー（５’−ＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣ−３’（配列番号８））の使用により短縮されており、ポリメラーゼＩのいわゆる大きいフラグメントと類似している。

Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））で組換えタンパク質産生を実施した。細胞をテリフィックブロスで増殖させ、ＩＰＴＧの添加により遺伝子発現を誘導した。タンパク質産生を１５℃で６時間実施した。第一精製段階では、固定化Ｎｉ²⁺−アフィニティークロマトグラフィーによりＨｉｓ６タグ化タンパク質を精製した。第二段階は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによるタグの切断であり、４℃で一晩実施した。Ｈｉｓ₆タグおよびＨｉｓ₆タグ化ＴＥＶプロテアーゼからタンパク質を分離するため、第三段階で２回目のＮｉ²⁺−アフィニティークロマトグラフィーを実施した。タンパク質精製の第四段階および最終段階は、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でのサイズ排除クロマトグラフィーとした。最終タンパク質溶液を濃縮し、５０％グリセロールを加えて−２０℃で保管した。

ポリメラーゼ活性アッセイ
この実験は、２５℃で分子ビーコンアッセイを用いてＰＢポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を特定の市販のポリメラーゼと比較するものである。

ポリメラーゼ活性アッセイは、分子ビーコンプローブ（Ｓｕｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，４２９，２２５−２３５から修正したもの）に基づくものである。分子ビーコン鋳型は、ＧＣリッチ８量体ステム領域（配列がイタリック体で示されている）によって連結された２３量体ループと４３量体の伸長部分とからなる。ループ形成により、フルオロフォアであるＤａｂｃｙｌとＦＡＭが近接するため消光する。分子ビーコン鋳型とアニールするプライマーのＤＮＡポリメラーゼＩにより伸長が起こると、ステムが開き、ＦＡＭ蛍光の回復により２つのフルオロフォアの距離の増大が測定される（励起４８５ｎｍ、発光５１８ｎｍ）。

分子ビーコン鋳型
５’−ＧＧＣＣＣＧＴ^DabcylＡＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡＴ^FAMＡＣＧＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＧＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号９）
プライマー
５’−ＧＴＧＧＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中１０μＭの分子ビーコン鋳型と１５μＭのプライマー２０μｌを９５℃で５分間インキュベートすることにより分子ビーコン基質を作製した。次いで、反応物を室温で２時間冷却させた。基質溶液を最終濃度１０μＭで−２０℃にて保管した。

５０マイクロリットルの反応物は、２００ｎＭの基質と２００μＭのｄＮＴＰ（等モル量のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）とからなるものとした。ＰＢポリメラーゼＩについては、反応物に５０ｍＭビス‐トリスプロパン（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２％グリセロール中５ｍＭのＭｇＣｌ₂をさらに含めた。商業的に既知のポリメラーゼＩについては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から提供された各反応緩衝液を使用した。各ポリメラーゼに最適な塩に応じて反応緩衝液中の最終塩濃度を１００ｍＭに調整した。黒色の９６ウェル蛍光アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で活性アッセイを２５℃にて実施した。タンパク質溶液の添加（すなわち、ポリメラーゼの添加）により反応を開始させた。適切な時間間隔で、４８５ｎｍでの励起および５１８ｎｍでの発光によりＦＡＭ蛍光の増大を相対蛍光単位として測定した。測定はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で実施した。

このポリメラーゼ活性アッセイの結果を図１に示す。ＰＢポリメラーゼは、市販（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）のポリメラーゼであるＫＦ（クレノーフラグメント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｂｓｔ（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のポリメラーゼ）、Ｂｓｔ ２．０（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のポリメラーゼ）より高いポリメラーゼ活性を示している。この温度では、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＢＳＵポリメラーゼのみがポリメラーゼ活性より高い活性を示している。

このほか、ＰＢポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を海洋生物源由来の他のＤＮＡポリメラーゼと比較するため、同じタイプのポリメラーゼ活性アッセイを実施した（データ不掲載）。ＰＢポリメラーゼには、試験した他の海洋生物のポリメラーゼ（例えば、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）のＤＮＡポリメラーゼ）と比較して著明に高いポリメラーゼ活性がみられた。

鎖置換活性アッセイ
この実験は、２５℃で鎖置換活性アッセイを用いてＰＢ ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を特定の市販のポリメラーゼと比較するものである。鎖置換と呼ばれる、ポリメラーゼが鎖を置換する能力は多くの等温増幅法に重要なものである。

鎖置換特性を評価する際に重要なのは、安定したアッセイを設計することである。アッセイ設定の概要を図２に示す。このアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を介してのみ達成可能な消光レポーター鎖の置換時に測定される蛍光シグナルの増大に基づくものである。対照として、鎖置換陰性ポリメラーゼＴ４を使用し、このアッセイで活性は示さなかった（結果不掲載）。

鎖置換活性アッセイのための基質は、１９オリゴヌクレオチドの「コールド」プライマー（配列番号１１）と、２０オリゴヌクレオチドからなり３’末端をＴＡＭＲＡフルオロフォア（Ｆ）で標識したレポーター鎖（配列番号１２）とからなるものである。鋳型鎖は４０オリゴヌクレオチドからなり、５’末端がＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＢＨＱ２）で標識されている（配列番号１３）。プライマーが鋳型鎖とアニールし、鋳型鎖上の２０位にヌクレオチドギャップが１つ残る。さらに、標識が近接しているため、ＢＨＱ２によりフルオロフォアＴＡＭＲＡが消光する。ＤＮＡポリメラーゼＩの鎖置換活性が生じると、ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドが鋳型鎖から移動する。その結果、フルオロフォアと消光剤が近接した状態ではなくなり、ＴＡＭＲＡ蛍光の増大を測定することが可能になる（励起５２５ｎｍ、発光５９８ｎｍ）。

５’−ＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＴＡＣＣＣＴ ＣＧＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＴＣＡＡＴ［ＴＡＭＲＡ］−３’
３’−ＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＡ［ＢＨＱ２］−５’
上記の鎖置換活性アッセイを用いて、ｍＲＦＵ／（分・μｇ）で表したＰＢポリメラーゼの鎖置換活性を解析した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中１０μＭの「コールド」プライマー、１０μＭのレポーター鎖および１０μＭの鋳型鎖２０μｌを９５℃で５分間インキュベートすることにより、鎖置換活性アッセイのための基質を作製した。次いで、反応物を室温で２時間冷却した。基質溶液を最終濃度１０μＭで−２０℃にて保管した。

５０マイクロリットルの反応物は、２００ｎＭの基質と２００μＭのｄＮＴＰ（等モル量のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）とからなるものとした。ＰＢポリメラーゼＩについては、反応物に５０ｍＭビス‐トリスプロパン（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２％グリセロール中５ｍＭのＭｇＣｌ₂をさらに含めた。商業的に既知のポリメラーゼＩについては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から提供された各反応緩衝液を使用した。各ポリメラーゼに最適な塩に応じて反応緩衝液中の最終塩濃度を１００ｍＭに調整した。黒色の９６ウェル蛍光アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で活性アッセイを２５℃にて実施した。タンパク質溶液の添加（すなわち、ポリメラーゼの添加）により反応を開始させた。適切な時間間隔で、５２５ｎｍで励起させ５９８ｎｍで発光を記録することにより、ＴＡＭＲＡ蛍光の増大を相対蛍光単位として測定した。測定はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２ｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で実施した。

この鎖置換活性の結果を図３に示す。結果から、サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種（ＰＢ）由来のポリメラーゼは、市販のポリメラーゼであるＫＦ（クレノーフラグメント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｂｓｔ（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のポリメラーゼ）、Ｂｓｔ ２．０（Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のポリメラーゼ）より優れた鎖置換活性を有することがわかる。サイクロバチルス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種（ＰＢ）のＤＮＡポリメラーゼは市販のＢＳＵ（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））ポリメラーゼと同程度の鎖置換活性を示している。

このほか、ＰＢポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を海洋生物源由来の他のＤＮＡポリメラーゼと比較するため、同じタイプの鎖置換活性アッセイを実施した（データ不掲載）。ＰＢポリメラーゼには、試験した他の海洋生物のポリメラーゼ（例えば、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）のＤＮＡポリメラーゼ）と比較して著明に高い鎖置換活性がみられた。

ポリメラーゼ活性に対する塩濃度の影響の解析
血液などの粗試料中には、ポリメラーゼ反応を阻害し得る化合物が複数存在し得る。このような化合物の１つが塩である（高塩含有量）。ポリメラーゼ活性に対する塩濃度の影響を評価する実験を以下に記載する通りに実施した。

記載のポリメラーゼ活性アッセイを用い、反応緩衝液中に存在する塩の量を変化させてＰＢ ＤＮＡポリメラーゼに最適なＮａＣｌ濃度を解析した。１００パーセントの活性は、ポリメラーゼ活性が最大となる塩濃度を指す。換言すれば、各被験ＤＮＡポリメラーゼについて、観察された最大ポリメラーゼ活性を１００％の活性値として設定する。各曲線のその他の値（データポイント）は、各ポリメラーゼの１００％の活性に対して相対的なものである。

５０マイクロリットルの反応物は、２００ｎＭの基質と２００μＭのｄＮＴＰ（等モル量のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）とからなるものとした。ＰＢポリメラーゼＩについては、反応物に５０ｍＭビス‐トリスプロパン（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２％グリセロール中５ｍＭのＭｇＣｌ₂をさらに含めた。商業的に既知のポリメラーゼＩの緩衝液については、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社により提供された各緩衝液から塩を省いた組成に従って調製した。この実験で試験した各ＮａＣｌ濃度を個別に各反応物に加えた。黒色の９６ウェル蛍光アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で活性アッセイを２５℃にて実施した。タンパク質溶液をＰＢについては１μｇ／ｍｌ、Ｂｓｔについては１６単位／ｍｌ、Ｂｓｔ ２．０については１６単位／ｍｌ、ＢＳＵについては２．５単位／ｍｌまたはＫＦについては２単位／ｍｌで添加することにより反応を開始させた。適切な時間間隔で、４８５ｎｍでの励起および５１８ｎｍでの発光によりＦＡＭ蛍光の増大を相対蛍光単位として測定した。測定はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で実施した。

この実験の結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＰＢ ＤＮＡポリメラーゼには様々な塩濃度の範囲に対する耐性がみられる。

ＰＢポリメラーゼのポリメラーゼ活性に対する温度の影響
ＰＢポリメラーゼＩのポリメラーゼ活性に対する温度の影響を単一ヌクレオチド組込みアッセイで検討した。

単一ヌクレオチド組込みアッセイ
１９オリゴヌクレオチドからなるプライマー（配列番号１５）を４０オリゴヌクレオチドからなる鋳型鎖（配列番号１４）とアニールさせる。プライマーの５’末端をＦＡＭフルオロフォアで標識する。反応設定では、ｄＡＴＰのみを供給するため、ポリメラーゼはプライマーを５’−３’方向に２０位の１ヌクレオチド分のみ伸長させることができる。それに続く変性ポリアクリルアミドゲル（１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）およびＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドのスキャンによる解析では、１９オリゴヌクレオチドからなるプライマーおよびヌクレオチドアデニンの分だけ伸長し、したがって２０オリゴヌクレオチドからなるプライマーがみられる。伸長プライマー（強度１）および未伸長プライマー（強度０）を表すバンドの濃度測定により酵素活性を求める。相対組込み率を
組込み［％］＝強度１／（強度０＋強度１）×１００
により算出する。

５’−ＡＴＴＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＣＧＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＴＡ−３’ ４０量体
３’−ＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＣＣＴＡＴ［ＦＡＭ］−５’ １９量体
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中０．５μＭのフルオロフォア標識プライマーおよび０．５μＭの鋳型ＤＮＡ ２０μｌを７５℃で５分間インキュベートすることにより、単一ヌクレオチド組込みアッセイのための基質を作製した。次いで、反応物を室温で２時間冷却した。基質溶液を最終濃度０．５μＭで−２０℃にて保管した。

１０マイクロリットルの反応物は、３０ｎＭの基質と１０μＭのｄＡＴＰとを含むものとした。ＰＢポリメラーゼＩについては、反応物に５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２％グリセロール中５ｍＭのＭｇＣｌ₂をさらに含めた。室温での反応緩衝液のｐＨを各インキュベーション温度でｐＨ８．５となるよう調整した。０．０１８ｎｇ／μｌのタンパク質ＰＢポリメラーゼＩの添加により反応を開始させ、各温度（すなわち、図５のデータポイントに対応する温度）で１５分間インキュベートした。陰性対照として、タンパク質溶液の代わりにタンパク質希釈緩衝液を使用した。

変性ゲルローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール）２．５μｌの添加および９５℃で５分間のインキュベーションにより反応を停止させた。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）には、試料体積６μｌをゲル上に負荷した。０．５×ＴＢＥ緩衝液（４４．５ｍＭトリス、４４．５ｍＭホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いゲル電気泳動を５０Ｗで１時間１５分実施し、次いで、ゲルをＰｈａｒｏｓＦＸ Ｐｌｕｓ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でスキャンした。

この実験の結果を図５に示す。１００パーセントの活性は、活性が最も高い温度の値を指す。換言すれば、被験ＰＢ ＤＮＡポリメラーゼについて、観察された最大ポリメラーゼ活性を１００％の活性値として設定する。各曲線のその他の値（データポイント）は、各ポリメラーゼの１００％の活性に対して相対的なものである。例を挙げれば、インキュベーション温度２０℃では、ＰＢポリメラーゼのポリメラーゼ活性は、観察された最大ＰＢポリメラーゼ活性の約６０％である、すなわち、約６０％の「相対」活性がみられる。

図５の結果から、ＰＢポリメラーゼは広範囲の温度にわたって相当なポリメラーゼ活性を示す。

ＫＦ（クレノーフラグメント）と比較したＰＢポリメラーゼの安定性に対する温度の影響。
ＰＢポリメラーゼＩの安定性に対する温度の影響を単一ヌクレオチド組込みアッセイで検討した。

単一ヌクレオチド組込みアッセイ
１９オリゴヌクレオチドからなるプライマー（配列番号１５）を４０オリゴヌクレオチドからなる鋳型鎖（配列番号１４）とアニールさせる。プライマーの５’末端をＦＡＭフルオロフォアで標識する。反応設定では、ｄＡＴＰのみを供給するため、ポリメラーゼはプライマーを５’−３’方向に２０位の１ヌクレオチド分のみ伸長させることができる。それに続く変性ポリアクリルアミドゲル（１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）およびＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドのスキャンによる解析では、１９オリゴヌクレオチドからなるプライマーおよびヌクレオチドアデニンの分だけ伸長し、したがって２０オリゴヌクレオチドからなるプライマーがみられる。伸長プライマー（強度１）および未伸長プライマー（強度０）を表すバンドの濃度測定により酵素活性を求める。相対組込み率を
組込み［％］＝強度１／（強度０＋強度１）×１００
により算出する。

５’−ＡＴＴＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＣＧＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＴＡ−３’ ４０量体
３’−ＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＣＣＴＡＴ［ＦＡＭ］−５’ １９量体
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中０．５μＭのフルオロフォア標識プライマーおよび０．５μＭの鋳型ＤＮＡ２０μｌを７５℃で５分間インキュベートすることにより、単一ヌクレオチド組込みアッセイのための基質を作製した。次いで、反応物を室温で２時間冷却した。基質溶液を最終濃度０．５μＭで−２０℃にて保管した。

ＰＢポリメラーゼＩについては、５０ｍＭビス‐トリスプロパン（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２％グリセロール中、１０μｌの反応を実施した。不活化温度を試験するため、０．０１８ｎｇ／μｌのＰＢポリメラーゼＩを反応緩衝液に加え、各温度（すなわち、図６のデータポイントに対応する温度）で１５分間インキュベートし、次いで、氷上で５分間冷却した。ＫＦについては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより提供された各緩衝液の組成に従い、最適ｐＨで２５℃にて反応緩衝液を調製した。タンパク質を０．６７単位／ｍｌで反応緩衝液に加え、ＰＢポリメラーゼＩについて記載した通りに反応物をインキュベートした。陰性対照として、タンパク質溶液の代わりにタンパク質希釈緩衝液を使用した。

３０ｎＭの基質および１０μＭのｄＡＴＰの添加により単一ヌクレオチド伸長反応を開始させ、混合物を２５℃で１５分間インキュベートした。変性ゲルローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール）２．５μｌの添加および９５℃で５分間のインキュベーションにより反応を停止させた。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）には、試料体積６μｌをゲル上に負荷した。０．５×ＴＢＥ緩衝液（４４．５ｍＭトリス、４４．５ｍＭホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いゲル電気泳動を５０Ｗで１時間１５分実施し、次いで、ゲルをＰｈａｒｏｓＦＸ Ｐｌｕｓ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でスキャンした。

この実験の結果を図６に示す。１００パーセントの活性は、氷上（０℃）でインキュベートした酵素試料を指す。換言すれば、各被験ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＢおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のクレノーフラグメント（ＫＦ））について、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前にポリメラーゼを氷上（０℃）で１５分間インキュベートした場合に観察されたポリメラーゼ活性を１００％の活性値として設定する。各曲線のその他の値（データポイント）は、各ポリメラーゼの１００％の活性に対して相対的なものである。例を挙げれば、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に３７℃で１５分間インキュベートした後のＰＢポリメラーゼのポリメラーゼ活性は、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に氷上（０℃）で１５分間のインキュベーションを実施した場合に観察されたＰＢポリメラーゼ活性の約８０％である、すなわち、約８０％の「残存」活性がみられる。

図６の結果から、ＰＢポリメラーゼは、様々な温度で事前にインキュベートした後もＫＦより高いポリメラーゼ活性を保持することがわかる。換言すれば、ＰＢポリメラーゼは、温度に対する安定性がＫＦポリメラーゼより高い。例えば、ＰＢポリメラーゼは、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に３０℃で１５分間インキュベートしても、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に氷上（０℃）でインキュベートした場合と同じポリメラーゼ活性を保持している（すなわち、３０℃でインキュベーションを実施しても１００％の残存活性がみられる）。これに対し、ＫＦポリメラーゼは、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に３０℃で１５分間インキュベートすると、ポリメラーゼ活性が、単一ヌクレオチド伸長反応の開始前に氷上（０℃）でインキュベーションを実施した場合に観察された活性の約６０％にとどまっている（すなわち、３０℃でインキュベーションを実施すると約６０％の残存活性がみられる）。

このほか、ＰＢポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を海洋生物源に由来する他のＤＮＡポリメラーゼと比較するため、同じタイプのアッセイを実施した（データ不掲載）。ＰＢポリメラーゼには、試験した他の海洋生物のポリメラーゼ（例えば、アリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）のＤＮＡポリメラーゼ）と比較して著明に高い安定性がみられた。

様々なｐＨ緩衝液中でのＰＢポリメラーゼの融解温度を示す生物物理学的データ
Ｅｒｉｃｓｓｏｎら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００６，３５７，２８９−２９８）に従い、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ実験によりタンパク質の融解温度（Ｔｍ）を求めた。濃度５０ｍＭ、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．５の緩衝液を数種類試験した。最終希釈率６倍の各緩衝液ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）とタンパク質（すなわち、ＰＢポリメラーゼ）１２．５μｇを薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ社）のウェルの中で十分に混合した。ウェルを光学品質のシールテープ（Ｂｉｏｒａｄ社）で密閉した。最終反応物の体積を２５μｌとした。ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ実験では、１０〜９０℃の温度範囲について３秒間隔で０．３℃ずつ上昇させながらスキャンした。

この実験の結果を図７に示す。ＰＢポリメラーゼＩは、ｐＨ６〜８．５の範囲で広範囲のｐＨ安定性プロファイルを示しており、さらに、融解温度の平均値が約４３〜４４℃であることから、相対的温度適用範囲も広い。

処理能力
処理能力とは、ＤＮＡポリメラーゼが合成（ヌクレオチド組込み）時に解離するまでＤＮＡ鋳型鎖との結合を維持する能力のことであり、したがって、所与のポリメラーゼの処理能力が増大するとＤＮＡ合成全体の効率が増大し得る。この特徴は、より長いＤＮＡを合成する必要がある場合に特に重要なものとなり得る。このため、単一の結合事象後の重合度を測定するよう処理能力アッセイを設計する。伸長産物にポリメラーゼの処理能力が反映されるように、この場合、各プライマー鋳型が１回だけ伸長するように、過剰のトラップＤＮＡを加えた。

１００量体鋳型
３’ＡＴＧＴＴＧＧＴＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＣＴＴＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣ−５’（配列番号１６）
Ｆａｍ標識２０量体プライマー
５’ＦＡＭ−ＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＴＡＣＧＡＣ（配列番号１７）
プライマー−鋳型ＤＮＡ基質を調製するため、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の存在下、１００量体の鋳型（０．５μＭ）を２０量体のＦＡＭ標識プライマー（０．５μＭ）と７５℃で５分間インキュベートし、室温で少なくとも２時間冷却した。本明細書で試験するＰＢポリメラーゼＩおよび市販のポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ＰＢポリメラーゼＩおよびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼにはｐＨ８．５、Ｂｓｔ ２．０およびＢＳＵにはｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ（ＰＢポリメラーゼＩ、Ｂｓｔ ２．０、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ）または５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＢＳＵ）、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび２％グリセロール中、ＤＮＡ基質（２５ｎＭ）およびｄＮＴＰｓ（１０μＭ）と２５℃で１０分間プレインキュベートした。

５ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびトラップの１．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを添加することにより反応（Ｐｒ）を開始させ、２分後、停止液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、，０．０５％ブロモフェノールブルー）の添加により停止させた。トラップの効果をみるため、ＭｇＣｌ₂との反応開始前（Ｒ０）、並行する反応の形で同じ量のＰｂＩを１．１ｍｇ／ｍｌトラップおよびＤＮＡ基質とプレインキュベートした。プライムした基質の完全重合の対照として、同じ反応条件下でトラップを一切添加せずに別の反応（Ｐ）を実施した。Ｐ反応で同等のポリメラーゼ活性が得られた酵素量を処理能力解析の開始点として用いた。したがって、以下の量の酵素を処理能力解析に用いた：ＰＢポリメラーゼＩ ０．０１３μｇ、Ｂｓｔ ２．０ ０．１４μｇおよびＢＳＵ ０．０１６μｇ。

反応を９５℃で５分間加熱し、８Ｍ尿素を含有する１０％ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル上で産物を分解した。次いで、Ｐｈａｒｏｓｅ ＦＸ Ｐｌｕｓ ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）により画像を可視化した。

この実験の結果を図８に示す。この結果から、ＰＢポリメラーゼはＢｓｕおよびＢｓｔ２．０より大幅に高い処理能力を有し、これらの酵素の性能がＰＢ＞Ｂｓｕ＞Ｂｓｔ ２．０の順であることがわかる。

Claims (28)

1. 単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントであって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
2. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
3. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
4. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも３０％を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
5. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、２０℃〜３５℃の温度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも６０％を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
6. 前記ＤＮＡポリメラーゼが最大活性を示す温度から最大１０℃逸脱した温度で、前記ＤＮＡポリメラーゼがその最大ポリメラーゼ活性の少なくとも３０％を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
7. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に０℃〜４０℃の温度範囲の任意の温度で前記ＤＮＡポリメラーゼを１５分間インキュベートした後も、その最大活性の少なくとも４０％を示す、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
8. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価する前に０℃〜３７℃の温度範囲の任意の温度で前記ＤＮＡポリメラーゼを１５分間インキュベートした後も、その最大活性の少なくとも６０％を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
9. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、６．０〜８．５の範囲のｐＨで４２℃〜４５℃の融解温度を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
10. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはアリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼより高いポリメラーゼ活性を有し、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が２５℃で評価されるものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
11. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはアリイビブリオ・サルモニシダ（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来のＤＮＡポリメラーゼより少なくとも５０％高い鎖置換活性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
12. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼより高い処理能力を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
13. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、０ｍＭ〜２１０ｍＭ ＮａＣｌの濃度範囲にわたって、その最大ポリメラーゼ活性の少なくとも３０％を示す、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメント。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントと、緩衝剤とを含む、組成物。
15. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
16. 配列番号２で記載されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
17. 請求項１５または１６に記載の核酸分子と、前記核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列とを含む、発現ベクター。
18. １つもしくは複数の請求項１７に記載の発現ベクターまたは１つもしくは複数の請求項１５もしくは１６に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
19. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
    （ｉ）コードされる前記ＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で、請求項１７に記載の組換え発現ベクターのうち１つもしくは複数のものまたは請求項１５もしくは１６に記載の核酸分子のうち１つもしくは複数のものを含む宿主細胞を培養する段階と、
    （ｉｉ）前記宿主細胞または増殖培地もしくは上清から前記ＤＮＡポリメラーゼを単離または採取する段階と
    を含む、方法。
20. ヌクレオチド重合への請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントの使用。
21. 核酸増幅反応またはシーケンシング反応への請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントの使用。
22. 前記ＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを一定温度で使用する、請求項２０または２１に記載の使用。
23. 前記反応が、等温核酸増幅反応である、請求項２１または２２に記載の使用。
24. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを用いるヌクレオチド重合の方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントと、鋳型核酸分子と、前記鋳型核酸分子の一部分とアニールすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーと、１つまたは複数の種のヌクレオチドとを含む反応混合物を準備する段階と、
    （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドプライマーが前記鋳型核酸分子とアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１つまたは複数のヌクレオチドを重合させることにより前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で前記反応混合物をインキュベートする段階と
    を含む、方法。
25. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントを用いて核酸を増幅する方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼまたはその酵素的に活性なフラグメントと、鋳型核酸分子と、前記鋳型核酸分子酸分子の一部分とアニールすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）と、ヌクレオチドとを含む反応混合物を準備する段階と、
    （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）が前記鋳型核酸分子とアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１つまたは複数のヌクレオチドを重合させることにより前記オリゴヌクレオチドプライマー（１つまたは複数）を伸長させてポリヌクレオチドを生成する条件下で前記反応混合物をインキュベートする段階と
    を含む、方法。
26. 一定温度で実施する、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記一定温度が、０℃〜４２℃である、請求項２２に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
28. 前記一定温度が、１０℃〜２５℃である、請求項２７に記載の使用または請求項２７に記載の方法。
    

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