JP6989088B2

JP6989088B2 - 新規機能タンパク質及びそれを用いた老化抑制方法及び薬剤、並びに老化抑制薬剤候補物質スクリーニング方法

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Description

本発明は、新規な機能を有するタンパク質と、それを用いた老化抑制方法及び薬剤、並びに、老化抑制薬剤候補物質のスクリーニング方法に関する。

細胞内の遊離Ｃａ^２＋は、心筋や平滑筋の収縮、神経伝達物質の放出、遺伝子発現の制御などに関与する重要なイオンであり、このＣａ^２＋濃度は、細胞膜や筋小胞体膜のＣａ^２＋Ｃａ^２＋ポンプ、Ｃａ^２＋チャンネル、ＮＣＸ（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger）チャンネルにより調節されている。

ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルは、Ｎａ^＋とＣａ^２＋を交換輸送する細胞膜イオントランスポーターであり、心血管系疾病や糖尿病などとの関係については報告があり、その阻害剤についても報告がある（特許文献１〜５、非特許文献１〜４）。

しかし、ＮＣＸ１チャンネルと老化との関係については知られていない。
アンチエイジングに対する需要は大きく、その医薬が期待されている。

ＷＯ２００３／０６８２６３特開２００６−４５１４２特表２００８−５１０１５０特表２０１０−５２０７５９特表２０１６−５１１２６６

日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn.）129，2007,262−265 DIABETES,VOL.60,AUGUST 2011,2076−2085 DIABETES,VOL.59,JULY 2010,1693−1688 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.285, NO. 29,22291−22298, July 16,2010

そこで、本発明は、老化を抑制する薬剤及び方法、並びに、老化を抑制する薬剤となる候補物質をスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明の新規な機能を有するタンパク質は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルを阻害する機能を有することを特徴とする。

また、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、オートファジーの障害を抑制する機能を有するタンパク質でもよい。

ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解を抑制する機能を有するタンパク質でもよい。

ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、テロメアの長さの減少を抑制する機能を有するタンパク質でもよい。

ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、ゲノムまたはエピゲノムの変化を抑制する機能を有するタンパク質でもよい。

本発明の薬剤は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を主成分とし、生体の老化を抑制する作用を有することを特徴とする。

本発明の老化抑制方法は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を生体に導入し、生体の老化を抑制することを特徴とする。

本発明の薬剤候補物質スクリーニング方法は、生体の老化を抑制する作用を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法であって、候補物質が、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の発現を誘導し得るか否か、または、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の活性を誘導し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程と、を有することを特徴とする。

また、生体の老化を抑制する作用を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法であって、候補物質が、ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルを阻害し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程と、を有する方法でもよい。

ここで、老化シグナルを、オートファジーの障害、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解、テロメアの長さの減少、ゲノムまたはエピゲノムの変化のうちの少なくとも一つとしてもよい。

本発明によると、ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルを阻害し、Ｃａ^２＋の流入を抑制できるので、生体の老化の抑制に寄与する。

野性型細胞（ＷＴ）、老化促進モデル細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）の蛍光免疫染色写真（左）及びウエスタンブロット写真（右）ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）によるクロマチン構造の回復を示すDAPI染色写真白血球の野性型細胞（ＷＴ）及び老化促進モデル細胞（ＴＧ）のテロメア長を示すグラフ（左）と、線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）のテロメア長を示すグラフ（右）ＮＭ＿０２６３３３タンパク質によるＨＥＫ−２９３細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフＮＭ＿０２６３３３タンパク質によるＡ７ｒ５細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフＮＭ＿０２６３３３タンパク質を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞の染色写真ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を過剰発現させたＡ７ｒ５細胞の染色写真Ｈｉｓタグ付きＮＭ＿０２６３３３タンパク質の相互作用を示すウエスタンブロット写真ＮＣＸ１阻害薬によるＨＥＫ−２９３細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６による作用を示す下段の図を、図１に等しい上段の図に加えた写真ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６を投与した老化促進モデル細胞（ＴＧＳＮ−６１０^-5Ｍ）によるクロマチン構造の回復を示すDAPI染色写真マウス線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＮＣＸ１阻害剤を投与した老化促進モデル細胞（ＴＧＳＮ−６１０^-5Ｍ）のテロメア長を示すグラフ（左）と、ヒトＨＥＫ−２９３細胞の老化促進モデル細胞（ＣＦ６）及びＮＣＸ１阻害剤を投与した老化促進モデル細胞（ＣＦ６ＳＮ−６１０^-5Ｍ）のテロメア長を示すグラフ（右）

以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、上記の先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。

老化促進モデルマウス及び高食塩摂取マウスの心臓及び腎臓から組織を採取し、マイクロアレー法により、共通して発現が低下しているタンパク質のスクリーニングを行った。
老化促進モデルマウスとしては、７週齢の雄性C57BL/6Jの野生型と７週齢の雄性human coupling factor 6 (CF6) 過剰発現マウス（ヒトCF6＋human elongation factor 1 プロモーターのDNA断片を作成し、２系統のＴＧ（老化促進モデル）マウスを確立し、そのうちの１系統を使用）を用い、高食塩摂取マウスとしては、食塩負荷を４週齢の雄性C57BL/6Jの野生型に普通食または高塩食（8% NaCl）を３週間摂取させた７週齢マウスを用いた。

ＲＮＡ単離には、組織及び細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で手早くすすぎ、製造者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することにより行った。ＲＮＡ品質は分光光度分析（ＯＤ２６０／２８０）により保証された。ＲＮＡは、分光光度分析により２６０ｎｍで定量した。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの直線的増幅は、ＡｍｉｎｏＡｌｌｙｌＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ａＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用い、製造者の推奨に従って２回の連続増幅工程で得た。２つの異なる供給源からのＲＮＡサンプルをＣｙ３結合デオキシリボヌクレオチドまたはＣｙ５結合デオキシリボヌクレオチド（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）のいずれかで標識した異なるマイクロアレイスライドを用いて各２反復の実験を行った。実験的ａＲＮＡに由来するプローブ上の蛍光色素はＣｙ５であり、対照プローブ上の色素はＣｙ３であった。

ｃＤＮＡマイクロアレイには、ＴＧマウスとＷＴ（野性型）マウスまたは高食塩摂取マウスの間の心臓及び腎臓で、また、１０^-7Ｍの共役因子６に２４時間曝した初代ＨＵＶＥＣで変化した遺伝子を同定するために、ＤＮＡマイクロアレイＡｃｅＧｅｎｅ−ＭｏｕｓｅＯｌｉｇｏＣｈｉｐ３０Ｋ１ＣｈｉｐＶｅｒｓｉｏｎ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社、神奈川、日本）を用いた。標識されたプローブをハイブリダイゼーション溶液（５×塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４×デンハート液、２０％ハイブリダイゼーション溶液、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び１０％ホルムアミド）と混合し、４６℃で１４時間のハイブリダイゼーション後、これらのスライドを５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で２分、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３０℃で１０分、０．５×ＳＳＣ中、室温で２分洗浄した。スライドのＣｙ３蛍光及びＣｙ５蛍光を、４２８アレイスキャナー（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）でスキャンし、蛍光をＤＮＡＳＩＳアレイソフトウエアバージョン２．６（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社、神奈川、日本）で定量した。現行の分析では強度依存グローバルノーマライゼーション（平均：１０，０００）を使用した。強度依存ノーマライゼーションは、このような２色試験において色素関連のアーチファクトを消去するために使用される。各遺伝子に関する結果を３つのスライドから得られた平均とした。データはＣｙ５（共役因子６＋の場合）とＣｙ３（共役因子６−の場合）のノーマライズ後の比とし、２０００以上の強度を使用した。
４種類のマイクロアレーで安定した発現があり安定して発現抑制が認められ、機能が特定されていないｃＤＮＡのみが報告されている遺伝子を探索した結果、ＮＭ＿０２６３３３の２６９個のアミノ酸配列から成るタンパク質が同定された。ＴＧマウスの心臓で0.375±0.042、腎臓で0.430±0.209、高食塩摂取マウスの心臓で0.655±0.138、腎臓で0.204±0.408であり、野生型マウスに比較して有意な安定した発現低下が認められた。

図１は、野性型細胞（ＷＴ）、老化促進モデル細胞（ＴＧ）、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）の蛍光免疫染色の写真（左）及びウエスタンブロットの写真（右）である。
蛍光免疫染色では、マウス心臓からexplant 法で採取したfibroblastを使用し、スライドグラスつきのペトリディッシュに細胞を培養し、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質をEffectene Transfection Reagent（QIAGEN, Valencia, CA, USA）で導入し４８時間後に、serum-free DMEM中で４〜６時間培養後、各抗体で染色した。
ウエスタンブロットでは、６ｃｍのペトリディッシュに細胞を培養し、上記と同様の時間経過後、細胞を採取しRIPA Lysis buffer に溶解し、その上清に同量のLaemmli (5% βメルカプト添加)を加え、攪拌後９５℃で５分処理後、BioRadの5%-20%ゲルにアプライし膜に転写後、各抗体で染色した。

タンパク質発現の測定には、組織及び細胞サンプルをＲＩＰＡ溶解バッファー（２０ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／ｌＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％グリセロール、１ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール及び０．５ｍｍｏｌ／ｌフェニルメチルスルホニルフルオリド）中でホモジナイズし、サンプルを、５％β−メルカプトエタノールを含んだＬａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にロードした。タンパク質をポリビニリデンジフルオリドメンブレンに電気泳動的に転写し、ＬＣ３ＩＩ、ｐ６２、Ａｔｇ７、ＨＨＡＣ１−４、パン−アセチルＨ３、パン−アセチルＨ４、Ｈ４Ｋ５、Ｈ４Ｋ８、Ｈ４Ｋ１２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、ＮＣＸ１、ＴＲＰＣ３及び６、Ｃａｖ１．２、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、ヘテロクロマチンタンパク質１α（ＨＰ１α）、ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ１（ＨＭＧＢ１）、ｂａｒｒｉｅｒ−ｔｏ−ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（ＢＡＦ）、及びＧＡＰＤＨに対する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。タンパク質バンドをECL Plus（登録商標；GEヘルスケア、米国）検出システムにより検出し、デンシトメトリー分析を、Ｓｃｉｏｎイメージソフトウエアを用いて行い、各サンプルにおいてタンパク質バンドに対する相対比を計算した。

蛍光免疫染色によると、野性型細胞（ＷＴ）では、核の周辺にＬＣ３ＩＩとリソソームが強く染色され、よくマージし、正常のオートファゴソーム形成、すなわち正常のオートファジーが観察された。老化促進モデル細胞（ＴＧ）では、ＬＣ３ＩＩとリソソームが細胞質に一様に染色され、一部マージしなかった。
この老化促進モデル細胞（ＴＧ）に、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入し過剰発現させた細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）では、野性型細胞（ＷＴ）と同様の染色形態になり、オートファジーの障害の消失が観察された。

オートファジー関連タンパク質と核膜ラミナタンパク質のウエスタンブロットによると、老化促進モデル細胞（ＴＧ）で認められたＬＣ３ＩＩの増加と、核膜ラミナタンパク質であるラミン及びエメリンの減少と、クロマチンモデリングに関連するヘテロクロマチンタンパク質１αの減少が認められた。しかし、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）では、これらの老化シグナルが消失し、野性型細胞（ＷＴ）と同様になった。

図２は、図１のオートファジーで用いた細胞の核をDAPIで染色した写真である。
老化促進モデル細胞（ＴＧ）は10％FBS-DMEMで培養し、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）を投与した４８時間後に、serum-free DMEM中で４〜６時間培養し、DAPIで核染色した。
老化促進モデル細胞（ＴＧ）では、核クロマチンのヘテロクロマチン構造が消失しているが、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）では、ヘテロクロマチン構造の回復が観察された。

図３は、白血球の野性型細胞（ＷＴ）及び老化促進モデル細胞（ＴＧ）のテロメア長を示すグラフ（左）、並びに、線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）のテロメア長を示すグラフ（右）である。
１００週齢の雄性・雌性マウスC57BL/6Jの７匹の野性型細胞（ＷＴ）と５匹の野性型細胞（ＷＴ）、老化促進モデル細胞（ＴＧ）から採血し、QIAamp DNA Blood Mini Kitを用いて白血球ゲノムＤＮＡを抽出した。
同様に、線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）と、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入し４８時間経過後の老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）からゲノムＤＮＡを抽出した。

テロメア長は、ＣＦＸ３８４リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デンマーク）にて、改良型モノクロマルチプレックス定量ＰＣＲ法（１）を用いて測定した。二重鎖ＰＣＲにおいて、アルブミンをコードするシングルコピー遺伝子γ−グロビンを同じウェルでテロメア鋳型と同時に増幅し、異なるサンプルで異なるＤＮＡ量を調整するための参照として使用した。ＰＣＲ試薬の終濃度は、容量１０μＬ中、１×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）、２０ｎｇＤＮＡ、３００ｎｍｏｌ／ｌフォワードテロメアプライマー（５’−ＡＣＡＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴ−‘３）、３００ｎｍｏｌ／ｌリバーステロメアプライマー（５’−ＴＧＴＴＡＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡ−‘３）、３５０ｎｍｏｌ／ｌフォワード３６Ｂ４ γ−グロビンプライマー（５’−ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡＧ−‘３）、及び３５０ｎｍｏｌ／ｌリバース３６Ｂ４ γ−グロビンプライマー（５’−ＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴ−‘３）であった。本温度サイクルプロフィールは次の通りであった：ステージ１：９５℃で１５分；ステージ２：９４℃で１５秒、４９℃で１５秒の２サイクル；及びステージ３：９４℃で１５秒、６２℃で１０秒、シグナルの取得を伴って７３℃で１５秒、８４℃で１０秒、シグナルの取得を伴って８７℃で１５秒の４０サイクル；ステージ４：シグナルの取得を伴って６５℃で０．０５秒の１サイクル。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ中のＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩが二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光シグナルを生じる。７３℃での読み取りをテロメア鋳型の増幅のＣｔ値とした（初期サイクルで３６Ｂ４ γ−グロビンシグナルがまだベースラインにある場合）。８７℃での読み取りを３６Ｂ４ γ−グロビン鋳型の増幅のＣｔ値とした（この温度でテロメア鋳型は完全に融解される）。ステージ４の６５℃でのシグナル取得を、再実行のためにプライマーが二量体を形成したウェルを同定するために使用した。
２回の「Ｔ」実行（テロメア反復配列のコピー数のため）及び２回の「Ｓ」実行（シングルコピー遺伝子のコピー数のため）。この試験で用いた参照シングルコピー遺伝子は齧歯類３６Ｂ４ γ−グロビンであった。２つのＴ測定値の平均を２つのＳ測定値の平均で割って平均Ｔ／Ｓ比を算出した。なおこの比は、サザンブロット末端制限断片分析（２）によるテロメア長の独立した測定値と極めてよく一致していることが従前に判明している。

図３（左）に示すように、老化促進モデル細胞（ＴＧ）のテロメア長は、野性型細胞（ＷＴ）に比べて有意に短かったが、図３（右）に示すように、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を導入した老化促進モデル細胞（ＴＧＮＭ＿０２６３３３）では、老化促進モデル細胞（ＴＧ）に比べて有意に回復していた。なお、グラフの縦軸は、３６Ｂ４（変化倍率）を示す。

以上により、老化促進モデル細胞（ＴＧ）に認められたＮＭ＿０２６３３３タンパク質の発現減少は、ベクター導入により補充すると、オートファジーの障害、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解、テロメアの長さの減少、ゲノムまたはエピゲノムの変化などの老化シグナルが低減することから、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質は生体の老化を抑制する作用を有すると言える。なお、ベクターとしては、ＮＭ＿０２６３３３塩基配列に従い合成された人工合成遺伝子でクローニングされたpBApo-CMV Neoベクター（タカラバイオ株式会社、京都）を用いた。

次に、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の細胞内局在とＣａイオンチャンネルに及ぼす影響について検討を行った。

図４は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質によるＨＥＫ−２９３細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフである。
前記の線維芽細胞と同様に、ＨＥＫ−２９３細胞を10％FBS-DMEMで培養し、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質プラスミドをTransIT-293 Transfection Reagent (Mirus Bio LLC, Madison, WI, USA)を用いて導入し、４８時間後にFura-2 AMをloadし440/480nmの２波長法で測定した。

左上図のように、ＨＥＫ−２９３細胞にアセチルコリン１０^−４Ｍを投与すると、細胞内Ｃａイオン濃度は、スパイク状に上昇した後、徐々に低下した。
左下図のように、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質過剰発現細胞では、アセチルコリン１０^−４Ｍを投与すると、細胞内Ｃａイオン濃度は、スパイク状に上昇した後、速やかに低下し、Ｃａイオンの流入阻害が認められた。
右図のように、細胞外Ｃａイオンを除いた液でアセチルコリン１０^−４Ｍを投与すると、細胞内貯蔵部位からのＣａイオンは遊離は起こるが、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質が過剰発現されてるか否かでの差異は認められなかった。

図５は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質によるＡ７ｒ５細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフである。
前記と同様に、Ａ７ｒ５細胞（ラット大動脈血管平滑筋細胞）を10％FBS-DMEMで培養し、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質プラスミドをEffectene Transfection Reagentを用いて導入し、４８時間後にFura-2 AMをloadし440/480nmの２波長法で測定した。

左下図のように、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質過剰発現細胞では、アセチルコリン１０^−６Ｍを投与による細胞内Ｃａイオン濃度のスパイク状上昇は、顕著に低下し、正常細胞にジルチアゼムを前投与した右上図と同様の結果となった。
右下図のように、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質過剰発現細胞においては、アセチルコリン１０^−６Ｍを投与による細胞内Ｃａイオン濃度のスパイク状上昇も顕著な低下は、ジルチアゼムの前投与の影響を受けなかった。

図６は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞の染色写真である。
前記の線維芽細胞と同様に、ＨＥＫ−２９３細胞を10％FBS-DMEMで培養し、スライドグラスつきのペトリディッシュに細胞を培養し、Ｈｉｓタグが付いたＮＭ＿０２６３３３タンパク質プラスミドをTransIT-293 Transfection Reagentを用いて導入し、４８時間後にＨｉｓタグ抗体で染色した。二次抗体はTexas Red-Goat-Anti-rabbit IgGを使用した。
その結果、細胞膜での強い染色が観察され、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の細胞内移行が認められた。

図７は、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を過剰発現させたＡ７ｒ５細胞の染色写真である。
前記と同様に、、Ａ７ｒ５細胞を10％FBS-DMEMで培養し、スライドグラスつきのペトリディッシュに細胞を培養し、Ｈｉｓタグが付いたＮＭ＿０２６３３３タンパク質プラスミドをEffectene Transfection Reagentを用いて導入し、４８時間後にＨｉｓタグ抗体で染色した。二次抗体はTexas Red-Goat-Anti-rabbit IgGを使用した。
その結果、細胞膜での強い染色が観察され、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の細胞内移行が認められた。

以上により、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質は、生体の老化を抑制する作用を有する膜性タンパク質と言える。

次に、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の標的分子について検討を行った。

図８は、Ｈｉｓタグ付きＮＭ＿０２６３３３タンパク質の相互作用を示すウエスタンブロット写真である。縦軸は分子量を示す。
前記の線維芽細胞と同様に、ＨＥＫ−２９３細胞を10％FBS-DMEMで培養し、ペトリディッシュに細胞を培養し、Ｈｉｓタグが付いたＮＭ＿０２６３３３タンパク質プラスミドまたはempty vectorをTransIT-293 Transfection Reagentを用いて導入し、４８時間後に細胞ペレットを採取し、Talon magnetic beads (コバルトレジン)で精製後、ウエスタンブロット法でＮＭ＿０２６３３３タンパク質を検索した。
ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）に対するラビットポリクローナル抗体(Alomone 社、イスラエル)を使用した。100 kD周辺にＮＣＸ１のバンド、50 kD周辺に非特異的バンドが認められた。なお、非特異的陽イオンチャネルTRPC(transient receptor potential-canonical)3並びに6抗体(Alomone 社、イスラエル)と電位依存性カルシウムチャネルCav1.2抗体(Alomone 社、イスラエル)を使用したウエスタンブロットでは、バンドは検出されなかった。

Ｈｉｓタグ付き蛋白質の精製には、ＴＡＬＯＮ磁性ビーズ（カタログ番号６３５６３６及び６３５６３７）を、マグネチックセパレーターでのＨｉｓタグ付きタンパク質のマイクロスケール精製に使用した。トラクターバッファーを細胞ペレットに加え、ピペットで数回出し入れすることにより穏やかに混合した。サンプルを４℃にて１０，０００〜１２，０００ｘｇで２０分間遠心分離して不溶性材料を除去した後、ペレットを乱すことなく上清を透明な試験管に移した。少量のこの明澄化サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために氷上に取っておき、ＴＡＬＯＮ磁性ビーズ精製プロトコールを進めた。ビーズのアリコートをマイクロ遠沈管に加え、保存バッファーを除去した後に脱イオン水で洗浄した。これらのビーズを平衡化／洗浄バッファーで平衡化した後、細胞溶解液をビーズに加え、室温で３０分間、ロータリーシェーカー上で混合した。これらのビーズを平衡化／洗浄バッファーで３回洗浄し、１回目、２回目、３回目の洗液をそれぞれ回収した。蛋白質を溶出させるために、溶出バッファーをビーズ懸濁液に加え、５分間混合し、溶出液をその後のウエスタンブロット解析のために回収した。

以上から、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質が、ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルとタンパク質間相互作用をすること、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質が、ＮＣＸ１（Na⁺ - Ca²⁺ exchanger 1）チャンネルを阻害し、Ｃａイオンの流入を抑制することがわかった。

図９は、ＮＣＸ１阻害薬によるＨＥＫ−２９３細胞内Ｃａイオン濃度の変化を示すグラフである。
前記の線維芽細胞と同様に、ＨＥＫ−２９３細胞を10％FBS-DMEMで培養し、ＮＣＸ１阻害剤であるＳＮ−６及びジルチアゼム（各１０^-5Ｍ）をアセチルコリン投与２分前に投与し、Fura-2 AMをloadし440/480nmの２波長法で測定した。

その結果、ＨＥＫ−２９３細胞にアセチルコリンを投与すると、Ｃａイオンの流入が生じるが、ＮＣＸ１阻害剤を前投与すると、Ｃａイオンの流入が抑制され、前記のＮＭ＿０２６３３３タンパク質導入と同様の作用であることがわかった。

図１０は、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６による作用を示す下段の図を、図１に等しい上段の図に加えた写真である。その下段の図では、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６を投与した老化促進モデル細胞（ＴＧＳＮ−６１０^-5Ｍ）の蛍光免疫染色写真（左）及びウエスタンブロット写真（右）を示す。
図１での条件と比べると、オートファジーの染色は同じであるが、ＣＦ６の老化促進モデル細胞（ＴＧ）は10％FBS-DMEMで培養し、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）の投与４８時間後に、serum-free DMEM中で４〜６時間培養し、各抗体で染色した。ウエスタンブロットでは、老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＨＥＫ−２９３細胞を10％FBS-DMEMで培養し、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）の投与４８時間後に、serum-free DMEM中で４〜６時間培養し、細胞を採取しRIPA Lysis buffer に溶解した。その上清に同量のLaemmli (5% βメルカプト添加)を加え、攪拌後９５℃で５分処理後、BioRadの５〜２０%ゲルにアプライし膜に転写後、各抗体で染色した。

オートファジーに及ぼす影響としては、老化促進モデル細胞（ＴＧ）にＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）を投与することにより、蛍光免疫染色ではＬＣ３ＩＩとＬＡＭＰ１の細胞質での染色が回復し、ウエスタンブロットではＬＣ３ＩＩ、エメリン、Ａｔｇ７の回復が観察され、この回復反応は、前記のＮＭ＿０２６３３３タンパク質導入と同様であった。ウエスタンブロットでは特に、ヒト細胞であるＨＥＫ−２９３細胞におけるＣＦ６添加によるオートファジー抑制は、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６投与によりマウス細胞と同様な回復が認められた。

図１１は、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６を投与した老化促進モデル細胞（ＴＧＳＮ−６１０^-5Ｍ）によるクロマチン構造の回復を示すDAPI染色写真である。
老化促進モデル細胞（ＴＧ）は10％FBS-DMEMで培養し、ＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）を投与した４８時間後に、serum-free DMEM中で４〜６時間培養し、DAPIで核染色した。
クロマチン構造は、老化促進モデル細胞（ＴＧ）にＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）を投与することで、ヘテロクロマチン構造への回復が観察された。

図１２は、マウス線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＮＣＸ１阻害剤を投与した老化促進モデル細胞（ＴＧＳＮ−６１０^-5Ｍ）のテロメア長を示すグラフ（左）、並びに、ヒトＨＥＫ−２９３細胞の老化促進モデル細胞（ＣＦ６）及びＮＣＸ１阻害剤を投与した老化促進モデル細胞（ＣＦ６ＳＮ−６１０^-5Ｍ）のテロメア長を示すグラフ（右）である。
老化促進モデル細胞（ＴＧ）及びＨＥＫ−２９３細胞は10％FBS-DMEMで培養し、ＨＥＫ−２９３細胞ではＣＦ６（１０^-７Ｍ）を添加し、老化促進モデル細胞（ＴＧ）ではＣＦ６を添加せず、それぞれにＮＣＸ１阻害剤ＳＮ−６（１０^-5Ｍ）を投与し４８時間後に、QIAamp DNA Blood Mini Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。テロメア長の測定は、前記と同様にＰＣＲ法で行い、controlに対する相対値で示した。

その結果、マウス線維芽細胞の老化促進モデル細胞（ＴＧ）にＮＣＸ１阻害剤を投与した場合と、ヒトＨＥＫ−２９３細胞の老化促進モデル細胞（ＣＦ６）にＮＣＸ１阻害剤を投与した場合に、テロメアの伸長が認められた。

以上により、ＣＦ６はヒト細胞においてもＮＣＸ１チャンネルを介するＣａイオン流入増加により老化シグナルを発現させ、ＮＣＸ１チャンネルの阻害は老化シグナルを抑制することがわかった。

上述の知見によって、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、ＮＣＸ１チャンネルを阻害する機能を有するタンパク質を、新規な機能を有するタンパク質として提供可能である。

同様に、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、オートファジーの障害を抑制する機能を有するタンパク質、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解を抑制する機能を有するタンパク質、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、テロメアの長さの減少を抑制する機能を有するタンパク質、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質から成り、ゲノムまたはエピゲノムの変化を抑制する機能を有するタンパク質も、新規な機能を有するタンパク質として提供可能である。

また、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を主成分とし、生体の老化を抑制する作用を有する薬剤を、新規な薬剤として提供可能である。

また、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質を生体に導入し、生体の老化を抑制する方法を、新規な方法として提供可能である。

更に、生体の老化を抑制する作用を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法も提供可能である。
すなわち、候補物質が、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の発現を誘導し得るか否か、または、ＮＭ＿０２６３３３タンパク質の活性を誘導し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程とを設けるか、或いは、候補物質が、ＮＣＸ１チャンネルを阻害し得るか否かを評価する工程と、候補物質を被験体に導入する工程と、被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程とを設ける。
ここで、老化シグナルとしては、オートファジーの障害、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解、テロメアの長さの減少、ゲノムまたはエピゲノムの変化のうちの少なくとも一つが使用可能である。

被験物質としては、任意の公知化合物や新規化合物が使用でき、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）、糖質（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など）、脂質（飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、環を含む脂肪酸など）、アミノ酸、蛋白質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物などが挙げられる。

非ヒト動物が用いられる場合、候補物質の非ヒト動物への投与には従来公知の方法が利用できる。例えば、経口投与、非経口投与（静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、局所注入など）が挙げられる。投与量、投与間隔、投与期間等は、用いる候補物質や動物の種類等に応じて適宜設定される。

候補物質の有効性の評価には、従来公知の方法が利用でき、例えば、候補物質を投与した非ヒト動物から骨髄や血液等の生体試料を採取し、老化シグナルの低減量を測定することによって行える。

また、本発明によって提供される薬剤においては、各種循環器系疾患（例えば、末梢循環障害、冠循環障害、及び、脳循環障害による循環器系障害）の治療薬として使用する場合は、一般的な医薬製剤として調製される。例えば、本発明薬剤を製剤上許容しうる担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤）と混合して得られる医薬組成物または錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、座剤、吸入剤、経皮吸収剤等の製剤として経口または非経口に適した形態で処方される。

このような製剤を製造するには、従来公知の溶剤、可溶化剤、当張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤等を添加することができる。溶剤としては、例えば、水、生理食塩水、可溶化剤としては、例えば、エタノール、ポリソルベート類、クレモルファ、賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウム、結合剤としては、例えば、デンプン、ポリビニルピロリド、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、ケルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油が、安定化剤としては、例えば、乳糖、マンニトール、マルトース、ポリソルベート類、マクロゴール類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が挙げられる。
また、必要に応じて、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤、塩基性物質（例えば、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、トリスアミノメタン）などが添加可能である。

本発明薬剤の投与量は、動物実験の結果及び種々の状況を勘案して、単回及び反復投与したときに総投与量が一定量を超えないように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、例えば0.1mg−1000mgの範囲内で、年齢、体重、性別、感受性、食事、投与時間、併用する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて変化し、一定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針をもととして専門医の適量決定試験によって決定される。

本発明薬剤による末梢循環改善作用、冠循環改善作用（例えば、抗狭心症作用）及び脳循環改善作用は、血管収縮抑制作用及び血流量増加作用等によって確認することができる。
血管収縮抑制作用を確認する場合には、例えば哺乳動物の胸部大動脈を摘出した後、Ｃａイオン流入増加物質で処理し、Ｃａイオン流入増加物質による動脈の収縮を誘発させ、その後、ＮＣＸ１阻害薬で処理した場合のＣａイオン流入増加物質による動脈の収縮を測定し、ＮＣＸ１阻害薬を投与していない時の収縮を基準とすることで血管収縮の抑制作用を確認することができる。

また、血流量の増加作用を確認する場合には、例えば、哺乳動物にＣａイオン流入増加物質を投与し、Ｃａイオン流入増加物質によって高血圧が誘発された哺乳動物を作製し、ＮＣＸ１阻害薬を高血圧動物に腹腔内投与した後、皮膚血流量を測定し、投与前の血流量と比較することで血流量の増加作用を確認することができる。

さらに、本発明薬剤を利用して、Ｃａイオン流入増加物質または老化シグナルと関連する循環器系疾患の診断をすることも可能である。例えば、各種循環器系疾患患者にＮＣＸ１阻害薬を投与し、血管収縮の抑制作用及び血流量の増加作用等を測定することによってＣａイオン流入増加物質と関連する循環器系疾患かどうか判断することができる。これによると、生体内に多種類存在し微量であるＣａイオン流入増加物質を特異抗体やＨＰＬＣを用いて定量する必要がなくなるため、簡便で短時間に疾患の診断を行える。また例えば、ＮＣＸ１阻害薬を患者に対して経口又は外用(塗布等)的に投与し、レーザードップラー式血流画像化装置を用いて患者の手指等の皮膚血流量を測定することにより、Ｃａイオン流入増加物質または老化シグナルと関連する循環器系疾患の診断をすることが可能である。

本発明によると、生体の老化抑制に寄与するため、産業上有用である。

Claims

ＮＣＸ１（Na ⁺ - Ca ²⁺ exchanger 1）チャンネルの阻害用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、
ＮＣＸ１チャンネルを阻害する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
オートファジーの障害の抑制用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、
オートファジーの障害を抑制する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
核膜またはクロマチン構造の変化または細胞内タンパクの融解の抑制用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、
核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解を抑制する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
テロメアの長さの減少の抑制用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、
テロメアの長さの減少を抑制する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
ゲノムまたはエピゲノムの変化の抑制用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、
ゲノムまたはエピゲノムの変化を抑制する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
生体の老化の抑制用薬剤であって、
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を主成分とし、生体の老化を抑制する作用を有する
ことを特徴とする薬剤。
配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質を生体（ヒトを除く）に導入し、生体（ヒトを除く）の老化を抑制する
ことを特徴とする方法。
生体の老化を抑制する作用を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質が、配列表番号１の塩基配列から発現されるタンパク質の発現を誘導し得るか否かを評価する工程と、
候補物質を被験体（ヒトを除く）に導入する工程と、
前記被験体における老化シグナルが低減し得るか否かを評価する工程と、を有する
ことを特徴とする薬剤候補物質スクリーニング方法。
老化シグナルが、オートファジーの障害、核膜またはクロマチン構造の変化、または細胞内タンパクの融解、テロメアの長さの減少、ゲノムまたはエピゲノムの変化のうちの少なくとも一つである
請求項８に記載の薬剤候補物質スクリーニング方法。