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JP6987638B2 - クレブシエラ・ニューモニエのガラクタンベースのｏ抗原をターゲティングする抗体 - Google Patents
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JP6987638B2 - クレブシエラ・ニューモニエのガラクタンベースのｏ抗原をターゲティングする抗体 - Google Patents

クレブシエラ・ニューモニエのガラクタンベースのｏ抗原をターゲティングする抗体 Download PDF

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Description

本発明は、伝染性多剤耐性クレブシエラ・ニューモニエ（肺炎杆菌）(Klebsiella pneumoniae)ＳＴ２５８の大部分に関連するユニークなガラクタンベースのＯ抗原構造体を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。
クレブシエラ・ニューモニエは、著しい罹患率および死亡率をもたらす尿路感染症、肺炎および敗血症に関与する重大な腸内細菌系病原体である。多剤耐性（ＭＤＲ）菌株が最近出現して世界的に拡散しており、それに対する治療選択肢は限られている。
リポ多糖（ＬＰＳ）は、クレブシエラ・ニューモニエなどのグラム陰性細菌の外膜の外葉(outer leaflet)の主成分である。ＬＰＳは、構造的および機能的に異なる３つの主要部分をもつ：ｉ）リピドＡ，それはエンドトキシンとしても知られている、ｉｉ）コア−オリゴ糖、およびｉｉｉ）Ｏ抗原，それはオリゴ糖ブロックの反復単位で構築されている。
クレブシエラ・ニューモニエＯ抗原は多様な構造の表面抗原であり、種々のＯタイプを規定する。現在認識されている７つのＯタイプのうち最も一般的な血清型はＯ１およびＯ２であると思われ、それらは合わせてすべての分離株の大部分（すなわち、＞５０％）が発現していると報告された(1;2)。Ｏ１およびＯ２抗原は両方とも、ガラクトースポリマー、すなわちガラクタンから構成されている。Ｏ２抗原（後記のＯ２ａｃと区別するために、Ｏ２ａまたはＯ２ａｂとしても知られる）は、いわゆるガラクタン−Ｉ 二糖のリピートで構成されている（参照：図３）。これに対し、Ｏ１およびＯ２ａｃ抗原は、ガラクタン−Ｉのほかに下記のように別個の追加構造を含む：ＬＰＳコア近接部分はガラクタン−Ｉのリピートで構成され、それにガラクタン−ＩＩ（Ｏ１の場合、異なるガラクトースホモポリマー）または非ガラクタン反復単位（Ｏ２ａｃの場合）がキャッピングしている。
ガラクタン−Ｉ Ｏ−サブユニットを共有する血清型は、この構造体の合成および輸出をコードする類似性の高いｒｆｂ遺伝子座を保有する。ガラクタン−Ｉをコードするオペロンのヌクレオチド配列は部分的に決定されている(3)。その遺伝子座は６つの遺伝子を含む７．３ｋｂの長さであると記載されている。クレブシエラ・ニューモニエＯ１、大腸菌(E. coli)Ｋ−１２またはチフス菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)のラフ型変異体(rough mutant)にクローン化ｒｆｂ遺伝子座を補充すると、ガラクタン−Ｉ Ｏ抗原リピートからなるスムーズＬＰＳ(smooth LPS)の産生を回復した。これは、ガラクタン−Ｉ Ｏ抗原側鎖の産生にはこれら６つの遺伝子が必須かつ十分であることを示唆する(3)。種々のＯ２クレブシエラ属(Klebsiella)菌株におけるＤ−ガラクタン−Ｉの構造修飾がKellyらにより公表された(5)。それにもかかわらず、これらの修飾の遺伝学的バックグラウンドは依然として解明されないままである。ガラクタン−ＩＩ反復単位（すなわち、ガラクタン−Ｉまたは本明細書に提示するガラクタン−ＩＩＩをキャッピングしているもの）をコードする遺伝学的決定因子が最近記載された(4)。重要な点は、これらの遺伝子は、ガラクタン−Ｉユニットをガラクタン−ＩＩＩに変換するのに関与する遺伝学的決定因子とは無関係なことである。したがって、Ｏ１血清型の菌株は、血清型を決定する表面存在ガラクタン−ＩＩ反復単位を発現するほかに、リピドＡ−コアとガラクタン−ＩＩリピートとを架橋するガラクタン−Ｉまたはガラクタン−ＩＩＩのいずれかの反復単位を発現する可能性がある。
最近出現したクレブシエラ・ニューモニエの多剤耐性（ＭＤＲ）菌株は、著しい割合のクレブシエラ・ニューモニエ感染症の原因である。ＭＤＲ菌株は大部分のクラスの臨床関連抗生物質に対する耐性を発生させたので、それに対抗する治療選択肢は著しく限定されつつある。したがって、別の治療選択肢、たとえばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による受動免疫化は将来に対する大きな有望性をもつ。
クレブシエラ・ニューモニエの新たなターゲットが求められている。特に、免疫適性(immunorelevant)でありかつ療法および診断薬の開発に使用できるターゲットを同定する必要がある。
Hansen DS, Mestre F, Alberti S, et al. Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide O typing: revision of prototype strains and O-group distribution among clinical isolates from different sources and countries. J Clin Microbiol 1999 Jan;37(1):56-62. Trautmann M, Ruhnke M, Rukavina T, et al. O-antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolates and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Clin Diagn Lab Immunol 1997 Sep;4(5):550-5. Clarke BR, Whitfield C. Molecular cloning of the rfb region of Klebsiella pneumoniae serotype O1:K20: the rfb gene cluster is responsible for synthesis of the D-galactan I O polysaccharide. J Bacteriol 1992 Jul;174(14):4614-21. Hsieh PF, Wu MC, Yang FL, et al. D-galactan II is an immunodominant antigen in O1 lipopolysaccharide and affects virulence in Klebsiella pneumoniae: implication in vaccine design. Front Microbiol 2014;5:608. R.F.Kelly, M.B.Perry, L.L.MacLean, C.Whitfield. Structures of the O-antigens of Klebsiella serotypes 02 (2a,2e), 02 (2a,2e,2h), and 02 (2a,2f,2g) members of a family of related D-galactan O-antigens in Klebsiella spp. Journal of Endotoxin Research 1995;2:131-40.
本発明の目的は、クレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防または治療に使用するための、クレブシエラ・ニューモニエ、特にＭＤＲ株に対する抗体であって、病原体をターゲティングするための改善された適合率を備えた抗体を提供することである。さらに、クレブシエラ・ニューモニエ細菌、たとえばＭＤＲ株を、迅速に信頼性をもって診断できる手段および方法を提供することが目的である。
この目的は本発明の主題により解決される。
本発明によれば、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ） Ｏ抗原構造体のガラクタン−ＩＩＩエピトープを特異的に認識する単離された抗体であって、エピトープはガラクタン−ＩＩＩ反復単位に内包されており、そのガラクタン−ＩＩＩ反復単位が式（Ｉ）
Figure 0006987638
の分枝ガラクトースホモポリマーである、上記抗体を提供する。
具体的には、ガラクタン−ＩＩＩエピトープは少なくとも２、または少なくとも３、４もしくは５つのｇａｌ−ＩＩＩ反復単位を含むＯ抗原構造体に内包されている。
特定の側面によれば、この抗体はガラクタン−Ｉエピトープに対比してガラクタン−ＩＩＩエピトープに優先的に結合するか、あるいはガラクタン−Ｉエピトープと交差反応せず、ここで、ガラクタン−Ｉ（ｇａｌ−Ｉ）エピトープはクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ Ｏ２ａ抗原構造体のガラクタン−Ｉ反復単位に内包されており、そのガラクタン−Ｉ反復単位は式（ＩＩ）
Figure 0006987638
の線状ガラクトースホモポリマーである。
たとえば、本発明の抗体は、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原を含むＯ抗原構造体を特異的に認識または結合するｇａｌ−ＩＩＩ特異的抗体である。代表的抗体、またはそのような抗体のバリアントを、図１および２に挙げる。バリアントを提示する目的のために、それらの抗体を本明細書中で親抗体と呼び、それらのＣＤＲまたはフレームワーク配列を本明細書中で親ＣＤＲまたは親フレームワーク配列と呼ぶ。
特定の側面によれば、抗体は、たとえば異なる由来の組換えＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、その際、ＣＤＲおよびフレームワーク配列のうち少なくとも１つはヒト、ヒト化、キメラ、ネズミまたは親和性成熟(affinity matured)配列を含み、好ましくはその際フレームワーク配列はいずれかの免疫グロブリンアイソタイプ、特にＩｇＧ抗体のものである。
具体的には、本発明の抗体はｇａｌ−ＩＩＩおよびｇａｌ−Ｉエピトープの結合に対して交差特異的であり、クレブシエラ・ニューモニエのＯ２抗原のｇａｌ−Ｉ抗原構造体に対比してｇａｌ−ＩＩＩ抗原構造体に優先的に、たとえばｇａｌ−Ｉ抗原と比較してｇａｌ−ＩＩＩを結合する方が高い親和性で、結合する。特定の態様によれば、抗体はｇａｌ−Ｉ抗原と比較してｇａｌ−ＩＩＩの結合について少なくとも２倍大きい親和性をもつ；具体的には、少なくとも２倍の差、または少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、またはさらには少なくとも１０倍の差、たとえば親和性（アフィニティー）(affinity)および／またはアビディティー(avidity)の差。たとえば、ｇａｌ−Ｉ抗原よりｇａｌ−ＩＩＩ抗原を優先的に結合するＫｄ差は、イムノアッセイ、好ましくはイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により判定して、少なくとも０．５もしくは１ ｌｏｇ、またはさらには少なくとも２ ｌｏｇ、もしくは少なくとも３ ｌｏｇの差である。
本発明の抗体は、具体的にはさらに、他のいずれのクレブシエラ・ニューモニエ抗原とも交差反応しないことを特徴とし、および／または抗体は他のいずれかのクレブシエラ・ニューモニエ抗原に、より低い親和性で結合する；たとえば、その際、他のクレブシエラ・ニューモニエ抗原（ｇａｌ−ＩＩＩまたはｇａｌ−Ｉ抗原以外のもの）よりｇａｌ−ＩＩＩ抗原を優先的に結合するＫｄ差は、少なくとも２ ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ ｌｏｇである。
具体的には、機能活性バリアントは機能活性ＣＤＲバリアントであり、それは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
特定のバリアントはたとえば親抗体のヒト化バリアントであり、その際、親ＣＤＲ配列はヒトまたはヒト化フレームワーク配列に内包され、場合により親またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を改善するために点変異の導入によりそれぞれの親ＣＤＲ配列の１、２、３または４個のアミノ酸残基がさらに変異していてもよい。
具体的には、そのようなバリアントのＶＨまたは重鎖（ＨＣ）配列がそれぞれ他のバリアントのＶＨおよびＨＣ配列により置換されていてもよく、特にその際、他のバリアントは同じ親抗体の他のいずれかのバリアントである。
具体的には、そのようなバリアントのＶＬまたは軽鎖（ＬＣ）配列がそれぞれ他のバリアントのＶＬおよびＬＣ配列により置換されていてもよく、特にその際、他のバリアントは同じ親抗体の他のいずれかのバリアントである。
具体的には、ガラクタン−ＩＩＩエピトープは多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエ、より具体的にはＭＤＲクローンＳＴ２５８により発現される。具体的には、ガラクタン−ＩＩＩエピトープは多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエのものである。
特定の態様によれば、抗体は、ガラクタン−ＩＩＩエピトープを１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、よりいっそう好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで結合する親和性をもつ。
親和性成熟により製造された親抗体のバリアント（本明細書中で親和性成熟バリアントと呼ぶ）は、親抗体と比較してＫｄ差が少なくとも１ ｌｏｇ、または２ ｌｏｇ、または３ ｌｏｇの増大した結合親和性をもつ可能性がある。親和性成熟バリアントは、一般にｇａｌ−ＩＩＩ抗原を１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄで結合する親和性をもつ。親抗体が１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＫｄの親和性をもち、かつ親抗体が親和性成熟を受けているならば、親和性成熟バリアントはそれぞれ１０−９Ｍ未満および１０−１０Ｍ未満のＫｄの、よりいっそう高い親和性をもつ可能性がある。
特定の側面によれば、抗体は中和抗体である。具体的には、抗体はインビトロまたはインビボ検出法により判定して、ガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシン（すなわち、ＬＰＳ）を中和する。具体的には、抗体は特定のＬＰＳ分子のエンドトキシン作用をインビトロで中和する。
具体的には、抗体はガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシンを中和し、その際、中和力価は少なくとも、Ｋａｂａｔの命名法に従った下記のものを含む基準抗体（たとえば、基準抗体２Ｄ８−Ａ１０）の力価である：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；および
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６。
そのようなＣＤＲ配列はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示されている。
以下において、別に指示しない限り、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングした、すなわちＫａｂａｔ命名法(参照：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S.Department of Health and Human Services. (1991))に従って定めたＣＤＲ配列、特に表１に挙げたＣＤＲ配列について述べる。本発明および特許請求の範囲が、同じ抗体およびＣＤＲであるけれども異なるナンバリングおよび表示をもつＣＤＲ領域、すなわち、ＩＭＧＴシステム(The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212)に従って定義されたＣＤＲ領域をも包含するはずであることは十分に理解される。
具体的には、本発明の抗体がターゲティングするクレブシエラ・ニューモニエ株は、追加グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｒ）遺伝子が内包されたｒｆｂｇａｌ−Ｉ遺伝子座を特徴とする。
特定の側面によれば、抗体はＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエのクローンＳＴ２５８、特にガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現している株を認識する。
特定の態様は、完全長モノクローナル抗体、その抗体フラグメントであって結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含むもの、または結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質のいずれかである抗体について述べる；具体的には、その際、抗体はランダム化または人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である。
具体的には、抗体はネズミ、リャマ、ウサギ、ヤギ、ウシ、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよび一本鎖抗体、たとえばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ、好ましくはヒトＩｇＧ抗体またはネズミＩｇＧ抗体からなる群から選択される抗体である。
具体的には、抗体はモノクローナル抗体である。
特定の態様によれば、抗体は少なくとも、表１に挙げるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を特徴とする抗体重鎖可変領域またはドメイン（ＶＨ）（それらはＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示されている）のいずれか、またはその機能活性ＣＤＲバリアントを含む。
特定の側面によれば、本発明は、本明細書に添付する図面に詳述する代表的（親）抗体、およびそのような親抗体のさらなる抗体バリアント、特に本質的に親抗体（図２のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列により形成される特異的結合部位あるいは表１の各ＣＤＲ配列を特徴とするもの）と同じエピトープに結合するバリアントを含むものを提供する。そのような抗体は、たとえば親抗体の各ＣＤＲまたは抗体配列を修飾することにより得られる機能活性バリアント抗体であってもよい。本明細書に記載する抗体配列であって、たとえば点変異によるバリエーションを受ける配列はいずれも“親”配列とみなされることは十分に理解されされる。
例に記載する抗体はネズミ由来またはそのヒト化形態である。ヒト化および場合により親和性成熟により得られるバリアントは、周知の手法で工学操作されたものであってもよい。これらのバリアント抗体はターゲット抗原に結合し、よって機能活性であるとみなされる。たとえばそれぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列中に修飾をもつバリアントＶＨまたはＶＬドメインであって、機能活性であるもの、たとえば親抗体と同じエピトープに結合し、または同じ結合部位を含み、または同じ結合特性をもつものを使用できる。本明細書に記載する抗体のあるＦＲまたはＣＤＲ配列を、他の抗体、たとえば表１に挙げた抗体のものと交換することもできる。
具体的には、本発明の抗体は、図１（表１）に示す抗体重鎖可変領域のＣＤＲ配列のいずれかもしくはその機能活性ＣＤＲバリアント、および／または図２に示すＶＨ配列から選択されるいずれかのＶＨアミノ酸配列もしくはその機能活性バリアント、たとえば抗体重鎖（ＨＣ）またはＶＨアミノ酸配列を含む；それは、ＣＤＲ１、２および３、すなわちＣＤＲ１配列１、４、７もしくは１０のいずれか；および／またはＣＤＲ２配列２、５、８もしくは１１のいずれか；および／またはＣＤＲ３配列３、６、９もしくは１２のいずれかを含む；あるいはＶＨ配列１９、２１、２３または２５のいずれかを含む。
具体的には、抗体は下記のものである：
Ａ）グループメンバーｉ）〜ｉｖ）からなるグループから選択される抗体
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体。
具体的には、機能活性バリアントは機能活性ＣＤＲバリアントであり、それは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
具体的には、抗体は図２に示すいずれかのＶＨ配列から選択されるＶＨアミノ酸配列を含む。
特定の態様によれば、抗体はさらに、抗体軽鎖可変領域またはドメイン（ＶＬ）を含み、それは表１に挙げるＣＤＲ４〜ＣＤＲ６配列（それらはＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示されている）のいずれか、またはその機能活性ＣＤＲバリアントを含む。
具体的には、本発明の抗体は図１（表１）に示す抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ配列のいずれかもしくはその機能活性ＣＤＲバリアント、および／または図２に示すＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列もしくはその機能活性バリアント、たとえば抗体軽鎖（ＬＣ）またはＶＬアミノ酸配列を含む；それは、ＣＤＲ４、５および６、すなわちＣＤＲ４配列１３、１６もしくは１９のいずれか；および／またはＣＤＲ５配列１４、１７もしくは２０のいずれか；および／またはＣＤＲ６配列３、６、９もしくは１２のいずれかを含む；あるいはＶＨ配列１５または１８のいずれかを含み、あるいはＶＬ配列２０、２２、２４または２６のいずれかを含む。
具体的には、抗体は下記のものである：
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体。
具体的には、機能活性バリアントは機能活性ＣＤＲバリアントであり、それは親ＣＤＲ配列中に少なくとも１つの点変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
具体的には、抗体は下記を特徴とするＶＬドメイン：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４、またはそのＣＤＲ４の機能活性ＣＤＲバリアント；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５、またはそのＣＤＲ５の機能活性ＣＤＲバリアント；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６、またはそのＣＤＲ６の機能活性ＣＤＲバリアント；
を、好ましくは本明細書に記載するいずれかのＶＨ配列との組合わせで含む。
具体的には、抗体は図２に示すＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列を含む。
具体的には、抗体はＶＨおよびＶＬの両方のアミノ酸配列、ならびに場合によりさらに完全長抗体または抗体フラグメント、特に完全長抗体またはＦａｂフラグメントのいずれかのフレームワーク配列を含む。
具体的には、抗体は下記のものを含む：
ａ）表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
ｂ）図２に示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬ配列；または
ｃ）ａ）〜ｃ）の配列を特徴とする親抗体の機能活性バリアント：
好ましくは、その際、
ｉ．機能活性バリアントは、親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む；および／または
ｉｉ．機能活性バリアントは、ＶＨおよびＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域に少なくとも１つの点変異を含む；
さらに
ｉｉｉ．機能活性バリアントは、親抗体と同じエピトープを結合する特異性を有する；および／または
ｉｖ．機能活性バリアントは、親抗体のヒト、ヒト化、キメラもしくはネズミおよび／または親和性成熟バリアントである。
具体的には、抗体は下記のものからなる群から選択される：
ａ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ２のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ３のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １３のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １４のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １５のＣＤＲ６配列；
ｂ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １６のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｃ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ７のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ８のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ９のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｄ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｅ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｆ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
または以上のいずれかの機能活性ＣＤＲバリアントであって、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原を１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、好ましくは１０−１１Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を備えたもの、たとえばピコモル濃度範囲の親和性を備えたもの。
具体的には、抗体は表１に挙げるいずれかのＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含み、その際、機能活性ＣＤＲバリアントは少なくとも下記のものを含む：
ａ）親ＣＤＲ配列における１、２もしくは３つの点変異；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端もしくは４つのＮ末端もしくは４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１もしくは２つの点変異；および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性；
好ましくは、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む。
具体的には、機能活性バリアント抗体は本発明の少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む。具体的には、少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む機能活性バリアント抗体は、親抗体と同じエピトープを結合する特異性をもつ。
具体的には、機能活性バリアントはＣＤＲバリアントであり、たとえばそれは、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を備えたＣＤＲ、より具体的にはＣＤＲループ配列を含む。
特定の側面によれば、少なくとも１つの点変異は１以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
具体的には、機能活性バリアントはアミノ酸配列中の、好ましくはＣＤＲ中の、少なくとも１つの点変異において親抗体と異なり、その際、各ＣＤＲアミノ酸配列中の点変異の数は０、１、２または３である。
具体的には、抗体はそのような抗体から各ＣＤＲ配列またはＣＤＲ変異体を用いて誘導され、それには機能活性ＣＤＲバリアント、たとえば１つのＣＤＲループ内に、たとえばアミノ酸５〜１８個の長さのＣＤＲ内に、たとえばアミノ酸５〜１５個またはアミノ酸５〜１０個のＣＤＲ領域内に、１、２または３つの点変異を含むものが含まれる。あるいは、機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体を得るために、１つのＣＤＲループ内に、たとえばアミノ酸５個未満の長さのＣＤＲ内に、１〜２つの点変異があってもよい。特定のＣＤＲ配列、たとえばＣＤＲ２またはＣＤＲ５配列は、短くてもよい。特定の態様によれば、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む。
特定の側面によれば、本発明の抗体はＣＤＲおよびフレームワーク配列を含み、その際、ＣＤＲおよびフレームワーク配列のうち少なくとも１つはヒト、ヒト化、キメラ、ネズミまたは親和性成熟配列を含み、好ましくはフレームワーク配列はＩｇＧ抗体のもの、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブタイプのもの、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ抗体のものである。
特定の抗体は、たとえば親抗体の製造適性または耐容性を改善するために、たとえば低い免疫原ポテンシャルをもつ改善された（変異）抗体を提供するために、フレームワーク変異抗体として、たとえば親抗体と比較してＣＤＲ配列および／またはフレームワーク配列のいずれかに変異をもつヒト化抗体として、提供される。
たとえば抗体の親和性を改善するために、および／または親抗体がターゲティングするエピトープと同じエピトープをターゲティングするかまたはその近くにあるエピトープをターゲティングする（エピトープシフト）ために、さらなる特定の抗体はＣＤＲ変異抗体として提供される。
したがって、改善されたバージョンを工学的に作製するために、表１または図２に挙げるいずれかの抗体を親抗体として使用できる。
特定の側面によれば、本発明の抗体は図１（表１）に挙げるＣＤＲ組合わせを含むが、ただし、その抗体はなお機能活性である。
具体的には、本発明の抗体は表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜６を含む。しかし、別態様によれば、抗体は異なるＣＤＲ組合わせを含むことができ、たとえばその際、抗体は表１に挙げるように少なくとも１つのＣＤＲ配列、たとえば１つの抗体の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ配列、および表１に挙げるいずれかの抗体と異なる抗体の少なくとも１つのさらなるＣＤＲ配列を含む。特定の例によれば、抗体は１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ配列を含み、その際、ＣＤＲ配列は１より多い抗体、たとえば２、３、４、５または６つの異なる抗体のＣＤＲの組合わせである。たとえば、好ましくは表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜３のうち１、２または３つすべて、および同じ抗体または表１に挙げる他のいずれかの抗体のＣＤＲ４〜６のうち１、２または３つすべてを含むようにＣＤＲ配列を組み合わせることができる。
たとえば、好ましくは少なくとも表１に挙げるいずれかの抗体、たとえば８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、もしくは２Ｄ８−Ａ１０と表示されるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜３、および／または表１に挙げるいずれかの（他の）抗体、たとえば５Ａ４−Ａ７と表示される抗体の少なくともＣＤＲ４〜６、または少なくともそれのＣＤＲ４およびＣＤＲ６配列をそれのＣＤＲ５の機能活性ＣＤＲバリアントと組み合わせたものを含むように、ＣＤＲ配列を組み合わせることができる。特定の態様によれば、本発明の抗体は表１に挙げるいずれかの抗体、たとえば、８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、または２Ｄ８−Ａ１０と表示されるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜６を含む。しかし、さらなる特定の側面によれば、抗体は異なるＣＤＲ組合わせを含むことができる；たとえば表１に挙げる抗体、たとえば８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、または２Ｄ８−Ａ１０と表示されるいずれかの抗体が、異なる抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列、たとえば１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ配列、たとえば表１に挙げるいずれかの抗体のうちいずれか異なる抗体のＣＤＲ配列を含むことができる。たとえば、抗体は１、２、３、４、５または６つのＣＤＲ配列を含み、その際、ＣＤＲ配列は１より多い抗体、たとえば２、３、４、５または６つの異なる抗体のＣＤＲの組合わせである。異なる抗体のＣＤＲ配列を含む代表的抗体を図２に示す。
特に、
ｉ．抗体Ｇ３−７７は、抗体９Ｈ９−Ｈ７のＶＨ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、２および３）；および抗体５Ａ４−Ａ７のＶＬ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ４、５および６）を含む；
ｉｉ．抗体Ｇ３−７８は、抗体９Ｈ９−Ｈ７のＶＨ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、２および３）；および抗体５Ａ４−Ａ７のＶＬ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ４、５および６）を含む；
ｉｉｉ．抗体Ｇ３−９７は、抗体２Ｄ８−Ａ１０のＶＨ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、２および３）；および抗体５Ａ４−Ａ７のＶＬ−ＣＤＲ配列（ＣＤＲ４、５および６）を含む。
特定の態様によれば、抗体は抗原結合部分としてＶＨドメインのみを含み、よってＣＤＲ１〜３を含み、各ＶＬドメインを含まない。
本発明において特に、ＣＤＲ１、２および３とナンバリングされたＣＤＲはＶＨドメインの結合領域を表わし、ＣＤＲ４、５および６はＶＬドメインの結合領域を表わすと解釈される。
特定の側面によれば、本発明の抗体は図２に示すいずれかのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の組合わせ、またはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列のそのような組合わせにより形成される結合部位を含む。あるいは、２つの異なる抗体の免疫グロブリンドメインの組合わせを使用できるが、ただしその抗体はなお機能活性である。たとえば、１抗体のＶＨ配列を他の抗体のＶＬ配列と組み合わせることができる。さらなる特定の態様によれば、図２に提示するいずれかのフレームワーク領域を、本明細書に記載するいずれかのＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ組合わせに対するフレームワークとして使用できる。
特定の側面によれば、本発明の抗体は図２に示すいずれかのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の組合わせ、またはそのようなＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の組合わせにより形成される結合部位を含む。
本発明の抗体は場合により、そのような図２のアミノ酸配列を含み、適切なシグナル配列またはリーダー配列を含むかまたは含まないと解釈される。
特定の側面によれば、図２の配列はそれぞれ定常領域において末端が伸長または欠失していてもよい；たとえば、１個以上のＣ末端アミノ酸の欠失。
図２は、８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、２Ｄ８−Ａ１０、Ｇ３−４３、Ｇ３−４６、Ｇ３−７７、Ｇ３−７８、およびＧ３−９７と呼ばれる親抗体の種々のＶＨ配列および種々のＶＬ配列を示し、親抗体それぞれのいずれかのＶＨ／ＶＬ組合わせ、よって一連の種々のＶＨ／ＶＬ組合わせ、たとえば図９に示すものを支持する。したがって、親抗体の特定のバリアントは、１つの親抗体のＶＨ配列および他の親抗体のＶＬ配列、またはそのようなＶＨおよびＶＬ配列の機能活性バリアント、たとえば同じ親抗体に由来する機能活性バリアントを含むことができる。
特に、図２は、８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、２Ｄ８−Ａ１０、Ｇ３−４３、Ｇ３−４６、Ｇ３−７７、Ｇ３−７８、およびＧ３−９７と呼ばれる親抗体の種々のＶＨ配列および種々のＶＬ配列を示す。たとえば、１つの親抗体のＶＨ配列と他の親抗体のＶＬ配列を組み合わせる８１種類の異なるＶＨ／ＶＬ組合わせが可能であり、いずれかのＶＨまたはＶＬ配列が親配列の機能活性バリアント、たとえばいずれかのＣＤＲ変異および／またはフレームワーク変異を含むバリアントであれば、より多数のバリアントが可能である。
図２のＶＨおよびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列は、図１に挙げるそれぞれのＣＤＲ配列と同一である。
本発明はさらに、本発明のいずれかの抗体、たとえば表１に挙げる抗体、または図２に示すいずれかのＶＨまたはＶＬアミノ酸配列の組合わせを含む抗体、またはそのようなＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の組合わせにより形成される結合部位を含む抗体である親抗体の機能活性抗体バリアントを製造する方法を提供し、その方法は、いずれかのフレームワーク領域（ＦＲ）または定常ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）において少なくとも１つの点変異を工学的に形成してバリアント抗体を得ること、および具体的にはｇａｌ−ＩＩＩエピトープを１０−６Ｍ未満、好ましくは１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ、さらには１０−１０Ｍ未満、または１０−１１Ｍ未満のＫｄで、たとえばピコモル濃度範囲の親和性で結合する親和性によりバリアント抗体の機能活性を判定することを含む。機能活性を判定すると、さらなる使用のために、および場合により組換え体製造方法による製造のために、機能活性バリアントを選択する。
特定の側面によれば、バリアント抗体は親抗体と同じエピトープを結合する。
さらなる特定の側面によれば、バリアント抗体は親抗体と同じ結合部位を含む。
機能活性バリアント抗体は、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかにおいて異なるか、あるいは共通のＶＨおよびＶＬ配列を共有し、それぞれのＦＲに修飾を含む可能性がある。親抗体から変異形成により誘導されるバリアント抗体は、当技術分野で周知の方法により製造できる。
代表的な親抗体を後記の実施例のセクションならびに図１（表１）および図２に記載する。具体的には、抗体は表１または図２に挙げる配列を特徴とする親抗体の機能活性誘導体である。１以上の修飾ＣＤＲ配列をもつバリアント、および／または１以上の修飾ＦＲ配列（たとえば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４の配列）もしくは修飾された定常ドメインをもつバリアントを工学的に作製できる。
たとえば、機能活性バリアント抗体は変異形成、具体的には親和性成熟および／またはヒト化により得ることができる。バリアント抗体は親抗体の共通のＣＤＲ配列ＣＤＲ１〜６または共通のＶＨおよびＶＬ配列をなお共有することができるけれども、それぞれのＦＲまたはＣＤＲ配列における修飾をもつ機能活性であるバリアント抗体または抗体ドメインを製造することも可能である。
親抗体の代表的バリアント抗体は、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかに少なくとも１つの点変異、および／またはＦＲ配列のいずれかに少なくとも１つの点変異を含み、好ましくはその抗体は親抗体と同じエピトープを結合する特異性をもつ。
ある側面において、本発明はそのような機能活性バリアント抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト化またはヒト抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、軽鎖もしくはＶＬ可変領域またはそれぞれのＣＤＲが、親抗体、すなわち８Ｄ５−１Ｇ１０もしくは４Ｄ５−Ｄ４と表示される抗体または表１もしくは図２に挙げる他の抗体から、少なくとも１つのＦＲまたはＣＤＲ配列の修飾により誘導されたアミノ酸配列を含むものを提供する。
本発明はさらに、対象における感染を制限するかまたはその感染から生じる病状を軽減するのに有効な量の抗体を対象に投与することを含む、クレブシエラ・ニューモニエの感染または定着のリスクをもつかまたはそれを伴う対象の処置に使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、本発明の抗体を提供する。
したがって、本発明はさらに、対象における感染を制限するかまたはその感染から生じる病状を軽減するのに有効な量の抗体を対象に投与することを含む、クレブシエラ・ニューモニエの感染または定着のリスクをもつかまたはそれを伴う対象を処置する方法、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかを治療または予防する方法である。
その抗体は、具体的には致死的なエンドトキセミア（内毒素血症）を中和することができる。そのような機能活性は適宜なインビボモデル（精製ＬＰＳで攻撃したもの）において判定できる。
具体的には、抗体はｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエ、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエ、好ましくはＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエＳＴ２５８に対する殺細菌活性を提供することができる。
特定の側面によれば、本発明の抗体を用いる免疫療法は、たとえば種々の動物モデルにおいて判定して生細菌攻撃に対し効果的に防御できる。
前記抗体は、具体的には、補体仲介殺菌によりｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して有効な可能性があり、たとえばインビトロ血清殺細菌アッセイ(serum bactericidal assay)（ＳＢＡ）により判定して、たとえば対照試料（抗体無添加または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％高い殺細菌を伴う。
前記抗体は、具体的には、抗体仲介食作用によりｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して有効な可能性があり、たとえばインビトロ オプソニン食作用殺菌アッセイ(opsonophagocytotic killing assay)（ＯＰＫ）により判定して、たとえば対照試料（抗体無添加または無関係な対照ｍＡｂを添加）より少なくとも２０％高い装入細菌取込みまたは２０％低い最終ＣＦＵカウントを伴う。
前記抗体は、具体的には、エンドトキシン機能を中和することによりｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエに対して有効であり、たとえばインビトロＬＡＬアッセイ、またはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイにより判定して、たとえば対照試料（抗体無添加または無関係な対照ｍＡｂを添加）と比較して少なくとも２０％のエンドトキシン活性低減を伴う。
さらなる特定の側面によれば、抗体はヒトおよび非ヒト動物の両方を含めた動物においてターゲットである病原体を中和し、インビボで、好ましくは原発性および続発性の
菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかのモデルにおいて発病を阻害する。
中和力価を判定するための基準（陽性対照）として、実施例のセクションに記載するいずれかの抗体を使用できる。好ましくは、本発明の抗体の中和力価は本明細書において２Ｄ８−Ａ１０と呼ぶ抗体のＣＤＲ１〜６配列を特徴とする抗体、特に実施例に記載するキメラＩｇＧ１抗体と同等であるかまたはそれより高い。
本発明はさらに、本発明の抗体を含み、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、医薬製剤（好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む）を提供する。
そのような医薬組成物は、その抗体を唯一の有効物質として、または他の有効物質もしくは有効物質のカクテルとの組合わせで、たとえば少なくとも２または３種類の異なる抗体の組合わせまたはカクテルで含有することができる。
本発明によれば、本発明の抗体は具体的には医療、診断または分析用として提供される。
本発明はさらに、診断の目的のための、具体的には対象におけるクレブシエラ・ニューモニエ（特にＳＴ２５８）の感染もしくは定着、または関連疾患、たとえば原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎もしくは髄膜炎の診断のための、本発明の抗体の使用を提供する。
具体的には、対象はヒト、特に免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の患者、またはその接触者(contact)である。
具体的には、抗体は本発明に従って対象の生体試料を抗体と接触させることによりその対象におけるｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着をエクスビボで判定するのに使用するために提供され、その際、抗体の特異的な免疫反応が感染または定着を決定する。
具体的には、生体試料は体液または組織試料、好ましくは血液試料、糞便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器検体、たとえば気管内吸引物、胸膜液、肺穿刺液、鼻スワブもしくは喀痰、または以上のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である。具体的には、体液の試料を特異的免疫反応について検査し、その試料は尿、血液、血液分離物または血液培養物、吸引物、喀痰、挿管対象の洗浄液、および糞便からなる群から選択される。
具体的には、生体試料を処理して生体試料に由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株を調製し、その分離株をさらにそれのｇａｌ−ＩＩＩ遺伝子型もしくは表現型、および／またはｇａｌ−ＩＩＩ抗原の発現レベルについて解明することができる。細菌分離株を調製するための好ましい調製方法は、細菌の富化および培養工程を採用するものである。
具体的には、場合により、マトリックス効果を低減しかつ検査の特異度および感度を増大させるために富化または精製する調製工程に従って生体試料を処理して、試料中のｇａｌ−ＩＩＩレベルを直接決定する。調製工程には、標準的培養法、たとえば限定ではなく、微生物学実験室でルーティンに実施される標準的な増殖培地における血液培養および固体寒天上での検体培養（表現型決定−すなわち耐性記録(antibiogram)を含む）に従って生物学的検体を培養する工程が含まれる。細菌をＣＦＵ拡大のために種々の培地（標準培地および／または化学的に規定した培地；高栄養素、低栄養素、限定増殖培地組成）で継代培養して、病原因子(virulence factor)の発現を増大させることができる。細菌懸濁液を調製し、標準緩衝液中で洗浄して、潜在的なマトリックス効果を排除することができる。
具体的には、イムノアッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ディップスティックアッセイ(dipstick assay)およびウェスタンブロットのいずれか、または質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはｇａｌ−ＩＩＩ発現の指標となる対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを決定する方法、特に、好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いてｇｔｒ遺伝子に特異的な核酸配列を決定する方法のうち少なくとも１つにより、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原を決定する。
具体的には、本発明に従った診断使用は、臨床検体から回収した純粋なクレブシエラ・ニューモニエ培養物に由来するクレブシエラ・ニューモニエの血清型をインビトロで決定して、その細菌がｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのものであるか否かを判定することを表わす。
本発明はさらに、下記の構成要素
ａ）抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により、抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相
を含む、組成物またはキット状パーツ中に抗体およびさらなる診断試薬を含む、本発明の抗体の診断用製剤を提供する。
診断用製剤は、場合により組成物またはキット状パーツ中に本発明の抗体およびさらなる診断試薬を含む。
診断キットは、好ましくは生体試料におけるｇａｌ−ＩＩＩ発現を判定するための必須成分をすべて含み、場合により一般的または非特異的的な物質または成分、たとえば水、緩衝液または賦形剤を含まない。貯蔵安定キットは、好ましくは少なくとも６か月間、より好ましくは少なくとも１または２年間、貯蔵できる。それは乾燥した（たとえば、凍結乾燥した）成分から構成されてもよく、および／または保存剤を含有してもよい。
好ましい診断キットは、パッケージまたはプレパッケージされたユニットとして提供され、それはたとえば構成要素が１つのパッケージのみに収容され、それによりルーティン実験が容易になる。そのようなパッケージは、たとえば一連の生体試料の検査を実施するのに適した１回以上の検査に必要な試薬を収容することができる。キットはさらに、適切には標準または基準対照としてのｇａｌ−ＩＩＩ抗原製品を収容することができる。
診断用組成物は、生体試料との反応混合物中にそのまま使用できる試薬、またはそのような試薬の保存形態、たとえば凍結乾燥；瞬間凍結（たとえば、液体窒素中における）、超低温貯蔵（−７０℃および−８０℃）、低温貯蔵（−２０℃および５℃）および制御された室温（１５℃〜２７℃）での貯蔵；標準的試料貯蔵、たとえばグリセロールストック(glycerol-stock)、組織パラフィンブロック、（口腔）スワブ、および他の標準的な生体試料貯蔵など、貯蔵安定形態であってもよく、それらの保存形態の試薬を再構成または調製して、そのまま使用できる試薬を得ることができる。そのようなそのまま使用できる試薬は、一般に水溶液、具体的には（生理的）緩衝状態のもの（たとえば、ＥＤＴＡ緩衝化、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、クエン酸緩衝液など）の形態である。
具体的には、さらなる診断試薬は、抗体と、および／または抗体がそれの抗原に結合した反応生成物と、特異的に反応する試薬である。対象においてクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断またはモニタリングするイムノアッセイを実施するために、適宜な診断試薬を使用するのが適切である。適宜な診断試薬は、本発明の抗体および／または抗体−抗原免疫複合体に特異的に結合する溶媒、緩衝液、色素、抗凝固剤、リガンドであってもよい。
具体的には、本発明は本発明の抗体の診断用製剤を提供し、それは場合により、標識を備えた抗体、および／または標識を備えたさらなる診断試薬、たとえば抗体を、または抗体と各ターゲット抗原との免疫複合体を特異的に認識する試薬、ならびに／あるいは抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相を収容している。
抗体または診断試薬を直接または間接的に標識することができる。間接標識は、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原に対する抗体または診断試薬との複合体を形成する標識された結合剤を含むことができる。
標識は一般に、アッセイにおいて検出できる分子または分子の一部である。代表的な標識は発色団、蛍光色素、または放射性分子である。ある態様において、抗体または診断試薬を検出可能な標識にコンジュゲートさせる；それには、それら自体が検出可能である分子（たとえば、蛍光性部分、電気化学的標識、金属キレートなど）、および間接的に、検出可能な反応生成物の産生によって検出できる分子（たとえば酵素、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、またはそれ自体が検出可能である特異的結合分子（たとえば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、ヒ酸フェニル、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）によって検出できる分子が含まれる。
好ましい診断用製剤またはアッセイは、たとえば検査すべき試料から得られるｇａｌ−ＩＩＩタイプの細菌の、抗体による凝集を検査するために、固相、たとえばラテックスビーズ、金粒子などに固定化した本発明の抗体を含む。
本発明はさらに、
ａ）本発明による抗体を用意し、そして
ｂ）その抗体が被験対象の生体試料中のガラクタン−ＩＩＩエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断する
ことを含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ株により起きたクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断する方法を提供する。
そのような診断は、具体的にはＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着の症例、特にｇａｌ−ＩＩＩタイプのＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエに対する診断に適用される。場合により、診断アッセイは、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原とｇａｌ−Ｉ抗原を識別できるように、ｇａｌ−ＩＩＩおよび／またはｇａｌ−Ｉを結合する異なる特異性および／または親和性を備えた２種類の異なる抗体を伴うことができる。
特定の側面によれば、本発明は、本発明の診断薬または本発明の診断法によりクレブシエラ・ニューモニエ、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエによる対象の感染を判定するためのコンパニオン診断薬を提供して、そのような感染症に対する療法薬による処置、たとえば本発明の抗体による処置などの免疫療法を用いる処置の基礎を提供する。
特定の側面によれば、本発明は、生菌の量が限られている場合にたとえば臨床検体からの遊離ＬＰＳを決定することにより、クレブシエラ・ニューモニエ、特にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエによる対象の感染を診断するための高感度ベッドサイド診断薬を提供する。そのようなアッセイの感度は具体的には１００ｎｇ未満、好ましくは１０ｎｇ未満のＬＰＳである。
本発明はさらに、本発明のいずれかの抗体をコードする、単離された核酸を提供する。
本発明はさらに、本発明の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミドを提供する。
本発明はさらに、本発明の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本発明の抗体を製造する方法であって、その抗体を産生する条件下で本発明の宿主細胞を培養または維持する方法を提供する。
特に好ましいものは、宿主細胞が
− 抗体軽鎖を発現するコード配列を内包する本発明のプラスミドまたは発現カセット；および
− 抗体重鎖を発現するコード配列を内包する本発明のプラスミドまたは発現カセット
を含む、宿主細胞およびそのような宿主細胞を用いる製造方法である。
さらなる側面によれば、本発明は、本発明の抗体を製造する方法であって、
ａ）非ヒト動物をクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩ抗原で免疫化し、そして抗体を産生するＢ細胞を分離し；
ｂ）分離したＢ細胞から不死化細胞系を形成し；
ｃ）それらの細胞系をスクリーニングして、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原および場合により（たとえば、ｇａｌ−Ｉと比較してｇａｌ−ＩＩＩに対する優先的結合を判定する場合には）ｇａｌ−Ｉ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞を同定し；そして
ｄ）モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を備えたヒト化抗体もしくはヒト型抗体、またはその誘導体を製造する
ことを含む方法を提供する。
本発明はさらに、
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体とガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法を提供する。
本発明はさらに、
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体とガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、ガラクタン−Ｉエピトープと対比した、抗体とガラクタン−ＩＩＩエピトープの特異的な陽性反応により、その抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法を提供する。
本発明はさらに、
ａ）本発明に従って同定した候補抗体を用意し；
ｂ）候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えた、モノクローナル抗体、またはヒト化もしくはヒト型の候補抗体、またはその誘導体を製造する
ことを含む、本発明の抗体を製造する方法を提供する。
図１．表１：８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、および２Ｄ８−Ａ１０と呼ばれる抗体のＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ命名法）；図１で用いる命名法は下記の意味をもつ：ＶＨ ＣＤＲ１＝ＣＤＲ１ＶＨ ＣＤＲ２＝ＣＤＲ２ＶＨ ＣＤＲ３＝ＣＤＲ３ＶＬ ＣＤＲ４＝ＣＤＲ４＝ＶＬ ＣＤＲ１ＶＬ ＣＤＲ５＝ＣＤＲ５＝ＶＬ ＣＤＲ２ＶＬ ＣＤＲ６＝ＣＤＲ６＝ＶＬ ＣＤＲ３ 図２．下記のもののＶＨおよびＶＬ配列： ・表１のＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を含むキメラ抗体（マウス可変ドメインをもつ）８Ｅ３−Ｅ５、９Ｈ９−Ｈ７、５Ａ４−Ａ７、および２Ｄ８−Ａ１０ ・ヒト化抗体Ｇ３−４３、Ｇ３−４６、Ｇ３−７７、Ｇ３−７８、Ｇ３−９７Ｇ３−４３ ＶＨ： （ＶＨ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−４３ ＶＬ： （ＶＬ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−４６ ＶＨ： （ＶＨ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−４６ ＶＬ： （ＶＬ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−７７ ＶＨ： （ＶＨ ９Ｈ９−Ｈ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−７７ ＶＬ： （ＶＬ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−７８ ＶＨ： （ＶＨ ９Ｈ９−Ｈ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−７８ ＶＬ： （ＶＬ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−９７ ＶＨ： （ＶＨ ２Ｄ８−Ａ１０のＣＤＲ配列を含む）Ｇ３−９７ ＶＬ： （ＶＬ ５Ａ４−Ａ７のＣＤＲ配列を含む）ＶＨのＦＲ配列： ＦＲ１（ＣＤＲ１に対してＮ末端に位置する）、ＦＲ２（ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間に位置する）、ＦＲ３（ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間に位置する）およびＦＲ４（ＣＤＲ３に対してＣ末端に位置する）ＶＬのＦＲ配列： ＦＲ１（ＣＤＲ４に対してＮ末端に位置する）、ＦＲ２（ＣＤＲ４とＣＤＲ５の間に位置する）、ＦＲ３（ＣＤＲ５とＣＤＲ６の間に位置する）およびＦＲ４（ＣＤＲ６に対してＣ末端に位置する） 同上。 図３．クレブシエラ・ニューモニエＯ１、Ｏ２ａｂおよびＯ２ａｃ Ｏ抗原側鎖の構造図および糖鎖組成。本発明に基づいて、すべての場合、ガラクタン−Ｉサブユニットをガラクタン−ＩＩＩサブユニットに置き換えることができる。 図４．配列決定されたクレブシエラ・ニューモニエ株のｒｆｂ（ｗｂ）オペロンの長さ（Ａ）、およびガラクタン−Ｉをコードする異なるｒｆｂ（ｗｂ）遺伝子座の遺伝子機構の比較図（Ｂ）。黒として表わした遺伝子はClarke et al. (3)により記載されたものを示す。中空矢印はｇｔｒ様遺伝子を表わし、それに対し２つのｒｆｂ（ｗｂ）バリアント間の灰色矢印は保存されていない仮定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を表わす。 同上。 図５．修飾ガラクタン−Ｉ（本明細書中でガラクタン−ＩＩＩと呼ぶ）反復単位の構造(5)。 図６．Ｏ１、Ｏ２およびＯ２ａｃのｒｆｂ（ｗｂ）オペロン中のｇｔｒ様遺伝子を検出するＰＣＲ反応の結果。約２ｋｂサイズのアンプリコンによりｇｔｒ様遺伝子の欠如が確認されるが、約５ｋｂのアンプリコンによりｗｂｂＯとｈｉｓＩの間のｇｔｒ様遺伝子の存在が示唆される。 図７．Ｄ−ガラクタンＩＩＩ分子を認識するｍＡｂ ９Ｈ９−Ｈ７を用いたイムノブロット。 図８．アイソジェン(isogenic)（同質遺伝子）菌株パネルから精製したＬＰＳを用いたイムノブロットにより、ｇｔｒ遺伝子の存在下でのｍＡｂの反応性が確認される。 図９．試験したヒト化ｍＡｂのＶＨおよびＶＬの組成。ヒト化ｍＡｂのＣＤＲ領域は指示したキメラ親に由来する。指示したＣＤＲ領域をヒトフレームワーク配列中へグラフトした。ヒト化ｍＡｂの結合特性が保持されていることを、フローサイトメトリーにより測定したｇａｌ−ＩＩＩ発現クレブシエラ・ニューモニエの表面染色により確認した（最終欄）。 図１０．ＧａｌＮ感作した菌血症マウスモデルにおいてキメラ（パネルＡ）またはヒト化（パネルＢ）ガラクタン−ＩＩＩ特異的ｍＡｂ（それぞれ１または２μｇ／マウスの投与量）により誘導された、後続のクレブシエラ・ニューモニエ生菌による致死的攻撃に対する防御。グラフはマウス５匹ずつのグループを用いた２つの別個の実験の結果を合わせたものを示す。 図１１．濃度１μｇ／ｍｌのヒト化ｇａｌ−ＩＩＩ特異的ｍＡｂのエンドトキシン中和力価。本文中の詳述を参照されたい。 図１２．選択したヒト化および親キメラｇａｌ−ＩＩＩ特異的ｍＡｂにより示されるエンドトキシン中和力価の用量測定。ベンチマークとしてポリミキシンＢによる中和を用いた。
本明細書中で用いる用語“抗体”は、抗体ドメイン（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインであると解釈される）を含むかまたはそれらからなり、リンカー配列を含むかまたは含まない、ポリペプチドまたはタンパク質を表わすものとする。ポリペプチドは、抗体ドメイン構造体の少なくとも２つのベータ鎖がループ配列により連結したものからなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインであると解釈される。抗体ドメインは天然構造のものであってもよく、あるいはたとえば抗原結合特性または他のいずれかの特性、たとえば安定性または機能特性、たとえばＦｃ受容体であるＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために、変異形成または誘導体化により修飾されていてもよい。
本明細書中で用いる抗体は、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープを結合する特異的結合部位をもち、具体的には下記のものがそれに含まれる：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨのＣＤＲ結合部位；あるいは可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含む抗体、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、または完全長抗体の結合部位。
本明細書中で用いる用語“抗体”は、特に、下記のものを含むかまたはそれらからなる抗体フォーマットを表わすものとする：単一の可変抗体ドメイン、たとえばＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ；あるいは可変および／または定常抗体ドメインの組合わせであって連結配列またはヒンジ領域を含むかまたは含まないもの：これには可変抗体ドメイン対、たとえばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対と定常抗体ドメインを含む抗体、たとえば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、または完全長抗体、たとえばＩｇＧタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体が含まれる。用語“完全長抗体”は、少なくとも天然抗体モノマーに一般的にみられるＦｃドメインおよび他のドメインの大部分を含むいずれかの抗体分子を表わすために使用できる。この句は本明細書中で特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられる。
用語“抗体”は、具体的には単離された形態の抗体を含むものとし、それらは他の抗体、すなわち異なるターゲット抗原に対する抗体または異なる構造アレンジメントの抗体ドメインを含む抗体を実質的に含まない。ただし、単離された抗体は、単離された抗体と、たとえば少なくとも１種類の他の抗体、たとえば異なる特異性をもつモノクローナル抗体または抗体フラグメントとの組合わせを含有する組合わせ製剤に含まれていてもよい。
用語“抗体”は、ヒト種を含む動物、たとえばヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、リャマ、ウシおよびウマを含む哺乳類、または鳥類、たとえばニワトリに由来する抗体に適用されるものとし、この用語は特に、動物由来の配列、たとえばヒトの配列をベースとする組換え抗体を含むものとする。
用語“抗体”はさらに、異なる種に由来する配列、たとえばネズミおよびヒトに由来する配列を含む、キメラ抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“キメラ”は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列それぞれの一部が特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に対して相同であり、これに対しその鎖の残りのセグメントは他の種またはクラスにおける対応する配列に対して相同である抗体を表わす。一般に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は哺乳類のある種に由来する抗体の可変領域を模倣し、これに対し定常部は他の種に由来する抗体の配列と相同である。たとえば、非ヒト宿主生物由来の容易に入手できるＢ細胞またはハイブリドーマを用いて現在既知の供給源から可変領域を誘導し、たとえばヒト細胞製剤に由来する定常領域と組み合わせることができる。
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用できる。
抗体に関して用いる用語“ヒト化”は、実質的に非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位をもち、その分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列をベースとする分子を表わす。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが可変ドメイン中の適宜なフレームワーク領域にグラフトしたもののいずれを含むこともできる。抗原結合部位は、野生型、またはたとえば１以上のアミノ酸置換により修飾されたもの、好ましくはヒト免疫グロブリンにいっそう近似するように修飾されたものであってもよい。ある形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保存している（たとえば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は元の抗体に対して変異した１以上のＣＤＲをもつ。
用語“抗体”はさらに、ヒト抗体に適用される。
抗体に関して用いる用語“ヒト”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域をもつ抗体を含むと解釈される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異形成により、またはインビボでの体細胞変異により、導入された変異）を、たとえばＣＤＲ中に含むことができる。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体が含まれる。
用語“抗体”は、具体的にはいかなるクラスまたはサブクラスの抗体にも適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を主要クラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに配属することができ、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類できる。
この用語はさらに、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、具体的には組換え抗体に適用され、この用語には、組換え手段により製造、発現、作製または単離されたすべての抗体および抗体構造体、たとえば動物、たとえばヒトを含めた哺乳類に由来する抗体であって、異なる由来の遺伝子または配列を含むもの、たとえばネズミ、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来の抗体が含まれる。さらなる例は、その抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う他のいずれかの手段により製造、発現、作製または単離された抗体を表わす。
用語“抗体”は抗体の誘導体、特に機能活性誘導体をも表わすと解釈される。抗体誘導体は、１以上の抗体ドメインもしくは抗体のいずれかの組合わせ、および／または融合タンパク質、すなわち抗体のいずれかのドメインを１以上の他のタンパク質、たとえば他の抗体のいずれかの位置に融合させたもの、たとえばＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、ただしリガンド、足場タンパク質、酵素、トキシンなどをも含む結合構造体であると解釈される。抗体の誘導体は、種々の化学的手法、たとえば共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などにより他の物質に会合または結合させることによって得ることができる。抗体に結合した他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機もしくは無機の分子、またはそのいずれかの組合わせ（たとえば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であってもよい。特定の態様において、抗体は生物学的に許容できる化合物との特異的な相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。ターゲットへの抗体の結合に対するタグの負の影響が無いかまたは耐容できる限り、本発明に使用できるタグに関する特別な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグが含まれる。他の特定の態様において、抗体は標識を含む誘導体である。本明細書中で用いる用語“標識”は、“標識した”抗体を作製するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートさせた検出可能な化合物または組成物を表わす。標識はそれ自体が検出可能であってもよく（たとえば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合は基質である化合物または組成物の化学変化を触媒し、それが検出可能であってもよい。
本明細書に記載する好ましい誘導体は抗原結合に関して機能活性であり、好ましくは、たとえばＳＢＡ、ＯＰＫまたはＬＡＬアッセイで判定してクレブシエラ・ニューモニエと戦う効力、あるいは細菌攻撃に対して防御し、またはエンドトキセミアを中和する効力をもつ。
具体的には、本発明の抗体から誘導した抗体は、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原への差示結合、たとえばｇａｌ−ＩＩＩ抗原の特異的または選択的な結合において機能活性である、少なくとも１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域またはそのＣＤＲバリアントを含むことができる。
親抗体または親抗体配列、たとえば親ＣＤＲまたは親ＦＲから誘導された抗体は、本明細書において特に、たとえばインシリコ(in silico)または組換え工学あるいは化学的な誘導体化または合成により得られた変異体またはバリアントであると解釈される。
用語“抗体”は抗体のバリアントをも表わすと解釈され、それには親ＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体、および親抗体の機能活性バリアント抗体が含まれる。
具体的には、本発明の抗体から誘導される抗体は少なくとも１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域またはそのＣＤＲバリアント、たとえば重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲもしくはＦＲ領域のうち少なくとも１つまたはＨＣもしくはＬＣの定常領域に少なくとも１つの点変異をもち、機能活性であり、たとえばｇａｌ−ＩＩＩ抗原を特異的に結合することができる。
用語“バリアント”は特に、たとえば定常ドメインにおいて抗体の安定性、エフェクター機能もしくは半減期を工学操作するために、または可変ドメインにおいてたとえば当技術分野で利用できる親和性成熟法により抗原結合特性を改善するために、たとえば変異形成法、特に特定の抗体におけるアミノ酸配列もしくは領域の欠失、交換、挿入配列導入、またはアミノ酸配列の化学的誘導体化により得られた、変異抗体または抗体フラグメントなどの抗体を表わすものとする。既知のいずれかの変異形成法を使用でき、それには希望する位置においてたとえばランダム化法により得られる点変異が含まれる。ある場合には、位置はランダムに、たとえば抗体配列をランダム化するために可能なアミノ酸または選択した好ましいアミノ酸のいずれかについて選択される。用語“変異形成”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するために当技術分野で認識されているいずれかの手法を表わす。好ましいタイプの変異形成には、エラープローンＰＣＲ(error prone PCR)変異形成、飽和変異形成(saturation mutagenesis)、または他の部位特異的変異形成が含まれる。
用語“バリアント”は、具体的には機能活性バリアントを包含するものとする。
本明細書中で用いる、ＣＤＲ配列の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性ＣＤＲバリアント”であると解釈され、本明細書中で用いる、抗体の“機能活性バリアント”という用語は、“機能活性抗体バリアント”であると解釈される。機能活性バリアントは、この配列（親抗体または親配列）を１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により修飾することから得られる配列、あるいはアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドを、すなわち配列の一端または両端の、たとえばＣＤＲ配列においてＮ末端および／またはＣ末端の１、２、３または４個のアミノ酸、および／または中心の１、２、３または４個のアミノ酸（すなわち、ＣＤＲ配列の中央）を化学的に誘導体化することから得られる配列であって、その修飾がこの配列の活性に影響しないもの、特に損なわないものを意味する。選択したターゲット抗原に対する特異性をもつ結合部位の場合、これが変化する可能性、たとえば特定のエピトープに対する微細な特異性、親和性（アフィニティー）、アビディティー、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度などが変化する可能性はあるけれども、抗体の機能活性バリアントはなお前決定した結合特異性をもつであろう。たとえば、具体的には親和性成熟抗体は機能活性バリアント抗体であると解釈される。したがって、親和性成熟抗体における修飾されたＣＤＲ配列は機能活性ＣＤＲバリアントであると解釈される。
具体的には、本発明の抗体の機能活性バリアントはクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩ抗原を結合する効力および他の抗原と対比してｇａｌ−ＩＩＩ抗原に優先的に結合する特異性または選択性をもち、たとえばクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩに結合し、ｇａｌ−Ｉ抗原には結合しないか、またはｇａｌ−Ｉ抗原を有意には結合せず、および／またはクレブシエラ・ニューモニエの他の抗原には結合しない。
機能活性バリアントは、たとえば親抗体の配列を変化させることにより得ることができる；たとえば、表１および図２に挙げるいずれかの抗体におけると同じ結合部位を含むけれども結合部位以外の領域に修飾を伴う抗体、またはそのような親抗体から結合部位内ではあるけれども抗原結合性を損なわない修飾により誘導される抗体であって、好ましくは親抗体と実質的に同じ生物活性または改善すらされた活性を備えた抗体；それには、クレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩ抗原を特異的または選択的に結合する能力、たとえばクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩに結合し、ｇａｌ−Ｉ抗原には結合しないか、またはｇａｌ−Ｉ抗原を有意には結合せず、および／またはクレブシエラ・ニューモニエの他の抗原には結合しない能力が含まれる。場合により、機能活性バリアントはさらにＳＢＡアッセイにおける中和効力および／または補体仲介殺菌効力を含み、および／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおける抗体仲介食作用の効力を含み、および／または場合によりさらにＬＡＬアッセイにおけるエンドトキシン中和機能を含み、たとえばターゲットである（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエに対する特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。
本明細書中で用いる用語“実質的に同じ生物活性”は、匹敵する抗体または親抗体について判定した活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、たとえば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、またはたとえば２００％に及ぶ活性である実質的に同じ活性、またはよりいっそう高い活性により示される活性を表わす。
本明細書に記載する好ましいバリアントまたは誘導体は抗原結合に関して機能活性であり、好ましくはクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩ抗原を特異的に結合する効力をもち、他の抗原には結合せず、たとえばクレブシエラ・ニューモニエのｇａｌ−ＩＩＩに結合し、ｇａｌ−Ｉ抗原には結合しないかまたはｇａｌ−Ｉ抗原を有意には結合せず、あるいはｇａｌ−Ｉと対比してｇａｌ−ＩＩＩ抗原を優先的に結合し、あるいはｇａｌ−Ｉ株に対して形成された現在のポリクローナルタイピング血清と比較してｇａｌ−ＩＩＩをより高い親和性で結合する。好ましいバリアントは少なくとも２ ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ ｌｏｇのＫｄ値の差でクレブシエラ・ニューモニエの他の抗原には結合せず、場合によりさらにＳＢＡアッセイにおいてたとえばその抗体を含まない対照試料と対比して有意の細菌数低減を達成する補体仲介殺菌効力を含み、および／または場合によりさらにＯＰＫアッセイにおいてたとえばその抗体を含まない対照試料と対比して有意の細菌数低減を達成する抗体仲介食作用の効力を含み、および／または場合によりさらにＬＡＬまたはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおいてたとえばその抗体を含まない対照試料と対比して有意のエンドトキシン活性低減を達成するエンドトキシン中和機能を含み、たとえばターゲットであるクレブシエラ・ニューモニエに対する特異的結合アッセイまたは機能試験により判定して実質的に同じ生物活性を備えている。種々のアッセイにおける有意の活性低減は、一般に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％、最大で約１００％（±１％）の完全低減に及ぶ低減を意味する。
好ましい態様において、親抗体の機能活性バリアントは
ａ）親抗体の生物活性フラグメントであり、そのフラグメントは親分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは９７％、９８％または９９％を含む；
ｂ）親抗体から少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失により誘導され、その機能活性バリアントは親分子またはそれの一部に対して配列同一性をもつ；たとえば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性をもつ抗体；および／または
ｃ）親抗体またはその機能活性バリアント、およびさらにそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対してヘテロロガス（非相同）である少なくとも１個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
本発明の好ましい一態様において、本発明による抗体の機能活性バリアントは本質的に前記のバリアントと同一であるが、それが異なる種の相同配列に由来するという点において、それぞれそれのポリペプチドまたはヌクレオチド配列と異なる。これらは天然のバリアントまたはアナログと呼ばれる。
用語“機能活性バリアント”には、天然の対立遺伝子バリアント、および変異体または他のいずれかの非天然バリアントも含まれる。当技術分野で知られているように、対立遺伝子バリアントは（ポリ）ペプチドの別形態であって、そのポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加をもつことを特徴とする。
機能活性バリアントは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列変更により、たとえば１以上の点変異により得ることができ、その際、本発明の組合わせに用いた場合にその配列変更は変化していないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持または改善する。そのような配列変更には（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含めることができるが、これらに限定されない。
特定の機能活性バリアントはＣＤＲバリアントである。ＣＤＲバリアントは、ＣＤＲ領域に少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列を含み、その際、その修飾はアミノ酸配列の化学変化または部分的変更であってもよく、その修飾によりバリアントは非修飾配列の生物学的特性を保持したままである。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の欠失もしくは置換によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の付加もしくは挿入によるもの、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の化学的誘導体化によるもの、あるいはその組合わせであってもよい。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、たとえば１個の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換するものであってもよい。
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連性があるアミノ酸のファミリー内で行なわれるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型側鎖、大型側鎖などを備えたアミノ酸である。
点変異は、特にポリヌクレオチドの工学操作であって、１以上の単一（不連続）または二重のアミノ酸が異なるアミノ酸に置換もしくは交換され、欠失し、または挿入されている点において、工学操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすものであると解釈される。
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表わす。これに関してアミノ酸は６４のトリプレットコドンによりコードされる２０種類の天然アミノ酸を表わす。これら２０種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷をもつものに分類できる：
“中性”アミノ酸をそれらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ，Ａ） 非極性，中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ，Ｎ） 極性，中性；
システイン：（Ｃｙｓ，Ｃ） 非極性，中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ，Ｑ） 極性，中性；
グリシン：（Ｇｌｙ，Ｇ） 非極性，中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ，Ｉ） 非極性，中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ，Ｌ） 非極性，中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ，Ｍ） 非極性，中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ，Ｆ） 非極性，中性；
プロリン：（Ｐｒｏ，Ｐ） 非極性，中性；
セリン：（Ｓｅｒ，Ｓ） 極性，中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ，Ｔ） 極性，中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ，Ｗ） 非極性，中性；
チロシン：（Ｔｙｒ，Ｙ） 極性，中性；
バリン：（Ｖａｌ，Ｖ） 非極性，中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ，Ｈ） 極性，正（１０％） 中性（９０％）
“正”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アルギニン：（Ａｒｇ，Ｒ） 極性，正；および
リジン：（Ｌｙｓ，Ｋ） 極性，正
“負”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ，Ｄ） 極性，負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ，Ｅ） 極性，負。
本明細書に記載する抗体配列およびホモログに関する“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、最大の配列同一性パーセントが達成されるように配列をアラインさせ、必要であればギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
抗体バリアントは、具体的には、たとえば糖鎖工学により製造された特定のグリコシル化パターンをもつホモログ、アナログ、フラグメント、修飾体またはバリアントであって、機能性であり、機能同等物として作用でき、たとえば特定のターゲットに結合し、機能特性を備えたものを含むと解釈される。
本発明の抗体はＦｃエフェクター機能を示してもよく、示さなくてもよい。作用様式はＦｃエフェクター機能をもたない中和抗体によって主に仲介されるが、Ｆｃは補体をリクルートし、免疫複合体の形成により循環からターゲット抗原、たとえばトキシンを排除するのを補助する。
特定の抗体は活性Ｆｃ部分を含まなくてもよく、よって抗体のＦｃ部分を含まないかまたはＦｃガンマ受容体結合部位を含まない抗体ドメインから構成され、あるいはＦｃエフェクター機能を低減する修飾、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を無効にするかまたは低減する修飾によりＦｃエフェクター機能を欠如した抗体ドメインを含む。別の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増大させる修飾、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増強する修飾を取り込むように工学操作されていてもよい。
そのような修飾は、Ｆｃエフェクター機能の低減または増大が達成されるように、変異形成，たとえばＦｃガンマ受容体結合部位における変異により、または抗体フォーマットのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を妨げる誘導体もしくは作用剤により行なうことができる。
Ｆｃエフェクター機能の有意の低減は、一般にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定して非修飾（野生型）フォーマットの１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を表わすと解釈される。Ｆｃエフェクター機能の有意の増大は、一般にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性により測定して非修飾（野生型）フォーマットの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＦｃエフェクター機能増大を表わすと解釈される。
抗体配列に関して“糖鎖工学操作された”バリアントという用語は、糖鎖工学操作の結果として改変された免疫原または免疫調節（たとえば、抗炎症）特性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣをもつ、グリコシル化バリアントを表わすものとする。すべての抗体が重鎖定常領域の保存された位置に炭水化物構造を含み、各アイソタイプは異なるアレイのＮ連結炭水化物構造をもち、それらがタンパク質のアセンブリー、分泌または機能活性に多様に影響を及ぼす。ＩｇＧ１タイプの抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ連結グリコシル化部位をもつ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複雑な二アンテナ型(bi-antennary)オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋め込まれて、ポリペプチドバックボーンと広範な接点を形成し、それらの存在は抗体がエフェクター機能、たとえば抗体依存性細胞傷害(antibody dependent cellular cytotoxicity)（ＡＤＣＣ）を仲介するために必須である。たとえば、Ｎ２９７をたとえばＡに変異させることによりＮ２９７のＮ−グリカンを除去するか、またはＴ２９９は、一般に、ＡＤＣＣが低減した脱グリコシル(aglycosylated)抗体フォーマットを生じる。具体的には、本発明の抗体はグリコシル化もしくは糖鎖工学操作された抗体または脱グリコシル抗体であってもよい。
抗体グリコシル化において細胞系間で大きな相異が生じ、異なる培養条件下で増殖させた特定の細胞系には微小な相異すらみられる。細菌細胞における発現は一般に脱グリコシル抗体を生成する。テトラサイクリン調節によるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、すなわちバイセクティングＧＩｃＮＡｃ(bisecting GIcNAc)の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼの発現を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性をもつと報告された(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180)。宿主細胞の選択のほかに、抗体の組換え産生に際してグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。
用語“抗原結合部位”または“結合部位”は、抗体の抗原結合に関与する部分を表わす。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖および／または軽（“Ｌ”）鎖のＮ末端可変（“Ｖ”）領域、すなわちその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の“超可変領域”と呼ばれる３つの高度に多様性である範囲が、より保存されたフレームワーク領域として知られるフランキング範囲間に挟まれている。抗原結合部位は結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に対して相補的な表面を備えており、超可変領域は“相補性決定領域”、すなわち“ＣＤＲ”と呼ばれる。ＣＤＲに内包されている結合部位を本明細書中では“ＣＤＲ結合部位”とも呼ぶ。
本明細書中で“ターゲット”または“ターゲット抗原”と互換性をもって用いる用語“抗原”は、ターゲット分子全体、またはそのような分子の、抗体の結合部位により認識されるフラグメントを表わすものとする。具体的には、一般に“エピトープ”、たとえばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる、抗原の免疫関連性である下部構造、たとえばポリペプチドまたは炭水化物構造を、そのような結合部位が認識できる。ｇａｌ−ＩＩＩまたはｇａｌ−Ｉ抗原のような特定の抗原は炭水化物構造体であり、場合により人工的キャリヤー上に付与した単離された抗原として、あるいはそれらの抗原を発現するクレブシエラ・ニューモニエ細胞の形態またはその細胞画分の形態で提供できる。
本明細書中で用いる用語“エピトープ”は、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成するかまたは特異的結合パートナーの一部であってもよい分子構造体を表わすものとする。エピトープは炭水化物、ペプチド構造体、脂肪酸、有機物、生化学物質もしくは無機物またはその誘導体、およびそのいずれかの組合わせから構成される可能性がある。エピトープがペプチド構造体、たとえばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に含まれる場合、それは通常は少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、より好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含むであろう。エピトープは線状または立体構造のいずれかのエピトープの可能性がある。線状エピトープはポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは連続的でもオーバーラップしていてもよい。
立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて三次構造を形成することによって寄せ集められたアミノ酸または炭水化物から構成され、それらのアミノ酸は線状配列中で必ずしも互いに隣接してはいない。具体的には、ポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中では離れていたけれどもポリペプチドが折り畳まれて天然タンパク質／抗原になった際にその分子の表面で調和のとれた構造に組み立てられる２個以上の不連続なアミノ酸残基の存在を特徴とする。
本明細書中で用語“エピトープ”は、特に、抗体により認識される単一エピトープ、または少なくとも２つの異なる抗原により共有され、場合により交差反応性抗体により認識される交差反応性エピトープを表わすものとする。
用語“発現”は、下記のように解釈される。目的とする発現生成物（たとえば本明細書に記載する抗体）のコード配列および作動可能な状態で連結した制御配列（たとえばプロモーター）を含む核酸分子を、発現の目的に使用できる。これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。形質転換を行なうために、発現系をベクターに含有させることができる；しかし、関連ＤＮＡを宿主染色体に組み込むこともできる。具体的には、この用語は、そのベクターにより運ばれて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡがコードするタンパク質の発現に適した条件下にある宿主細胞および適合するベクターを表わす。
コーディングＤＮＡは、特定のポリペプチドまたはタンパク質、たとえば抗体に対するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、調節、または他の形で仲介または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとコーディングＤＮＡは同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来するものであってよく、同じ生物または異なる生物に由来するものであってよい。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１以上の複製系、宿主における選択のための１以上のマーカー、たとえば抗生物質耐性、および１以上の発現カセットを含むであろう。
本明細書中で用いる“ベクター”は、適切な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子を転写し、それらのｍＲＮＡを翻訳するのに必要な、ＤＮＡ配列と定義される。
“発現カセット”は、発現生成物をコードするＤＮＡコーディング配列またはＤＮＡのセグメントであって、既定の制限部位においてベクターに挿入できるものを表わす。カセットの制限部位は、カセットを適正なリーディングフレームに確実に挿入するようにデザインされる。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位に挿入され、次いでベクターによって、伝達可能なベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞内へ運ばれる。ＤＮＡが挿入または付加された、ＤＮＡのセグメントまたは配列、たとえば発現ベクターを、“ＤＮＡ構築体”と呼ぶこともできる。
発現ベクターは発現カセットを含み、さらに通常は宿主またはゲノム組込み部位における自己複製のための起点、１以上の選択マーカー（たとえば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素開裂部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は作動可能な状態で互いに連結している。本明細書中で用いる用語“ベクター”は、自己複製ヌクレオチド配列およびゲノム組込みヌクレオチド配列を含む。一般的なタイプのベクターは“プラスミド”であり、それは一般に追加（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子(self-contained molecule)であり、かつ適切な宿主細胞に容易に導入できる。プラスミドベクターは、しばしばコーディングＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、かつ外来ＤＮＡの挿入に適した１以上の制限部位をもつ。具体的には、用語“ベクター”または“プラスミド”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、それによりその宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを表わす。
本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、特定の組換えタンパク質、たとえば本明細書に記載する抗体を産生するために形質転換された初代対象細胞およびそのいずれかの子孫を表わすものとする。必ずしもすべての子孫が厳密に親細胞と同一であるとは限らない（環境における故意のまたは意図しない変異または相異のため）が、そのような変異した子孫は最初に形質転換された細胞のものと同じ機能性をその子孫が保持している限りこれらの用語に含まれると解釈すべきである。用語“宿主細胞系”は、組換え遺伝子を発現させて、組換えポリペプチド、たとえば組換え抗体を産生させるために用いる宿主細胞の細胞系を表わす。本明細書中で用いる用語“細胞系”は、特定の細胞タイプの樹立したクローンであって、長期間にわたって増殖する能力を獲得したものを表わす。そのような宿主細胞または宿主細胞系を細胞培養において維持および／または培養して、組換えポリペプチドを産生させることができる。
本明細書中で核酸、抗体または他の化合物に関して用いる用語“単離された”または“単離”は、自然状態でそれに付随していたであろう環境から十分に隔離され、それによって“実質的に純粋な”形態で存在する化合物を表わすものとする。“単離された”は、必ずしも他の化合物または物質との人為的もしくは合成による混合物の排除、または基本的活性を妨害しない、たとえば精製不完全のため存在する可能性のある不純物の存在の排除を意味するわけではない。特に、本発明の単離された核酸分子は、自然界に存在しないもの、たとえばコドン最適化した核酸もしくはｃＤＮＡ、または化学合成したものをも含むものとする。
同様に、本発明の単離された抗体は、具体的には、自然界に存在しないもの、たとえば他の抗体または活性物質との組合わせ製剤で提供されるもの（その組合わせは自然界に存在しない）、または天然抗体の最適化もしくは親和性成熟バリアント、または抗体の加工適性を改善するために工学操作されたフレームワーク領域を備えた抗体である。そのような最適化または工学操作により、抗体はその抗体に関して自然界ではみられない１以上の合成配列または特徴を含む。
本発明の核酸に関して、用語“単離された核酸”を時に用いる。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、それが由来する生物の天然ゲノム中でそれが隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を表わす。たとえば、“単離された核酸”は、ベクター、たとえばプラスミドベクターもしくはウイルスベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用された場合、用語“単離された核酸”は主に、前記に定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を表わす。あるいは、この用語は、それの自然状態で（すなわち、細胞または組織において）それに付随していたであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を表わすことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段で直接製造され、それの製造中に存在する他の成分から分離された分子を表わすことができる。
ポリペプチドまたはタンパク質、たとえば単離された本発明の抗体またはエピトープに関して、用語“単離された”は、具体的には自然状態でそれらに付随する物質、たとえばそれらの自然環境で、または製造がインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ法による場合にはそれらが製造される環境（たとえば、細胞培養）で、それらと共にみられる他の化合物を含まないかまたは実質的に含まない化合物を表わすものとする。単離された化合物に希釈剤または佐剤を配合してもなお実用上の目的では単離されているという可能性がある−たとえば、診断または療法に用いる際にそれらのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と混合することができる。特に、本発明の単離された抗体は単離された純粋な形態で提供され、好ましくは単離された抗体を唯一の活性物質として含む製剤で提供されるので、クレブシエラ・ニューモニエ株に対して形成されたポリクローナル血清製剤とは異なる。ただし、これは単離された抗体を限られた数のさらなる十分に規定された（単離された）抗体を含む組合わせ製剤で提供することを排除しない。単離された抗体を固体、半液体または液体キャリヤー、たとえばビーズ上において提供することもできる。
用語“中和する”または“中和”は、最も広い意味で用いられ、中和が達成されるメカニズムには関係なく、病原体、たとえばクレブシエラ・ニューモニエが対象に感染するのを阻害するいずれかの分子、または病原体がエンドトキシン産生により感染を促進するのを阻害すること、またはエンドトキシンがそれらの生物活性を発揮するのを阻害することを表わす。中和は、たとえば宿主において粘膜表面におけるクレブシエラ・ニューモニエの定着、無菌状態の身体部位への侵入、および有害な生物学的シグナルの誘発（最悪の場合には敗血症性ショックの誘導）を阻害する抗体により達成できる。
厳密な意味で、中和は、特定のＬＰＳがそれのコグネイト受容体(cognate receptor)（たとえば、Ｔｏｌｌ様受容体−４複合体）に結合してそれにより生物活性を誘発するのを阻害することを意味する。この中和力価は一般に標準アッセイ、たとえばインビトロまたはインビボ中和アッセイ、たとえばＬＡＬ試験、またはＴＬＲ−４ベースのアッセイで決定され、その際、エンドトキシンの生物活性の阻害はたとえば比色法により測定される。
クレブシエラ・ニューモニエを攻撃または中和する抗体は、病原体および病原性反応を妨害し、よって感染を制限もしくは阻止し、および／またはそのような感染から生じる病状を改善し、あるいはクレブシエラ・ニューモニエの病理発生、特に宿主の無菌身体コンパートメント／部位内への播種およびその内部での複製を阻害することができる。これに関して、中和抗体は“防御抗体”であるとも解釈され、これはその抗体が感染物質に対する能動または受動免疫にみられる免疫に関与することを意味する。特に、本明細書に記載する中和または防御抗体は、病原体により誘発される疾患の症状、副作用または進行を阻止し、改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止する療法目的のために、たとえば予防または治療のために使用できる。具体的には、防御抗体は、療法適用に伴って、たとえば血清殺細菌活性またはオプソニン食作用活性を誘導することによりクレブシエラ・ニューモニエ生細胞を死滅させ、またはその複製を妨害し、あるいは細菌細胞全体またはそのＬＰＳ分子を無菌身体部位から排除する（すなわち、樹立した感染症に投与した場合）ことができる。あるいは、予防的に適用された防御抗体は、上記または他のメカニズムのひとつにより、感染の樹立（すなわち、非無菌部位から無菌の身体コンパートメント内へのクレブシエラ・ニューモニエの拡散）を阻害する。
本明細書中で用いる用語“生体試料”は、対象、たとえばヒトから得られるいずれかの材料であって、クレブシエラ・ニューモニエを含有する生体材料を含有するかまたは含有する可能性がある材料を表わすものとする。生体試料は、組織、体液または細胞培養試料であってもよい。本発明に従って使用するための試料の例には、患者試料、たとえば組織または体液、具体的には呼吸器検体、たとえば気管内吸引物、胸膜液、肺穿刺液、鼻スワブもしくは喀痰、血液試料、糞便試料、皮膚および尿試料または脳脊髄液が含まれるが、これらに限定されない。
生体試料は一般に、複雑な生体マトリックス、たとえば多数タイプの生体有機小分子を含有する複雑な粘稠な体液、たとえばタンパク性物質に富む粘稠な浸出液を含む。適切な添加剤または抽出法を用いて、試料マトリックスの粘稠成分または固体成分を可溶化および／または破壊することにより試料中のマトリックスに付随する可能性がある非特異的的結合を低減し、および／またはマトリックス粘度を低下させることもできる。マーカーを生物から遊離させ、および／または生体マトリックスを破壊および／または液化する試料調製法を採用できる。分析できる生体マトリックスには、粘液含有試料、たとえば鼻分泌物、喀痰、粘液質、咽頭浸出液、尿道または膣分泌物、およびそのような膜表面の洗浄液が含まれる。
適切な試料調製法には、生体マトリックスがアッセイに及ぼす影響を低減する工程が含まれる。そのような工程は、たとえば捕獲、クロマトグラフィー、スピン遠心および透析を含むことができるが、これらに限定されない。
対象から得た材料は、細菌分離体の形態、たとえば分離したクレブシエラ・ニューモニエを培養するための細胞培養物または細胞培養産物の形態であってもよい。クレブシエラ・ニューモニエ集団のみを富化するために培地は選択的であってもよく、あるいは非選択的であってもよい。
細菌分離株調製は、一般に、クレブシエラ・ニューモニエの増殖を増強する条件に試料を維持してそれにより試料中のクレブシエラ・ニューモニエ集団を富化するインキュベーション工程を伴う。
分離株が得られると、たとえばＯタイプおよびｇａｌ−ＩＩＩの発現レベルを決定するために、細菌をさらに生化学的および／または血清学的試験により調べることができる。クレブシエラ・ニューモニエ株を調べるための幾つかのタイピング法がある。これらの方法には一般に、血清型判別、多遺伝子座配列タイピング(multi-locus sequence typing)（ＭＬＳＴ）を含む標準的な遺伝関係／系統発生についてのタイピング、またはパルスフィールドゲル電気泳動(Pulsed Field Gel Electrophoresis)（ＰＦＧＥ）が含まれる。
本明細書中で用いる用語“ガラクタン−ＩＩＩ”（“ｇａｌ−ＩＩＩ”とも呼ばれる）は、ガラクトースポリマーおよび少なくとも１つの式（Ｉ）の反復単位を含む構造を含む、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ Ｏ抗原の炭水化物構造体を表わすものとする。そのような反復単位は分枝ガラクトースポリマーを含む；図５を参照。この構造はｇａｌ−Ｉ抗原のものと類似するが、明らかに異なるものである。Ｇａｌ−ＩＩＩは、本明細書中でｇａｌ−Ｉ抗原の存在およびｇａｌ−ＩＩＩ構造体の非存在を特徴とするＯ２ａ血清型と類似するけれども明らかに異なる新規な血清型決定因子であると解釈される。
ｇａｌ−ＩＩＩを含むそれぞれのＯ抗原を本明細書中で“ｇａｌ−ＩＩＩ抗原”と呼び、それは本発明のｇａｌ−ＩＩＩ特異的抗体により認識される“ｇａｌ−ＩＩＩエピトープ”を含む。ｇａｌ−ＩＩＩ抗原はｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳの外側部分であり、それは１以上の特異的ｇａｌ−ＩＩＩエピトープが内包された炭水化物構造を含む表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体であると解釈される。
ｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエの遺伝子型は、具体的にはｇｔｒ遺伝子が補足されたｒｆｂｇａｌ−Ｉ遺伝子座（図４Ｂ）、すなわちｇａｌ−Ｉタイプの線状のものと異なる分枝トリ−ガラクトース反復単位の発現に関与する追加ｇｔｒ遺伝子により伸長したｒｆｂ遺伝子座を特徴とする。
少なくとも１つのｇａｌ−ＩＩＩ構造を含むＬＰＳ Ｏ抗原を特徴とするクレブシエラ・ニューモニエをいずれも本明細書中でｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエと呼ぶ。ｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳは、ｇａｌ−ＩＩＩ構造のみ、またはｇａｌ−ＩＩＩとｇａｌ−Ｉの両方の構造を含む可能性がある。
本明細書中で用いる用語“ガラクタン−Ｉ”（“ｇａｌ−Ｉ”とも呼ばれる）は、ガラクトースポリマー、および少なくとも１つの式（ＩＩ）の反復単位を含むけれども式（Ｉ）の反復単位を含まない構造を含む、クレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ Ｏ抗原の炭水化物構造体を表わすものとする。そのような反復単位は線状ガラクトースポリマーを含む。Ｇａｌ−Ｉはｇａｌ−ＩＩＩ抗原を何ら含まないＯ２ａ血清型に特徴的である。
ｇａｌ−Ｉを含むそれぞれのＯ抗原を本明細書中で“ｇａｌ−Ｉ抗原”と呼び、それは本発明のｇａｌ−Ｉ特異的抗体により認識される“ｇａｌ−Ｉエピトープ”を含む。ｇａｌ−Ｉ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエの遺伝子型は、具体的にはｇｔｒ遺伝子を含まないｒｆｂｇａｌ−Ｉ遺伝子座を特徴とし、それはｇａｌ−ＩＩＩタイプの分枝したものとは異なる線状トリ−ガラクトース反復単位の発現に関与する。
ｇａｌ−Ｉ抗原はｇａｌ−Ｉ Ｏタイプのクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳの外側部分であり、それは１以上の特異的ｇａｌ−Ｉエピトープが内包された、ｇａｌ−ＩＩＩ構造を何ら含まない炭水化物構造を含む表面アクセス可能な抗原性炭水化物構造体であると解釈される。
本明細書中で用いる“特異的な”結合、認識またはターゲティングは、結合剤、たとえば抗体またはその抗原結合部位が、ヘテロロガスな分子集団中のターゲット抗原またはそれぞれのエピトープに対して明らかな親和性を示すことを意味する。よって、指定した条件下で（たとえば、イムノアッセイ）、結合剤はターゲットｇａｌ−ＩＩＩ抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子に有意量では結合しない。特異的結合は、選択したターゲット同一性、高、中または低親和性（アフィニティー）またはアビディティーに関して、結合が選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は結合定数または結合動態が少なくとも１０倍の差（少なくとも１ ｌｏｇの差と解釈される）であれば達成され、好ましくはその差は他のターゲットと比較して少なくとも１００倍（少なくとも２ ｌｏｇの差と解釈される）、より好ましくは少なくとも１０００倍（少なくとも３ ｌｏｇの差と解釈される）である。
用語“特異性”は、１以上の分子に結合する結合剤、たとえば交差特異的結合剤に適用されるとも解釈される。少なくとも２つの異なるターゲットまたはそのようなターゲットのエピトープもしくはヌクレオチド配列をターゲティングするか、あるいは少なくとも２つの異なるターゲット上の交差反応性エピトープまたはヌクレオチド配列をターゲティングする好ましい交差特異的（多特異的または交差反応性とも呼ばれる）結合剤は、実質的に類似の結合親和性で、たとえば１００倍未満の差もしくは１０倍未満の差ですら、または実質的に異なる結合親和性で、たとえば少なくとも１０倍もしくは少なくとも１００倍の差で、それらのターゲットを特異的に結合する。第１（たとえば、ｇａｌ−ＩＩＩ）および第２（たとえば、ｇａｌ−Ｉ）ターゲットの両方を認識し、第１ターゲットを第２ターゲットより優先的に結合する交差特異的結合剤は、一般に第２ターゲットと対比して第１ターゲットに対して等しい親和性またはより高い親和性を特徴とする；具体的には、その際、第２抗原と対比して第１抗原を優先的に結合する差示結合親和性は、具体的には少なくとも同等または同等より大きく、たとえば少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。そのような差示結合はイムノアッセイ、好ましくはイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法により判定できる。
本発明の好ましい抗体は、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原（ｇａｌ−ＩＩＩのみ、またはｇａｌ−Ｉ抗原と対比してｇａｌ−ＩＩＩを優先的に結合する）を、高い結合親和性（アフィニティー）、特に高いオン速度および／または低いオフ速度で、あるいは高い結合アビディティーで結合する。抗体の結合親和性は、通常は抗原結合部位の半分が占有される抗体濃度により特徴づけられ、これは解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として知られる。通常は、結合剤はＫｄ＜１０−７Ｍで、ある場合には、たとえば療法目的には、より高い親和性、たとえばＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍ、よりいっそう好ましくはＫｄ＜１０−１０Ｍで、高親和性結合剤とみなされる。
さらに、特に好ましい態様において、個々の抗原結合親和性は中等度親和性のもの、たとえば少なくとも２つの抗原に結合する場合はたとえば１０−６Ｍ未満、最大１０−８ＭのＫｄをもつものである。
中等度親和性の結合剤を、必要であれば好ましくは親和性成熟法と組み合わせた本発明に従って提供することができる。
親和性成熟は、ターゲット抗原に対する親和性が増大した抗体を製造する方法である。当技術分野で利用できる親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するいずれか１以上の方法を、本明細書に開示する発明の種々の態様に従って親和性成熟抗体を作製するために採用できる。代表的なそのような親和性成熟の方法および使用、たとえばランダム変異形成、細菌ミューテーター(mutator)株の継代、部位特異的変異形成、変異ホットスポットターゲティング(mutational hotspots targeting)、倹約変異形成(parsimonious mutagenesis)、抗体シャフリング(shuffling)、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異形成、ならびに本明細書に開示する本発明の種々の態様に従った方法および使用を実施できる親和性成熟ライブラリーを調製および使用する方法には、たとえば下記に開示されたものが含まれる: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679。
アミノ酸変異形成を含めた、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果としての、抗体の構造変化に伴って、抗原への結合部位のバリアントが生成し、より大きな親和性について選択された。親和性成熟抗体は、親抗体より数ｌｏｇ倍大きい親和性を示す可能性がある。単一の親抗体を親和性成熟させることができる。あるいは、ターゲット抗原に対して類似の結合親和性を備えた抗体のプールを親構造体とみなすことができ、それらを変異させて親和性成熟した単一の抗体またはそのような抗体の親和性成熟したプールを得ることができる。
本発明による抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、少なくとも２倍の結合親和性増大、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親和性成熟は、親分子のそれぞれのライブラリーを用いる選択活動に際し、中等度の結合親和性をもつ抗体について採用して、結合親和性Ｋｄ＜１０−８Ｍの特異的ターゲット結合特性をもつ本発明の抗体を得ることができる。あるいは、本発明による抗体の親和性成熟によって親和性をよりいっそう増大させて、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル濃度範囲のＫｄに相当する高い値を得ることができる。
ある態様において、結合親和性は親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性はＢＩＡｃｏｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイにより決定される。ある態様において、結合親和性は動力学的方法により決定される。ある態様において、結合親和性は平衡／溶解法により決定される。
用語“ 同じ特異性をもつ”、“同じ結合部位をもつ”または“同じエピトープを結合する”の使用は、同等のモノクローナル抗体が同じ、または本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、前選択したターゲット結合配列への結合に対して競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対的特異性は、競合アッセイ、たとえば Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)に記載されたものにより相対的に決定できる。
本明細書中で抗体に関して用いる用語“競合する”は、第１抗体またはその抗原結合性部分が第２抗体またはその抗原結合性部分の結合と十分に類似した様式でエピトープに結合し、したがって第１抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合の結果が第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して第２抗体の存在下で検出可能なほど低減することを意味する。その逆、すなわち第２抗体がそれのエピトープに結合する場合も第１抗体の存在下で検出可能なほど低減する可能性はあるが、必ずしもそうではない。すなわち、第１抗体は第２抗体がそれのエピトープに結合するのを阻害し、第２抗体は第１抗体がそれ自身のエピトープに結合するのを阻害しないという可能性がある。しかし、それぞれの抗体が他方の抗体とそれのコグネイトエピトープとの結合を検出可能なほど（同じ、より大きい、またはより少ない程度であっても）阻害する場合、それらの抗体はそれらの各エピトープ（単数または複数）への結合に対して互いに“競合する”と言われる。ｇａｌ−ＩＩＩ抗原の結合に対して例示抗体のいずれかと競合する抗体は、特に本発明に包含される。
競合は、本明細書中で、競合ＥＬＩＳＡ分析またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により判定して約３０％より大きい相対的阻害を意味する。特定の状況で、たとえば意図する抗原結合機能をもつように設計した新規抗体を選択またはスクリーニングするために競合分析を用いる場合、競合の適切なレベルである基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが望ましいであろう。よって、たとえば、抗体を十分に競合性であるとみなす前に、競合結合について少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくはさらには少なくとも１００％の相対的阻害が検出される基準を設定することができる。
本明細書中で用いる用語“診断キット”は、１以上の被分析体またはマーカーの測定／検出を実施して疾患または病状を判定し、あるいは疾患または疾患進行を推定するために、組み合わせまたは混合して使用できるキットまたは一組のパーツを表わす。特に、キットは少なくとも検出分子および／または結合剤を収容し、その検出分子および／または結合剤は被分析体もしくはマーカーまたはそのような被分析体もしくはマーカーの反応生成物を特異的に認識する。さらに、種々の試薬またはツールをキットに収容できる。診断キットは、本発明方法を実施するために有用ないずれかの試薬を含むことができ、それには、マイクロビーズまたは平坦なアレイもしくはウェルなどの基材、バイオマーカー単離のための試薬、特定のターゲットに対する検出分子、核酸の配列決定もしくは増幅のためのプライマーなどの試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒もしくは緩衝液など、種々のリンカー、種々のアッセイ成分、遮断剤などが含まれる。
キットは診断方法に使用するための指示をも含むことができる。そのような指示は、たとえばキットに収容されたデバイス上に、たとえば診断用の生体試料を調製するための、たとえばマーカーを決定する前に細胞および／またはタンパク質含有画分を分離するためのツールまたはデバイス上に提供することができる。キットは貯蔵安定形態で提供するのが好都合であり、たとえば市販のキットは少なくとも６か月の貯蔵寿命を備えている。
特定の診断キットは固体支持体をも含み、それは目的とするマーカーに対する検出分子を含むか、あるいはパターン化したアレイ状に検出分子が固定化されており、好ましくは第１マーカーに対する第１結合試薬を収容した第１領域および第２マーカーに対する第２結合試薬を収容した第２領域を含む。
特に、サンドイッチフォーマットを使用できる。たとえば、１以上の結合剤を生体試料との接触前に基材にコンジュゲートさせる。１以上の結合剤を検出分子として作用する検出可能な標識にコンジュゲートさせてもよい。他の態様において、１以上の結合剤を検出可能な標識にコンジュゲートさせる。この構成において、１以上の結合剤を生体試料との接触前に基材にコンジュゲートさせて捕獲剤として用いてもよい。さらに、１以上の結合剤を生体試料との接触前に基材にコンジュゲートさせることができ、および／または１以上の結合剤を検出可能な標識にコンジュゲートさせる。そのような場合、１以上の結合剤は捕獲剤と検出剤のいずれかまたは両方として作用することができる。
診断キットは具体的にはイムノアッセイに使用するために提供され、その際、検出分子は被分析体またはマーカーに免疫反応により結合する特異的結合剤である。そのような結合剤は、ターゲット抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメントまたは抗体様骨格であってもよい。
適切なイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、イムノクロマトグラフィー、ディップスティックアッセイおよびウェスタンブロットのいずれかである。
用語“クレブシエラ・ニューモニエ感染”および“クレブシエラ・ニューモニエ定着”は、下記のように解釈される：クレブシエラ・ニューモニエは腸内細菌科(Enterobacteriaceae)のグラム陰性細菌である。それは遍在性細菌であり、ヒト宿主にも一般に腸または上気道に定着できる。日和見病原体であるため、免疫系によって適正に制御されない場合にはそれはこれらの部位から無菌の身体部位に侵入できる。他の場合には無菌状態であるこれらの部位における無制御な細菌複製は炎症を誘発し、それは大部分がクレブシエラ・ニューモニエから放出されるエンドトキシン（すなわち、ＬＰＳ）分子により仲介される。菌血症の場合、エンドトキシン分子は敗血症性ショックの引き金となる可能性がある。
クレブシエラ・ニューモニエ定着は、対象のある部位にそれらを検出できるほど十分に高い濃度のクレブシエラ・ニューモニエ細菌があるけれどもまだその細菌が徴候または症状を引き起こしていないことを意味する。定着は長期間にわたって持続する可能性があり、消散はその生物に対する免疫応答、その部位における他の生物からの競合、および時には抗微生物薬の使用によって影響される。
一般に、クレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされる菌血症を既知の一般的な抗細菌療法、たとえば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系の炎症阻害薬による治療で処置するのに成功する可能性がある。本発明は、クレブシエラ・ニューモニエを特異的に認識する抗体を場合により抗細菌または抗炎症療法と組み合わせて用いる新規免疫療法を提供する。クレブシエラ・ニューモニエ感染症を伴う患者を処置するために用いる代表的な抗生物質は、アミノグリコシド類、セファロスポリン類、アミノペニシリン類、カルバペネム類、フルオロキノロン類、チゲサイクリン、コリスチンなどである。
多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエは、特に３クラス以上の抗生物質、たとえば下記の薬剤／グループに対して耐性を示す株であると解釈される：ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、フルオロキノロン類、ニトロフラントイン、トリメトプリム（およびそれの組合わせ）、ホスホマイシン(fosfomycin)、ポリミキシン類、クロラムフェニコール、アズトレオナム(azthreonam)、またはチゲサイクリン。
最近の抗生物質耐性株の出現に伴って、この性質をもつ菌血症の処置が著しくより困難になった。ＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエ疾患を発症している患者は、クレブシエラ・ニューモニエ疾患を伴わない患者より入院およびＩＣＵ滞在が長く、死亡率が高く、ヘルスケアコストが大きい。患者にＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエが多量に定着している場合、治療よりむしろ防止、すなわちクレブシエラ・ニューモニエ疾患予防により、患者のケアを改善し、院内感染を減らすことができる。
クレブシエラ・ニューモニエ疾患は、具体的にはクレブシエラ・ニューモニエ感染により引き起こされる疾患であると解釈される。そのような疾患には、局所性および全身性の疾患が含まれる。重篤な症例は、たとえば原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎である。
本明細書中で用いる用語“組換え体”は、“遺伝子工学操作により製造されたもの、またはその結果”を意味するものとする。組換え宿主は具体的には発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、あるいはそれは特にその宿主に対して外来であるヌクレオチド配列を用いて組換え核酸配列を収容するように遺伝子工学的に操作されている。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることにより製造される。本明細書中で用いる用語“組換え抗体”には、組換え手段で製造、発現、作製または単離された抗体、たとえば下記のものが含まれる：（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから作製されたハイブリドーマについてトランスジェニックまたは染色体導入(transchromosomal)状態である動物（たとえば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマ(transfectoma)から、単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル−ヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合性配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う他のいずれかの手段で製造、発現、作製または単離された抗体。そのような組換え抗体には、たとえば抗体成熟に際して起きる再配列および変異形成を含むように遺伝子工学操作された抗体が含まれる。本発明によれば、当業者がなしうる範囲の一般的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ手法を採用できる。そのような手法は文献に十分に説明されている。たとえば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)を参照。
選択的結合は、当技術分野で知られている組換え抗体最適化法によってさらに改善できる。たとえば、本明細書に記載する免疫グロブリン鎖の可変領域の特定領域に、軽鎖シャフリング、デスティネーション変異形成(destinational mutagenesis)、ＣＤＲ融合(CDR amalgamation)、ならびに選択したＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の特異的変異形成(directed mutagenesis)を含む１以上の最適化方策を施すことができる。
本明細書中で用いる用語“対象”は、温血哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物を表わすものとする。クレブシエラ・ニューモニエはきわめて重大なヒト病原体であり、動物医薬において出現しつつある関心事でもある。それは広範な非ヒト動物種に存在する。よって、用語“対象”は具体的にはイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含めた動物を表わす。特に、本発明の医療用途またはそれぞれの処置方法は、クレブシエラ・ニューモニエ感染に関連する病状の予防または治療を必要とする対象に適用される。対象は、クレブシエラ・ニューモニエ感染のリスクをもつ患者、または初期もしくは後期疾患を含めた疾患に罹患している患者であってもよい。用語“患者”には、予防処置または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳類対象が含まれる。よって、用語“処置”は予防処置および治療処置の両方を含むものとする。
対象は、たとえばクレブシエラ・ニューモニエ病状の予防または治療のために処置される。特に、感染またはそのような疾患の発症もしくは疾患再発のリスクをもつ対象、あるいはそのような感染および／またはそのような感染に関連する疾患を伴う対象を処置する。
具体的には、用語“予防”は防止措置を表わし、それは発病の防止または発病のリスクを低減するための予防措置を含むものとする。
具体的には、その処置はその状態の原因物質としてのクレブシエラ・ニューモニエの病的発生を妨害することによるものであってもよい。
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な”または“精製した”は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、たとえば核酸分子または抗体を含む調製物を表わすものとする。純度はその化合物に適した方法（たとえば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定される。
本明細書中で化合物、たとえば本発明の抗体の“有効量”または“十分な量”のいずれかと互換性をもって用いる“療法有効量”という用語は、対象に投与した際に、臨床結果を含む有益または希望する結果を及ぼすのに十分な量または活性であり、したがって有効量またはその同義語はそれが適用される状況に依存する。
有効量は、そのような疾患または障害を治療、防止または阻害するのに十分な化合物量を意味するものとする。疾患に関して、本明細書に記載する抗体の療法有効量は、具体的には、クレブシエラ・ニューモニエの病的発生、たとえば粘膜表面における付着および定着、無菌身体部位内での無制御な複製、ならびに細菌産物による宿主細胞傷害の阻害が有益である疾患または状態を治療し、調節し、減弱させ、反転させ、または影響を及ぼすために用いられる。
そのような有効量に相当する化合物量は、種々の要因、たとえば投与する薬物または化合物、医薬配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置される対象または宿主の素姓などに応じて異なるであろうが、それにもかかわらず当業者がルーティンに決定できる。
その必要があるヒト対象に投与される本明細書に記載する抗体の療法有効量は、具体的には０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、よりいっそう好ましくは最大２０ｍｇ／ｋｇ、最大１０ｍｇ／ｋｇ、最大５ｍｇ／ｋｇであってもよいが、たとえば急性病状を処置するためにはより高い用量を処方してもよい。効力の高い抗体を用いる場合、用量はこれよりはるかに低くてもよい。そのような場合、有効量は０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
さらに、療法有効量の本発明の抗体による対象の治療または防止計画は、単回投与からなることができ、あるいは一連の適用からなることができる。たとえば、抗体を少なくとも年１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも月１回、投与することができる。しかし、他の態様において、特定の処置について週に約１回から約１日１回まで、抗体を対象に投与することができる。処置期間の長さは、多様な要因、たとえば疾患の重症度、急性または慢性疾患、患者の年齢、抗体フォーマットの濃度および活性に依存する。治療または予防のために用いる有効量が特定の治療または予防計画のコースにわたって増加または減少する可能性があることも認識されるであろう。投与量の変更が生じる可能性があり、それは当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって明らかになる。ある場合には、長期投与が必要になる可能性がある。
ｇａｌ−ＩＩＩに対して高特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエ、具体的にはＳＴ２５８系列に属するＭＤＲ株の同定のための診断試薬としての大きな可能性をもつ。さらに、特にヒト化された場合、これらのｍＡｂはＳＴ２５８−ｇａｌ−ＩＩＩ株により引き起こされるクレブシエラ・ニューモニエ感染症の予防（たとえば、高リスクグループについて）および治療に用いるのに適切である。
ｇａｌ−ＩＩＩとｇａｌ−Ｉの炭水化物構造体はきわめて類似し、相異のない抗原であると考えられていた。ＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエＳＴ２５８株におけるＯ抗原合成の遺伝学的バックグラウンドは十分に解明されてはいなかった。ｒｆｂ（ｗｂ）クラスター（グリコシルトランスフェラーゼｇｔｒをコードする）に隣接する特定の遺伝子がｇａｌ−ＩＩＩ Ｏタイプの菌株のＰＣＲベースの同定の基礎をなすことは意外であった。
Ｏ抗原因子ガラクタン−Ｉをコードするｒｆｂ遺伝子クラスター内に不均一性の証拠がある。バリアント間にみられるサイズ差は、ｇｔｒ（グリコシルトランスフェラーゼ）様遺伝子を保有する約３−ｋｂフラグメントの存在または非存在に由来する。バリアントを識別するために開発されたＰＣＲ反応により、すべてのＯ１およびＯ２クレブシエラ臨床分離株のうち５０％以上、およびすべてのＳＴ２５８株のうち８０％以上がｇｔｒ様遺伝子座を保有することが明らかになった。
本発明の抗体がｇａｌ−ＩＩＩ抗原を特異的に結合できたことは意外であった。マウスをｇｔｒ＋ Ｏ２株で免疫化すると抗ガラクタン抗体が誘発され、それはｇｔｒ遺伝子座で修飾されたガラクタン−Ｉ分子（すなわち、ガラクタン−ＩＩＩ抗原）のみを認識することが分かった。この修飾の性質は先に血清型Ｏ２（２ａ、２ｆ、２ｇ）の反復単位として記載された同じ分枝ガラクタン構造と同定されたが、これらの構造が抗原的に異なることは見出されていなかった。本発明は、標準的なハイブリドーマ法により作製されたガラクタン−ＩＩＩに対して特異的なｍＡｂを初めて提供する。このｍＡｂが生存Ｏ２ ｇｔｒ＋クレブシエラ分離株（ＳＴ２５８株を含む）の表面に結合する能力を観察した。ガラクタン−ＩＩＩ特異的ｍＡｂの防御効果が菌血症および内毒素血症のネズミモデルでみられたことは意外であった。防御作用の推定様式はエンドトキシンの中和であり、それはインビトロ機能アッセイにより確認された。
ＭＤＲクレブシエラ属菌株により引き起こされる感染症の防止および治療のための療法用モノクローナル抗体の開発を目的として、特異的ｍＡｂの分子ターゲットは適切にはクレブシエラにおいて限られた不均質性を示すＬＰＳ Ｏ抗原である。そのようなＯ−側鎖は嵩高い莢膜多糖によって完全に遮閉されてはいないので、免疫適性であると考えられる。
希望する結合特性を備えた抗体が同定されると、そのような抗体（抗体フラグメントを含む）は、たとえばハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ技術を含めた当技術分野で周知の方法により製造できる。
組換えモノクローナル抗体は、たとえば必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクター、たとえば抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット（単数または複数）を用いて、発現のために組換え宿主細胞にそのコード配列をトランスフェクトすることにより製造できる。組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞、たとえば前記に述べたものであってもよい。
特定の側面によれば、ヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて、抗体をヒト化し、または抗体の親和性もしくは他の特性を改善することができる。たとえば、抗体をヒトの臨床試験および処置に用いる場合、免疫応答を避けるために定常領域を工学操作してヒト定常領域にいっそう近似させることができる。抗体配列を遺伝子操作して、ｇａｌ−ＩＩＩターゲットに対してより大きい親和性、およびクレブシエラ・ニューモニエ、具体的にはＭＤＲクローンＳＴ２５８に対してより大きい有効性を得ることが望ましいであろう。抗体に対して１以上のポリヌクレオチド変化を行なってもなおターゲットｇａｌ−ＩＩＩ抗原に対するそれの結合能力を維持できることは当業者に明らかであろう。
種々の手段による抗体分子の製造は一般に十分に理解されている。たとえばUS Patent 6331415 (Cabillyら)には、抗体を組換え製造するための方法が記載され、その場合、重鎖および軽鎖を同時に単一ベクターから、または２つの別個のベクターから、単一の細胞において発現させている。Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191 -202)およびLee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198)には、プラスミドを用いて別個の宿主細胞培養物中で発現させて別個に製造した重鎖および軽鎖からモノクローナル抗体を製造することが記載されている。抗体の製造に関する他の種々の手法が、たとえばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提示されている。
所望により、本発明の抗体、たとえば 図１または図２のいずれかの抗体を配列決定し、そのポリヌクレオチド配列を次いで発現または増幅のためにベクター中へクローニングすることができる。抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクター内に維持し、その宿主細胞を次いで増殖させ、将来の使用のために凍結することができる。細胞培養における組換えモノクローナル抗体の製造は、当技術分野で既知の手段によるＢ細胞からの抗体遺伝子のクローニングにより実施できる。
他の側面において、本発明は、本発明の組換え抗体の製造をコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
抗体をコードする核酸は、いずれか適切な特性をもち、いずれか適切な特徴またはその組合わせを含むことができる。よって、たとえば抗体をコードする核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形態であってもよく、非天然塩基、修飾されたバックボーン、たとえば核酸の安定性を増強するホスホロチオエートバックボーン、または両方を含むことができる。核酸は有利には、ターゲット宿主細胞（単数または複数）における希望する発現、複製および／または選択を増強する特徴を含む本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに収容されていてもよい。そのような特徴の例には、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサーエレメント構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終止構成要素などが含まれ、その多数の適切な例が知られている。
本開示はさらに、本明細書に記載するヌクレオチド配列のうち１以上を含む組換えＤＮＡ構築体を提供する。これらの組換え構築体は、開示したいずれかの抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されたベクター、たとえばプラスミド、ファージミド(phagemid)、ファージまたはウイルスベクターとの組合わせで用いられる。
モノクローナル抗体は、培養細胞系により、たとえば組換え真核（哺乳類または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞を培養することにより抗体分子を製造する、いずれかの方法を用いて製造される。モノクローナル抗体を製造するのに適した方法の例には、 Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497)のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; およびBrodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63)が含まれる。
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて同定または入手できる。そのような方法においては、マウスまたは他の適宜な宿主動物、たとえばハムスターを免疫化して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、適切な融合剤、たとえばポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することができる。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により判定する。
次いでｍＡｂを、それの特異的なｇａｌ−ＩＩＩ抗原結合についての、またはおそらくｇａｌ−Ｉ抗原に対比してｇａｌ−ＩＩＩ抗原を優先的に結合するそれの差示結合親和性についてのさらなる試験、およびたとえば種々の診断または療法目的での抗体の工学操作のために、ハイブリドーマ上清から精製することができる。
Ｇａｌ−ＩＩＩ特異的抗体は、ある場合には単一のｇａｌ−ＩＩＩ抗原に対するスクリーニングから明らかになる。差示結合するクローンを単離する可能性を高めるためには、種々の抗原に対して系統的にスクリーニングすることによる多重選択圧を適用する。特別なｍＡｂ選択方策は、ｇａｌ−ＩＩＩおよびｇａｌ−Ｉ成分または他のクレブシエラ・ニューモニエ抗原を交互に用いる。
希望する選択的結合特性を備えた抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合性配列をディスプレーするライブラリーを用いるディスプレー技術により行なうことができる（たとえば、ファージ、細菌、酵母もしくは哺乳類の細胞；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するインビトロディスプレーシステムを使用）。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、またはフローサイトメトリーを伴う表面染色に基づいて、たとえば標準アッセイを用いて、反応性を査定することができる。
単離された抗原（単数または複数）は、たとえば抗体ライブラリー、たとえば酵母ディスプレーされた抗体ライブラリーから抗体を選択するために使用できる。
たとえば、本発明は具体的にはｇａｌ−ＩＩＩ特異的抗体を提供し、それらはｇａｌ−ＩＩＩ抗原を結合する特異性を備えた抗体を同定する方法により、たとえば特異的なディカバリーセレクションスキームにより得られる。したがって、ｇａｌ−ＩＩＩターゲットとの反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーをターゲットとの反応性について選択することができる。
本発明はさらに、本明細書に記載する抗体および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は本発明に従ってボーラス注射もしくは注入として、または連続注入により投与できる。そのような投与手段を容易にするのに適したキャリヤーは当技術分野で周知である。
医薬的に許容できるキャリヤーには、一般に、本発明により提供される抗体または関連の組成物もしくは組合わせと生理的に適合するすべての適切な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容できるキャリヤーのさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそのいずれかの組合わせが含まれる。
そのような１側面において、抗体を希望する投与経路に適した１種類以上のキャリヤーと組み合わせることができ、抗体をたとえばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールと混合し、場合によりさらに好都合な投与のために打錠またはカプセル封入することができる。あるいは、抗体を生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および／または種々の緩衝液に溶解することができる。他のキャリヤー、佐剤、および投与様式は医薬技術分野で周知である。キャリヤーには、制御放出材料または遅延材料、たとえばモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル単独もしくはろうを含むもの、または当技術分野で周知である他の材料を含めることができる。
さらに他の医薬的に許容できるキャリヤーが当技術分野で知られており、たとえばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液体配合物は液剤、乳剤または懸濁液剤であってもよく、賦形剤、たとえば懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤を含有することができる。
本発明の抗体および１種類以上の療法有効薬剤を配合した医薬組成物が考慮される。希望する純度をもつ前記の免疫グロブリンを任意選択的な医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥配合物または水性液剤の形態で、本発明の抗体の安定配合物を貯蔵のために調製する。インビボ投与に用いるための配合物は、具体的には無菌、好ましくは無菌水性液剤の形態である。これは、無菌濾過膜による濾過または他の方法によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の療法有効薬剤を、免疫リポソームとして配合し、および／またはマイクロカプセルに封入することもできる。
本発明の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所（たとえば、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤など）、腹腔内、筋肉内、肺内（たとえば、吸入法または肺送達システムを採用）、膣、非経口、直腸または眼内を含めた多様な方法で行なうことができる。
非経口投与に用いる代表的配合物には、皮下、筋肉内または静脈内注射に適したもの、たとえば無菌の液剤、乳剤または懸濁液剤が含まれる。
１態様において、本発明の抗体は、たとえば疾患の改変または防止用の単剤療法として対象に投与する唯一の療法有効薬剤である。
他の態様において、クレブシエラ・ニューモニエ、具体的にはＳＴ２５８系列に属するＭＤＲ株をターゲティングするために、本発明の抗体をさらなる抗体とカクテル中で組み合わせ、たとえば、混合物またはキット状パーツ中で組み合わせ、したがってカクテルは、たとえば疾患改変または防止の併用療法として対象に投与される１種類より多い療法有効薬剤を含有する。
さらに、本発明の抗体を１種類以上の他の治療薬または予防薬との組合わせで投与することができ、それには標準処置、たとえば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症阻害薬、および／または他の抗体ベースの療法、たとえば抗細菌薬または抗炎症薬を用いるものが含まれるが、これらに限定されない。
併用療法は特に標準的な計画を用いるもの、たとえばクレブシエラ・ニューモニエ、具体的にはＭＤＲクローンＳＴ２５８による感染を処置するために用いるものである。これには、抗生物質、たとえばチゲサイクリン、コリスチン、ポリミキシンＢ、およびベータラクタム類を非ベータラクタム系阻害薬と組み合わせたものを含めることができる。
併用療法において、抗体を混合物として、または１種類以上の他の療法計画と併せて、たとえば併用する療法の前、同時または後に投与することができる。
本発明の抗体またはそれぞれの医薬製剤の生物学的性質を、エクスビボで細胞、組織および生物全身実験において解明することができる。当技術分野で知られているように、疾患もしくは疾患モデルに対する処置についての薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性および他の特性を測定するために、薬物をしばしばインビボで、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含めた動物において試験する。それらの動物を疾患モデルと呼ぶことができる。療法薬はしばしばマウスにおいて試験され、それにはヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）が含まれるが、これらに限定されない。そのような実験により、適宜な半減期、エフェクター機能、（交差−）中和活性、および／または能動もしくは受動免疫療法に際しての免疫応答性を備えた治療薬または予防薬として用いる抗体の力価を決定するための有意義なデータを得ることができる。いずれかの生物、好ましくは哺乳類を試験に使用できる。たとえば、霊長類であるサルはヒトに対するそれらの遺伝学的類似性のため適切な療法モデルとなることができ、よって被験薬または組成物の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために使用できる。薬物として承認されるためにはヒトにおける試験が最終的には要求されるので、もちろんこれらの実験も考慮する。よって、本発明の抗体およびそれぞれの療法用組成物をヒトにおいて試験して、それらの治療または予防効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または臨床特性を判定することができる。
以下の定義の主題を本発明の態様とみなす：
１． エピトープがガラクタン−ＩＩＩ反復単位に内包されており、そのガラクタン−ＩＩＩ反復単位が式（Ｉ）
Figure 0006987638
の分枝ガラクトースホモポリマーであるクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ） Ｏ抗原構造体のガラクタン−ＩＩＩエピトープを特異的に認識する、単離された抗体。
２． ガラクタン−Ｉエピトープに対比してガラクタン−ＩＩＩエピトープに優先的に結合するか、あるいはガラクタン−Ｉエピトープと交差反応しない抗体であって、ガラクタン−Ｉエピトープがクレブシエラ・ニューモニエのＬＰＳ Ｏ２ａ抗原構造体のガラクタン−Ｉ反復単位に内包されており、そのガラクタン−Ｉ反復単位が式（ＩＩ）
Figure 0006987638
の線状ガラクトースホモポリマーである、定義１に記載の抗体。
３． ガラクタン−ＩＩＩエピトープが多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエ、特にＭＤＲクローンＳＴ２５８のものである、定義１または２に記載の抗体。
４． １０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、よりいっそう好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄでガラクタン−ＩＩＩエピトープを結合する親和性を有する、定義１〜３のいずれか１つに記載の抗体。
５． ガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシンを中和する、定義１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
６． ガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ株のエンドトキシンを中和し、その際、中和力価が少なくとも、Ｋａｂａｔの命名法に従った
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
を含む基準抗体の力価である、定義１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
７． 菌株が、ｇｔｒ遺伝子を内包するｒｆｂｇａｌ−Ｉ遺伝子座を特徴とする、定義５または６に記載の抗体。
８． ＭＤＲクレブシエラ・ニューモニエ クローンＳＴ２５８を認識する、定義５〜７のいずれか１つに記載の抗体。
９． 完全長モノクローナル抗体、その抗体フラグメントであって結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含むもの、または結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特に抗体がランダム化または人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である、定義１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
１０． ヒト、ヒト化、キメラまたはネズミ由来のものである、定義１〜９のいずれか１つに記載の抗体。
１１． モノクローナル抗体である、定義１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
１２． 少なくとも、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示された表１に挙げるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列のいずれかまたはその機能活性ＣＤＲバリアントを特徴とする抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、定義１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。
１３．
Ａ）グループメンバーｉ）〜ｉｖ）からなるグループから選択される抗体
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体
である、定義１２に記載の抗体。
１４． 図２に示すＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列を含む、定義１２または１３に記載の抗体。
１５． さらに、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示された表１に挙げるＣＤＲ４〜ＣＤＲ６配列のいずれかまたはその機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、定義１２〜１４のいずれか１つに記載の抗体。
１６．
Ａ）グループメンバーｉ）〜ｉｖ）からなるグループから選択される抗体
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体
である、定義１５に記載の抗体。
１７． 図２に示すＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列を含む、定義１６に記載の抗体。
１８．
ａ）表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
ｂ）図２に示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬ配列
を含み、あるいは
ｃ）ａ）〜ｃ）の配列を特徴とする親抗体の機能活性バリアントであり、
好ましくは、その際、
ｉ．機能活性バリアントは、親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む；および／または
ｉｉ．機能活性バリアントは、ＶＨおよびＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域に少なくとも１つの点変異を含む；
ならびに、さらに
ｉｉｉ．機能活性バリアントは、親抗体と同じエピトープを結合する特異性を有する；および／または
ｉｖ．機能活性バリアントは、親抗体のヒト、ヒト化、キメラもしくはネズミおよび／または親和性成熟バリアントである；
定義１２〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
１９． 表１に挙げるいずれかのＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含み、機能活性ＣＤＲバリアントが下記のうちの少なくとも１つであり：
ａ）親ＣＤＲ配列中に１、２または３つの点変異を含む；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端または４つのＮ末端または４つの中心アミノ酸位置のいずれかに１または２つの点変異を含む；および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性を含む；
好ましくは、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む、
定義１〜１８のいずれか１つに記載の抗体。
２０． 対象における感染を制限するかまたはその感染から生じる病状を軽減するのに有効な量の抗体を対象に投与することを含む、クレブシエラ・ニューモニエの感染または定着のリスクをもつかまたはそれを伴う対象の処置に使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
２１． 定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体を含み、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む医薬製剤。
２２． 対象においてクレブシエラ・ニューモニエの感染もしくは定着、または原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎もしくは髄膜炎などの関連疾患を診断するための、定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体の使用。
２３． 対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の患者またはその接触者である、定義２２に記載の使用。
２４． 下記の構成要素
ａ）抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により、抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相
を含む、組成物またはキット状パーツ中に抗体およびさらなる診断試薬を含む、定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体の診断用製剤。
２５． さらなる診断試薬が、抗体と、および／または抗体がそれの抗原に結合した反応生成物と、特異的に反応する診断用の標識または試薬である、定義２４に記載の診断用製剤。
２６．
ａ）定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体を用意し、そして
ｂ）その抗体が被験対象の生体試料中のガラクタン−ＩＩＩエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断する
ことを含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ株により起きたクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断する方法。
２７． 生体試料が、体液または組織試料、好ましくは血液試料、糞便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器検体、たとえば気管内吸引物、胸膜液、肺穿刺液、鼻スワブもしくは喀痰、または以上のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ分離株からなる群から選択される試料である、定義２６に記載の方法。
２８． 定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
２９． 定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質構築体またはタンパク質を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
３０． 定義２９に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞。
３１． 定義３０に記載の宿主細胞をその抗体を産生する条件下で培養または維持する、定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体を製造する方法。
３２．
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と定義１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法。
３３．
ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と定義１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、ガラクタン−Ｉエピトープと対比した、ガラクタン−ＩＩＩ抗体とエピトープの特異的な陽性反応により、その抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法。
３４．
ａ）定義３２または３３に従って同定した候補抗体を用意し；そして
ｂ）候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えた、モノクローナル抗体、またはヒト化もしくはヒト型の候補抗体、またはその誘導体を製造する
ことを含む、定義１〜１９のいずれか１つに記載の抗体を製造する方法。
本発明を下記の例によってさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。
実施例１：新規ガラクタン構造の遺伝学的バックグラウンドの同定：
ガラクタン−Ｉ特異的ｒｆｂ（ｗｂとしても知られる）クラスターの最初の記載(3)以来、幾つかの完全ゲノム配列が得られるようになった。ｒｆｂクラスターは常に２つの保存された遺伝子（ｕｇｅおよびｈｉｓＩ）の間に組み込まれているので、ｒｆｂ遺伝子座の厳密なサイズを決定できた。インシリコ分析により２つの異なる長さのｒｆｂオペロンが明らかになった（図４Ａ）。これらの配列の詳細な分析（図４Ｂ）により、ｒｆｂクラスター内にClarkeら(3)が同定していない追加遺伝子があることが明らかになった。
短い方の完全長ｒｆｂオペロンですらClarkeらが記載したものより約２ｋｂ長く、仮説グリコシルトランスフェラーゼファミリーのタンパク質と注釈される追加遺伝子を含む。この遺伝子が長いｒｆｂオペロンと短いｒｆｂオペロンの間に示す相同性は乏しい。この遺伝子を含まないクローン化したクラスターがガラクタン−Ｉ合成を再建すれば(5)、この遺伝子はガラクタン−Ｉ発現に必ずしも必要ではないと思われる。
長い方の形態のｒｆｂ遺伝子座には、反対側のＤＮＡ鎖上に１つのオペロンに組織化された３つの遺伝子を含む追加の３ｋｂ領域がある。これらの遺伝子は、腸内細菌科の種々のメンバーにおいて可動遺伝子エレメント(mobile genetic element)がしばしば保有するグリコシルトランスフェラーゼファミリーに対する高い配列類似性を示す。この種類の水平伝播されたグリコシルトランスフェラーゼは血清型変換において役割を果たし(6)、あるいは株内および株間での表現型多様性を増大させると考えられる。興味深いことに、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)の場合、同一のｇｔｒクラスターがｒｆｂクラスターと連結していない染色体部位に見出された（未発表所見）。したがって、あるクレブシエラ・ニューモニエ株がこのクラスターをクレブシエラ・オキシトカから水平伝達により獲得した可能性がある。
長い方のｒｆｂ遺伝子座（すなわち、ｇｔｒ遺伝子を内包するもの）を保有するＯ２株から精製したＯ抗原サブユニットの構造は、ガラクタン−Ｉ構造と異なる分枝トリガラクトース反復単位を示した（図５）。この構造は先にＯ２（２ａ，２ｆ，２ｇ）と呼ばれるＯ２サブ血清型としてKellyらにより同定された(5)。それの染色体上に空のベクターまたはそのベクターにｇｔｒ遺伝子をクローニングしたもののいずれかをトランス相補した(trans-complemented)短いオペロンを保有するＯ２株の構造解析により、１−４結合での分枝ガラクトースの付加はｇｔｒ遺伝子によりコードされることが分かった（後記の実施例３を参照）。
先に公表されていたもの(5)と対照的に、大部分の単位はガラクタン−ＩＩＩであるけれどもガラクタン−Ｉ反復単位のこの修飾は必ずしも完全に化学量論的ではないことが生化学分析により示された。それにもかかわらず、修飾の化学量論は菌株依存性でありかつ発現調節の影響下にある可能性があり、したがってさらなる調査が必要である。
実施例２：ガラクタン−ＩＩＩの疫学
クレブシエラ・ニューモニエの臨床分離株におけるｒｆｂクラスター内のｇｔｒ様遺伝子を検出するために、保存されたｗｂｂＯおよびｈｉｓＩ遺伝子（図４Ｂを参照）にアニールするプライマーを設計した（下記の表２）。
Figure 0006987638
クレブシエラ・ニューモニエのＯ１、Ｏ２およびＯ２ａｃプロトタイプ株をｇｔｒ様遺伝子の存在について上記プライマーで調べた。ゲノムＤＮＡをそれらの菌株からＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造業者の指示に従って精製した。ＰＣＲ反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ハイフィディリティー(High-Fidelity)ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ）で、２０ｐｍｏｌのフォワードおよびリバースプライマーならびに０．２μｌの精製ｇＤＮＡを含む２０μｌ混合物中に設定した。ＰＣＲをＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＴＲＩＯサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）において下記のプログラムで実施した：
Figure 0006987638
反応混合物を１％アガロースゲルに装填し、ＧｅｌＲｅｄ（商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標） ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でイメージを取得した（図６）。
ＰＣＲにより、ｇｔｒ＋およびｇｔｒ−分離株をＯ１およびＯ２株の両方に検出できることが確認された。臨床分離株内のｇｔｒ＋およびｇｔｒ−分離株の頻度を明らかにするために、スクリーニングした４５のＯ１および４７のＯ２臨床分離株を異なる地理的由来からスクリーニングした。Ｏ１分離株内には分離された２７（６０％）のｇｔｒ−および１８（４０％）のｇｔｒ＋分離株が分離され、Ｏ２株内には同定された１５（３２％）のｇｔｒ−および３２（６８％）のｇｔｒ＋株が同定された。
興味深いことに、多剤耐性ＫＰＣ(Klebsiella pneumoniae carbapenemase(クレブシエラ・ニューモニエ カルバペネマーゼ))産生−固有クローン(endemic clone)ＳＴ２５８に属する大部分の菌株が、ガラクタン−ＩＩＩをコードするオペロン（すなわち、ｇｔｒ遺伝子を内包する長いｒｆｂｇａｌ−Ｉ遺伝子座）を保有することが見出された。２７のＳＴ２５８分離株をＰＣＲにより分析し、さらにデータベースにおいて得られる２２４のゲノム配列をインシリコ分析した。これらの菌株のうち合計２１０（８３．６％）が、ｇｔｒ遺伝子を内包する無傷ｒｆｂオペロン（すなわち、ガラクタン−ＩＩＩ抗原を発現すると予想されるもの）を保有していた。残りの菌株の多くのゲノムがｇｔｒ遺伝子の少なくとも一部を含んでいたが、欠失またはトランスポゾン挿入のため無傷ガラクタン−ＩＩＩを発現するとは期待されなかった。
ガラクタン−ＩＩ合成の遺伝学的バックグラウンドが最近記載された(4)ので、Ｏ１株と２株をゲノム配列の分析のみにより識別できた。しかし、これらのＯ１特異的決定因子を保有するＳＴ２５８分離株はなかった。さらに、入手したＳＴ２５８株はいずれもガラクタン−ＩＩ特異的ｍＡｂに反応せず、これらの分離株がＯ２血清グループのものであることが確認された。
これらのデータは、クローン系列ＳＴ２５８がガラクタン−ＩＩＩ Ｏ抗原の発現と強く関連しており、明らかに大部分のＳＴ２５８株においてガラクタン−ＩＩＩが唯一のＯ側鎖決定因子である（すなわち、ガラクタン−ＩＩＩ抗原はガラクタン−ＩＩによりキャッピングされない）ことを示唆する。これにより、ガラクタン−ＩＩＩは免疫ベースの診断薬および／または療法薬のための抗体に対する魅力的なターゲットになる。
実施例３：ガラクタン−ＩＩＩに対して特異的なモノクローナル抗体の作製
ネズミモノクローナルｍＡｂを標準的なハイブリドーマ法により、ｇｔｒ＋ Ｏ２（すなわち、ｇａｌ−ＩＩＩ発現性）菌株で免疫化したマウスを用いて作製した。ガラクタン−ＩＩＩ抗原に対して特異性を示した４種類のｍＡｂを選択した。これらのｍＡｂの結合がガラクタン−Ｉ分子のｇｔｒ仲介修飾により影響を受けるかどうかを調べるために、ｇｔｒ−およびｇｔｒ＋ Ｏ１およびＯ２株から精製したＬＰＳ分子のパネルを、イムノブロット法により調べた。抗体を１μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、抗マウスＩｇＧ二次抗体を１：２０，０００に希釈した。
４種類すべてのｍＡｂが同一の結合パターンを示した。１つの代表的ｍＡｂ（９Ｈ９−Ｈ７）について得られた結果を図７に示す。１つの菌株（Ｋｐ６７，列８）以外は、ｇｔｒ＋菌株から得られたすべてのＯ抗原が強く染色され、これに対しｇｔｒ− ＬＰＳ分子はいずれもこのｍＡｂによって（他の３種類によっても）認識されなかった。株Ｋｐ６７はｇｔｒ−遺伝子座についてＰＣＲ陽性であると認められたが、それは推定ｇｔｒ−仲介修飾については表現型陰性であると思われる。銀染色ゲルにおける粗面ＬＰＳ表現型により（すなわち、検出可能なＯ抗原の欠如により）示唆されるように（データを示していない）、この矛盾の理由はｒｆｂオペロン内の変異に由来する可能性が最も大きい。
さらにこれらのｍＡｂの特異性を確認するために、アイソジェン（同質遺伝子）誘導体のパネルについて免疫反応性を調べた（図８）。予想どおり、Ｏ２ ｇｔｒ−株から抽出したＬＰＳへの結合の欠如がみられた（図８，列２）。ｇｔｒ遺伝子を保有するプラスミドを補充すると、強い結合が検出された（図８，列５および６）。
実施例４：バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）測定
抗体結合特性をバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)（ＢＬＩ）により調べた。ビオチニル化Ｄ−ガラクタン ＩＩＩ多糖抗原（Ｏ２ ｇｔｒ＋クレブシエラ・ニューモニエ株から精製）をストレプトアビジンセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化し、前装填したセンサーへのキメラｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の会合を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＤＰＢＳ中で１０分間モニターし、続いて同じ緩衝液中で解離させる（１時間）ことにより、抗体結合を測定した。Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＫｄ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を決定した。０．０５ｎｍ未満の応答値を陰性とみなした。
Ｋｄ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を表３にまとめる。すべてのｍＡｂが精製抗原への強いアビジン結合を示し（Ｋｄ ０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）、ｋｏｎ値は類似していた（最低と最高のｋｏｎ値間でわずか３倍の差）。これに対し、ｍＡｂ ５Ａ４および９Ｈ９のｋｏｆｆ値は２Ｄ８および８Ｅ３のものより約２桁低い。陰性対照抗原への結合はいずれのｍＡｂについてもみられなかった。
Figure 0006987638
実施例５：クレブシエラ生細胞の表面染色
異なるＯタイプをもつ幾つかのクレプシエラ属臨床分離株に対する１つの代表的なｍＡｂ（９Ｈ９−Ｈ７）の表面結合をフローサイトメトリーで調べた（表４）。
一夜増殖させた細菌を希釈し、中間対数期（ＯＤ６００＝０．５）まで増殖させ、ＰＢＳ中で洗浄し、表面染色に用いた。２×１０６個の細菌を、０．５％のＢＳＡ＋０．０．１％のナトリウムアジドを含有するＰＢＳに再懸濁し、４０μｇ／ｍＬ濃度のｍＡｂ ９Ｈ９−Ｈ７により氷上で３０分間染色した。ＢＳＡおよびナトリウムアジドを含有するＰＢＳ緩衝液中で試料を２回洗浄し、４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を含有するＰＢＳに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、５ｎＭ ＳＹＴＯ−６２色素を含有するＰＢＳに試料を再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした後、ｉ−Ｃｙｔ Ｅｃｌｉｐｓｅフローサイトメーターで分析した。
フロー結果（表４）は、臨床ｇｔｒ＋およびｇｔｒ−菌株について得られた結果に基づいて、調べたｍＡｂがガラクタン−ＩＩＩ（すなわち、ｇｔｒ陽性菌株）に対する特異性をもつことを確証する。
Figure 0006987638
さらに、一群のＳＴ２５８株への結合を同様に前記に従ってフローサイトメトリーにより決定した（表５）。調べた菌株のうち８／１１が４種類すべてのｍＡｂによって強く染色され、１菌株はラフであることが証明され、残り２つの菌株は型別不能な(non-typeable)ＬＰＳ構造を示した（データを示していない）。これらの菌株はいずれもガラクタン−ＩＩ特異的ｍＡｂに反応しなかった（上記を参照）。
Figure 0006987638
実施例６：種々のガラクタン−ＩＩＩ特異的ｍＡｂの機能効力の比較
マウス可変領域（重鎖および軽鎖についてそれぞれＶＨおよびＶＬ）をヒトＩｇＧ１およびカッパ定常領域に遺伝子融合させたキメラｍＡｂを作製した。種々の機能アッセイにおいてインビトロおよびインビボで試験した（下記を参照）後、最良のキメラｍＡｂをヒト化処理した。ヒト化は、ネズミフレームワーク領域から重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ配列を対応する（インシリコ推定）ヒトフレームワーク内へグラフトさせることにより達成された。その結果、これらのヒト化ｍＡｂにおいて唯一のマウス由来配列はＣＤＲ領域であり、ｍＡｂの残部はヒト配列で構成されている。
さらに、ヒト化軽鎖を種々のヒト化重鎖と対合させた（軽鎖シャフリング，図９を参照）。興味深いことに、５Ａ４由来のヒト化軽鎖を含むｍＡｂは有意に、より高い効力を示すと思われ、これらの特定の軽鎖ＣＤＲ領域はあるｍＡｂの卓越した効力に寄与している可能性があることを示唆する。ヒト化ｍＡｂの結合を、フローサイトメトリーにより査定した特定細菌の表面染色により確認した（図９）。
実施例７：ｇａｌ−ＩＩＩ特異的ｍＡｂのインビボでの防御効力
マウス５匹のグループを、キメラ（図１０Ａ）またはヒト化（図１０Ｂ）ガラクタン−ＩＩＩ特異的ｍＡｂまたは対照としてのアイソタイプマッチした無関係なｍＡｂで腹腔内受動免疫化した。２４時間後、マウスを２０ｍｇのＧａｌＮの腹腔内投与によりエンドトキシンに感作させ、同時に致死量のクレブシエラ・ニューモニエ株＃７９で攻撃した。死亡率を毎日観察した。
試験したすべてのキメラｍＡｂが、１μｇ／マウス（約５０μｇ／ｋｇの用量に相当）の低い用量で有意の防御を示した（図１０Ａ）。ｍＡｂ ５Ａ４は卓越した防御効力を示し、それはそれのより高い親和性（実施例４）およびインビトロＬＰＳ中和力価（後記の実施例８）と良好に相関する。
エンドトキシン中和力価に関して最も有効なヒト化ｍＡｂ（後記の実施例８を参照）を、同じモデルにおいて試験した。すべてのヒト化ｍＡｂが５Ａ４由来の軽鎖ＣＤＲを保有していたので、キメラｍＡｂ ５Ａ４を防御効力の基準とした。図１０Ｂに示すように、大部分のヒト化ｍＡｂの卓越した防御効力が保持されていた。これらのヒト化ｍａｂは異なる重鎖ＣＤＲをもつ（ただし、軽鎖ＣＤＲを共有）ので、軽鎖領域が強い防御効力に有意に寄与すると結論できる。
実施例８：エンドトキシンのインビトロ中和
クレブシエラ・ニューモニエＯ２株の高い血清感受性を考慮して、本発明者らは、前記の防御（実施例７）について殺細菌活性ではなくエンドトキシン中和が主な作用様式の可能性があると提唱した。これを実験で確証するために、ガラクタン−ＩＩＩ特異的ｍＡｂのエンドトキシン中和力価をインビトロで調べた。
市販のレポーター細胞系（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従って、精製ＬＰＳにより誘発したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）シグナル伝達を検出した。３５μｌのｍＡｂ（ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）培地中に希釈）を、融解したばかりの２５μｌの精製ＬＰＳと混合した。Ｏ２ ｇｔｒ＋ ＬＰＳは菌株ＰＣＭ−２７由来であった（Ｏ２ ｇｔｒ＋：Ｋ２７ Ｐｏｌｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ポーランド）。原液を０．４ｎｇ／ｍｌ濃度でＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）培地中に調製した。混合物を透明９６ウェル−ハーフエリア(half-area)プレートに移し、室温で３０分間インキュベートした。５０μｌのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞懸濁液を添加した（約５０，０００個の細胞／ウェル）。プレートをアルミニウム箔に包み、３７℃、５％ ＣＯ２で一夜（１６〜１８時間）インキュベートした。翌日、６３０ｎｍで光学濃度を測定し、モック(mock)を上回るレポータータンパク質レベル（分泌型胚性アルカリホスファターゼ(secreted embryonic alkaline phosphatase)−ＳＥＡＰ）を計算した。無抗体対照に対比したＳＥＡＰ誘導の阻害パーセントを種々のｍＡｂ濃度において計算し、プロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０でｌｏｇ（阻害薬）対 応答−可変勾配非線形回帰分析を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。陽性対照としてポリミキシンＢ（硫酸ＰＭＢ，ＦＬＵＫＡ カタログ＃８１３３４）を被験ｍＡｂと同様に用いた。陰性対照として、無関係なｍＡｂを含めた。
ヒト化ｍＡｂの中和力価をそれらの親（ヒト化軽鎖はシャッフルされたので、重鎖に関して）キメラｍＡｂと、１ｕｇ／ｍｌ ｍＡｂ用量で比較した（図１１）。この用量で、キメラｍＡｂ ５Ａ４は他のキメラｍＡｂと対比して卓越した中和力価を示した；これはＢＬＩにより測定した親和性（実施例４）と良好に相関する。興味深いことに、それぞれの重鎖系列のヒト化誘導体のうちあるものは、５Ａ４由来のヒト化軽鎖と対合させた場合にキメラ５Ａ４に匹敵する良好な中和を示した。この所見も、５Ａ４軽鎖ＣＤＲ配列が改善された中和力価に寄与し、よって前記のインビボ防御（実施例７）に寄与している可能性があることを示唆する。
この所見をさらに支持するために、それぞれの系列の最良のヒト化ｍＡｂおよびそれらの親キメラｍＡｂを同じインビトロ中和アッセイで調べた。図１２に示すように、５Ａ４由来の軽鎖ＣＤＲを保有するすべてのｍＡｂがポリミキシンＢ（エンドトキシン結合特性をもつことが知られている小分子抗生物質）のものより優れた中和力価を示し、これに対し残りのｍＡｂはより高い用量でのみ中和を示した。
参考文献
(1) Hansen DS, Mestre F, Alberti S, et al. Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide O typing: revision of prototype strains and O-group distribution among clinical isolates from different sources and countries. J Clin Microbiol 1999 Jan;37(1):56-62.
(2) Trautmann M, Ruhnke M, Rukavina T, et al. O-antigen seroepidemiology of Klebsiella clinical isolates and implications for immunoprophylaxis of Klebsiella infections. Clin Diagn Lab Immunol 1997 Sep;4(5):550-5.
(3) Clarke BR, Whitfield C. Molecular cloning of the rfb region of Klebsiella pneumoniae serotype O1:K20: the rfb gene cluster is responsible for synthesis of the D-galactan I O polysaccharide. J Bacteriol 1992 Jul;174(14):4614-21.
(4) Hsieh PF, Wu MC, Yang FL, et al. D-galactan II is an immunodominant antigen in O1 lipopolysaccharide and affects virulence in Klebsiella pneumoniae: implication in vaccine design. Front Microbiol 2014;5:608.
(5) R.F.Kelly, M.B.Perry, L.L.MacLean, C.Whitfield. Structures of the O-antigens of Klebsiella serotypes 02 (2a,2e), 02 (2a,2e,2h), and 02 (2a,2f,2g) members of a family of related D-galactan O-antigens in Klebsiella spp. Journal of Endotoxin Research 1995;2:131-40.
(6) Allison GE, Verma NK. Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella flexneri. Trends Microbiol 2000 Jan;8(1):17-23.
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のリポ多糖（ＬＰＳ） Ｏ抗原構造体のガラクタン−ＩＩＩエピトープを特異的に認識する単離された抗体であって、エピトープはガラクタン−ＩＩＩ反復単位に内包されており、該ガラクタン−ＩＩＩ反復単位が式（Ｉ）
Figure 0006987638
 の分枝ガラクトースホモポリマーである、上記抗体。
［態様２］ガラクタン−Ｉエピトープに対比してガラクタン−ＩＩＩエピトープに優先的に結合するか、あるいはガラクタン−Ｉエピトープと交差反応せず、ここで、該ガラクタン−Ｉエピトープはクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＬＰＳ Ｏ２ａ抗原構造体のガラクタン−Ｉ反復単位に内包されており、該ガラクタン−Ｉ反復単位が式（ＩＩ）
Figure 0006987638
 の線状ガラクトースホモポリマーである、態様１に記載の抗体。
［態様３］ガラクタン−ＩＩＩエピトープが多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、特にＭＤＲクローンＳＴ２５８のものである、態様１または２に記載の抗体。
［態様４］ガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)株のエンドトキシンを中和し、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、よりいっそう好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄでガラクタン−ＩＩＩエピトープを結合する親和性を有する、態様１〜３のいずれか１に記載の抗体。
［態様５］完全長モノクローナル抗体、その抗体フラグメントであって結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含むもの、または結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特に抗体がランダム化または人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である、態様１〜４のいずれか１に記載の抗体。
［態様６］少なくとも、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示された表１に挙げるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列のいずれかまたはその機能活性ＣＤＲバリアントを特徴とする抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、態様１〜５のいずれか１に記載の抗体。
［態様７］Ａ）グループメンバーｉ）〜ｉｖ）からなるグループから選択される抗体
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体
である、態様６に記載の抗体。
［態様８］図２に示すＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列を含む、態様６または７に記載の抗体。
［態様９］さらに、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って表示された表１に挙げるＣＤＲ４〜ＣＤＲ６配列のいずれかまたはその機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、態様６〜８のいずれか１に記載の抗体。
［態様１０］Ａ）グループメンバーｉ）〜ｉｖ）からなるグループから選択される抗体
ｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｉｉ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
ｉｖ）下記のものを含む抗体
ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
または
Ｂ）Ａのグループメンバーのいずれかである親抗体の機能活性バリアントであって、親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む抗体
である、態様９に記載の抗体。
［態様１１］図２に示すＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列を含む、態様１０に記載の抗体。
［態様１２］ａ）表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
ｂ）図２に示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬ配列
を含み、あるいは
ｃ）ａ）〜ｃ）の配列を特徴とする親抗体の機能活性バリアントであり、
好ましくは、その際、
ｉ．機能活性バリアントは、親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能活性ＣＤＲバリアントを含む；および／または
ｉｉ．機能活性バリアントは、ＶＨおよびＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域に少なくとも１つの点変異を含む；
ならびに、さらに
ｉｉｉ．機能活性バリアントは、親抗体と同じエピトープを結合する特異性を有する；および／または
ｉｖ．機能活性バリアントは、親抗体のヒト、ヒト化、キメラもしくはネズミおよび／または親和性成熟バリアントである；
態様６〜１１のいずれか１に記載の抗体。
［態様１３］表１に挙げるいずれかのＣＤＲ配列の機能活性ＣＤＲバリアントを含み、機能活性ＣＤＲバリアントが下記のうちの少なくとも１つであり：
ａ）親ＣＤＲ配列中に１、２または３つの点変異を含む；および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端または４つのＮ末端または４つの中心アミノ酸位置のいずれかに１または２つの点変異を含む；および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性を有する；
好ましくは、機能活性ＣＤＲバリアントは４または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列中に１または２つの点変異を含む、
態様１〜１２のいずれか１に記載の抗体。
［態様１４］ａ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ２のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ３のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １３のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １４のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １５のＣＤＲ６配列；
ｂ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １６のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｃ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ７のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ８のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ９のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｄ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｅ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
ｆ）下記のものを含む抗体：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
または以上のいずれかの機能活性ＣＤＲバリアントであって、ｇａｌ−ＩＩＩ抗原を１０−８Ｍ未満のＫｄで結合する親和性を有するもの、
からなる群から選択される、態様１〜１２のいずれか１に記載の抗体。
［態様１５］対象における感染を制限するかまたはその感染から生じる病状を軽減するのに有効な量の抗体を対象に投与することを含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の感染または定着のリスクをもつかまたはそれを伴う対象の処置に使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体。
［態様１６］態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体を含み、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む医薬製剤。
［態様１７］対象においてクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の感染もしくは定着、または原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎もしくは髄膜炎などの関連疾患を診断するための、態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体の使用。
［態様１８］対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の患者またはその接触者である、態様１７に記載の使用。
［態様１９］下記の構成要素
ａ）抗体；および
ｂ）さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに場合により、抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相
を含む、組成物またはキット状パーツ中に抗体およびさらなる診断試薬を含む、態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体の診断用製剤。
［態様２０］さらなる診断試薬が、抗体と、および／または抗体がそれの抗原に結合した反応生成物と、特異的に反応する診断用の標識または試薬である、態様１９に記載の診断用製剤。
［態様２１］ａ）態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体を用意し、そして
ｂ）その抗体が被験対象の生体試料中のガラクタン−ＩＩＩエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の感染または定着を診断する
ことを含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ株により起きたクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を診断する方法。
［態様２２］生体試料が、体液または組織試料、好ましくは血液試料、糞便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸器検体、たとえば気管内吸引物、胸膜液、肺穿刺液、鼻スワブもしくは喀痰、または以上のいずれかに由来するクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)分離株からなる群から選択される試料である、態様２１に記載の方法。
［態様２３］態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
［態様２４］態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
［態様２５］態様２４に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞。
［態様２６］態様２５に記載の宿主細胞をその抗体を産生する条件下で培養または維持する、態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体を製造する方法。
［態様２７］ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と態様１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法。
［態様２８］ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と態様１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、ガラクタン−Ｉエピトープと対比して、ガラクタン−ＩＩＩ抗体とエピトープの特異的な陽性反応により、その抗体を候補抗体と同定する
ことを含む、候補抗体を同定する方法。
［態様２９］ａ）態様２７または２８に従って同定した候補抗体を用意し；そして
ｂ）候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えた、モノクローナル抗体、またはヒト化もしくはヒト型の候補抗体、またはその誘導体を製造する
ことを含む、態様１〜１４のいずれか１に記載の抗体を製造する方法。

Claims (25)

  1. クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のリポ多糖（ＬＰＳ） Ｏ抗原構造体のガラクタン−ＩＩＩエピトープを特異的に認識する単離された抗体であって、エピトープはガラクタン−ＩＩＩ反復単位に内包されており、該ガラクタン−ＩＩＩ反復単位が式（Ｉ）
    Figure 0006987638
     の分枝ガラクトースホモポリマーである、上記抗体。
  2. ガラクタン−Ｉエピトープに対比してガラクタン−ＩＩＩエピトープに優先的に結合するか、あるいはガラクタン−Ｉエピトープと交差反応せず、ここで、該ガラクタン−Ｉエピトープはクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のＬＰＳ Ｏ２ａ抗原構造体のガラクタン−Ｉ反復単位に内包されており、該ガラクタン−Ｉ反復単位が式（ＩＩ）
    Figure 0006987638
     の線状ガラクトースホモポリマーである、請求項１に記載の抗体。
  3. ガラクタン−ＩＩＩエピトープが多剤耐性（ＭＤＲ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、特にＭＤＲクローンＳＴ２５８のものである、請求項１または２に記載の抗体。
  4. ガラクタン−ＩＩＩエピトープを発現しているクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）株のエンドトキシンを中和し、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、よりいっそう好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄでガラクタン−ＩＩＩエピトープに結合する親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 完全長モノクローナル抗体、その抗体フラグメントであって結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含むもの、または結合部位を内包する少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質であり、特に抗体がランダム化または人工アミノ酸配列を含む非天然抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 少なくとも抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体であって、該抗体重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表示されるＶＨ ＣＤＲ配列を含み、該抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５、及びＣＤＲ６と表示されるＶＬ ＣＤＲ配列を含み、
    該抗体のＶＨ ＣＤＲ配列が、以下のグループｉ）〜ｉｖ）：
    ｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
    ｉｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ ４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
    ｉｉｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ ７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
    ならびに
    ｉｖ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
    からなる群より選択され、
    該抗体のＶＬ ＣＤＲ配列が、以下のグループｖ）〜ｖｉｉｉ）：
    ｖ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
    ｖｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
    ｖｉｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
    ならびに
    ｖｉｉｉ）
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ １９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４；および
    ｂ）ＳＥＱ ＩＤ １７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５；および
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ １８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６；
    からなる群より選択される、上記抗体、
    である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 図２に示すＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  8. 図２に示すＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  9. ａ）表１に挙げるいずれかの抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６配列；または
    ｂ）図２に示すいずれかの抗体のＶＨおよびＶＬ配列
    を含む、
    請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体。
  10. ａ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ １のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ２のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ３のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １３のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １４のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １５のＣＤＲ６配列；
    ｂ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １６のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
    ｃ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ ７のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ８のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ９のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
    ｄ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ １７のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
    ｅ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ ４のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ５のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ６のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
    ならびに
    ｆ）下記のものを含む抗体：
    ａ．ＳＥＱ ＩＤ １０のＣＤＲ１配列；および
    ｂ．ＳＥＱ ＩＤ １１のＣＤＲ２配列；および
    ｃ．ＳＥＱ ＩＤ １２のＣＤＲ３配列；および
    ｄ．ＳＥＱ ＩＤ １９のＣＤＲ４配列；および
    ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ２０のＣＤＲ５配列；および
    ｆ．ＳＥＱ ＩＤ １８のＣＤＲ６配列；
    からなる群から選択される、
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 対象における感染を制限するかまたはその感染から生じる病状を軽減するのに有効な量の抗体を対象に投与することを含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）の感染または定着のリスクをもつかまたはそれを伴う対象の処置に使用するための、好ましくは原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎または髄膜炎のいずれかを治療または予防するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含み、場合により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含有する、好ましくは非経口または粘膜用の配合物を含む医薬製剤。
  13. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）の感染もしくは定着、または原発性および続発性の菌血症、肺炎、尿路感染症、肝膿瘍、腹膜炎もしくは髄膜炎などの関連疾患を診断するための診断用組成物。
  14. 対象が免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の患者またはその接触者である、請求項１３に記載の診断用組成物。
  15. 下記の構成要素
    ａ）抗体；および
    ｂ）さらなる診断試薬；
    ｃ）ならびに場合により、抗体および診断試薬のうち少なくとも１つを固定化するための固相
    を含む、組成物またはキット状パーツ中に抗体およびさらなる診断試薬を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体の診断用製剤。
  16. さらなる診断試薬が、抗体と、および／または抗体がそれの抗原に結合した反応生成物と、特異的に反応する診断用の標識または試薬である、請求項１５に記載の診断用製剤。
  17. ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を用意し、そして
    ｂ）その抗体が被験対象の生体試料中のガラクタン−ＩＩＩエピトープと特異的に免疫反応するかどうかを検出し、それによりクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）の感染または定着をエクスビボで判定する
    ことを含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ株により起きたクレブシエラ・ニューモニエの感染または定着を決定する方法。
  18. 生体試料が、体液または組織試料である、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  20. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含むタンパク質を発現するコード配列を含む、発現カセットまたはプラスミド。
  21. 請求項２０に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む、宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞をその抗体を産生する条件下で培養または維持する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を製造する方法。
  23. ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
    ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と請求項１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、抗体とエピトープの陽性反応によりその抗体を候補抗体と同定する
    ことを含む、候補抗体を同定する方法。
  24. ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を用意し；そして
    ｂ）試料中の抗体または試料により産生された抗体と請求項１に定めたガラクタン−ＩＩＩエピトープとの結合を査定し、その際、ガラクタン−Ｉエピトープと対比して、ガラクタン−ＩＩＩ抗体とエピトープの特異的な陽性反応により、その抗体を候補抗体と同定する
    ことを含む、候補抗体を同定する方法。
  25. ａ）請求項２３または２４に従って同定した候補抗体を用意し；そして
    ｂ）候補抗体と同じエピトープ結合特異性を備えた、モノクローナル抗体、またはヒト化もしくはヒト型の候補抗体、またはその誘導体を製造する
    ことを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を製造する方法。
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